LEURS UTILISATIONS EN DIAGNOSTIC

Domaine de l'invention

L'invention concerne des anticorps dirigés contre le canal sodique Nav 1.9 et leur utilisation dans le diagnostic de pathologies associées à une douleur entérique ou orofaciale.

Contexte de l'invention

Les canaux sodium voltage-dépendants sont des acteurs essentiels de l'initiation et de la propagation des potentiels d'actions au niveau des cellules dites « excitables ». Ces canaux sodiques sont principalement exprimés au niveau des neurones du système nerveux central et périphérique et au niveau des cellules musculaires. Il s'agit de protéines transmembranaires comprenant une large sous-unité alpha (a) d'environ 260 kDa associée à une ou plusieurs sous-unités béta de 33 à 38 kDa. La sous-unité alpha forme le cœur du canal et comprend quatre domaines membranaires homologues (I-IV), chacun constitué de 6 segments transmembranaires (S1-S6). Les domaines membranaires de la sous unité alpha sont reliés entre eux par de grandes boucles intracellulaires qui comprennent de nombreux sites de régulation. La sous-unité alpha est responsable des propriétés de conductance et de sélectivité du canal alors que les sous-unités béta sont impliquées dans la stabilisation et dans les propriétés cinétiques du canal. A ce jour, 10 isoformes pour la sous-unité alpha ont été identifiées chez l'homme. Le nom attribué à ces isoformes contient le symbole de l'ion transporté (Na), avec en indice l'élément régulateur (le voltage v). Les chiffres qui suivent désignent la sous-famille de gènes et le numéro associé à l'isoforme considérée. A ce jour, la principale sous-famille de gènes identifiée comprend les isoformes Navl. l à Navl.9. Une isoforme supplémentaire, plus éloignée, Nax a été également identifiée. Le pourcentage d'identité de séquence entre les différences isoformes Navl. l à Nav 1.9 est d'au moins 60%. Les isoformes Navl. l à Navl.9 se différencient, entre autres, par leur sensibilité à la tétrodotoxine (TTX), un bloqueur très puissant et sélectif des canaux sodiques, et par leur distribution tissulaire. Les isoformes Navl.l à Navl.4, Navl.6 et Nav 1.7 sont dites sensibles à la TTX avec des EC50 de l'ordre du nanomolaire. Les isoformes Navl.5, Navl.8 et Navl.9 sont considérées, quant à elles, comme résistantes à la TTX. A cet égard, TEC50 de la TTX pour Navl.9 est d'environ 200 μΜ. En ce qui concerne la distribution tissulaire, les isoformes Navl. l, Nav 1.2, Nav 1.3 et Navl.6 sont principalement exprimées au niveau du système nerveux central. L'isoforme Navl.4 est exprimée principalement au niveau des myocytes squelettiques alors que Nav 1.5 est essentiellement présente, chez l'individu adulte, au niveau des myocytes cardiaques. Enfin, les isoformes Navl.7, Navl.8 et Navl.9 sont exprimées au niveau du système nerveux périphérique (SNP). Nav 1.9 a été initialement détecté au niveau des neurones sensitifs des ganglions trijumeaux et des ganglions spinaux. Des expériences d'invalidation du gène de Nav 1.9 ont confirmé l'implication de ce canal sodique dans la nociception, en particulier dans l'hyperexcitabilité des nocicepteurs et l'hyperalgie associée à l'inflammation. Plus récemment, Padilla et al. (Molecular and Cellular Neuroscience , 2007; 35(1): 138-52) ont mis en évidence, chez le rat, que Nav 1.9 est exprimé au niveau des terminaisons nerveuses du nerf trijumeau, et au niveau des neurones sensitifs afférents du plexus myentérique et sous-muqueux du duodénum. Cette distribution tissulaire suggère que Nav 1.9 pourrait être impliqué dans la perception des douleurs orofaciales et dans certains troubles intestinaux. Enfin, Lolignier et al. (PlosOne, 2011, e23083) ont montré une surexpression de Nav 1.9 au niveau des fibres nerveuses innervant un foyer inflammatoire chez un modèle murin d'inflammation aiguë. Ces auteurs ont également montré, grâce à des modèles murins, que Nav 1.9 est impliqué dans l'hypersensibilité à la douleur mécanique et thermique associée aux inflammations subaiguë et chronique.

Néanmoins, l'implication de Nav 1.9 dans les pathologies humaines reste encore à explorer. A la connaissance des demandeurs, aucun anticorps ciblant spécifiquement Nav 1.9 humain (hNav 1.9) et utilisable pour la détection et la quantification de cette protéine dans des tissus humains n'a été décrit à ce jour. Il existe donc à l'heure actuelle un besoin de nouveaux outils biochimiques de détection et de quantification tissulaire de hNav 1.9.

Résumé de l'invention

L'invention a pour objet un anticorps dirigé contre Nav 1.9 humain caractérisé en ce que ledit anticorps se lie à un épitope inclus dans un peptide de séquence SEQ ID N°l, SEQ ID N°2 ou SEQ ID N°3. L'anticorps selon l'invention est adapté à une utilisation pour la détection ou la quantification de Nav 1.9 dans un échantillon biologique, de préférence tissulaire. L'anticorps selon l'invention peut être un anticorps polyclonal, de préférence d' isotype IgG ou IgM, ou un anticorps monoclonal. L'anticorps peut être chimérique ou humanisé. Il peut être choisi parmi une immunoglobuline comprenant 2 chaînes lourdes et 2 chaînes légères, un anticorps à simple domaine (sdab), ou une IgNar, un polypeptide comprenant un domaine variable d'un anticorps tel qu'un ScFv, un VH, un V _H H, un V _NAR , un Fab, et les versions chimériques ou humanisés de ceux-ci. Dans certains modes de réalisation, l'anticorps selon l'invention ne se lie pas à Nav 1.5 et Nav 1.7, de préférence humain. Dans un mode de réalisation supplémentaire, l'anticorps selon l'invention est obtenu à partir d'anticorps, ou de cellules exprimant des anticorps, provenant d'un animal non-humain immunisé avec un composé antigénique comprenant au moins un peptide ayant au moins 90% d'identité de séquence avec SEQ ID N°l, SEQ ID N°2 ou SEQ ID N°3. Dans certains modes de réalisation, le composé antigénique comprend au moins un peptide de SEQ ID N°l, SEQ ID N°2 ou SEQ ID N°3 ou un peptide ayant une séquence qui diffère de SEQ ID N°l, N°2 ou N°3 en vertu d'une, de deux, ou de trois modifications d'acide aminé.

L'anticorps selon l'invention peut être couplé à un moyen de détection, de préférence choisi parmi une enzyme produisant un signal détectable telle que la peroxydase de raifort, la phosphatase alcaline, la 3-galactosidase, ou la glucose-6-phosphate déshydrogénase, un chromophore, un composé fluorescent, un composé luminescent, un radionucléide tel que

32 P, 35 S ou 125 I, une particule métallique, par exemple une nanoparticule d'or, une biotine, une streptavidine, une avidine, un sucre ou une lectine.

Un objet supplémentaire de l'invention est une méthode de préparation d'un anticorps dirigé contre Nav 1.9 humain comprenant une étape d'immunisation d'un animal non-humain avec un composé antigénique comprenant au moins un peptide ayant au moins 90% d'identité de séquence avec SEQ ID N°l, de SEQ ID N°2 ou SEQ ID N°3. Dans certains modes de réalisation, le composé antigénique comprend au moins un peptide de SEQ ID N°l, SEQ ID N°2 ou SEQ ID N°3 ou un peptide ayant une séquence qui diffère de SEQ ID N°l, N°2 ou N°3 en vertu d'une, de deux, ou de trois modifications d'acide aminé. Le composé antigénique peut en outre comprendre une protéine porteuse couplée à une ou plusieurs copies dudit peptide.

Dans certains modes de réalisation, la méthode de préparation selon l'invention peut comprendre, en outre, la récupération de l'anticorps dirigé contre Nav 1.9 humain à partir du plasma sanguin de l'animal non-humain, après immunisation.

Dans d'autres modes de réalisation, la méthode de préparation selon l'invention peut comprendre, la production de l'anticorps dirigé contre Nav 1.9 par un hybridome obtenu à partir d'une cellule exprimant des anticorps, de préférence un lymphocyte B, provenant de l'animal non-humain, après immunisation.

L'invention a également pour objet l'utilisation d'un anticorps tel que décrit précédemment pour la détection ou la quantification de Nav 1.9 dans un échantillon biologique humain. L'échantillon biologique peut être un résidu chirurgical, une biopsie ou un prélèvement post- mortem. Un objet supplémentaire de l'invention est l'utilisation dudit anticorps pour le diagnostic, le pronostic et/ou la prédiction in vitro d'une pathologie, de préférence à caractère inflammatoire, associée à une douleur entérique ou à une douleur orofaciale. Les pathologies associées à une douleur entérique comprennent, entre autres, le syndrome de l'intestin irritable, les maladies inflammatoires chroniques intestinales telles que la maladie de Crohn et la colite ulcéreuse. Les pathologies provoquant une douleur orofaciale comprennent, entre autres, une hypersensibilité dentaire (dents sensibles), une pulpite, une odontalgie, une douleur des muscles maxillaires ou des articulations temporo-mandibulaires, une névralgie, de préférence idiopathique, du nerf trijumeau, une céphalée et une brûlure idiopathique de la langue et de la bouche.

Dans des modes de réalisations préférés, l'anticorps dirigé contre Nav 1.9 selon l'invention est utilisé pour détecter ou quantifier Nav 1.9 dans un échantillon tissulaire humain comprenant un ganglion et/ou une fibre nerveuse sensitive du tube intestinal ou d'une zone orofaciale. L'échantillon tissulaire peut être ainsi choisi parmi un échantillon de pulpe dentaire, un échantillon de ganglions myentériques, un échantillon de ganglions du plexus sous-muqueux, un échantillon comprenant des fibres nerveuses du plexus myentérique ou sous-muqueux. La détection ou la quantification de Nav 1.9 par l'anticorps selon l'invention peut être réalisée par western blot, par immunodosage ou par immunomarquage. Une méthode de détection ou de quantification de Nav 1.9 particulièrement préférée est l'immunohistochimie.

Enfin, la présente invention a également pour objet un kit, ou l'utilisation d'un kit, pour le diagnostic d'une pathologie associée à une douleur viscérale ou à une douleur orofaciale, comprenant au moins un anticorps dirigé contre Nav 1.9 selon l'invention et en option un moyen de détection dudit anticorps.

Figures

La Figure 1 montre les résultats d'immunomarquage de cellules HEK après fixation au PAF (paraformaldéhyde) 2% par un anticorps monoclonal anti-Myc et l'anticorps anti-hNav 1.9 Rbaa4. Figure la : cellules transfectées avec phNavl.9-myc. Figurelb : cellules non transfectées.

La Figure 2 montre les résultats d'immunomarquage avec l'anticorps Rbaa4 des cellules co- transfectées avec hNav 1.5 et un plasmide codant pour la GFP (Figure 2A) ou hNav 1.7 et un plasmide codant pour la GFP (Figure 2B). Alors que le signal émis par la GFP est clairement visible, le marquage avec Rbaa4 des cellules est très faible voire inexistant. La Figure 3 montre les western blot réalisés sur des extraits protéiques de cellules HEK non transfectées ou transfectées avec un plasmide codant pour hNav 1.9-myc. NT : lysat de cellules non-transfectées (témoin négatif), T : lysat de cellules transfectées. Les anticorps Rbaa4 et Rbaaô reconnaissent une bande protéique

d'un poids moléculaire d'environ 250 kDa qui n'est pas détectée pour les cellules non transfectées. Cette bande est bien reconnue par l'anticorps anti-Myc.

La Figures 4 montre l'immunomarquage d'une coupe transverse de côlon chimiquement fixée au paraformaldéhyde. De haut en bas : marquage avec un anticorps anti HuC/D, marquage avec l'anticorps Rbaa4, comarquage HuC/D et Nav 1.9. * : neurones immunopositifs pour Nav 1.9, ⁰ : neurones immunonégatifs pour Nav 1.9.

La Figures 5 montre l'immunomarquage d'une coupe transverse de côlon chimiquement fixée au paraformaldéhyde par un anticorps anti-HuC/D (figure 5 A) et par l'anticorps Rbaaô (Figure 5B). Le résultat de co-marquage est montré à la figure 5C. * : neurones immunopositifs pour Nav 1.9, ⁰ : neurones immunonégatifs pour Nav 1.9.

La Figure 6 montre l'immunomarquage d'une coupe transverse de côlon cryofixée. De haut en bas : marquage avec un anticorps anti-NF200, marquage avec l'anticorps 3881.1, comarquage. * : neurones immunopositifs pour Nav 1.9, ⁰ : neurones immunonégatifs pour Nav 1.9.

La Figure 7 montre l'immunomarquage d'un échantillon de pulpe dentaire radiculaire fixée au paraformaldéhyde par un anticorps anti-périphérine (Figure 7 A) et par l'anticorps Rbaa4 (Figure 7B). Le résultat de co-marquage est montré à la figure 7C.

La Figure 8 montre l'immunomarquage d'un échantillon de pulpe dentaire radiculaire fixée au paraformaldéhyde par un anticorps anti-périphérine (Figure 8 A) et par l'anticorps Rbaaô (Figure 8B). Le résultat de co-marquage est montré à la figure 8C.

La Figure 9 montre l'immunomarquage d'un échantillon de plexus sub-odonblastique (pulpe dentaire coronaire) cryofixée par un anticorps anti-périphérine (Figure 9A) et par l'anticorps 3881.1 (Figure 9B). Le résultat de co-marquage est montré à la figure 9C.

La Figure 10 montre l'immunomarquage d'un échantillon de pulpe dentaire radiculaire cryofixée par un anticorps anti-périphérine (Figure 10A) et par l'anticorps 3881.1 (Figure 10B). Le résultat de co-marquage est montré à la figure 10C.

La Figure 11 montre l'immunomarquage d'un échantillon de ganglion trijumeau (prélèvement post-mortem) cryofixé par un anticorps anti-NF200 (Figure 11 A) et par l'anticorps Rbaaô (Figure 11B). Le résultat de co-marquage est montré à la figure 11C. Description détaillée de l'invention

Les Demandeurs ont préparé trois anticorps polyclonaux - dénommés ci-après Rbaa4, 3881-1 et Rbaaô - dirigés contre Nav 1.9 humain. Ces anticorps ont été obtenu par immunisation d'un animal non-humain (lapin) avec un composé antigénique comprenant un peptide de séquence SEQ ID N°l, SEQ ID N°2 ou SEQ ID N°3. Le peptide de séquence SEQ ID N°l correspond à un fragment de la partie N-terminale de Nav 1.9 humain (hNav 1.9) alors que les peptides de séquence SEQ N°2 et SEQ ID N°3 sont des fragments provenant des boucles intracellulaires reliant les domaines transmembranaires I-II et II- III de hNav 1.9, respectivement. Les Demandeurs ont mis en évidence que ces anticorps polyclonaux sont capables de détecter in vitro la présence de Nav 1.9 et ceci de manière spécifique. Grâce à ces anticorps, les Demandeurs ont montré que hNav 1.9 est exprimé au niveau des fibres sensitives non- myélinisées de la pulpe dentaire et du plexus myentérique provenant d'échantillons humains. Ces résultats suggèrent fortement une implication de Nav 1.9 dans des pathologies associées à une douleur entérique ou orofaciale. Par ailleurs, les Demandeurs ont également montré que le canal sodique Nav 1.9 est impliqué dans les mécanismes de relargage de peptides proinflammatoires par les neurones sensitifs, consécutivement à leur stimulation. Nav 1.9 serait donc également impliquée dans la potentialisation des réponses inflammatoires neurogènes. Ainsi, la présente invention concerne des anticorps dirigés contre Nav 1.9 humain, et leur procédé de préparation. L'invention concerne également l'utilisation de ces anticorps dans le diagnostic de pathologies associées à une douleur orofaciale ou entérique, de préférence à caractère inflammatoire.

^■ Anticorps dirigés contre Nav 1.9

Selon un premier aspect, l'invention concerne un anticorps dirigé contre Nav 1.9 humain (également désigné ici hNav 1.9 et Nav 1.9). Cet anticorps est caractérisé en ce qu'il est capable de se lier à un épitope inclus dans un peptide de séquence SEQ ID N°l, SEQ ID N°2 ou SEQ ID N°3.

On entend par « Nav 1.9 » ou « hNav 1.9 » la sous-unité alpha humaine Nav 1.9 constitutifs de certains canaux sodiques dépendants du potentiel (ou voltage-dépendants) humains. La sous- unité alpha Nav 1.9 est codée par le gène SCN11A qui est également dénommé NaN, SCN12A et SNS-2 dans la littérature. Le numéro d'identifiant du gène Nav 1.9 humain dans la base de gènes du NCBI est 11289 (NCBI Gene ID). La séquence protéique de Nav 1.9 humain est notamment décrite dans la base de séquences UniProt (Référence de séquence : Q9UI33) et celle du NCBI (référence de séquence NCBI : NP_054858). En ce qui concerne l'ARNm pour Nav 1.9, voire la séquence de référence NCBI : NM_014139.

Le peptide de séquence SEQ ID N°l correspond à un fragment de la partie N-terminale de hNav 1.9 (acides aminés de la position 31 à 47 de hNavl.9) alors que les peptides de séquence SEQ N°2 et SEQ ID N°3 sont des fragments provenant des boucles intracellulaire reliant les domaines membranaires I-II et II- III de hNav 1.9, respectivement. Plus précisément, le peptide de SEQ ID N°2 correspond au fragment allant de l'acide aminé 473 à l'acide aminé 488 de la séquence de hNavl.9 et le peptide de SEQ ID N°3 correspond au fragment allant de l'acide aminé 945 à l'acide aminé 961 de la séquence de Nav 1.9.

On entend par « anticorps anti-Nav 1.9 » ou par « anticorps dirigé contre Nav 1.9 » tout anticorps ou tout polypeptide comprenant un fragment d'anticorps capable de reconnaître et de se lier spécifiquement à un épitope de la sous-unité alpha Nav 1.9 humain, ledit épitope ayant de préférence une séquence en acides aminés incluse dans SEQ ID N°l, SEQ ID N°2 ou SEQ ID N°3. Nav 1.9 peut être associé à d'autres protéines, par exemple à une sous-unité beta, et/ou exprimé au niveau d'une membrane cellulaire. Dans certains modes de réalisation, les anticorps selon l'invention peuvent se lier à Nav 1.9 présent sous une forme isolée (par exemple sous une forme pré-purifiée, purifiée et/ou non-enchâssée dans une membrane cellulaire). Dans d'autres modes de réalisations les anticorps selon l'invention sont capables de reconnaître Nav 1.9 exprimé au niveau d'une membrane cellulaire et/ou sous la forme de vésicules cytoplasmiques

Les Demandeurs ont montré que les anticorps selon l'invention sont particulièrement adaptés à une utilisation pour la détection ou la quantification de Nav 1.9 dans un échantillon biologique, de préférence un échantillon tissulaire. Les anticorps selon l'invention peuvent être utilisés pour détecter ou quantifier Nav 1.9 par des techniques d'immunomarquage, et/ou d'immunodosage et/ou par western blot. Les anticorps selon l'invention sont particulièrement adaptés à une utilisation dans la détection ou la quantification de Nav 1.9 par immunohistochimie. Il va de soi que les échantillons sont des échantillons biologiques humains c'est-à-dire des échantillons qui sont préalablement collectés ou prélevés sur un être humain. Les échantillons biologiques préférés selon l'invention sont décrits en détail ci- après.

Sans vouloir être lié par une quelconque théorie, les Demandeurs sont d'avis que les propriétés de détection des anticorps selon l'invention résultent des épitopes spécifiques de Nav 1.9 contre lesquels les anticorps sont dirigés. En effet, les Demandeurs ont montré que des anticorps dirigés contre d'autres régions de Nav 1.9 - par exemple contre le peptide de SEQ ID N°4 de la boucle intracellulaire liant les domaines membranaires II- III de Nav 1.9 - présentent soit une sensibilité trop faible (c'est-à-dire une affinité trop faible pour Nav 1.9) et/ou une spécificité trop faible pour être utilisés pour la détection ou la quantification tissulaire de Nav 1.9.

Dans certains modes de réalisations, l'anticorps selon l'invention a été obtenu à partir d'un anticorps, de préférence plasmatique, ou d'une cellule exprimant des anticorps, ledit anticorps ou ladite cellule provenant d'un animal non-humain immunisé avec un composé antigénique comprenant au moins un peptide ayant au moins 90% d'identité de séquence avec SEQ ID N°l, SEQ ID N°2 ou SEQ ID N°3. Dans certains modes de réalisation, le composé antigénique comprend au moins un peptide de SEQ ID N°l, SEQ ID N°2 ou SEQ ID N°3 ou un peptide ayant une séquence qui diffère de SEQ ID N°l, N°2 ou N°3 en vertu d'une, de deux, ou de trois modifications d'acide aminé.

De préférence, le composé antigénique comprend au moins un peptide de séquence SEQ ID N°l, SEQ ID N°2 ou SEQ ID N°3. On entend par « composé antigénique » un composé dont l'administration à un animal non-humain, seule ou en combinaison avec un immunoadjuvant, est capable d'induire une réaction immunitaire humorale. Dans un mode de réalisation préféré, le composé antigénique comprend plusieurs copies dudit peptide ou desdits peptides ci-dessus décrits, éventuellement couplées entre elles. Dans certains modes de réalisation, le composé antigénique comprend une protéine porteuse sur laquelle est greffée une ou plusieurs copies d'un peptide ou de plusieurs peptides tels que définis précédemment.

Des méthodes pour obtenir un anticorps selon l'invention sont décrites en détails ci-après. Comme mentionné ci-avant, un anticorps selon l'invention peut être tout anticorps ou polypeptide comprenant un fragment d'anticorps capable de reconnaître et de se lier spécifiquement à Nav 1.9 humain, de préférence à un épitope inclus dans une région de Nav 1.9 de séquence choisie parmi SEQ ID N°l, SEQ ID N°2 et SEQ ID N°3. L'anticorps selon l'invention peut être un anticorps monoclonal ou polyclonal. On entend, par « anticorps polyclonaux » ou « anticorps polyclonal », un mélange d'anticorps dirigés contre plusieurs épitopes. On entend par « anticorps monoclonal » ou « anticorps monoclonaux », un anticorps ou un ensemble d'anticorps qui reconnaisse un même et unique épitope.

L'anticorps selon l'invention peut être un anticorps humanisé ou chimérique. Dans certains modes de réalisations, il est préparé par un procédé incluant une étape d'immunisation d'un animal non-humain. A titre alternatif, il peut être préparé par des techniques de génie génétique. Dans certains modes de réalisation, l'anticorps est une immunoglobuline « entière » c'est-à- dire qu'il a la structure d'une immunoglobuline présente naturellement dans un plasma sanguin. Il peut s'agir d'une immunoglobuline comportant 2 chaînes lourdes et 2 chaînes légères, par exemple une immunoglobuline d'isotype G, ou d'un anticorps à chaîne lourde, c'est-à-dire constitué de 2 chaînes lourdes et dépourvu de chaînes légères tel qu'un anticorps à chaîne lourde d'un camélidé (HcAb) ou une IgNAR d'un poisson cartilagineux.

Dans d'autres modes de réalisation, l'anticorps selon l'invention est un polypeptide comprenant un fragment d'une immunoglobuline, de préférence un domaine variable capable de se lier à Nav 1.9, en particulier à un épitope inclus dans un peptide de séquence SEQ ID N°l, SEQ ID N°2 et SEQ ID N°3. L'anticorps selon l'invention peut être choisi parmi un ScFv, un VH, un V _H H (également appelé anticorps à simple domaine), un V _NAR , un Fab, ou un Fab2, les versions chimériques et humanisés de ceux-ci et les polypeptides les comprenant. A titre d'exemple, l'anticorps selon l'invention peut être une protéine de fusion comprenant un domaine ScFv humanisé fusionné avec les domaines CH3-CH2 du domaine Fc d'une IgG humaine.

Dans un mode de réalisation préféré, l'anticorps selon l'invention est un anticorps polyclonal. Dans un mode de réalisation supplémentaire, l'anticorps est spécifique de Nav 1.9, en particulier par rapport à Nav 1.5 et/ou Nav 1.7. Ceci signifie que l'affinité de l'anticorps selon l'invention pour Nav 1.9 est supérieure à celle observée pour une autre protéine, en particulier Nav 1.5 et/ou Nav 1.7.

La spécificité de l'anticorps selon l'invention pour Nav 1.9 peut être déterminée par toute méthode connue de l'homme du métier. Lorsque l'anticorps selon l'invention est monoclonal, on peut comparer par exemple sa constante de dissociation (Kd) pour Nav 1.9 par rapport à son éventuel Kd pour l'autre protéine. Les constantes de dissociation peuvent être déterminées par toute méthode adaptée, y compris par résonance plasmonique de surface. On peut considérer que l'anticorps selon l'invention est spécifique de Nav 1.9 par rapport à une autre protéine si sa constante de dissociation pour Nav 1.9 est au moins 10 fois inférieure, de préférence au moins 100 voire au moins 1000 fois inférieure, à celle observée pour l'autre protéine.

De manière générale, le Kd d'un anticorps monoclonal selon l'invention est généralement inférieur à 10 ^"6 , de préférence 10 ^"9 M.

Lorsque l'anticorps selon l'invention est polyclonal, on peut évaluer sa spécificité vis-à-vis de Nav 1.9 et d'une autre protéine par immunomarquage, comme cela est illustré dans les exemples. A cette fin, on effectue un immunomarquage avec l'anticorps selon l'invention d'une première culture cellulaire exprimant de manière recombinante le Nav 1.9 humain, et d'une seconde culture cellulaire exprimant de manière recombinante l'autre protéine.

On considère que l'anticorps est spécifique de Nav 1.9 par rapport à l'autre protéine si le marquage obtenu pour la première culture cellulaire exprimant Nav 1.9 est plus important (d'au moins 20%, de préférence d'au moins 50% en intensité et/ou en surface) par rapport à celui obtenu pour la seconde culture cellulaire. A titre alternatif, la spécificité d'un anticorps peut être évaluée grâce à des expériences de western blot effectuées sur des extraits protéiques provenant des systèmes cellulaires ci-dessus mentionnés.

Dans certains modes de réalisation, l'anticorps selon l'invention ne lie pas Nav 1.5 et/ou Nav.1.7. En d'autres termes, le rapport de sa constante de dissociation pour Nav 1.9 sur celle de Nav 1.5 et/ou Nav 1.7 est au plus égale à 10 ^"3 , de préférence 10 ^"4 et/ou le marquage avec l'anticorps selon l'invention d'une culture cellulaire exprimant Nav 1.5 et/ou Nav 1.7 (sans exprimer Nav 1.9) est faible, voire inexistant, en comparaison avec le marquage obtenu pour une lignée cellulaire identique exprimant Nav 1.9 (sans exprimer Nav 1.5 ou Nav 1.7).

Dans d'autres modes de réalisation l'anticorps selon l'invention ne présente pas une réactivité croisée vis-à-vis d'une protéine homologue à Nav 1.9 humain. Par exemple, l'anticorps selon l'invention ne lie pas Nav 1.9 de rat, de lapin ou de souris.

Dans un mode de réalisation supplémentaire, l'anticorps selon l'invention ne présente pas de réactivité croisée vis-à-vis de hNav 1.8, et/ou hNav 1.7 et/ou hNav 1.5, et/ou des Nav 1.9 non- humains.

Dans un autre mode de réalisation, l'anticorps dirigé contre Nav 1.9 est couplé à un moyen permettant sa détection. Le moyen de détection peut être tout moyen connu par l'homme du métier. Il peut s'agir d'une enzyme produisant un signal détectable par exemple par colorimétrie, fluorescence, luminescence, comme la peroxydase de raifort, la phosphatase alcaline, la 3-galactosidase, ou la glucose-6-phosphate déshydrogénase. A titre alternatif, l'anticorps peut être couplé à un chromophore, par exemple, un composé fluorescent, luminescent ou colorant. A titre d'exemple de molécules fluorescentes, on peut citer les Alexa ou les phycocyanines. Le moyen de détection peut être également choisi parmi les radionucléides tels que 32 P, 35 S ou le 125 I, les particules métalliques, par exemple, les nanoparticules d'or ou encore les quantum dots. La détection de l'anticorps peut être également effectuée grâce à un système de reconnaissance de type biotine/streptavidine ou avidine ou encore sucre/lectine. Dans ce cas, l'anticorps peut être, par exemple, couplé à la biotine et la détection se fait grâce à la streptavidine ou Γ avidine elle-même marquée par un moyen de détection tels que ceux précédemment cités. Dans d'autres modes de réalisation, l'anticorps selon l'invention n'est pas couplé à un moyen de détection. Dans ce cas, l'anticorps selon l'invention peut être détecté de manière indirecte en utilisant un anticorps de détection (également appelé anticorps secondaire) lui-même couplé à un moyen de détection comme décrit précédemment. L'anticorps de détection peut être par exemple dirigé contre la partie Fc de l'anticorps selon l'invention.

^■ Méthode de préparation d'un anticorps selon l'invention

Un objet supplémentaire selon l'invention est une méthode de préparation d'un anticorps dirigé contre Nav 1.9 humain. Cette méthode peut comprendre une étape d'immunisation d'un animal non-humain avec un composé antigénique comprenant un peptide ayant au moins 80%, de préférence 90% d'identité de séquence avec SEQ ID N°l, SEQ ID N°2 ou SEQ ID N°3. Dans certains modes de réalisation, la méthode de préparation d'un anticorps dirigé contre Nav 1.9 comprend une étape d'immunisation d'un animal non-humain avec un composé antigénique comprenant un peptide de SEQ ID N°l, N°2 ou N°3, ou comprenant un peptide dont la séquence diffère d'une séquence choisie parmi SEQ ID N°l, 2 et 3 en vertu d'une, deux ou trois modifications d'acide aminé.

Au sens de l'invention, une modification d'acide aminé englobe le remplacement (ou la substitution) d'un acide aminé par un autre acide aminé, la délétion d'un acide aminé ou l'insertion d'un acide aminé.

De préférence, la ou les modifications d'acide aminé sont des substitutions conservatives.

L'animal non-humain peut être tout animal utilisé pour générer des anticorps en laboratoire ou dans l'industrie pharmaceutique. Il peut s'agir, par exemple, d'une souris, d'un rat, une chèvre ou d'un lapin. Pour obtenir un anticorps à chaîne lourde, l'animal non-humain est choisi parmi un camélidé ou un poisson cartilagineux.

De préférence, le composé antigénique comprend au moins un peptide de séquence choisie parmi SEQ ID N°l, SEQ N°2 et SEQ ID N°3.

Dans certains modes de réalisation, le composé antigénique peut comprendre plusieurs peptides, par exemple un peptide de séquence SEQ ID N°l et un peptide de séquence SEQ ID N°2, ou un peptide de SEQ ID N°2 et un peptide de SEQ ID N°3, ou encore un peptide de SEQ ID N° 1 et un peptide de SEQ ID N°3.

Dans certains modes de réalisation, le composé antigénique comprend une protéine porteuse couplée à une ou plusieurs copies dudit peptide ou desdits peptides. La protéine porteuse peut être choisie par exemple parmi la KLH (Keyhole limpet hemocyanin), une albumine sérique, une ovalbumine, une poly-L-lysine ou un toxoïde, par exemple le toxoïde tétanique. L'étape d'immunisation de l'animal non-humain comprend l'administration à l'animal non-humain du composé antigénique, seul ou en combinaison avec un immunoadjuvant. L' immuno-adjuvant peut être tout immunoadjuvant classiquement utilisé en recherche, par exemple, l'adjuvant de Freund, une huile minérale comme le specol, un squalène ou un sel d'aluminium. L'administration du composé antigénique peut être faite par toute voie, de préférence par voie sous-cutanée, intramusculaire ou intra-péritonéale. La dose du composé antigénique varie selon l'animal-non humain à immuniser et est comprise généralement entre 10 μg et 10 mg. L'administration du composé antigénique peut être renouvelée plusieurs fois, par exemple 2, 3, 4, 5, 6 fois jusqu'à obtenir une réponse immunitaire humorale satisfaisante. Chaque administration peut être espacée d'un ou plusieurs jours, typiquement de 7 à 30 jours. Les étapes de la méthode de préparation selon l'invention varient selon que l'on souhaite obtenir un anticorps monoclonal, polyclonal ou encore un anticorps chimérique ou humanisé. Les anticorps monoclonaux peuvent être obtenus à partir de cellules productrices d'anticorps, par exemple des lymphocytes B, prélevées après immunisation de l'animal non-humain. Dans ce cas, on utilise la technique classique de préparation d'hybridomes bien connue de l'homme du métier.

Un anticorps polyclonal peut être obtenu à partir du plasma sanguin de l'animal non-humain, prélevé après immunisation, en mettant en œuvre des étapes classiques de purification comme des étapes de centrifugation, de précipitation et de chromatographies d'affinité, en particulier en utilisant comme ligand d'affinité le peptide dérivé de Nav 1.9 présent dans le composé antigénique utilisé pour immuniser l'animal non-humain ou la protéine hNav 1.9 elle-même. On préfère utiliser une chromatographie d'affinité dans laquelle le ligand d'affinité est choisi parmi le groupe constitué par le peptide de séquence SEQ ID N°l, le peptide de séquence SEQ ID n°2 et le peptide de séquence SEQ ID N°3.

Selon un aspect supplémentaire, l'invention a également pour objet une méthode de sélection d'un anticorps dirigé contre hNav 1.9 adapté à une utilisation pour la détection ou la quantification de hNav 1.9 dans un échantillon biologique, de préférence un échantillon tissulaire, par exemple un échantillon de peau, ladite méthode de sélection comprenant les étapes consistant à :

(a) fournir un ou plusieurs anticorps susceptibles d'être dirigé contre hNav 1.9,

(b) mettre en contact le ou les anticorps fournis à l'étape (a) avec un peptide ayant au moins 90%, de préférence 100%, d'identité de séquence avec SEQ ID N°l, SEQ ID N°2 ou SEQ ID N°3, ledit peptide étant de préférence immobilisé sur un support, et

(c) sélectionner le ou les anticorps ayant formé un complexe avec le peptide à l'étape (b). Le ou les anticorps de l'étape (a) peuvent être fournis sous la forme d'une solution comprenant un mélange d'anticorps, par exemple une solution dérivant d'un plasma sanguin, sous une forme isolée (purifiée ou pré-purifiée), chaque anticorps étant testé séparément, ou encore sous la forme d'une librairie d'anticorps exprimée à la surface de phages ou de cellules.

Il va de soi que la présente invention concerne également un anticorps dirigé contre Nav 1.9 obtenu ou susceptible d'être obtenu par l'une des méthodes de préparation ci-dessus décrites.

^■ Utilisations de l'anticorps selon l'invention

Comme mentionné précédemment, les anticorps selon l'invention sont particulièrement adaptés pour une utilisation pour la détection et/ou la quantification de Nav 1.9 dans des échantillons biologiques, en particulier des échantillons tissulaires humains. Les anticorps selon l'invention sont donc utilisables en tant qu'outil diagnostique. Ces anticorps trouvent des applications, entre autres, en anapathologie, en médecine légale et en recherche médicale.

Sans vouloir être lié par une quelconque théorie, les Demandeurs sont également d'avis qu'une surexpression de Nav 1.9 au niveau des neurones sensitifs, en particulier au niveau des terminaisons nerveuses, est impliquée dans la pathogénèse de certaines pathologies se caractérisant par des douleurs aiguës. A cet égard, les Demandeurs ont mis en évidence l'expression de hNav 1.9 au niveau des corps cellulaires des neurones du ganglion trijumeau mais également au niveau des fibres nerveuses sensitives de la pulpe dentaire, à partir d'échantillons humains de dents de sagesse. hNav 1.9 peut donc être considéré comme un marqueur pour le diagnostic de pathologies associée à une douleur orofaciale.

Les Demandeurs ont également montré que Nav 1.9 est exprimé au niveau des ganglions du plexus myentérique (également appelé plexus d'Auerbach) présent dans des résidus chirurgicaux sains de côlon de patients atteints de cancer Les Demandeurs sont également d'avis que Nav 1.9 est exprimé au niveau du plexus sous-muqueux (également appelé plexus de Meissner). De manière plus générale, les Demandeurs sont d'avis que hNavl.9 est également un marqueur pour le diagnostic de certaines pathologies touchant l'appareil gastro- intestinal et se caractérisant par des douleurs entériques ou un inconfort abdominal.

Ainsi, un objet supplémentaire selon l'invention est l'utilisation d'un anticorps tel que décrit précédemment pour la détection ou la quantification de Nav 1.9 dans un échantillon biologique humain, de préférence un échantillon tissulaire. L'invention a également pour objet l'utilisation d'un anticorps selon l'invention pour le diagnostic, le pronostic et/ou la prédiction d'une pathologie associée à une douleur entérique ou à une douleur orofaciale. Dans certains modes de réalisation, la pathologie est une pathologie inflammatoire. En d'autres termes, une pathologie selon l'invention peut être une maladie (ou un désordre) associée, causée ou impliquant une réaction inflammatoire.

Au sens de l'invention, on entend par « diagnostic » une méthode permettant de déterminer si un individu est effectivement atteint par une pathologie associée à une douleur entérique ou à une douleur orofaciale. On entend par « pronostic » une méthode permettant d'évaluer l'évolution d'une pathologie associée à une douleur entérique ou à une douleur orofaciale chez un patient qui en est atteint, éventuellement en présence d'un traitement thérapeutique. On entend par « prédiction » une méthode permettant d'évaluer si un individu est susceptible de développer ladite pathologie associée à une douleur entérique ou une douleur orofaciale. Au sens de l'invention, on entend par « une pathologie associée à une douleur entérique » une maladie ou un désordre dont un des symptômes possibles est une douleur entérique. Les patients atteints par une pathologie associée à une douleur entérique englobe les patients atteints par ladite pathologie et souffrant effectivement d'une douleur entérique ainsi que les patients atteints par ladite pathologie mais qui ne présentent pas, ou qui n'ont pas encore développé, une douleur entérique. Une douleur entérique fait référence à une douleur touchant, ou trouvant son origine, dans un tissu ou un organe de l'appareil digestif. Il peut s'agir d'une douleur œsophagienne, d'une douleur gastrique, d'une douleur épigastrique, d'une douleur intestinale ou d'une douleur rectale. De préférence, il s'agit d'une pathologie affectant l'intestin grêle, et/ou le côlon et/ou le rectum. A titre d'exemple, il peut s'agir d'un syndrome de l'intestin irritable ou d'une maladie inflammatoire chronique de l'intestin. Les principales maladies inflammatoires chroniques de l'intestin sont la maladie de Crohn et la colite ulcéreuse (également appelé rectocolite hémorragique). Ces pathologies englobent également la pochite et les colites dites microscopiques telles que les colites collagénique et lymphocytaire.

Au sens de l'invention, on entend par « pathologie associée à une douleur orofaciale » une maladie ou un désordre dont un des symptômes possibles est une douleur orofaciale. Les patients atteints par une pathologie associée à une douleur orofaciale englobe les patients atteints par ladite pathologie et souffrant effectivement d'une douleur orofaciale ainsi que les patients atteints par ladite pathologie mais qui ne présentent pas, ou qui n'ont pas encore développé, une douleur orofaciale. On entend par « douleur orofaciale » une douleur affectant une zone du visage, du cou, de la bouche ou de la sphère ORL en particulier de l'oreille ou du nez. Il peut s'agir d'une douleur affectant un muscle ou une articulation faciale, d'une douleur dentaire ou encore d'une névralgie faciale.

De préférence, la pathologie associée à une douleur orofaciale est choisie dans le groupe constitué parmi une hypersensibilité dentaire (dents sensibles), une pulpite, une odontalgie, une douleur des muscles maxillaires ou des articulations temporo-mandibulaires, une névralgie, de préférence idiopathique, du nerf trijumeau, une céphalée, et une brûlure idiopathique de la langue et de la bouche.

Typiquement, les utilisations selon l'invention sont des utilisations ex vivo, plus exactement in vitro. En particulier, ces utilisations ne couvrent pas des utilisations dans lesquelles l'anticorps serait en interaction directe avec le corps humain ou un animal. Les utilisations selon l'invention comprennent généralement la détection ou la quantification de Nav 1.9 dans un échantillon biologique du patient à l'aide d'un anticorps selon l'invention. En d'autres termes, les utilisations selon l'invention comprennent généralement la mise en contact d'un échantillon biologique du patient dans des conditions permettant la formation d'un complexe immun entre Nav 1.9, potentiellement présent dans l'échantillon, et l'anticorps dirigé contre Nav 1.9, ce par quoi l'expression de Nav 1.9 dans l'échantillon biologique peut être détectée et/ou quantifiée. Comme cela sera exprimé ci-après, l'échantillon biologique peut subir un certain nombre de traitement avant la mise en contact avec l'anticorps dirigé contre Nav 1.9. La présente invention concerne également une méthode in vitro de diagnostic ou de pronostic d'une pathologie associée à une douleur orofaciale ou entérique chez un individu, ladite méthode comprenant la détection de Nav 1.9, à l'aide d'un anticorps selon l'invention, dans un échantillon biologique de l'individu. Plus précisément, cette méthode peut comprendre les étapes consistant à:

(a) détecter ou quantifier l'expression de Navl.9 dans un échantillon biologique du patient avec un anticorps selon l'invention, et

(b) comparer l'expression de Navl.9 obtenue à l'étape (a) avec l'expression de Navl.9 détectée ou quantifiée dans un ou plusieurs échantillons biologiques provenant d'un ou plusieurs sujets contrôles.

Dans certains modes de réalisations, le ou les sujets contrôles sont des individus souffrant de la pathologie que l'on souhaite diagnostiquer chez le patient. Dans ce mode de réalisation, on peut considérer que le patient souffre, ou est très susceptible de souffrir à court terme, de ladite pathologie si l'expression de Nav 1.9 déterminée à l'étape (a) est au moins égale à celle détectée dans les échantillons des sujets contrôles. Si l'expression de Nav 1.9 déterminée à l'étape (a) est significativement inférieure à celle détectée pour les sujets contrôles, le diagnostic est négatif. Enfin, si l'expression de Nav 1.9 déterminée à l'étape (a) n'est que très légèrement inférieure à celle déterminée pour les sujets contrôles, le patient peut être diagnostiqué comme un patient à risque, c'est-à-dire un patient susceptible de développer la pathologie considérée.

Dans d'autres modes de réalisation, le ou les sujets contrôles correspondent à des patients sains, c'est-à-dire à des individus qui ne souffrent pas de la pathologie associée à une douleur orofaciale ou entérique. Dans ces modes de réalisations, le patient est diagnostiqué comme souffrant de la maladie considérée, ou susceptible d'en souffrir (c'est-à-dire diagnostiqué comme un patient à risque), si son échantillon biologique présente une expression de Nav 1.9 supérieure à celle du ou des échantillons provenant des patients sains. En revanche, si l'expression de Nav 1.9 déterminée à l'étape (a) est inférieure ou égale à celle des échantillons provenant des patients contrôles (sains), alors le diagnostic peut être considéré comme négatif. On peut considérer que l'échantillon du patient est positif si l'échantillon présente une expression pour Nav 1.9 au moins 10% supérieure, de préférence au moins 20% voire au moins 50% supérieure à celle du ou des échantillons des patients sains.

La détection ou la quantification de Nav 1.9 dans les échantillons biologiques du ou des sujets contrôles peuvent être concomitantes à celles effectuées pour l'échantillon du patient ou provenir de données collectées antérieurement et disponibles, par exemple, sur une base de données.

L'invention a également pour objet l'utilisation d'un anticorps selon l'invention pour évaluer l'efficacité d'un médicament dans le traitement d'une pathologie associée à une douleur orofaciale ou entérique telle que décrite précédemment. Afin de suivre l'efficacité d'un traitement thérapeutique d'une maladie cutanée inflammatoire chez un patient, on peut mettre en œuvre les étapes suivantes:

(a) détecter ou quantifier l'expression de Navl.9, à l'aide de l'anticorps selon l'invention, dans un échantillon biologique du patient avant traitement,

(b) détecter ou quantifier l'expression de Navl.9, à l'aide de l'anticorps selon l'invention, dans un échantillon biologique du patient après traitement, et

(c) comparer l'expression de Navl.9 de l'étape (a) avec l'expression de Navl.9 de l'étape (b).

L'efficacité du traitement est déterminée en comparant les expressions de Nav 1.9 dans les échantillons (a) et (b). Si l'expression de Nav 1.9 est plus faible dans l'échantillon de l'étape (b) que dans l'échantillon de l'étape (a), ceci signifie que le traitement est efficace. S'il y a une augmentation de l'expression de Nav 1.9, on peut considérer que le traitement est peu actif ou inactif selon l'importance de la variation observée. Dans certains modes réalisations, on considère que le traitement a un effet thérapeutique sur la pathologie considérée s'il implique une diminution d'expression de Nav 1.9 d'au moins 10%, de préférence d'au moins 20%, de manière encore plus préférée d'au moins 50%.

De préférence, dans les deux étapes (a) et (b), on utilise le même anticorps selon l'invention. Un autre objet selon l'invention est l'utilisation d'un anticorps selon l'invention pour le suivi in vitro de l'évolution d'une pathologie associée à une douleur entérique ou orofaciale telle que décrite ci-avant. Pour ce faire, les étapes suivantes peuvent être réalisées :

(a) détecter ou quantifier l'expression de Navl.9, à l'aide d'un anticorps selon l'invention, dans un premier échantillon biologique du patient à un temps tl,

(b) détecter ou quantifier l'expression de Navl.9, à l'aide d'un anticorps selon l'invention, dans un second échantillon biologique du patient, à un temps t2 postérieur au temps tl, et

(c) comparer l'expression de Navl.9 de l'étape (b) avec l'expression de Navl.9 de l'étape (a).

De préférence, dans les deux étapes (a) et (b), on utilise le même anticorps selon l'invention. La comparaison des taux d'expressions de Nav 1.9 dans l'étape (c) est un critère permettant de déterminer la progression ou le stade de la maladie considérée. Il est ainsi possible de déterminer si la maladie est en régression, stationnaire ou s'aggrave.

Si l'échantillon de l'étape (b) présente un taux d'expression de Nav 1.9 inférieur au taux d'expression mesuré à l'étape (a), il peut être conclu que la pathologie considérée est en régression. A l'inverse, si l'échantillon de l'étape (b) présente un taux d'expression de Nav 1.9 supérieur à celui mesuré à la première étape, la pathologie est en voie de progression. Le temps t2 peut être postérieur d'au moins 1 mois, de préférence d'au moins 6 mois, voire d'au moins 1 an au temps tl.

L'invention a également pour objet l'utilisation d'un anticorps selon l'invention pour générer des données et/ou des informations utiles pour diagnostiquer, et/ou pour prédire et/ou pour suivre l'évolution d'une pathologie associée à une douleur orofaciale ou entérique, ces méthodes pouvant contenir l'une quelconque des combinaisons d'étapes ci-dessus décrites. Dans l'ensemble des méthodes et utilisations ci-dessus décrites, la pathologie associée à une douleur orofaciale de préférence une hypersensibilité dentaire ou une névralgie, ou à une douleur entérique de préférence le syndrome de l'intestin irritable ou la maladie de Crohn Dans les utilisations et méthodes ci-dessus décrites, la nature des échantillons biologiques varie en fonction de la finalité recherchée, et de la pathologie à diagnostiquer ou à pronostiquer. De manière générale, l'échantillon biologique est un échantillon tissulaire comprenant des ganglions et/ou des fibres nerveuses sensitives innervant une région de l'appareil digestif, en particulier le côlon, l'intestin grêle ou le rectum, ou une zone orofaciale. Lorsque l'anticorps est utilisé pour détecter et quantifier hNav 1.9 en recherche médicale ou en médecine légale, l'échantillon biologique peut être tout type d'échantillon tissulaire adapté, prélevé post-mortem

Lorsque l'anticorps est utilisé à des fins diagnostiques chez un patient, l'échantillon biologique peut correspondre à une biopsie ou à un résidu opératoire.

Lorsque la pathologie à diagnostiquer ou à pronostiquer est une pathologie associée à une douleur entérique, l'échantillon biologique peut être une biopsie prélevée au cours d'une endoscopie ou d'une coloscopie ou encore au cours d'une chirurgie viscérale. A titre alternatif, il peut s'agir d'un résidu opératoire obtenu au cours d'une résection intestinale ou rectale. Pour le diagnostic ou le pronostic d'une pathologie associée à une douleur entérique, l'échantillon biologique est de préférence un échantillon de ganglions myentériques, un échantillon de ganglions du plexus sous-muqueux ou encore un échantillon comprenant des fibres nerveuses du plexus myentérique ou du plexus sous-muqueux. De préférence, l'échantillon biologique est un échantillon de côlon ou d'intestin grêle.

Lorsque la pathologie à diagnostiquer ou à pronostiquer est une pathologie associée à une douleur orofaciale, l'échantillon biologique peut être un échantillon de pulpe dentaire. Cet échantillon de pulpe dentaire peut être obtenu après extraction d'une dent définitive ou d'une dent de lait ou par prélèvement à l'aide d'un moyen adapté au travers de la couronne dentaire.

L'échantillon de pulpe dentaire peut être radiculaire ou coronaire. A titre alternatif, il peut s'agir également d'une biopsie d'un tissu comprenant des fibres nerveuses du nerf trijumeau. Comme cela est détaillé ci-après, l'échantillon biologique peut subir un ou plusieurs traitements afin de permettre la détection ou la quantification de Nav 1.9 par un anticorps selon l'invention.

Les méthodes et utilisations selon l'invention sont généralement basées sur une étape de mise en contact de l'échantillon biologique avec l'anticorps selon l'invention dans des conditions permettant la formation d'un complexe immun entre Nav 1.9, potentiellement présent dans l'échantillon, et ledit anticorps. La détection et/ou la quantification de Nav 1.9 dans l'échantillon est en général réalisée via la formation et éventuellement la détection du complexe immun. La détection et/ou la quantification de Nav 1.9 à l'aide d'un anticorps selon l'invention peut être réalisée par toute méthode connue de l'homme du métier, par exemple par immunodosage, par western blot ou par immunomarquage, en particulier par immunohistochimie ou par immunocytochimie. A titre d'exemple de techniques d'immuno- dosages, on peut citer les dosages radio-immunologiques (RIA), les dosages immunologiques « magnétiques » (magnetic immunoassay MIA), les tests ELISA en sandwich ou par compétition. La quantification et/ou la détection de Nav 1.9 dans un échantillon biologique peut être basée sur une étape séparative par immuno-chromatographie dans laquelle l'anticorps selon l'invention est utilisé en tant que ligand d'affinité. Il peut être envisagé de détecter ou de quantifier Nav 1.9 dans un échantillon biologique par immunoprécipitation ou encore par résonance plasmonique de surface dans laquelle l'anticorps selon l'invention est immobilisé à la surface du senseur.

Les techniques préférées sont Γ immunohistochimie et le western blot. Il s'agit là de techniques bien connues de l'homme du métier. Des exemples de mises en œuvre sont présentés dans la partie expérimentale de la présente demande.

Brièvement, la technique par western blot comprend la préparation d'un extrait protéique à partir de l'échantillon biologique, la mise en œuvre d'une étape d'électrophorèse généralement en conditions dénaturantes (gel SDS-PAGE), le transfert des protéines ayant migré sur une membrane puis une étape d'immunodétection à l'aide d'un anticorps primaire (anticorps anti-Nav 1.9 selon l'invention) puis une étape de révélation du complexe anticorps- Nav 1.9 éventuellement formé.

Pour la détection ou la quantification de Nav 1.9 dans un échantillon biologique par western blot, on préfère utiliser un anticorps selon l'invention dirigé contre un épitope inclus dans un peptide de séquence SEQ ID N°l ou SEQ ID N°3.

La technique d' immunohistochimie comprend la préparation d'une coupe tissulaire qui peut être soit cryofixée, soit fixée chimiquement. La coupe de tissu peut être en option réhydratée avant la mise en contact avec l'anticorps selon l'invention. L'échantillon est incubé avec l'anticorps selon l'invention dans des conditions favorables à la formation du complexe anticorps-Nav 1.9. La détection du complexe peut être effectuée directement si l'anticorps est couplé à un moyen de détection ou, le cas échéant à l'aide d'un anticorps secondaire. En général, le moyen de détection couplé à l'anticorps selon l'invention, ou le cas échéant, à l'anticorps secondaire est une molécule fluorescente. La détection des complexes Nav 1.9- anticorps selon l'invention peut alors être effectuée par microscopie à fluorescence. Dans certains modes de réalisation, afin de visualiser les structures cellulaires au niveau desquelles une expression de Nav 1.9 est attendue, un co-marquage avec un second anticorps peut être effectué. A titre d'exemple, afin de visualiser les fibres nerveuses sensitives susceptibles d'exprimer Nav 1.9 au niveau de la pulpe dentaire, un co-marquage avec un anticorps anti- périphérine peut être réalisé. Les anticorps selon l'invention sont particulièrement adaptés à une utilisation en immunomarquage.

Les anticorps dirigés contre un épitope inclus dans les séquences SEQ ID N°l et SEQ ID N°3 sont utilisables sur tissus cryofixés ou chimiquement fixés. Ces anticorps sont également utilisables en immunocytochimie.

Les anticorps selon l'invention dirigés contre un épitope contenu dans SEQ ID N°2 sont de préférence utilisés pour détecter ou quantifier Nav 1.9 sur des coupes tissulaires cryofixées. Dans certains modes de réalisations, les méthodes et utilisations selon l'invention peuvent comprendre la détection d'un marqueur supplémentaire à Nav 1.9 ou l'évaluation d'un symptôme particulier de la pathologie considérée.

Enfin, l'invention concerne également un kit pour le diagnostic d'une pathologie associée à une douleur orofaciale ou entérique comprenant un anticorps selon l'invention et en option un moyen de détection dudit anticorps. Le kit diagnostic peut également comprendre un ou plusieurs objets supplémentaires, par exemple, une notice explicative pour la mise en œuvre du test diagnostic, un ou plusieurs réactifs pour la préparation de l'échantillon biologique, ou encore un ou plusieurs moyens utiles pour le prélèvement de l'échantillon biologique. L'invention a également pour objet l'utilisation d'un kit comprenant un anticorps selon l'invention et en option un moyen de détection dudit anticorps dans le diagnostic in vitro d'une pathologie associée à une douleur orofaciale ou entérique.

D'autres aspects et avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent. Ces exemples doivent être considérés comme illustratifs et en aucun cas comme limitant la portée de l'invention.

Exemples

Exemple 1 : préparation d'anticorps polyclonaux

Anticorps Rbaa4 et Rbaa6 :

Deux lapins ont été, chacun, immunisés avec un mélange peptidique contenant les 2 peptides (SEQ ID N°l et SEQ ID N°3) couplés à KLH (calendrier ci-après). Contrôle de la réponse immunitaire par ELIS A. Purification sur colonne d'affinité (couplage Hi-trap NHS) des prélèvements J63 et J77.

L'anticorps Rbcca4 a été isolé par un procédé de purification comprenant une étape de chromatographie d'affinité dans laquelle le ligand immobilisé était le peptide de SEQ ID N°l. L'anticorps Rbccaô a été isolé par un procédé de purification comprenant une étape de chromatographie d'affinité dans laquelle le ligand immobilisé était le peptide de SEQ ID N°3.

Anticorps 3881.2 et 3881.1 :

Deux lapins ont été, chacun, immunisés avec un mélange peptidique contenant les 2 peptides (SEQ ID N°2 et SEQ ID N°4) couplés à KLH (calendrier ci-après). Purification sur colonne d'affinité (AF-Amino TOYOPEARL/MBS) des prélèvements J28. L'anticorps 3881.1 a été isolé par un procédé de purification comprenant une étape de chromatographie d'affinité dans laquelle le ligand immobilisé était le peptide de SEQ ID N°2. L'anticorps 3881.2 a été isolé par un procédé de purification comprenant une étape de chromatographie d'affinité dans laquelle le ligand immobilisé était le peptide de SEQ ID N°4.

Exemple 2 : Caractérisations des anticorps 1. Immunofluorescence sur systèmes hétérologues

Un système d'expression hétérologue a été utilisé pour sélectionner les anticorps et tester leur spécificité. Des cellules HEK-293 ont été transfectées : 1) avec un plasmide contenant la séquence nucléique codant pour la sous-unité alpha Navl.9 humaine étiquetée myc à son extrémité C-terminale ou 2) avec les séquences codant pour Nav 1.5 ou Nav 1.7 humains (hNavl.5 et hNavl.7). Ces derniers n'étant pas étiquetés, ils ont été co-transfectés avec un plasmide codant pour l'expression de la GFP. .

24 h après transfection, les cellules ont été fixées au paraformaldéhyde 2% (PAF), perméabilisées au triton 0,1% puis incubées avec l'anticorps anti-hNav 1.9 à tester. L'expression de hNavl.9 est testée par un co-marquage avec un anticorps monoclonal anti- myc alors que l'expression de hNavl.5 et hNavl.7 est testée avec un anticorps PanNav, reconnaissant tous les canaux sodiques.

- Résultats

Le marquage du système hétérologue exprimant hNavl.9-myc avec l'anticorps Rbaa4 ou l'anticorps Rbaaô est co-localisé avec le marquage anti-myc. On ne distingue aucun marquage par Rbaa4 et Rbaaô des cellules non-transfectées, ce qui montre que ces anticorps ne se lient pas à une protéine endogène. A titre d'illustration, la Figure 1 montre les résultats de co-marquage avec l'anticorps monoclonal anti-Myc et l'anticorps polyclonal Raab4 pour des cellules recombinantes exprimant hNavl.9-Myc (Figure 1A) et des cellules non- recombinantes (Figure 1B). Des marquages identiques ont été obtenus pour l'anticorps Rbaaô (données non montrées).

Il apparaît également que les anticorps Rbaa4 et Rbaaô ne marquent pas les systèmes hétérologues exprimant hNav 1.5 et hNav 1.7, dont le pourcentage d'identité est de 56 % et 55 % avec hNavl.9. Ceci montre que Rbaa4 et Rbaaô n'ont pas de réactivité croisée vis-à-vis de hNav 1.5 et hNavl.7. A cet égard, la Figure 2 montre les résultats d'immunomarquage avec l'anticorps Rbaa4 des cellules HEK exprimant hNavl.5, identifiées par la GFP (Figure 2A) et des cellules HEK exprimant hNavl.7, identifiées par la GFP (Figure 2B). Alors que le signal émis par la GFP est clairement visible, le marquage avec Rbaa4 des cellules est très faible voire inexistant. Le marquage avec un anticorps monoclonal anti-PanNav a confirmé une expression correcte de hNav 1.5 ou hNav 1.7 par les cellules HEK. Des marquages identiques ont été obtenus pour l'anticorps Rbaaô (données non montrées). Les anticorps Rbaa4 et Rbaaô reconnaissent donc de manière spécifique hNav 1.9 et ne présentent pas de réactivité croisée avec hNav 1.5 et hNav 1.7.

Aucun marquage n'est détecté avec l'anticorps 3888.1 que ce soit avec les cellules transfectées ou non-transfectées. Cette absence de détection résulte du procédé de fixation chimique qui doit induire une altération de la conformation de la région de hNav 1.9 reconnue par cet anticorps. En revanche, cet anticorps marque de manière très efficace et sensible des tissus cryofixés (voir ci-après). L'anticorps dirigé contre le peptide SEQ ID N°4 est incapable de détecter hNav.1.9, quel que soit le système cellulaire et le tissu analysé.

2. Western Blot

Des analyses par western blot d'extraits protéiques issus de la lyse des cellules HEK transfectées avec hNavl.9 ont été réalisés afin de conforter la spécificité de détection des anticorps Rbaa4 et Rbaaô.

- Résultats

Les anticorps Rbaa4 et Rbaaô reconnaissent une bande ayant un poids moléculaire aux alentours de 250 kDa (Figure 2). Cette bande est aussi présente lors de la détection avec l'anticorps anti-myc. De plus, cette bande n'est pas détectée pour l'extrait provenant de cellules non transfectées (contrôle négatif). Le poids moléculaire de la bande spécifique est un peu plus haut que le poids moléculaire attendu pour hNav 1.9-Myc (210 kDa environ). Cette différence de poids moléculaire est certainement attribuable à des modifications post- traductionnelles, en particulier à des glycosylations. Une expérience de déglycosylation sur le lysat protéique a été réalisée et a mis en évidence une diminution de l'intensité de la bande à 250 kDa, ce qui conforte cette hypothèse.

Exemple 3 : Immunohistochimie sur tissus humains

Des essais d'immunomarquage de ganglions myentériques, de pulpe dentaire et de ganglions trijumeaux humains ont été réalisés à l'aide des anticorps Rbaa4, Rbaaô et 3881.1.

^■ Préparation des échantillons biologiques

Ganglions myentériques : Les résidus opératoires de côlon (parties saines) sont récupérés rapidement après prélèvement, placés sur glace dans du Krebs carbogéné, additionné de bloqueurs de la contraction musculaire (atropine, 2 μΜ et nicardipine, 6 μΜ), avant dissection.

Composition du Krebs carbogéné (en mM) : 118 NaCl, 4.8 KC1, 1 NaH2P04, 25 NaHC03, 1.2 MgC12, 2.5 CaC12 et 11 Glucose, équilibré à pH 7.4 avec 95% 02-5% C02.

La dissection consiste à enlever la muqueuse, la sous-muqueuse et à réduire l'épaisseur du tissu en enlevant un peu de muscle (longitudinal et circulaire) de manière à rendre accessible les neurones des ganglions myentériques (Osorio et Delmas, 2010, Nature Protocols, 6(1) : 15-27). Le tissu est ensuite incubé lh dans du PBS 4% sucrose (masse/volume) à 4°C, puis 12h dans du PBS 20% sucrose, toujours à 4°C.

Composition du PBS (en mM) : 140 NaCl, 10 mM P04 Buffer (NaHP04 et NaH2P04), 3 mM KCI, pH 7.2.

Pulpe dentaire : Après prélèvement, la dent est conservée dans du PBS à 4°C. La pulpe dentaire est extraite de l'émail, puis incubé lh dans du PBS 4% sucrose (masse/volume) à 4°C, puis 12h dans du PBS 20% sucrose, toujours à 4°C.

Ganglion trijumeau : Après prélèvement (12-24h post-mortem), les ganglions sont incubés 2h dans du PBS 4% sucrose (masse/volume) à 4°C, puis 12h dans du PBS 20% sucrose, toujours à 4°C.

Enfin, les tissus sont inclus dans de l'OCT et congelés dans de l'isopentane rafraîchi avec de la carboglace. Les blocs sont stockés au -80°C.

Les coupes transverses de 15-30 μιη sont faites au cryostat, montées sur des lames Superfrost, séchées (lh sous Sorbonne) puis stockées au -80°C jusqu'à utilisation.

A la sortie du congélateur, les lames sont séchées 30 min sous une sorbonne.

Les tissus peuvent ensuite être traités de deux manières différentes selon que l'anticorps primaire nécessite un tissu cryofixé ou fixé chimiquement. Ils sont donc :

Réhydratées avec du PBS pendant lh : tissu cryofixé

ou fixés avec du paraformaldéhyde (PAF) 4% (volume/volume) pendant 10 min, puis rincées 4 x 10 min dans du PBS : tissu fixé chimiquement

^■ Protocole d'immunomarquage

Les coupes sont incubées lh30 à température ambiante dans un milieu de saturation : PBS + 3% (masse/volume) BSA + 0.3% (volume/volume) Triton X-100. Les anticorps primaires sont ajoutés au milieu de saturation pour une incubation de 12 h à 4°C en chambre humide. Les coupes sont ensuite rincées 4 fois 15 min dans du PBS avant 45 min d'incubation à à température ambiante avec les anticorps secondaires dans du PBS + 3% (masse/volume) BSA en chambre humide. Enfin, les coupes sont rincées 4 fois 15 min dans du PBS avant d'être montées dans un milieu de montage (Mowiol ou Prolong Gold)

Des co-marquages avec un anticorps anti-HuC/D ou anti-NF200 pour les ganglions myentériques, avec un anticorps anti-périphérine pour la pulpe dentaire ou avec un anticorps anti-NF200 pour le ganglion trijumeau ont été réalisés afin de visualiser les corps cellulaires ou les fibres des neurones. ^■ Résultats

Les anticorps Rbaa4 et Rbaaô donnent un marquage intéressant de Nav 1.9 pour les différents tissus humains testés, qu'ils soient chimiquement ou cryo-fixés. Les anticorps Rbaa4 et Rbaaô sont ainsi capables de détecter la présence de Nav 1.9 au niveau de coupes transversales de côlon, de pulpe dentaire, et de ganglions trijumeaux après fixation chimique ou cryofixation. Des exemples d'immunomarquages (non-exhaustifs) obtenus par les Demandeurs avec les anticorps Rbaa4 et Rbaaô sont illustrés par les Figures 4 et 5 (côlon), 7 et 8 (pulpe dentaire) et 11 (ganglion trijumeau).

L'anticorps 3881.1 marque de manière très efficace et sensible les tissus cryo-fixés, en particulier de pulpe dentaire (Figures 9 et 10) et de plexus myentérique (Figure 6). En revanche, l'anticorps 3881.1 est inefficace sur tissu fixé chimiquement (données non montrées) et donne un marquage faible des ganglions trijumeau.

Le marquage obtenu pour les coupes de côlon révèle que certains neurones du plexus myentérique expriment fortement Nav 1.9 (neurones immunopositifs) alors que d'autres sont immunonégatifs. Un tel résultat suggère que Nav 1.9 est exprimé par une sous-population de neurones du plexus myentérique. Aucun marquage des muscles longitudinal et circulaire n'a été détecté, ce qui confirme la spécificité des anticorps selon l'invention.

La pulpe dentaire est innervée par un grand nombre de fibres nerveuses non-myélinisée ou faiblement myélinisée de la branche mandibulaire du nerf trijumeau Les immunomarquages de la pulpe dentaire coronaire et radiculaire par les anticorps selon l'invention ont montré que Nav 1.9 est essentiellement exprimé au niveau des fibres non-myélinisées et positives à la périphérine. On note également que le marquage de Nav 1.9 n'est pas uniforme, contrairement à ce qui est observé pour la périphérine, ce qui suggère la présence de « cluster » d'expression pour Nav 1.9.

Enfin, immunomarquage de coupes de ganglion trijumeau a montré que Nav 1.9 est présent au niveau des corps cellulaires de neurones sensitifs de petite et moyenne taille.

Ces expériences d' immunomarquage démontrent que les anticorps selon l'invention peuvent être utilisés pour la détection de hNav 1.9 au niveau de différents tissus humains par immunohistochimie. Ces expériences suggèrent également l'implication de Nav 1.9 dans la transmission de la douleur orofaciale, en particulière dentaire, et dans des pathologies associées à une douleur entérique. Tableau de séquences

Référence Séquence

Peptide inclus dans l'extrémité N-terminale de hNavl.9 :

SEQ ID N ⁰ 1

IAIQKEKKKSKDQTGEV

Peptide de la boucle intracellulaire I-II

SEQ ID N°2

ESGKDQPPGSDSDEDC

Peptide de la boucle intracellulaire II- III

SEQ ID N°3

Q A YELHQENKKPTS QR V

Peptide de la boucle intracellulaire II- III

SEQ ID N°4

SNEERNGNLEGEARK