Die Assoziation von Laminin (ein 800 kDa Glycoprotein) und Nidogen (ein 160 kDa Glycoprotein) wird als ein entscheidender biomolekularer Mechanismus bei der Synthese und Stabilisierung von Basalmembranen betrachtet (Mayer, U. & Timpl, R.

(1994) in : Extracellular Matrix Assembly and Structure (Ed. : P. D. Yurchenco et al.) S. 389-416, Academic Press, Orlando, FL). Durch die Fähigkeit des Nidogens mit allen Hauptbestandteilen der Basalmembran wie z. B. y1 enthaltenden Laminin- lsoformen (zur Nomenklatur siehe : Burgeson, R. E. et al. (1994) Matrix Biology 14 : 209-211), Kollagen IV, Perlecan und Fibulin sowie deren jeweiligen Assoziationsstrukturen ternäre Komplexe auszubilden, übernimmt es die Funktion eines Bindegliedes, welches die voneinander unterschiedlichen Makrostrukturen miteinander verbindet, räumlich organisiert und stabilisiert (Fox, J. W. et al. (1991) EMBO J. 10 : 3137-3146 ; Aumailley, M. et al. (1993) Kidney Int. 43:7 -12).

Einen deutlichen Hinweis auf die zentrale Funktion der Laminin/Nidogen-Interaktion bei der Synthese einer funktionalen Basalmembran konnten Experimente mit polyklonalen Anti-Laminin-Antikörpern liefern. Die beschriebenen Antikörper wurden durch Immunisierung von Kaninchen mit Laminin P1 oder dem rekombinant erzeugten Lamininfragment y1 ill 3-5 gewonnen und über eine Affinitätschromatographie an Laminin P1 oder Laminin y1 III 3-5-Matrices angereichert. Sie zeigten in Inhibitionstests eine komplette Hemmung der Laminin/Nidogen-Assoziation. Diese basiert aber auf einer sterischen Blockade des Nidogenzugangs zum Laminin durch die Antikörper, deren Bindungsregionen nur in der Nähe der nidogenbindenden Sequenzen des Laminins liegen (Mayer, U. et al.

(1993) EMBO J. 12 : 1879-1885). In embryonalen Organkulturen konnten die beschriebenen Antikörper sowohl die Genese von Nierentubuli, als auch die Ausbildung von Lungenbläschen inhibieren. Beides sind Ontogeneseprogramme die von einer ungehinderten Neusynthese einer Basalmembran abhängen (Ekblom, P. et al. (1994) Development 120 : 2003-2014 ; Ekblom, P. (1993) in : Molecular and Cellular Aspects of Basement Membranes (Ed. : Rohrbach, D. H. & Timpl, R.) S. 359 -383 ; Academic Press, San Diego, CA.).

Die Nidogen-Bindungsdomäne des Laminins konnte in ihrer Lokalisation, Sequenz und in ihrer räumlichen Struktur (Röntgenkristallstruktur und NMR-Struktur) eindeutig identifiziert und charakterisiert werden (Mayer, U. et al. (1993) EMBO J. 12 : 1879- 1885 ; Baumgartner, R. et al. (1996) J. Mol. Biol. 257 : 658-668 ; Stetefeld, J. et al.

(1996) J. Mol. Biol. 257 : 644-657). Sie befindet sich in einem"LE Modul" (laminin- type epidermal growth factor-like) des kurzen Arms der y1-Kette des Laminins, in der Domäne y1 lil 4."LE Module"sind Strukturmotive aus 50-60 Aminosäuren die ein komplexes, zum"epidermal growth factor"analoges Faltungsmuster mit 4 Disulfidbrücken aufweisen (Bairoch, A. (1995) Nomenclature of extracellular domains. The SWISS-PROT Protein sequence data bank. release 310 ; Engel, J.

(1989) FEBS Letters 251 : 1-7).

Eine hochaffine Bindung des Nidogens zur komplementären Laminin-Domäne konnte für Laminin P1 aus dem EHS Tumor der Maus, Laminin-2 und Laminin-4 aus humaner Plazenta und Laminin aus Drosophila nachgewiesen werden. Ursache für diese speziesübergreifende Bindungsspezifität ist die außerordentlich hohe Aminosäuresequenzidentität, die in der Laminin y1 III 4-Domäne bei den untersuchten Spezies vorliegt. Sie beträgt 97% zwischen Mensch und Maus und erstaunliche 61 % zwischen Mensch und Drosophila, wenn das ganze Modul berücksichtigt wird. Beschränkt man den Vergleich auf den Bereich der loops a bis c, die wesentliche Nidogen-Bindungsstellen enthalten, dann erhöhen sich die Werte auf 100% bzw. 75% (Pikkarinen, T. et al. (1987) J. Biol. Chem. 263 : 6751-6758 ; Chi, H.-C. & Hui, C.-F. (1989) J. Biol. Chem. 264 : 1543-1550).

Neben der Abhängigkeit der Nidogen-Bindung von einer intakten dreidimensionalen Struktur, konnten eindeutige Sequenzbereiche identifiziert werden, die sich in den S- S stabilisierten loops a und c der Laminin-Domäne y1 1114 befinden. Fünf essentielle Aminosäuren wurden identifiziert : Vier befinden sich innerhalb eines Abschnitts aus 7 Aminosäuren im loop a und eine Tyrosinseitenkette im loop c (Pöschl, E. et al.

(1994) EMBO J. 3741-3747 ; Mayer, U. et al. (1993) EMBO J. 12 : 1879-1885 ; Pöschl, E. et al. (1996) EMBO J. 15 : 5154-5159).

Synthetische Peptide, die aus den entsprechenden Bereichen der Laminin-Domäne y1 1114 abgeleitet werden können, sind in der Lage die Laminin/Nidogen-Bindung in speziellen Bindungsassays komplett zu inhibieren (US 5, 493, 008). Allerdings zeigen derartige synthetische Peptide in Inhibitionsassays eine Aktivität, die etwa 400-bzw.

10000-fach schwächer ist als die des intakten Laminin P1 oder Laminin y1 III 3-5 (Pöschl, E. et al. (1994) EMBO J. 13 : 3741-3747 ; US 5, 493, 008). Die Laminin/Nidogen-lnteraktion ist durch eine starke konformationelle Komponente beeinflußt (Mayer, U. et al. (1993) EMBO J. 12 : 1879-1885). Die schwächere inhibitorische Wirkung der synthetischen Peptide ist erklärbar, da Peptide in wäßriger Lösung eine Myriade von unterschiedlichen Konformationen einnehmen können und deshalb nur ein gewisser Prozentsatz der Peptide in der biologisch aktiven Konformation anzutreffen ist.

Die Verwendung solcher Peptide als Medikament ist daher aufgrund ihrer konformationellen Flexibilität, aber auch wegen ihrer Instabilität gegenüber Proteasen sowie ihrer schlechten Bioverfügbarkeit und Pharmakodynamik erheblich limitiert (Milner-White, E. J. (1989) Trends Pharmacol. Sci. 10 : 70-74 ; Hruby, V. J.

(1994) in : Peptides, Proc. Thirteenth American Peptide Symposium ; (Ed. : Hodges, R. S. & Smith, J. A.) S. 3-17 ; ESCOM : Leiden, Netherlands).

Antikörper, die spezifisch an die Nidogen-Bindungsdomaine des Laminins binden und die Assoziation zwischen Laminin und Nidogen bei geringer Konzentration kompetitiv zu inhibieren vermögen, sind aufgrund ihrer höheren Affinität und Avidität, ihrer hohen Stabilität sowie ihrer guten Pharmakokinetik besser als Therapeutikum zur Behandlung von Krankheiten geeignet. Weiterhin können sie als Diagnostikum oder als Hilfsmittel in biologischen und pharmakologischen Modellen zur Entwicklung und Bewertung von die Laminin/Nidogen-Interaktion beeinflussenden Stoffen eingesetzt werden.

Die bisher erzeugten Anti-Laminin P1-oder Anti-Laminin y1 lil 3-5-Antikörper können zwar zum Teil die Nidogen/Laminin-Bindung inhibieren. Sie erkennen jedoch die Nidogen-Bindungsstellen der Laminin y1-Kette nicht direkt, sondern die Inhibition der Nidogen/Laminin-Bindung erfolgt über sterische Wechselwirkung (Mayer, U. et al. (1993) EMBO J. 12 : 1879-1885). Die Nidogen-Bindungsdomäne der Laminin y1- Kette ist speziesübergreifend außerordentlich stark konserviert. Darüber hinaus ist Laminin ein extrazelluläres Protein, das sowohl als integrierter Bestandteil von Basalmembranen, als auch in Form einer zirkulierenden Serumkomponente (EP 0 696 597 A2) ständig mit dem Immunsystem in Kontakt steht. Aufgrund der Fähigkeit des Immunsystems,"selbst"von"nicht-selbst"zu unterscheiden, muß gefolgert werden, daß jede immunisierte Spezies das hoch konservierte Immunisierungsantigen als eigenen Körperbestandteil erkennt und daher keine Antikörper gegen diesen entwickelt. Die Erzeugung eines spezifischen Antikörpertiters konnte deshalb nicht erwartet werden. Bestätigung fand diese allgemein anerkannte Lehrmeinung durch die Tatsache, daß durch Immunisierung von Kaninchen mit Laminin P1 und Laminin y1 tut 3-5 bisher keine Antikörper gegen die Nidogen-Bindungsdomaine des Laminins erzeugt werden konnten (Mayer, U. et al. (1993) EMBO J. 12 : 1879-1885). Die oben beschriebenen polyklonalen Antikörper, die an nicht genau definierte Epitope außerhalb der Nidogen- Bindungsdomäne des Laminins binden, sind jedoch als Therapeutikum, als Diagnostikum bzw. als Modellsubstanz zur Entwicklung und Bewertung von die Nidogen/Laminin-Interaktion beeinflussenden Stoffen nur sehr eingeschränkt bzw. überhaupt nicht geeignet : Die sterische Inhibition ist abhängig von der räumlichen Ausdehnung des Hemmstoffs, so daß der aus pharmakologischen Gründen bevorzugte Einsatz von Teilen dieser Antikörper als Therapeutikum kaum möglich ist. Des weiteren schränken mögliche Kreuzreaktionen mit nicht-nachzuweisenden Analyten die Verwendung dieser Antiköper in diagnostischen Testen ein Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Antikörper zu erzeugen, die spezifisch an die Nidogen-Bindungsdomäne des Laminins binden, also die Nidogen- Bindungsdomäne der Laminin-y1-Kette direkt erkennen, und die als Arzneimittel, als Diagnostikum zum Nachweis von Laminin-Isoformen sowie als Modellsubstanz zur Entwicklung und Bewertung von die Nidogen/Laminin-Interaktion beeinflussenden Stoffen geeignet sind.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß getost, durch die im folgenden beschriebenen Antikörper sowie die Verfahren zu deren Herstellung und Verwendung.

Die erfindungsgemäßen Antikörper oder Teile davon sind dadurch gekennzeichnet, daß sie an die Nidogen-Bindungsdomäne des Laminins, die Laminin y1 III 4- Domäne, bevorzugt an den hochkonservierten Bereich des Loops a bzw. der Loops a und c der Laminin y1 III 4-Domäne binden. Besonders bevorzugt binden die erfindungsgemäßen Antikörper in bezug auf das Epitop konformationsabhängig (d. h. die Nidogenbindungsstelle des Laminins in deren nativen Konformation erkennend ; vgl. Beispiel 6) direkt oder überlappend an den hochkonservierten Bereich des Loops a bzw. der Loops a und c. Insbesondere werden von der Erfindung Antikörper oder Teile davon miteingeschlossen, die mindestens an ein Peptid gemäß Tabelle 1 binden. Die vorliegende Erfindung stellt sowohl polyklonale als auch monoklonale Antikörper bereit. Die Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung sind bevorzugt chimäre, humanisierte, bi-oder oligospezifische Antikörper. Besonders bevorzugt wird die Laminin-Nidogen-Bindung durch die Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung kompetitiv oder partiel kompetitiv inhibiert (vgl. Beispiel 7).

Tabelle 1 : Aminosäuresequenz der zu Immunisierung verwendeten Peptide (1) : DNIDPNAVGNL (2) DNIDPNAVGNLKCIYNTAGFYCDR (S-sverbrckteForm) I I Die erfindungsgemäßen Antikörper sind erhältlich durch die Immunisierung immunkompetenter Wirbeltiere, wie z. B. Kaninchen, Mäuse, Schafe, Ziegen, Meerschweinchen, Ratten und Hühner mit Laminin, Laminin P1, Laminin y1 III-3-5, Laminin y1 1114 sowie insbesondere mit Peptiden, die wesentliche Nidogen- Bindungsstellen enthalten aber nicht die vollständige Aminosäuresequenz der y1 III 4-Domäne des Laminins, ganz besonders bevorzugt eines der oder beide Peptide gemäß Tabelle 1, als Immunisierungsantigen.

Im Falle der Immunisierung mit Laminin bzw. Laminin P1 wird der Antikörper mittels Laminin y1 III-3-5 und/oder Laminin Y1 III-4 identifiziert und schließlich auf kompetitive oder partiel kompetitive Inhibierung der Laminin-Nidogen-Bindung geprüft.

Im Falle der Immunisierung mit Laminin y1 III-3-5 wird der Antikörper mittels Laminin und/oder Laminin P1 identifiziert und schließlich auf kompetitive oder prtiell kompetitive Inhibierung der Laminin-Nidogen-Bindung geprüft.

Besonders bevorzugt werden als Immunisierungsantigen Laminin y1 III-4 oder eines oder mehrere Peptide gemäß Tabelle 1 eingesetzt. Die durch die Immunisierung mittels dieser Immunisierungsantigene erhältlichen Antikörper werden vorzugsweise mittels Laminin und/oder Laminin P1 identifiziert. Vorteilhafterweise werden die identifizierten Antikörper auf kompetitive oder partiell kompetitive Inhibierung der Laminin-Bindungsstelle geprüft.

Neben polyklonalen Antikörpern sind auch monoklonale Antikörper (MAK) erhältlich, wobei bei letzteren zunächst MAK-produzierende Hybridoma-Zellen erzeugt werden.

Die Antikörper sind auch in gereinigter Form erhältlich, indem die erfindungsgemäßen Antikörper aus Antikörper-enthaltendem Material, wie z. B.

Antiserum des immunisierten Tieres, Hybridoma-Zelikulturüberstand, Aszites oder Zellen, beispielsweise durch Affinitätschromatographie, vorzugsweise an Laminin und/oder Laminin P1 als Affinitätsmatrix, gereinigt werden.

Die erfindungsgemäßen Antikörper oder Teile davon können die Laminin/Nidogen- Interaktion inhibieren und umfassen als Überbegriff auch die an anderer Stelle näher beschriebenen entsprechenden chimären, humanisierten, bi-oder oligospezifischen Antikörper sowie Antikörperanaloga.

Die Erfindung beinhaltet auch tierische, pflanzliche und prokaryontische Zellen sowie Zelllinien, die die erfindungsgemäßen Antikörper und Antiköperteile produzieren, vorzugsweise das Hybridon DSMACC 2327, welches am 27. Oktober 1997 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ, Marscheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, DE) gemäß den Vorschriften des Budapester Vertrags hinterlegt wurde. Die vorliegende Erfindung betrifft auch den von dem unter der Hinterlegungsnummer DSMACC 2327 hinterlegten Hybridom produzierten monoklonalen Antikörper.

Ferner umfaßt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung der oben beschriebenen Antikörper, wobei immunkompetente Wirbeltiere, wie z. B. Kaninchen, Mäuse, Schafe, Ziegen, Meerschweinchen, Ratten und Hühner, mit Laminin, Laminin P1, Laminin y1 III 3-5 sowie Laminin Y1 1114, besonders bevorzugt Peptide, die nicht die vollständige Aminosäuresequenz der Y1 III 4-Domäne des Laminins enthalten, ganz besonders bevorzugt eines der oder beide Peptide gemäß Tabelle 1. Unter dem Begriff"Peptide"sind Oligopeptide, Polypeptide sowie Proteine und Proteinfragmente zu verstehen. Die als Immunisierungsantigen verwendeten Peptide werden bevorzugt gekoppelt an Träger wie beispielsweise Proteine, z. B.

Ovalbumin, Albumin oder Hämocyanin, oder Polymere, z. B. Polyethylenglykol, Polyacrylamid oder Poly-d-Glutamin-d-Lysin, eingesetzt.

Im Falle der Immunisierung mit Laminin oder Laminin P1 wird der Antikörper mittels Laminin y1 III-3-5 und/oder Laminin y1 111-4 identifiziert und auf kompetitive oder partiel kompetitive Inhibierung der Laminin-Nidogen-Bindung geprüft.

Im Falle der Immunisierung mit Laminin y1 III-3-5 wird der Antikörper mittels Laminin und/oder Laminin P1 identifiziert und auf kompetitive oder partiell kompetitive Inhibierung der Laminin-Nidogen-Bindung geprüft.

Vorzugsweise wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren Laminin Y1 III-4 oder wahlweise eines der oder beide Peptide gemäß Tabelle 1 als Immunisierungsantigen eingesetzt, welches vorzugsweise an einen Träger gekoppelt ist.

Der durch Immunisierung mit Laminin y1 III-4 oder mit einem der oder beiden Peptiden gemäß Tabelle 1 erzeugte Antikörper wird vorzugsweise mittels Laminin und/oder Laminin P1 identifiziert und vorteilhafterweise auf kompetitive oder partiel kompetitive Inhibierung der Laminin-Nidogen-Bindung geprüft.

Optional beinhaltet das Verfahren auch die Erzeugung von MAK-produzierenden Hybridoma-Zellen. Es hat sich als vorteilhaft erwiesen, die erfindungsgemäßen Antikörper oder deren Teile aus Antikörper enthaltendem Material, wie z. B.

Antiserum des immunisierten Tieres, Hybridoma-Zellkulturciberstand, Aszites oder Zellen beispielsweise mit Hilfe der A9nitätschromatographie zu reinigen, wobei bevorzugt eine Laminin und/oder Laminin P1-Affinitätsmatrix verwendet wird.

Die erfindungsgemäßen Antikörper oder Teile davon können vielfältig verwendet werden, z. B. als Arzneimittel, als Diagnostikum, als Hilfsmittel in biologischen und pharmakologischen Modellen zur Entwicklung und Bewertung von die Laminin/Nidogen-interaktion beeinflussenden Stoffen, z. B. als Modellsubstanz zur Evaluierung der räumlichen Struktur der zur Nidogen-Bindungstelle des Laminins komplementären Kontaktzone und deren potentieller Bindungsvalenzen, sowie zur Untersuchung der Biosynthese von Basalmembranen und des Einflusses von Basalmembranen bei unterschiedlichen physiologischen Prozessen, wie z. B. der Organentwicklung, Angiogenese oder Embryogenese. Die Erfindung schließt auch Arzneimittel und Diagnostika mit ein, die einen oder mehrere der erfindungsgemäßen Antikörper oder Antikörperteile enthalten.

Ferner umfa#t ist die Verwendung von einem oder mehreren erfindungsgemäßen Antikörpern oder Antikörperteilen * zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Krankheiten, die durch eine vermehrte oder unerwünschte Synthese von Basalmembranen charakterisiert sind, insbesondere von Fibrosen, vor allem die alkoholische Leberfibrose sowie die Lungenfibrose, sowie alle Formen von diabetischen Spätkomplikationen, die von Verdickungen der Basatmembran begleitet sind-vor allem in Niere, Auge und Gefäßsystem-, sowie die Arteriosklerose und alle Krankheiten, bei denen eine Angiogenese zur Verschlechterung des klinischen Bildes beiträgt, z. B. Krebserkrankungen, diabetische Retinopathie und Erkrankungen mit einer starken entzündlichen Komponente wie z. B. rheumatoide Arthritis, Osteoarthritis, Vaskulitis, Haemangiome und Psoriasis ; * zur Herstellung eines Diagnostikums zum Nachweis von yl-enthaltenen Lamininisoformen in biologischen Proben, z. B. in Körperflüssigkeiten wie Blut, Serum, Plasma, Urin, Speichel oder Liquor, sowie in Geweben. Unter den Begriff Diagnostikum fallen z. B. die verschiedenen Ausführungsformen heterogener und homogener Immunoassays, Testsysteme in der Immunhistochemie sowie auch Reagenzien für in vivo Nachweisverfahren wie z. B. der Immunszintigraphie. Die die erfindungsgemäßen Antikörper oder Antikörperteile enthaltenden Zubereitungen können auch alleine oder zusammen mit weiteren Hilfsreagenzien, wie z. B. Puffer, Waschlösungen, Meßsignal-auslösenden Lösungen, und/oder anderen Hilfsmitteln, wie z. B. Küvetten, in Form von Diagnostika-Kits zusammengefaßt werden.

Im folgenden wird die Erfindung näher beschrieben und anhand diverser Beispiele im Detail erläutert : Überraschenderweise konnte mit den in Tabelle 1 aufgeführten Peptiden, die kein Faltungsmuster auszubilden vermögen wie es in LE-Modulen vorliegt, Antikörper gegen die hochkonservierte Aminosäuresequenz der Nidogen-Bindungsdomaine des Laminins erzeugt werden. Hierzu wurden die Peptide gemäß Tabelle 1 mit Hilfe von Carbodiimid an Ovalbumin gekoppelt und diese Konjugate zur Immunisierung von Kaninchen eingesetzt. Die Entwicklung eines spezifischen Antikörper-Titers gegen Laminin P1 und Laminin y1 lil 3-5 wurde mit Hilfe eines Enzymimmunoassays analysiert.

Die polyklonalen Antikörper gewünschter Spezifität wurden dann per Affinitätschromatographie über eine Matrix, an die Laminin P1 aus humaner Plazenta gebunden war, und anschließender Siebgelchromatographie angereichert. Die Methoden zur Reinigung und Charakterisierung von Laminin aus humaner Plazenta sowie dessen Verwendung zur Immunisierung von Mäusen und zur Gewinnung von Anti-Laminin P1-Antikörper synthetisierenden Hybridomen sind in der EP 0 696 597 A2 beschrieben.

Die nach Laminin P1-Affinitätschromatographie des Antiserums angereicherten Antikörper zeigen eine Bindungsspezifität gegenüber Laminin P1 aus der Humanplazenta, Laminin P1 aus der Maus (EHS Tumor) und Laminin aus der Ratte (Dottersack). Die Antikörper erkennen nicht nur die spezifische Sequenz sondern auch die biologisch aktive Konformation der Nidogen-Bindungsdomäne des Laminins. Sie sind in der Lage, die Laminin/Nidogen-Bindung komplett zu inhibieren.

Die erfindungsgemäßen Antikörper sind aber auch erhältlich durch die Immunisierung anderer immunkompetenter Wirbeltiere, wie z. B. Mäuse, Schafe, Ziegen, Meerschweinchen, Ratten u. Hühner, bevorzugt mit Laminin y1 1114 sowie insbesondere mit Peptiden, die wesentliche Nidogen-Bindungsstellen enthalten aber nicht die vollständige Aminosäuresequenz der Y1 III 4-Domäne des Laminins, ganz besonders bevorzugt die Peptide gemäß Tabelle 1. Erfindungsgemäße polyklonale Antikörper können aus dem Antiserum der immunisierten Tiere gereinigt werden. Um entsprechende monoklonale Antikörper zu erzeugen, werden nach allgemein bekannten Verfahren (siehe z. B. Harlow, E. & Lane, D. (1988) Antibodies : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor) die Immunzellen immunisierter Tiere, wie z. B. Mäuse, mit Myelomzelien zum Erzeugen von MAK-produzierenden Hybridoma-Zellen verschmolzen und anschlie#end geeignete Klone isoliert. Die Auswahl der die gewünschten MAK-produzierenden Klone wird mit Hilfe spezifischer Screeningverfahren durchgeführt. Hierbei wird die Bindungsspezifität der in den Kulturüberstand abgegebenen Antikörper z. B. an das Immunisierungsantigen, an den Träger des Immunisierungsantigens, an natives wie rekombinantes Laminin bzw. an dessen Fragmente bevorzugt mittels Enzym-oder Radioimmunoassays sowie Western Blots überprüft. Ein weiteres mögliches Selektionskriterium ist die die Fähigkeit der Antikörper, die Nidogen/Laminin-Bindung zu verhindern. Diese kann z. B. mittels der in den Beispielen näher beschriebenen Inhibitionsassays bewertet werden. Hybridome, die spezifisch an die Nidogen- Bindungsdomäne des Laminins bindende MAK herstellen, werden kloniert. Sie stehen sodann für die MAK-Produktion auf Dauer zur Verfügung. Je nach gewünschtem Verwendungszweck ist es vorteilhaft, nur Teile der Antikörper, wie z. B. F (ab) 2, Fab'oder Fab-Fragmente, einzusetzen. Diese können beispielsweise mit dem Fachmann bekannten enzymatischen Spaltverfahren (siehe z. B. Harlow, E. & Lane, D. (1988) Antibodies : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor) erzeugt werden.

Die Antigenbindungstellen eines Antikörpers befinden sich in den sogenannten variablen Domänen, die durch die entsprechenden V-Gene kodiert sind. Mit den bekannten gentechnischen Methoden (siehe z. B. Sambrook, J. et al. (1989) Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, 2nd. edition ; McCafferty, J. et al. (1990) Nature 348 : 552-554) kann auch die entsprechende Nukleinsäuresequenz eines an die Nidogen- Bindungsdomäne des Laminins bindenden Antikörpers ermittelt werden sowie dadurch auch die entsprechende Aminosäuresequenz, sofern diese noch nicht per Aminosäuresequenzierung bereits bekannt war. Als Ausgangsmaterial für die Analysen werden Hybridoma-Zellen bzw. die Antikörper-produzierenden Immunzellen immunisierter Säugetiere eingesetzt.

In Kenntnis der Nuklein-und Aminosäuresequenz können mit Hilfe üblicher gentechnischer und molekularbiologischer Methoden (siehe auch Johnson, K. S. & Chiswell, D. J. (1993) Current Opinion in Structural Biology 3 : 564-571) dann humanisierte oder chimäre, bi-oder oligospezifische Antikörper sowie Antikörperanaloga, wie z. B. von der"complementarity determining region" abgeleiteten Polypeptide ("minimal recognition units"),"single chain"-Fragmente oder funktionelle Fusionsprodukte-wie insbesondere rekombinant hergestellte Antikörper-Enzym oder-Komplement-Konstrukte-hergestellt werden, die spezifisch an die Nidogen-Bindungsdomäne des Laminins binden. Diese vom erfindungsgemäßen Antikörper bzw. Antikörpergen abgeleiteten Moleküle werden von dem in dieser Schrift verwendeten Überbegriff"Antikörper oder ein Teil desselben"mitumfaßt. Mit diesen Molekülen kann z. B. eine Verringerung der Immunogenität und/oder eine verstärkte Wirksamkeit bei Verabreichung als Arzneimittel erzielt werden und/oder es ergeben sich Vorteile für den Einsatz als Diagnostikum bzw. als Hilfsmittel für die Entwicklung und Bewertung von die Laminin/Nidogen-hteraktion beeinflussenden Stoffen. Die Antikörper oder Teile derselben sind herstellbar in pflanzlichen (z. B. Hefe), tierischen und prokaryontischen Zellen.

Die erfindungsgemäßen Antikörper sowie Teile derselben können modifiziert werden, z. B. durch die Markierung mit radioaktiven Isotopen oder paramagnetischen Verbindungen zum Einsatz für die in vivo-Diagnostik oder durch die Anbindung von pharmakologisch wirksamen Substanzen zur Erzeugung eines noch wirksameren Arzneimittels.

Die im folgenden aufgeführten Beispiele dienen zur exemplarischen Beleuchtung einzelner Aspekte der Erfindung.

Beispiele : SDS-Gelelektrophorese, Western Blotting, BCA Proteinbestimmung wurden nach Standardprotokollen oder nach den Anweisungen der Hersteller durchgeführt.

Wenn nicht ausdrücklich angegeben, wurden die verwendeten Chemikalien von den Firmen Merck (Darmstadt), Sigma (München) oder Riedel de Haen (Seeize) bezogen.

Beispiel 1 : Synthese von Peptiden 148 mg (0, 1 mmol) eines FMOC-Amidanker-PAM Harzes wurden zur Festphasensynthese-ABI 433 Peptidsynthesizer-des Peptides eingesetzt. Nach Beendigung der Synthese beobachtete man eine Gewichtszunahme des Harzes auf 513 mg. Das Harz wurde mit einer Lösung aus 10 ml Trifluoressigsäure und 365 pi Triethylsilan für 2 Stunden bei Raumtemperatur behandelt. Nach Abfiltration des Harzes wurde die Lösung im Vakuum einrotiert und mit 50 mi 10% Essigsäure (AcOH) aufgenommen und gefriergetrocknet. Man erhielt 145 mg (54% Ausbeute) an Rohpeptid. Das Rohpeptid wurde anschließend in 3 mi 80% AcOH gelöst und diese Lösung zu einer schnell gerührten Lösung (0, 006 mmol Jod, 0, 006 mmol Natriumacetat in 55 ml 80% AcOH) zugetropft. Nach 5 min wurde die Reaktion durch Zugabe von 0, 1 N Ascorbinsäurelösung beendet. Die Lösung wurde auf ein Volumen von 2 ml eingeengt und auf eine Sephadex G25 Säule, die mit 0, 1 M AcOH entwickelt wurde, aufgetragen. Das isolierte Peptid wurde durch Reversed Phase HPLC-Chromatographie hochgereinigt.

Ausbeute : 36 mg von DNIDPNAVGNLKCIYNTAGFYCDR-NH2 (13, 5% der Theorie.) Die Struktur wurde durch Massenspektroskopie (Molmasse : 2673 Da) und Aminosäureanalyse bestätigt.

Analog wurde das Peptid DNIDPNAVGNL-NH2 hergestellt.

Ausbeute : 268mg (67% der Theorie) ; Molmasse : 1140 Da Beispiel 2 : Kopplung der Peptide an Ovalbumin 30 mg Ovalbumin (Sigma A-2512) wurden in 1 ml Na-Phosphat Puffer, pH 7, 4 gelöst und mit 200 ut einer wäßrigen Lösung aus 7 mg N-Hydroxysulfosuccinimid Na-Salz (Fluka 56485) sowie 300 ut einer wäßrigen Lösung aus 100 mg 1-Ethyl-3- (3- Diaminaminopropyl)-carbodiimid, HCI (Sigma E-6383) versetzt. Nach 5 Minuten wurde die Peptidlösung (30 mg des entsprechenden Peptids in 1 ml 10 mM Na- Phosphat Puffer, pH 7, 4) zugegeben. Die Kopplungsreaktion verlief 16 Stunden bei Raumtemperatur im Dunkeln. Nach der Reaktionszeit wurde die Lösung zentrifugiert, um eventuell auftretende Trübungen zu entfernen. Unreagierte Chemikalien und Salze wurden anschließend durch Chromatographie über eine NAP-25 Saute (Pharmacia) entfernt. Das Ovalbumin/Peptid Konjugat wurde dadurch in PBS + 0, 04% Tween-20 überführt. Die Ausbeute betrug 50-55 mg Konjugat.

Konjugat-1 : Ovalbumin-DNIDPNAVGNL Konjugat-2 : Ovalbumin-DNIDPNAVGNLKCIYNTAGFYCDR (s-s verbruckte Form) I I Beispiel 3 : Immunisierung von Kaninchen Gemischtrassige Kaninchen mit einem Körpergewicht von ca. 3 kg wurden mit den Ovalbumin/Peptid Konjugaten immunisiert. Hierfür wurden 1 mg der entsprechenden Konjugate in 0, 5 mi Phosphat-gepufferte Saline (PBS) gelöst und dann mit demselben Volumen komplettes Freund'sches Adjuvans gemischt und sorgfältig emulgiert. 1 ml der so erhaltenen Emulsion wurde einem Kaninchen intradermal injiziert ; dabei wurde jeweils ein Fünftel des Volumes in fünf unterschiedliche Stellen, nahe der regionalen Lymphknoten, appliziert. Booster-Injektionen (das Antigen wurde hierfür mit unkompletten Freund'schem Adjuvans emulgiert) wurden mit halbkonzentrierter Antigenemulsion nach 21 Tagen und 53 Tagen durchgeführt.

Beispiel 4 : Titerentwicklung in vier immunisierten Kaninchen Die spezifische Antikörper-Titerentwicklung wurde bei vier Tieren mit einem Enzymimmunoassay unter Verwendung von Laminin P1 bzw. Laminin y1 lil 3-5 beschichteten Kunststoffgefäßen näher untersucht. Die entsprechenden Tierseren sind mit den Bezeichnungen K2, K3, K4 und K905 spezifiziert. Die Seren K3 und K4 wurden durch Immunisierung mit Konjugat-1 erhalten, die Seren K2 und K905 durch Immunisierung mit Konjugat-2. In allen Kaninchen wurde sehr schnell eine Immunreaktion angeregt, die dann nach 21 Tagen (1. Booster) konstant blieb, bzw. langsam aber kontinuierlich abklang. Eine erneute Stimulierung der Immunantwort durch eine zweite Boosterinjektion wurde nicht beobachtet. Die gebildeten Antiköper reagierten sowohl mit Laminin P1 als auch mit der Laminin-Domäne Y1 III 3-5. Die Bindung zum Laminin P1 war allerdings etwas weniger ausgeprägt als die zum Laminin y1 II 3-5 und schien im Prozeß der Immunreaktion stärkeren Schwankungen unterworfen zu sein. Dies kann ein Hinweis sein auf mehrere Antikörperpopulationen im polyklonalen Serum, die mit verschiedenen Affinitäten die Nidogen-bindenden Motive, bzw. deren Konformationen im Laminin P1 und im Laminin y1 III 3-5 binden.

Beispiel 5 : Affinitätsreinigung der Antikörper Zur weiteren Charakterisierung wurden die spezifischen Antikörper von den übrigen Immunglobulinen im Tierserum, weiteren Serumbestandteilen und den gegen Ovalbumin gerichteten Antikörpern abgetrennt. Hierfür wurde eine Affnitätschromatographie an einer Laminin P1-Affinitätsmatrix durchgeführt.

Als Träger (Gelmatrix) wurde Fractogel EMD Azlacton 650 (S) (Merck, Darmstadt) verwendet. 0, 3 g des Materials wurden vor der Kopplung 15 Minuten in 6 ml PBS, 1 M Na2SO3, pH 7, 4 inkubiert, anschließend wurde der flüssige Überstand abgegossen. Während der Inkubation quoll das Material auf ein Volumen von 1 ml und die Matrix konnte direkt zur kovalenten Kopplung des gewünschten Liganden eingesetzt werden.

3, 4 mg humanes Laminin P1 wurden in 2 ml 0, 2 M Ammoniumbicarbonat, pH 8, 0 gelöst und mit 1 ml aktiviertem (s. o.) Trägermaterial bei 4°C über Nacht (> 16 h) inkubiert. Anschlie#end wurde das Gelmaterial mit 0, 2 M Ammoniumbicarbonat, pH 8, 0 gewaschen. Die verbliebenen aktiven Gruppen des Trägermaterials wurden durch eine 24-stündige Inkubation in 5 ml 0, 2 M Glyzin, pH 8, 0 bei 4°C blockiert.

Schließlich wurde die Gelmatrix mit drei Waschzyklen, bestehend aus alternierenden Inkubationen in PBS, 1 M Na2SO3, pH 7, 4, 0, 1 M Na-Azetat, pH 4, 0 und 0, 2 M Glyzin, pH 8, 0 für die Affinitätsbindung vorbereitet. Die Matrix wurde in eine HR 5/5 Saute von Pharmacia gefüllt und mit PBS/0, 04% Tween-20 equilibriert.

Zur Reinigung Laminin P1-bindender Antikörper aus den Tierseren wurde das jeweilige Serum 1 : 2 mit PBS/0, 04% Tween-20 verdünnt und bei einer Flußrate von 2 ml/min über die Säule geleitet. Anschließend wurde mit Puffer nachgewaschen bis im UV-Signal (220 nm) des Durchflußmonitors die Grundlinie wieder erreicht wurde.

Die Elution der gebundenen Antikörper erfolgte schließlich durch den Wechsel des Laufpuffers zu 0, 1 M Glycin/HCI, pH 2, 7.

Die Analyse der Säulendurchläufe und Säuleneluate erfolgte mit Hilfe eines Enzymimmunoassays unter Verwendung von immobilisiertem Laminin yl III 3-5.

Aus den vier Tierseren konnten durch die beschriebene Affinitätsreinigung Antikörper gereinigt werden. Die Ausbeute betrug durchschnittlich 0, 3 mg pro 50 ml Serum (im Falle des Serums K2 betrug die Ausbeute lediglich 0, 1 mg). Ein Großteil der Antikörper in allen Seren (> 80%) band allerdings nicht an Laminin P1, vermutlich aufgrund einer zu langsamen Bindungskinetik oder aufgrund einer ausschließlichen Affinität zur Sequenz des zur Immunisierung verwendeten Peptids.

Die Affinitätschromatographie an Laminin P1-Säulen führt folglich zu einer selektiven Anreicherung der schnell und stabil bindenden Antikörpervarianten (der gesuchten Antikörper) aus dem Serum.

Beispiel 6 : Bindungsspezifitäten der affinitätsgereinigten Antikörper Mittels Western Blot wurde nachgewiesen, daß die affinitätsgereinigten Antikörper ihre Bindungsspezifität zum Laminin P1 bewahrt haben und daß die verschiedenen Präparationen stärker mit dem nicht reduzierten Laminin P1 reagierten als mit den durch Reduktion der Disulfide separierbaren linearen Laminin P1-Fragmenten (Gerl, M. et al. (1991) Eur. J. Biochem. 202 : 167-174). Dies ist ein Indiz für eine konformationsabhängige Komponente in der Bindungsspezifität der Antikörper.

Weiterhin zeigte sich, daß sich die vier Antikörperpräparationen in ihren Bindungspräferenzen voneinander unterschieden. Die beiden durch Immunisierung mit Konjugat-1 gewonnenen Antikörperpräparationen K3 und K4 erkannten identische Laminin P1-Banden nach SDS (Sodiumdodecylsulfat) Gelelektrophorese der nicht reduzierten Probe. Die beiden Antikörperpräparationen K2 und K 905 (Anti- Konjugat-2) zeigten ebenfalls ein zueinander identisches Reaktionsmuster, allerdings wurden weniger Laminin P1-Banden erkannt als bei den beiden Anti- Konjugat-1-Antikörpernpräparationen.

Beim immunchemischen Nachweis der durch Reduktion und SDS-Gelelektrophorese separierten Laminin P1-Banden fallut auf, daß alle vier Antikörperpräparationen unterschiedliche Bindungspräferenzen zu Laminin y1 1114 enthaltenden Fragmenten aufwiesen.

Beispiel 7 : Inhibitionsassays-Hemmung der Laminin/Nidogen-Bindung mit affinitätsgereinigten Antikörpern Die inhibitorische Aktivität der affinitätsgereinigten Antikörper kann mit einem "coated tube assay"identifiziert werden, in dem die Bindung von radioaktiv markiertem Nidogen an Laminin P1 (aus humaner Plazenta) beschichtete Röhrchen in Anwesenheit der Antikörper gemessen wird.

Radioaktive Markierung von Nidogen mit 125Jod Rekombinant produziertes humanes Nidogen (35 µg, Beschreibung des Klons, Kultur-und Reinigungsbedingungen, siehe Mayer, U. et al. (1995) Eur. J. Biochem.

227 : 681-686) wurde in 250 pI PBS gelöst und mit 0, 405 mCi (= 15 MBq) Na-Jodid (1251) Lösung (= 1, 55 Nl, Nordion Europe), 10 ut 0, 5 M Na-Phosphat, pH 7, 4 sowie 40 pg Chloramin T (N-Chlor4-Toluolsulfonsäureamid Natriumsalz, Merck) in 100 ut 0, 05 M Na-Phosphat, pH 7, 4 versetzt. Die Reaktion erfolgte 60 Sekunden bei Raumtemperatur und wurde durch Zugabe einer Lösung von 40 ug Na-Meta-Bisulfit (Riedel-de-Haen) in 100 ut 0, 05 M Na-Phosphat, pH 7, 4 gestoppt. Dies erfolgte in maximal 30 Sekunden, dann wurde der Ansatz mit 900 µ 1% BSA (Sigma) in PBS versetzt. Die Abtrennung freier Radioaktivität und überschüssiger Salze erfolgte durch Siebgelchromatographie mit Hilfe einer PD 10 Saute (Pharmacia). Das in PBS eluierte jodierte Nidogen wurde gepoolt und so mit 1% BSA/0, 05 M Na- Phosphat/0, 01 % Na-Azid, pH 7, 4 verdünnt, daß eine Konzentration von 50 ng/ml resultierte.

Beschichtung von Reaktionsröhrchen Reaktionsröhrchen (Greiner, 75 x 12, No. 115061) werden mit einer Laminin P1 Lösung, 4 pg/ml in Carbonat Puffer (0, 159g Na2CO3 ; 0, 293g NaHCO3 ; 0, 02g NaN3 in 1 Liter destilliertem Wasser), 20 ug/ml BSA (Rinderserumalbumin, Serva) pH 9, 2 über Nacht bei 4°C beschichtet. Freie Bindungsstellen werden anschließend durch 2-stündige Inkubation mit 0, 5 mi 0, 5% BSA in PBS/0, 04% Tween-20 blockiert.

Inhibitonsassay mit"lamininmimetischen"Strukturen (sequentielle Inhibition) In einem Reaktionsgefäß wurden 200 NI jodiertes Nidogen (ca. 10 ng, ca. 40000 counts per min) und 200 ul des Inhibitors (z. B. Peptide, die aus der Domäne y1 ici 4 des Laminins abgeleitet werden können) oder Standards (Laminin y1 lit 3-5) bei Raumtemperatur geschüttelt. Sowohl der Inhibitor als auch der Standard waren in PBS/0, 04% Tween-20 gelost. Nach einer Inkubationszeit von 3 Stunden wurden 150 pi aus diesem Ansatz in die gecoateten Röhrchen überführt und weitere 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Schließlich wurde die Lösung abgekippt, zweimal mit 1 ml PBS/0, 04% Tween-20 gewaschen und die gebundene Radioaktivität (Nidogen) im Gamma-Counter gemessen. Die Menge an gebundenem Nidogen in den Lösungen mit Inhibitor wurde mit der des Nidogens ohne Inhibitorzusatz in Beziehung gesetzt.

Inhibitonsassay mit"nidogenmimetischen"Strukturen (sequentielle Inhibition) In den mit Laminin P1 beschichteten Reaktionsgefäßen wurden 150 pi des Inhibitors (z. B. ein an die Domäne Y1 III 4 des Laminins bindender Antikörper oder ein Peptid, welches aus der Sequenz des Nidogens abgeleitet werden kann) oder Standards (rekombinantes Nidogen) für 3 Stunden geschüttelt. Sowohl Inhibitor als auch Standard waren in PBS/0, 04% Tween-20 gelost. Nach dem Absaugen der Probe wurde für 2 Stunden 150 pI jodiertes Nidogen (ca. 10 ng, ca. 40000 counts per min) zugegeben, um den gebundenen Inhibitor zu verdrängen. Schließlich wurde die Lösung abgekippt, zweimal mit 1 ml PBS/0, 04% Tween-20 gewaschen und die gebundene Radioaktivität (Nidogen) im Gamma-Counter gemessen. Die Menge an gebundenem radioaktiven Nidogen wurde mit der Inhibitor-bzw.

Standardkonzentration in Beziehung gesetzt.

Inhibitonsassay (simultane Inhibition) Bei dieser Assayvariante erfolgte keine Vorinkubation. Es wurden vielmehr 75 pl jodiertes Nidogen (10 ng) mit 75 pi Inhibitor oder Standard direkt in die gecoateten Röhrchen pipettiert und 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert, ansonsten wurde analog zu den sequentiellen Assayvarianten verfahren.

Ergebnis Für den Standard Laminin y1 III 3-5 wurde aus zehn unabhängig durchgeführten Assays eine IC50% von 0, 22 nM mit einer Standardabweichung von +/-15 % ermittelt. Die IC50% ist als die Stoffkonzentration definiert, die für eine 50% ige Hemmung der Nidogen-Bindung an Laminin P1 benötigt wird. Mit dem in US 5, 493, 008 beschriebenen (Equilibrium-) Inhibitionsassay wurde vergleichsweise ein In50% von 0, 05 nM mit einer Standardabweichung von +/-52 % erhalten.

Der Tabelle 2 sind die IC50%-Werte der Antikörperpräparationen K3, K905, K1. 2, K2. 2 und K3. 2 sowie verschiedener freier Peptide zu entnehmen. Die Antikörperpräparationen K1. 2, K2. 2 und K3. 2 stammen aus einer zweiten Immunisierungskampagne von Kaninchen mit neuem Konjugat-2 und vergleichbarer Aufreinigung. Die Ergebnisse belegen die Reproduzierbarkeit des Verfahrens. Tabelle 2 : Inhibition der Laminin/Nidogen-Bindung durch die erfindungsgemäßen Antikörper. Inhibitor K3 K905 K1.2 K2. 2 K2. 2 K3. 2 Peptid (1) * Peptid (2) * IC50% IC50% IC50% IC50% IC50% IC50% IC50% nM nM nM nM nM nM nM sequentiell** 72 150 500 80 350 60000 20000 simultan"110-600 80 500 60000 20000 * : Aminosäuresequenz s. Tabelle 1 ** : Assaytyp In US 5, 493, 008 werden für inhibitorische Peptide, die aus der Nidogen/Bindungsdomaine abgeleitet werden können, IC50%-Werte zwischen 22 nM und 1000 nM angegeben. Diese Werte konnten mit dem gewählten Assay- aufgrund der drastisch verkürzten Inkubationszeiten-nicht erreicht werden ; Das Peptid DNIDPNAVGNL erreichte im hier beschriebenen Assay z. B. nur einen IC50% = 60000 nM.

Beispiel 8 : Charakterisierung der Bindungskinetiken mit dem BlAcore) System Mit dem BlAcore° System der Firma Pharmacia Biosensor können biospezifische Interaktionen on-line verfolgt werden. Das Prinzip der Messung beruht auf einem optischen Phänomen (surface plasmon resonance), das durch die auf einem Goldfilm gebundene Masse beeinflu#t wird. Vereinfacht ausgedrückt handelt es sich um eine miniaturisierte Affinitätschromatographie auf einer Gold-Sensoroberfläche.

Die Menge des spezifisch gebundenen Liganden kann in Form eines Resonanzsignals bildlich dargestellt werden (Chaiken,I. et al. (1992) Anal. Biochem.

201 : 197-201 ; Karlsson, R. et al. (1992) in : Structure of Antigens ; (Ed. : van Regenmortel). S. 127-148 ; CRC Press, Boca Raton, Fl.) Laminin P1 wurde gemäß den Instruktionen des User-Manuals bei einer Konzentration von 200 pg/ml in 10 mM Na-Acetat, pH 4, 0 auf dem Sensorchip immobilisiert. Es resultiert eine Matrix mit 4000 RU gebundenem Laminin P1. Zur Regeneration der Affinitätsmatrix kann ein Doppelimpuls à 4 µl 100 mM HCI durchgeführt werden.

Bei einer Flußrate von 2 pI/min in HBS Puffer (10 mM HEPES, 3, 4 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0, 005% BlAsurfactant P20 ; pH = 7, 4) band Nidogen (20 µg/ml) mit einer parabolischen Sättigingskinetik an Laminin P1, die affinitätsgereinigten Antikörperpräparationen K905 und K3 in einer lineraren Abhängigkeit zum Antigen.

Die Tatsache, daß nach 1400 Sekunden noch kein Übergang zur Gleichgewichtseinstellung zu beobachten war, kann Ausdruck dafür sein, daß die spezifische Peptidsequenz des Laminin P1, welche für die Nidogen-Bindung verantwortlich ist, für die Antikörper gut zugänglich war. Die Antikörper banden an diese Sequenz unabhängig davon, ob sie in der biologisch aktiven oder in einer davon unterschiedlichen Konformation vorlag. Beleg dafür ist die Beobachtung, da# das Nidogen bereits nach einer Bindung von 600 RU einen deulichen Übergang in die Sättigungsphase aufwies. Es lagen also offensichtlich nicht alle immobilisierten Laminin P1 Moleküle in einer für das Nidogen erkennbaren Struktur vor, da die theoretische Maximalsättigung der Schicht von 2500 RU nicht erreicht wurde. Diese wäre aber von den beiden Antikörpern nach langer Kontaktzeit erreicht worden.

Auffallend ist, daß die Probe K905 zehnfach höher konzentriert eingesetzt werden (320 ug/mt) mußte, um eine mit K3 (33 ug/ml) vergleichbare Bindungsrate zu erreichen. Die Bindung von K905 zum Laminin P1 war hingegen stabiler als die von K3, denn die Dissoziationsrate von K905 (erkennbar ab dem Zeitpunkt des Wechsels zum HBS Puffer : 1500 Sekunden) war erheblich langsamer als die der Präparation K3.

Diese Befunde erklären die in den Inhibitionsassays festgestellten Unterschiede zwischen K3 und K905 : Die Antikörperpräparation K3 inhibiert die Laminin-Nidogen-Bindung besser als K905, weil sie durch eine schnellere Assoziationskinetik charakterisiert ist.

Die Antikörperpräparation K3 inhibiert auch dann, wenn sie simultan mit dem Nidogen in den mit Laminin P1 beschichteten Röhrchen inkubiert wird, weil sie bei einer zum Nidogen vergleichbaren Konzentration eine gute Assoziationskinetik hat.

Die Antikörperpräparation K905 kann nur in der Assayvariante"sequentielle Inhibition"inhibieren, weil sie durch eine langsame Dissoziationsrate charakterisiert ist und deshalb von dem später zugesetzten Nidogen nicht mehr so gut vom Antigen verdrängt werden kann. Bei einer gleichzeitigen Konkurrenz um die Bindungsstelle ist K905 aufgrund der sehr langsamen Assoziationskinetik dem Nidogen unterlegen.

Beispiel 9 : Nachweis der Bindungsspezifitäten der affinitätsgereinigten Antikörperpräparationen K3 und K905 mittels Western Blot In Westen Blot-Analysen wurde die Interaktion der Antikörperpräparationen K3 und K905 mit dem Konjugat-2 und dem Ovalbumin untersucht. Hierzu wurden die Antigene mit Hilfe von 4-12%NuPAGE# Gelen (NOVEX#, San Diego, CA) unter Zuhilfenahme eines MOPS-Puffers gemäß Instruktionsanleitung von NOVEZ aufgetrennt und anschlie#end unter Verwendung von NuPAGET" Transferpuffer (NOVEZ) auf Nitrozellulose-Membranen übertragen. Nach Blockierung der freien Bindungsstellen auf der Membran mit 1 µg/ml Polyvinylalkohol (1 min) wurden die Antigene mit den Testantikörpern inkubiert. Der Nachweis von gebundenen Antikörpern erfolgte dann mit Hilfe von Anti-Kaninchen IgG-Antikörpern, an die das Enzym alkalische Phosphatase kovalent gebunden war.

Es zeigte sich, daß die affinitätsgereinigten Antikörper auschliel3lich an das Peptid binden, denn eine Interaktion mit dem Trägerprotein Ovalbumin ist nicht nachweisbar. Eine Reaktion mit den blaugefärbten Markern des"See Blue" Standards (NOVEZ) konnte ebenfalls nicht beobachtet werden.

Weiterhin wurde nachgewiesen, daß sowohl K3 als auch K905 mit Laminin und Lamininderivaten unterschiedlicher Spezies (Laminin aus der humanen Plazenta sowie aus dem Dottersack der Ratte (Calbiochem), Laminin P1 aus der humanen Plazenta sowie dem EHS Tumor der Maus, rekombinant hergestelltes Maus-Laminin y1 III 3-5) reagieren. Dies belegt die Bindung der Antikörper an die konservierte Sequenz innerhalb der Nidogen-Bindungsdomäne. Beide Antikörperpräparationen zeigten keine Kreuzreaktivität zum humanen Nidogen und zum humanen Kollagen Typ IV. Dies ist die Voraussetzung für die eindeutige Verwendung der beschriebenen Antikörper als Nidogen-Antagonisten.

Beispiel 10 : Herstellung monoklonaler Antikörper Zur Gewinnung monoklonaler Antikörper werden geeignete Wirbeltiere, bevorzugt Mäuse oder Ratten, nach Standardverfahren z. B. mit Laminin, Laminin P1, Laminin y1 III 3-5, Laminin Y1 III 4 oder mit den im Beispiel 2 aufgeführten Konjugaten immunisiert. Im Falle einer spezifischen Immunreaktion des Antiserums werden gemäß Standardverfahren MAK-produzierende Hybridome gewonnen.

Das Screening nach den gewünschten Antikörpern bzw. den entsprechenden Hybridoma-Klonen ermöglichen u. a. Bindungsassays (z. B. Dot Blot oder Western Blot mit Laminin y 1 III 3-5 und/oder Laminin y 1 III 4) sowie vor allem auch die im Beispiel 7 beschriebenen Inhibitionsassays. Die selektierten Klone stellen eine Quelle für die Synthese großer Mengen der erfindungsgemäßen Antikörper dar.

Zur Reinigung der gewünschten Antikörper können übliche Verfahren eingesetzt werden, wie z. B. die Bindung an Protein G oder A. Bevorzugt erfolgt jedoch eine Affinitätschromatographie an Laminin P1-Säulen. Dieser Reinigungsschritt erlaubt, wie im Falle der weiter oben beschriebenen polyklonalen Antikörper, die Auswahl und selektive Anreicherung der monoklonalen Antikörper mit den besten Bindungskonstanten.

Ein Beispiel für einen Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung ist der monoklonale Antikörper (MAK), welcher von dem unter der Hinterlegungsnummer DSMACC2327 am 27. Oktober 1997 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ, MarscheroderWeg 1b, 38124 Braunschweig, Deutschland) gemäß den Vorschriften des Budapester Vertrags hinterlegten monoklonalen Zeliklon A6/2/4 produziert wird.

Das Hybridom stammt aus einer Immunisierung von Mäusen mit Laminin P1, welches aus Humanplazenta isoliert worden war. Die Reinigung des Antigens, sowie die Erzeugung der Hybridome ist in der EP 0 696 597 A2 beschrieben.

Der Antikörper A6/2/4 wurde aufgrund seiner Bindungseigenschaften an Laminin y1 III 3-5 und Laminin y1 ici 4 identifiziert. Es handelt sich um einen monoklonalen Antikörper des IgM-Subtyps der durch Siebgelchromatographie gereinigt werden kann. Die Bindung zum Laminin P1 ist u. a. aufgrund der gegebenen Polyvalenz außerordentlich stark. Deshalb und aufgrund der Größe des IgM Antikörpers ist eine Elution von Laminin P1 Affinitatssaulen (s. o.) nicht zu erzielen. Die starke Bindung zum Laminin P1 spiegel sich im Inhibitionsassay ("simultane Variante", s. o.) wider.

Der MAK A6/2/4 ist in der Lage, die Laminin/Nidogen Assoziation mit einem IC50 von 30 nM zu inhibieren.

Aufgrund der ausgeprägten Konformationsabhängigkeit in seiner Bindung kann das Bindeepitop in der Laminin Y1 III 4 Domäne (der Nidogen bindenden Domäne des Laminins) nicht eindeutig eingekränzt werden. Die Tatsache, daß Peptide, die aus der Nidogenbindungssequenz des Laminins abgeleitet werden können, die Wechselwirkung des Antikörpers mit Laminin P1 partiel (75-80 %) unterdrücken, deutet aber darauf hin, daß das Bindeepitop des MAK A6/2/4mit dem des Nidogens überlappt.

Im folgenden wird die Herstellung von inhibitorischen, monoklonalen Antikörpern beschrieben die, wie die polyklonalen Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung, mit Hilfe des Peptid/Ovalbumin Konjugats erzeugt werden können.

Mäuse vom SJUJ-Stamm werden mit 50 ug Peptid-2/Ovalbumin Konjugat (Konjugat 2, s. o.) in Gegenwart von komplettem Freund'schen Adjuvans subcutan immunisiert. Nach 4 und 8 Wochen wird die Immunreaktion durch weitere subcutane Injektionen von je 25 ug Konjugat 2 in Gegenwart von inkomplettem Freund'schen Adjuvans verstärkt und sieben weitere Wochen gewartet. Drei Tage vor der Fusion wird die Immunantwort durch intraperitoneale Injektion von weiteren 25 ug Konjugat 2 verstärkt.

Zur Fusion werden die Tiere getötet und die Milzzellen isoliert. In Gegenwart von Polyethylenglycol werden die Milzzellen mit der Myeloma Zellinie P3X63AG8. 653 fusioniert. Durch Kultivierung der Fusionsmischung in Hypoxanthin-Aminopterin- Thymidin-Medium über einen Zeitraum von drei Wochen wird auf Milzzell x P3X63AG8. 653-Hybride selektioniert. Zur Erreichung einer stabilen Zellinie werden die erhaltenen Zellklone mehrfach subkloniert. Die entstehenden Zelikolonien werden in verschiedenen immunologischen Bindungstests auf Antikörperproduktion getestet. Die entstandenen Zellinien E79/1/6 und E82/1/10 wurden aufgrund der unten stehenden Screeningstrategie selektioniert.

Versuche zur Charakterisierung und Identifizierung der spezifischen monoklonalen Antikörper.

Die Immunisierung von SJUJ-Mäusen mit Konjugat 2 führt zu einer au#erordentlich gro#en Anzahl Antikörper produzierender Hybridomaklone. Die Antikörper im Kulturüberstand weisen eine starke Immunreaktion mit Laminin y1 III 3-5, Laminin P1 und Ovalbumin auf.

Um nun Klone zu finden die monoklonale Antikörper gegen die nativ stukturierte Nidogen Bindungsdomäne des Laminins produzieren, mußte ein geeignetes Screeningverfahren durchgeführt werden.

Hauptaugenmerk bei diesem Screeningverfahren wird auf die Bindung der Antikörper an Laminin P1 und Laminin y1 III 3-5 gelenkt. Gleichzeitig mu# im Zuge der Subklonierungen darauf geachtet werden, da# die Reaktion mit dem Trägerprotein, Ovalbumin, vernachlässigbar wird und Antikörper die ausschlie#lich Ovalbumin erkennen aussortiert werden.

In den Tabellen 3 und 4 sind die Ergebnisse dargestellt, die mit zwei derart identifizierten Klonen (E79 und E82) erzielt werden.

Tabelle 3 : Bestimmung der Bindung von E79 im ELISA Laminin Laminin P1 Ovalbumin Y1 III 3-5, Beschichtung : 2, 5 Beschichtung : Beschichtung : pg/ml 2, 0 pg/ml 20 pg/ml Hybridom E79 unverdünnter Kulturüberstand 1, 33 0, 68 1, 63 E79/1/6, 1. Klonierung 2, 03 0, 16 0, 27 unverdünnter Kulturüberstand E79/1/6, gereinigter Antikörper 2, 5 pg/ml 0, 56 0, 33 0, 05 Tabelle 4 : Bestimmung der Bindung von E82 im ELISA Laminin Laminin P1 Ovalbumin Y1 III 3-5, Beschichtung : Beschichtung : Beschichtung : 2, 5 µg/ml 2,0 µg/ml 20 pg/mi Hybridom E82 unverdünnter 1, 77 1, 48 2, 33 Kulturüberstand E82/1/10, 1. Klonierung 1, 32 0, 26 0, 05 unverdünnter Kulturüberstand E82/1/10, gereinigter 1, 55 0, 5 0, 18 Antikörper 6, 4 ug/ml Durch die Klonierung ist es offensichtlich gelungen, Zellen abzutrennen, die eine Immunreaktion mit Ovalbumin zeigen. Gleichzeitig konnte jeweils ein Zellklon separiert werden, der Antikörper produziert der eine Bindung zu Laminin y1 III 3-5 und Laminin P1 zeigt. Diese Tatsache und die Tatsache, daß die Immunisierung mit einem Peptid erfolgte, das aus der Nidogen Bindungsdomäne des Laminins abgeleitet ist, belegt, daß die gefundenen Antikörper an das nativ strukturierte Nidogen Bindungsmotif des Laminins binden.

Den direkten Beweis für die Bindungsspezifität liefert die"simultane"Variante des Inhibitionsassays (s. o.), in dem die gefundenen Antikörper direkt mit jodiertem Nidogen um die Bindung an das Nidogen Bindungsmotif des intakten Laminins (Laminin aus Maus EHS Tumor, Chemicon, Nr. CC095) konkurrieren.

Der von Zellklon E79/1/6 gebildete Antikörper (IgG2a - Subtyp) inhibiert die Laminin -Nidogen Assoziation mit einem IC50 von 19 nM, der von Zettkfon E82/1/10 gebildete Antikörper (IgG1-Subtyp) inhibiert die Laminin-Nidogen Assoziation mit einem IC50 von 190 nM.