本发明属于工业微生物领域， 具体涉及新的抗生素 Tetrathiazomycin A及其 制备方法和在制备抗肿瘤药物中的应用。 背景技术：

恶性肿瘤是目前严重危害人类生命和生活质量 的主要疾病之一，现已成为我 国居民的主要死因， 占死亡原因 20 %以上。 20世纪下半叶以来， 世界恶性肿瘤 与死亡均呈上升趋势， 尤其是 70年代以后， 恶性肿瘤以年均 3 %〜5 %的速度递 增。 世界卫生组织预测， 到 2020年， 将有 2000万新发恶性肿瘤病例， 其中死亡 人数达 1200万， 且绝大部分将发生在发展中国家。 在恶性肿瘤的三大疗法中， 药物治疗占用重要的地位。在合成化学类药物 中多数都是以天然抗肿瘤活性成分 为先导化合物的。据报道， 1984年到 1995年， 天然产物占上市抗肿瘤药物的 60 %以上， 1995- 1999年， 3 个天然产物衍生物作为新的抗肿瘤药物上市， 由此可 见， 天然产物是结构新颖和作用独特的抗肿瘤药物 的重要来源。 目前发现的多肽 类化合物具有广泛的生物学活性，据报道， 含有噻唑环和恶唑环的环肽具有很强 的细胞毒活性， 例如 Urukthapelstatin A对人体肺癌细胞的 IC _5Q 值惊人的达到了 12nM o 发明内容：

本发明的第一个目的是提供一个新的具有抗肿 瘤活性的含四噻唑的内酰胺 化合物 Tetrathiazomycin A或其盐。

本发明的含四噻唑的内酰胺化合物 Tetrathiazomycin A或其盐， 其结构如式 ( I ) 所示：

( D o

本发明的第二个目的是提供化合物 Tetrathiazomycin A的制备方法， 其特征 在于， 所述的化合物 Tetrathiazomycin A 是从放线菌 Marinactinospora thermotolerans SCSIO 00652的发酵培养物中制备分离得到的。

优选通过以下方法从放线菌 Marinactinospora thermotolerans SCSIO 00652 的发酵培养物中制备分离得到 Tetrathiazomycin A， 具体步骤如下：

a)制备放线菌 Man 7a _C ^ _0¾ 9 _0ra thermotolerans SCSIO 00652的发酵培养物， 将该发酵培养物的发酵液和菌丝体分离开，发 酵液用乙酸乙酯萃取， 乙酸乙酯相 经浓縮后得到浸膏 A;

b )浸膏 A经正相硅胶柱层析， 以氯仿 /甲醇作为洗脱剂，从体积比 100: 0-1： 1进行梯度洗脱， 收集氯仿 /甲醇体积比 92: 8〜1： 1梯度洗脱下来的馏分 Fr.5-8， 再经硅胶柱层析， 用乙酸乙酯 /甲醇作为洗脱剂， 从体积比 94: 6〜8： 2进行梯度 洗脱，收集体积比 9: 1〜8： 2洗脱的组分 Fr.5-8-1 ,再经 ODS反相中压液相色谱， 以体积分数从 10%〜100%的甲醇 /水梯度洗脱， 收集体积分数 80〜90%的甲醇 /水 梯度洗脱下来的馏分， 最后经高效液相色谱纯化后得到 Tetrathiazomycin A。

所述的 a) 步骤的制备 Man'wact ww/wra thermotolerans SCSIO 00652的发酵 培养物是通过以下方法制备的：将活化的 Marinactinospora thermotolerans SCSIO 00652接入种子培养基中， 28 °C， 200 rpm, 培养 4 d制得种子液， 将种子液按 10%的接种量接到发酵培养基中， 28 °C， 200 rpm, 振荡培养 7d， 而制得发酵培 养物， 所述的种子培养基和发酵培养基的配方都为每 升培养基中含有： 淀粉 10 g， (NH ₄ ) ₂ S0 ₄ 2g, K ₂ HP0 ₄ lg， MgS0 ₄ -7H ₂ 0 lg， NaCl lg， 蛋白胨 lg， 酵母提 取粉 0.5g， trace element solution 0.1 mL, 粗海盐 30 g， 余量为水， pH 7.4。

本发明的第三个目的是提供 Man'wact ww/wra thermotolerans SCSIO 00652 在制备化合物 Tetrathiazomycin A中的应用。 本发明通过实验发现， 本发明的 Tetrathiazomycin A对神经胶质瘤细胞株 ( SF-268 ) , 乳腺癌细胞株 （MCF-7 ) , 人大细胞肺癌细胞株 （NCI-H460 ) 和人 肝癌细胞 （HepG-2 ) 具有较好的细胞毒活性， 其 IC _5Q 分别为 38χ 10— ² μΜ、 43 10" ² μΜ 47χ 10— ² μΜ和 52χ 10— ² μΜ， 可应用于制备抗肿瘤药物。

因此， 本发明的第四个目的是提供 Tetrathiazomycin A在制备抗肿瘤药物中 的应用。

所述的抗肿瘤药物优选为抗神经胶质瘤药物、 抗乳腺癌药物、抗肺癌药物或 抗肝癌药物。

本发明从放线菌属 Mar^act ww/wra thermotolerans SCSIO 00652的发酵培 养物中分离得到新的具有抗肿瘤活性的化合物 Tetrathiazomycin A， 为化合物 Tetrathiazomycin A的制备开辟了新的途径，并且本发明的化合� � Tetrathiazomycin

A具有较好的抗肿瘤活性， 能应用制备抗肿瘤药物中， 为抗肿瘤药物的开发提供 了先导化合物。

本发明的放线菌属 Man'wact ww/wra thermotolerans SCSIO 00652是已知菌 种，公开于非专利文献：探侮放线葡 Marinactinospora thermotolerans SCSIO 00652 遗传操作系统的建立. 李军、 朱清华、 张云、 马俊英、 田新朋、 李文均、 张长生、 鞠建华. 中国抗生素杂志. 2012 ( 2 ) 105〜111。 本申请人保证自申请日起 20年 内向公众提供该 Marinactinospora thermotolerans SCSIO 00652菌株。 附图说明：

图 1是 Marinactinospora thermotolerans. SCSIO 00652的电镜扫描图， 其中图 1A 和图 1B是不同倍数下的电镜扫描图；

图 2是 Tetrathiazomycin A的 X-单晶衍射图。 具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明， 而不是对本发明的限制。

实施例 1 :

Tetrathiazomycin A的分离和制备

1、 培养基 A、种子培养基：每升培养基中含有：淀粉 10 g， (NH ₄ ) ₂ S0 ₄ 2g， K ₂ HP0 ₄ lg， MgS0 ₄ '7H ₂ 0 lg, NaCl lg, 蛋白胨 lg， 酵母提取粉 0.5g， trace element solution 0.1 mL, 粗海盐 30g， 余量为水， pH7.4。 121°C， 灭菌 30 min;

B、 发酵培养基： 配方同种子培养基。 121°C， 灭菌 30min。

2、 发酵

将活化的放线菌属 Marinactinospom thermotolerans . SCSIO 00652 (其电镜扫 描图如图 1所示）接入 6L种子培养基中， 28°C， 200 rpm,培养 4 d制得种子液， 将 6L的种子液接入到 60L发酵培养基中， 28 °C， 200 rpm, 振荡培养 7d， 而制 得发酵培养物。

3、 萃取

发酵培养物先进行离心分离（4000 rmin- ¹ , lOmin), 将发酵液和菌丝体分离 开， 发酵液经等体积的乙酸乙酯萃取， 乙酸乙酯层经蒸馏浓縮后得到浸膏 A (20.1g

4、 化合物 TetrathiazomycinA (1) 的提取分离和鉴定

浸膏 A经正相硅胶柱层析（硅胶 100〜200目）， 以氯仿 /甲醇作为洗脱剂， 从 体积比 100: 0-1： 1进行梯度洗脱， 收集氯仿 /甲醇体积比 92: 8〜1： 1梯度洗脱 下来的馏分 Fr.5-8， 再经硅胶柱层析， 用乙酸乙酯 /甲醇作为洗脱剂， 从体积比 94： 6-8： 2进行梯度洗脱， 收集体积比 9: 1-8： 2洗脱的组分 Fr.5-8-l， 再经 ODS反相中压液相色谱（S-50 μηι, 12 nm; 100 20 mm, YMC)，流速为 15 ml/min, 以体积分数从 10%〜100%的甲醇 /水梯度洗脱 60min， 收集体积分数 80〜90%的甲 醇 /水梯度洗脱下来的馏分， 最后经高效液相色谱 （ODS-A, 250 10 mm, 5 μηι; YMC), 流速为 2.5 ml/min， 以体积分数从 70%〜100%的乙腈 /水梯度洗脱 30min， 在保留时间为 22min得到化合物 1 (TetrathiazomycinA) (16mg)。

通过结构分析，对本发明的从 Mar^actww/wra thermotolerans. SCSIO 00652 的发酵培养物中制备得到的化合物 1 (TetrathiazomycinA) 进行鉴定， 其鉴定结 果如下：

白色固体，其核磁数据归属如表 1所示， 700° (c = 0.2, MeOH 1HNMR (500 MHz, CD ₃ OD) 及 ¹³ CNMR(125 MHz，CD ₃ OD)， 见表 1。 熔点： 115〜116°C。 HR-ESI-MS m/z 666.1382 ([M+H] ⁺ , 理论值 666.1444). 其 X-单晶衍射图如图 2 所示。

表 1 : 化合物 1 (Tetrathiazomycin A) 的核磁数据 H-NMR数据于 500MHz测定， 括号 中为偶合常数 (Hz)， ¹³ C-NMR数据于 125MHz测定， 溶剂为氘代甲醇） position ， multi. (</ in Hz) HMBC ^l U- ^l U COSY

1 171.3, qC

2 6.99, d (8.1) C-l H-3

3 5.50, m 47.1, CH C-5 H-2, 4

4 1.61, d (7.1) 23.0, CH ₃ C-3, 5 H-3

5 174.3, qC

7 7.74, s 118.2, CH C-5, 8, 10

8 147.2, qC

10 161.1, qC

12 7.72, s 118.3, CH C-10, C-l 3, C-15

13 148.1, qC

15 161.0, qC

17 7.66, s 122.3, CH C-l 5, C-l 8, C-20

18 148.9, qC

20 161.7, qC

22 3.70, d (10.8) 36.3, CH ₂ C-20, 23, 25 H-23

23 4.81, t (10.5) 78.8, CH C-20, 25 H-22

25 170.3, qC

26 8.19, d (10.2) C-25 H-27

27 5.12, td (3.8, 10.8) 56.4, CH C-25, 28 H-26, 28

28 2.98 , dd (11.4, 13.5); 40.3, CH ₂ C-27, 29, 30, 34 H-27

3.53, dd (3.8, 13.6)

29 137.1, qC

30/34 7.34, d (7.4) 129.4, CH C-28, 32

31/33 7.27, t (7.4) 128.5, CH C-29, 33

32 7.20, t (7.4) 126.9, CH C-30, 34

35 172.0, qC

36 8.48, d (9.6) C-35 H-37

37 4.70, dd (3.7, 9.6) 58.0, CH C-1, 35, 38, 39, 40 H-36, 38

38 2.12, m 36.6, CH C-41 H-37, 39, 40

39 0.79, dd (7.1, 15.5) 16.0, CH ₃ C-37, 38, 40 H-38

40 1.02, m; 1.34, m 24.8, CH ₂ H-38, 41

41 0.49, t (7.4) 11.8, CH ₃ C-38, 40 H-40 综上所述， 鉴定化合物 1的结构式如式（ I )所示， 命名为 Tetrathiazomycin

(1)。

实施例 2: TetrathiazomycinA的抗肿瘤活性测定

测试 TetrathiazomycinA对神经胶质瘤细胞株 SF-268,乳腺癌细胞株 MCF-7, 人大细胞肺癌细胞株 NCI-H460和人肝癌细胞 HepG-2的抑制率和 IC _5Q 值测定。

采用国际通用的肿瘤细胞株， 即： 神经胶质瘤细胞株 （SF-268), 乳腺癌细 胞株 （MCF-7), 人大细胞肺癌细胞株 （NCI-H460) 和人肝癌细胞 （HepG-2)。 试验方法为国际通用的 SRB法： 根据细胞生长速度， 将处于对数生长期的肿瘤 细胞以 180 μΙ7孔接种于 96孔板， 贴壁生长 24小时再加药 （不同浓度的化合物 1的 RPMI-1640溶液） 20 μΙ7孔。每个浓度设 3复孔。 并设相应的 RPMI-1640溶 媒对照及无细胞凋零孔。 肿瘤细胞在 37 。C、 5%的 C0 ₂ 条件下培养 72小时， 倾 去培养液， 每孔加入 50 μΐ,的 50% 冷 TCA固体细胞， 然后采用 0.4%的 SRB染 色 30分钟， 用 1%的乙酸洗涤 5次， 空气干燥。 最后加入 200μΙ7孔的 Tris溶液， 酶标仪 570nm波长测定 OD值。 以顺铂作为阳性对照。 实验结果见表 2:

表 2: TetrathiazomycinA对肿瘤细胞株的抑制作用 （IC ₅ 。， μΜ)

SF-268 MCF-7 NCI-H460 HepG-2

TetrathiazomycinA 38x10— ² 43x10— ² 47x10— ² 52x10— ²

顺铂 Cisplatin" 20x10— ³ 47x10— ⁴ 27 10^ 14x10— ³

Positive control