VIH-1 induce la reducción de los linfocitos T CD4+ y el síndrome de inmunodeficiencia adquirida posterior (SIDA) en el hospedador. La entrada del virus en las células hospedadoras está mediada por glicoproteínas de la envuelta viral, la glicoproteína exterior 120 (gpl20) y la glicoproteína 41 transmembrana de la envuelta (gp41) ; gpl20 es la proteína más expuesta y forma una espiga proteica trimérica de envuelta sobre el virión.

VIH-1 entra por fusión directa entre la proteína Env de la superficie del virión y la célula diana, en un proceso que requiere la proteína Env viral y dos moléculas receptoras distintas de la superficie celular, CD4 y un receptor de quimioquinas específico (Berger, et al.

(1999), Chemokine receptors as HIV-1 co-receptors : roles in viral entry, tropism, and disease. Annu. Rev. Immunol.

17,657-700). Aunque la especificidad de la cepa de VIH- 1 por los co-receptores de quimioquinas es compleja, preferentemente se usa CCR5 por la mayoría de los aislados primarios y no por las cepas de laboratorio adaptadas por células T (TCLA); CXCR4 se usa preferentemente por cepas de laboratorio y por algunos aislados primarios. CCR3 y CCR2b también se han presentado como co-receptores de VIH-1.

Se ha informado que varios ligandos de quimioquinas inhiben la infección por VIH-1. CXCR4, usado como co- receptor por cepas de VIH-1 T-trópicas, puede bloquearse por SDF-1. En los pacientes infectados por VIH-1 con variantes del gen SDF-lß (SDF1 3'-alelo A) se observa una progresión más lenta hasta el SIDA. Se demostró que otros

ligandos de quimioquinas CCR5, tales como RANTES, MIP-1a y MIP-lß inhibían la infección por VIH-1 M-trópico de células CD4+. El papel de CCR5 como co-receptor in vivo se confirma por la resistencia a la infección por el virus VIH-1 R5 en individuos homocigotos para una deleción del gen CCR5 de 32 pb (32-CCR5). También se ha informado que los polimorfismos de alelos en el promotor de CCR5 y en los genes de CCR2 (CCR2-64I) influyen en la progresión hasta el SIDA.

Varias líneas de evidencia sugieren que la interacción de gpl20 con receptores de células diana implica la unión inicial a CD4 ; esto induce cambios conformacionales en gpl20, potenciando la unión al co- receptor. Las regiones de gpl20 para la unión al co- receptor se han estudiado por inhibición con anticuerpos, mutagénesis y cristalografía de rayos X. Se localizaron restos Env muy conservados importantes para la unión al co-receptor en dos cadenas beta del minidominio de la lámina de unión de gpl20. La naturaleza de la interacción gpl20-receptor asociada con los cambios conformacionales en Env tiene implicaciones importantes para el bloqueo por anticuerpos de las funciones de Env.

Los inventores han realizado análisis exhaustivos de un individuo LTNP (>15 años) infectado por VIH-1, incluyendo los genes de quimioquinas de VIH-1 asociados con el retraso del SIDA, la caracterización del virus VIH-1 de LTNP y el análisis molecular de la respuesta de anticuerpos primaria y secundaria a la proteína gpl20 de VIH-1. La determinación de los genotipos para CCR5, el promotor de CCR5, CCR2b y 3UTR-SDF-lß no mostró ninguna mutación de alelos que se considerara asociada con el retraso del SIDA. El aislado de LTNP se clasificó como un virus NSI por infección de células MT-2. Se analizaron los genes gpl20 y Nef de LTNP. E1 análisis comparativo de múltiples clones virales de la región C2-V3-C3 de gpl20

obtenidos del donante, varios aislados de VIH-1 españoles y cepas de virus de referencia, indican que el aislado del donante pertenece a la clase B. De acuerdo con el fenotipo del virus, las regiones V3 de gpl20 presentan marcadores NSI/M-trópicos. No se encontraron codones stop prematuros ni deleciones en las secuencias del gen Nef del virus LTNP. La respuesta humoral a gpl20 muestra una respuesta de IgM compuesta de anticuerpos polirreactivos de baja afinidad que maduran hasta una respuesta de IgG secundaria más competente. Los Fab IgG específicos de alta afinidad contra gpl20 obtenidos a partir de bibliotecas de presentación de fagos construidas a partir del donante pudieron neutralizar varias cepas del virus de referencia in vitro, incluyendo los virus VIH-1 X4 y R5. Uno de los Fab IgG ensayados (S8) mostró actividad neutralizadora in vivo contra el virus VIH-1 M-trópico (Bal), usando ratones SCID reconstituidos con PBL humano como modelo de infección antiviral. Se seleccionaron péptidos mimótopos capaces de competir por la unión Fab- gpl20 a partir de bibliotecas de presentación de fagos de péptidos aleatorios. Se usaron la información obtenida de los mimopéptidos y el modelado molecular de la estructura de gpl20 para identificar el epítopo del Fab S8. El modelo sugiere que el epítopo de Fab es conformacional e implica restos clave de gpl20 implicados en el sitio de unión al co-receptor de quimioquinas. Este epítopo se consideró conservado en la mayoría de los virus VIH-1. La actividad del Fab S8 puede implicar la interacción de un resto de HCDR3 cargado (Arg95) de este Fab con la Glu381 de gpl20, produciendo cambios conformacionales significativos en el interdominio interno-externo de gpl20.

La información proporcionada por los inventores ha dado como resultado ensayos y compuestos que son útiles para estudiar y/o tratar las infecciones por VIH-1.

El primer aspecto de la invención proporciona un anticuerpo o un fragmento del mismo que comprende una cadena ligera y/o una cadena pesada, comprendiendo la cadena ligera o la cadena pesada la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID 2, SEC ID 4, SEC ID 6 o SEC ID 8 y/o mostrada en las Figuras 8 a 11.

Preferiblemente, el fragmento del anticuerpo es capaz de unirse a la proteína gpl20 del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), con la condición de que cuando esté presente parte de la SEC ID NO 4, SEC ID 6 o SEC ID 8, en el fragmento de anticuerpo esté presente al menos un aminoácido desde la posición 119 en delante de cada secuencia.

La secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID 2 codifica la cadena ligera para cada uno de los 3 anticuerpos identificados por los inventores, S8, S19 y S20. La SEC ID 4 codifica la cadena pesada de S8, la SEC ID 6 codifica la cadena pesada de S19 y la SEC ID 8 codifica la cadena pesada de S20. Estas secuencias también se muestran en las Figuras 8 a 11.

Preferiblemente, el anticuerpo o el fragmento, de acuerdo con la invención, comprende un bucle HCDR3, comprendiendo el bucle la Arg95. Este resto se ha identificado como un resto especialmente importante en la interacción de los anticuerpos con gpl20. Se cree que forma una interacción electrostática con la Glu38l de gpl20. Lo más preferible, es que el bucle HCDR3 sea el del Fab S8.

Por lo tanto, el anticuerpo o fragmento puede comprender un bucle HCDR3, comprendiendo el bucle un resto de Arg que interacciona electrostáticamente con gpl20 cuando se une a esta proteína.

Preferiblemente, los anticuerpos o sus fragmentos, de acuerdo con el primer aspecto de la invención, comprenden al menos un fragmento de una cadena pesada

codificado por la SEC ID 6 (cadena pesada de S19) e incluyen al menos el resto 32 de ese péptido. Los inventores han identificado que este resto está implicado en la unión a gpl20.

El anticuerpo o su fragmento, como alternativa, puede comprender la cadena pesada de S20 (SEC ID 8) y comprender Arg30 y Asp3l, que son restos en la región HCDR1, y se ha demostrado por los inventores que estos restos están implicados en la unión a antígenos.

Preferiblemente, lo restos 30 ó 31 se reemplazaron por diferentes aminoácidos para mejorar la unión a gpl20.

Esto puede conseguirse por mutación somática. Más preferiblemente, los cambios son de Ser30 y Ser31 a Asp30 y Arg3 1- Las sustituciones preferidas para los fragmentos S19 y S20 se muestran con detalle en el artículo de Torán J. L. et al., European Journal of Immunology, Vol. 31 (2001), páginas 128-131.

El segundo aspecto de la invención proporciona un anticuerpo o un fragmento del mismo que comprende una cadena ligera y una cadena pesada, comprendiendo la cadena ligera la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID 2 y comprendiendo la cadena pesada una secuencia de aminoácidos seleccionada entre la SEC ID 4, SEC ID 6 y SEC ID 8, siendo capaz el anticuerpo o el fragmento de unirse a la proteína gpl20 de VIH.

Preferiblemente, los fragmentos de anticuerpo de acuerdo con el primer o segundo aspectos de la invención son F (ab') 2, Fab o fragmentos de una sola cadena (SchFv).

Más preferiblemente, el fragmento de anticuerpo usado es el anticuerpo Fab S8.

Los anticuerpos per se son bien conocidos en la técnica. Normalmente comprenden las denominadas cadenas pesadas y cadenas ligeras. Una cadena ligera normalmente está unida a una cadena pesada por medio de un enlace

disulfuro. Dos cadenas pesadas, a su vez, normalmente están unidas entre sí por medio de uno o más enlaces disulfuro. Los anticuerpos pueden ser de una de varias clases diferentes, tales como IgG, IgD, IgE, IgA e IgM.

Preferiblemente, los anticuerpos son anticuerpos o fragmentos humanos. Como alternativa, los anticuerpos pueden proceder de fuentes no humanas y preferiblemente pueden humanizarse usando procedimientos conocidos en la técnica.

Más preferiblemente, el anticuerpo o el fragmento del mismo es un anticuerpo IgG humano o un fragmento del mismo.

Los anticuerpos F (ab') 2 se forman por digestión con pepsina de anticuerpos que comprenden las dos cadenas ligeras y las dos cadenas pesadas. Los fragmentos Fab se forman por digestión con papaína de anticuerpos que comprenden las dos cadenas ligeras y las dos cadenas pesadas, para formar dos fragmentos Fab que constan de un fragmento de cadena pesada unido por al menos un enlace covalente, tal como un enlace disulfuro, a una cadena ligera. Las técnicas para la formación de los fragmentos F (ab') 2 y Fab a partir de anticuerpos son bien conocidas en la técnica.

Preferiblemente, el virus VIH del cual deriva la proteína gpl20 es VIH-1.

Se sabe que las secuencias de, gpl20 son ligeramente variables. Por ejemplo, en los artículos de Myers, et : al., (1992) ; Gurgo, et al. (1998); y McCutchan, et al., (1992) se muestran diferentes secuencias.

Preferiblemente, la secuencia de la gpl20 usada en la invención es el genoma completo del virus de la Inmunodeficiencia Humana de tipo 1 (HBx2); HIV- 1/LAV (IIIB) (Ratner, L. et al., (1985)).

Preferiblemente, los anticuerpos o sus fragmentos son capaces de unirse a gpl20 con una Kd de al menos 1 x

10-la M, especialmente mayor de 9,0 10-lo M Preferiblemente, la especificidad de unión se mide por resonancia de plasmón superficial.

El tercer aspecto de la invención proporciona una molécula de ácido nucleico seleccionada entre : (a) una molécula de ácido nucleico que codifica para un anticuerpo o un fragmento de un anticuerpo de acuerdo con la invención; (b) una molécula de ácido nucleico que comprende el ácido nucleico mostrado en la SEC ID 1, SEC ID 3, SEC ID 5 o SEC ID 7, preferiblemente la secuencia de ácido nucleico comprende la secuencia mostrada en la SEC ID 1 y además una o más de las SEC ID 3, SEC ID 5 o SEC ID 7; (c) una molécula de ácido nucleico, cuya cadena complementaria hibrida con una molécula de ácido nucleico definida en (a) o (b) y que codifica un anticuerpo o un fragmento de un anticuerpo que es capaz de unirse a la proteína gpl20 de VIH, especialmente de VIH-1, y que preferiblemente codifica un anticuerpo o un fragmento de un anticuerpo que tiene tanto cadenas ligeras como cadenas pesadas; y (d) moléculas de ácido nucleico que difieren de la secuencia de (c) debido a la degeneración del código genético.

Los aminoácidos se codifican por tripletes de tres nucleótidos de una cierta secuencia, denominados codones.

Para la mayoría de los aminoácidos hay más de un codón.

Esto se denomina"degeneración". Por lo tanto, uno o más tripletes pueden reemplazarse por otros tripletes, pero la molécula de ácido nucleico puede seguir codificando el mismo péptido.

La invención también proporciona moléculas de ácido nucleico que comprenden una secuencia de nucleótidos que tiene una homología mayor del 90%, preferiblemente una homología del 92,94, 95,96, 98 o 99% con la SEC ID 1,

SEC ID 3, SEC ID 5 o SEC ID 7. También se proporcionan fragmentos de anticuerpos codificados por tales moléculas de ácido nucleico. Preferiblemente, los anticuerpos y los fragmentos son capaces de unirse a la proteína gpl20 de VIH, más preferiblemente de VIH-1.

En las Figuras 8 a 11 también se muestran las secuencias de ácido nucleico para la cadena ligera, la cadena pesada de S8, la cadena pesada de S19 y la cadena pesada de S20.

Las secuencias de ácidos nucleicos pueden usarse en vacunas.

También se proporcionan vectores y células hospedadoras que comprenden moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la invención. Los vectores adecuados incluyen plásmidos, cósmidos y vectores virales. Los vectores preferiblemente comprenden una o más secuencias reguladoras tales como promotores, secuencias de terminación y secuencias señal secretoras para permitir que la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención se exprese como una proteína. Preferiblemente, el vector es un vector retroviral, que puede usarse para infectar las células o los pacientes con el ácido nucleico. Tales vectores retrovirales pueden usarse para terapia génica. Se prefieren especialmente los. vectores adenovirales.

Las células hospedadoras adecuadas incluyen las conocidas en la técnica, incluyendo células eucariotas, tales como células de mamífero, células de levadura y células procariotas tales como E-coli.

Preferiblemente, la molécula de ácido nucleico es ADN o ARN y preferiblemente comprende nucleótidos que se producen de forma natural, por ejemplo, que contienen adenina, guanina, timina, citosina o uracilo como bases.

También pueden usarse nucleótidos que no se producen de forma natural, por ejemplo, del tipo conocido en la

técnica.

Los anticuerpos o los fragmentos de anticuerpos de acuerdo con la invención pueden usarse para identificar compuestos capaces de competir por la unión del anticuerpo o su fragmento a la proteína gpl20 de VIH o a un fragmento de la misma. Preferiblemente, la proteína gpl20 es de VIH-1. El fragmento de una proteína gpl20 puede comprender una porción de la proteína que contenga una o los dos regiones siguientes : Ile420-Gln422 y/o Pro437-Pro438. El compuesto químico preferiblemente es un péptido o un peptoide. En particular, el compuesto químico puede ser un mimótopo.

Los mimótopos preferiblemente son péptidos que imitan a un epítopo. Los mimótopos pueden tener secuencias de aminoácidos que no son similares a la secuencia de aminoácidos del epítopo original. En particular, los mimótopos pueden identificarse por selección de series de péptidos aleatorios.

Por péptido se entiende una secuencia de aminoácidos, que pueden ser aminoácidos naturales o no naturales, con una longitud menor de 40 ó 35 aminoácidos, preferiblemente menor de 30, menor de 25, menor de 20, menor de 15 y especialmente menor de 13 aminoácidos.

Los aminoácidos son los bloques de construcción básicos a partir de los cuales se construyen los péptidos y las proteínas. Los aminoácidos poseen tanto un grupo amino (-NH2) como un grupo carboxilo (-COOH). Muchos aminoácidos, pero no todos, tienen la estructura MH2-CHR- COOH, en la que R es hidrógeno o cualquiera de una diversidad de grupos funcionales. Existen 20 aminoácidos codificados genéticamente de forma natural, sin embargo, pueden usarse aminoácidos no naturales tales como los conocidos en la técnica.

Un péptido se compone de una pluralidad de restos de aminoácidos unidos entre sí por enlaces peptidilo (-NHCO-

Éstos pueden producirse por expresión de las moléculas de ácido nucleico de la invención o artificialmente por síntesis química.

Los peptoides son análogos de un péptido en los que uno o más enlaces peptídicos se han reemplazado por enlaces pseudopeptídicos, por ejemplo : Carba w (CH2-CH2) Depsi T (CO-0) Hidroxietileno T (CHOH-CH2) Cetometileno T (CH-CH2) Metileno-oxi CH2-O- Reducido CH2-NH Tiometileno CH2-S- Tiopéptido CS-NH N-modificado-NRCO- Por epítopo se entiende una región inmunológicamente activa o un inmunógeno que es capaz de unirse al anticuerpo o a un fragmento del mismo. Preferiblemente, el inmunógeno es gpl20 de VIH, especialmente de VIH-1, o un fragmento de tal proteína.

Preferiblemente, pueden usarse bibliotecas de presentación de fagos aleatorias, u otras bibliotecas combinatorias, para identificar compuestos químicos que puedan competir por la unión del anticuerpo o su fragmento a la proteína gpl20 de VIH o a un fragmento de la proteína.

Los inventores han descubierto varias secuencias peptídicas que son capaces de competir por la unión del anticuerpo o su fragmento a la proteína gpl20 de VIH.

La invención también incluye compuestos químicos identificables por los procedimientos descritos anteriormente. Preferiblemente, el compuesto químico es un péptido o peptoide. El péptido puede ser especialmente un epítopo conformacional para una o las dos siguientes

regiones : Ile420-Gln422 y/o Pro437-Pro438 de la proteína gpl20. El péptido puede comprender una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las SEC ID 9, SEC ID10, SEC ID 11, SEC ID 12 y SEC ID 13, o una secuencia mostrada en cualquiera de las SEC ID Nos. 14 a 43, o una secuencia mostrada en la Tabla 1.

Más preferiblemente, los péptidos pueden comprender una secuencia de aminoácidos como la mostrada en las SEC ID 9 y SEC ID 10.

La invención también proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican los péptidos.

Los compuestos químicos, tales como los péptidos o peptoides, pueden usarse para, producir una vacuna.

También pueden usarse como vacunas ácidos nucleicos, tales como ADN, que codifican los péptidos. Estas últimas vacunas se conocen normalmente por el término general "vacunas de ADN". Como alternativa, el ácido nucleico puede estar dentro de un vector, tal como un vector retroviral.

Preferiblemente, los compuestos se mezclan con uno o más adyuvantes tales como albúmina de suero bovino, sulfato de potasio y aluminio, adyuvante incompleto de Freund o adyuvante completo de Freund.

La vacuna puede administrarse en una dosis típicamente de 0,01-50 mg/kg., especialmente de 0,1-5 mg/kg. Puede administrarse por técnicas conocidas en la técnica, incluyendo la vía intravenosa, intradérmica, subcutánea, intramuscular o intraperitoneal.

La invención también incluye dentro de su alcance el uso de anticuerpos o fragmentos de acuerdo con la invención o compuestos de acuerdo con la invención, para la prevención o tratamiento de infecciones producidas por VIH, especialmente por VIH-1. La invención también incluye anticuerpos o fragmentos de los mismos, de acuerdo con la invención, o compuestos de acuerdo con la

invención, para uso en el tratamiento de infecciones producidas por VIH, especialmente por VIH-1.

Los anticuerpos o fragmentos de acuerdo con la invención o los compuestos de acuerdo con la invención pueden marcarse, por ejemplo, con compuestos fluorescentes, nucleótidos radiactivos, metales coloidales, compuestos bioluminiscentes y/o enzimas.

Tales marcadores son bien conocidos en la técnica. Los anticuerpos o fragmentos o compuestos después pueden usarse para estudiar las infecciones por VIH in vivo o ín vitro por su capacidad de unirse a gpl20 o de inhibir la unión de los anticuerpos o los fragmentos a la proteína gpl20.

Los anticuerpos, fragmentos o compuestos químicos también pueden usarse para inhibir la unión de VIH a co- receptores virales. Los inventores han indicado que los anticuerpos de acuerdo con la invención interaccionan con Ile420-Gln422 y/o Pro437-Pro438 de la proteína gpl20 de VIH. C. Rizzuto y J. Sodroski (2000) han indicado que estas regiones están dentro de una región que es importante para la unión.

En otro aspecto de la invención, los anticuerpos, fragmentos o compuestos pueden usarse para evaluar la progresión del SIDA y/o el estado de infección como un marcador del pronóstico.

Otro aspecto de la invención proporciona un kit para estudiar la infección por VIH, especialmente la infección por VIH-1, in vivo y/o in vitro, que comprende un anticuerpo o un fragmento o un compuesto de acuerdo con la invención.

Los anticuerpos, fragmentos o compuestos pueden marcarse como se ha indicado anteriormente.

Otro aspecto de la invención proporciona un kit para estudiar la inhibición de la unión de VIH a un co- receptor que comprende el uso de un anticuerpo, fragmento

o compuesto de acuerdo con la invención. Preferiblemente, el VIH es VIH-1. Preferiblemente, la interacción que se inhibe es la interacción entre gpl20 y CCR5.

A continuación la invención se describirá por medio de ejemplos sólo haciendo referencia a las siguientes figuras : La Figura 1 muestra las secuencias de aminoácidos deducidas de gpl20 y Nef y la clasificación filogenética del virus VIH-1 aislado del donante LTNP (A) Alineación de las secuencias de aminoácidos deducidas del virus VIH-1 aislado del donante LTNP. (B) Las secuencias de aminoácidos de gpl20 se numeraron de acuerdo con la cepa de referencia viral HBX2. Los aminoácidos de V3 para el fenotipo NSI M-trópico se indican por flechas. Secuencias de aminoácidos deducidas de Nef procedentes del virus VIH-1 del donante LTNP. (C) Las secuencias de Nef se obtuvieron a partir del ADN proviral de muestras del donante tomadas en 1998 y 2000 (JMM98 y JMM00). Se indica la localización del motivo previsto para la señal de miristoilación, la secuencia de polimorfismo de región variable, la región con carga ácida, las secuencias repetidas (PxxP), el supuesto sitio de fosforilación (PKC), el tracto de polipurina (PPT), el extremo 5'de 3'UTR, la vuelta beta (GPG), y ExxxLL (para endocitosis mediada por CD4-Nef). Clasificación filogenética del aislado viral del donante LTNP. La región C2-V3-C3 de las secuencias virales de LTNP se comparó con 73 aislados españoles y con las secuencias de referencia de varios subtipos de VIH-1 usando el procedimiento de Neighbor-Joing. Las cepas B de referencia (LAI, MN, SF-2, SF-162 y RF) están marcadas.

La Figura 2 muestra las propiedades de unión del suero del donante LTNP y del Fab anti-gpl20 Las propiedades de unión de IgG (A, izquierda) e IgM (derecha) de suero del donante LTNP a gpl20 III-B

recombinante, p24, BSA y dsDNA, se ensayaron en un ELISA.

(B) unión a gpl20 y BSA del Fab IgM polirreactivo derivado del donante (M025) y de los Fabs IgG de alta afinidad S8, S19 y S20. (C) Redistribución de cadena ligera entre Fab anti-gpl20 polirreactivos y específicos ; se combinaron las cadenas pesadas y ligeras de la IgM M025, la IgG S8 o S20, y un Fab irrelevante contra el toxoide tetánico (Tet), y los pares de HC/LC de Fab resultantes se ensayaron en un ELISA para determinar la unión a gpl20 y BSA.

(D) Competición de unión a antígenos entre el suero del donante y Fab S8; la unión del Fab S8 (0, 05 ug/ml) a gpl20 III-B (2 ug/ml) se ensayó en un ELISA en presencia de diluciones de suero total del donante o suero VIH-1- seronegativo como control; la unión del Fab S8 se realizó usando un anticuerpo anti-histidina conjugado con PO. (E) El suero del donante (1/200) se ensayó con respecto a la unión a gpl20 ICI-B en presencia del Fab S8 (0,01-30 ug/ml) o del Fab P1 irrelevante; la unión al suero IgG se realizó usando Fc IgG anti-humana conjugada con PO.

La Figura 3 muestra la neutralización de VIH-1 por Fab humano (A) Neutralización de la cepa MN de VIH-1 por los Fab IgM M02 y M025 y por los Fab IgG S8, S19 y S20, determinada por ensayo de placas (NPA) en células MT-4.

(B) Neutralización de las cepas adaptadas a células T LAI, MN, RF y SF-2 por el Fab S8 usando el ensayo de reducción de infectividad (IRA) en células MT-2. (C) Capacidad de neutralización del Fab S8 determinada por cuantificación de p24 después de la infección de PBMC con X4 (NL4-3) y (D) cepa VIH-1 R5 (Bal). (E) Actividad de neutralización del Fab S8 in vivo de la infección por VIH-1 R5 (Bal) en ratones SCID reconstituidos con PBMC humanos. Se infectaron ratones SCID a los que se les habían injertado PBMC humanos adultos (SCID-hu-PBMC)

sensibles a la infección por VIH-1, dos semanas después de la reconstitución de soluciones madre de VIH-1 Bal sin células que contenían 100 TCIDso. A los ratones se les inyectó i. p. el Fab S8 purificado (300 ug/ratón ; grupo tratado) o PBS solo (grupo no tratado). Después de 15 días, se recuperaron células peritoneales y se co- cultivaron con PBMC activado con PHA de individuos VIH-1- seronegativos. En los co-cultivos se controló, por medio de un ELISA, el antígeno nuclear de VIH-1 en el sobrenadante en los días 7 (izquierda) y 14 (derecha), y estos co-cultivos se consideraron positivos cuando p24 era> 30 ng/ml.

La Figura 4 muestra la unión a gpl20 del Fab S8 en presencia de sCD4 Por medio de un ELISA, se ensayaron varias diluciones del Fab S8 purificado con respecto a la unión a la proteína gpl20 III-B (2 ug/ml) sola, o que se había preincubado con un exceso molar de 5 veces de sCD4. Se obtuvieron resultados similares usando el Fab S20.

La Figura 5 muestra la inhibición por mimopéptidos de la unión del Fab S8 a gpl20 La unión del Fab S8 a gpl20 se ensayó en un ELISA en presencia de péptidos derivados de la biblioteca peptídica que abarcaba 12R1 (A), 12R4 (B), 12R9 (D), un péptido irrelevante (C), y un péptido de VIH-1 correspondiente a la secuencia de aminoácidos 428-439 de gpl20 (E).

La Figura 6 muestra la unión a gpl20 por el Fab S8 y mutantes HCDR3 S20 La Arg95 del Fab S8 (A) y HCDR3 S20 (B) se reemplazó por los aminoácidos indicados en el código de una sola letra. La unión a gpl20 y BSA por estos mutantes Fab, así como por las formas no mutadas y el Fab M025 polirreactivo relacionado, se ensayó por medio de un ELISA.

La Figura 7 muestra el modelo molecular para el epítopo de gpl20 del Fab S8 En A, Parte superior : Reconstrucción de la reproducción del modelo trimérico de gpl20 propuesta por Kwong et al. ; el CD4 unido se muestra en dorado. La superficie de gpl20 está coloreada por dominios; dominio interno en amarillo (aminoácidos 90-117,208-255, 474- 492), dominio de lámina de enlace en violeta (aminoácidos 118-207,422-439) y dominio externo en rojo (aminoácidos 256-396,410-421, 440-473). La bola blanca corresponde al C-alpha del resto 299 de gpl20, y ayuda a visualizar el bucle V3 que falta en la estructura nuclear de gpl20.

Parte inferior : Representación con bolas y varillas del epítopo conformacional del Fab S8 propuesto. Esta región imita la secuencia de los mimótopos de péptidos lineales obtenidos a partir de bibliotecas de presentación de fagos; esta región está bien conservada en la mayoría de las secuencias de gpl20. La figura también muestra un enlace salino entre la Glu381 y la Lys207, para el que se ha sugerido un papel clave en la relación entre dominios.

También se indica la Arg 419, que forma un enlace fuerte con el Fab 17b. La posición del epítopo conformacional del Fab S8 solapa al menos con dos de los restos que forman parte de epítopo de CD4i (Arg419 y Gln422) ; es claramente diferente del sitio de unión a gpl20 CD4, y también difiere de la región V3 bien caracterizada.

La Figura 8 muestra las secuencias de ácido nucleico y de aminoácidos para las cadenas ligeras de S8, S19 y S20.

La Figura 9 muestra las secuencias de ácido nucleico y de aminoácidos para la cadena pesada de S8.

La Figura 10 muestra las secuencias de ácido nucleico y de aminoácidos para la cadena pesada de S19.

La Figura 11 muestra las secuencias de ácido nucleico y de aminoácidos para la cadena pesada de S20.

EJEMPLO

MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS Donante VIH-1 seropositivo asintomático a largo plazo La seropositividad con respecto al VIH-1 del paciente JMM se detectó en 1985. Este paciente nunca se ha tratado con agentes antirretrovirales y ha mantenido <BR> <BR> <BR> (> 15 años) un estado asintomático con recuentos absolutos de CD4+ >800-950/mm3 y una baja carga viral, medida periódicamente en PBMC (carga viral (bDNA 3.0 Bayer Diagnosys), copias de ARN viral/ml) durante los dos últimos años : 4367 c/ml en 05/99 ; 6936 c/ml en 10/99; 5326 c/ml en 03/00 y 7205 c/ml en 03/01).

Análisis de genotipos de alelos del donante LTNP de VIH-1 Se aisló ADN genómico a partir de células sanguíneas mononucleares periféricas (PBMC) del donante JMM usando Easy DNA (Invitrogen). Se usaron cebadores oligonucleotídicos cadena arriba y cadena abajo para amplificar el gen el CCR5 correspondiente a la segunda región extracelular; su secuencias son : cebador 5' : CCTGGCTGTCGTCCATGCTG; cebador 3' : CAAGCAGCGGCAGGACCAGC.

Usando este primer juego, el alelo de CCR5 de tipo silvestre da lugar a un fragmento de reacción de cadena de la polimerasa (PCR) de 245 pb, mientras que el alelo delecionado produce un fragmento de 213 pb. Para cada reacción de PCR (100 ml), se desnaturalizó ADN genómico (1 ug) a 95°C durante 5 minutos, se amplificó por 5 ciclos de PCR (94°C, 45 s ; 55°C,, 45 s ; 72°C, 45 S), seguidos de 35 ciclos adicionales (94°C, 45 s; 63°C, 45 s; 72°C, 30 s). Los productos de reacción (25 ul) se separaron en un gel de agarosa Nusieve GTG al 3% y las bandas de ADN se tiñeron con bromuro de etidio. Los fragmentos de PCR de CCR5 se clonaron en el vector pCR 2.1 (Invitrogen) y se secuenciaron varios clones automáticamente.

La región promotora de CCR5 (nucleótidos 59013 a 59732; GenBank Acc. No. U9526) se amplificó a partir del

ADN genómico del donante por PCR como se ha descrito (McDermott, et al. 1998) usando cebadores LK84 y LK87.

El gen CCR2b correspondiente a la región 1 a 327 pb, se amplificó por PCR usando los cebadores CCR2 F3 (5'- ATGCTGTCCACATCTCGTTC-3') y CCR2 R3 (5'- CCCAAAGACCCACTCATTTG-3') como se describe (Smith, et al.

1997). El fragmento 3'UTR del gen SDF-1 » (nucleótidos 357-1080) se amplificó por PCR usando los cebadores 5-Sdf TGAGAGGGTCAGACGCCTGAGG y 3-Sdf AGTTTTGGTCCTGAGAGTCC. Los productos de fragmentos de PCR de los genes se subclonaron en pCR 2.1 (Invitrogen), se secuenciaron automáticamente y se compararon en el GenBank.

Ensayo de MT-2 para la determinación de fenotipos NSI e inductor de sincitio (SI).

E1 fenotipo inductor de sincitio (SI) o NSI se definió por la infección de células MT-2 como se ha descrito previamente (Koot et al. 1992). Los sincitios se definen como células multinucleares grandes persistente con un diámetro 3 veces mayor que el de las células normales. E1 virus de JMM se cultivó en PBMC procedentes de donantes seronegativos y se tituló. E1 aislado de JMM, 1,3 x 103 TCIDgo (dosis infecciosas de cultivos de tejidos al 50%), se mezcló con células MT-2 (10 xl06/ml) y en medio MT-2 (RPMI sin IL2) durante 2 horas a 37°C.

Después de la centrifugación (10 minutos a 15000 rpm), se recogieron las células y se añadió medio MT-2 para enrasar a 10 ml. Cada semana, las células se retiraron y se reemplazaron con 5 x106 células MT-2. Los cultivos se examinaron con respecto a la presencia de sincitios y se midió el nivel de p24 en los sobrenadantes a los 7,14 y 30 días. Los cultivos de JMM se consideraron negativos para p24 y para el fenotipo SI.

Análisis de secuencias de env y Nef de pgl20 de VIH-1 del virus del donante LTNP E1 gen env de gpl20 del donante JMM procedía del ADN

proviral de PBMC separado por centrifugación de Ficoll.

La muestra se amplificó por PCR inclusiva, en la primera reacción con cebadores 128EU (5'- TTAGGCATCTCCTATGGCAGGAAGAAGCGG-3') y 129ED (5'- GTCTGGGGCATCAAACAGCTCCAGGCAAGA-3') y en la segunda PCR con cebadores 99EU (5'-AGAGCAGAAGACAGTGGC-3') y 96ED (5'- CGCACAAGACAATAA TTGTCTGGCCTGTACCGT-3'). Las PCR se realizaron en un volumen final de 50 ml, en tampón Tris- HC1 10 mM, pH 8,3 con KC1 50 mM, gelatina al 0, 01%, MgCl2 1,5 mM, 100 ng de cada cebador y 2,5 U de Ampli-Taq polimerasa (Perkin Elmer-Cetus, Norwalk, CT). La condiciones de amplificación fueron 1 ciclo a 94°C, 5 minutos, 35 ciclos a 94°C, 1 minuto, 55°C (en la primera PCR) o 58°C (PCR inclusiva), 1 minuto, y 72°C, 2 minutos en la segunda reacción, seguido de una incubación final a 72°C durante 10 minutos. Los productos de PCR se clonaron en el vector de clonación TA (Invitrogen) y se secuenciaron automáticamente ocho clones. La región C2- V3-C3 de JMM se comparó con secuencias del fragmento C2- V3-C3 del gen env de varias muestras españolas amplificadas por PCR inclusiva, como se describe (Casado, et al., 2000a).

Para el análisis de los datos de nucleótidos, se descargaron cepas de referencia de los subtipos A a H de la base de datos de Los Alamos (http : //hiv-web. lan. gov).

Las secuencias de nucleótidos se a, linearon con muestras españolas (Casado, et al., 2000a) y la muestra JMM usando el programa CLUSTALW (Thompson, et al., 1994) y se editaron manualmente. Las matrices de distancia de ADN se calcularon con el modelo de dos parámetros de Kimura y se usaron para construir un árbol filogenético por el procedimiento Neighbor-Joing (Felsenstein, 1993). La solidez del árbol se evaluó por análisis de secuencia inicial de instrucciones en 1000 réplicas (Kumar, 1993) ; para editar el árbol filogenético se usó TreeView,

versión 1.5 (página, 1996). El gen Nef de JMM se amplificó por PCR a partir del ADN proviral de muestras del donante tomadas en 1998 y 2000. La vuelta inicial de PCR se realizó usando los cebadores p211 5'- TAAAGAATAGTGCTGTTAGCTTGCTC-3'y pl63 5'-CTG AGGGATCTCTAG TTACCAGAG-3'seguido de una segunda reacción con los cebadores nef-205 5'-GCAGTAGCTGAG GGGACAGATAG-3'y nef- 216 5'-GAGCTCCCAGGCTCAGATCTGGTCT-3'. Las condiciones de amplificación fueron 1 ciclo (94°C, 5 min; 55°C, 30 seg; 72°C, 1 min) y 35 ciclos (94°C, 30 seg; 55°C, 1 min; 72°C, 1 min) seguido de un incubación final (72°C, 10 min). Los productos de PCR se secuenciaron-automáticamente.

Suero y anticuerpos monoclonales del donante de VIH-1 E1 suero del donante LTNP JMM se diluyó en PBS y se ensayó con respecto a la especificidad por gpl20, p24, y otros antígenos en una ELISA. Los pocillos se recubrieron con gpl20 III-B (2 pg/ml), gp41 (2 ug/ml), p24 (2 ug/ml), BSA al 3% (Sigma), ssDNA (4 ug/ml), OVA (2 ug/ml), o hGH (hormona de crecimiento humana, 2 pg/ml), se lavaron y se bloquearon. Se incubaron diluciones del suero del donante con antigens y se desarrollaron usando mAb IgGl e IgM anti-humano de ratón conjugado con peroxidasa (PO) (Pharmingen, San Diego, CA). Los Fab S19, S8 y S20 y los Fab IgM M02 y M025 humanos anti-gpl20 se obtuvieron a partir de bibliotecas de presentación de fagos de anticuerpos de isotipo IgGl, k y VH3IgM, construidas a partir de PBMC del donante JMM, como se ha indicado previamente (Torán, et al., 1999). Para la mayoría de los experimentos, los Fab se purificaron por cromatografía Ni-NTA (Quiagen, Hilden, Alemania).

Para la inhibición de la unión de S8 a gpl20 por el suero del donante, los pocillos se recubrieron con gpl20 III-B (2 ug/ml), y se añadieron Fab S8 (0, 05 pg/ml) purificados en presencia de varias diluciones de suero del donante. Los pocillos se lavaron y se realizó la

unión del Fab S8 a gpl20 usando un anticuerpo anti- histidina conjugado con PO y OPD (Sigma), y se leyeron a D0492 nm. Para la inhibición de la unión del suero del donante a gpl20 por el Fab S8, los pocillos se recubrieron con gpl20 III-B como se ha indicado anteriormente. Se añadió suero del donante (1/200) en presencia del Fab S8 (0, 01-30 ug/ml) o del Fab P1 irrelevante y la unión de IgG se realizó con Fc IgG anti- humana conjugada con PO y OPD (Sigma).

Medición de los parámetros cinéticos de los Fab anti- gpl20 por resonancia de plasmón superficial La constante de la cinética de unión de Fab a gpl20 III-B se determinó por resonancia de plasmón superficial usando un biosensor (BIAcore, Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suecia). La inmovilización del ligando y los análisis de unión se realizaron como se ha descrito anteriormente. En resumen, gpl20 (10-30 ug/ml en acetato sódico 10 mM) se inmovilizó en un chip sensor CM5 (Pharmacia) por medio de grupos amina como se recomienda por el fabricante. Todos los experimentos de inmovilización e interacción se realizaron usando HBS como tampón de ensayo (HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 3,4 mM, tensioactivo P20 BIAcore al 0,05%, pH 7,4) a un caudal constante de 5 ul/min. (20 ul/min. para la fase de disociación). Posteriormente, se usó ácido fosfórico 100 mM para regenerar la superficie de unión. Los análisis cinéticos se realizaron con el Fab purificado, a concentraciones que variaban de 1 a 135 nM en HBS a 25°C.

Las constantes de velocidad cinética (Kon y Koff) y las constantes aparentes de afinidad en equilibrio (Ka = Kon/Koff Y Kd = Koff/Kon) se determinaron usando el Software BIAlogue Kinetic Evaluation (Pharmacia Biosensor). Como control negativo, se usaron Fab contra el toxoide tetánico.

Redistribución de cadena ligera de Fab y mutantes CDR3 de

cadena pesada de Fab Se amplificaron fragmentos de LC y HC de las cadenas pesada y ligera de M025, S20 y S8 del Fab IgM M025, de los Fab IgG S8 o S20, o de un Fab irrelevante (Tet) por PCR y se clonaron secuencialmente en el vector H Pcomb3.

Se ensayaron Fab solubles de cada par HC/LC resultante con respecto a la unión a gpl20 III-B y BSA en ELISA como se ha indicado anteriormente. El residuo 95 se reemplazó en los mutantes HCDR3 de cadena pesada de los Fab S8 y S20 y M025 por mutagénesis de PCR dirigida. Los Fab solubles de cada mutante se ensayaron con respecto a la unión a gpl20 III-B y BSA en un ELISA como se ha indicado anteriormente.

Neutralización del Fab de VIH-1 Se estableció un ensayo de neutralización en placa (NPA) en células MT-4 (Harada, et al., 1985) con modificaciones minoritarias (Sánchez, et al., 1993). Se incubaron placas de seis pocillos (Costar, CA) con 1 ml de poli-L-lisina (50 pg/ml, Sigma) durante 60 minutos a temperatura ambiente y se lavaron 3 veces en solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7). Se añadieron células MT-4 (4 x 106/pocillo) y se incubaron durante 2 horas, después de lo cual se retiraron las células no unidas. La neutralización se realizó con 100 unidades formadoras de placas (pfu) de virus y cinco Fab purificados (S20, S19, S8, M02 y M025) a diferentes concentraciones. La mezcla de virus-anticuerpos se incubó (37°C, 3 h), se añadió lentamente a las placas y se adsorbió (37°C, 90 min), después de lo cual el virus se retiró y se añadieron 2 ml de medio de agarosa (agarosa SeaPlaque al 0, 2% en medio RPMI completo). Las placas se incubaron (37°C, atmósfera con 5% de CO2), y se añadieron 2 ml de medio de agarosa en el día 3. La producción de placas se contó a simple vista en el día 7. La titulación de neutralización se calculó de acuerdo con la fórmula

neutralización = (1-p/n) X 100, donde p es la cantidad de virus producida en presencia del Fab correspondiente, n es la cantidad media de virus producida sin Fab, medida por el número de placas en los cultivos.

En los experimentos de neutralización se usaron los siguiente virus : HIV1 MN, HIV-1 RF, HIV-1 SF-2, HIV-1 N14-3 y HIV-1 Ba-L.

El ensayo de reducción de infectividad (IRA) se realizó usando células MT-2. La titulación de virus de las cepas LAI, SF-2, MN y RF se determinó en células MT-2 y se expresó como TCID50 (dosis infecciosas de cultivo de tejidos al 50%), calculada por la fórmula de Spearman- Karber. Se mezclaron cinco diluciones de virus de 10 veces con diferentes concentraciones de Fab S20, S19, S8, M02 y M025, se incubaron (37°C, 1 h, 5% de CO2), y después se añadieron a una placa de microtitulación de 96 pocillos que contenía 105 células MT-2/pocillo. Cuatro días después, se añadió medio nuevo (100 ul). El efecto citopático (CPE), caracterizado por la aparición de células gigantes multinucleares, se cuantificó en el día 7. Para cada dilución se obtuvieron seis pocillos replicados. La neutralización se calculó por la fórmula % neutralización = (1-p/n) x 100, donde p es la titulación media en TCID50/ml de virus producido en cultivos incubados con la mezcla correspondiente y n es la titulación media de virus producido en cultivos incubados sin Fab. Cada punto de titulación es la media de dos experimentos individuales.

Los PBMC obtenidos del paciente en 1996 se co- cultivaron con PBMC VIH-1 seronegativos que se habían estimulado durante 3 días con fitohemaglutinina (PHA).

El co-cultivo se mantuvo en medio con interleuquina-2 (IL-2) durante al menos 40 días (37°C, 5% de COz). Se añadieron más PBMC cada semana y se controló la producción de antígeno p24 cada 7 días. El sobrenadante

se recogió y se caracterizó por TCID50% en PBMC estimulados. El sobrenadante (1 ml) del cocultivo (1.3 x 103 TCID50gó) se inoculó en 10 x 106 PBMC. Después de la incubación (1 h, 37°C), las células se centrifugaron y se añadieron 10 ml de RPMI con IL-2. Se cultivó y se recogió el virus. Esta solución madre del virus de primer pase se usó para realizar el IRA en PBMC. Se incubaron 4 diluciones madre virales de 4 veces con varias concentraciones del Fab S8 (1 h, 37°C) y se añadieron a 2 x 105 PBMC. El medio con IL-2 se cambio dos veces por semana. Después de 14 días, se realizó el ensayo de p24 y se calculó la TCID5o%. La titulación de neutralización se calculó de acuerdo con la fórmula indicada anteriormente.

Para la neutralización por Fab S8 de virus VIH-1 Bal y NL4-3, se activaron PBMC de un donante no infectado con PHA (10 ng/ml, 48 h, 37°C, 5% de CO2) ; después del lavado, las células se incubaron con solución madre viral de Bal o NL4-3 (2 ng/106 por ensayo, 30 min, 37°C), solo o con Fab purificado (0,05 a 10 ug/ml) en medio RPMI 1640 completo que contenía rhIL-2 (10 ng/ml). El exceso de virus y de Fab se retiraron por lavado, y los PBMC se incubaron en RPMI 1640 completo a 37°C. Cada dos días después de la infección, se retiró la mitad del sobrenadante del cultivo (500 ul) y se reemplazó con medio nuevo que contenía rhIL-2 y Fab a la concentración anterior. Los sobrenadantes sin células se ensayaron con respecto al antígeno p24 de VIH-1 en el día 7 usando un ensayo ELISA comercial (Coulter, Miami, FL). El porcentaje de neutralización se calculó como la relación entre los niveles de p24 para las muestras de ensayo solas o con Fab. Como control negativo se usó HmFab Pl irrelevante (10 ug/ml).

Reconstitución de ratones SCID y exposición al virus VIH- 1 Se criaron ratones CB. 17 SCID/SCID y se mantuvieron

en condiciones especificas sin patógenos en la instalación animal del Centro Nacional de Biotecnología.

Se reconstituyeron ratones de fenotipo no defectuoso de 8 a 10 semanas de edad por inyección i. p. de 20 x 106 PBMC humanos normales recién aislados. Cuatro horas antes de la exposición viral y durante los dos siguientes días, a los ratones se les inyectó i. p. Fab S8 purificado (100 ug/ratón) en PBS o PBS solo. Los ratones se infectaron 2 semanas después de la reconstitución con PBMC por inyección i. p. de 0,5 ml de soluciones madre VIH-1 Bal sin células diluidas, que contenían 100 TCID50. Dos semanas después de la exposición viral, los ratones se sacrificaron por dislocación cervical y se obtuvieron células peritoneales por lavado con PBS enfriado con hielo. Las células (1 x 106) se incubaron con PBMC (1 x 106) activados con fitohemaglutinina (PHA) de donantes VIH-1-seronegativos, en RPMI 1640 con 10% de FCS inactivado térmicamente e IL-2 recombinante (10 ng/ml).

Los co-cultivos se controlaron por medio de un ELISA con respecto al antígeno nuclear de VIH-1 en los sobrenadantes en los días 7 y 14, y consideraron positivos cuando p24 era > 30 ng/ml.

Selección de péptidos de unión al Fab S8 entre bibliotecas de péptidos de presentación de fagos Se adquirieron las bibliotecas de presentación de fagos de péptidos Ph. D. 7., Ph. D.-C7C y Ph. D. -12 de New England BioLabs. Para la selección de encuadramiento de fagos de unión a péptidos, se recubrieron pocillos de microtitulación (4°C, durante una noche) con 50 ul del Fab S8 purificado (1 ug/ml en PBS), se lavaron tres veces con agua, y se bloquearon con BSA al 3% en PBS (37°C, 1 h). Para reducir la unión no específica a péptidos del fago, previamente las bibliotecas de presentación de fagos peptídicas se incubaron con F (ab) 2 humano con 0, 5% de BSA (37°C, 1 h). Para cada vuelta de selección, los

pocillos se rellenaron con 50 ul de la biblioteca correspondiente (2 x 1011 pfu), se incubaron (37°C, 2 h), y se lavaron vigorosamente varias veces con PBST (PBS/0, 05W de Tween 20), los fagos que presentaron unión se eluyeron con glicina-HCl, pH 2,5 y BSA (1 mg/ml), y se neutralizaron rápidamente con Tris-HCl 1 M. Las muestras de fagos eluidas se titularon de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los fagos eluidos se amplificaron en E. coli ER2537, se concentraron con PEG, y se usaron para la siguiente vuelta de selección. Para la identificación de los clones de unión a los péptidos de los fagos, se seleccionaron aleatoriamente placas de fago azules independientes de las vueltas de selección, se amplificaron y su ADN se preparó y se secuenció automáticamente. Se realizaron vueltas adicionales de encuadramiento en condiciones similares. Como control, Se tituló el nivel de fondo de unión de un fagémido en la últimas vueltas como se ha indicado anteriormente, con la excepción de que se omitió el Fab S8.

Inhibición por péptidos de la unión gpl20-Fab Se sintetizaron péptidos de clones de fagos seleccionados por Isogen (Maarssen, Países Bajos). Para los experimentos de unión competitiva, se incubó Fab S8 purificado (1 ug/ml) (4°C, 4 h) con varias diluciones del péptido correspondiente antes de la adición a pocillos de microtitulación recubiertos con gp, 120 III-B (2 ug/ml).

Los pocillos se incubaron (37°C, 1 h), se lavaron con PBST, y se realizó la unión de Fab S8 a gpl20 con F (ab)'2 (Pierce) anti-humano de cabra conjugado con PO y OPD.

Modelado molecular La accesibilidad estructural y de disolventes se analizó con WhatIf (Vriend, 1990) y Grasp (Nicholls, et al., 1991). Las Figuras se obtuvieron con Insight II (v.

98. 0, Molecular Simulations). Las estructuras usadas para el análisis se obtuvieron a partir de la base de datos

Protein Data Bank (PDB) (http : //www. rcsb. org/pdb/). Las estructuras usadas para el análisis, 1GC1, lG9N y 1G9M (Kwong, et al., 2001; Kwong, et al., 1998), se obtuvieron del Protein Data Bank (http : //www. rcsb. org/pdb/). El modelo trimérico se generó por ajuste manual basándose en el modelo propuesto por Kwong et al. (Kwong, et al., 2000). Para la localización de la variabilidad de la superficie de gpl20, se obtuvo la alineación de la secuencia de gpl20 a partir de la base de datos Pfam (Bateman et al. 2000). Si se desean más detalles acerca de la alineación y la serie de secuencias de gpl20 de VIH-1 usadas, véase la información de la página web (indicada más adelante). La Figura se trazó con el Sistema de Modelado Molecular Insight II Versión 98.0. Están disponibles figuras e información adicionales en :"http : //www. cnb. uam. es/-cnbprot/S20/".

RESULTADOS Genotipo de alelos y análisis filogenético del donante LTNP y el virus VIH-1 El donante (JMM) analizado en este estudio es un individuo LTNP VIH-1 seropositivo no tratado (periodo de infección por VIH-1 en el estudio >15 años) ; este paciente ha mantenido recuentos de CD4 normales y una baja carga viral hasta el momento actual (véase la sección Procedimientos). Para determinar si están presentes receptores de quimioquinas o alelos de genes de ligandos de quimioquinas asociados con el retraso del SIDA, se realizó un análisis extensivo del genotipo de ADN, incluyendo los receptores de quimioquinas CCR5 y CCR2b, el promotor de CCR5, y la quimioquina 3'UTR SDF- 1 (3. El análisis revela alelos no mutantes para los receptores de quimioquinas CCR5, CCR2, el promotor del gen CCR5 y 3'UTR SDF-lß, indicando que el fenotipo del donante LTNP no se debe a factores genéticos conocidos asociados con un retraso en el desarrollo del SIDA.

Los inventores después identificaron la cepa viral de VIH-1 en este individuo. Se obtuvieron PBMC del donante y se usaron para aislar el ADN proviral por PCR.

El gen env se amplificó a partir del ADN proviral y se clonó. La gpl20 se secuenció completamente a partir de varios clones independientes; se muestran las secuencias de aminoácidos obtenidas (Fig. 1A). Se encontró una variación de la secuencia de gpl20 del 3, 02% entre los clones analizados. Este nivel de variación genética es similar al encontrado en pacientes (Myers, et al., 1992).

La distancia máxima entre miembros de cuasi-especies era del 6, 07% (entre los clones 50-10 y 50-9), la distancia mínima fue del 0, 2% (entre los clones 50-3 y 50-1). Dos de los clones que presentaron deleciones en el bucle V1 también tuvieron un sitio de glicosilación en la posición 299, como el encontrado en la posición 289 en el clon LAI de HXB2. En tres miembros de las cuasi-especies (Fig. 1A) se encontró un nuevo sitio de glicosilación, no presente en HXB2, en la posición 409. El virus aislado primario del donante LTNP se obtuvo por pases en PBMC de individuos seronegativos sanos. El virus no puede crecer y formar sincitios en células MT-2. Además, el análisis de la región V3 de gpl20 de varios clones virales de donantes aislados muestran marcadores de aminoácidos NSI/M-trópicos (S311 y E320) (De Jong, et al., 1992; Connor et al 1997; Shankarappa, et al., 1999), que concurren con el fenotipo viral NSI observado.

El gen Nef de VIH-1 de LTNP se amplificó a partir del ADN proviral del donante en dos puntos del estudio y se secuenció completamente; se muestran las secuencias de aminoácidos obtenidas (Fig. 1B). Se observó una baja variación (menor del 1%) entre las muestras, y no se encontraron deleciones ni cambios estructurales que produjeran codones stop prematuros de Nef. Además, en el virus LTNP se conservaron todos los motivos de Nef

funcionales previstos. Para estudiar la clasificación filogenética del aislado de LTNP, se compararon sus secuencias de gpl20 con las de 73 aislados españoles (Casado, et al., 2000) y las secuencias de referencia de varios subtipos de VIH-1 (Myers, et al., 1992). El análisis se realizó en la región C2-V3-C3 de gpl20 por el procedimiento de Neighbor-Joing (Felsenstein, 1993); el árbol resultante se muestra en la Fig. 1C. E1 aislado de LTNP se incluyó en la clase B, junto con las cepas españolas y las cepas B de referencia (LAI, MN, SF-2, SF- 162 y RF) con un alto valor de autocarga.

Respuesta de anticuerpos a gpl20 de VIH-1 Se analizó la unión de IgM e IgG de suero del donante JMM a gpl20 y p24 por medio de un ELISA; se encontraron altas titlulaciones de IgM y IgG contra los dos antigens (Fig. 2A). Previamente se notificó el aislamiento de un panel de Fab IgM e IgGl anti-gpl20 por bioencuadramiento de gpl20 a partir de dos bibliotecas de presentación de fagos de isotipos de anticuerpos (correspondientes a los repertorios de IgM e IgG) construidas a partir de este donante (Torán, et al., 1990). En estos experimentos, se descubrió que los Fab IgM se unen a gpl20 con baja afinidad y reaccionan con varios antígenos, mientras que los Fab IgG recuperados eran específicos, con alta afinidad (Kd, 2,2 x 10-9 a 9,5 x 10-1° M) para gpl20 (Fig. 2B). El, análisis de los genes VH del Fab IgM mostraron el uso de un diversidad de genes de líneas germinales, la mayoría no mutados. Por el contrario, todos los Fab IgG aislados procedían de un solo gen de línea germinal VH3 (DP50), lo que demostraba una mutación somática extensiva, y el análisis de HCDR3 indicó un origen clonal común. Sin embargo, los Fab IgG tuvieron diferentes constantes de afinidad por gpl20 III- B, como se mide en BIAcore. Estas diferencias de afinidad se deben a cambios de aminoácidos en sus regiones FR1 y

HCDR1, originadas por mutación somática, que condujeron a un aumento de 10 veces en la afinidad por gpl20 (Torán, et al., 2001). La relación entre estos dos isotipos de este donante se mostró por análisis de VH y HCDR3 de los Fab IgM e IgG codificados por el gen VH DP50, y sugieren que un Fab IgG, S8, proviene del Fab IgM M025.

Aunque el VH de estos dos Fab tiene mutaciones somáticas comunes y difiere principalmente en las regiones HCDR3, el análisis molecular de la cadena ligera (LC) de los Fab S8 y M025 mostró diferentes emparejamientos HC/LC. El emparejamiento HC/LC original de las células B puede perderse usando el enfoque combinatorio del repertorio k LC del donante con los diferentes repertorios de HC (IgM e IgG); sin embargo, se sabe que la mayoría de los anticuerpos retienen su especificidad cuando un HC particular se empareja con diferentes LC (Collet, et al., 1992). De esta forma, se analizaron las propiedades de unión de cada par HC/LC en los dos Fabs intercambiando las LC de los Fab S8 y M025, y se ensayó la unión a gpl20 por estas combinaciones por medio de un ELISA. Los resultados demuestran que la especificidad del Fab S8 por gpl20 no se veía afectada por el emparejamiento de su HC con LC de M025 o de un Fab irrelevante (Tet) (Fig. 2C). Además, la combinación de la HC del Fab M025 con la LC del Fab S8 no modificaba la polirreactividad observada para Mu025. De esta forma, todos los datos indican que la LC tiene un papel minoritario en el reconocimiento del antígeno, y que las diferencias de especificidad de unión al antígeno se gobiernan por las cadenas pesadas de estos Fab.

La representación de la especificidad del Fab S8 en el repertorio de anticuerpos del donante se demostró en una ELISA por inhibición de la unión gpl20-Fab por el suero total del donante recogido en el mismo momento que el PBL usado para construir las bibliotecas combinatorias

(Fig. 2D). Además, la unión a gpl20 de la IgG del suero se inhibió por el Fab S8 (Fig. 2E). Esto demuestra que las especificidades del anticuerpo contra gpl20 seleccionadas usando el procedimiento de presentación de anticuerpos de fagos se representan en la respuesta humoral del donante ante la gpl20 de VIH-1.

Considerando conjuntamente estos datos se indica que, como ocurre para otras respuestas humorales, VIH-1 inducía una respuesta IgM primaria polirreactiva y una respuesta IgG de alta afinidad ante gpl20 en este LTNP.

La maduración de la respuesta de anticuerpos primaria incluía la acumulación de VH y la mutación somática CDR3 y el cambio de isotipos, dando como resultado un cambio de especificidad (de anticuerpos polirreactivos a específicos) asociado con un aumento de afinidad (100 veces) para gpl20, como se ilustra por el Fab IgG.

Parámetros cinéticos de los Fab anti-gpl20 medidos por resonancia de plasmón superficial A continuación se muestran los resultados para cada Fab : Fab K (Mw) Koff (s) Ka (M~l) Kd (M) S19 4,8 104 4, 0 10-4 1, 2 108 8,3 10-9 S8 5,4 104 1,. 2 10'4 4,5 10 2 r 2 10 S20 19,0 104 1 8 10-4 10, 5 108 9, 5 10'l0 Neutralización de VIH-1 por Fab anti-gpl20 humanos La capacidad de neutralización de VIH-1 (cepa MN) de Fab purificados se determinó por, NPA en células MT-4 (Fig. 3A). En este ensayo, se observaron modelos distintos dependiendo de la concentración de Fab requerida para una neutralización del 100%. El Fab S20 alcanzó una neutralización del 100% a la menor concentración (1 ug/ml). El Fab S8 mostró una neutralización del 100% a 10 ug/ml ; para el Fab S19, se observó una neutralización del 92% a 20 ug/ml. Los Fab IgM (M02 y M025) procedentes del mismo gen de línea germinal DP50 que los Fab S8, S19 y S20 tuvieron modelos

de neutralización similares, con una neutralización del 90% a 10 ug/ml. A 20 ug/ml, todos los Fab presentan una neutralización del 90%.

El Fab S8 se seleccionó para estudiar la neutralización frente a diferentes cepas adaptadas a células T (TCA) (LAI, MN, RF y SF-2), usando el IRA en células MT-2 (Fig. 3B). Se usaron varias concentraciones de Fab S8 para neutralizar cinco diluciones de 10 veces de cada virus. El Fab S8 neutralizó todas las cepas TCA, aunque la concentración neutralizadora variaba entre las cepas. A 1 ug/ml del Fab S8, solo se neutralizó un 50% de SF-2, MN y RF. A 10 ug/ml, los valores de neutralización para MN, SF-2 y RF fueron mayores del 90%, mientras que la cepa LAI de VIH-1 se neutralizaba deficientemente a la misma concentración de Fab. El aislado del virus del donante se neutralizó usando un ensayo IRA en PBMC; a 25 ug/ml de Fab, se observó una neutralización del 32%.

También se determinó la capacidad de neutralización del Fab S8 por cuantificación de p24 después de la infección de PBMC con las cepas X4 (NL4-3) y R5 (Bal) de VIH-1 (Fig. 3C, D). En este ensayo, se observó una neutralización del 50% de NL4-3 y Bal con menos de 0, 1 ug/ml del Fab S8.

Se extendieron los resultados de la neutralización in vitro del Fab S8 a la infección de la cepa R5 (Bal) ín vivo en ratones SCID reconstituidos, con PBMC humano. Los ratones SCID con injertos de PBL humanos (SCID-hu-PBMC) son sensibles a la infección por VIH-1; por consiguiente, sufren una pérdida de linfocitos T CD4+ humanos, lo que les hace adecuados para estudiar los mecanismos de la patogénesis de VIH-1 y los tratamientos terapéuticos potenciales (Mosier, 1996). A ratones SCID-hu-PBMC se les inyectaron 100 ug del Fab S8 purificado o PBS antes de la infección con 100 TCIDgo de VIH-1 Bal. Después de la infección viral, se administraron dos dosis adicionales

de Fab S8. Los ratones se sacrificaron después de 15 días, se recuperaron las células peritoneales y se co- cultivaron con PBMC humanos activados con PHA. La proteína p24 de VIH-1 de los sobrenadantes de los co- cultivos se midió en los días 7 y 14 usando un kit comercial. p24 fue indetectable en el 100% de los ratones tratados con Fab en el día 7, y en siete de los ocho tratados en el día 14, mientras que el 41% de los ratones de control mostró altos niveles de p24 (Fig. 3E). Los datos indican que el Fab S8 también tiene actividad neutralizadora in vivo para la cepa Bal de VIH-1 R5 M- trópica en ratones SCID-hu-PBMC.

Caracterización del epítopo de gp120 de VIH-1 reconocido por neutralización de Fab IgG Usando presentación de fagos, otros grupos han notificado el aislamiento de Fab recombinantes dirigidos al sitio de unión gpl20-CD4. La competición por la unión Fab S8-gpl20 por CD4 soluble (sCD4) no reduce la unión del Fab al antígeno (no mostrado). Sin embargo, la preincubación de gpl20 con CD4 muestra un aumento del 30% en la unión del Fab a gpl20 como se mide por ELISA (Fig.

4). Estos resultados indican que el epítopo de gpl20 reconocido por el Fab probablemente se expone mejor después de la interacción con CD4. Sin embargo, este aumento en la unión de Fab-gpl20 es menos pronunciado que el notificado para los anticuerpos CD4i (17b y 48d), que sólo se unen a gpl20 en presencia de sCD4 (Sullivan, et al., 1998; Thali, et al., 1993).

Se usaron varios procedimientos para caracterizar el epítopo de gpl20 que reconoce los Fab IgG aislados del donante JMM. Se preparó una colección de péptidos 20- meros solapantes correspondientes a la secuencia de aminoácidos de gpl20 III-B (LAI) en celulosa, y se localizó el epítopo usando Fab S8 purificado y anticuerpo de cabra-anti-humano. Se identificó un motivo de péptido

no único correspondiente a la secuencia primaria, que sugería un epítopo de gpl20 conformacional (no mostrado).

Después se usó una serie de bibliotecas de presentación de péptidos de fagos para localizar el epítopo Fab-gpl20.

Se identificaron clones de fago que se unían al Fab S8 haciendo reaccionar tres bibliotecas de péptidos de fago diferentes, Ph. D.-C12 (12 aminoácidos), Ph. D. -C7 (siete aminoácidos) y Ph. D. -C7C (siete aminoácidos ciclados) con el Fab. Después de cuatro vueltas de selección de encuadramiento, se encontró un enriquecimiento de fago significativo en las bibliotecas Ph. D. -C12 y Ph. D.-C7C.

E1 ADN de clones de fagos individuales eluidos, correspondiente a cada vuelta de selección, se secuenció para deducir la secuencia de aminoácidos deducida del péptido (Tabla 1).

Usando la biblioteca Ph. D. -C12, se identificaron ocho secuencias peptídicas independientes a partir de la última vuelta de selección. Once clones de fago analizados eran únicos y compartían la misma secuencia de nucleótidos y peptídica representada por el clon c124R4 (LLADTTHHRPWT). Los clones peptídicos de fago c124R9 (GIQLANPPRLYG) y c124R1 (FLQPPDFSHLPP) se encontraron cuatro y dos veces, respectivamente, mientras que los otros clones de fago se encontraron una vez cada uno.

Además, también se encontraron clones de péptidos de fago c124R4 y c124R9 dentro de los clones de fago analizados a partir de la segunda y tercera vueltas de selección.

Todos los clones independientes recuperados de la última vuelta de selección de la biblioteca Ph. D.-C7C tenían secuencias peptídicas distintas, y se identificó un motivo no consenso. Después de cuatro vueltas de selección de Fab S8, la biblioteca Ph. D. -C7 produjo fagos que presentaban diferentes secuencias peptídicas, aunque el clon c72R4 (SAMEAPP) mostró un motivo de secuencia similar al clon c124R9 de la biblioteca Ph. D.-C12.

Aunque no se encontró ningún motivo de aminoácidos consenso evidente en todos los clones de péptido de fago, la mayoría de los péptidos tenían dos restos de prolina consecutivos. Se sintetizaron los péptidos de los clones c124R9 (GIQLANP PRLYG), c124R4 (LLADTTHHRPWT), c124R1 (FLQPPDFSHLPP) y el péptido ENV-9 (QEVGKAMYAPPI), que corresponde a los restos de aminoácidos 428-439 de la gpl20 con la que puede alinearse el péptido 124R9 y c72R4, y se ensayaron en una ELISA para determinar la inhibición de la unión del Fab S8 a gpl20. Los péptidos 124R4 y 124R9 mostraron una inhibición del 50% de la unión de Fab S8-gpl20 a 50 pg/ml, mientras que el péptido 124R1 mostró solo un 15% a una concentración similar (Fig. 5). Además, el péptido ENV-9 mostró una inhibición del 50% de la unión de Fab S8-gpl20. Un péptido de control negativo no relacionado no mostró ninguna actividad de inhibición de la unión Fab S8-gpl20.

Análisis estructural de interacciones conformacionales de Fab-epitopo de gpl20 Ya se ha notificado la importancia de la región HCDR3 en la unión Ab-Ag (Morea, et al., 1997); los restos aminoácidos de esta región a menudo son responsables de interacciones Ab-Ag. Para la neutralización de VIH-1 por los Fab IgG S8, S19 y S20, un modelo molecular de sus cadenas pesadas sugiere un papel clave para el bucle HCDR3 en el contacto con el antígeno (Torán, et al., 1999). La IgG de los Fab neutralizadores de alta afinidad S8, S19 y S20 tiene un resto aminoácido cargado (Arg) en la posición 95 en el bucle HCDR3, mientras que el Fab IgM polirreactivo M025 tiene una Thr en esta posición, lo que sugiere que la presencia de Arg95 en HCDR3 tiene un papel fundamental en la especificidad y unión por el antígeno.

E1 papel clave de este residuo en los Fab IgG se analizó por generación de mutantes de Fab Arg95 y por la determinación de sus propiedades de unión a gpl20 por

medio de un ELISA. Los resultados demuestran que el reemplazo de Arg95 por Asp, Pro o Gly anulaba la unión del Fab a gpl20 ; el reemplazo por un aminoácido de carga similar (Lys) en Fab mutantes S895K o S2095K no mostró ningún cambio en la especificidad por gpl20 (Fig. 6).

Por el contrario, los Fab en los que la Arg95 se reemplazó por Trp, Met o Thr (esta última es el resto equivalente en el Fab M025) mostró una menor unión y un cambio en la especificidad por gpl20.

Table 1. Secuencias de aminoácidos deducidas de clones de fago recuperados después des<BR> encuardamiento del Fab S8 de bibliotecas de presentactión de péptidos de fagos<BR> Vuelta de selección<BR> 1 2 3 4<BR> Secuencia de péptidos *<BR> 1r1 SGLDGMHVNSPW (1) 2r1 HTKCSDASCPLI (1) 3r1 SAKPSYQPYAQP (1) 4r1 FLQPPDFSHLPP (2)<BR> 1r2 FPASMPGLLLRV (1) 2r3 HGHPLKTNTHRS (1) 3r2 LLADTTHHRPWT (1) 4r3 TAMNLGPALFRT (1)<BR> 1r3 QVMRMMPNGVYC (1) 2 $MPNPRQNPPPPL (1) 3r3 HIETLLPAPELS (1) 4r4 LLADTTHHPRWT (11)<BR> 1r4 QDRALITPLDQT (1) 2r5 NFQTPDRTQSNL (1) 3r4 KAPIPSSIPGFR (1) 4r5 WFKPPQTPLTLM (1)<BR> 1r5 HDEFVWISIWEP (1) 2r6 FYTPTMHSYGIQ (1) 3r5 GTTQNAMSLARL (1) 4r9 GIQLANPPRLYG (4)<BR> 1r6 WTTNFADPPSST (1) 2r7 SVSPNMRMLHWW (1) 3r6 QPTTPFFDWDTH (1) 4r10 TMQPYKSWWSSK (1)<BR> 1r7 SSCAAFWSKARP (1) 2r8 GIQLANPPRLYG (1) 3r7 HASTPSSPWSRP (1) 4r15 ADVMLHSKHVQM (1)<BR> 1r8 CLSSNSSPPPRP (1) 2r9 TTGDHRAFWLGG (1) 3r9 MQSQLYRDSPRG (1) 4r17 SASTPSSPWSRP (1)<BR> 1r9 HTRVLPSTAMTL (1) 2r10 NYFQQPPERHSS (1) 3r10 LPNATKLAPISP (1) 4c7 SAMEAPP @ (2)<BR> 1r10 LFQKQIESPWRS (1) EN-9 QEVGKAMYAPPI<BR> Las bibliotecas dee péptidos Ph.D.-C7, Ph.D.C7C y Ph.D.-C12 se seleccionaron<BR> independientemente contra el Fab S8. Después de varias vueltas de encuadramiento, se<BR> recuperaron clones de los fagos y se dedujo el péptido presentado por secuencición. Sólo<BR> se muestran las secuencias de clones de Ph.D.-C12 y Ph.D.-C7 (@). Los motivos de los clones<BR> con dos prolinas consecutivas están subrayados.<BR> <P>* Número de clon M13 y, entre paréntesis, el número de clones de fagos independientes<BR> recuperados con secuencias de nucleótidos y de péptidos idénticas.<BR> <P>@ péptido EN-9, correspondiente a los restos aminoácidos 430-438 de gp120 de VIH-1.

Para analizar la estructura del epítopo de gpl20 reconocida por el Fab S8, se compararon secuencias peptídicas derivadas de fagos de péptidos con la secuencia de aminoácidos de varias envueltas de VIH-1, incluyendo gpl20 del donante JMM, usando Clustal W (Thompson, et al., 1994). Se encontró una analogía parcial alrededor de las dos prolinas consecutivas en algunos péptidos y gpl20, que probablemente reflejaba la naturaleza aleatoria de la presentación del péptido de fago, donde ciertos restos de aminoácidos específicos pueden imitar el verdadero epítopo del antígeno.

Basándose en la estructura del núcleo de gpl20, se buscaron manualmente secuencias de superficie conformacionales correspondientes a los péptidos de unión al Fab S8. Solo los péptidos 124R9 (GIQLANPPRLYG) y 124R1 (FLQPPDFSHLPP) producen un epítopo conformacional, y se alinean en los restos 420-422 y 437-439 con dos regiones gpl20 (Fig. 7 A), compartiendo de esta forma aminoácidos con la región de unión gpl20-CCR5 (Rizzuto y Sodroski, 2000). La variabilidad-de aminoácidos del epítopo de Fab S8 se analizó por alineación de un gran número de secuencias de gpl20 de VIH-1 (incluyendo las secuencias de virus trópicos M y T) de Pfad (base de datos de familias de proteínas; Bateman et al. 2000). La variabilidad se calculó a partir de una alineación de gpl20 no redundante del 99% (sin fragmentos pgl20) usando la matriz de McLachlan (McLachlan,'1971), y se localizó sobre la superficie de la estructura del núcleo de gpl20 (Kwong, et al., 1998). Los aminoácidos Ile420, Gln422, Pro437 y Pro438, que componen el epítopo del Fab S8, mostraron baja variabilidad, indicando un alto grado de conservación en la mayoría de los virus VIH-1 (Fig. 7b).

Considerando estos datos y los resultados del experimento de mutagénesis para la Arg95 del Fab S8, los inventores buscaron restos de aminoácidos cargados (Asp o

Glu) cerca del supuesto epítopo del Fab contra gpl20 y sólo encontraron Glu381 como candidato para establecer una interacción electrostática con Arg95 en el bucle HCDR3 de Fab. Además, se descubrió que la Glu381 se conservaba en los virus VIH-1 (véase la página web). Las observaciones previas indican que Glu381 y Lys207 forman un enlace salino entre los dominios interno y externo de la proteína gpl20 unida a CD4 (Rizzuto y Sodroski, 2000).

Además, los cambios en Glu381 o Lys207 abrogan la unión a CCR5, lo que demuestra la importancia de estos restos en las relaciones entre dominios de gpl20 y la unión al correceptor. De esta forma, una interacción hipotética entre la Arg95 del bucle HCDR3 del Fab S8 y la Glu381 de gpl20 podría romper un enlace salino de alta energía inaccesible (Hendsch y Tidor, 1994; Sindelar, et al., 1998), dando como resultado un cambio en las relaciones entre dominios interno-externo de gpl20.

DISCUSIÓN Entre las personas infectadas por VIH-1, las personas sin progreso de la enfermedad a largo plazo (LTNP). constituyen un grupo reducido de individuos infectados que toleran la infección sin supresión inmune durante > 10 años en ausencia de terapia antirretroviral.

Estos individuos manifiestan una potente respuesta humoral capaz de neutralizar in vitro varios aislados de VIH-1, proporcionando una oportunidad de estudiar el papel de la respuesta humoral desarrollado como consecuencia de la infección natural por VIH-1. Aunque no se conoce el papel de los anticuerpos en la inmunidad protectora contra VIH-1, los datos indican que las dianas de los anticuerpos neutralizadores eficaces pueden ser epítopos de envuelta discontinuos en lugar de epítopos lineales. Los anticuerpos dirigidos a epítopos conformacionales constituyen la mayoría de los anticuerpos anti-glicoproteína de VIH-1 en los individuos

infectados por VIH-1. Este tipo de anticuerpo no se ha detectado en voluntarios vacunados, en los que los inmunógenos inducen anticuerpos contra epítopos lineales con diversas especificidades, que neutralizan virus TCLA (Mascola, et al., 1996), pero no aislados primarios (Beddows, et al., 1999 ; Loomis, et al., 1995). Pueden obtenerse anticuerpos humanos de alta afinidad específicos contra epítopos conformacionales usando el procedimiento de presentación de anticuerpos de fagos, que también permite el análisis del repertorio de anticuerpos humanos creados como consecuencia de la infección natural. Previamente se construyeron dos bibliotecas de isotipos de presentación de anticuerpos de fagos (IgM e IgG) a partir de un donante LTNP (>15 años) infectado por VIH-1 (Torán, et al., 1999). A partir de estas bibliotecas, se seleccionaron varios Fab por encuadramiento del antígeno gpl20 ; los Fab IgG recuperados fueron de alta afinidad y específicos para gpl20, mientras que los Fab IgM fueron de baja afinidad y polirreactivos.

En este caso, los inventores han extendido estos resultados, han realizado un análisis exhaustivo de genes de quimioquinas asociados con el retraso del SIDA, y han caracterizado el virus VIH-1 de LTNP. La determinación del genotipo del ADN del donante no muestra alelos relacionados con los genes humanos principales que se ha informado que producen un retraso'en el desarrollo del SIDA (O'Brien y Moore, 2000), indicando que el fenotipo de este donante LTNP no se debe a tales factores genéticos. El aislado del virus del donante se clasificó como NSI, basándose en su fenotipo en células MT-2. El análisis de gpl20 no mostró ninguna variación de secuencia significativa, indicando un aislado del virus VIH-1 homogéneo, y que la región V3 de gpl20 tenía marcadores de aminoácidos M-trópicos que se correlacionan

con el fenotipo NSI observado. No se encontraron alelos defectuosos de gen Nef del virus LTNP. La clasificación filogenética demostró que este aislado de VIH-1 de LTNP pertenece a la clase B, el subtipo predominante en España (Casado, et al., 2000a, b).

Para extender el análisis de los anticuerpos primarios- (IgM) y secundarios (IgG) obtenidos a partir del donante, se caracterizaron extensivamente Fab IgG anti-gpl20 de alta afinidad. Las propiedades de unión del Fab IgG pueden atribuirse principalmente a las cadenas pesadas. Estos resultados indican un papel minoritario para las cadenas ligeras en las propiedades de unión y en la especificidad de los Fab IgG S8 y S20; una combinación de la cadena pesada de S8 con la cadena ligera de un. Fab IgM polirreactivo relacionado clonalmente (M025) o un Fab no específico no relacionado no tuvo ningún efecto sobre la unión y especificidad del Fab S8 contra gpl20. Aunque el emparejamiento original de cadenas pesada y ligera puede perderse durante la generación de la biblioteca de anticuerpos usando el enfoque combinatorio, se observó que el Fab IgG S8 y el suero del donante LTNP podían competir por la unión a gpl20. Estos datos indican que las especificidades del Fab S8 anti-gpl20 recuperadas de la biblioteca están bien representadas en el suero del donante y no son nuevas especificidades de anticuerpo generadas por la aleatoriedad del procedimiento (Persson, et al., 1991).

Esto también confirma la utilidad del procedimiento de presentación de anticuerpos para estudiar el repertorio de respuestas inmunes humorales (Barbas, et al., 1993 ; Ditzel, et al., 1997).

En comparación con el Fab IgG, todos los Fab IgM seleccionados del donante fueron polirreactivos, con baja afinidad por gpl20. Un Fab IgM (M025) polirreactivo derivó del mismo gen de línea germinal que el que

codificaba para el Fab IgG S8 y compartía secuencias de nucleótidos de VH comunes, con cambios de aminoácidos causados por mutaciones somáticas idénticas. Las analogías de HCDR3 también sugerían una relación entre estos dos Fab. Se demostró que las diferencias de restos aminoácidos de HCDR3 entre estos dos Fab juegan un papel significativo en la especificidad y afinidad del Fab contra gpl20. Los resultados indican que el reemplazo de la Arg95 de HCDR3= por Asp, Pro o Gly inhibía la unión del Fab S8 a gpl20 ; además, el reemplazo de Arg95 por Trp, Met o Thr (este último es el resto nativo en el Fab M025) produce cambios de unión y especificidad por gpl20. Estos hallazgos están de acuerdo con experimentos recientes que usan un modelo de ratón transgénico con una región V limitada pero un diversidad de CDR3 completa. Los resultados de estos estudios demostraron que la diversidad de HCDR3 era suficiente para la mayoría de las especificidades de anticuerpos, y que la mutación somática permite conseguir afinidades de anticuerpos sorprendentemente altas.

Todos los Fab derivados de DP50 (IgM y IgG) aislados a partir de este donante podrían neutralizar la cepa MN de VIH-1 de laboratorio. La capacidad de neutralización del Fab S8 también se ensayó usando varios procedimientos y cepas de VIH-1; este Fab neutralizó las cepas de X4 VIH-1 MN, RF, SF-2, III-B y NL4-3, así como la cepa R5 Bal. Además, el Fab S8 neutralizó La infección por Bal M- trópico in vivo en ratones SCID reconstituidos con PBMC humanos. Estos datos indican que el Fab S8 anti-gpl20 aislado del donante LTNP es un potente inhibidor in vitro e in vivo de la infectividad por VIH-1.

Para caracterizar adicionalmente el Fab S8, se localizó el epítopo gpl20 usando varios procedimientos.

Los experimentos previos que usaron el epítopo de péptidos solapantes de gpl20 sugieren que el Fab S8

reconoce un epítopo no lineal. Después se usó una serie de bibliotecas de péptidos de fago aleatorios como herramienta alternativa para localizar el epítopo S8 (Boots, et al., 1997 ; Ferrer y Harrison, 1999; Ferrer, et al., 1999; Schellekens, et al., 1994; Scott y Smith, 1990 ; Yip y Ward, 1999). La mayoría de los fagos recuperados después del encuadramiento con el Fab S8 tenían péptidos con un motivo de dos prolinas consecutivas. Se eligieron los péptidos de los fagos seleccionados con más frecuencia, se sintetizaron y se ensayaron con respecto a la unión competitiva S8-gpl20.

Los resultados indican que los péptidos 124R1, 124R9 y 124R4 mostraron una inhibición significativa de la unión S8-gpl20. Además, el péptido ENV-9, que corresponde a los restos aminoácidos 428-439 de gpl20 y elegido por analogía a 124R9 y a 72R4 (un péptido derivado del clon c72R4 del fago por encuadramiento de la biblioteca peptídica Ph. D. -C7), también inhibía la unión Fab S8- gpl20. La alineación de péptidos candidatos con la secuencia de aminoácidos de varias proteínas de la envuelta de VIH-1, incluyendo gpl20 del donante, así como los péptidos 124R9 y 124R1, demostró solo una analogía parcial alrededor de las dos prolinas consecutivas de gpl20 (Pro437 y Pro438). Estas dos prolinas se describieron recientemente como restos clave implicados en el sitio de unión al correceptor de gpl20 (Rizzuto y Sodroski, 2000).

Para estudiar el epítopo del Fab S8 en detalle, se usó un modelado molecular para buscar las secuencias conformacionales superficiales basadas en la estructura del núcleo de gpl20 que corresponden a los péptidos de unión al Fab S8. Este modelo predice que los péptidos 124R9 y 124R1 pueden producir un epítopo conformacional que se alinea con dos regiones gpl20 en los restos 420- 422 y 437-439. Los aminoácidos de estas regiones (Ile420,

Lys421, Gln422, Pro438) se han descrito como componentes de la región de unión gpl20-CCR5. Los experimentos de mutagénesis indican que las modificaciones de estos residuos, así como de Gly441, tenían consecuencias específicas sobre la unión a CCR5, con poco efecto sobre la unión a CD4 (Rizzuto y Sodroski, 2000) ; también se ha notificado que los anticuerpos monoclonales 17b y 4. 8d se unen a aminoácidos de esta región (Thali, et al., 1993).

Estos Ab se unen a gpl20 y neutralizan eficazmente a VIH-1 (Salzwedel, et al., 2000) sólo en presencia de CD4, definiendo un epítopo CD4 inducible (CD4i) en gpl20 (Sullivan, et al., 1998; Thali, et al., 1993).

Los resultados sugieren que ciertos aminoácidos de gpl20 reconocidos por Fab S8 se comparten con los reconocidos por el mAb 17b, aunque en comparación con 17b, se observó poca dependencia de CD4 de la unión del Fab S8 a gpl20 (el CD4 soluble previamente unido a gpl20 aumentaba la unión de Fab-gpl20 sólo en un 30%). De esta manera, el epítopo de Fab S8 se define como semejante a CD4i (CD4il). Las diferencias entre epítopos 17b-CD4i (Sullivan, et al., 1998) y S8-CD4il puede deberse a que a) el epítopo de 17b-CD4i, a diferencia de S8-CD41i, puede presentarse como una consecuencia de cambios conformacionales dramáticos después de la unión de CD4 a gpl20, b) en ausencia de unión a CD4, la región V3 de gpl20 puede enmascarar al epítopo 17b-CD4i mejor que el epítopo S8-CD4il, o c) una combinación de esos procesos.

El modelo del inventor sugiere que el Fab S8 puede unirse a dos regiones gpl20, Ile420-Gln422 y Pro437- Pro438, localizadas en diferentes cadenas de la estructura de gpl20 que forman parte del minidominio de la lámina de unión. Se ha descrito la importancia de HCDR3 en la interacción Ab-Ag (Morea, et al., 1997). Los -resultados de la mutagénesis de Arg95 en la HCDR3 confirman el modelo previo de los presentes inventores

que demuestra que este resto de HCDR3 es fundamental en la unión del Fab S8 a gpl20 (Torán, et al., 1999). A la luz de estos resultados, se buscó el supuesto epítopo de gpl20 para restos aminoácidos capaces de interaccionar con el bucle de HCDR3 del Fab S8, y se encontró la Glu381 como único candidato para establecer una interacción electrostática con Arg95. La interacción de la Glu381 con la Lys207 forma un enlace salino entre los dominios interno y externo de gpl20 (Rizzuto y Sodroski, 2000); los cambios en Glu381 o Lys207 abrogan la unión de CCR5, indicando la importancia de esta relación entre dominios para la interacción con el correceptor (Rizzuto, et al., 1998). De esta forma, una interacción hipotética entre la Arg95 en el bucle de la HCDR3 del Fab S8 y la Glu381 de gpl20 puede producir cambios relevantes en las relaciones entre dominios interno-externo de gpl20.

Finalmente, los inventores analizaron la variabilidad del epítopo del Fab S8 desde una alineación no redundante grande de aminoácidos de pgl20. Sus resultados indican una baja variabilidad para los aminoácidos Glu381, Ile420, Gln422, Pro437, y Pro438, indicando un alto grado de conservación para el epítopo S8 entre los virus VIH-1. Aunque la especificidad de la cepa de VIH-1 por correceptores de quimioquinas es compleja, se propone que la especificidad por CCR5 y CXCR4 reside en el bucle variable V3 de gpl20 de VIH-1, ya que un solo reemplazo de aminoácidos en este bucle altera el tropismo viral (Hu, et al., 2000). Los resultados de los presentes inventores sugieren que el epítopo reconocido por el Fab S8 no es dependiente de la región V3. Este Fab neutralizó tanto las cepas de VIH-1 X4 como R5, confirmando la implicación de una región de gpl20 común en la interacción con el correceptor de quimioquinas. Ciertos datos estructurales recientes demuestran que la cara neutralizadora en gpl20 ocupa una

área reducida en la molécula (Wyatt, et al., 1998). La mayor parte de los potentes mAb neutralizadores de clase cruzada descritos (bl2, 2G12 y 2F5) (Burton, et al., 1994 ; Muster, et al., 1993; Trkola, et al., 1996) se dirigen contra epítopos conformacionales, aunque rara vez se inducen estas especificidades. Se descubrió que el epítopo del Fab S8 era accesible en la superficie de la molécula y que se conservaba en la mayoría de los virus VIH-1. De forma interesante, la cadena pesada del Fab S8 se codifica por la familia VH3, una familia de Ig VH que, según se ha descubierto, se reduce en la mayoría de los individuos infectados con VIH-1 que progresan al SIDA (Juompan, et al., 1998). Estas especificidades de anticuerpos pueden ser un factor importante que contribuye al estado de salud, y se necesitan más experimentos para analizar el grado de especificidad del epítopo S8 en personas infectadas por VIH-1. Además, el Fab S8 humano podría incluirse en estrategias de anticuerpos para combatir la infección por VIH-1. El péptido descrito en este documento, derivado de la localización de este Fab humano, puede contribuir a entender las interacciones de gpl20-correceptor y al desarrollo de nuevas estrategias para combatir el SIDA.

Abreviaturas CD4i inducida por CD4 CD4il semejante a inducido por CD4 CDR región determinante de co'mplementariedad CPE efecto citopático FR región estructural HC cadena pesada HCDR3 región determinante de complementariedad 3 de cadena pesada IRA ensayo de reducción de infectividad LC cadena ligera LTNP individuo sin progresión a largo plazo

NPA ensayo de neutralización en placas NSI no inductor de sincitios PBMC células mononucleares de sangre periférica PHA fitohemaglutinina SI inductor de sincitio TCA adaptado a células T TCID dosis infecciosa en cultivos de tejidos al 50% TCLA cepas de laboratorio adaptadas a células T Bibliografia Barbas, C. R., T. A. Collet, W. Amberg, P. Roben, J. M.

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Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp 65 70 75 80 Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Ser Tyr Pro Leu Thr Phe 85 90 95 Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser 100 105 110 Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala 115 120 125 Ser Val Val Cys Leu Leu Asn ; Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val 130 135 140 Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser 145 150 155 160 Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr 165 170 175 Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys 180 185 190 Glu Val Thr His G1n Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn 195 200 205 Lys Gly Lys Val Leu Ile Leu 210 215 < 210> 3 < 211> 675 < 212> ADN < 213> Homo sapiens <220> <221> Cadena pesada S8 < 400> 3 ctcgagtcgg ggggaggctt ggtaaagcct ggggggtccc ttagactctc ctgtgcagcc 60 tctggtttca ctttcagtag ctatgctatg cactgggtcc gccaggctcc aggcaagggg 120 ctggagtggg tggcatttat atggtttgat ggaagtaatg aacgatatgc agactccgtg 180 aagggccgat tcaccatcac cagagacaat cccaagaaca ctctctatct gcaaatgaac 240 agcctgagag tcgaggacac ggctgtttat tactgtgtga gaaggggagg ctcgattttg 300 actggttttc atttagacta ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctcagcctcc 360 accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca 420 gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 480

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Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 Ser 225 < 210> 5 < 211> 675 < 212> ADN < 213> Homo sapiens <220> < 221> Cadena pesada S19 < 400> 5 ctcgagtcgg ggggaggcgt ggtccagccc gggaggtccc tgagactctc ctgtgcagca 60 tctggattca gcttcagtag tcatggcatg cactgggtcc gccaggctcc aggcaagggg 120 ctggagtggg tggcatttat atggtttgat ggaagtaatg aacgatatgc agactccgtg 180 aagggccgat tcaccatcac cagagacaat cccaagaaca ctctctatct gcaaatgaac 240 agcctgagag tcgaggacac ggctgtttat tactgtgtga gaaggggagg ctcgattttg 300 actggttttc atttagacta ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctcagcctcc 360 accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca 420 gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 480 tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 540 tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc 600 tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agagagttga gcccaaatct 660 tgtgacaaaa ctagt 675 < 210> 6 < 211> 225 < 212> PRT < 213> Homo sapiens <220> < 221> Cadena pesada S19 < 400> 6 Leu Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu 1 5 10 15 Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser His Gly Met His Trp

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tctggattca gcttcagaga ttatgccatg cactgggtcc gccaggctcc aggcaagggg 120 ctggagtggg tggcatttat atggtttgat ggaagtaatg aacgatatgc agactccgtg 180 aagggccgat tcaccatcac cagagacaat cccaagaaca ctctctatct gcaaatgaac 240 agcctgagag tcgaggacac ggctgtttat tactgtgtga gaaggggagg ctcgattttg 300 actggttttc atttagacta ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctcagcctcc 360 accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca 420 gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 480 tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 540 tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc 600 tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agagagttga gcccaaatct 660 tgtgacaaaa ctagt 675 <210> 8 < 211> 225 < 212> PRT < 213> Homo sapiens <220> < 221> Cadena pesada S20 < 400> 8 Leu Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu 1 5 10 15 Ser Cys Ser Ala Ser Gly Phe Ser Phe Arg Asp Tyr Ala Met His Trp 20 25 30 Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Phe Ile Trp 35 40 45 Phe Asp Gly Ser Asn Glu Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe 50 55 60 Thr Ile Thr Arg Asp Asn Pro Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn 65 70 75 80 Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg Arg Gly 85 90 95 Gly Ser Ile Leu Thr Gly Phe His Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 : Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 Ser 225 < 210> 9 < 211> 12 < 212> PRT < 213> Secuencia artificial <220> < 221> Descripción de Secuencia Artificial : péptidos capaces de inhibir la unión de anticuerpos a gpl20 < 400> 9 Gly Ile G1n Leu Ala Asn Pro Pro Arg Leu Tyr Gly 1 5 10 < 210> 10 < 211> 12 < 212> PRT < 213> Secuencia artificial <220> < 221> Descripción de Secuencia Artificial : péptidos capaces de inhibir la unión de anticuerpos a gpl20 < 400> 10 Phe Leu Gln Pro Pro Asp Phe Ser His Leu Pro Pro 1 5 10 < 210> 11 < 211> 7

< 212> PRT < 213> Secuencia artificial <220> <221> Descripción de Secuencia Artificial : péptidos capaces de inhibir la unión de anticuerpos a gpl20 < 400> 11 Ser Ala Met Glu Ala Pro Pro 1 5 < 210> 12 ; < 211> 12 < 212> PRT <213> Secuencia artificial <220> < 221> Descripción de Secuencia Artificial : péptidos capaces de inhibir la unión de anticuerpos a gpl20 < 400> 12 Leu Leu Ala Asp Thr Thr His His Arg Pro Trp Thr 1 5 10 < 210> 13 < 211> 12 < 212> PRT <213> Secuencia artificial <220> < 221> Descripción de Secuencia Artificial : péptidos capaces de inhibir la unión de anticuerpos a gpl20 < 400> 13 Gln Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala. Pro Pro Ile 1 5 10 < 210> 14 < 211> 12 < 212> PRT < 213> Secuencia artificial <220> < 221> Descripción de Secuencia Artificial : péptidos capaces de unirse a anticuerpos

< 400> 14 Ser Gly Leu Asp Gly Met His Val Asn Ser Pro Trp 1 5 10 < 210> 15 < 211> 12 < 212> PRT < 213> Secuencia artificial <220> < 221> Descripción de Secuencia artificial : péptidos capaces de unirse a anticuerpos < 400> 15 His Thr Lys Cys Ser Asp Ala Ser Cys Pro Leu Ile 1 5 10 < 210> 16 < 211> 12 < 212> PRT <213> Secuencia artificial <220> < 221> Descripción de Secuencia artificial : péptidos capaces de unirse a anticuerpos < 400> 16 Ser Ala Lys Pro Ser Tyr Gln Pro Tyr Ala Gln Pro 1 5 10 < 210> 17 < 211> 12 < 212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <221> Descripción de Secuencia artificial : péptidos capaces de unirse a anticuerpos < 400> 17 Phe Pro Ala Ser Met Pro Gly Leu Leu Leu Arg Val 1 5 10 <210> 18 < 211> 12

< 212> PRT < 213> Secuencia artificial <220> < 221> Descripción de Secuencia artificial : péptidos capaces de unirse a anticuerpos < 400> 18 Gln Val Met Arg Met Met Pro Asn Gly Val Tyr Cys 1 5 10 < 210> 19 < 211> 12 < 212> PRT < 213> Secuencia artificial <220> < 221> Descripción de Secuencia artificial : péptidos capaces de unirse a anticuerpos < 400> 19 Gln Asp Arg Ala Leu Ile Thr Pro Leu Asp Gln Thr 1 5 10 < 210> 20 < 211> 12 < 212> PRT < 213> Secuencia artificial <220> < 221> Descripción de Secuencia artificial : péptidos capaces de unirse a anticuerpos < 400> 20 His Asp Glu Phe Val Trp Ile Ser Ile Trp Glu Pro 1 5 10 < 210> 21 < 211> 12 < 212> PRT < 213> Secuencia artificial <220> < 221> Descripción de Secuencia artificial : péptidos capaces de unirse a anticuerpos

< 400> 21 Trp Thr Thr Asn Phe Ala Asp Pro Pro Ser Ser Thr 1 5 10 < 210> 22 < 211> 12 < 212> PRT < 213> Secuencia artificial <220> < 221> Descripción de S : ecuencia artificial : péptidos capaces de unirse a anticuerpos <400> 22 Ser Ser Cys Ala Ala Phe Trp Ser Lys Ala Arg Pro 1 5 10 < 210> 23 < 211> 12 < 212> PRT < 213> Secuencia artificial <220> <221> Descripción de Secuencia artificial : péptidos capaces de unirse a anticuerpos <400> 23 Cys Leu Ser Ser Asn Ser Ser Pro Pro Pro Arg Pro 1 5 10 < 210> 24 < 211> 12 < 212> PRT < 213> Secuencia artificial <220> < 221> Descripción de Secuencia artificial : péptidos capaces de unirse a anticuerpos <400> 24 His Thr Arg Val Leu Pro Ser Thr Ala Met Thr Leu 1 5 10 <210> 25 <211> 12

< 212> PRT < 213> Secuencia artificial <220> < 221> Descripción de Secuencia artificial : péptidos capaces de unirse a anticuerpos < 400> 25 Leu Phe Gln Lys Gln Ile Glu Ser Pro Trp Arg Ser 1 5 10 < 210> 26 < 211> 12 < 212> PRT < 213> Secuencia artificial <220> < 221> Descripción de Secuencia artificial : péptidos capaces de unirse a anticuerpos < 400> 26 His Gly His Pro Leu Lys Thr Asn Thr His Arg Ser 1 5 10 < 210> 27 < 211> 12 < 212> PRT < 213> Secuencia artificial <220> < 221> Descripción de Secuencia artificial : péptidos capaces de unirse a anticuerpos <400> 27 Met Pro Asn Pro Arg Gln Asn Pro Pro, Pro Pro Leu 1 5 10 < 210> 28 < 211> 12 < 212> PRT < 213> Secuencia artificial <220> < 221> Descripción de Secuencia artificial : péptidos capaces de unirse a anticuerpos

<400> 28 Asn Phe Gln Thr Pro Asp Arg Thr G1n Ser Asn Leu 1 5 10 < 210> 29 < 211> 12 < 212> PRT < 213> Secuencia artificial <220> <221> Descripción de Secuencia artificial : péptidos capaces de unirse a anticuerpos < 400> 29 Phe Tyr Thr Pro Thr Met His Ser Tyr Gly Ile Gln 1 5 10 < 210> 30 < 211> 12 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> < 221> Descripción de Secuencia artificial : péptidos capaces de unirse a anticuerpos < 400> 30 Ser Val Ser Pro Asn Met Arg Met Leu His Trp Trp 1 5 10 < 210> 31 < 211> 12 < 212> PRT < 213> Secuencia artificial.

<220> < 221> Descripción de Secuencia artificial : péptidos capaces de unirse a anticuerpos < 400> 31 Thr Thr Gly Asp His Arg Ala Phe Trp Leu Gly Gly 1 5 10 < 210> 32 < 211> 12

< 212> PRT < 213> Secuencia artificial <220> < 221> Descripción de Secuencia artificial : péptidos capaces de unirse a anticuerpos < 400> 32 Asn Tyr Phe Gln Gln Pro Pro Glu Arg His Ser Ser 1 5 10 < 210> 33 < 211> 12 < 212> PRT < 213> Secuencia artificial <220> < 221> Descripción de Secuencia artificial : péptidos capaces de unirse a anticuerpos < 400> 33 His Ile Glu Thr Leu Leu Pro Ala Pro Glu Leu Ser 1 5 10 < 210> 34 < 211> 12 < 212> PRT < 213> Secuencia artificial <220> < 221> Descripción de Secuencia artificial : péptidos capaces de unirse a anticuerpos < 400> 34 Lys Ala Pro Ile Pro Ser Ser Ile Pro Gly Phe Arg 1 5 10 < 210> 35 < 211> 12 < 212> PRT < 213> Secuencia artificial <220> < 221> Descripción de Secuencia artificial : péptidos capaces de unirse a anticuerpos

< 400> 35 Gly Thr Thr Gln Asn Ala Met Ser Leu Ala Arg Leu 1 5 10 < 210> 36 < 211> 12 < 212> PRT < 213> Secuencia artificial <220> < 221> Descripción de Secuencia artificial : péptidos capaces de unirse a anticuerpos < 400> 36 Gln Pro Thr Thr Pro Phe Phe Asp Trp Asp Thr His < 210> 37 < 211> 12 < 212> PRT < 213> Secuencia artificial <220> < 221> Descripción de Secuencia artificial : péptidos capaces de unirse a anticuerpos < 400> 37 His Ala Ser Thr Pro Ser Ser Pro Trp Ser Arg Pro 1 5 10 < 210> 38 < 211> 12 < 212> PRT < 213> Secuencia artificial <220>- < 221> Descripción de Secuencia artificial : péptidos capaces de unirse a anticuerpos < 400> 38 Met Gln Ser Gln Leu Tyr Arg Asp Ser Pro Arg Gly 1 5 10 < 210> 39 < 211> 12 < 212> PRT

< 213> Secuencia artificial <220> < 221> Descripción de Secuencia artificial : péptidos capaces de unirse a anticuerpos < 400> 39 Leu Pro Asn Ala Thr Lys Leu Ala Pro Ile Ser Pro 1 5 10 < 210> 40 <BR> <BR> <BR> <BR> < 211> 12 < 212> PRT < 213> Secuencia artificial <220> < 221> Descripción de Secuencia artificial : péptidos capaces de unirse a anticuerpos < 400> 40 Thr Ala Met Asn Leu Gly Pro Ala Leu Phe Arg Thr 1 5 10 < 210> 41 < 211> 12 < 212> PRT < 213> Secuencia artificial <220> < 221> Descripción de Secuencia artificial : péptidos capaces de unirse a anticuerpos <400> 41 Trp Phe Lys Pro Pro Gln Thr Pro Leu Thr Leu Met 1 5. 10 < 210> 42 < 211> 12 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <221> Descripción de Secuencia artificial : péptidos capaces de unirse a anticuerpos < 400> 42

Thr Met Gln Pro Tyr Lys Ser Trp Trp Ser Ser Lys 1 5 10 < 210> 43 <211> 12 < 212> PRT < 213> Secuencia artificial <220> < 221> Descripción de Secuencia artificial : péptidos capaces de unirse a anticuerpos <400> 43 Ala Asp Val Met Leu His Ser Lys His Val Gln Met 1 5 10