Die Erfindung betrifft antibakterielle Amid-Makrozyklen und Verfahren zu ihrer Herstellung, ihre Verwendung zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Krankheiten sowie ihre Verwendung zur Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Krankheiten, insbeson- dere von bakteriellen Infektionen.

In WO 03/106480 und WO 04/012816 werden antibakteriell wirkende Makrozyklen vom Biphenomycin B Typ mit Amid- bzw. Estersubstituenten beschrieben.

In US 3,452,136, Dissertation R. U. Meyer, Universität Stuttgart, Deutschland 1991, Dissertation V. Leitenberger, Universität Stuttgart, Deutschland 1991, Synthesis (1992), (10), 1025-30, J. Chem. Soc, Perkin Trans. 1 (1992), (1), 123-30, J. Chem. Soc, Chem. Commun. (1991), (10), 744, Synthesis (1991), (5), 409-13, J. Chem. Soc, Chem. Commun. (1991), (5), 275-7, J. Antibiot. (1985), 38(11), 1462-8, J. Antibiot. (1985), 38(11), 1453-61, wird der Naturstoff Biphenomycin B als antibakteriell wirksam beschrieben. Teilschritte der Synthese von Biphenomycin B werden in Synlett (2003), 4, 522-526 beschrieben.

Chirality (1995), 7(4), 181-92, J. Antibiot. (1991), 44(6), 674-7, J. Am. Chem. Soc. (1989), 111(19), 7323-7, J. Am. Chem. Soc. (1989), 111(19), 7328-33, J. Org. Chem. (1987), 52(24), 5435-7, Anal. Biochem. (1987), 165(1), 108-13, J. Org. Chem. (1985), 50(8), 1341-2, J. Antibiot. (1993), 46(3), C-2, J. Antibiot. (1993), 46(1), 135-40, Synthesis (1992), (12), 1248-54, Appl. Environ. Microbiol. (1992), 58(12), 3879-82, J. Chem. Soc, Chem. Commun. (1992), (13), 951-3 beschreiben einen strukturell verwandten Naturstoff, Biphenomycin A, der am Makrozyklus eine weitere Substitution mit einer Hydroxygruppe aufweist. .

Die Naturstoffe entsprechen hinsichtlich ihrer Eigenschaften nicht den Anforderungen, die an antibakterielle Arzneimittel gestellt werden. Auf dem Markt sind zwar strukturell andersartige antibakteriell wirkende Mittel vorhanden, es kann aber regelmäßig zu einer Resistenzentwicklung kommen. Neue Mittel für eine gute und wirksamere Therapie sind daher wünschenswert.

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, neue und alternative Verbindungen mit gleicher oder verbesserter antibakterieller Wirkung zur Behandlung von bakteriellen Erkrankungen bei Menschen und Tieren zur Verfügung zu stellen.

Überraschenderweise wurde gefunden, dass bestimmte Derivate dieser Naturstoffe, worin die Carboxylgruppe des Naturstoffs gegen eine Amidgruppe ausgetauscht wird, die eine basische Gruppe enthält, gegen Biphenomycin resistente S. aureus Stämme (RN4220BiR und Tl 7) antibakteriell wirksam sind. Weiterin zeigen die Derivate gegen S. aureus Wildtyp-Stämme und Biphenomycin resistente S. aureus Stämme eine verbesserte Spontanresistenz-Frequenz. Gegenstand der Erfindung sind Verbindungen der Formel

bei denen R1 gleich eine Gruppe der Formel

'%^NH2 "'V^NH2

wobei R7 gleich Wasserstoff oder Hydroxy ist, * die Anknüpfstelle an das Kohlenstoffatom ist, R2 gleich Wasserstoff, Methyl oder Ethyl ist, R3 gleich eine Gruppe der Formel

ist, wobei * die Anknüpfstelle an das Stickstoffatom ist, R8 gleich Wasserstoff, Amino oder Hydroxy ist, R9 gleich Wasserstoff, Methyl oder eine Gruppe der Formel

ist, worin die Anknüpfstelle an das Stickstoffatom ist, - A - R20 gleich Wasserstoff oder *-<CH2)rNHR22 ist, worin R22 gleich Wasserstoff oder Methyl ist und f eine Zahl 1, 2 oder 3 ist, R21 gleich Wasserstoff oder Methyl ist, d eine Zahl 0, 1, 2 oder 3 ist und e eine Zahl 1, 2 oder 3 ist, R10 gleich Wasserstoff oder Aminoethyl ist, oder R9 und R10 bilden zusammen mit dem Stickstoffatom an das sie gebunden sind einen Piperazin-Ring, R11 und R15 unabhängig voneinander *-(CH2)Zi-OH, *-(CH2)z2-NHR16, Hydroxy- carbonyl, Aminocarbonyl, Hydroxycarbonylmethyl, Aminocarbonyl- methyl, *-CONHR17 oder *-CH2CONHR18 sind, worin * die Anknüpfstelle an das Kohlenstoffatom ist, Zl und Z2 unabhängig voneinander eine Zahl I5 2 oder 3 sind, R16 gleich Wasserstoff oder Methyl ist und R17 und R18 unabhängig voneinander eine Gruppe der Formel

sind, worin * die Anknüpfstelle an das Stickstoffatom ist, R8a gleich Wasserstoff, Amino oder Hydroxy ist, R9a gleich Wasserstoff, Methyl oder Aminoethyl ist, R1Oa gleich Wasserstoff oder Aminoethyl ist, oder R9a und R10a bilden zusammen mit dem Stickstoffatom an das sie gebunden sind einen Piperazin-Ring, Rna und R15a unabhängig voneinander MCH2)Zi3-OH, *-(CH2)z2a- NHRI6a, Hydroxycarbonyl, Aminocarbonyl, Hydroxycarbonyl- methyl oder Aminocarbonylmethyl sind, worin * die Anknüpfstelle an das Kohlenstoffatom ist, R16a gleich Wasserstoff oder Methyl ist und ZIa und Z2a unabhängig voneinander eine Zahl 1, 2 oder 3 sind, RI2a und RHa unabhängig voneinander Wasserstoff oder Methyl sind, R13a gleich Amino oder Hydroxy ist, ka eine Zahl 0 oder 1 ist, Ia, wa, xa und ya unabhängig voneinander eine Zahl 1, 2, 3 oder 4 sind, R12 und R14 unabhängig voneinander Wasserstoff, Methyl oder eine Gruppe der Formel

sind, worin * die Anknüpfstelle an das Stickstoffatom ist, R20a gleich Wasserstoff oder *-(CH2)fa-NHR22a ist, worin R22a gleich Wasserstoff oder Methyl ist und fa eine Zahl 1, 2 oder 3 ist, R21a gleich Wasserstoff oder Methyl ist, da eine Zahl 0, 1, 2 oder 3 ist und ea eine Zahl 1, 2 oder 3 ist, R13 gleich Amino oder Hydroxy ist, R19 eine Gruppe der Formel

ist, worin * die Anknüpfstelle an das Stickstoffatom ist, R8b gleich Wasserstoff, Amino oder Hydroxy ist, R9b gleich Wasserstoff, Methyl oder Aminoethyl ist, R10b gleich Wasserstoff oder Aminoethyl ist, oder R9b und R10 bilden zusammen mit dem Stickstoffatom an das sie gebunden sind einen Piperazin-Ring, Rnb und R15b unabhängig voneinander *-(CH2)zlb-OH, *-(CH2)Z2b-NHR16b, Hydroxycarbonyl, Aminocarbonyl, Hydroxycarbonylmethyl oder Amino- carbonylmethyl sind, worin * die Anknüpfstelle an das Kohlenstoffatom ist, R16b gleich Wasserstoff oder Methyl ist und ZIb und Z2b unabhängig voneinander eine Zahl 1 , 2 oder 3 sind, R12b und R14b unabhängig voneinander Wasserstoff oder Methyl sind, R13b gleich Amino oder Hydroxy ist, kb eine Zahl O oder 1 ist,

Ib, wb, xb und yb unabhängig voneinander eine Zahl 1, 2, 3 oder 4 sind,

k und t unabhängig voneinander eine Zahl 0 oder 1 sind,

1, w, x und y unabhängig voneinander eine Zahl 1, 2, 3 oder 4 sind,

m, r, s und v unabhängig voneinander eine Zahl 1 oder 2 sind,

n, o, p und q unabhängig voneinander eine Zahl 0, 1 oder 2 sind,

u eine Zahl 0, 1, 2 oder 3 ist,

L JI , w,x oder y unabhängig voneinander bei 1, w, x oder y gleich 3 eine Hydroxy

Gruppe tragen kann,

R4 gleich Wasserstoff, Halogen, Amino, Hydroxy, Aminocarbonyl, Hydroxycarbonyl, Nitro, Trifluormethyl, Trifluormethoxy, (CrC4)-Alkoxy oder (CrC6)-Alkylamino ist,

R5 gleich Wasserstoff, Halogen, Amino, Hydroxy, Aminocarbonyl, Hydroxycarbonyl, Nitro, Trifluormethyl, Trifluormethoxy, (Ci-C4)-Alkyl, (CrC4)-Alkoxy oder (CrC6)-Alkylamino ist,

R6 gleich Wasserstoff, Methyl oder Ethyl ist,

und ihre Salze, ihre Solvate und die Solvate ihrer Salze.

Erfindungsgemäße Verbindungen sind die Verbindungen der Formel (I) und deren Salze, Solvate und Solvate der Salze, die von Formel (I) umfassten Verbindungen der nachfolgend genannten Formel (Ia) und deren Salze, Solvate und Solvate der Salze sowie die von Formel (I) und/oder (Ia) umfassten, nachfolgend als Ausführungsbeispiel(e) genannten Verbindungen und deren Salze, Solvate und Solvate der Salze, soweit es sich bei den von Formel (I) und/oder (Ia) umfassten, nachfolgend genannten Verbindungen nicht bereits um Salze, Solvate und Solvate der Salze handelt.

Die erfϊndungsgemäßen Verbindungen können in Abhängigkeit von ihrer Struktur in stereoisomeren Formen (Enantiomere, Diastereomere) existieren. Die Erfindung umfasst deshalb die Enantiomeren oder Diastereomeren und ihre jeweiligen Mischungen. Aus solchen Mischungen von Enantiomeren und/oder Diastereomeren lassen sich die stereoisomer einheitlichen Bestandteile in bekannter Weise isolieren.

Sofern die erfindungsgemäßen Verbindungen in tautomeren Formen vorkommen können, umfasst die vorliegenden Erfindung sämtliche tautomere Formen.

Als Salze sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung physiologisch unbedenkliche Salze der erfin¬ dungsgemäßen Verbindungen bevorzugt. Umfasst sind aber auch Salze, die für pharmazeutische Anwendungen selbst nicht geeignet sind aber beispielsweise für die Isolierung oder Reinigung der erfindungsgemäßen Verbindungen verwendet werden können.

Physiologisch unbedenkliche Salze der erfindungsgemäßen Verbindungen umfassen Säure- additionssalze von Mineralsäuren, Carbonsäuren und Sulfonsäuren, z.B. Salze der Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Methansulfonsäure, Ethansulfonsäure, Toluolsulfonsäure, Benzolsulfonsäure, Naphthalindisulfonsäure, Essigsäure, Trifluoressigsäure, Propionsäure, Milchsäure, Weinsäure, Äpfelsäure, Zitronensäure, Fumarsäure, Maleinsäure und Benzoesäure.

Physiologisch unbedenkliche Salze der erfindungsgemäßen Verbindungen umfassen auch Salze üblicher Basen, wie beispielhaft und vorzugsweise Alkalimetallsalze (z.B. Natrium- und Kaliumsalze), Erdalkalisalze (z.B. Calcium- und Magnesiumsalze) und Ammoniumsalze, abgeleitet von Ammoniak oder organischen Aminen mit 1 bis 16 C-Atomen, wie beispielhaft und vorzugsweise Ethylamin, Diethylamin, Triethylamin, Ethyldiisopropylamin, Monoethanolamin, Diethanolamin, Triethanolamm, Dicyclohexylamin, Dimethylaminoethanol, Prokain, Dibenzylamin, N- Methylmorpholin, Arginin, Lysin, Ethylendiamin und N-Methylpiperidin.

Als Solvate werden im Rahmen der Erfindung solche Formen der erfindungsgemäßen Verbindungen bezeichnet, welche in festem oder flüssigem Zustand durch Koordination mit Lösungsmittel¬ molekülen einen Komplex bilden. Hydrate sind eine spezielle Form der Solvate, bei denen die Koordination mit Wasser erfolgt.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung haben die Substituenten, soweit nicht anders spezifiziert, die folgende Bedeutung:

Alkyl per se und "Alk" und "Alkyl" in Alkoxy und Alkylamino stehen für einen linearen oder verzweigten Alkylrest mit in der Regel 1 bis 6, vorzugsweise 1 bis 4, besonders bevorzugt 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, beispielhaft und vorzugsweise für Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, tert-Bxityl, n-Pentyl und n-Hexyl. Alkoxy steht beispielhaft und vorzugsweise für Methoxy, Ethoxy, n-Propoxy, Isopropoxy, tert- Butoxy, n-Pentoxy und n-Hexoxy.

Alkylamino steht für einen Alkylaminorest mit einem oder zwei (unabhängig voneinander gewählten) Alkylsubstituenten. (C1 -C3)- Alkylamino steht beispielsweise für einen Monoalkyl- aminorest mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen oder für einen Dialkylaminorest mit jeweils 1 bis 3 Kohlenstoffatomen pro Alkylsubstituent. Beispielhaft und vorzugsweise seien genannt: Methylamino, Ethylamino, n-Propylamino, Isopropylamino, terr-Butylamino, n-Pentylamino, n- Hexylamino, N,N-Dimethylamino, N,N-Diethylamino, N-Ethyl-N-methylamino, N-Methyl-N-n- propylamino, N-Isopropyl-N-n-propylamino, N-fert-Butyl-N-methylamino, N-Ethyl-N-n-pentylamino undN-n-Hexyl-N-methylamino.

Halogen steht für Fluor, Chlor, Brom und Iod.

Ein Symbol * in der Formel einer Gruppe kennzeichnet die Anknüpfstelle der Gruppe. Der End¬ punkt der Linie, neben der jeweils ein * steht, steht dabei nicht für ein Kohlenstoffatom beziehungsweise eine GH^-Gruppe sondern ist Bestandteil der Bindung zu dem Atom, an das die Gruppe gebunden ist.

In den Formeln der Gruppen, für die R1 stehen kann, steht der Endpunkt der Linie, neben der jeweils ein * steht, nicht für ein Kohlenstoffatom beziehungsweise eine CH2-Gruppe sondern ist Be¬ standteil der Bindung zu dem Kohlenstoffatom, an das R1 gebunden ist.

In den Formeln der Gruppen, für die R3 stehen kann, steht der Endpunkt der Linie, neben der jeweils ein * steht, nicht für ein Kohlenstoffatom beziehungsweise eine CHrGruppe sondern ist Be¬ standteil der Bindung zu dem Stickstoffatom, an das R3 gebunden ist. R3 ist also beispielsweise 2-Aminoethyl im Falle von k = 0, 1 = 1, R9 = H und R10 = H, 3-Amino-2-hydroxypropyl im Falle von k = 1, R8 = OH, 1 = 1, R9 = H und R10 = H, Piperidin-4-yl-methyl im Falle von q = 1 und r = 1 oder Piperidin-4-yl im Falle von q = 0 und r = 1.

Bevorzugt im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind Verbindungen, welche der Formel

(Ia), entsprechen, worin R1 bis R6 die gleiche Bedeutung wie in Formel (I) haben, und ihre Salze, ihre Solvate und die Solvate ihrer Salze. Bevorzugt im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind erfindungsgemäße Verbindungen, bei denen R1 gleich eine Gruppe der Formel

wobei R7 gleich Wasserstoff oder Hydroxy ist, * die Anknüpfstelle an das Kohlenstoffatom ist, R2 gleich Wasserstoff oder Methyl ist, R3 gleich eine Gruppe der Formel

ist, wobei * die Anknüpfstelle an das Stickstoffatom ist, R8 gleich Wasserstoff, Amino oder Hydroxy ist, R9 gleich Wasserstoff, Methyl oder eine Gruppe der Formel

ist, worin * die Anknüpfstelle an das Stickstoffatom ist, R20 gleich Wasserstoff oder *-{CH2)rNHR22 ist, worin R22 gleich Wasserstoff ist und f eine Zahl 1, 2 oder 3 ist, R21 gleich Wasserstoff ist, d eine Zahl 0 ist und e eine Zahl 1, 2 oder 3 ist, R10 gleich Wasserstoff oder Aminoethyl ist, R11 gleich *-(CH2)zi-OH, MCH2)Z2-NHR16, Hydroxycarbonyl, Aminocarbonyl, Hydroxycarbonylmethyl, Aminocarbonyl-methyl, *-CONHR17 oder *-CH2CONHR18ist, worin * die Anknüpfstelle an das Kohlenstoffatom ist, Zl und Z2 unabhängig voneinander eine Zahl 1, 2 oder 3 sind, R16 gleich Wasserstoff oder Methyl ist und R17 und R18 unabhängig voneinander eine Gruppe der Formel

sind, worin die Anknüpfstelle an das Stickstoffatom ist, R >8a a gleich Wasserstoff, Amino oder Hydroxy ist, R9a gleich Wasserstoff, Methyl oder Aminoethyl ist, R1Oa gleich Wasserstoff oder Aminoethyl ist, oder R9a und R1Oa bilden zusammen mit dem Stickstoffatom an das sie gebunden sind einen Piperazin-Ring, Rlla und R15a unabhängig voneinander *-(CH2)zia-OH, *-{CH2)Z2a- NHR16a, Hydroxycarbonyl, Aminocarbonyl, Hydroxycarbonyl- methyl oder Aminocarbonylmethyl sind, worin die Anknüpfstelle an das Kohlenstoffatom ist, R16a gleich Wasserstoff oder Methyl ist und ZIa und Z2a unabhängig voneinander eine Zahl 1, 2 oder 3 sind, RI2a und R14a unabhängig voneinander Wasserstoff oder Methyl sind, R13a gleich Amino oder Hydroxy ist, ka eine Zahl 0 oder 1 ist, Ia, wa, xa und ya unabhängig voneinander eine Zahl 1, 2, 3 oder 4 sind, R12 gleich Wasserstoff oder Methyl ist, k gleich eine Zahl 0 oder 1 ist, 1 und w unabhängig voneinander eine Zahl 1, 2, 3 oder 4 sind,

[ "J l oder w unabhängig voneinander bei 1 oder w gleich 3 eine Hydroxy-Gruppe tragen kann, R4 gleich Hydroxy ist, R5 gleich Wasserstoff ist, R6 gleich Wasserstoff ist, und ihre Salze, ihre Solvate und die Solvate ihrer Salze. Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der Formel (I) oder ihrer Salze, ihrer Solvate oder der Solvate ihrer Salze, wobei nach Verfahren [A] Verbindungen der Formel

worin R1, R2, R4, R5 und R6 die oben angegebene Bedeutung haben und boc gleich tert-Butoxy- carbonyl ist, in einem zweistufigen Verfahren zunächst in Gegenwart von einem oder mehreren De- hydratisierungsreagenzien mit Verbindungen der Formel H2NR3 (UI), worin R3 die oben angegebene Bedeutung hat, und anschließend mit einer Säure umgesetzt werden, oder [B] Verbindungen der Formel

worin R1, R2, R4, R5 und R6 die oben angegebene Bedeutung haben und Z gleich Benzyloxy- carbonyl ist, in einem zweistufigen Verfahren zunächst in Gegenwart von einem oder mehreren De- hydratisierungsreagenzien mit Verbindungen der Formel H2NR3 (m), worin R3 die oben angegebene Bedeutung hat, und anschließend mit einer Säure oder durch Hydrogenolyse umgesetzt werden, oder [C] Verbindungen der Formel

worin R1, R2, R4, R5 und R6 die oben angegebene Bedeutung haben und Z gleich Benzyloxy- carbonyl ist, und

R23 gleich Benzyl, Methyl oder Ethyl ist,

in einem zweistufigen Verfahren zunächst in Gegenwart von Kaliumcyanid mit Verbindungen der Formel

H2NR3 (HI),

worin R3 die oben angegebene Bedeutung hat,

und anschließend mit einer Säure oder durch Hydrogenolyse umgesetzt werden.

Die freie Base der Salze kann zum Beispiel durch Chromatographie an einer Reversed Phase Säule mit einem Acetonitril-Wasser-Gradienten unter Zusatz einer Base erhalten werden, insbesondere durch Verwendung einer RPl 8 Phenomenex Luna Cl 8(2) Säule und Diethylamin als Base.

Weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der Formel (I) oder ihrer Solvate nach Anspruch 1, bei dem Salze der Verbindungen oder Solvate der Salze der Verbindungen durch Chromatographie unter Zusatz einer Base in die Verbindungen oder ihre Solvate überführt werden.

Die Hydroxygruppe an R7 ist gegebenenfalls während der Umsetzung der Verbindungen der Formeln (IX) und (XI) mit einer te/Y-Butyldimethylsilyl-Gruppe geschützt und wird in einem der darauf folgenden Reaktionsschritte unter Desilylierungsbedingungen mit abgespalten.

Reaktive Funktionalitäten in den Resten R1 und R3 von Verbindungen der Formeln (II), (III), (FV) und (VI) werden bereits geschützt mit in die Synthese eingebracht, bevorzugt sind säurelabile Schutzgruppen (z.B. boc oder z). Nach erfolgter Umsetzung zu Verbindungen der Formel (I) können die Schutzgruppen durch Entschützungsreaktion abgespalten werden. Dies geschieht nach Standardverfahren der Schutzgruppenchemie. Bevorzugt sind Entschützungsreaktionen unter sauren Bedingungen oder durch Hydrogenolyse.

Reaktive Funktionalitäten in dem Rest R1 von Verbindungen der Formeln (VII), (VIII), (IX) und (XI) werden bereits geschützt mit in die Synthese eingebracht, bevorzugt sind säurelabile Schutzgruppen (z.B. boc oder z). Diese Schutzgruppen werden in einem der darauf folgenden Reaktionsschritte durch Entschützungsreaktion abgespalten. Dies geschieht nach Standardverfahren der Schutzgruppenchemie. Bevorzugt sind Entschützungsreaktionen unter sauren Bedingungen oder durch Hydrogenolyse.

Die Umsetzung der ersten Stufe der Verfahren [A] und [B] erfolgt im Allgemeinen in inerten Lösungsmitteln, gegebenenfalls in Gegenwart einer Base, bevorzugt in einem Temperaturbereich von 00C bis 400C bei Normaldruck.

Als Dehydratisierungsreagenzien eignen sich hierbei beispielsweise Carbodiimide wie z.B. N,N'~ Diethyl-, N,N'-Dipropyl-, N,N'-Diisopropyl-, N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid, N-(3-Dimethylamino- isopropyl)-N'-ethylcarbodiimid-Hydrochlorid (EDC), N-Cyclohexylcarbodiimid-N '-propyloxy- methyl-Polystyrol (PS-Carbodiimid) oder Carbonylverbindungen wie Carbonyldiimidazol, oder 1,2-Oxazoliumverbindungen wie 2-Ethyl-5-phenyl-l,2-oxazolium-3-sulfat oder 2-tert-Buty\-5- methyl-isoxazolium-perchlorat, oder Acylaminoverbindungen wie 2-Ethoxy-l-ethoxycarbony 1-1,2- dihydrochinolin, oder Propanphosphonsäureanhydrid, oder Isobutylchloroformat, oder Bis-(2-oxo- 3-oxazolidinyl)-phosphorylchlorid oder Benzotriazolyloxy-tri(dimethylamino)ρhosphoniumhexa- fluorophosphat, oder O-(Benzotriazol-l-yl)-N,N,N',N'-tetra-methyluroniumhexafluor ophosphat (HBTU), 2-(2-Oxo-l-(2H)-pyridyl)-l,l,3,3-tetramethyluroniumtetrafluo roborat (TPTU) oder 0-(7-Azabenzotriazol-l -yI)-N,N,N' N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphat (HATU), oder 1-Hydroxybenztriazol (HOBt)5 oder Benzotriazol-l-yloxytris(dimethylamino)-phosphonium- hexafluoro-phosphat (BOP), oder Mischungen aus diesen, oder Mischung aus diesen zusammen mit Basen.

Basen sind beispielsweise Alkalicarbonate, wie z.B. Natrium- oder Kaliumcarbonat, oder -hydrogencarbonat, oder organische Basen wie Trialkylamine z.B. Triethylamin, N-Methylmorpholin, N-Methylpiperidin, 4-Dimethylaminopyridin oder Diisopropylethylamin.

Vorzugsweise wird die Kondensation mit HATU in Gegenwart einer Base, insbesondere Diisopropylethylamin, durchgeführt.

Inerte Lösungsmittel sind beispielsweise Halogenkohlenwasserstoffe wie Dichlormethan oder Trichlormethan, Kohlenwasserstoff wie Benzol, oder Νitromethan, Dioxan, Dimethylformamid oder Acetonitril. Ebenso ist es möglich, Gemische der Lösemittel einzusetzen. Besonders bevorzugt ist Dimethylformamid.

Die Umsetzung der ersten Stufe des Verfahrens [C] erfolgt im Allgemeinen mit der Verbindung der Formel (HI) als Lösungsmittel, bevorzugt in einem Temperaturbereich von 00C bis 400C bei Normaldruck.

Die Umsetzung mit einer Säure in der zweiten Stufe der Verfahren [A], [B] und [C] erfolgt bevorzugt in einem Temperaturbereich von 00C bis 4O0C bei Normaldruck.

Als Säuren eignen sich hierbei Chlorwasserstoff in Dioxan, Bromwasserstoff in Essigsäure oder Trifluoressigsäure in Methylenchlorid.

Die Hydrogenolyse in der zweiten Stufe der Verfahren [B] und [C] erfolgt im Allgemeinen in einem Lösungsmittel in Gegenwart von Wasserstoff und Palladium auf Aktivkohle, bevorzugt in einem Temperaturbereich von O0C bis 4O0C bei Normaldruck.

Lösungsmittel sind beispielsweise Alkohole wie Methanol, Ethanol, n-Propanol oder iso-Propanol, in einem Gemisch mit Wasser und Eisessig, bevorzugt ist ein Gemisch aus Ethanol, Wasser und Eisessig.

Die Verbindungen der Formel (HI) sind bekannt oder können analog bekannten Verfahren hergestellt werden.

Die Verbindungen der Formel (II) sind bekannt oder können hergestellt werden, indem Verbindungen der Formel

worin R1, R2, R4, R5 und R6 die oben angegebene Bedeutung haben,

mit Di-(ter?-butyl)-dicarbonat in Gegenwart einer Base umgesetzt werden. Die Umsetzung erfolgt im Allgemeinen in einem Lösungsmitteln, bevorzugt in einem Tem¬ peraturbereich von 00C bis 400C bei Normaldruck.

Basen sind beispielsweise Alkalihydroxide wie Natrium- oder Kaliumhydroxid, oder Alkalicarbonate wie Cäsiumcarbonat, Natrium- oder Kaliumcarbonat, oder andere Basen wie DBU, Triethylamin oder Diisopropylethylamin, bevorzugt ist Natriumhydroxid oder Natrium- carbonat.

Lösungsmittel sind beispielsweise Halogenkohlenwasserstoffe wie Methylenchlorid oder 1,2-Di- chlorethan, Alkohole wie Methanol, Ethanol oder iso-Propanol, oder Wasser.

Vorzugsweise wird die Umsetzung mit Natriumhydroxid in Wasser oder Natriumcarbonat in Methanol durchgeführt.

Die Verbindungen der Formel (V) sind bekannt oder können hergestellt werden, indem Ver¬ bindungen der Formel

worin R1, R2, R4, R5 und R6 die oben angegebene Bedeutung haben, und

R23 gleich Benzyl, Methyl oder Ethyl ist,

mit einer Säure oder durch Hydrogenolyse, wie für die zweite Stufe des Verfahrens [B] beschrieben, gegebenenfalls durch anschließende Umsetzung mit einer Base zur Verseifung des Methyl- oder Ethylesters, umgesetzt werden.

Die Verseifung kann zum Beispiel erfolgen, wie bei der Umsetzung von Verbindungen der Formel (VI) zu Verbindungen der Formel (IV) beschrieben.

Die Verbindungen der Formel (IV) sind bekannt oder können hergestellt werden, indem in Verbindungen der Formel (VI) der Benzyl-, Methyl- oder Ethylester verseift wird. Die Umsetzung erfolgt im Allgemeinen in einem Lösungsmitteln, in Gegenwart einer Base, be¬ vorzugt in einem Temperaturbereich von 00C bis 400C bei Normaldruck.

Basen sind beispielsweise Alkalihydroxide wie Lithium-, Natrium- oder Kaliumhydroxid, be¬ vorzugt ist Lithiumhydroxid.

Lösungsmittel sind beispielsweise Halogenkohlenwasserstoffe wie Dichlormethan oder Trichlor- methan, Ether wie Tetrahydrofuran oder Dioxan, oder Alkohole wie Methanol, Ethanol oder Iso- propanol, oder Dimethylformamid. Ebenso ist es möglich, Gemische der Lösungsmittel oder Gemische der Lösungsmittel mit Wasser einzusetzen. Besonders bevorzugt sind Tetrahydrofuran oder ein Gemisch aus Methanol und Wasser.

Die Verbindungen der Formel (VI) sind bekannt oder können hergestellt werden, indem Ver¬ bindungen der Formel

worin R , R , R , R , R und R die oben angegebene Bedeutung haben,

in der ersten Stufe mit Säuren, wie für die zweite Stufe der Verfahren [A] und [B] beschrieben, und in der zweiten Stufe mit Basen umgesetzt werden.

In der zweiten Stufe erfolgt die Umsetzung mit Basen im Allgemeinen in einem Lösungsmitteln, bevorzugt in einem Temperaturbereich von 00C bis 4O0C bei Normaldruck.

Basen sind beispielsweise Alkalihydroxide wie Natrium- oder Kaliumhydroxid, oder Alkalicarbo- nate wie Cäsiumcarbonat, Natrium- oder Kaliumcarbonat, oder andere Basen wie DBU, Triethyl- amin oder Diisopropylethylamin, bevorzugt ist Triethylamin. Lösungsmittel sind beispielsweise Halogenkohlenwasserstoffe wie Chloroform, Methylenchlorid oder 1,2-Dichlorethan, oder Tetrahydrofuran, oder Gemische der Lösungsmittel, bevorzugt ist Methylenchlorid oder Tetrahydrofuran.

Die Verbindungen der Formel (VE) sind bekannt oder können hergestellt werden, indem Verbin- düngen der Formel

worin R1, R2, R4, R5, R6 und R23 die oben angegebene Bedeutung haben,

mit Pentafluorphenol in Gegenwart von Dehydratisierungsreagenzien, wie für die erste Stufe der Verfahren [A] und [B] beschrieben, umgesetzt werden.

Die Umsetzung erfolgt bevorzugt mit DMAP und EDC in Dichlormethan in einem Temperaturbe¬ reich von -400C bis 4O0C bei Normaldruck.

Die Verbindungen der Formel (VIII) sind bekannt oder können hergestellt werden, indem Verbin¬ dungen der Formel

worin R1, R2, R4, R5, R6 und R23 die oben angegebene Bedeutung haben,

mit Fluorid, insbesondere mit Tetrabutylammoniumfluorid, umgesetzt werden. Die Umsetzung erfolgt im Allgemeinen in einem Lösungsmitteln, bevorzugt in einem Tempera¬ turbereich von -1O0C bis 300C bei Normaldruck.

Inerte Lösungsmittel sind beispielsweise Halogenkohlenwasserstoffe wie Dichlormethan, oder Kohlenwasserstoffe wie Benzol oder Toluol, oder Ether wie Tetrahydrofuran oder Dioxan, oder Dimethylformamid. Ebenso ist es möglich, Gemische der Lösemittel einzusetzen. Bevorzugte Lösungsmittel sind Tetrahydrofuran und Dimethylformamid.

Die Verbindungen der Formel (TX) sind bekannt oder können hergestellt werden, indem Verbin¬ dungen der Formel

worin R2, R4, R5 und R23 die oben angegebene Bedeutung haben,

mit Verbindungen der Formel

worin R1 und R6 die oben angegebene Bedeutung haben,

in Gegenwart von Dehydratisierungsreagenzien, wie für die erste Stufe der Verfahren [A] und [B] beschrieben, umgesetzt werden.

Die Verbindungen der Formel (X) sind bekannt oder können analog den im Beispielteil beschrie¬ benen Verfahren hergestellt werden.

Die Verbindungen der Formel (XI) sind bekannt oder können analog bekannten Verfahren herge¬ stellt werden. Die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen kann durch folgendes Syntheseschema ver¬ deutlicht werden: Synthese von Biphenomycin A-Derivaten am Beispiel von (7R,8S,11S,14S)-14- Amino-N-(2-aminoethyl)-l l-[(2R)-3-amino-2-hydroxypropyl]-5,7,17-trihydroxy-10,13-dio xo-9,12- diazatricyclofl 4.3.1.12>6]henicosa- 1 (20),2(21 ),3 ,5, 16, 18-hexaen-8-carboxamid-Trihydrochlorid

Die erfindungsgemäßen Verbindungen zeigen ein nicht vorhersehbares, wertvolles pharmakologi¬ sches und pharmakokinetisches Wirkspektrum.

Sie eignen sich daher zur Verwendung als Arzneimittel zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Krankheiten bei Menschen und Tieren.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können aufgrund ihrer pharmakologischen Eigenschaften allein oder in Kombination mit anderen Wirkstoffen zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Infektionskrankheiten, insbesondere von bakteriellen Infektionen, eingesetzt werden.

Beispielsweise können lokale und/oder systemische Erkrankungen behandelt und/oder verhindert werden, die durch die folgenden Erreger oder durch Mischungen der folgenden Erreger verursacht werden:

Gram-positive Kokken, z.B. Staphylokokken (Staph. aureus, Staph. epidermidis) und Streptokokken (Strept. agalactiae, Strept. faecalis, Strept. pneumoniae, Strept. pyogenes); gram-negative Kokken (neisseria gonorrhoeae) sowie gram-negative Stäbchen wie Enterobakteriaceen, z.B. Escherichia coli, Hämophilus influenzae, Citrobacter (Citrob. freundii, Citrob. divernis), Salmonella und Shigella; ferner Klebsiellen (Klebs. pneumoniae, Klebs. oxytocy), Enterobacter (Ent. aerogenes, Ent. agglomerans), Hafnia, Serratia (Serr. marcescens), Proteus (Pr. mirabilis, Pr. rettgeri, Pr. vulgaris), Providencia, Yersinia, sowie die Gattung Acinetobacter. Darüber hinaus umfaßt das antibakterielle Spektrum die Gattung Pseudomonas (Ps. aeruginosa, Ps. maltophilia) sowie strikt anaerobe Bakterien wie z.B. Bacteroides fragilis, Vertre- ter der Gattung Peptococcus, Peptostreptococcus sowie die Gattung Clostridium; ferner My¬ koplasmen (M. pneumoniae, M. hominis, M. urealyticum) sowie Mykobakterien, z.B. Mycobacte¬ rium Tuberculosis.

Die obige Aufzählung von Erregern ist lediglich beispielhaft und keineswegs beschränkend aufzu¬ fassen. Als Krankheiten, die durch die genannten Erreger oder Mischinfektionen verursacht und durch die erfindungsgemäßen topisch anwendbaren Zubereitungen verhindert, gebessert oder geheilt werden können, seien beispielsweise genannt:

Infektionskrankheiten beim Menschen wie z. B. septische Infektionen, Knochen- und Gelenk¬ infektionen, Hautinfektionen, postoperative Wundinfektionen, Abszesse, Phlegmone, Wundinfek¬ tionen, infizierte Verbrennungen, Brandwunden, Infektionen im Mundbereich, Infektionen nach Zahnoperationen, septische Arthritis, Mastitis, Tonsillitis, Genital-Infektionen und Augeninfektio¬ nen. Außer beim Menschen können bakterielle Infektionen auch bei anderen Spezies behandelt werden. Beispielhaft seien genannt:

Schwein: Coli-diarrhoe, Enterotoxamie, Sepsis, Dysenterie, Salmonellose, Metritis-Mastitis-Aga- laktiae-Syndrom, Mastitis;

Wiederkäuer (Rind, Schaf, Ziege): Diarrhoe, Sepsis, Bronchopneumonie, Salmonellose, Pasteurellose, Mykoplasmose, Genitalinfektionen;

Pferd: Bronchopneumonien, Fohlenlähme, puerperale und postpuerperale Infektionen, Salmonel¬ lose;

Hund und Katze: Bronchopneumonie, Diarrhoe, Dermatitis, Otitis, Harnwegsinfekte, Prostatitis;

Geflügel (Huhn, Pute, Wachtel, Taube, Ziervögel und andere): Mycoplasmose, E. coli-Infektionen, chronische Luftwegserkrankungen, Salmonellose, Pasteurellose, Psittakose.

Ebenso können bakterielle Erkrankungen bei der Aufzucht und Haltung von Nutz- und Zierfϊschen behandelt werden, wobei sich das antibakterielle Spektrum über die vorher genannten Erreger hinaus auf weitere Erreger wie z.B. Pasteurella, Brucella, Campylobacter, Listeria, Erysipelothris, Corynebakterien, Borellia, Treponema, Nocardia, Rikettsie, Yersinia, erweitert.

Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist der Einsatz der erfindungsgemäßen Verbin¬ dungen zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Erkrankungen, vorzugsweise von bakteriellen Krankheiten, insbesondere von bakteriellen Infektionen.

Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Erkrankungen, insbesondere der zuvor genannten Erkrankungen.

Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Er¬ krankungen, insbesondere der zuvor genannten Erkrankungen.

Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Behandlung und/oder Pro¬ phylaxe von Erkrankungen, insbesondere der zuvor genannten Erkrankungen, unter Verwendung einer antibakteriell wirksamen Menge der erfindungsgemäßen Verbindungen.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können systemisch und/oder lokal wirken. Zu diesem Zweck können sie auf geeignete Weise appliziert werden, wie z.B. oral, parenteral, pulmonal, nasal, sublingual, lingual, buccal, rectal, dermal, transdermal, conjunctivae otisch oder als Implantat bzw. Stent.

Für diese Applikationswege können die erfindungsgemäßen Verbindungen in geeigneten Applika¬ tionsformen verabreicht werden.

Für die orale Applikation eignen sich nach dem Stand der Technik funktionierende schnell und/oder modifiziert die erfindungsgemäßen Verbindungen abgebende Applikationsformen, die die erfindungsgemäßen Verbindungen in kristalliner und/ oder amorphisierter und/oder gelöster Form enthalten, wie z.B. Tabletten (nichtüberzogene oder überzogene Tabletten, beispielsweise mit magensaftresistenten oder sich verzögert auflösenden oder unlöslichen Überzügen, die die Freisetzung der erfindungsgemäßen Verbindung kontrollieren), in der Mundhöhle schnell zerfal¬ lende Tabletten oder Filme/Oblaten, Filme/Lyophylisate, Kapseln (beispielsweise Hart- oder Weichgelatinekapseln), Dragees, Granulate, Pellets, Pulver, Emulsionen, Suspensionen, Aerosole oder Lösungen.

Die parenterale Applikation kann unter Umgehung eines Resorptionsschrittes geschehen (z.B. intravenös, intraarteriell, intrakardial, intraspinal oder intralumbal) oder unter Einschaltung einer Resorption (z.B. intramuskulär, subcutan, intracutan, percutan oder intraperitoneal). Für die parenterale Applikation eignen sich als Applikationsformen u.a. Injektions- und Infusionszuberei¬ tungen in Form von Lösungen, Suspensionen, Emulsionen, Lyophilisaten oder sterilen Pulvern.

Für die sonstigen Applikationswege eignen sich z.B. Inhalationsarzneiformen (u.a. Pulverinhalato- ren, Nebulizer), Nasentropfen, -lösungen, -sprays; lingual, sublingual oder buccal zu applizierende Tabletten, Filme/Oblaten oder Kapseln, Suppositorien, Ohren- oder Augenpräparationen, Vaginal¬ kapseln, wässrige Suspensionen (Lotionen, Schüttelmixturen), lipophile Suspensionen, Salben, Cremes, transdermale therapeutische Systeme (wie beispielsweise Pflaster), Milch, Pasten, Schäume, Streupuder, Implantate oder Stents.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in die angeführten Applikationsformen überführt werden. Dies kann in an sich bekannter Weise durch Mischen mit inerten, nichttoxischen, pharma¬ zeutisch geeigneten Hilfsstoffen geschehen. Zu diesen Hilfsstoffen zählen u.a. Trägerstoffe (bei¬ spielsweise mikrokristalline Cellulose, Laktose, Mannitol), Lösungsmittel (z.B. flüssige Polyethylenglycole), Emulgatoren und Dispergier- oder Netzmittel (beispielsweise Natriumdode- cylsulfat, Polyoxysorbitanoleat), Bindemittel (beispielsweise Polyvinylpyrrolidon), synthetische und natürliche Polymere (beispielsweise Albumin), Stabilisatoren (z.B. Antioxidativen wie bei¬ spielsweise Ascorbinsäure), Farbstoffe (z.B. anorganische Pigmente wie beispielsweise Eisen¬ oxide) und Geschmacks- und / oder Geruchskorrigentien. Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Arzneimittel, die mindestens eine erfin¬ dungsgemäße Verbindung, üblicherweise zusammen mit einem oder mehreren inerten, nichttoxischen, pharmazeutisch geeigneten Hilfsstoffen enthalten, sowie deren Verwendung zu den zuvor genannten Zwecken.

Im Allgemeinen hat es sich als vorteilhaft erwiesen, bei parenteraler Applikation Mengen von etwa 5 bis 250 mg/kg Körpergewicht je 24 h zur Erzielung wirksamer Ergebnisse zu verabreichen. Bei oraler Applikation beträgt die Menge etwa 5 bis 100 mg/kg Körpergewicht je 24 h.

Trotzdem kann es gegebenenfalls erforderlich sein, von den genannten Mengen abzuweichen, und zwar in Abhängigkeit von Körpergewicht, Applikationsweg, individuellem Verhalten gegenüber dem Wirkstoff, Art der Zubereitung und Zeitpunkt bzw. Intervall, zu welchem die Applikation erfolgt. So kann es in einigen Fällen ausreichend sein, mit weniger als der vorgenannten Mindest¬ menge auszukommen, während in anderen Fällen die genannte obere Grenze überschritten werden muss. Im Falle der Applikation größerer Mengen kann es empfehlenswert sein, diese in mehreren Einzelgaben über den Tag zu verteilen.

Die Prozentangaben in den folgenden Tests und Beispielen sind, sofern nicht anders angegeben, Gewichtsprozente; Teile sind Gewichtsteile. Lösungsmittelverhältnisse, Verdünnungsverhältnisse und Konzentrationsangaben von flüssig/flüssig-Lösungen beziehen sich jeweils auf das Volumen. A. Beispiele

Verwendete Abkürzungen:

Aloe Allyloxycarbonyl aq. wässrig Äquiv. Äquivalent Bn Benzyl Boc ter/-Butoxycarbonyl CDCl3 Chloroform CH Cyclohexan d Dublett (im 1H-NMR) dd Dublett von Dublett DCM Dichlormethan DCC Dicyclohexylcarbodiimid DIC Diisopropylcarbodiimid DIPEA Diisopropylethylamin DMSO Dimethylsulfoxid DMAP 4-NN-Dimethylammopyridin DMF Dimethylformamid d. Th. der Theorie EDC N'-(3-Dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimid x HCl EE Ethylacetat (Essigsäureethylester) ESI Elektrospray-Ionisation (bei MS) ges. gesättigt HATU <3-(7-Azabenzotriazol- 1 -yl)-N,N,N' N'-tetramethyluronium- hexafluorophosphat HBTU O-(Benzotriazol-l-yl)-N,N,N'N'-tetramethyluronium- hexafluorophosphat HOBt 1-Hydroxy-lH-benzotriazol x H2O h Stunde(n) HPLC Hochdruck-, Hochleistungsflüssigchromatographie konz. konzentriert LC-MS Flüssigchromatographie-gekoppelte Massenspektroskopie m Multiple« (im 1H-NMR) min Minuten MS Massenspektroskopie MeOH Methanol NMR Kernresonanzspektroskopie MTBE Methyl-tert-burylether Pd/C Palladium/Kohle proz. Prozent q Quartett (im 1H-NMR) Rf Retentionsindex (bei DC) RT Raumtemperatur Rt Retentionszeit (bei HPLC) S Singulett (im 1H-NMR) t Triplett (im 1H-NMR) TBS tert-Butyldimethylsilyl THF Tetrahydrofuran TMSE 2-(Trimethylsilyl)-ethyl TPTU 2-(2-Oxo- 1 (2H)-pyridy I)- 1,1,3,3 -tetramethy luroniumtetrafluoroborat Z Benzyloxycarbonyl

LC-MS- und HPLC-Methodea:

Methode 1 (HPLC): Instrument: HP 1100 mit DAD-Detektion; Säule: Kromasil RP-18, 60 mm x 2.1 mm, 3.5 μm; Eluent A: 5 ml Perchlorsäure/l Wasser, Eluent B: Acetonitril; Gradient: 0 min 2%B, 0.5 min 2%B, 4.5 min 90%B, 9 min 90%B, 9.2 min 2%B, 10 min 2%B; Fluss: 0.75 ml/min; Ofen: 3O0C; UV-Detektion: 210 nm.

Methode 2 (GC-MS): Instrument: Micromass GCT, GC6890; Säule: Restek RTX-35MS, 30 m x 250 μm x 0.25 μm; konstanter Fluss mit Helium: 0.88 ml/min; Ofen: 6O0C; Inlet: 25O0C; Gradient: 600C (0.30 min halten), 50°C/min → 1200C, 16°C/min → 2500C, 30°C/min → 3000C (1.7 min halten).

Methode 3 (HPLC): Instrument: HP 1100 mit DAD-Detektion; Säule: Kromasil RP-18, 60 mm x 2.1 mm, 3.5 μm; Eluent A: 5 ml Perchlorsäure/l Wasser, Eluent B: Acetonitril; Gradient: 0 min 2%B, 0.5 min 2%B, 4.5 min 90%B, 6.5 min 90%B, 6.7 min 2%B, 7.5 min 2%B; Fluss: 0.75 ml/min; Ofen: 300C; UV-Detektion: 210 nm.

Methode 4 (LC-MS): Gerätetyp MS: Micromass ZQ; Gerätetyp HPLC: Waters Alliance 2795; Säule: Phenomenex Synergi 2μ Hydro-RP Mercury 20 mm x 4mm; Eluent A: 1 1 Wasser + 0.5 ml 50%ige Ameisensäure, Eluent B: 1 1 Acetonitril + 0.5 ml 50%ige Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 90%A -> 2.5 min 30%A -> 3.0 min 5%A -> 4.5 min 5%A; Fluss: 0.0 min 1 ml/min, 2.5 min/3.0 min/4.5 min 2 ml/min; Ofen: 500C; UV-Detektion: 210 nm.

Methode 5 (LC-MS): Gerätetyp MS: Micromass ZQ; Gerätetyp HPLC: HP 1100 Series; UV DAD; Säule: Phenomenex Synergi 2μ Hydro-RP Mercury 20 mm x 4 mm; Eluent A: 1 1 Wasser + 0.5 ml 50%ige Ameisensäure, Eluent B: 1 1 Acetonitril + 0.5 ml 50%ige Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 90%A -» 2.5 min 30%A -> 3.0 min 5%A -» 4.5 min 5%A; Fluss: 0.0 min 1 ml/min, 2.5 min/3.0 min/4.5 min. 2 ml/min; Ofen: 5O0C; UV-Detektion: 210 nm.

Methode 6 (LC-MS): Instrument: Micromass Quattro LCZ mit HPLC Agilent Serie 1100; Säule: Phenomenex Synergi 2μ Hydro-RP Mercury 20 mm x 4 mm; Eluent A: 1 1 Wasser + 0.5 ml 50%ige Ameisensäure, Eluent B: 1 1 Acetonitril + 0.5 ml 50%ige Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 90%A -> 2.5 min 30%A -> 3.0 min 5%A -> 4.5 min 5%A; Fluss: 0.0 min 1 ml/min, 2.5 min/3.0 min/4.5 min 2 ml/min; Ofen: 500C; UV-Detektion: 208- 400 nm.

Methode 7 (LC-MS): Instrument: Micromass Platform LCZ mit HPLC Agilent Serie 1100; Säule: Thermo HyPURITY Aquastar 3μ 50 mm x 2.1 mm; Eluent A: 1 1 Wasser + 0.5 ml 50%ige Ameisensäure, Eluent B: 1 1 Acetonitril + 0.5 ml 50%ige Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 100%A -> 0.2 min 100%A -> 2.9 min 30%A -> 3.1 min 10%A ■* 5.5 min 10%A; Ofen: 500C; Fluss: 0.8 ml/min; UV-Detektion: 210 nm.

Methode 8 (HPLC mit chiraler Phase): Säule: Packungsmaterial Chiraler Kieselgelselektor KBD 5287 (250 mm x 4.6 mm) basierend auf dem Selektor Poly(N-methacryloyl-L-leucin- dicyclopropylmethylamid); Eluent: Methyl-tert-butylether; Temperatur: 24°C; Fluß: 1 ml/min.

Methode 9 (HPLC mit chiraler Phase): Säule: Packungsmaterial Chiraler Kieselgelselektor KBD 5326 (600 mm x 40 mm) basierend auf dem Selektor Poly(N-methacryloyl-L-leucin- dicyclopropylmethylamid); Eluent A: Methyl-tert-butylether, Eluent B: Tetrahydrofuran; Gradient: 0.0 min 100%A -» 45 min 100%A -> 55 min 100%B; Temperatur: 240C; Fluß: 50 ml/min.

Methode 10 (LC-MS): Gerätetyp MS: Micromass ZQ; Gerätetyp HPLC: Waters Alliance 2790; Säule: Grom-Sil 120 ODS-4 HE 50 mm x 2 mm, 3.0 μm; Eluent A: Wasser + 500 μl 50%ige Ameisensäure / 1, Eluent B: Acetonitril + 500 μl 50%ige Ameisensäure / 1; Gradient: 0.0 min 70%B -> 4.5 min 90%B; Ofen: 45°C; Fluss: 0.8 ml/min; UV-Detektion: 210 nm.

Präparative RP-HPLC: Säule: YMC Gel ODS-AQ S-5 / 15 μM, 250 mm x 30 mm, Eluent A: Wasser, Eluent B: Acetonitril; Gradient: 0.00 min 5%B -> 3.00 min 5%B -> 35.0 min 95%B -> 46.0 min 95%B; Temp.: Raumtemperatur; Fluss: 50 ml/min; UV-Detektion. Chemische Synthese der Beispiele

Synthese der Ausgangsverbindungen:

Synthese von substituierten beta-Hydroxyphenylalaninderivaten am Beispiel von Methyl-(betaR)- 2-(benzy loxy)-5-brom-N-(tert-butoxycarbonyl)-beta- { [tert-butyl(dimethyl)silyl] oxy } -L- phenylalaninat

Synthese von geschützten Biphenyl-bisaminosäuren am Beispiel von Methyl-(2S,3R)-3-(4,4'- bis(benzyloxy)-3'-{(2S)-2-{[(benzyloxy)carbonyl]amino}-3-oxo -3-[2-(trimethylsilyl)ethoxy]- propyl}biphenyl-3-yl)-2-[(/e^-butoxycarbonyl)amino]-3-{[/er/ -butyl(dimethyl)silyl]oxy}propan

Ausgangsverbindungen

Beispiel IA

Benzyl-2-(benzyloxy)-5-brombenzoat

Zu einer Lösung von 40 g (0.184 mol) 5-Brom-2-hydroxybenzoesäure in 500 ml wasserfreiem Di- methylformamid werden 62 ml (0.46 mol) Benzylbromid und 76 g (0.553 mol) Kaliumcarbonat gegeben. Nach 16 h Rühren bei 85°C wird die abgekühlte Mischung filtriert und das Filtrat wird im Vakuum zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wird in Essigsäureethylester aufgenommen und mehrmals mit Wasser gewaschen. Die organische Phase wird über Natriumsulfat getrocknet, das Lösungsmittel im Vakuum eingedampft und der Rückstand aus Petrolether umkristallisiert.

Ausbeute: 58 g (79% d. Th.), Feststoff

HPLC (Methode 1): R4 = 5.81 min.

MS (DCI(NH3)): m/z = 414 (M+NK,)"1".

1H-NMR (300 MHz, d6-DMSO): δ = 5.2 (s, 2H), 5.3 (s, 2H), 7.23 (d, IH), 7.25-7.45 (m, 10H), 7.70 (dd, IH), 7.8 (d, IH).

Beispiel 2A

2-(Benzyloxy)-5-brombenzoesäure

Darstellung siehe Collect. Czech. Chem. Commun., 1976, 41, 3384-3387. 30.6 g (77 mmol) Benzyl-2-(benzyloxy)-5-brombenzoat (Beispiel IA) werden in 450 ml THF / Wasser (1 :1) gelöst und mit 77 ml IN Natriumhydroxid-Lösung versetzt. Das Reaktionsgemisch wird 24 h bei 8O0C gerührt. Im Vakuum wird auf ein Volumen von 100 ml eingeengt und mit Diethylether extrahiert. Die wässrige Phase wird abgetrennt, mit IN Salzsäure auf pH 1 gestellt und mehrmals mit Essigsäureethylester extrahiert. Die organische Phase wird über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum zur Trockne eingeengt.

Ausbeute: 21 g (89% d. Th.), Feststoff

GC-MS (Methode 2): R1 = 12.90 min,

MS (EI+): m/z = 306 (M)+.

1H-NMR (400 MHz, d6-DMSO): δ = 5.21 (s, 2H), 7.17 (d, IH), 7.31 (mc, IH), 7.38 (mc, 2H), 7.47 (mc, 2H), 7.64 (dd, IH), 7.73 (d, IH), 13.05 (br. s, IH).

Beispiel 3A

Methyl-2-(benzyloxy)-5-brom-N-(^er?-butoxycarbonyl)-beta- oxophenylalaninat

Zu einer auf 00C gekühlten Lösung 1 von 17.5 g (57 mmol) 2-(Benzyloxy)-5-brombenzoesäure (Beispiel 2A) in 80 ml absolutem Dichlormethan werden unter Argon 18.8 ml (0.143 mmol) l-Chlor-N,N,2-trimethylpropenylamin zugegeben. Es wird 1 h bei O0C gerührt. In einem zweiten Kolben werden unter Argon 26.6 g (0.114 mmol) Methyl-N-(ter7-butoxycarbonyl)-3-oxoserinat (Darstellung siehe Synthesis, 1992, 1248-1254) in 770 ml absolutem THF bei -7O0C mit 143 ml (228 mmol) einer 1.6M Lösung von n-Butyllithium in Hexan versetzt und für 20 min gerührt. Anschließend wird bei -700C das in Lösung 1 erzeugte Säurechlorid langsam zugetropft. Nach beendeter Zugabe wird langsam auf RT erwärmt und weitere 24 h intensiv gerührt. Die Lösungsmittel werden im Vakuum eingedampft, der Rückstand wird in Essigsäureethylester aufgenommen und nacheinander mit eisgekühlter 0.5%iger Schwefelsäure und IN Kalium- hydrogencarbonat-Lösung gewaschen. Die organische Phase wird über Magensiumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel wird im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird säulen- chromatographisch an Kieselgel 60 gereinigt (Cyclohexan:Essigsäureethylester 20:1). Ausbeute: 19 g (70% d. Th.), Feststoff

HPLC (Methode 3): R4 = 5.26 min.

MS (DCI(NH3)): m/z = 495 (M+NH4)+.

1H-NMR (400 MHz, d6-DMSO): δ = 1.35 (s, 9H), 3.54 (s, 3H), 5.25 (s, 2H), 5.68 (d, IH), 7.2 (d, IH), 7.3-7.5 (m, 5H), 7.65-7.78 (m, 3H).

Beispiel 4A

Methyl-2-(benzyloxy)-5-brom-N-(/ert-butoxycarbonyl)-beta- hydroxyphenylalaninat

Unter Argon werden 2.1 ml einer IM Lösung (S)-2-Methyl~CBS-oxazaborolidin in 25 ml Tetrahydrofuran vorgelegt und mit 4.8 ml (27 mmol) Boran-NN-diethylanilin-Komplex versetzt. Nach 30 min Rühren bei RT werden bei 00C 10 g (20.9 mmol) Methyl-2-(benzyloxy)-5-brom-N- (fert-butoxycarbonyl)-beta-oxophenylalaninat (Beispiel 3A) gelöst in 25 ml THF zugetropft. Nach beendeter Zugabe wird die Lösung unter langsamem Erwärmen auf RT 16 h gerührt. Anschließend tropft man 15 ml Methanol langsam hinzu und engt im Vakuum ein. Der Rückstand wird chromatographisch an einer präparativen RP-HPLC gereinigt. Das Produkt liegt als threo / erythro Gemisch (1:5) vor. Der Enantiomerenüberschuss (ee) beträgt jeweils 55%, ermittelt durch analytische HPLC an chiraler Phase (Methode 8).

Ausbeute: 5.1 g (51% d. Th.)-

threo-Isomer:

LC-MS (Methode 4): Rt = 2.59 min

MS (ESI): m/z = 480 (M+H)+.

1H-NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 1.3 (s, 9H), 2.66 (br, s, IH), 3.75 (s, 3H), 4.77 (br. d, IH), 5.14 (mc, 2H), 5.25 (br. s, IH), 5.58 (br. s, IH), 6.8 (d, 1 H), 7.28-7.50 (m, 6 H), 7.55 (d, IH). erythro-Isomer:

LC-MS (Methode 4): R4 = 2.57 min

MS (ESI): m/z = 480 (M+H)+.

1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 1.43 (s, 9H), 3.40 (s, 3H), 4.49 (br. d, IH), 4.71 (br. m, IH), 5.05

(mc, 2H), 5.34 (br. m, IH), 5.40 (br. m, IH), 6.77 (d, 1 H), 7.28-7.45 (m, 6 H), 7.47 (d, IH).

Beispiel 5A

Methyl-(betaR)-2-(benzyloxy)-5-brom-N-(/ert-butoxycarbony l)-beta-hydroxy-L-phenylalaninat

Die Verbindung aus Beispiel 4A wird als Isomerengemisch durch Chromatographie an einer chiralen stationären Phase (Methode 9) in die vier Diastereomere getrennt. Die Zielverbindung

wird als dritte Fraktion eluiert.

LC-MS (Methode 6): R1 = 2.75 min

MS (ESI): m/z = 480 (M+H)+.

Beispiel 6A

Methy l-(betaR)-2-(benzyloxy)-5-brom-N-(fe^-butoxycarbonyl)-beta- { |/ert-butyl(dimethyl)sily]]-

oxy}-L-phenylalaninat

Eine Lösung von 200 mg (0.416 mmol) Methyl-(betaR)-2-(benzyloxy)-5-brom-N-(tert- butoxycarbonyl)-beta-hydroxy-L-phenylalaninat (Beispiel 5A) in 2.5 ml DMF wird bei 00C mit 220 mg (0.832 mmol) Trifluormethansulfonsäure-^er^-butyldimethylsilylester, 0.084 mg (0.832 mmol) Triethylamin und 1 mg (0.42 mmol) 4-Dimethylaminopyridin versetzt und nach Aufwärmen auf RT für 24 Stunden gerührt. Die Reaktionsmischung wird mit Dichlormethan versetzt und nacheinander mit IN Νatriumhydrogencarbonatlösung und Wasser gewaschen. Die vereinigten organischen Phasen werden über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert, eingeengt und im Vakuum getrocknet. Das Rohprodukt wird chromatographisch gereinigt (RP-HPLC, Laufmittel Gradient aus Acetonitril / Wasser).

Ausbeute: 140 mg (57% d. Th.)

LC-MS (Methode 5): R4 = 3.51 min

MS (ESI): m/z = 595 (M+H)+.

1H-NMR (300 MHz, CDCl3): δ = -0.15 (s, 3H), -0.7 (s, 3H), 0.87 (s, 9H), 1.29 (s, 9H), 3.72 (s, 3H), 4.7 (dd, IH), 5.0-5.3 (m, 3H), 5.68 (d, IH), 6.76 (d, 1 H), 7.25-7.50 (m, 7 H).

Beispiel 7A

2-(Trimethylsilyl)ethyl-2-(benzyloxy)-N-[(benzyloxy)carbo nyl]-5-(4,4,5,5-tetramethyl-l,3,2- dioxaborolan-2-yl)-L-phenylalaninat

Zu einer Lösung aus 2.0 g (3.17 mmol) 2(θ)-Benzyloxycarbonylamino-3-(2-benzyloxy-5-iod- phenyl)-propionsäure-(2-trimethylsilyl)-ethylester (Beispiel I IA aus WO03/106480) in 30 ml DMSO werden 0.923 g (9.5 mmol) Kaliumacetat zugegeben. Die Mischung wird deoxygeniert, indem durch die kräftig gerührte Lösung 15 min lang Argon durchgeleitet wird. Dann werden 0.924 g (3.64 mmol) 4,4,4',4',5,5,5',5'-Octamethyl-2,2'-bi-l,3,2-dioxaborolan und 0.116 g (0.160 mmol, 0.05 Äquivalente) Bis-(diphenylphosphino)ferrocenpalladium(II)chlorid zugegeben. Unter leichtem Argonstrom wird auf 8O0C erhitzt und nach 6 h wieder abgekühlt. Die Mischung wird über Silicagel (Laufmittel: Dichlormethan) filtriert. Der Rückstand wird säulen- chromatographisch an Silicagel (Laufmittel: Cyclohexan:Ethylacetat 4:1) gereinigt.

Ausbeute: 1.12 g (56% d. Th.)

LC-MS (Methode 10): R4 = 3.02 min.

MS (EI): m/z = 632 (M+H)+

1H-NMR (200 MHz, CDCl3): δ = 0.92 (dd, 2H), 1.31 (s, 12H), 2.95-3.95 (m, 2H), 4.11 (mc, 2H), 4.55 (11 (mc, IH), 4.99 (s, 2H), 5.08 (s, 2H), 5.53 (d, IH), 6.90 (d, IH), 7.15-7.47 (m, 10H), 7.58 (d, IH), 7.67 (dd, IH).

Beispiel 8A

Methyl-(2S,3R)-3-(4,4'-bis(benzyloxy)-3l-{(2S)-2-{[(benzy loxy)carbonyl]amino}-3-oxo-3-[2- (trimethylsilyl)ethoxy]propyl}biphenyl-3-yl)-2-[(^ert-butoxy carbonyl)amino]-3-{[^er?-butyl- (dimethyl)sily 1] oxy } propanoat

Eine Lösung von 2.0 g (3.36 mmol) Methyl-(betaR)-2-(benzyloxy)-5-brom-N-(tert-butoxy- carbonyl)-beta-{[fert-butyl(dimethyl)silyl]oxy}-L-phenylalan inat (Beispiel 6A) und 2.92 g (3.70 mmol) 2-(Trimethylsilyl)ethyl-2-(benzyloxy)-N-[(benzyloxy)carbonyl ]-5-(4,4,5,5-tetra- methyl-l,3,2-dioxaborolan-2-yl)-L-phenylalaninat (Beispiel 7A) in 16 ml l-Methyl-2-pyrrolidon wird inertisiert und mit Argon gesättigt (ca. 30 min Argon durchleiten). Anschließend gibt man 250 mg (0.34 mmol) Bis(diphenylphosphino)ferrocen-palladium(II)chlorid (PdCl2(dppf)), 2.19 g (6.73 mmol) Cäsiumcarbonat und 0.8 ml Wasser hinzu. Das Reaktionsgemisch wird mit Argon leicht überströmt und für 3 h bei 50°C gerührt. Die Mischung wird abgekühlt, in Essigsäureethylester aufgenommen und nacheinander mit gesättigter Νatriumchlorid-Lösung und Wasser gewaschen. Die organische Phase wird über Magensiumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel wird im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird säulenchromatographisch an Kieselgel gereinigt (CyclohexanrEssigsäureethylester Gradient: 15:1— »10:1) und anschließend in Methanol ausgerührt. Der entstandene Feststoff wird abfiltriert und im Hochvakuum getrocknet.

Ausbeute: 2.77 g (77% d. Th.).

LC-MS (Methode 5): R, = 3.75 min

MS (EI): m/z = 1019 (M+H)+.

1H-NMR (300 MHz, CDCl3): δ = -0.11 (s, 3H), 0.00 (m, 12H), 0.8-0.95 (m, HH), 1.17 (s, 9H), 3.0-3.3 (m, 2H), 3.75 (s, 3H), 4.0-4.25 (m, 2H)5 4.52-4.65 (m, IH), 4.77 (mc, IH), 4.92-5.3 (m, 7H), 5.52-5.65 (m, IH), 5.77 (d, IH), 6.85-6.97 (m, 2H), 7.19-7.46 (m, 16H), 7.48-7.65 (m, 3H).

Beispiel 9A

Methyl-(2S,3R)-2-amino-3-(4,4'-bis(benzyloxy)-3'-{(2S)-2- {[(ben2yloxy)carbonyl]amino}-3-oxo- 3-[2-(trimethylsilyl)ethoxy]propyl}biρhenyl-3-yl)-3-{[fert- butyl(dimethyl)silyl]oxy}propanoat Hydrochlorid

Zu einer auf 00C gekühlten Lösung von 1.64 g (1.61 mmol) Methyl-(2S,3R)-3-(4,4'- bis(benzyloxy)-3'-{(2S)-2-{[(benzyloxy)carbonyl]amino}-3-oxo -3-[2-(trimethylsilyl)ethoxy]- propyl}biphenyl-3-yl)-2-[(^ert-butoxycarbonyl)amino]-3-{[ter t-butyl(dimethyl)silyl]oxy}propanoat (Beispiel 8A) in 5 ml wasserfreiem Dioxan werden 30 ml einer 4M Chlorwasserstoff-Dioxan- Lösung über ca. 20 min hinzugegeben. Nach 3 h Rühren wird das Lösungsmittel im Vakuum eingedampft, das Rohprodukt im Hochvakuum getrocknet und ohne weitere Reinigung für nachfolgende Synthesen eingesetzt.

Ausbeute: quant.

LC-MS (Methode 4): R. = 3.24 min.

MS (EI): m/z = 919 (M-HC1+H)+. Beispiel IQA

Methyl-(2S,3R)-2-[((2S,4R)-5-{[(benzyloxy)carbonyl]amino} -2-[(^^-butoxycarbonyl)amino]-4- {[^r^-butyl(dimethyl)silyl]oxy}pentanoyl)amino]-3-(4,4'-bis( benzyloxy)-3'-{(2S)-2-{[(benzyl- oxy)carbonyl]amino}-3-oxo-3-[2-(trimethylsilyl)ethoxy]propyl }biphenyl-3-yl)-3-{[/erf-butyl(di- methyl)silyl]oxy}propanoat

Zu einer auf O0C gekühlten Lösung von 1.54 g (1.61 mmol) Methyl-(2S,3R)-2-amino-3-(4,4'- bis(benzyloxy)-3 '- {(2S)-2- { [(benzyloxy)carbony 1] amino } -3 -oxo-3 -[2-(trimethylsilyl)ethoxy]-pro- pyl}biphenyl-3-yl)-3-{[fe^butyl(dimethyl)silyl]oxy}propanoat Hydrochlorid (Beispiel 9A) und 0.88 g (1.77 mmol) 5-Benzyloxycarbonylammo-2(ιS)-te^butoxycarbonylamino-4(i?)- (tert- butyldimethylsilyloxy)-pentansäure (Beispiel 14A aus WO03/106480) in 25 ml wasserfreiem DMF werden 0.76 g (2.01 mmol) HATU und 0.58 g (4.5 mmol) N,N-Diisopropylethylamin hinzugegeben. Nach 30 min Rühren bei O0C werden zusätzliche 0.15 g (1.13 mmol) NN- Diisopropylethylamin hinzugegeben. Das Reaktionsgemisch wird 15 h bei RT gerührt. Das Lösungsmittel wird dann eingedampft und der Rückstand in Dichlormethan aufgenommen. Die organische Phase wird nacheinander mit Wasser, 0.2Ν Salzsäure und gesättigter wässriger Natriumchlorid-Lösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Das Rohprodukt wird säulenchromatographisch. an Kieselgel mit Dichlormethan/Essigsäureethylester (Gradient 30/l→20/l→2/l) gereinigt.

Ausbeute: 1.94 g (86% d. Th.)

LC-MS (Methode 4): R, = 3.98 min.

MS (EI): m/z = 1397 (M+H)+. Beispiel IIA

Methyl-(2S,3R)-2-({(2S)-3-{[(benzyloxy)carbonyl]amino}-2- [(terf-butoxycarbonyl)amino]- butanoyl}amino)-3-(4,4'-bis(benzyloxy)-3'-{(2S)-2-{[(benzylo xy)carbonyl]amino}-3-oxo-3-[2- (trimethylsilyl)ethoxy]propyl}biphenyl-3-yl)-3-{[fert-butyl( dimethyl)silyl]oxy}propanoat

Die Herstellung erfolgt analog Beispiel 1OA aus 0.352 g (0.37 mmol) Methyl-(2S,3R)-2-amino-3- (4,4'-bis(benzyloxy)-3'-{(2S)-2-{[(benzyloxy)carbonyl]ammo}- 3-oxo-3-[2-(trimethylsilyl)ethoxy]- propyl}biphenyl-3-yl)-3-{[fert-butyl(dimethyl)silyl]oxy}prop anoat Hydrochlorid (Beispiel 9A) und 142 mg (0.41 mmol) (2S)-4-{[(Benzyloxy)carbonyl]amino}-2-[(fe/"?-butoxycarbonyl )amino]- butancarbonsäure mit 154 mg (0.41 mmol) HATU und insgesamt 167 mg (1.29 mmol) Hünig-Base in 5 ml absolutem DMF.

Ausbeute: 412 mg (72% d. Th.)

LC-MS (Methode 4): Rt = 3.55 min.

MS (EI): m/z = 1253 (M+H)+.

Beispiel 12A

Methyl-(2S,3R)-2-({(2S)-5-{[(benzyloxy)carbonyl]amino}-2- [(fe^-butoxycarbonyl)amino]- pentanoyl}amino)-3-(4,4'-bis(benzyloxy)-3'-{(2S)-2-{[(benzyl oxy)carbonyl]amino}-3-oxo-3-[2- (trimethylsilyl)ethoxy]propyl}biphenyl-3-yl)-3-{[^rf-butyl(d imethyl)silyl]oxy}propanoat

Die Herstellung erfolgt analog Beispiel 1OA aus 0.98 g (1.02 mmol) Methyl-(2S,3R)-2-amino-3- (4,4'-bis(benzy loxy)-3 '- {(2S)-2- { [(benzy loxy)carbonyl] amino } -3 -oxo-3 -[2-(trimethylsily l)ethoxy]- propyl}biphenyl-3-yl)-3-{[ter^butyl(dimethyl)silyl]oxy}propa noat Hydrochlorid (Beispiel 9A) und 0.45 g (1.23 mmol) N5-[(Benzyloxy)carbonyl]-N2-(fer?-butoxycarbonyl)-L-ornithin mit 0.486 g (1.28 mmol) HATU und insgesamt 0.463 g (3.58 mmol) Hünig-Base in 16 ml absolutem DMF.

Ausbeute: 1.06 g (68% d. Th.)

LC-MS (Methode 4): R4 = 3.56 min.

MS (EI): m/z = 1267 (M+H)+.

Beispiel 13A

Methyl-(2S,3R)-2-({(2S)-3-{[(benzyloxy)carbonyl]amino}-2- [(?e^-butoxycarbonyl)amino]- hexanoyl}ammo)-3-(4,4'-bis(benzyloxy)-3'-{(2S)-2-{[(benzylox y)carbonyl]amino}-3-oxo-3-[2- (trimethylsilyl)ethoxy]propy 1 } biphenyl-3-yl)-3 - { [tert-butyl(dimethyl)sily 1] oxy } propanoat

Die Herstellung erfolgt analog Beispiel 10A aus 0.38g (0.40 mmol) Methyl-(2S,3R)-2-amino-3- (4,4'-bis(benzyloxy)-3'-{(2S)-2-{[(benzyloxy)carbonyl]amino} -3-oxo-3-[2-(trimethylsilyl)ethoxy]- propyl}biphenyl-3-yl)-3-{[?er/-butyl(dimethyl)silyl]oxy}prop anoat Hydrochlorid (Beispiel 9A) und 0.18 g (0.48 mmol) N5-[(Benzyloxy)carbonyl]-N2-(?e/-f-butoxycarbonyl)-L-lysin mit 0.188 g (0.50 mmol) HATU und insgesamt 0.180 g (1.39 mmol) Hünig-Base in 5 ml absolutem DMF.

Ausbeute: 0.63 g (78% d. Th.)

LC-MS (Methode 4): R1 = 3.57 min.

MS (EI): m/z = 1281 (M+H)+.

Beispiel 14A

(2S)-2-{[(Benzyloxy)carbonyl]amino}-3-{4,4'-bis(benzyloxy )-3'-[(lR,2S)-2-({(2S,4R)-5- {[(benzyloxy)carbonyl]amino}-2-[(ter^-butoxycarbonyl)amino]- 4-hydroxypentanoyl}amino)-l- hy droxy-3 -methoxy-3 -oxopropy 1] bipheny 1-3 -y 1 } Propionsäure

Zu einer Lösung von 183 mg (0.13 mmol) Methyl-(2S,3R)-2-[((2S,4R)-5-{[(benzyloxy)carbonyl]- amino}-2-[(ferf-butoxycarbonyl)amino]-4-{[terf-butyl(dimethy l)silyl]oxy}pentanoyl)amino]-3- (4,4'-bis(benzyloxy)-3'-{(2S)-2-{[(benzyloxy)carbonyl]amino} -3-oxo-3-[2-(trimethylsilyl)ethoxy]- propyl}biphenyl-3-yl)-3-{[^er^-butyl(dimethyl)silyl]oxy}prop anoat (Beispiel 10A) in 2.65 ml abso¬ lutem DMF werden bei RT tropfenweise 0.52 ml IN Tetrabutylammoniumfiuorid-Lösung in THF hinzugegeben. Nach 60 min bei RT wird auf O0C abgekühlt und mit Eiswasser versetzt. Es wird sofort mit Essigsäureethylester und etwas IN Salzsäure-Lösung versetzt. Die organische Phase wird über Magnesiumsulfat getrocknet, im Vakuum eingeengt und 1 h im Hochvakuum getrocknet. Das Rohprodukt wird ohne weitere Reinigung umgesetzt.

Ausbeute: quant. LC-MS (Methode 4): R, = 2.82 min.

MS (EI): m/z = 1069 (M+H)+.

Analog zur Vorschrift des Beispiels 14A werden die in der folgenden Tabelle aufgeführten

Beispiele 15A bis 17A hergestellt.

Beispiel 18A

Methyl-(2S,3R)-2-({(2S,4R)-5-{[(benzyloxy)carbonyl]amino} -2-[(ter^-butoxycarbonyl)amino]-4- hydroxypentanoyl}amino)-3-{4,4'-bis(benzyloxy)-3'-[(2S)-2-{[ (benzyloxy)carbonyl]amino}-3-oxo- 3-(ρentafluorphenoxy)propyl]biphenyl-3-yl}-3-hydroxypropano at

141 mg (Rohprodukt, ca. 0.13 mmol) (2S)-2-{[(Benzyloxy)carbonyl]amino}-3-{4,4'-bis- (benzyloxy)-3'-[(lR,2S)-2-({(2S,4R)-5-{[(benzyloxy)carbonyl] amino}-2-[(tert-butoxycarbonyl)- amino]-4-hydroxypentanoyl}amino)-l-hydroxy-3-methoxy-3-oxopr opyl]biphenyl-3-yl}- propionsäure (Beispiel 14A) werden in 5 ml Dichlormethan vorgelegt und mit 121 mg (0.66 mmol) Pentafluorphenol, gelöst in 1 ml Dichlormethan, versetzt. Man fugt 2 mg (0.01 mmol) DMAP hinzu und kühlt auf -25°C (Ethanol/Kohlendioxid-Bad). Bei -25°C werden 39 mg (0.172 mmol) EDC hinzugefügt. Die Mischung erwärmt sich über Nacht langsam auf RT. Die Reaktionsmischung wird im Vakuum eingeengt und im Hochvakuum kurz getrocknet. Das Rohprodukt wird ohne weitere Reinigung umgesetzt.

Ausbeute: quant.

LC-MS (Methode 5): R1 = 3.34 min.

MS (EI): m/z = 1235 (M+H)+.

Analog zur Vorschrift des Beispiels 18A werden die in der folgenden Tabelle aufgeführten Beispiele 19A bis 21 A hergestellt.

Beispiel 22A

Methyl-(2S,3R)-2-[((2S,4R)-2-amino-5-{[(benzyloxy)carbony l]amino}-4-hydroxypentanoyl)- amino]-3-{4,4'-bis(benzyloxy)-3'-[(2S)-2-{[(benzyloxy)carbon yl]amino}-3-oxo-3-(pentafluor-

phenoxy)propyl]biphenyl-3-yl}-3-hydroxypropanoat Hydrochlorid

0.163 g (Rohprodukt, ca. 0.132 mmol) Methyl-(2S,3R)-2-({(2S,4R)-5-{[(ben2yloxy)carbonyl]- ammo}-2-[(tert-butoxycarbonyl)amino]-4-hydroxypentanoyl}amin o)-3-{4,4'-bis(benzyloxy)-3'- [(2S)-2- { [(benzy loxy)carbony 1] amino} -3 -oxo-3 -(pentafluorphenoxy)propy l]bipheny 1-3 -y 1} -3- hydroxypropanoat (Beispiel 18A) werden bei O0C in 4 ml einer 4M Chlorwasserstoff-Dioxan- Lösung gelöst. Nach 2.5 h bei 00C wird die Reaktionslösung bei im Vakuum eingeengt, mehrmals mit Dichlormethan coevaporiert und im Hochvakuum getrocknet. Das Rohprodukt wird ohne weitere Reinigung umgesetzt.

Ausbeute: quant.

LC-MS (Methode 5): Rt = 2.71 min.

MS (EI): m/z = 1135 (M-HC1+H)+.

Analog zur Vorschrift des Beispiels 22A werden die in der folgenden Tabelle aufgeführten Beispiele 23A bis 25A hergestellt.

Beispiel 26A

Methyl-(7R,8S,l lS,14S)-5,17-bis(benzyloxy)-14-{[(benzyloxy)carbonyl]amino}- l l-((2R)-3-

{ [(benzyloxy)carbonyl] amino} -2-hydroxypropyl)-7-hy droxy- 10,13-dioxo-9, 12-diazatri- cyclo[14.3.1.12'6]henicosa-l(20),2(21),3,5,16,18-hexaen-8-ca rboxylat

150 mg (Rohprodukt, ca. 0.13 mmol) Methyl-(2S,3R)-2-[((2S,4R)-2-amino-5-{[(benzyloxy)- carbonyl] amino } -4-hydroxypentanoyl)amino] -3 - {4,4'-bis(benzyloxy)-3 '-[(2S)-2- { [(benzy loxy)- carbonyl]amino}-3-oxo-3-(pentafluorphenoxy)propyl]biphenyl-3 -yl}-3-hydroxypropanoat Hydrochlorid werden in 150 ml Dichlormethan gelöst und tropfenweise mit einer Lösung von 0.37 ml Triethylamin in 30 ml Dichlormethan versetzt. Es wird über Nacht bei RT gerührt. Zur Aufarbeitung wird das Gemisch schonend im Vakuum einrotiert und der Rückstand in Acetonitril verrührt. Der Feststoff wird abfiltriert, mit Acetonitril gewaschen und im Hochvakuum getrocknet.

Ausbeute: 73 mg (58% d. Th., über vier Stufen ausgehend von Beispiel 10A).

LC-MS (Methode 5): R4 = 3.02 min.

MS (EI): m/z = 951 (M+H)+.

1H-NMR (300 MHz, d6-DMSO): δ = 1.42-1.61 (m, IH), 1.7-1.95 (m, IH), 2.92 (mc, IH), 3.02-3.13 (m, 2H), 3.3 (m, IH unter D2O), 3.68 (s, 3H), 4.45 (mc, IH), 4.68 (mc, IH), 4.83-5.25 (m, 9H), 5.77 (d, IH), 5.86 (d, IH), 6.53 (d, IH), 6.95-7.2 (m, 4H), 7.21-7.60 (m, 23H), 8.54 (d, IH), 8.64 (d, IH).

Analog zur Vorschrift des Beispiels 26A werden die in der folgenden Tabelle aufgeführten Beispiele 27A bis 29A hergestellt.

δ

Beispiel 30A

(7R,8S,11 S,14S)-5,17-Bis(benzyloxy)-14-{[(benzyloxy)carbonyl]amino}-l l-((2R)-3-{[(benzyl- oxy)carbonyl] amino} -2-hydroxypropyl)-7-hydroxy- 10, 13 -dioxo-9, 12-diazatricy clo [14.3.1.12'6]- henicosa-l(20),2(21),3,5,16,l 8-hexaen-8-carbonsäure

Eine Suspension aus 25 mg (0.026 mmol) Methyl-(7R,8S,llS,14S)-5,17-bis(benzyloxy)-14- {[(ben2yloxy)carbonyl]amino}-l l-((2R)-3-{[(benzyloxy)carbonyl]amino}-2-hydroxypropyl)-7- hydroxy-10,13-dioxo-9,12-diazatricyclo[14.3.1.12'6]henicosa- l(20),2(21),3,5,16,18-hexaen-8- carboxylat (Beispiel 26A) in 10 ml Dioxan /Wasser (4:1) wird nach Zugabe von 0.53 ml (0.053 mmol) einer 0.1N wässrigen Lithiumhydroxid-Lösung für 3 h bei 100C gerührt. Durch Zugabe von 0.1N Salzsäure wird auf pH 2 gestellt, der ausgefallene Feststoff wird abfiltriert und im Hochvakuum getrocknet.

Ausbeute: 24 mg (98% d. Th.)

LC-MS (Methode 6): R1 = 2.85 min.

MS (EI): m/z = 937 (M+H)+.

Beispiel 31 A

(7R,8S,l lS,14S)-5,17-Bis(benzyloxy)-14-{[(benzyloxy)carbonyl]amino}- l l-(3-{[(benzyloxy)- carbonyl]amino}propyl)-7-hydroxy-l 0, 13-dioxo-9, 12-diazatricyclo[ 14.3.1.12>6]henicosa- 1 (20),2(21 ),3 ,5 , 16, 18-hexaen-8-carbonsäure

Eine Suspension aus 30 mg (0.032 mmol) Methyl-(7R,8S,l lS,14S)-5,17-bis(benzyloxy)-14- {[(benzyloxy)carbonyl]amino}-l l-(3-{[(benzyloxy)carbonyl]amino}propyl)-7-hydroxy-10,13- dioxo-9, 12-diazatricyclo [14.3.1.12>6]henicosa- 1 (20),2(21 ),3 ,5 , 16, 18-hexaen-8-carboxy lat (Beispiel 28A) in 25 ml Tetrahydrofuran / Wasser (4:1) wird nach Zugabe von 0.64 ml (0.054 mmol) einer 0.1N wässrigen Lithiumhydroxid-Lösung für 12 h bei RT gerührt. Durch Zugabe von 0.1N Salzsäure wird auf pH 2 gestellt, der ausgefallene Feststoff wird abfiltriert und im Hochvakuum getrocknet.

Ausbeute: 25 mg (85% d. Th.)

LC-MS (Methode 5): R1 = 2.95 min.

MS (EI): m/z = 921 (M+H)+.

Analog zur Vorschrift des Beispiels 3 IA werden die in der folgenden Tabelle aufgeführten Beispiele 32A und 33A hergestellt.

Beispiel 34A

Benzyl-{(2R)-3-[(7R,8S,llS,14S)-8-{[(2-aminoethyl)amino]c arbonyl}-5,17-bis(benzyloxy)-14- { [(benzyloxy)carbonyl]amino}-7-hydroxy-l 0, 13-dioxo-9,l 2-diazatricyclo[ 14.3.1.12>6]henicosa- l(20),2(21),3,5,16,l 8-hexaen-l l-yl]-2-hydroxypropyl}carbamat

Eine Lösung aus 40 mg (0.042 mmol) Methyl-(7R,8S,l lS,14S)-5,17-bis(benzyloxy)-14- {[(benzyloxy)carbonyl]amino}-l l-((2R)-3-{[(ben2yloxy)carbonyl]amino}-2-hydroxypropyl)-7- hydroxy-10,13-dioxo-9,12-diazatricyclo[14.3.1.12)6]henicosa- l(20),2(21),3,5,16,18-hexaen-8- carboxylat (Beispiel 26A) in 1.5 ml 1,2-Diaminoethan wird nach Zugabe von 0.55 mg (0.008 mmol) Kaliumcyanid 16 h bei RT gerührt. Nach Zugabe von Wasser wird der ausgefallene Feststoff abfiltriert und im Hochvakuum getrocknet.

Ausbeute: 27 mg (65% d. Th.) LC-MS (Methode 5): R4 = 2.39 min.

MS (EI): m/z = 979 (M+H) .

Analog zur Vorschrift des Beispiels 34A werden die in der folgenden Tabelle aufgeführten Beispiele 35A bis 37A hergestellt.

Beispiel 38A

Benzyl- {2-[(7R,8S, 11 S, 14S)-5, 17-bis(benzyloxy)-l 4-{ [(benzyloxy)carbonyl]amino } -8-[( {2-[bis(2- aminoethyl)amino]ethyl}amino)carbonyl]-7-hydroxy-10,13-dioxo -9,12-diazatricyclo[14.3.1.12'6]- henicosa-l(20),2(21),3,5,l 6,18-hexaen-l l-yl]ethyl}carbamat

Die Herstellung erfolgt analog zu Beispiel 34A aus 15 mg (0.02 mmol) Methyl-(7R,8S,11S,14S> 5 , 17-bis(benzyloxy)- 14- { [(benzy loxy)carbonyl]amino } - 11 -(2- { [(benzyloxy)carbony 1] amino } - ethyl)-7-hydroxy-l 0, 13-dioxo-9, 12-diazatricyclo[l 4.3.1.12'6]henicosa-l (20),2(21 ),3,5 , 16, 18- hexaen-8-carboxylat (Beispiel 27A) in 0.5 ml N,N-Bis(2-aminoethyl)ethan-l,2-diamin und mit 0.11 mg (0.0016 mmol) Kaliumcyanid.

Ausbeute: 14.4 mg (85% d. Th.)

LC-MS (Methode 5): Rt = 1.99 min.

MS (EI): m/z = 1035 (M+H)+.

Beispiel 39A

Methyl-(7R,8S,l lS,14S)-14-amino-l l-[(2R)-3-amino-2-hydroxypropyl]-5,7,17-trihydroxy-10,13- dioxo-9, 12-diazatricy clo [14.3.1.12>6]henicosa- 1 (20),2(21 ),3 , 5, 16, 18-hexaen-8-carboxy lat Dihydrochlorid

Es werden 30 mg (0.32 mmol) Methyl-(7R,8S,l lS,14S)-5,17-bis(benzyloxy)-14-{[(benzyloxy)- carbonyl]amino}-l l-((2R)-3-{[(benzyloxy)carbonyl]amino}-2-hydroxypropyl)-7-hy droxy-10,13- dioxo-9, 12-diazatricyclo[l 4.3.1.12'6]henicosa-l (20),2(21 ),3,5, 16, 18-hexaen-8-carboxylat (Beispiel 26A) in ein Gemisch aus 10 ml Essigsäure/Wasser/Ethanol 4:1:1 gegeben. Dazu gibt man 10 mg Palladium auf Aktivkohle (10%ig) und hydriert anschließend 15 h bei Normaldruck. Das Reaktionsgemisch wird über vorgewaschenem Kieselgur filtriert und das Filtrat im Vakuum einrotiert. Der Rückstand wird mit 0.95 ml 0.1N wässriger Salzsäure versetzt und eingeengt. Man verrührt den Rückstand mit 10 ml Diethylether und dekantiert ab. Der zurückgebliebene Feststoff wird im Hochvakuum getrocknet.

Ausbeute: 18 mg (97% d. Th.).

LC-MS (Methode 7): R1 = 2.29 min

MS (EI): m/z = 503 (M-2HC1+H)+.

1H-NMR (400 MHz, D2O): δ = 1.8-1.93 (m, IH), 1.96-2.1 (m, IH), 2.83-2.93 (m, IH), 2.97-3.12 (m, 2H), 3.5 (m0, IH), 3.77 (s, 3H), 3.95-4.05 (m, IH), 4.37-4.42 (m, IH), 4.9 (mc, IH), 4.94-4.49 (m, IH), 5.78 (mc, IH), 6.84-6.95 (m, 3H), 7.27-7.42 (m, 3H).

Analog zur Vorschrift des Beispiels 39A werden die in der folgenden Tabelle aufgeführten Beispiele 4OA bis 46A hergestellt.

Beispiel 47A

(7R,8S,11 S,14S)-14-[(te^Butoxycarbonyl)amino]-l l-{(2R)-3-[(^^-butoxycarbonyl)amino]-2-

hydroxypropyll-SjT.π-trihydroxy-lO.lS-dioxo^j^-diazatric yclotH.S.l.l^henicosa- 1 (20),2(21 ),3 ,5 , 16, 18-hexaen-8-carbonsäure

50 mg (0.087 mmol) Methyl-(7R,8S,l lS,14S)-14-amino-l l-[(2R)-3-amino-2-hydroxypropyl]- 5,7,17-trihydroxy-10,13-dioxo-9,12-diazatricyclo[14.3.1.12&g t;6]henicosa-l(20),2(21),3,5,16,18- hexaen-8-carboxylat Dihydrochlorid (Beispiel 39A) werden in 0.43 ml (0.43 mmol) IN Natronlauge gelöst und bei Raumtemperatur unter Rühren mit 56.9 mg (0.26 mmol) Di-tert-huty\- dicarbonat, gelöst in 0.5 ml Methanol, versetzt. Nach 2 h Rühren bei RT wird durch Zutropfen von 0.1N Salzsäure auf pH 3 gestellt. Man extrahiert dreimal mit Essigsäureethylester, trocknet die organische Phase über Magnesiumsulfat und dampft im Vakuum bis zur Gewichtskonstanz ein.

Ausbeute: 37 mg (62% d. Th.).

LC-MS (Methode 6): Rt = 1.83 min.

MS (EI): m/z = 703 (M+H)+.

Beispiel 48A

(7R,8S, 11 S, 14S)-14-[(tert-Butoxycarbonyl)amino]- 11 - {3-[(tert-butoxycarbonyl)amino]propyl} - 5,7,17-trihydroxy-10,13-dioxo-9,12-diazatricyclo[14.3.1.12'6 ]henicosa-l(20),2(21),3,5,16,18- hexaen-8-carbonsäure

Die Herstellung erfolgt analog Beispiel 47 A aus 50 mg (0.088 mmol) Methyl-(7R,8S,11S,14S> 14-amino-l l-(3-aminopropyl)-5,7,17-trihydroxy-10,13-dioxo-9,12-diazatr icyclo[14.3.1.12>6]- henicosa-l(20),2(21),3,5,16,18-hexaen-8-carboxylat Dihydrochlorid (Beispiel 41A) mit 58 mg (0.26 mmol) Di-tert-butyl-dicarbonat in 0.44 ml (0.44 mmol) IN Natronlauge und 0.5 ml Methanol.

Ausbeute: 4.6 mg (77% d. Th.).

LC-MS (Methode 6): R, = 1.93 min. MS (EI): m/z = 687 (M+H)+.

Beispiel 49 A

ter^-Butyl-[(lS)-4-[(fert-butoxycarbonyl)amino]-l-(hydrox ymethyl)butyl]carbamat

Eine Lösung von 300 mg (0.90 mmol) N2,N5-Bis(tert-butoxycarbonyl)-L-ornithin in 10 ml Tetrahydrofuran wird bei -100C mit 91 mg (0.90 mmol) 4-Methylmorpholin und 98 mg (0.90 mmol) Chlorameisensäureethylester versetzt und 30 min gerührt. Bei dieser Temperatur werden 1.81 ml (1.81 mmol) einer IM Lösung von Lithiumaluminiumhydrid in Tetrahydrofuran langsam zugetropft. Es wird langsam auf RT erwärmt und für 12 h bei RT gerührt. Unter Eiskühlung gibt man vorsichtig 0.1 ml Wasser und 0.15 ml 4.5%ige Natriumhydroxid-Lösung hinzu und rührt weitere 3 h bei RT. Der Ansatz wird filtriert und das Filtrat wird im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird in Essigsäureethylester gelöst, mit Wasser gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und erneut im Vakuum zur Trockne eingeengt. Das Produkt wird ohne weitere Reinigung umgesetzt.

Ausbeute: 239 mg (83% d. Th.)

MS (ESI): m/z = 319 (M+H)+; 341 (M+Na)+.

Beispiel 5OA

(2S)-2,5-Bis[(ter^butoxycarbonyl)amino]pentyl-methansulfo nat

Eine Lösung von 240 mg (0.75 mmol) te^Butyl-[(lS)-4-[(tert-butoxycarbonyl)amino]-l- (hydroxymethyl)butyl]carbamat (Beispiel 49A) in 20 ml Dichlormethan wird mit 103 mg (0.90 mmol) Methansulfonsäurechlorid und 0.21 ml (1.5 mmol) Triethylamin versetzt und für 16 h bei RT gerührt. Es wird mit Dichlormethan verdünnt und zweimal mit 0.1N Salzsäure gewaschen. Die organische Phase wird über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum bis zur Trockne eingeengt. Das Produkt wird ohne weitere Reinigung umgesetzt. Ausbeute: 218 mg (73% d. Th.)

MS (ESI): m/z = 419 (M+Na)+.

Beispiel 51A

fert-Butyl-{(4S)-5-azido-4-[(ϊert-butoxycarbonyl)amino]p entyl}carbamat

Eine Lösung von 218 mg (0.55 mmol) (2S)-2,5-Bis[(tert-butoxycarbonyl)amino]pentyl- methansulfonat (Beispiel 50A) in 15 ml Dimethylformamid wird mit 36 mg (0.55 mmol) Natriumazid versetzt und 12 h bei 7O0C gerührt. Ein Großteil des Lösungsmittel wird im Vakuum abdestilliert und der Rückstand wird mit Essigsäureethylester verdünnt. Es wird mehrmals mit gesättigter Natriumhydrogencarbonat-Lösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum zur Trockne eingeengt. Das Produkt wird ohne weitere Reinigung umgesetzt.

Ausbeute: 188 mg (99% d. Th.)

MS (ESI): m/z = 344 (M+H)+.

Beispiel 52A

fer^-Butyl-{(4S)-5-amino-4-[(?ert-butoxycarbonyl)amino]pe ntyl}carbamat

Eine Lösung von 188 mg (0.55 mmol) ter^Butyl-{(4S)-5-azido-4-[(tert-butoxycarbonyl)amino]- pentyl}carbamat (Beispiel 51 A) in Ethanol wird nach Zugabe von 20 mg Palladium auf Aktivkohle (10%ig) 12 h bei RT und Normaldruck hydriert. Es wird über Kieselgur filtriert und der Rückstand mit Ethanol gewaschen. Das Filtrat wird im Vakuum zur Trockne eingeengt. Das Produkt wird ohne weitere Reinigung umgesetzt.

Ausbeute: 102 mg (59% d. Th.)

MS (ESI): m/z = 318 (M+H)+; 340 (M+Na)+. Beispiel 53A

ter^Butyl-{(3S)-3-[(tert-butoxycarbonyl)amino]-4-hydroxyb utyl}carbamat

Die Herstellung erfolgt analog Beispiel 49A aus 300 mg (0.60 mmol) Dicyclohexylamino-(2S)- 2,4-bis[(tert-butoxycarbonyl)amino]butanat in 10 ml Tetrahydrofuran mit 61 mg (0.60 mmol) 4- Methylmorpholin, 65 mg (0.60 mmol) Chlorameisensäureethylester und 1.2 ml (1.20 mmol) einer IM Lösung von Lithiumaluminiumhydrid in Tetrahydrofuran. Das Produkt wird ohne weitere Reinigung umgesetzt.

Ausbeute: 174 mg (95% d. Th.)

MS (ESI) : m/z = 305 (M+H)+.

Beispiel 54A

(2S)-2,4-Bis[(ter^butoxycarbonyl)amino]butyl-methansulfon at

Die Herstellung erfolgt analog Beispiel 50A aus 250 mg (0.81 mmol) tert-Butyl-{(3$)-3-[(tert- butoxycarbonyl)amino]-4-hydroxybutyl}carbamat (Beispiel 53A) in 20 ml Dichlormethan mit 110 mg (0.97 mmol) Methansulfonsäurechlorid und 0.23 ml (1.6 mmol) Triethylamin. Das Produkt wird ohne weitere Reinigung umgesetzt.

Ausbeute: 200 mg (64% d. Th.)

MS (ESI): m/z = 383 (M+H)+; 400 (M+Na)+. Beispiel 55A

terf-Butyl-{(3S)-4-azido-3-[(rerr-butoxycarbonyl)amino]bu tyl}carbamat

Die Herstellung erfolgt analog Beispiel 51A aus 200 mg (0.52 mmol) (2S)-2,4-Bis[(tert- butoxycarbonyl)amino]butyl-methansulfonat (Beispiel 54A) in 15 ml Dimethylformamid mit 34 mg (0.52 mmol) Natriumazid. Das Produkt wird ohne weitere Reinigung umgesetzt.

Ausbeute: 171 mg (99% d. Th.)

Beispiel 56A

^er?-Butyl-{(3S)-4-amino-3-[(fer^-butoxycarbonyl)ammo]but yl}carbamat

Die Herstellung erfolgt analog Beispiel 52A aus 171 mg (0.52 mmol) tert-Butyl-{(3S)-4-azido-3- [(ter£-butoxycarbonyl)ammo]butyl}carbamat (Beispiel 55A) in 10 ml Ethanol unter Zusatz von 20 mg Palladium auf Aktivkohle (10%ig). Das Produkt wird ohne weitere Reinigung umgesetzt.

Ausbeute: 117 mg (75% d. Th.)

MS (ESI): m/z = 304 (M+H)+; 326 (M+Na)+.

Beispiel 57A

Benzyl-{(lS)-4-[(tert-butoxycarbonyl)amino]-l-[({2-[(/ert -butoxycarbonyl)amino]ethyl}amino)- carbonyl]butyl} carbamat

Unter Argon werden 300 mg (0.82 mmol) N2-[(Benzyloxy)carbonyl]-NJ-(ter/-butoxycarbonyl)-L- ornithin und 171 mg (1.06 mmol) tert-Butyl-(2-aminoethyl)carbamat in 6 ml Dimethylformamid gelöst. Bei 00C (Eisbad) werden dann 204 mg (1.06 mmol) EDC und 33 mg (0.25 mmol) HOBt zugegeben. Es wird langsam auf RT erwärmt und für 12 h bei RT gerührt. Die Lösung wird im Vakuum eingeengt und der Rückstand wird mit Essigsäureethylester aufgenommen. Die organische Phase wird nacheinander mit gesättigter Νatriumhydrogencarbonat- und Νatrium- chlorid-Lösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum eingedampft. Der verbleibende Feststoff wird im Hochvakuum getrocknet.

Ausbeute: 392 mg (94% d. Th.)

LC-MS (Methode 5): R4 = 2.36 min.

MS (EI): m/z = 509 (M+H)+

Beispiel 58A

Benzy 1- { ( 1 S)-4-[(ter?-butoxycarbony l)amino]- 1 -[( { 3 -[(teτt-butoxycarbonyl)amino]-2-hydroxy- propyl} amino)carbonyl]butyl} carbamat

Die Herstellung erfolgt analog zu Beispiel 57A aus 300 mg (0.82 mmol) N2- [(Benzyloxy)carbonyl]-N5-(tert-butoxycarbonyl)-L-ornithin und 202 mg (1.06 mmol) tert-Bυtyl-(3- amino-2-hydroxypropyl)carbamat in 6 ml Dimethylformamid unter Zusatz von 204 mg (1.06 mmol) EDC und 33 mg (0.25 mmol) HOBt.

Ausbeute: 412 mg (93% d. Th.)

LC-MS (Methode 6): R1 = 2.23 min.

MS (EI): m/z = 539 (M+H)+ Beispiel 59A

NJ-(^er?-Butoxycarbonyl)-N-{2-[(teτ"f-butoxycarbonyl)ami no]ethyl}-L-ornithinamid

Die Herstellung erfolgt analog Beispiel 52A aus 390 mg (0.77 mmol) Benzyl-{(lS)-4-[(te/tf- butoxycarbonyl)amino]- 1 -[( {2-[(^erf-butoxycarbonyl)amino]ethyl} amino)carbonyl]butyl}-carba- mat (Beispiel 57A) in 50 ml Ethanol unter Zusatz von 40 mg Palladium auf Aktivkohle (10%ig). Das Produkt wird ohne weitere Reinigung umgesetzt.

Ausbeute: 263 mg (91% d. Th.)

MS (ESI): m/z = 375 (M+H)+; 397 (M+Νa)+.

Beispiel 6OA

N5-(^e7^-Butoxycarbonyl)-N-{3-[(terf-butoxycarbonyl)amino ]-2-hydroxypropyl}-L-ornithinamid

Die Herstellung erfolgt analog Beispiel 52A aus 412 mg (0.76 mmol) Benzyl-{(lS)-4-[(ter^- butoxycarbonyl)amino]-l-[({3-[(ter^-butoxycarbonyl)amino]-2- hydroxypropyl}amino)-carbonyl]- butyl}carbamat (Beispiel 58A) in 50 ml Ethanol unter Zusatz von 41 mg Palladium auf Aktivkohle (10%ig). Das Produkt wird ohne weitere Reinigung umgesetzt.

Ausbeute: 306 mg (99% d. Th.)

MS (ESI): m/z = 405 (M+H)+. Beispiel 61A

terr-Butyl-[(7R,8S,HS,14S)-8-[({(2S)-2,5-bis[(^7-r-butoxy carbonyl)amino]pentyl}amino)- carbonyl]-l l-{3-[(to^-butoxycarbonyl)amino]proρyl}-5,7,17-trihydroxy-1 0,13-dioxo-9,12- diazatricyclo[14.3.1.12'6]henicosa-l(20),2(21),3,5,16,18-hex aen-14-yl]carbamat

Unter Argon werden 23 mg (0.034 mmol) (7R,8S,llS,14S)-14-[(?e^-Butoxycarbonyl)amino]-l l- {3-[(?er^-butoxycarbonyl)amino]propyl}-5,7,17-trihydroxy-10, 13-dioxo-9,12-diazatricyclo- [14.3.1.12'6]henicosa-l(20),2(21),3,5,16,18-hexaen-8-carbons äure (Beispiel 48A) und 11.9 mg (0.07 mmol) ?ert-Butyl-{(4S)-5-amino-4-[(tert-butoxycarbonyl)amino]penty l}carbamat (Beispiel 52A) in 0.75 ml Dimethylformamid gelöst. Bei 00C (Eisbad) werden dann 8.5 mg (0.051 mmol) EDC und 1.4 mg (0.01 mmol) HOBt zugegeben. Es wird langsam auf RT erwärmt und für 12 h bei RT gerührt. Die Lösung wird im Vakuum eingeengt und der Rückstand wird mit Wasser verrührt. Der verbleibende Feststoff wird abgesaugt und durch präparative RP-HPLC gereinigt (Reprosil ODS-A, Laufmittel Acetonitril / 0.2% wässrige Trifluoressigsäure 5:95 → 95:5).

Ausbeute: 15 mg (45% d. Th.)

LC-MS (Methode 6): R4 = 2.48 min.

MS (EI): m/z = 972 (M+H)+

Analog zur Vorschrift des Beispiels 61 A werden die in der folgenden Tabelle aufgeführten Beispiele 62A bis 66A hergestellt.

Beispiel 67A

(3S)-3-{[(Benzyloxy)carbonyl]amino}-6-[(terNbutoxycarbony l)amino]hexanoylmethylcarbonat

Unter Argon werden 2 g (5.26 mmol) (3S)-3-{[(Benzyloxy)carbonyl]amino}-6-[(tert-butoxy- carbonyl)amino]hexansäure und 0.56 g (5.73 mmol) Triethylamin in 30 ml THF gelöst und auf 00C abgekühlt. Dazu gibt man 0.59 g (5.73 mmol) Methylchloroformiat und lässt 3 Stunden bei 00C nachrühren. Die Reaktionsmischung wird über Kieselgur filtriert. Das Filtrat wird direkt umgesetzt.

Beispiel 68A

Benzyl-[(lS)-4-[(^er?-butoxycarbonyl)amino]-l-(2-hydroxye thyl)butyl]carbamat

Das Filtrat von (3S)-3-{[(Benzyloxy)carbonyl]amino}-6-[(terf-butoxycarbonyl) amino]hexanoyl- methylcarbonat (Beispiel 67A) wird zu einer Suspension von 0.49 g (13.14 mmol) Natrium- borhydrid in 0.6 ml Wasser bei 00C tropfenweise hinzugegeben. Die Mischung erwärmt sich langsam auf Raumtemperatur und wird über Nacht gerührt. Die Reaktionslösung wird in Vakuum eingeengt, und der Rückstand wird zur Aufarbeitung mit Essigsäureethylester und Wasser versetzt. Die organische Phase wird über Magnesiumsulfat getrocknet, im Vakuum eingeengt und im Hochvakuum getrocknet. Das Rohprodukt wird ohne weitere Reinigung umgesetzt.

Ausbeute: 570 mg (30% d. Th.)

LC-MS (Methode 6): R1 = 2.09 min.

MS (EI): m/z = 367 (M+H)+. Beispiel 69A

tert-Butyl-[(4S)-4-amino-6-hydroxyhexyl]carbamat

Die Herstellung erfolgt analog Beispiel 52A aus 620 mg (1.69 mmol) Benzyl-[(lS)-4-[(Yerf- butoxycarbonyl)amino]-l-(2-hydroxyethyl)butyl]carbamat (Beispiel 68A) in 60 ml Ethanol unter Zusatz von 100 mg Palladium auf Aktivkohle (10%ig). Das Produkt wird ohne weitere Reinigung umgesetzt.

Ausbeute: 370 mg (95% d. Th.)

1H-NMR (400 MHz, D2O): δ = 1.2-1.6 (m, 6H), 1.4 (s, 9H), 2.6-3.0 (m, IH), 3.0-3.2 (m, 2H), 3.7- 3.9 (m, 2H), 4.6 (br.s, IH).

Beispiel 70A

Benzyl-{3-[(2-[(fert-butoxycarbonyl)amino]-l-{[(ferf-buto xycarbonyl)amino]methyl}ethyl)- amino]propyl} carbamat

310 mg (1.07 mmol) Di-te^butyl-(2-aminopropan-l,3-diyl)biscarbamat und 222 mg (1.07 mmol) Benzyl-(3-oxopropyl)carbamat werden in 15 ml Dichloromethan gelöst. 334 mg (1.5 mmol) Natriumtriacetoxyborhydrid werden hinzugegeben und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Gemisch wird eingedampft und der Rückstand mittels präparative HPLC gereinigt.

Ausbeute: 168 mg (38% d. Th.)

LC-MS (Methode 4) : R, = 1.76 min.

MS (EI): m/z = 481 (M+H)+. Beispiel 71A

Benzy 1- {3 -[(tert-butoxycarbony l)(2-[(tert-butoxycarbonyl)amino] - 1 - { [(tert-butoxycarbonyl)- amino]methyl} ethyl)amino]propyl} carbamat

bo

Zu einer Lösung von 168 mg (0.35 mmol) Ben2yl-{3-[(2-[(tert-butoxycarbonyl)amino]-l-{[(tert- butoxycarbonyl)amino]methyl}ethyl)amino]propyl} carbamat (Beispiel 70A) in 2 ml Acetonitril werden 0.55 ml einer 10%igen Triethylamin-Lösung in Acetonitril und 154 mg ( 0.70 mmol) Di- tert-butyl-dicarbonat hinzugegeben. Die Reaktionsmischung wird 6 Stunden bei 6O0C gerührt. Die Lösung wird eingeengt und das Rohprodukt wird ohne weitere Reinigung umgesetzt.

Ausbeute: quant.

LC-MS (Methode 5): Rt = 2.87 min.

MS (EI): m/z = 580 (M+H)+.

Beispiel 72A

Di-?er?-butyl-{2-[(3-aminopropyl)(ferr-butoxycarbonyl)ami no]propan-l,3-diyl}biscarbamat

Eine Lösung von 190 mg (0.327 mmol) Benzyl-{3-[(rert-butoxycarbonyl)(2-[(^err-butoxy- carbonyl)amino]-l-{[(/ert-butoxycarbonyl)amino]methyl}ethyl) amino]propyl}carbamat (Beispiel 71A) in 50 ml Eisessig/Wasser/Ethanol 4/1/1 wird nach Zugabe von 20 mg Palladium auf Aktivkohle (10%ig) 12 h bei Raumtemperatur und Normaldruck hydriert. Es wird über Kieselgur filtriert und der Rückstand mit Ethanol gewaschen. Das Filtrat wird im Vakuum zur Trockne eingeengt. Das Produkt wird ohne weitere Reinigung umgesetzt.

Ausbeute: quant. LC-MS (Methode 5): R, = 1.71 min. MS (EI): m/z = 447 (M+H)+. Ausführungsbeispiele

Beispiel 1

(7R,8S,l lS,14S)-14-Amino-N-(2-aminoethyl)-l l-[(2R)-3-amino-2-hydroxypropyl]-5,7,17- trihydroxy-10,13-dioxo-9,12-diazatricyclo[14.3.1.12-6]henico sa-l(20),2(21)53,5,16,18-hexaen-8- carboxamid Trihydrochlorid

Es werden 30 mg (0.32 mmol) Benzyl-{(2R)-3-[(7R,8S,l lS,14S)-8-{[(2-aminoethyl)amino]- carbonyl} -5 , 17-bis(benzy loxy)- 14- { [(benzyloxy)carbonyl]amino } -7-hydroxy- 10,13-dioxo-9, 12- diazatricyclo[14.3.1.12>6]henicosa-l(20),2(21),3,5,16,18- hexaen-l l-yl]-2-hydroxypropyl}carbamat (Beispiel 34A) in ein Gemisch aus 10 ml Essigsäure/Wasser/Ethanol 4:1:1 gegeben. Dazu gibt man 10 mg Palladium auf Aktivkohle (10%ig) und hydriert anschließend 15 h bei RT und Normaldruck. Das Reaktionsgemisch wird über vorgewaschenem Kieselgur filtriert, mit Ethanol gewaschen und das Filtrat im Vakuum einrotiert. Der Rückstand wird mit 0.96 ml 0.1N wässriger Salzsäure versetzt und eingeengt. Man verrührt den Rückstand mit 10 ml Diethy lether und dekantiert ab. Der zurückgebliebene Feststoff wird im Hochvakuum getrocknet.

Ausbeute: 18 mg (97% d. Th.).

LC-MS (Methode 7): R1 = 1.92 min

MS (EI): m/z = 531 (M-3HC1+H)+.

1H-NMR (400 MHz, D2O): δ = 1.83-1.93 (m, IH), 1.94-2.08 (m, IH), 2.88 (mc, IH), 2.97-3.18 (m, 4H), 3.42-3.64 (m, 3H), 3.91 (mc, IH), 4.39 (mc, IH), 4.82 (m0, IH), 5.0 (mc, IH), 5.56 (m0, IH), 6.85-6.97 (m, 3H), 7.27-7.46 (m, 3H). Beispiel 2

(7R,8S,l lS,14S)-14-Amino-N-(2-aminoethyl)-l l-[(2R)-3-amino-2-hydroxypropyl]-5,7,17- trihydroxy-10,13-dioxo-9,12-diazatricyclo[14.3.1.12>6]hen icosa-l(20),2(21),3,5,16,18-hexaen-8 carboxamid Tri(hydrotrifluoracetat)

Das Trihydrochlorid (Beispiel 1) wird durch präparative HPLC (Reprosil ODS-A, Laufmittel Acetonitril / 0.2% wässrige Trifluoressigsäure 5:95 — » 95:5) in das Tri(hydrotrifluoracetat) überfuhrt.

Ausbeute: quant.

1H-NMR (400 MHz, D2O): δ = 1.83-1.93 (m, IH), 1.94-2.08 (m, IH), 2.88 (mc, IH), 2.97-3.18 (m, 4H), 3.42-3.64 (m, 3H), 3.91 (mc, IH), 4.39 (mc, IH), 4.82 (m0, IH), 5.0 (mc, IH), 5.56 (mc, IH), 6.85-6.97 (m, 3H), 7.27-7.46 (m, 3H).

Analog zur Vorschrift des Beispiels 1 werden die in der folgenden Tabelle aufgeführten Beispiele 3 bis 6 hergestellt und gegebenenfalls analog Beispiel 2 in das entsprechende Tri(hydrotrifluoracetat) überfuhrt.

Beispiel 7

(7R,8S,11 S,14S)-14-Amino-N-(2-aminoethyl)-l l-(3-aminopropyl)-5,7,17-trihydroxy-10,13-dioxo- 9, 12-diazatricyclo[ 14.3.1.12>6]henicosa-l (20),2(21 ),3 ,5, 16, 18-hexaen-8-carboxamid Tri(hydrotrifluoracetat)

Das Trihydrochlorid (Beispiel 5) wird durch präparative HPLC (Reprosil ODS-A, Laufmittel Acetonitril / 0.2% wässrige Trifluoressigsäure 5:95 → 95:5) in das Tri(hydrotrifluoracetat) überfuhrt.

Ausbeute: quant.

1H-NMR (400 MHz, D2O): δ = 1.6-1.95 (m, 4H), 2.97-3.02 (m, 3H), 3.07-3.17 (m, 2H), 3.45-3.56 (m, 3H), 4.41 (m0, IH), 4.78 (mc, IH), 4.85 (mc, IH), 5.5 (m0, IH), 6.85-6.95 (m, 3H), 7.28-7.39 (m, 3H).

Beispiel 8

(7R,8S,l lS,14S)-14-Amino-l l-(3-aminopropyl)-N-[(2S)-2,5-diammopentyl]-5,7,17-trihydrox y- 10,13-dioxo-9,12-diazatricyclo[14.3.1.12>6]henicosa-l(20) ,2(21),3,5,16,18-hexaen-8-carboxamid Tetrahydrochlorid

In 1 ml einer eisgekühlten 4N Chlorwasserstoff-Dioxan-Lösung gibt man 5.5 mg (5.7 μmol) tert-

Butyl-[(7R,8S, 11 S, 14S)-8-[({(2S)-2,5-bis[(ϊert-butoxycarbonyl)amino]pentyl} amino)-carbonyl]- 11 - {3-[(ter/-butoxycarbonyl)amino]propyl} -5,7, 17-trihydroxy-l 0, 13-dioxo-9, 12-diazatricyclo- [14.3.1.12>6]henicosa-l(20),2(21),3,5,16,18-hexaen-14-yl] carbamat (Beispiel 61A) und rührt eine

Stunde bei RT. Anschließend engt man im Vakuum zur Trockne ein und trocknet bis zur Gewichtskonstanz.

Ausbeute: 4 mg (98% d. Th.)

LC-MS (Methode 7): R, = 0.25 min.

MS (EI): m/z = 513 (M-4HC1+H)+

Analog zur Vorschrift des Beispiels 8 werden die in der folgenden Tabelle aufgeführten Beispiele 9 bis 13 hergestellt.

B. Bewertung der physiologischen Wirksamkeit

Verwendete Abkürzungen:

AMP Adenosinmonophosphat ATP Adenosintriphosphat BHI Medium Brain heart infusion medium CoA Coenzym A DMSO Dimethylsulfoxid DTT Dithiothreitol EDTA Ethylendiamintetraessigsäure KCl Kaliumchlorid KH2PO4 Kaliumdihydrogenphosphat MgSO4 Magnesiumsulfat MHK Minimale Hemmkonzentration MTP Mikrotiterplatte NaCl Natriumchlorid Na2HPO4 Dinatriumhydrogenphosphat NH4Cl Ammoniumchlorid NTP Nukleotidtriphosphat PBS Phosphat Buffered Saline PCR Polymerase Chain Reaction PEG Polyethylenglykol PEP Phosphoenolpyruvat Tris Tris[hydroxymethyl]aminomethan

Die in vzϊro-Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindungen kann in folgenden Assays gezeigt werden:

In vitro Transkription-Translation mit E. coli Extrakten

Zur Herstellung eines S30-Extraktes werden logarithmisch wachsende Escherichia coli MRE 600 (M. Müller; University Freiburg) geerntet, gewaschen und wie beschrieben für den in vitro Transkriptions-Translations-Test eingesetzt (Müller, M. and Blobel, G. Proc Natl Acad Sei U S A (1984) 81, pp.7421-7425). Dem Reaktionsmix des in vitro Transkriptions-Translations-Tests werden zusätzlich 1 μl cAMP (11.25 mg/ml) je 50 μl Reaktionsmix zugegeben. Der Testansatz beträgt 105 μl, wobei 5 μl der zu testenden Substanz in 5%igem DMSO vorgelegt werden. Als Transkriptionsmatrize werden 1 μg/lOOμl Ansatz des Plasmides pBESTLuc (Promega, Deutschland) verwendet. Nach Inkubation für 60 min bei 3O0C werden 50 μl Luziferin-Lösung (20 inM Tricine, 2.67 mM MgSO4, 0.1 mM EDTA, 33.3 mM DTT pH 7.8, 270 μM CoA, 470 μM Luziferin, 530 μM ATP) zugegeben und die entstehende Biolumineszenz für 1 Minute in einem Luminometer gemessen. Als IC50 wird die Konzentration eines Inhibitors angegeben, die zu einer 50% igen Inhibition der Translation von Firefly Luziferase führt.

In vitro Transkription-Translation mit S. aureus Extrakten

Konstruktion eines S. aureus Luziferase Reporterplasmids

Zur Konstruktion eines Reporterplasmids, welches in einem in vitro Transkriptions-Translations- Assay aus S. aureus verwendet werden kann, wird das Plasmid pBESTluc (Promega Corporation, USA) verwendet. Der in diesem Plasmid vor der Firefly Luziferase vorhandene E. coli tac Promoter wird gegen den capAl Promoter mit entsprechender Shine-Dalgarno Sequence aus S. aureus ausgetauscht. Dazu werden die Primer CAPFor 5'-CGGCC- AAGCTTACTCGGATCCAGAGTTTGCAAAATATACAGGGGATTATATATAATGGAAAAC AAGAAAGGAAAATAGGAGGTTTATATGGAAGACGCCA-S' und CAPRev 5'- GTCATCGTCGGGAAGACCTG-3' verwendet. Der Primer CAPFor enthält den capAl Promotor, die Ribosomenbindestelle und die 5'-Region des Luziferase Gens. Nach PCR unter Verwendung von pBESTluc als Template kann ein PCR-Produkt isoliert werden, welches das Firefly Luziferase Gen mit dem fusionierten capAl Promotor enthält. Dieses wird nach einer Restriktion mit CIaI und HindlH in den ebenfalls mit CIaI und HindHI verdauten Vektor pBESTluc ligiert. Das entstandene Plasmid pla kann in E. coli repliziert werden und als Template im S. aureus in vitro Transkriptions-Translations-Test verwendet werden.

Herstellαng von S30 Extrakten aus S. aureus

Sechs Liter BHI Medium werden mit einer 250 ml Übernachtkultur eines S. aureus Stammes inokuliert und bei 370C bis zu einer OD600nm von 2-4 wachsen gelassen. Die Zellen werden durch Zentrifugation geerntet und in 500 ml kaltem Puffer A (10 mM Tris-acetat, pH 8.0, 14 mM Magnesiumacetat, 1 mM DTT, IM KCl) gewaschen. Nach erneutem Abzentrifugieren werden die Zellen in 250 ml kaltem Puffer A mit 50 mM KCl gewaschen und die erhaltenen Pellets bei -2O0C für 60 min eingefroren. Die Pellets werden in 30 bis 60 min auf Eis aufgetaut und bis zu einem Gesamtvolumen von 99 ml in Puffer B (10 mM Tris-acetat, pH 8.0, 20 mM Magnesiumacetat, 1 mM DTT, 50 mM KCl) aufgenommen. Je 1.5 ml Lysostaphin (0.8 mg/ml) in Puffer B werden in 3 vorgekühlte Zentrifugenbecher vorgelegt und mit je 33 ml der Zellsuspension vermischt. Die Proben werden für 45 bis 60 min bei 370C unter gelegentlichem Schütteln inkubiert, bevor 150 μl einer 0.5 M DTT Lösung zugesetzt werden. Die lysierten Zellen werden bei 30.000 x g 30 min bei 4°C abzentrifugiert. Das Zellpellet wird nach Aufnahme in Puffer B unter den gleichen Bedingungen nochmals zentrifugiert und die gesammelten Überstände werden vereinigt. Die Überstände werden nochmals unter gleichen Bedingungen zentrifugiert und zu den oberen 2/3 des Überstandes werden 0.25 Volumen Puffer C (670 mM Tris-acetat, pH 8.0, 2O mM Magnesiumacetat, 7 mM Na3-Phosphoenolpyruvat, 7 mM DTT, 5.5 mM ATP, 70 μM Aminosäuren (complete von Promega), 75 μg Pyruvatkinase (Sigma, Deutschland))/ml gegeben. Die Proben werden für 30 min bei 370C inkubiert. Die Überstände werden über Nacht bei 40C gegen 2 1 Dialysepuffer (10 mM Tris-acetat, pH 8.0, 14 mM Magnesiumacetat, 1 mM DTT, 60 mM Kaliumacetat) mit einem Pufferwechsel in einem Dialyseschlauch mit 3500 Da Ausschluss dialysiert. Das Dialysat wird auf eine Proteinkonzentration von etwa 10 mg/ml konzentriert, indem der Dialyseschlauch mit kaltem PEG 8000 Pulver (Sigma, Deutschland) bei 4°C bedeckt wird. Die S30 Extrakte können aliquotiert bei -7O0C gelagert werden.

Bestimmung der ICgn im S. aureus in vitro Transcriptions-Translations-Assay

Die Inhibition der Proteinbiosynthese der Verbindungen kann in einem in vitro Transkriptions- Translations-Assay gezeigt werden. Der Assay beruht auf der zellfreien Transkription und Translation von Firefly Luziferase unter Verwendung des Reporterplasmids pla als Template und aus S. aureus gewonnenen zellfreien S30 Extrakten. Die Aktivität der entstandenen Luziferase kann durch Lumineszenzmessung nachgewiesen werden.

Die Menge an einzusetzenden S30 Extrakt bzw. Plasmid pla muss für jede Präparation erneut ausgetestet werden, um eine optimale Konzentration im Test zu gewährleisten. 3 μl der zu testenden Substanz gelöst in 5% DMSO werden in eine MTP vorgelegt. Anschließend werden 10 μl einer geeignet konzentrierten Plasmid-Lösung pla zugegeben. Anschließend werden 46 μl eines Gemisches aus 23 μl Premix (500 mM Kaliumacetat, 87.5 mM Tris-acetat, pH 8.0, 67.5 mM Ammoniumacetat, 5 mM DTT, 50 μg Folsäure/ml, 87.5 mg PEG 8000/ml, 5 mM ATP, 1.25 mM je NTP, 20 μM je Aminosäure, 50 mM PEP (Na3-SaIz), 2.5 mM cAMP, 250 μg je E. coli tRNA/ml) und 23 μl einer geeigneten Menge S. aureus S30 Extrakt zugegeben und vermischt. Nach Inkubation für 60 min bei 3O0C werden 50 μl Luziferin-Lösung (20 mM Tricine, 2.67 mM MgSCλt, 0.1 mM EDTA, 33.3 mM DTT pH 7.8, 270 μM CoA, 470 μM Luziferin, 530 μM ATP) und die entstehende Biolumineszenz für 1 min in einem Luminometer gemessen. Als IC50 wird die Konzentration eines Inhibitors angegeben, die zu einer 50%igen Inhibition der Translation von Firefly Luziferase fuhrt.

Bestimmung der Minimalen Hemmkonzentration (MHK)

Die minimale Hemmkonzentration (MHK) ist die minimale Konzentration eines Antibiotikums, mit der ein Testkeim in seinem Wachstum über 18-24 h inhibiert wird. Die Hemmstoff¬ konzentration kann dabei nach mikrobiologischen Standardverfahren mit modifiziertem Medium im Rahmen eines Agardilutionstests bestimmt werden (siehe z.B. The National Committee for Clinical Laboratory Standards. Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically; approved standard-fϊfth edition. NCCLS document M7-A5 [ISBN 1-56238- 394-9]. NCCLS, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 19087-1898 USA, 2000). Die Bakterienkeime werden auf 1.5%igen Agarplatten kultiviert, die 20% defibriniertes Pferdeblut enthalten. Die Testkeime, die über Nacht auf Columbia-Blutagarplatten (Becton- Dickinson) inkubiert werden, werden in PBS verdünnt, auf eine Keimzahl von ca. 5x105 Keime/ml eingestellt und auf Testplatten getropft (1-3 μl). Die Testsubstanzen enthalten unterschiedliche Verdünnungen der Testsubstanzen (Verdünnungsstufen 1:2). Die Kulturen werden bei 370C für 18-24 Stunden in Gegenwart von 5% CO2 inkubiert.

Die jeweils niedrigste Substanzkonzentration, bei der kein sichtbares Bakterienwachstum mehr auftritt, wird als MHK definiert. Die MHK-Werte in μg/ml einiger erfindungsgemäßer Verbindungen gegenüber einer Reihe von Testkeimen sind in der nachstehenden Tabelle beispielhaft aufgeführt. Die Verbindungen zeigen eine abgestufte antibakterielle Wirkung gegen die meisten der Testkeime.

Tabelle A (mit Vergleichsbeispiel 43A (Biphenomycin A))

Konzentrationsangaben: IC50 in μM; MHK in μg/ml. Systemische Infektion mit S. aureus 133

Die Eignung der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Behandlung von bakteriellen Infektionen kann in verschiedenen Tiermodellen gezeigt werden. Dazu werden die Tiere im allgemeinen mit einem geeigneten virulenten Keim infiziert und anschließend mit der zu testenden Verbindung, die in einer an das jeweilige Therapiemodell angepassten Formulierung vorliegt, behandelt. Speziell kann die Eignung der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Behandlung von bakteriellen Infektionen in einem Sepsismodell an Mäusen nach Infektion mit S. aureus demonstriert werden.

Dazu werden S. aureus 133 Zellen über Nacht in BH-Bouillon (Oxoid, Deutschland) angezüchtet. Die Übernachtkultur wurde 1 : 100 in frische BH-Bouillon verdünnt und für 3 Stunden hochgedreht. Die in der logarithmischen Wachstumsphase befindlichen Bakterien werden abzentrifugiert und zweimal mit gepufferter, physiologischer Kochsalz-Lösung gewaschen. Danach wird am Photometer (Dr. Lange LP 2W) eine Zellsuspension in Kochsalz-Lösung mit einer Extinktion von 50 Einheiten eingestellt. Nach einem Verdünnungsschritt (1:15) wird diese Suspension 1:1 mit einer 10%-igen Mucinsuspension gemischt. Von dieser Infektionslösung wird 0.2 ml/20 g Maus i.p. appliziert. Dies entspricht einer Zellzahl von etwa 1-2 x 106 Keimen/Maus. Die i.v.-Therapie erfolgt 30 Minuten nach der Infektion. Für den Infektionsversuch werden weibliche CFWl -Mäuse verwendet. Das Überleben der Tiere wird über 6 Tage protokolliert. Das Tiermodell ist so eingestellt, daß unbehandelte Tiere innerhalb von 24 h nach der Infektion versterben. Für die Beispielverbindung 2 konnte in diesem Modell eine therapeutische Wirkung von EDioo = 1.25 mg/kg demonstriert werden.

Bestimmung der Spontanresistenzfrequenzen gegen S. aureus

Die Spontanresistenzraten der erfindungsgemäßen Verbindungen werden wie folgt bestimmt: die Bakterienkeime werden auf Blutagarplatten oder Müller-Hinton-Agarplatten bei 37°C über Nacht kultiviert, in 2 ml PBS resuspendiert (ca. 2x109 Keime/ml). 100 μl dieser Zellsuspension bzw. 1:10 und 1:100 Verdünnungen werden auf vorgetrockneten Agarplatten (1.5% Agar, 20% defibriniertes Pferdeblut bzw. 1.5% Agar, 20% Rinderserum in 1/10 Müller-Hinton-Medium verdünnt mit PBS), welche die zu testende erfindungsgemäße Verbindung in einer Konzentration entsprechend 5xMHK bzw. 1 OxMHK enthalten, ausplattiert und 48 h bei 37°C bebrütet. Die entstehenden Kolonien (cfu) werden ausgezählt. Isolierung der Biphenomycin-resistenten S. aureus Stämme RN4220BiR und T17

Der S. aureus Stamm RN4220BiR wird in vitro isoliert. Dazu werden jeweils 100 μl einer S. aureus RN4220 Zellsuspension (ca. 1.2x108 cfu/ml) auf einer antibiotikafreien Agarplatte (18.5 mM Na2HPO4, 5.7 mM KH2PO4, 9.3 mM NH4Cl, 2.8 mM MgSO4, 17.1 mM NaCl, 0.033 μg/ml Thiaminhydrochlorid, 1.2 μg/ml Nicotinsäure, 0.003 μg/ml Biotin, 1% Glucose, 25 μg/ml von jeder proteinogenen Aminosäure unter Zusatz von 0.4% BH-Bouillon und 1% Agarose) und einer Agarplatte, die 2 μg/ml Biphenomycin B (1 OxMHK) enthält, ausplattiert und über Nacht bei 37°C bebrütet. Während auf der antibiotikafreien Platte ca. IxIO7 Zellen wachsen, wachsen auf der antibiotikahaltigen Platte ca. 100 Kolonien, entsprechend einer Resistenzfrequenz von IxIO"5. Einige der auf der antibiotikahaltigen Platte gewachsenen Kolonien werden auf MHK gegen Biphenomycin B getestet. Eine Kolonie mit einer MHK > 50 μM wird zur weiteren Verwendung ausgewählt und der Stamm mit RN4220BiR bezeichnet.

Der S. aureus Stamm T17 wird in vivo isoliert. CFWl-Mäuse werden mit 4x10^ £. aureus 133 - Zellen pro Maus intraperitoneal infiziert. 0.5 Std. nach der Infektion werden die Tiere mit 50 mg/kg Biphenomycin B intravenös behandelt. Den überlebenden Tieren werden am Tag 3 nach der Infektion die Nieren entnommen. Nach dem Homogenisieren der Organe werden die Homogenate, wie bei RN4220BiR beschrieben, auf antibiotikafreien und antibiotikahaltigen Agarplatten, ausplattiert und über Nacht bei 370C bebrütet. Etwa die Hälfte der aus der Niere isolierten Kolonien zeigen ein Wachstum auf den antibiotikahaltigen Platten (2.2x10δ Kolonien), was die Anreicherung von Biphenomycin B resistenten S. aureus Zellen in der Niere der behandelten Tiere belegt. Ca. 20 dieser Kolonien werden auf MHK gegen Biphenomycin B getestet und eine Kolonie mit einer MHK > 50 μM wird zur Weiterkultivierung ausgewählt und der Stamm mit Tl 7 bezeichnet.

C. Ausführungsbeispiele für pharmazeutische Zusammensetzungen

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können folgendermaßen in pharmazeutische Zubereitungen überfuhrt werden:

Intravenös applizierbare Lösung;

Zusammensetzung:

1 mg der Verbindung von Beispiel 1, 15 g Polyethylenglykol 400 und 250 g Wasser für Injektionszwecke. Herstellung:

Die erfindungsgemäße Verbindung wird zusammen mit Polyethylenglykol 400 in dem Wasser unter Rühren gelöst. Die Lösung wird sterilfiltriert (Porendurchmesser 0.22 μm) und unter aseptischen Bedingungen in hitzesterilisierte Infusionsflaschen abgefüllt. Diese werden mit Infusionsstopfen und Bördelkappen verschlossen.