【발명의 명칭】

알파-시누클레인에 대한항체 및그용도

【기술분야】

본발명은알파-시누클레인항체 및그용도에 관한기술이다.

【배경기술】

알파-시누클레인 ( _{a -} Synuclein， a -syn)은 뉴론의 전 시냅스 말단에서 주로 발현되며, 정상상태에서는자연적으로 접히지 않은상태의 단량체로 존재한다. 알파-시누클레인은 자발적 및 비자발적 운동의 시작과 정지를 제어하는 중요한 일종의 신경 전달 물질인 도파민의 방출을 규제하는것을돕는다. 특히 알파-시누클레인의 기능은시냅스활동의 증가 및나이가듦에 따라서 중요하며， 신경퇴화의 중요한인자이다.

그러나， 병적인 상태에서 알파-시누클레인은 액적 (droplet ) , 인지질 이중막또는지질막등과의 결합및상호작용을통해 구조적 변화를일으켜 접힌 또는 폴딩된 a -헬리칼 형태의 2차 구조를 형성하여 이량체 (dimer) , 올리고머 (ol igomer ) 및/또는 섬유상 형태의 분자를 포함하는 응집체를 형성하게 된다.

이러한 알파-시누클레인 응집체는 세포에 독성을 유발하는 것으로 알려져 있으며, 파킨슨병 (Parkinson' s di sease , PD) , 파킨슨질환성 치매 (Parkinson’ s di sease dement ia , PDD) , 다계통 위죽증 (mul t iple system atrophy, MSA) , 루이소체 치매 (dement i a wi th Lewy bodies , DLB) , 그 외 다양한 질환의 신경세포 내에서 발견되는 비정상적인 단백질 응집체인 루이소체의 주성분이다. 또한 알파-시누클레인의 인산화， 또는 유비퀴틴화와같은번역 후변형도알파-시누클 레인의 응집 및 신경독성과 관련이 있는 것으로 알려져 있다. 알파-시누클레인은 동물실험 및 세포실험에서도 도파민 신경세포를 사멸시키고 염증반응을 유발하며, 실험동물에서 파킨슨 병증과 유사한 운동증상을 유발하는 것으로 알려져 있다. 또한， 알파-시누클레인 응집은 파킨슨 병， 파킨슨질환성 치매， 루이소체 치매， 다계통위축증 및 기타 다수의 신경축삭 질환을 포함하는 시누클레인병 ( a -synucleinopathies)라고 불리는 일군의 신경퇴행성 질환의 병인과관련이 있는것으로알려져 있다.

나아가 파킨슨 질환 환자의 뇌척수액 및 혈장 샘플에서 올리고머 형태 및 모노머 형태의 알파-시누클레인이 모두 발견되었는데, 이는 작은 분자량의 알파-시누클레인 응집체가 세포막을 투과하여 세포외 공간에 접근할 수 있음을 나타낸다. 또한 폴딩된 알파-시누클레인이 엑소사이토시스에 의해 세포로부터 방출된 후， 프리온 단백질처럼, 세포간 전달에 의해 뇌의 한 영역에서 다른 영역으로 전달될 수 있는 것으로 나타났다.

이에, 알파-시누클레인이 파킨슨질환과같은시누클레인병의 치료제 개발의 표적이 되고 있다. 주요 개발 전략은 응집체 형성 억제， 유전자 사일런싱 및 응집체 제거를 포함한다. 전자의 경우， Epigal locatechin-3- gal late (EGCG) , 3-(1, 3-benzod i oxo 1 -5-y 1 ) -5- ( 3-br omopheny 1 ) - lH-py r azole (anlel38b, CLR0120 및 프롤릴 올리고펩티다제 억제제 KYP-20479를 포함한다.

저분자 화합물의 경우 표적 특이적인 결합력이 떨어지고 낮은 반감기로 인하여 높은 용량을 투여해야 한다. 항체는 저분자 화합물과 비교하여 표적 특이적이고， 높은 반감기를 나타내나, 질환 치료 가능성을 높이기 위해서는 높은 결합력으로 응집체에 선호적으로 결합하는 항체가 필요하다. 따라서 알파-시누클레인 응집체의 비정상적 축적과 연관된 질환의 치료를 위해， 알파- 시누클레인, 특히 알파-시누클레인의 응집체에 선호적으로결합할수있는항체의 개발이 필요하다.

【발명의 상세한설명】

【기술적 과제】

본 명세서에서는 알파-시누클레인, 특히 알파-시누클레인 응집체에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하고자 한다. 상기 알파-시누클레인에 대한 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 알파-시누클레인을 특이적으로 인식하고 결합할 수 있으며, 특히 알파- 시누클레인의 C-말단부위에 결합하는것일수있다.

본발명의 일 예는， 알파-시누클레인또는알파-시누클레인응집체� �� 특이적으로 결합하여, 대상 (subject)의 신경계에서 알파-시누클레인의 수준을 감소시키는 항체를 제공하다. 더욱 구체적으로， 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 알파-시누클레인 응집체， 구체적으로， 아밀로이드 피브릴 (amyloid f ibr i l s) , 프로토피브릴 (protof ibr i I s) 및 올리고머 (ol igomers)), 특히 아밀로이드피브릴에 대해 높은결합친화성을 가지며 , 알파-시누클레인 모노머 (monomer)에 대해 낮은 결합 친화성을 가지는항체또는이의 항원결합단편에 관한것이다.

본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편은， ( 0 알파- 시누클레인 또는 알파-시누클레인 응집체에 특이적인 결합, (i i ) 대상의 신경계에서 알파-시누클레인， 또는 알파-시누클레인 응집체의 수준 감소, (i i i) 신경세포간알파-시누클레인 또는 이의 응집체의 이동 (cel l-to-cel l transmi ssion) 감소또는 저해， 및 (vi ) 신경세포에 의한 알파-시누클레인 또는 이의 응집체의 식세포 작용 (phagocyt i c uptake)의 증진으로 이루어지는 군에 선택된 1종 이상의 활성을 갖는 것일 수 있다. 바람직하게는, 본발명에 따른항체 또는이의 항원 결합단편은상기 활성 (i )내지 (iv)를모두가지는것일수있다.

본 발명의 일 예는, 알파-시누클레인， 특히 알파-시누클레인 응집체에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 시누클레인병의 예방， 경감， 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 일 예는， 알파-시누클레인, 특히 알파-시누클레인 응집체에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을， 이를필요로하는대상에게 투여하는단계를포함하는시누클레인병의 예방, 경감, 개선 또는 치료방법에 관한 것이다. 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 투여량은대상의 신경계에서, 더욱자세하게는신경계의 신경세포외 영역에서 알파-시누클레인， 특히 알파-시누클레인 응집체의 수준을 감소시키는유효량일수있다.

본 발명의 일 예는, 알파-시누클레인， 특히 알파-시누클레인 응집체에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는， 대상의 신경계에서, 더욱 자세하게는 신경계의 신경세포외 영역에서 알파-시누클레인, 특히 알파-시누클레인 응집체의 수준을 감소시키는 방법 또는 신경계의 신경세포외 영역에서 알파-시누클레인， 특히 알파-시누클레인응집체의 수준을감소시키는용도에 관한것이다 _. 본 발명의 일 예는， 알파-시누클레인, 특히 알파-시누클레인 응집체에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는， 대상의 신경계에서， 더욱 자세하게는 신경세포간 알파- 시누클레인 또는 이의 응집체의 이동 (cel 1-to-cel 1 transmi ss ion) 감소 또는 저해시키는 방법， 또는 신경계의 신경세포간 알파-시누클레인 또는 이의 응집체의 이동 (cel 1-to-cel 1 transmi ssion) 감소 또는 저해사키는 용도에 관한것이다.

본 발명의 일 예는， 알파-시누클레인, 특히 알파-시누클레인 응집체에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, 대상의 신경계에서 미세교세포 (microgl i a)에 의한 알파- 시누클레인 또는 이의 응집체의 식세포 작용 (phagocyt ic uptake)을 증가시키는 방법, 또는 대상의 신경계에서 미세교세포 (mi crogl ia)에 의한 알파-시누클레인 또는 이의 응집체의 식세포 작용 (phagocyt i c _· uptake)을 증가시키는용도에 관한것이다.

【기술적 해결방법】

이하， 본발명을더욱자세히 설명하고자한다.

본 발명은 알파-시누클레인， 특히 알파-시누클레인 응집체에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하고자 한다. 상기 알파 시누클레인에 대한 항체 또는 이의 항원 결합 단편은， 베타 ( P )-혹은감마 ( Y )_시누클레인에 결합하지 않고알파-시누클레인을 특이적으로 인식하고 결합할 수 있으며, 아밀로이드 베타 (amyloid beta) 및 타우 (tau)의 응집체에 결합하지 않고 알파-시누클레인의 응집체에 특이적으로결합하는것일수있다.

본원에서 용어 "항원’ 또는 ⁿ 면역원”은 예를들면 항원 결합단백질 (예를 들면， 항체 또는 이의 면역학적으로 기능적인 항원 결합 단편)이 결합할수 있으며， 동물에서 항원에 결합할수 있는항체 생산에 사용될수 있는 분자 또는 분자의 일부를 의미한다. 항원은 상이한 항체 또는 이의 단편과 상호작용할 수 있는 하나 이상의 에피토프를 포함할 수 있다. 본원에 따른 일 구현예에서 항원은 알파-시누클레인 단백질 또는 알파- 시누클레인 응집체일 수 있다. 구체적으로 상기 알파-시누클레인 응집체는 아밀로이드 피브릴 (amyloid f ibr i l s) , 프로토피브릴 (protof ibr i I s) 및 올리고머 (ol igomers)) , 특히 아밀로이드피브릴일 수 있다. 본발명에 따른 알파-시누클레인 또는 이의 응집체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 항원 결합 단편은， 특히 알파-시누클레인의 C-말단 부위에 결합하는 것일 수 있다. N-말단을 인식하는 알파-시누클레인 항체들은 알파-시누클레인 관련 질환을 통칭하는 시누클레인병에 속하는 다계통위축증와 같은 다른 질병의 응집체는 인식하지 못하는 반면, C-말단 부위를 인식하는 알파- 시누클레인 항체들은 파킨슨 질병뿐 아니라 기타 다양한 시누클레인병 질환의응집체도인식한다는장점을가진다.

본원에서 용어 "중화 ¹ ’는결합단백질이 항원에 특이적으로결합할때， 상기 항원의 생물학적 활성을 억제 또는 감소하는 것이다. 일 구현예에서 중화 단백질 또는 중화 항체는 항원 (알파-시누클레인 또는 알파- 시누클레인 응집체)에 결합하여， 대상의 신경계에서 신경세포외 영역에서 항원의 수준을 적어도 약 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%를감소시키거나, 신경세포외 영역에서 항원의 수준증가를사전에 예방할수있다. 본원에서 ’’알파-시누클레인"은 SNCA 유전자에 의해 코딩되는 140개 잔기 아미노산으로 구성된 네이티브 _Q -Syn (NCBI ID： NP_000336)으로， 전장의 비처리된 것은 물론 처리된 다양한 형태의 것을 포함한다. 또한 자연적으로 나타나는 알파-시누클레인의 변이체， 예를 들면 돌연변이， 스플라이스 변이체 또는 대립 변이체를또한포함하는 것이다. 변이체로는 140개 잔기 단백질 이외에, 엑손 3 및 엑손 5가 결실된 126개 및 112개 잔기 단백질 형태도 존재한다 (CAG3339.1) . 또한 SNCA 유전자의 특정 다형성 (polymorphi sm) 또는 미스센스 (missense) 돌연변이가 파킨슨 질환의 발생과 관련성이 있는 것으로 알려져 있으며， 이러한 돌연변이체도 포함된다. 알파-시누클레인의 호몰로그인 베타- 및 감마-시누클레인이 존재한다. 일 구현예에서 본원에 따른 항체는 알파-시누클레인을 특이적으로 인식한다. 알파-시누클레인의 아미노산 서열은 서열번호 225로 표시된다.

본원에서 "알파-시누클레인 응집체”는 알파-시누클레인의 구조 (conformat ion)의 변화로 인한 것으로, 올리고머, 프로토피브릴， 피브릴 및/또는상기 구조중하나이상을포함하는구조또는응집체를 포함한다. 본 명세서에서 제공되는 항체가 항원으로 인식하는 알파- 시누클레인은 인간 알파-시누클레인， 원숭이 알파-시누클레인 (예컨대, Rhesus 알파-시누클레인)， 마우스 알파-시누클레인， 래트 알파-시누클레인 등의 포유동물 알파-시누클레인들중에서 선택된 것일 수 있으며, 예컨대, 인간 알파-시누클레인은 알파-시누클레인 (NCBI ID： NP_000336) 일 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다. 본 명세서에 다르게 언급되지 않는 한， 알파-시누클레인은인간알파-시누클레인을지� ��하는것일 수 있고 _, 본 명세서에서 제공되는항체 또는 이의 항원결합단편은인간알파-시누클레인 뿐만 아니라 원숭이 (예컨대， Rhesus) , 래트， 및/또는 마우스 알파- 시누클레인에도특이적인결합능을갖는것일수 있다.

상기 항체또는이의 항원결합단편이 결합하는알파-시누클레인의 C- 말단 부위에 결합하며, 구체적으로 인간 알파-시누클레인 단백질은 서열번호 126의 아미노산 서열에서， C-말단 영역, 예를 들면 110번 잔기 내지 120번 잔기 또는 111번 잔기 내지 122번 잔기를 포함하는 연속하는 적어도 11개 또는 12개 아미노산으로 구성된 펩타이드를 포함하는 C-말단 영역일 수 있다. 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원결합단편은， 상기 항원인식부위를 인식하여 알파-시누클레인 응집체에 대한 높은 친화도로 결합하는것이 확인되었다.

본 명세서에서 "친화성 또는 친화도 (af f inity 는 항체 또는 이의 항원 결합단편과 항원 사이의 상호작용의 강도이며， 항체 또는 항원결합 단편의 抑 R 서열， 및/또는 항체 또는 항원결합 단편의 물리화학적 특성 (친수성/소수성， 정전기적 특성 등) , 항원의 크기， 모양, 및/또는 전하와 같은 항원의 특징 등에 의해 결정될 수 있다. 이러한 친화도를 결정하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 통상적으로 해리 상수 (di ssociat ion constant , KD)로나타낼수있으나， 이에 제한되는것은아니다.

본 명세서에서, "알파-시누클레인 단백질 또는 알파-시누클레인 응집체에 특이적 결합한다"함은 알파-시누클레인단백질 또는 알파- 시누클레인응집체에 대한 친화도가 다른 항원과 비교하여 상대적으로 높은 것을 의미하는 것으로, 예컨대， 알파-시누클레인 응집체， 구체적으로， 아밀로이드 피브릴 (amyloid f ibri ls) , 프로토피브릴 (protof ibr i Is) 및 올리고머 (ol igomers) , 특히 아밀로이드 피브릴에 대해 친화도가 Octet 및 SPR분석에서 각각 0.1 x 10’ M 내지 2 x 10’ M, 또는 0.05 x 10 ¹⁰ M 내지 0.3x1(厂 ⁹ M이나, 이에 제한되는것은아니다.

본 발명의 일예에 따른 경쇄 및 중쇄를 포함하는 인간화 알파- 시누클레인 항체， 예를 들면 HullFll_(ver .l) , HullFlKver .2) , 및 HullFll_ABL2-4의 경우， 키메릭 알파-시누클레인항체에 비하여 높은식세포 작용 촉진 활성을 나타낸다. HullFlKver .1) , HullFlKver .2) , HullFlKver .3) , HullFlKver .4) , ABL2-4의 경우, 키메릭 알파-시누클레인 항체에 비하여 피브릴의 신경세포막 결합에 대한 높은 억제능을 보이며, HullFlKver .2) , HullFlKver .4) , ABL2-4의 경우， 키메릭 알파-시누클레인 항체 대비, 알파-시누클레인 과발현 세포로부터 분비된 알파-시누클레인의 다른 신경세포로의 전파에 대한 높은 억제능을 나타낸다. 알파- 시누클레인응집체에 대한 결합력, 예를 들면 cel l -based assay에서는 측정한결합력은키메릭 알파-시누클레인 항체와유사하거나우수한활성을 갖는다.

본 발명에 따른 알파-시누클레인 항체는 적용 대상 (subj ect)의 신경계에서 신경세포 밖으로 분비된 알파-시누클레인 응집체가 세포 외 공간 (extracel lular space)에서 다른 정상 세포로 이동하여 해당 신경세포를 일종의 감염시키는 작용을 억제하며 ( inhibi t cel l_to_cel l transmi ssion of aggregates) , 또한， 미세교세포가 세포 외 공간에 위치하는 알파-시누클레인 응집체에 대한 식세포 작용 촉진능을 가진다. 알파-시누클레인응집체는프리온처럼 한세포에서 다른세포로 전파되면서 해당 정상 세포 내에도 알파-사누클레인， 특히 알파-시누클레인 응집체가 뇌 전반으로 퍼져나가면서 시누클레인병을 초래한다. 따라서， 알파- 시누클레인 응집체는 뇌 신경세포에 독성이 있으며， 뇌 신경세포 사멸 (neurodegenerat ion) , 뇌염증 반응 (neuroinf lammation)을 일으키는 것으로 잘 알려져있다. 따라서 알파-시누클레인 응집체가 뇌의 여러 부위에 퍼져나가면서 뇌세포 사멸과 뇌염증 반응이 증가할 것이며， 이로 인하여 시누클레인병， 예를들면 파킨슨병이 진행되면서 확인되는뇌세포사멸 및 이로인한행동, 인지 기능의 장애가나타난다.

이에, 본 발명의 알파-시누클레인 항체는 알파-시누클레인 또는 알파-시누클레인 응집체의 신경세포간 이동을 억제하여 알파-시누클레인 응집체가뇌의 다양한영역으로퍼져나가는현상을방지할수 있으며， 또한， 미세교세포의 식세포 작용을 촉진하여, 대상 신경계에서 신경세포 외부에 존재하는 알파-시누클레인 응집체 자체의 감소 또는 제거를 통해 시누클레인병의 중요한원인인 알파-시누클레인응집체의 수준을감소시켜， 뇌 신경세포 사멸 및 뇌 염증 반응을 줄이고 나아가서 시누클레인병， 예컨대 파킨슨병의 증상및 병의 진행을개선， 경감또는예방하는효과를 기대할수있다.

또한， 본발명에 따른 알파-시누클레인 항체는 (i ) 알파-시누클레인 또는 알파-시누클레인 응집체의 신경세포간 이동을 억제, 및 (i i ) 미세교세포의 식세포 작용을 촉진을 통한 뇌 신경계의 알파-시누클레인 응집체의 수준 감소와 관련하여 두 가지 기능을 모두 수행할 수 있는 2019/098763 1»（：1^1{2018/014123

점에서 우수한 활성을 가진다 （본원 ₀₆ 11-5 ₈₃₆ （1 ₃₃₃ 크 결과 참고）. 특히， 현재까지 임상 시험이 진행중이거나 논문에 공개된 알파-시누클레인 항체들은 상기 （0 및 （ ） 활성 중에서 한 가지 활성을 가지므로, 이는 본원의 알파-시누클레인 항체는 알려진 알파-시누클레인 항체에 비해 우수한시누클레인병의 예방또는치료에 장점이 있음을나타낸다. 따라서， 본원 발명에 따른 알파-시누클레인 항체는 알파-시누클레인 응집체의 제거 및 감소와 , 병인으로서의 작용을 억제하는 효능이 더욱 우수하고， 따라서 시누클레인병 또는 이와 관련한 증상적 질병 （예， 인지 장애 등）에 더욱 효과적이다.

알파-시누클레인 응집체에 대한 높은 친화도를 갖는 본원에 따른 항체 또는 항원 결합 단편은 알파-시누클레인 응집체 형성을 감소시킬 수 있어 뇌의 응집체의 농도를낮출수 있다. 또한 알파-시누클레인 응집체에 대한 높은 친화도를 갖는 본원에 따른 항체 또는 항원 결합 단편은 중추신경계 바깥에서의 알파-시누클레인 응집체 형성을 감소시킬 수 있어, 결국 뇌혈관장벽을 경계로한 알파-시누클레인 형태들 간의 평형상태를 변경시켜, 중추신경계 내의 응집체의 농도를낮추는효과를가져올수 있다. 이는 항체를， 예를 들면 이로 제한하는 것은 아니나, 보다 간편한 피하주사와 같은 방식으로 투여해도 충분한 효능을 얻을 수 있기 때문에, 임상에서 큰 장점이 있다. 나아가 알파-시누클레인 응집체에 대한 높은 친화도를 갖는 본원에 따른 항체 또는 항원 결합 단편은 알파-시누클레인 응집체 형성 및/또는 축적 및/또는 세포가 전달을 억제 및/또는 감소시킬 수 있어 뇌에서 응집체의 농도를 낮출 수 있다. 또한 알파-시누클레인 응집체에 대한 높은 친화도를 갖는 본원에 따른 항체 또는 항원 결합 단편은중추신경계 바깥에서의 알파-시누클레인응집체 형성을감소시킬수 있어, 결국 뇌혈관장벽을 경계로 한 알파-시누클레인 형태들 간의 평형상태를 변경시켜， 중추신경계 내의 응집체의 농도를 낮추는 효과를 가져올 수 있다. 또한 본 이론으로 한정하는 것은 아니나， 본원에 따른 항체 또는항원 결합단편은단량체의 제거를통한응집체 형성 억제， 또는 단량체와응집체를모두제거할수있다.

본 명세서에서 제공되는 알파-시누클레인 단백질 또는 알파- 시누클레인 응집체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원결합단편은 자연적으로 생산된 것이 아닐 수 있다 （ ₁₁ 이 _{1-11 103} 11 ₀₀₁₁₁ ^ ₁ 塔; 예컨대， 2019/098763 1»（：1^1{2018/014123

화학적 합성 또는재조합적으로생산된 것일수 있다）. 상기와같은재조합 기술은당해 기술분야에 널리 공지되어 있다 .

본 명세서에서 "항체’는 임의의 아이소타입의 온전한면역글로불린， 또는 표적 항원에의 결합을 위해 완전한 항체와 경쟁을 할 수 있는 항원 5 결합 단편을 의미한다. 예를 들면, 키메라, 인간화， 완전 인간 또는 이중특이적 항체 또는 이들의 항원 결합 단편을 포함한다 _. 항체는 그 자체로 항원 결합 단백질의 일종이기도 하다. 완전한 항체는 일반적으로 적어도 2개의 전장 중쇄와 2개의 전장 경쇄를 포함하지만, 일부 경우에 항체가단지 중쇄만을포함할수도있다.

10 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 오직 단일 원（30111X6）으로부터 유래될수 있거나, 또는키메라일수 있다, 키메라항체는 2종류의 상이한 항체로부터 유래된 부분을 포함하며， 아래 보다 상세하게 기술된다. 항체

1 ₅ 없다면， 본원에서 용어 항체는 2개의 전장 중쇄와 2개의 전장 경쇄를 포함하는 항체는 물론， 이들의 유도체， 변이체， 단편， 및 돌연변이체를 포함하고， 이들의 예는아래 기술된바바와같다.

일구현예에서, 항체는모노클로날항체， 이중특이적 항체, 미니바디, 도메인 항체， 항체 모방체 （또는 합성 항체）， 키메라 항체, 인간화 항체， 2 ₀ 인간 항체， 항체 융합체（또는 항체 접합체）， 및 이의 단편을 포함하나, 이에 국한되지 않으며 본원에 개시된 다양한 형태의 항체를 포함한다. 일

2 ₅ 분자일수있다.

본원에서 ”경쇄’는 항원 또는 에피토프에 대한 결합 특이성을 제공하기에 충분한 가변영역 서열을 갖는 전장의 경쇄 및 이의 단편을 포함한다. 전장 경쇄는 가변영역 도메인 I， 및 불변영역 도메인 比 을 포함한다. 경쇄의 가변영역 도메인은 경쇄 폴리펩타이드의 아미노 말단에 ₃₀ 존재한다. 경쇄의 종류에는카파및 람다사슬이 포함된다. 본원에서 '’중쇄’는 항원 또는 에피토프에 대한 결합 특이성을 제공하기에 충분한 가변영역 서열을 갖는 전장 중쇄 및 이의 단편을 포함한다. 전장중쇄는가변영역 도메인 VH및 3개의 불변영역 도메인 CH1, CH2 및 抑3을 포함한다. VH 도메인은 중쇄 폴리펩타이드의 아미노 말단에 존재하고， CH도메인은카복시 말단에 존재하며， CH3가카복시-말단에 가장 가깝게 위치한다. 중쇄는 IgG（IgGl, IgG2, IgG3및 IgG4서브타입 포함）， IgA（IgAl및 IgA2서브타입 포함）， IgM및 IgE의 아이소타입을포함한다. 본 명세서에 기재된 ”항원 결합 단편’은 항원에 대한 특이적 결합능을 갖는 항체의 일부 또는 이를 포함하는 폴리펩타이드를 의미한다. 예컨대, 항원결합단편은 항원（예컨대， 에피토프）과 상호작용하여， 항체에 항원에 대한특이성 및/또는 친화성을부여하는 아미노산 잔기를 포함하는 항체의 일부 또는 이를 포함하는 폴리펩타이드일 수 있다. 이러한 항원결합단편은 전형적으로， 하나 이상의 ’’상보성 결정 부위"（Comp l ement ary Determini ng Regi on , or CDR）을 포함할 수 있으며, 여기에 더하여， 하나이상의 ”프레임워크” 영역을포함할수 있다. CDR은 항체의 항원 결합의 특이성과 친화성에 기여하는 아미노산 서열이고， 프레임워크 영역은 이들 CDR 의 적절한 형태（conformat i on）를 유지하는데 기여하는 아미노산 서열 부위로， 항원 결합 영역과 항원 사이에 결합을 촉진할수있다.

본원에 사용된, 항체 또는면역글로불린의 사슬 （중쇄 또는 경쇄）의 "항원 결합 단편”은 전장사슬과 비교하여 일부 아미노산이 결여되었지만, 항원에 특이적으로 결합할수 있는항체의 일부를포함하는것이다. 이러한 단편은표적 항원에 특이적으로결합할수 있고, 또는다른항체 또는항원 결합 단편과 특정 에피토프에 결합하기 위해 경쟁할 수 있다는 측면에서 생물학적으로활성이 있다고할수 있다. 한양태에서， 이러한단편은전장 경쇄 또는 중쇄 내에 존재하는 적어도 하나의 CDR 을 포함하고， 일부 구현예에서， 단쇄 중쇄 및/또는 경쇄， 또는 이의 일부를포함한다. 이러한 생물학적 활성 단편은재조합 DNA기술에 의해 생산되거나, 또는예를들면 온전한항체를효소적 또는화학적 절단하여 생산될수 있다. 면역학적으로 기능적인 면역글로불린 단편에는 이로 제한하는 것은 아니나， Fab, Fab' , F（ab'）2, Fv, 도메인 항체 및 단쇄 항체 （예컨대, scFv, scFv-Fc 등）를 포함한다. 또한이로제한하는것은아니나， 인간, 마우스， 랫트， 카멜리드 또는 토끼를 포함하는 임의의 포유동물에서 유래될 수 있다. 본 명세서에 개시된하나이상의 CDR과같은항체의 기능적인부분은제 2의 단백질또는 2019/098763 1»（：1^1{2018/014123

저분자화합물과공유결합으로연결되어 특정 표적에 대한표적 치료제로서 사용될수있다.

본원에서 ’’此단편”은 1개의 경쇄와抑 1및 가변영역만을포함하는 1개 중쇄로 구성된다. 분자의 중쇄는 다른 중쇄 분자와 디설파이드 결합을형성할수없다.

본원에서 "比" 영역은 항체의 期 2 및 抑 3 도메인을 포함하는 중쇄 단편을두분자포함한다. 이들 2개의 중쇄 단편은 2개 이상의 디설파이드 결합및抑 3도메인의 소수성 상호작용에 의해서로결합되어 있다.

본원에서 ’’油’ 단편”은 北단편에 중쇄의 (11과抑 2도메인사이에 존재하는 영역을 추가로 포함하여, 두 분자의 油’ 단편의 두 개의 중쇄사이에서 사슬간 다이설파이드 결합이 형성되어, 北’)2 분자를 형성할수있다.

본원에서 " ' )2단편"은 앞서 기술한바와같이， 2개의 경쇄, 및 가변영역， 대1과 抑 1과 抑 2 도메인 사이에 불변영역의 일부를 포함하는 중쇄 2 분자를 포함하여， 2 분자의 중쇄 사이에서 사슬간 다이설파이드 결합이 형성된다. 따라서， 北’)2 단편은 2개의 北' 단편으로 구성되며， 상기 두 개의 此’ 단편은 이들 간의 다이설파이드 결합에 의해 서로

불변영역은포함하지 않는항체이다. 본원에서 "단쇄 항체’’는 중쇄 및 경쇄 가변영역이 유연한 링커에 의해 연결된 항원 결합 영역의 단일 폴리펩타이드사슬이다. 예컨대, 상기 단쇄 항체는 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역이 단일 사슬 형태로 연결된 중쇄가변영역 , 경쇄가변영역 , 및 ¾가단일사슬형태로연결된 등으로이루어진군에서 선택된 1종이상일수 있다. 단쇄 항체는예를 들면미국특허 제 5, 260, 203호를참조할수있다. 본원에서 ’’2가의 항원 결합 단백질 ¹ ’ 또는 "2가 항체 ¹ ’는 2개의 항원 결합부위를포함한다. 이러한 2가항체에 포함된 2개의 항원 결합부위는 동일한 항원 특이성을 갖거나， 또는 각각 상이한 항원에 결합하는 이중특이적 항체일 수 있다. 본원에서 "다중 특이적 항원 결합 단백질’’ 또는 "다중 특이적 항체"는 두 개 이상의 항원 또는 에피토프를 표적으로 하는것이다. 본원에서 _" 이특이적， _{" "} 이중특이적” 항원 결합단백질 또는항체는 2개의 상이한 항원 결합 부위를 갖는 하이브리드 항원 결합 단백질 또는 항체이다. 이러한 이특이적 항체는 다중 특이적 항원 결합 단백질 또는 다중 특이적 항체의 일종으로, 공지된 다양한 방법 예를 들면 하이브리도마의 융합또는 Fab ¹ 단편의 연결에 의해 생산될수있다.

본원에서 _" 이특이적，” _" 이중특이적 _" 항원 결합단백질 또는항체는 2개의 상이한 항원 결합 부위를 갖는 하이브리드 항원 결합 단백질 또는 항체이다. 이러한 이특이적 항체는 다중 특이적 항원 결합 단백질 또는 다중 특이적 항체의 일종으로， 공지된 다양한 방법 예를 들면 하이브리도마의 융합또는 Fab 단편혹은 scFv단편의 연결에 의해생산될 수 있다. 예를들면 , Songsivi lai and Lachmann , Cl in. Exp. Immunol . 1990, 79:315-321; Kostelny et al . J . Immunol . 1992, 148: 1547-1553 등을 참조할수 있다. 이특이적 항원 결합단백질 또는항체의 2개의 항원 결합 부위가 결합하는 2개의 서로 상이한 에피토프는 동일 또는 상이한 단백질 표적에 위치할 수 있다. 본원에 따른 일구현예에서 본원에 따른 항체는 혈관뇌장벽을 통과하여 전달되기 위해 전달체에 대한 결합을 추가로 포함하는 이중특이적 항체의 형태를 취할 수 있다. 혈관뇌장벽을 통하여 약물을전달하기 위한한가지 방법은세포에 내재된글루코스및 아미노산 전달체， 인슐린 또는 트랜스페린의 수용체 매개 트랜스사이토시스와 같은 전달시스템의 사용을포함한다. 본원에서 ’’컨쥬게이트"는 본원에 개시된 항체 또는 그 항원결합 단편과 다른 분자, 특히 후술하는 혈관뇌장벽 전달체 또는 치료제와의 키메라 분자를 일컫는 것이다. 컨쥬게이트에서 본원에 따른 항체 또는 그 항원결합 단편은 다른 분자와 예를 들면 공유결합 또는 반데스발스 또는 소수성상호작용에 의한 물리적 힘， 캡슐화， 매립화 (embedding) 또는 상기 조합을 포함하는 방법에 의해 물리적으로 결합된다. 일 구현예에 따른 컨쥬게이트에서 본원에 따른 항체 또는 그 항원결합 단편은 펩타이드 링커를통해 연결될수있다.

본원은 또한 본원에 개시된 하나 이상의 아미노산서열과 실질적인 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 아미노산 서열을 포함한다. 실질적 동일성이란 본원은 서열변이가 존재하는 본원에 개시된 효과를 유지하는 것을의미한다. 일 구현예에서 개시된 중쇄 가변영역과 약 90%， 95%, 또는 2019/098763 1»（：1^1{2018/014123

99% 동일성을 가진다. 다른 구현예에서 개시된 경쇄 가변영역과 약 90%, 95%, 또는 99%동일성을가진다. 예를들면 본원에 개시된 항체 또는항원 결합단편의 서열과 90%, 95%, 또는 99%동일성을나타내는 변이체의 경우， 임의의 변이는 보다는가변영역의 골격에서 발생된다.

본 발명에 따른 알파-시누클레인 또는 이의 응집체에 특이적으로 결합하는항체 또는그항원 결합단편은， 00^1, 00^2및 00애3의 상보성 결정부위를 포함하는 중쇄 가변영역; 및 001^1, 001^2 및 00 3의 상보성 결정부위를포함하는경쇄가변영역을포함할수 있다.

일 구체예에서, 상기 항- 알파-시누클레인 항체 또는 이의 항원결합단 서열을포함할수있다:

서열번호 1 및 서열번호 6의 아미노산서열중에서 하나를 포함하는 중쇄 0 1 0 抑 ）,

서열번호 2 내지 4 및 서열번호 7 내지 8의 아미노산 서열중에서 하나를포함하는중쇄抑요2 01 2） ,

서열번호 5및 서열번호 9의 아미노산서열중에서 하나를중쇄 0대?3

（ ），

서열번호 10및서열번호 13의 아미노산서열중에서 하나를포함하는 경쇄抑 （1^： 1）,

서열번호 11및서열번호 14의 아미노산서열중에서 하나를포함하는 경쇄 0 2 （1^迎?2）, 및

서열번호 12및서열번호 15의 아미노산서열중에서 하나를포함하는 경쇄 0 3（1 _/ ᅳ抑 1?3）.

상기 중쇄◦ 내지 0 3의 아미노산서열과

아미노산서열을표 1및표 2에 정리하였다:

[표 1] 중쇄 0 1내지 0 3의 아미노산서열

2019/098763 1»(：1^1{2018/014123

일 구체예에서， 상기 항- 알파-시누클레인 항체 또는 이의 항원결합단편은, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 抑財 01- 0에1) , 서열번호 2 내지 4의 아미노산 서열중에서 하나를 포함하는 중쇄 抑묘2 0｛ 2)， 및 서열번호 5의 아미노산서열을포함하는중쇄 0 3 01 0 3)을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 10의 아미노산 서열을 2019/098763 1»（：1^1{2018/014123

포함하는 경쇄 0예1 （1 1?1）, 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 抑 1?2 此 2）, 및 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 0에3（ 3）을포함하는경쇄가변영역을포함할수있다.

또한, 상기 항- 알파-시누클레인 항체 또는 이의 항원결합단편은， 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 0볘1 0{-抑財）， 서열번호 7 내지 8의 아미노산 서열중에서 하나를 포함하는 중쇄 抑요2 01 대?2）, 및 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 0볘3 0«： 3）을 포함하는

포함하는경쇄 가변영역을포함할수있다.

다른 구체예에서， 상기 항- 알파-시누클레인 항체 또는 이의

서열번호 16 내지 17 및 서열번호 35 내지 40의 아미노산 서열중에서 하나를포함하는폴리펩타이드단편을포함,

}{ 1과 «- 0 2 사이에 위치하는 중쇄가변영역 프레임워크 어- 1썽）로서， 서열번호 18 내지 19 및 서열번호 41 내지 44의 아미노산 서열중에서 하나를포함하는폴리펩타이드단편을포함,

표 에2와 {{ 대切 사이에 위치하는 중쇄가변영역 프레임워크 요3）로서， 서열번호 20 내지 31 및 서열번호 45 내지 50의 아미노산 서열중에서 하나를포함하는폴리펩타이드단편을포함，

}«1供3의 0말단에 위치하는 중쇄가변영역 프레임워크 （1«¾4）로서, 서열번호 32 내지 34 및 서열번호 51 내지 52의 아미노산 서열중에서 하나를포함하는폴리펩타이드단편을포함,

抑財의 I말단쪽에 위치하는중쇄가변영역 프레임워크 0^¾1）로서， 서열번호 53 내지 58 및 서열번호 71 내지 77의 아미노산 서열중에서

묘2）로서， 서열번호 59 내지 61 및 서열번호 78 내지 81의 아미노산 서열중에서 하나를포함하는폴리펩타이드단편을포함， 2019/098763 1»(：1^1{2018/014123

[-◦에2와 느 예3 사이에 위치하는 중쇄가변영역 프레임워크 （ 1?3）로서， 서열번호 62 내지 67 및 서열번호 82 내지 88의 아미노산 서열중에서 하나를포함하는폴리펩타이드단편을포함, 및/또는

0예3의 0말단에 위치하는 중쇄가변영역 프레임워크 （1^¾4）로서， 서열번호 68 내지 70 및 서열번호 89의 아미노산 서열중에서 하나를 포함하는폴리펩타이드단편을포함하는것일수 있다.

본 명세서에서 프레임워크로 사용 가능한 아미노산 서열로서， 중쇄가변영역 프레임워크서열을표 3및 표 4에， 경쇄가변영역 프레임워크 및표 5및표 6에 예시하였다.

[표 3] 중쇄프레임워크 1내지 2의 아미노산서열

2019/098763 1»（：1/10公018/014123

[표 4]중쇄프레임워크 3내지 4의 아미노산서열

2019/098763 1»(：1/10公018/014123

［표 5］ 경쇄프레임워크 1내지 2의 아미노산서열

2019/098763 1»（：1/10公018/014123

［표 6］ 경쇄프레임워크 3내지 4의 아미노산서열

2019/098763 1 ^» （：1^1{2018/014123

다른 구체예에서， 상기 항- 알파-시누클레인 항체 또는 이의 항원결합단편은， 서열번호 1 및 서열번호 6의 아미노산서열중에서 하나를 포함하는 01 01?1）， 서열번호 2내지 4및 서열번호 7내지 8의 아미노산서열중에서 하나를 포함하는중쇄 0 2 01 에2）, 서열번호 5 및 서열번호 9의 아미노산 서열중에서 하나를 중쇄 0 3 어 3） 포함하는 중쇄 가변영역을포함할수있으며 ,

상기 중쇄가변영역은서열번호 16내지 17및서열번호 35내지 40의 아미노산 서열중에서 하나를 포함하는 중쇄가변영역 프레임워크 어 ）, 서열번호 20 내지 31 및 서열번호 45 내지 50의 아미노산 서열중에서 하나를 포함하는 중쇄가변영역 프레임워크 어 1?2）， 서열번호 20 내지 31 및 서열번호 45 내지 50의 아미노산 서열중에서 하나를 포함하는 중쇄가변영역 프레임워크어냉요3）, 및 서열번호 32내지 34및 서열번호 51 내지 52의 아미노산서열중에서 하나를 포함하는 중쇄가변영역 프레임워크 （1«¾4）를 포함할 수 있다. 더욱 자세하게는， 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 서열번호 29 내지 31의 아미노산 서열중에서 하나를 포함하는 1«¾3， 및 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 요4을포함할수있다.

또한, 상기 항- 알파-시누클레인 항체 또는 이의 항원결합단편은, 서열번호 10 및 서열번호 13의 아미노산서열중에서 하나를포함하는 경쇄 0에1 此 예1）， 서열번호 11및 서열번호 14의 아미노산서열중에서 하나를 포함하는 및 서열번호 12및서열번호 15의 아미노산 2019/098763 1»（：1^1{2018/014123

서열중에서 하나를 포함하는 경쇄 0 3 （I - 0 3）을 포함하는 경쇄 가변 영역을포함할수있으며，

상기 경쇄가변영역은 추가로 서열번호 53 내지 58 및 서열번호 71 내지 77의 아미노산서열중에서 하나를 포함하는 경쇄가변영역 프레임워크 （1^¾1）， 서열번호 59 내지 61 및 서열번호 78 내지 81의 아미노산 서열중에서 하나를 포함하는 경쇄가변영역 프레임워크 （1^¾2）， 서열번호 62 내지 67 및 서열번호 82 내지 88의 아미노산 서열중에서 하나를 포함하는 경쇄가변영역 프레임워크 （丄 묘3）， 및 서열번호 68 내지 70 및 서열번호 89의 아미노산 서열중에서 하나를 포함하는 경쇄가변영역 프레임워크 （1 ¾4）를 포함할 수 있다. 더욱 자세하게는, 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 58의 아미노산 서열을 포함하는 1^¾1， 서열번호 59의 아미노산서열을포함하는 1^2, 서열번호 67의 아미노산서열을포함하는 1거¾3， 및서열번호 34의 아미노산을포함하는 포함할수있다. 다만， 본 발명에 따른 항- 알파-시누클레인 항체 또는 이의 항원결합단편은， 서열번호 1, 2 및 5의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 0 1 - 0 3와서열번호 10， 11, 및 12의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 0 1 - 0 3를 포함하고, 서열번호 16, 18, 20 및 32의 아미노산 서열로 이루어지는 53, 59, 62 및 68의 아미노산서열로 이루어지는 경쇄 갖는 마우스 항체 또는 키메릭 항체 또는 이의 항원결합단편을 포함하지 않는다. 또한, 본 발명에 따른 항- 알파- 시누클레인 항체 또는 이의 항원결합단편은, 서열번호 6, 7 및 9의 아미노산서열로 이루어지는 중쇄 0 1 - 0예3와 서열번호 13, 14, 및 15의 아미노산서열로이루어지는경쇄 0 1 - 0예3를포함하고， 서열번호 35， 41， 45및 51의 아미노산서열로 이루어지는중쇄 1?1내1?4와서열번호 71, 78, 82 및 89의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 갖는 마우스 항체 또는 키메릭 항체 또는 이의 항원결합단편을 포함하지 않는다. 구체적인 예로서, 서열번호 90의 중쇄 가변영역 서열（（土1 11 - 과 서열번호 109의 경쇄 가변영역 서열 （此1 11 - 1）을 포함하는 항체 또는 서열번호 102의 중쇄 가변영역 서열（此1 11 - ）과 서열번호 116의 경쇄 가변영역 서열 （此1 11 -孔）을 포함하는 0 ₁₃ 요9 항체는 본 발명에 따른 항 알파-시누클레인항체에 포함되지 않는다. 2019/098763 1»（：1^1{2018/014123

본 발명의 구체적인 일예에 따른 항- 알파-시누클레인 항체 또는 이의 항원결합단편은， 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 抑 대 ）， 서열번호 2내지 4의 아미노산서열중에서 하나를포함하는중쇄 0 2 01 에2）， 및 서열번호 5의 아미노산서열을포함하는중쇄 0에3 01- 0 3）을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 0 1 （ 1）， 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 0 2 比 에2）， 및 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 포함하는경쇄 가변영역을포함할수있으며，

상기 중쇄가변영역은 서열번호 16 내지 17의 아미노산 서열중에서 하나를포함하는중쇄가변영역 프레임워크 어 ）， 서열번호 18내지 19의 아미노산 서열중에서 하나를 포함하는 중쇄가변영역 프레임워크 서열번호 20내지 31의 아미노산서열중에서 하나를포함하는중쇄가변영역 프레임워크 어 1«）， 및 서열번호 32 내지 34의 아미노산 서열중에서 하나를포함하는중쇄가변영역 프레임워크（｝«¾4）를포함하고,

상기 경쇄가변영역은 서열번호 53 내지 58의 아미노산 서열중에서 하나를포함하는경쇄가변영역 프레임워크 （1^¾1）， 서열번호 59내지 61의 아미노산 서열중에서 하나를 포함하는 경쇄가변영역 프레임워크 （1^¾2）， 서열번호 62내지 67의 아미노산서열중에서 하나를포함하는경쇄가변영역 프레임워크 （1내묘3）， 및 서열번호 68 내지 70의 아미노산 서열중에서 하나를포함하는경쇄가변영역 프레임워크 0^¾4）를포함할수있다.

바람직하게는， 본발명의 구체적인 일예에 따른항-알파-시누클레인 항체 또는 이의 항원결합단편은 서열번호 1， 서열번호 2 및 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 0 1 내지 0 3을 포함하는 중쇄 가변영역과, 서열번호 10， 서열번호 11 및 서열번호 12의 아미노산서열을 포함하는경쇄 001^1내지 0 3을포함하는경쇄 가변영역을포함하며, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 서열번호 29 내지 31의 아미노산 서열중에서 하나를 포함하는 1«¾3, 및 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 포함할 수 있으며， 상기 경쇄 가변 영역은, 서열번호 58의 아미노산 서열을 포함하는 1^¾1， 서열번호 59의 아미노산 서열을포함하는 서열번호 67의 아미노산서열을포함하는 1 ¾3， 및 서열번호 34의 아미노산서열을포함하는 포함할수있다. 본 발명의 구체적인 일예에 따른 항- 알파-시누클레인 항체 또는 이의 항원결합단편은， 서열번호 6의 아미노산서열을 포함하는 중쇄 CDR1 (H-抑R1) , 서열번호 7내지 8의 아미노산서열중에서 하나를포함하는중쇄 CDR2 (H-CDR2) , 및 서열번호 9의 아미노산서열을포함하는중쇄 CDR3 (H- CDR3)을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 抑R1 (L-CDR1) , 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 抑R2 (L-CDR2) , 및 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3 (L-CDR3)을포함하는경쇄가변영역을포함할수있� ��며，

상기 중쇄가변영역은 서열번호 35 내지 40의 아미노산 서열중에서 하나를포함하는중쇄가변영역 프레임워크 (H-FR1) , 서열번호 41내지 44의 아미노산 서열중에서 하나를 포함하는 중쇄가변영역 프레임워크 (H-FR2) , 서열번호 45내지 50의 아미노산서열중에서 하나를포함하는중쇄가변영역 프레임워크 (H-FR3) , 및 서열번호 51 내지 53의 아미노산 서열중에서 하나를포함하는중쇄가변영역 프레임워크 (H-FR4)를포함하고，

상기 경쇄가변영역은 서열번호 71 내지 77의 아미노산 서열중에서 하나를포함하는경쇄가변영역 프레임워크 (L-FR1) , 서열번호 78내지 81의 아미노산 서열중에서 하나를 포함하는 경쇄가변영역 프레임워크 (L-FR2) , 서열번호 82내지 88의 아미노산서열중에서 하나를포함하는경쇄가변영역 프레임워크 (L-FR3) , 및 서열번호 89의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역 프레임워크 (L-FR4)를포함할수있다.

전장의 경쇄 및 중쇄에서, 가변영역 및 불변영역은 약 12개 이상의 아미노산 길이인 "J” 영역에 의해 결합되고, 중쇄는 또한 약 10개 이상의 아미노산의 "D" 영역을포함한다. 예를들면, Fundamental Immunology, 2nd ed. , Ch. 7 (Paul , ff . , ed. ) 1989, New York： Raven Press를 참조할 수 있다. 전형적으로 항체의 경쇄/중쇄 쌍의 가변영역이 항원 결합 부위를 형성한다. 면역글로불린사슬의 가변영역은일반적으로잔체적 구조가동일하며 , "상보적 결정부위 또는 영역 또는 도메인’’ 또는 CDR로 지칭되는 3 개의 초가변영역에 의해 이어지는 비교적 보존된 프레임워크 영역 (FR)을 포함한다. 중쇄/경쇄 쌍을 구성하는 각 사슬 유래의 가변영역의 CDR 은 전형적으로 프레임워크 영역에 의해 정렬되어 표적 단백질 (알파- 시누클레인)의 특정 에피토프와 특이적으로 결합하는 구조를 형성한다. 자연 발생 경쇄 및 중쇄 가변영역의 이러한 요소는 N-말단으로부터 C- 말단까지 전형적으로 다음 순서로 포함된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4. 가변영역에서 이들각각에 해당하는 아미노산서열의 위치는 Kabat 넘버링 시스템 (Rabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (1987 and 1991, NIH, Bethesda, MD) , 또는 Chothia & Lesk, 1987, J . Mol . Biol . 196:901-917; Chothi a et al . , 1989, Nature

342: 878-883에 기재된것을따른다. 본명세서에 개시된다양한중쇄 및 경쇄 가변영역은표 7및표 8에 개시된다. 이러한각각의 가변영역은온전한항체의 각각의 중쇄 및 경쇄를 형성하기 위해 상기 중쇄 및 경쇄 불변영역에 결합될 수 있다. 또한, 이렇게 생성된 각각의 중쇄 및 경쇄 서열은 또한 완전한 항체 구조를 형성하기 위해 조합될 수 있다. 예를 들면， 본 발명에 따른 항- 알파- 시누클레인 항체 또는 이의 항원결합단편은， 서열번호 90 내지 101 또는 서열번호 102 내지 108의 아미노산 서열중에서 하나의 중쇄 가변 영역과, 서열번호 109내지 115또는서열번호 116내지 123의 아미노산서열중에서 하나의 경쇄 가변 영역을 포함하며, 더욱 자세하게는 서열번호 90 내지 101의 아미노산 서열중에서 하나의 중쇄 가변 영역과 서열번호 109 내지 115의 아미노산서열중에서 하나의 경쇄 가변 영역을포함하거나, 서열번호 102 내지 108의 아미노산 서열중에서 하나의 중쇄 가변 영역과 서열번호 116 내지 123의 아미노산서열중에서 하나의 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 본발명의 구체적인 일예에서， 항-알파-시누클레인 항체 또는 이의 항원결합단편은서열번호 98 내지 1()1의 아미노산서열중에서 하나의 중쇄 가변영역과, 서열번호 115의 아미노산 서열의 경쇄 가변영역을 포함할 수 있거나 (예, HullFllJver . l) , HullFllJver .2) , HullFllJver .3)， HullFll_(ver .4) , 등) 또는 서열번호 92의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역과서열번호 113의 아미노산서열을 갖는 경쇄 가변영역을 포함할 수있다 (예, HullFll_(ABL2-4)항체) . 다만， 상기 항- 알파-시누클레인 항체 또는 이의 항원결합단편은， 서열번호 90의 중쇄 가변영역 및 서열번호 109의 경쇄가변영역으로 이루어지는 것 및 서열번호 102의 중쇄 가변영역 및 서열번호 116의 경쇄가변영역으로이루어지는것은제외된다. 일 구현예에 따른 항체 또는 항원 결합 단편의 중쇄 가변영역 및 경쇄가변영역의 아미노산서열을표 7및표 8에 예시하였다. [표 7]중쇄 가변영역

2019/098763 1»（：1/10公018/014123

[표 8] 경쇄가변영역

2019/098763 1»（：1^1{2018/014123

또한， 일 구현예에 따른항체 또는항원 결합단편의 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역의 조합과불변영역을포함하는， 예시적인 항체를표 9에 기재하였다.

[표 9] 2019/098763 1»（：1^1{2018/014123

본 명세서에 개시된 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역은 온전한 항체의 중쇄 및 경쇄를 형성하기 위하여, 각각 중쇄 불변영역 및 경쇄 불변영역에 결합될 수 있다. 이와 같이 생성된 각각의 중쇄 및 경쇄는 적절하게 짝지워져 중쇄-경쇄 조합을 이룰수 있고 , 상기 중쇄-경쇄 조합은 다합체를 형성 （예컨대, 1的타입 항체의 경우 이합체를 형성）하여 온전한 항체구조를이룰수있다.

상기 불변영역은 면역글로불린 （예컨대， 인간면역글로불린）의 중쇄 불변영역 및 경쇄 불변영역에서 적절히 선택될 수 있다. 예컨대, 중쇄 불변영역은 아 중쇄 불변영역， 1용3 중쇄 불변영역， 또는 중쇄 불변영역일 수 있고， 경쇄 불변영역은 카파 불변영역 또는 람다 경쇄 불변영역일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고， 항체 안정성， 제조 가능성， 항원 친화성， 및/또는 기타 목적하는 특징 등을 위하여 다른 유형의 불변영역 또는 변형된 불변영역을 적절하게 선택하여 사용할 수 있으며， 이는당업자가명확하게 알수있는사항이다. 다른구현예에서 상기 표 7및 표 8에 개시된중쇄 가변영역 및 경쇄 각 가변영역은 서로 자유롭게 조합되어 다양한 항체를 형성할 수 있고, 단일사슬형태로연결되어 항체를형성할수도있다. 본 명세서에 개시된 항체는 본 명세서에 개시된 다른 항체와 특정 영역 또는 서열을 공유한다. 일 구현예에서는 항체 또는 항원결합단편의 불변영역을공유할수있다. 다른구현예에서는 영역을공유할수있다. 일 예에서， 본 명세서에서 제공되는 항-알파-시누클레인 항체는 모노클로날항체 또는폴리클로날항체일 수 있다. 다른예에서， 상기 항- 2019/098763 1»（：1^1{2018/014123

알파-시누클레인 항체는 인간 항체, 인간화 항체， 키메라 항체, 또는 동물유래 항체일 수 있다. 다른 예에서， 상기 항-알파-시누클레인 항체는 재조합적또는화학적으로합성된것일수있다. 일 구현예에서, 본 명세서에 개시된 항체의 항원결합단편 또는항체

있다. 다른 구현예에서, 본원에 제공된 항체는 인간 항체 또는 인간화

또 다른 구현예에서, 항-알파-시누클레인 항체는 상기 기재된 경쇄 또는 중쇄만으로 이루어진 것일 수 있다. 다른 구현예에서, 항-알파- 시누클레인항체는경쇄 가변영역 또는중쇄 가변영역만으로 이루어진 것일 수있다.

00^2영역을포함하여 제조되지 않는다는것을당업자라면알것이다. 일 구현예에서, 상기 항체는모노클로날항체 또는다클론항체일 수 있다. 본 명세서에 개시된 항체는 알파-시누클레인에 결합하는 모노클로날 항체를 포함한다. 모노클로날 항체는 당해 기술 분야에 공지된 임의의 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들면， 면역화된 형질전환 동물로부터 수확된 비장 세포를 불멸화사킴으로써 생산될 수 있다. 하이브리도마 세포주에 의해 분비된 모노클로날 항체는 당해 기술 분야에 공지된기술을사용하여 정제할수있다. 다른구체예에서， 상기 항체는동물유래 항체 （예컨대， 마우스항체 등）, 키메릭 항체 （예컨대, 마우스-인간 키메릭 항체）, 인간화항체， 또는 인간 항체일 수 있다. 항체는 또한 다양한 목적을 위해 다양한 방식으로 변형될 수 있다. 키메라 및 인간화 항체가 또한 제공된다. 키메라 항체는 상이한 항체로부터 유래된 폴리펩타이드 단편들이 공유결합으로 연결되어 면역학적으로기능적인경쇄， 중쇄또는그단편을형성하는항체이다. 이러한 모노클로날 항체에서， 전형적으로 항체의 비-항원 인식 부분을구성하는특정 아미노산잔기가인간항체의 상응하는아이소타입의 상응하는 잔기와상동성이 되도록 변형된다. 인간화는， 예를 들면， 공지된 다양한방법을 이용하여， 설치류 가변영역의 적어도 일부를 인간 항체의 상응하는 영역으로 치환함으로써 수행될 수 있다 (미국 특허 제 5 ,585, 089호 및 제 5,693,762호; Jones et al . , 1986, Nature 321:522-525； Riechmann et al . , 1988, Nature 332:323-27; Verhoeyen et al . , 1988, Science

239: 1534-1536) . 완전인간항체는내인성 면역글로불린 생성이 결핍되어 인간항체를 생성할 수 있는 형질전환 동물 (통상적으로， 마우스)을 면역화시킴으로써 생성될 수 있다. 완전 인간 항체는 또한 파지-디스플레이 라이브러리 (phage-di splay l ibrary)로부터 유래될 수 있다. 완전 인간 항체를사용하면， 마우스 또는 마우스-유래된 mAb를 인간에 투여함으로써 유발될수있는면역원성 반응및 알레르기 반응을최소화할수있다. 일 구현예에서， 본원의 인간 알파-시누클레인 항체는 파지 디스플레이 방법을 통해 선별된다. 파아지 스크리닝을 통해 선별한 알파- 시누클레인 특이적인 단일클론 파이지 항체를 전체 IgG ( ful l IgG) 형태로 변환하기 위해 재조합 방법을 이용하였다. 항- 알파-시누클레인 항체의 재조합 제조을 위해 각 단일클론 파아지 항체의 서열을 확보한다. 확보한 서열에서 중쇄 가변영역 서열은 중쇄 불변영역서열에, 경쇄 가변영역 서열은 경쇄 불변영역 서열에 이식한후 코돈최적화 (codon opt imi zat ion) 방법을 통해 아미노산 서열을 핵산 서열로 변경한다. 확보한 핵산 서열을 동물세포배양용벡터에 클로닝 한후, CH0세포등의 단백질 생산용숙주 세포에 상기 벡터를 이용해 형질전환 하여， 배양한다. 상기 배양액에 포함된 항체를 정제하기 위해 친화도 크로마토그래피등의 정제 기술을 이용하여 재조합항체를분리 정제한다. 다른 구체예에서 , 상기 항체는 자연에서 발견되는 항체의 전형적인 구조를갖거나변형된구조를갖는항체일수있다 . 상기 전형적인 구조를갖는항체는서로다른두개의 폴리펩타이드 사슬 (즉 , 중쇄 및 경쇄 )을 포함하는 구조적 단위체를 포함하는 다합체 구조를가질 수 있다. 상기 서로다른두 개의 폴리펩타이드사슬은 전장 경쇄 (약 25kDa) 및 전장중쇄 (약 50내지 70kDa)를 포함할수 있다. 각 사슬은， 특징적인 접힘 패턴을 나타내며, 약 90 내지 110개 아미노산으로 이루어진， 수 개의 면역글로불린 도메인으로 구성되어 있다. 이러한 도메인은 항체 폴리펩타이드를 구성하고 있는 기본 단위체이다. 각사슬의 아미노-말단 부분은 전형적으로 항원을 인식하는 부분인 가변영역 또는 V 영역으로지칭되는부분을포함한다. 카복시-말단부분은아미노-말단보다 진화적으로 보다보존되었으며 불변영역 또는 C영역으로 지칭되는 부분을 포함한다. 인간 경쇄는 일반적으로 카파 ( _K) 및 람다 (X) 경쇄로서 분류되고， 이들 각각은 하나의 가변영역 및 하나의 불변영역을 포함한다. 중쇄는 일반적으로뮤(y), 델타U) , 감마(Y), 알파U)또는 엠실론(e) 쇄로서 분류되고, 이들은 각각 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE 이소타입으로 정의된다. IgG는 IgGl, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함하나, 이에 제한되지 않는 다수의 서브타입을 갖는다. 중쇄 불변영역은 전형적으로 효과기 기능을 나타내는 하나 이상의 도메인을포함한다. 중쇄 불변영역 도메인의 수는이소타입에 따라달라진다. IgG중쇄는， 예를들면， 각각 CHI, CH2및 期 3으로 공지된 3개의 C 영역 도메인을 포함한다. 본 명세서에 개시된 항체는 이러한 이소타입 및 서브타입 중의 임의의 하나일 수 있다. 일 구현예에서， 상기 항-알파-시누클레인 항체는 IgG이소타입， 예컨대， IgGl， IgG2또는 IgG4서브타입일수있다. 본 명세서에 개시된 항체는 또한 상기 본 명세서에 개시된 항체의 변이체이다. 예를 들면， 항원의 일부는 상기 개시된 중쇄 또는 경쇄， 가변영역 또는 CDR 서열의 하나 이상의 잔기에서 보존적 (conservative) 아미노산 치환을 포함한다. 당업자라면 공지된 기술을 사용하여 본 명세서에 개시된 폴리펩타이드의 적절한 변이체를 결정할수 있을 것이다. 당업자라면 폴리펩타이드에서 활성에 중요한 것으로 생각되지 않는 영역을 변이체의 표적으로 하여， 활성을 파괴하지 않으면서도 단백질을 변화시킬 수있는부위를찾아낼수있을것이다. 2019/098763 1»（：1^1{2018/014123

본원은 또한 본원에 개시된 항체의 유도체를 제공한다. 유도체화된 항체는 항체 또는 그 단편에 목적하는 특성, 예를 들면， 특정 용도에서 증가된 반감기를 제공하는 임의의 분자 또는 물질을 포함할 수 있다. 유도체화된 항체는， 예를 들면， 검줄가능（또는 표지화） 잔기（예: 방사성， 비색성， 항원성 또는 효소 분자， 검출가능한 비드（예: 자기 또는 전자밀도（예: 금） 비드）， 또는다른분자（예: 비오틴또는스트렙타비딘）에 결합하는 분자） , 치료적 또는 진단적 잔기（예 : 방사성， 세포독성 , 또는 약학적 활성 잔기）， 또는특별한용도（예를들면， 대상체, 예를들면， 인간 대상체에 투여， 또는 기타 생체내 또는 시험관내 사용）를 위한 항체의 적합성을증가시키는분자를포함할수있다.

다른 구현예는 항체의 영역에 알파-시누클레인 결합 단백질이 융합된 2개의 융합 단백질을 포함하는 이량체에 관한 것이다. 상기 이량체는， 예를 들면， 융합 단백질을 코딩하는 유전자 융합체를 적절한 발현 벡터 내로 삽입하고， 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포 내에서 유전자 융합체를 발현시키고， 발현된 융합 단백질이 항체 분자와 유사하게 조합할 수 있도록 함으로써 제조될 수 있고, 여기서 사슬간 디설파이드결합이 잔기사이에 형성되어 이량체가수득된다.

본원에서 사용된 용어 "此폴리펩타이드’는항체의 此 영역으로부터 유래된 폴리펩타이드로야생형 또는돌연변이 형태를포함한다. 이량체화를 촉진하는 힌지 영역을 포함하는 절단된 형태의 폴리펩타이드도 또한 포함된다. 잔기를포함하는융합단백질 및 이로부터 형성된 올리고머는 단백질쇼또는단백질 0칼럼을 이용한 친화성 크로마토그래피로 용이하게 분리할수있는장점이 있다.

다른 양태에서 본원은 또한 본원에 따른 상기 항체 또는 항원결합 단편을 코딩하는 분리된 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 다른 양태에서 본원은또한본원에 따른상기 폴리뉴클레오타이드를포함하는발현 벡터를 제공한다. 또 다른 양태에서 본원은 또한 본원에 따른 상기 발현 벡터로 형질전환된원핵또는진핵세포또는세포주를제 공한다.

또 다른 양태에서 본원은또한상기 본원에 따른 세포를상기 항체 또는 항원 결합 단편이 발현되기에 충분한 조건에서 배양하는 단계 ; 및 상기 세포주로부터 항체 또는 그 항원결합 단편을 분리하는 단계를 포함하는， 알파-시누클레인에 특이적으로 결합하는 분리된 항체 또는 그 항원결합단편의 제조방법을제공한다. 또한， 본 명세서에 개시된 항체 또는 항원 결합 단편은 다양한 유용성을가진다. 예를들면 특이적 결합분석, 친화도를 기초로 한 알파- 시누클레인 정제， 또는 알파-시누클레인길항제 규명을 위한 스크리닝 방법 등에 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 본원에 따른 항체는 알파_ 시누클레인응집체의 형성 억제, 신경계에서 알파-시누클레인응집체의 제거, 알파-시누클레인응집체의 세포간 이동 억제， 알파-시누클레인응집체에 대한 식세포 작용에 의한 세포외 알파-시누클레인응집체의 제거 및 감소에 유용할수있다.

본원에 따른 항체는 알파-시누클레인 또는 알파-시누클레인응집체와 관련된 다양한 질환의 검출 및/또는 치료에 사용될 수 있다. 예를 들면 질환은 알파-시누클레인또는 알파-시누클레인응집체에 관련된 질병， 증상 또는 질환의 검출， 치료， 경감， 완화에 유용한다또한본원에 따른항체는 알파-시누클레인 또는 알파-시누클레인응집체와 관련된 다양한 질환 또는 증상의 진단 또는 알파-시누클레인 또는 알파-시누클레인응집체의 유무 검출에사용될수있다.

본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편은， (0 알파- 시누클레인 또는 알파-시누클레인 응집체에 특이적인 결합, (i i ) 대상의 신경계에서 알파-시누클레인， 또는 알파-시누클레인 응집체의 수준 감소, (i i i )신경세포간알파-시누클레인또는 이의 응집체의 이동 (cel l-to-cel l transmi ssion) 감소 또는써해， 및 (vi ) 신경세포에 의한 알파-시누클레인 또는 이의 응집체의 식세포 작용 (phagocyt ic uptake)의 증진으로 이루어지는 군에 선택된 1종 이상의 활성을 갖는 것일 수 있다. 바람직하게는， 본발명에 따른항체또는이의 항원 결합단편은상기 활성 ( i )내지 (iv)를모두가지는것일수있다.

본 발명의 일 예는， 알파-시누클레인， 특히 알파-시누클레인 응집체에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 시누클레인병의 예방， 경감, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 일 예는， 알파-시누클레인， 특히 알파-시누클레인 응집체에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을， 이를필요로하는대상에게 투여하는단계를포함하는시누클레인병의 예방， 경감， 개선 또는 치료방법에 관한 것이다. 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 투여량은대상의 신경계에서， 더욱자세하게는신경계의 신경세포외 영역에서 알파-시누클레인， 특히 알파-시누클레인 응집체의 수준을 감소시키는유효량일수있다.

본 발명의 일 예는， 알파-시누클레인, 특히 알파-시누클레인 응집체에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는， 대상의 신경계에서, 더욱 자세하게는 신경계의 신경세포외 영역에서 알파-시누클레인 _, 특히 알파-시누클레인 응집체의 수준을 감소시키는 방법 또는 신경계의 신경세포외 영역에서 알파-시누클레인， 특히 알파-시누클레인응집체의 수준을감소시키는용도에 관한것이다. 또 다른 양태에서 본원은 또한 본원에 따른 임의의 항체 또는 그 항원결합 단편을 포함하는 조성물 또는 키트를 제공하며， 상기 조성물은 약학 또는 진단 조성물로 제공될 수 있으며， 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한담체 또는부형제를포함할수 있으며， 진단조성물은진단또는 검출에 필요한시약을추가로포함할수있다.

본원에서 "혈관뇌장벽’’ 또는 BBB (blood-brain barr ier)는 뇌 및 척추와 그 주변 순환계 사이에 존재하는 뇌의 모세혈관 내피세포 막내에 타이트 결합 (junct ion)에 의해 형성된 장벽이다. 이러한 장벽은 매우 견고해서 약 60Da 분자량의 저분자 물질이 뇌로 통과하는 것도 제한한다. 뇌의 혈관뇌장벽， 척추의 혈관척수장벽 그리고 망막의 혈관망막장벽은 중추신경계내의 연속적인모세혈관장벽으로, 통상 BBB로칭한다.

본원에서 "혈관뇌장벽 전달체”는 이러한 혈관뇌장벽을 통과하여， 본원에 따른항체 또는항원 결합단편을전달할수 있는분자 예를들면， 펩타이드 및 폴리펩타이드를 포함하는 단백질， 핵산, 항체, 또는 저분자 화합물을포함한다.

본원에 "치료제’’는목적하는 치료효과를위해 대상체에게 투여되는 분자를 일컫는다. 대상체는 비인간 포유류 예를 들면 영장류 또는 인간을 포함한다. 치료제의 예로는 펩타이드 및 폴리펩타이드를포함하는 단백질, 핵산, 항체， 또는 저분자 화합물을 포함한다. 다른 측면에서 치료제는 일 구현예에서 본원에 따른 항체와 결합되어， 알파-시누클레인 응집체와 관련된질환의 치료제로서사용될수있다.

시누클레인병에서 알파-시누클레인의 축적이 신경퇴행의 전형적인 특성을유도하는정확한메카니즘및 시뉴클레인병의 고유의 증상이 충분히 이해되지 않고 있음에도 불구하고, 최근 연구는 알파-시누클레인응집체의 비정상적 형성 및 축적이 잠재적인 시누클레인병의 발생 및 퇴행성 진행에 관련됨을암시하고있다.

본 발명에 따르면， 용어 "시누클레인병"은 병리학적 시뉴클레인 응집체를 특징으로 하는 모든 신경퇴행성 장애를 포함한다. 파킨슨병, 파킨슨질환성 치매 (Parkinson s di sease dement i a, PDD) , 루이소체 치매 5 (dement ia wi th Lewy bodies, DLB) , 루이소체병, 루이소체를 동반한 치매, 치매를 동반한 파킨슨 증후군, 다계통 위축증 (mult iple system atrophy, MSA) , 다발성 신경계 위축 및 뇌 철 침착동반한신경변성 I형 (NBIA Type I)을 포함하는 몇 가지 신경퇴행성 장애는 시누클레인병으로서 집합적으로 그룹화된다. 또한, 알파-시누클레인 응집은 이차적으로 알츠하이머 10 질환에서도 발견된다 (Kim et al . Alzheimer’s Research & Therapy 2014, 6:73) .

시누클레인병은 공통적인 병리학적 특성을 공유하는 신경퇴행성 장애의 다양한 그룹이다: 신경병리적 실험에서, 특유의 병변은 뉴런 (neuron) 및 희소돌기신경교 (ol igodendrocyte)의 선택된 집단 내에서 15 알파-시누클레인 단백질의 비정상적 응집을 포함하며 감지될 수 있다. 알파-시누클레인 (처음에 PARK1 및 PARK4로 판명됨)은 신피질， 해마， 치상회， 후신경구， 선조체, 시상 및 소뇌에서 광범위하게 발현되는 140개 아미노산의 단백질이다. 알파-시누클레인은 또한 B-, T-, 및 ■ 세포를 비롯하여 단백구 및 혈소판을 포함하는 조혈세포에서 높게 발현된다. 20 이러한 세포 내에서의 정확한 역할은 알려지지 않았으나, 거핵구 (혈소판 전구체)의 분화와관련이 있었다.

본원에 따른 알파-시누클레인 응집체를 높은 친화도로 특이적으로 인식하며， 알파-시누클레인 항체가 이러한 질환의 진단, 또는 검출에 유용하게 사용될 수 있음을 나타낸다. 나아가 본원에 따른 알파 고도 시누클레인응집체를 특이적으로 인식하는 알파-시누클레인 항체는 알파- 시누클레인 응집체의 형성을 억제하거나 또는 응집체를 분해하고， 세포간 응집체의 전달을 억제하여， 시누클레인병, 특히 파킨슨 병의 치료에 효과적으로사용될수있음을나타낸다.

본원에서 ’’알파-시누클레인 응집체와 관련된 질환"은 시누클레인병 30 라고 불리는 일군의 신경퇴행성 질환으로, 뉴런 및 교세포 (gl ia) 집단을 포함하는 병소에서 알파-시누클레인 응집체가발견되며， 도파민성 시스템의 퇴화, 운동능력변화， 인지장애 및 루이소체 및/또는 루이 뉴라이트의 형성과 같은 특징을 가진다 (Kim et al . Alzheimer ' s Research & Therapy 2014， 6:73; McKei th et al .， Neurology (1996) 47： 1113-24) . 이러한 질환에는 파킨슨 질환，파킨슨질환성 치매，루이소체 치매， 알츠하이머 루이소체 질환， 복합성 알츠하이머 및 파킨슨 병, 다계통위축증 및 기타 다수의 신경축삭 질환을 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다. 일 구현예에서， 본원에 따른항체는파킨슨병의 치료에 효과적으로사용된다. 본원에서 "유효량 ¹ '은 일반적으로， 질환， 특히 알파-시누클레인과 연관된 질환으로 인한 증상의 심각성 및/또는 발생 빈도의 감소, 질환， 특히 알파-시누클레인과 연관된 질환으로 인한 증상 및/또는 질환 발생의 근본원인 제거, 또는질환， 특히 알파-시누클레인와연관된 질환으로인한 증상 및/또는 근본 원인 발생의 예방， 및/또는 질환， 특히 알파- 시누클레인과 연관된 질환으로 인한 손상을 개선 또는 교정하기에 충분한 양을 의미한다. 일부 구현예에서， 유효량은 치료적 유효량 또는 예방적 유효량이다. "치료적 유효량’'은질환， 특히 알파-시누클레인과 연관된상태 또는 증상을 치료하거나， 또는 질환， 특히 알파-시누클레인과 연관된 상태 또는 증상의 예방， 지체, 또는 그 진행을 역전시킬 만큼 충분한 양이다. "예방적 유효량"은 대상체에게 투여될 때, 의도된 대로， 질환， 특히 알파- 시누클레인과 연관된 질환의 발병 또는 재발, 또는 질환, 특히 알파- 시누클레인과 연관된 질환 또는 관련된 증상을 예방 또는 지연시키고， 그 발생 가능성을 감소시키는 양이다. 완전한 치료적 또는 예방적 효과는 용량의 1회 투여에 의해 발생하기 보다는 복용량의 수회 투여에 의해 발생할 수 있다. 따라서 치료적 또는 예방적 유효량은 1회 이상의 투여에 의해 전달될수있다. 본 다른 양태에서 본원은 본원에 따른 항체 또는 항원 결합 단편 또는 이를 포함하는 조성물을 이용하여, 시누클레인병을 갖는 대상체의 상기 질환 치료용 용도를 제공하며， 상기 항체 또는 항원 결합 단편 또는 이를 포함하는 조성물은 상기 대상체， 또는 대상체의 뇌에서， 알파- 시누클레인응집체의 세포간 전달의 억제， 알파-시누클레인응집체 분해， 알파-시누클레인 응집체 형성을 억제, 또는 알파-시누클레인 응집체의 미세교세포에 의한식세포작용의 증가를포함한다.

본명세서에서， ’’치료 ¹ '는 질병 또는질병 증상을감소， 완화, 경감， 또는 제거하거나, 질병의 증상 또는 병적 상태를 보다 잘 견딜 수 있는 상태로 만들어 주는 것， 또는 질병의 증상또는 병적 상태의 악화 속도를 늦추는 것 등을포함하는, 질병 또는 질병의 증상또는 병적 상태의 경감 또는 제거와 관련된 모든 작용을 의미할 수 있다. 용어 “대상” 또는 ”환자”는인간또는인간환자를포함한다.

항체의 치료적 유효량， 및 약학적으로 허용가능한 희석제， 담체, 가용화제， 유화제， 방부제 및/또는 보조제를 포함하는 약학적 조성물도 또한 제공된다. 또한， 예를 들면, 이러한 약학적 조성물을 투여함으로써 알파-시누클레인와 연관된 환자를 치료하는 방법이 포함된다. 생체내 투여에 사용되는 약학적 조성물은 전형적으로 무균 제제로서 제공된다. 일단 약학적 조성물이 제형화되면 , 이는 용액 , 현탁액， 겔 , 에멀젼， 고체， 결정， 또는 탈수되거나 동결건조된 분말로서 무균 바이알 내에 저장될 수 있다. 이러한제형은즉시 사용가능한 형태， 또는투여 직전에 재구성되는 형태（예를들면， 동결건조됨）로저장될수있다. 약학적 조성물의 투여 경로는공지된방법， 예를들면, 경구; 정맥내， 복막내， 뇌내（실질내）， 뇌실내， 근육내, 안구내， 동맥내， 문맥내, 또는 병소내 경로를 통한주사; 지속 방출 시스템 또는 이식 장치가사용될 수 있다. 특정 구현예에서， 조성물은 블루스 주사에 의해， 또는 주입 또는 이식 장치에 의해 연속적으로투여될수있다. 본원에 따른약학조성물또는키트는시누클레인병 치료용으로예를 들면상기 시누클레인병 는파킨슨병, 파킨슨질환성 치매, 루이소체 치매， 알츠하이머 루이소체 질환, 복합성 알츠하이머 및 파킨슨 병, 또는 다계통위축증를포함한다. 또다른양태에서 본원에 따른항체 또는항원 결합단편 또는 이를 포함하는조성물을시누클레인병의 치료및/또는 알파-시누클레인 응집체의 농도조절이 필요한 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는， 상기 대상체의 시누클레인병치료 또는 상기 대상체에서 알파-시누클레인 응집체의 농도를 조절하는방법을제공한다.

일 구현예에서 본원에 따른 항체는 BBB 통과를 위해 전달체와 연결되어 사용될 수 있다. BBB를 통하여 약물을 전달하기 위한 다수의 방법이 개시되어 있다. 예를 들면 브래드키닌, 또는 HIFU Hign densi ty foucues ultrasound）과 같은 방법을 사용하여 BBB의 삼투압을 와해시키는 방법이 있다. 또한 세포에 내재된 글루코스 및 아미노산 전달체, 인슐린 또는 트랜스페린의 수용체 매개 트랜스사이토시스와 같은 전달 시스템의 사용 또는 당단백질의 활성 유출 잔달 (ef f lux transporter)을 차단하는 것을포함한다.

또 다른 구현예에서 본원에 따른 항체는 다른 치료제와 연결되어 병합사용되어， 알파-시누클레인 응집체와 관련된 질환의 치료에 사용될 수 있다 _. 항체의 치료적 유효량， 및 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체， 가용화제, 유화제, 방부제 및/또는 보조제를 포함하는 약학적 조성물도 또한제공된다.

허용가능한 제형 물질은 사용되는 용량 및 농도에서 수용자에게 무독성이다. 특정 구현예에서, 치료적 유효량의 인간 알파-시누클레인 항체를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다. 특정 구현예에서, 허용가능한 제형 물질은바람직하게는사용되는용량및 농도에서 환자에게 무독성이다. 일 구현예에서, 약학적 조성물은, 예를 들면， 조성물의 pH, 오스몰농도， 점도, 투명도， 색상， 등장성， 향기， 무균성， 안정성, 용해 또는 방출의 속도， 흡수 또는 침투의 변경， 유지 또는 보존을 위한 특정 제형 물질을 포함할수있다.

특정 구현예에서， 최적의 약학적 조성물은， 예를 들면, 목적하는 투여 경로, 전달방법 및 목적하는 용량에 따라서 당업자에 의해 결정될 것이다 (상기 REMINGTON ' S PHARMA況 UTICAL SCIENCES, 참조) . 특정 구현예에서， 이들 조성물은 본원에 개시된 항체의 물리적 상태, 안정성， 생체내 방출속도및 생체내 클리어런스 (clearance)의 속도에 영향을줄수 있다. 특정 구현예에서， 약학적 조성물 중의 주요한 비히클 또는 담체는 수성 또는 비-수성일 수 있다. 예를 들면， 적절한 비히클 또는 담체는 가능하게는 비경구 투여용 조성물에서 통상적인 다른 물질로 보중된 주사용수， 생리 염수 용액일 수 있다. 추가로， 특정 구현예에서, 인간 알파-시누클레인 항체는 적절한 부형제， 예를 들면, 수크로스를 사용하여 동결건조물 (lyophi l i zate)로서 제형화될수있다.

약학적 조성물은 비경구 전달될 수 있으며, 치료적 조성물은 목적하는 인간 a -Syn 결합 단백질을 약학적으로 허용가능한 비히클 내에 포함하며， 파이로젠을 포함하지 않는 비경구에 허용되는 수용액의 형태로 제공될수있다.

일단 약학적 조성물이 제형화되면， 이는용액, 현탁액, 겔， 에멀젼， 고체， 결정， 또는 탈수되거나 동결건조된 분말로서 무균 바이알 내에 저장될 수 있다. 이러한 제형은 즉시 사용가능한 형태， 또는 투여 직전에 재구성되는 형태 (예를 들면， 동결건조됨)로 저장될 수 있다. 단일-용량 투여 단위체를 생성하기 위한 키트도 또한 제공된다. 투여 빈도는 사용된 제형의 인간 알파-시누클레인 항체의 약물동태학적 파라미터에 좌우될 것이다.

또한, 생체외에서 인간 알파-시누클레인 항체 약학적 조성물을 사용하는것이 바람직할수 있다. 이러한경우에， 환자로부터 제거된 세포， 조직 또는 기관은 인간 알파-시누클레인 항체 약학적 조성물에 노출되고, 이후 세포, 조직 및/또는 기관은 후속적으로 환자 내로 이식된다. 특히， 인간 알파-시누클레인 항체는 폴리펩타이드를 발현하고 분비하기 위하며, 본원에 기재된 것들과 같은 방법을 사용하여 유전자 조작된 특정 세포를 이식함으로써 전달될수있다.

또다른양태에서 본원에 따른항체또는항원결합단편을제공하는 단계 ; 및 상기 항체 또는항원결합단편을 알파-시누클레인 응집체 검출이 필요한 생물학적 시료와 접촉하는 단계를 포함하는 생물학적 시료에서 알파-시누클레인 응집체 검출방법을 제공한다. 생물학적 시료는 알파- 시누클레인 응집체의 검출이 필요한 다양한 시료를 포함하며， 예를 들면， 뇌척수액, 혈장을 포함하는 혈액 또는 소변을 포함하며， 또한 세포, 조직 또는 기관을 포함한다. 상기 방법은 인비트로 또는 인비보에서 수행될 수 있다. 인비보 이미징은 예를 들면 PEKpos i tron emi ssion tomography) , SPECKsingle photon emi ssion tomography) , NIR(near infrared) 광학 이미징 또는 MRl Onagnet ic resonance imaging)을이용하여 수행될수있다. 또다른 양태에서 본원은시누클레인병의 진단이 필요한 대상체에서 시누클레인병을 진단하는 방법으로， 상기 방법은 상기 대상체에서 알파_ 시누클레인 응집체의 농도 또는 세포내 위치를 본원에 따른 임의의 항체 또는 항원 결합 단편로 측정/검출하는 단계; 및 상기 대상체에서 측정된 상기 알파-시누클레인 응집체의 농도 또는 세포내 위치를 대조군 시료의 결과와비교하는단계를포함하며， 상기 대조군의 결과와유사또는차이는 상기 대상체가 시누클레인병에 걸린 것을 나타낸다. 상기 방법에서 대조군은정상또는시누클레인병 에 걸린 시료일수 있다. 검출또는진단 용도를위해항체는전형적으로검출가능한표지 물질로표지될수있다. 본원에 개시된 항체는 알파-시누클레인과 관련된 질환 및/또는 증상을 검출, 진단， 또는모니터링하기 위한진단목적에 사용될 수 있다. 일 구현예에서 본원에 따른 방법은 시누클레인병의 진단이 필요한 대상체에서 시누클레인병을 진단하는 방법으로， 상기 방법은 상기 대상체에서 알파-시누클레인 응집체의 농도 또는 세포내 위치를 본원에 따른 항체 또는 항원 결합 단편으로 측정하는 단계; 및 상기 대상체에서 측정된 상기 알파-시누클레인 응집체의 농도 또는 세포내 위치를 대조군 시료의 결과와비교하는단계를포함하며， 상기 대조군의 결과와유사또는 차이는상기 대상체가시누클레인병에 걸린것을나타내는것이다.

상기 방법에서 대상체는 증상이 없거나 또는 증상이 나타나기 전의 환자를포함하는것이다. 일 구현예에서 대조군은파킨슨병, 루이소체 치매 또는다계통위축증을을포함하는시누클레인병 환자일 수 있으며, 이 경우， 상기 비교 단계에서 대조군과의 유사성은 상기 대상체를 시누클레인병 환자로진단한다. 다른구현예에서 대조군은정상인유래의 시료인 경우에， 상기 비교단계에서 대조군과의 차이, 예를들면응집체 농도의 증가는상기 대상체를 시누클레인병으로 진단한다. 또 다른 구현예에서， 상기 대상체와 대조군의 연령이 매치될 수 있다. 상기 방법은 인비보 또는 대상체에서 분리된 생물학적 시료 예를 들면 혈액, 뇌척수액（CSF, Cerebrospinal f luid）또는소변시료에서 수행될수있다.

진단 용도를 위해 항체는 전형적으로 검출 가능한 표지 물질로 표지될수 있다. 적절한표지 물질은방사성동위원소또는방사성핵종（예를 들면， ¾， ¹⁴ C, ¹⁵ N, ³⁵ S, ⁹⁰ Y, "TC, ^m In, ¹²⁵ I , ¹³¹ I）, 형광물질（예를들면， FITC, 로다민， 란탄족 형광체）, 효소（예를 들면， 호스래디쉬 퍼옥시다제, 兵 -갈락토시다제, 루시퍼라제， 알칼리성 포스파타제）, 화학발광기， 바이오티닐 기， 또는 2차 리포터에 의해 인식되는 폴리펩타이드 에피토프（예를들면, 류신지퍼 쌍서열， 2차항체에 대한결합부위， 금속 결합도메인， 에피토프태그）가포함되나이로제한되는것은 아니다.

다른 양태에서 본원의 항체는 알파-시누클레인 응집체를 포함하는 조직의 식별에 사용될 수 있다 _. 특정 구현예에서， 항체는 표지물질로 표지되고， 표지된 항체의 알파-시누클레인응집체에 대한결합이 검출된다. 일 구현예에서， 알파-시누클레인 응집체에 대한항체의 결합은 생체내에서 검출된다.

다른 양태에서 본원은 본원에 개시된 항체와 알파-시누클레인 응집체에의 결합에 대하여 경쟁하는 시험 물질을 검줄또는 선별하는 것을 개시한다. 예를 들면 시험물질의 존재 또는 부재에서 알파-시누클레인 응집체를 포함하는 용액 내에서 유리 항체의 양을 검줄하는 단계를 포함한다.

유리 항체, 즉, 알파-시누클레인 응집체에 결합되지 않은 항체 농도의 증가는 시험 분자가 알파-시누클레인 응집체 결합에 대하여 항체와 경쟁할 수 있음을 지시할 것이다. 일 구현예에서， 항체는 표지 기로 표지된다. 대안적으로， 시험물질은 표지되고, 유리된 시험 물질의 양은 항체의 존재 및부재로모니터링 한다.

그 외 본원에 개시된 항체 또는항원 결합단편은다양한유용성을 가진다. 예를들면특이적 결합분석, 친화도를기초로한알파-시누클레인 정제， 또는 알파-시누클레인 길항제 규명을 위한 스크리닝 방법 등에 사용될수있다.

본원에 개시된 항체는 생물학적 시료에서 알파-시누클레인， 특히 루이소체와 같은 알파-시누클레인 응집체의 검출 및 알파-시누클레인 응집체를 포함하는 세포 또는 조직의 식별에 유용하다. 예를 들면， 알파- 시누클레인 항체는 진단, 예를 들면, 생물학적 시료 예를 들면 혈장을 포함하는혈액， 뇌척수액 (CSF, Cerebrospinal f luid)또는소변, 조직 또는 세포 내에서 발현된 알파-시누클레인 응집체를 검출하고/하거나 정량하는 분석， 및 이를근거로한시누클레인병의 진단에사용될수있다.

【발명의 효과】

본원에 개시된 항체는 알파-시누클레인， 특히 알파-시누클레인 응집체에 높은 결합력으로 선호적으로 결합한다. 높은 친화도를 갖는 본원에 따른 항체 또는 항원 결합 단편은 알파-시누클레인 응집체 형성을 감소시킬 수 있어 뇌의 응집체의 농도를 낮출 수 있다. 또한 알파- 시누클레인응집체에 대한높은친화도를갖는본원에 따른항체 또는항원 결합 단편은 중추신경계 바깥에서의 알파-시누클레인 응집체 형성을 감소시킬 수 있어， 결국 뇌혈관장벽을 경계로 한 알파-시누클레인 형태들 간의 평형상태를 변경시켜, 중추신경계 내의 응집체의 농도를 낮추는 효과를가져올수 있다. 또한높은친화도로 인해 낮은투여량으로투여될 수 있는장점이 있다. 이는항체를 예를들면 이로 제한하는 것은 아니나， 보다 간편한 피하주사와 같은 방식으로 투여해도 충분한 효능을 얻을 수 있기 때문에, 임상에서 큰장점이 있다.

본원에 개시된 항체는 알파-시누클레인 응집체를 효과적으로 제거하거나분해를촉할수 있고, 알파-시누클레인의 세포간전달을억제할 수 있어， 알파-시누클레인 의 응집체 축적과 관련된 질환의 치료에 유용하게사용될수있다.

【도면의 간단한설명】

도 1은 본 발명의 일예에서 제조된 단일클론 항체가응집된 형태의 nat ive 알파-시누클레인을 특이적으로 인식하는지 여부를 측정한 닷블롯 결과를나타낸다.

도 2는 본 발명의 일예에서 제조된 단일클론 항체의 친화도를 ELISA로측정한결과이다.

도 3a는 본 발명의 일예에서 제조된 단일클론 항체가 알파- 시누클레인 응집체에 대한 선호적 결합 특이성 및 친화도를 BIAcore로 분석한결과이다. 도 3b는도 3a의 결과를표로나타낸것이다.

도 4a는 본 발명의 일예에서 제조된 단일클론 항체가 알파- 시누클레인응집체에 선호적 결합특이성을 Octet으로분석한결과이다. 도 4b는도 4a의 결과를표로나타낸것이다.

도 5는 본 발명의 일예에서 제조된 단일클론 항체가 알파- 시누클레인의 세포 간 전파 (cel l to cel l transmi ssion)를 억제하는 지를 분석하는원리 (위 )및실험 결과를나타낸것이다.

도 6a는 본 발명의 일예에서 제조된 단일클론 항체가 인간 알파_ 시누클레인을 과발현하는 마우스 동물모델 (TG)에서 알파-시누클레인 응집체를 제거할 수 있는 지를， 마우스에 항체 투여 후 p-129 a -Syn 항체를 이용하여 마우스 뇌 조직을 염색하여 측정한 결과이다. 도면에서 HP는 Hippocampus이고, p-129 a-syn은 129번째 잔기가 인산화된 형태의 응집체의 마커이며, 화살표는인산화된알파-시누클레인을나타낸� �

도 6b는도 6a와동일한실험이나， 마커로서， 총 알파-시누클레인에 대한 항체를사용하여 염색한 결과이다. 화살표는 인간 알파-시누클레인을 나타낸다. 9B11, 11F4, 11F11 항체는 총 알파-시누클레인의 축적을 효과적으로억제하였다.

도 7a는 본 발명의 일예에서 제조된 단일클론 항체가 인비보 ( in vivo)에서 mi crogl iosi s를 감소시킬 수 있는지를, 마우스에 항체 투여 후 마커로서 Iba-l(microgl iosi s) 항체를 이용하여 마우스의 뇌 조직을 염색으로 측정한 결과이며， 화살표는 활성화된 마이크로글리아를 의미하는 것이다. 2019/098763 1»（：1^1{2018/014123

도 개는 본 발명의 일예에서 제조된 단일클론 항체가 인비보에서 크 대 크 를 감소시킬 수 있는지를 , 마우스에 항체 투여 후 마커로서 公 （크 ₃₁ ： _1'0 용1 ^ ） 항체를 이용하여 마우스의 뇌 조직을 염색으로측정한 결과이며， 화살표는활성화된에스트로사이트를의미하는 것이다.

도 7（：는 본 발명의 일예에서 단일클론 항체가 인비보에서 염증성 사이토카인을 감소시칼수 있는지를, 마우스에 항체 투여 후 마커로서 比_ 1베타 （1 1|3） 항체를 이용하여 마우스의 뇌 조직을 염색으로 측정한 결과이며， 화살표는比-1베타를발현하고있는세포를나타� ��다.

도 7（1는본발명의 일예에 따른단일클론항체가인비보에서 염증성 사이토카인을감소시킬수 있는지를， 마우스에 항체 투여 후마커로서 -6 항체를 이용하여 마우스의 뇌 조직을 염색으로 측정한 결과이며， 화살표는 염증성사이토카인인 -6룰발현하는세포를나타낸다.

도 8크및도 ¾는각각본발명의 일예에 따른단일클론항체 3쇼9및 111^11가 인간 뇌조직에서 루이소체 및 루이 신경돌기 （1 아 진）를 특이적으로 인식할 수 있는 지를 각각 측정한 결과이다. 본원에 따른항체가루이소체（화살표） 및 루이 신경돌기（왼쪽아래 실 같은 모양）에 결합하는것을나타낸다.

도 9은 본 발명의 일예에 따른 항체의 에피토프 맵핑 결과를 도식적으로 나타낸 것으로， 본원에 따른 항체들은 대부분 （：-말단 부위에 결합하는것으로나타났다.

도 10 ₃ 및 도 1아）는본발명의 일예에 따른 키메릭 항체 및 인간화 항체들의 미세교세포의 알파-시누클레인응집체에 대한식세포작용촉진능 분석 결과를 나타낸 것이며, 도 10크는 인간화 1 11 항체에 관한 것이고, 도 1（¾는인간화 3쇼9에 관한것이다.

도 11은 본 발명의 일예에 따른 키메릭 항체 및 인간화 항체들이 알파-시누클레인응집체의 신경세포표면에의 결합을저해하는능력에 관한 분석 결과이다.

도 12는 본 발명의 일예에 따른 키메릭 항체 및 인간화 항체들이 알파-시누클레인을 과발현하는 신경세포에서 분비되어 정상 신경세포로 알파-시누클레인 응집체가 이동하는 세포 간 전파를 억제하는 효능 분석 결과이다.

도 13은 본 발명의 일예에서 제조된 키메릭 항체와 인간화 11 11 항체의 친화도를此比쇼로측정한결과이다. 도 14는 본 발명의 일예에서 제조된 키메릭 항체와 인간화 11F11 항체가 알파-시누클레인 응집체에 대한 선호적 결합 특이성 및 친화도를 BIAcore로분석한결과이다.

도 15a, 15b, 15c는본발명의 일예에서 제조된키메릭 항체가베타- 시누클레인， 감마-시누클레인， 혹은 아밀로이드 베타 （amyl oi d bet ai-42） , 타우 （tau） 유래 응집체가 아닌 알파-시누클레인， 특히 알파-시누클레인 응집체에 특이적으로 결합하는 특이성을 ELISA 및 닷블롯으로 분석한 결과이다. 【발명의 실시를위한형태】

이하에서는 실사예를 들어 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하고자 하나， 이는 예시적인 것에 불과할 뿐 본 발명의 범위를 제한하고자 함이 아니다. 실시예 1：마우스알파-시누클레인항체의 제조

면역화

항원으로는전장 （140잔기） 또는（：-말단 21개 잔기가절단된 알파- 시누클레인 단량체를 37도 내라 미 0에 넣고 14일 동안 1050 대미으로 흔들어 응집화시켰으며 소니케이션 하여 사용하였다. 상기 제조된 1 ₁ 收/ ₁₁₁₁ 농도의 140개 및 119개 잔기의 알파-시누클레인 피브릴 각각을 아주번트와 1: 1（ _\ 1 : 1）로혼합하여 잘섞어 주었다.

이어, 상기 준비한혼합물 200 _II 느를 5~7주령 B^LB/c 암컷 마우스의 피하에 주사하였고, 2주 후에 동일한 방법으로 제조한 혼합물 200 u L를 추가로 피하주사 .하여 부스팅시켰다. 부스팅 1주일 후에 혈액을 채취하여 투여항원을 붙인 ELISA 방법을 사용하여 면역화 적정 ( immunizat ion t i terat ion)을수행하였다. 이어 3차부스팅은항원만을피하주사하였다. 하이브리도마생산

이어 상기와 같이 면역이 완료된 마우스의 비장을 제거하여， 이로부터 세포를 확보하였다. 이어 비장 세포를 10% FBS가 첨가된 Hybr idoma-SFM 배지 (Thermo Fi sher Sci ent i f i c , USA)에 현탁시켰다. 하이브리도마를 제조하기 위해 뮤린 골수종 세포인 SP2八)- Agl4와 비장 세포를 혈청이 포함되지 않은 Hybr idoma-SFM 배지에서 혼합한 후 원심분리를 하여 배지를 제거하였다. 이어 세포 펠렛에 PEG를 첨가한 후 37°C에서 1분간배양하여 세포융합을유도하였다. 단세포클로닝

융합 2주후에， 세포배양배지를 이용하여 마우스에 투여한항원을 붙인 ELISA 방법을 사용하여 항체를 생산하는 마우스 B 세포와의 융합을 확인하였다. 이어 하이브리도마를 이용하여 단세포 클로닝을 수행하여 단클론항체를 생산하는 하이브리도마를 총 16개 선별하였다. 전장 (140 잔기) 알파-시누클레인 응집체를 항원으로 이용하여 9B11 (각각 IgGl kappa) 클론을 수득하였고， C-말단 21개 잔기가 절단된 알파-시누클레인 응집체를 항원으로 이용하여 3A9및 11F11 (각각 IgG2b kappa, IgG2b kappa)의 클론을수득하였다. 항체의 정제

10% FBS가 포함된 RPMI 1640 배지에서 각 하이브리도마를 배양하다 항체 생산을 위해 serum이 없는 SFM 배지로 배양 배지를 교체한 후 4일 정도 배양한다. 세포 배양 상층액을 분리하여 원심분리한 후 0.22 u m 필터로 거른 후 IgGl 타입은 protein G column으로 나머지 항체들은 protein A column으로정제하였다. 가변영역서열결정

가변영역 및 CDR서열은 Ahn et al , Mol . Cel ls 2004， 18(2) :237-241 논문을 참조하여 결정하였다. 하이브리도마를 배양한 후 원심분리하여 세포만을 분리하였다. 분리된 하이브리도마에 트라이졸을 넣어 RNA를 분리하였으며 이를 템플릿으로 하여 cDNA를 합성한 후 염기서열 분석을 통해 가변영역 및 CDR 서열을 확인하였다. 따라서， 항체 3A9, 9B11, 11F11을얻었다. 실시예 2. 알파-시누클레인 항체를 이용한 항원 결합 특이성 및 결합력분석

실시예 2-1：항-알파-시누클레인항체를이용한닷블롯� ��석

본원에 따른 항체가 네이티브 상태에서의 단량체 또는 응집체에 결합하는 지를 분석하기 위해 닷블롯 실험을 수행하였다. 이를 위해 항원으로서 50 ng 혹은 100 ng의 알파-시누클레인 모노머 또는 피브릴 단백질 (서울대학교 이승재 교수 lab에서 제조함; Bae et al . , J . Neurosci 32 : 13454 , 2012)을 Dot blot apparatus(BioRad)를 이용하여 나이트로셀룰로스 멤브레인에 스팟로딩하였다. 2배씩 희석한 모노머 또는 피브릴 단백질은 멤브레인의 오른쪽에서부타 왼쪽으로 순차적으로 로딩하였다 ( 12.5, 25 , 50 , 100 ng) . 멤브레인을 TBST조성의 5% non-fat dry mi lk로 1시간동안상온에서 블로킹한뒤， 실시예 1에서 제조한 알파- 시누클레인 항체를 1 mg/ml의 농도로 1% bovine serum albumin함유 TBST에 넣고멤브레인과해당항체를 1시간동안상온에서 인큐베이션하였다. 이어 TBST로 세척한 뒤 HRP(horse radi sh peroxidase)가 결합된 2차 항체 및 기질로서 cherai luminscence substrate (NEN)를제조자의 방법대로사용하여 신호를 분석하였다. 결과는 LAS-3000 Luminescent Image Analysi s System (FUJIFILM Li fe Science)을 이용하여 이미징하였다. 결과는 도 1에 기재되어 있다.

도 1에 나타난바와같이 본원에 따른알파-시누클레인항체는알파- 시누클레인 모노머와 비교하여, 응집체에만 선호적으로 결합하는 것으로 나타났다. 특히 9B11, 3A9 및 11F11은 응집체에만 결합하는 것으로 나타났다. 274 항체 (Bae et al . , J Neurosci . 2012 Sep 26； 32(39) : 13454-13469)는단량체 및응집체에 모두결합하는비교항체이다. 실시예 2-2：항-알파-시누클레인항체를이용한 ELISA분석

본원에 따른항체의 항원에 대한결합력을정량적으로분석하기 위해 ELISA를 수행하였다. 이를 위해 본원에 따른 알파-시누클레인 항체를 1 mg/ml의 농도로 96웰플레이트에 코팅한후, 여기에 10, 100, 1000, 10,000 ng/ml 농도의 알파-시누클레인 피브릴응집체를처리한후, PBS로세척하고, 이어 바이오틴이 결합된 2차항체 및 HRP가결합된 스트렙타비딘을 처리한 후기질로서 TMB와반응한후흡광도를측정하였고, 그측정 결과를도 2에 나타냈다.

도 2에 나타난 바와 같이 본원에 따른 항체는 응집체에 높은 결합력으로 선호적으로 결합하는 것으로 나타났다. ELISA 결과를 통해 항체를분석해보면응집체 선호적으로결합하는항체들은 0.1x10— ⁹ M ~ 2 x 10 ⁹ M정도의 친화력을보였으며 단량체 및 응집체에 모두결합하는항체는 이보다 높은 ~1 x 10’ M값을 보였다. 본 발명에 따른 항체는 알파- 시누클레인 응집체에 높은 친화도로 선호적으로 결합하며， 단일체에 대해서는 응집체보다낮거나또는 결합하지 않기 때문에， 친화도를 도출할 수 없었다. 이러한 결과는 파킨슨병과 같은 알파 시큐클레인 병인을 갖는 신경퇴행성 질환의 원인물질을효과적으로제거할수 있거나활동을억제할 수있음을나타내는것이다. 실시예 2-3.항-알파-시누클레인항체를이용한 BIAcore분석

실시예 1에서 제조된 알파-시누클레인항체의 단량체 및 응집체항원 결합에 대한정량적 분석을 BIAcore를사용하여 수행하였다.

기기는 T200 (GEHeal thcare, S/N： 1565888)을 사용하였다. Chip은 Protein A를 사용하였으며 (GE Healthcare, Cat . 29-1275-56) , Regenerat ion buf f 는 10 mM Glycine-HCl pH1.5 (GE Healthcare, Cat . BR- 1003-54) , Running buffer와 analyte 희석， 샘플 희석 완충액으로는 HBS- EP를사용하였다. 실시예 1에서 제조된 a -syn항체 (3A9， 9B11, 11F11)는

IX HBS-EP (GE Heal thcare, Cat . BR-1006-69)로 희석하였으며 , a -syn 단량체 (1 mg/ml ) 또는 피브릴 단백질 (3 mg/ml ) (analyte)은 2배씩 순차적으로 희석하여, 0 nM포함총 6개 농도 (0， 0.39, 1.56, 6.25, 25, 100nM)에서 분석하였다. 캡처의 경우 단량체는 표적 RU를 800 (theoret ical )으로, 피브릴은표적 RU를 100 (theoret i cal )으로하고， 캡처 phase를 contact t ime을 60초, f low rate을 30 ii l/min으로， stabi l izat ion per iod를 180초로진행하였다. assocat ion phase에서는 associ at ion t ime을 120초로， f low rate를 30 y 1/min으로하였으며, di ssociat ion phase에서는 dissociation time을 360초로， flow rate를 30 yl/min으로 하였다. Regeneration phase에서는， flow rate을 30 yl/min으로하여 regeneration time을 240초 (1차), 60초 (2차)， 두 번에 걸쳐 진행하였다. 1:1 binding model을사용하여 fitting하였으며， evaluation software는 BIACore T200 Evaluation software를 사용하였다 (GE healthcare) . 결과는 도 3a 및 도 3b에 기재되어 있다.

도 3a는 본 발명의 일예에서 제조된 단일클론 항체가 알파- 시누클레인 응집체에 대한 선호적 결합 특이성 및 친화도를 BIAcore로 분석한 결과이다. 본원에 따른 항체가 높은 친화도로 응집체에 결합하는 것을 나타낸다. 이러한 결과는 파킨슨병과 같은 알파-시누클레인 병인을 갖는 신경퇴행성 질환의 원인물질을 효과적으로 제거할 수 있거나 활동을 억제할수 있음을 나타내는 것이다.도 3b는 도 3a의 결과를 표로 나타낸 것이다. 도 3a 및 도 3b의 결과에 나타낸 바와 같이, 분석한 4개의 알파- 시누클레인 항체 중 상술한 다른 방법에서 응집체에 선호적으로 결합하는 항체들인, 3A9, 9B11, 및 11F11이 BIAcore에서도 응집체에만 결합하는 것으로나타났으며 ,약 1~3 x 10 ⁹ M의 높은친화도를갖는것으로나타났다. 실시예 2-4.항-알파-시누클레인항체를이용한 Octet분석

실시예 1에서 제조된 알파-시누클레인 항체 (3A9, 9B11, 11F11)의 단량체 및 응집체 항원 결합에 대한 정량적 분석을 Octet를 사용하여 수행하였다.

구체적으로 running buffer는 IX KB buffer (cat .18-1092)혹은 IX PBS buffer를 1000 rpm에서 사용하였으며, immobilization buffer는 sodium acetate, pH 5 (lOmM, Cat . 18-1068)을 사용하였다. a-syn모노머는 a- syn 항원을 i_obi 1 izat ion 시켰으며, 피브릴의 경우 테스트 항체를 immobilization시켰다. target concent rat ion은모노머의 경우 20 pg/ml , 피브릴의 경우 0.4 yg/ml로하였으며， kinetics concent rat ion은모노머의 경우 50 부터, 피브릴의 경우 100이부터 2배씩 차례로 희석하여 총 7개의 포인트를 설정하였다. Association/Dissociation 시간은 모노머의 경우 5분/ 20분, 피브릴은 5분/ 25분이었으며， Biosensor는 ARG2를, fitting은 1:1 fitting을 사용하였다. 결과는 도 4에 기재되어 있다. 도 4는 본 발명의 일예에서 제조된 단일클론 항체가 a -Syn응집체에 선호적 결합특이성을 Octet으로분석한결과이다.

도 4a에 나타난 바와 같이, 3A9, 9B11 및 11F11의 경우 단량체에는 거의 결합하지 않으며 (붉은 점선 박스) , 응집체에는 잘 결합하는 것으로 나타났다 (붉은점선 박스내의 그래프가올라감) . 이러한결과는 Dot blot ,

Octet , ELISA에서의 결과들과유사혹은 일치하는 결과로， 테스트한 4개의 a -syn 항체 중 상기 다른 방법들에서 응집체에 선호적으로 결합하는 항체들인， 3A9, 9B11 및 11F11이 Octet에서도 응집체에만 결합하는 것으로 나타났다. 도 4b는도 4a의 결과를표로나타낸것이다. 도 4a및 도 4b의 결과는 알파-시누클레인 응집체에 선호적으로 결합하는 것을 나타내며， 도 1의 결과와 일치하는 것이다. 비교군으로사용된 #274항체의 경우단량체 및응집체에 모두잘결합하는것으로나타났다. 실시예 3. 항-알파-시누클레인 항체의 세포간 알파-시누클레인 응집체의 전달억제효과분석

알파-시누클레인 응집체의 세포간 전달이 알파-시누클레인 응집체 관련 질환의 한자지 병인으로제시되고 있기 때문에， 이를억제할수 있는 항체는 치료제로서 유용하게 사용될 수 있을 것이다. 이를 위해 BiFC (bimolecular f luorescence complementat ion) 분석을 다음과 같이 수행하였다. BiFC원리는도 5의 상부에 도식적으로나타냈다.

도 5는 본 발명의 일예에서 제조된 단일클론 항체가 알파- 시누클레인의 세포 간 전파 (cel l to cel l transmi ssion)를 억제하는 지를 분석하는원리 (위) 및 실험 결과를나타낸 것이다. 여기서 파란색은핵이며， 초록색은 세포밖으로 나온 알파-시누클레인 이 다른 세포안으로 전파되어 다른알파-시누클레인을만나응집체를만들었� �때의 신호이다.

BiFC분석을위한세포배양

알파-시누클레인과 절반의 Venus 형광단백질 (Venus 1- a Syn(VlS) , a Syn-Venus2(SV2))을 각각 발현하는 SH-SY5Y 인간 뉴로블라스토마 세포주는실험 전까지 종전에 기술된 바와같이 배양되었다 (Lee H-J et al .

J. Neurosci . 2004； 24： 1888-1896) . 실험에 앞서 VIS, SV2를 발현하는 세포 180,000개를 커버슬립 위에 혼합하여 깔아준 뒤 3일간 배양하였다. 계속적인 알파-시누클레인의 세포간이동을확인하기 위하여 ccrcul ture는 매 48시간 마다 sub-culture 되었다. 별도의 실험에서 6 계대 (passage) 정도에서 전달의 정도가 최대임을 확인하였으므로 (데이터 나타내지 않음) , 본 실시예에서 항체의 세포간 전달 억제효능은 6 계대의 co-culture를 이용하여 분석하였다.

₅

BiFC실험/항체 처리

이미징 전날 co-cul ture에 50 y g/ml의 IgG또는테스트항체 (3A9, 9B11, 11F11)를 추가하였다. 각 co-culture에서 나타나는 Venus channel에서의 신호는알파-시누클레인의 응집으로 인한응집체를나타내며， ₁₀ 이는 알파-시누클레인이 한 세포에서 다른 세포로 이동하여 생성된 응집체로간주하였다. 이러한신호는 IN Cel l Analyzer (GE Li fescience)로 자동분석하였다 (기기 설정: puncta si ze: 0.1-0.4 y m, intensi ty: 4000- 7000) . 결과는도 5에 개시되어 있다.

구체적으로， 파란색은 핵, 초록색은 하나의 세포에서 밖으로 나온 ₁₅ 알파-시누클레인이 다른 세포내의 알파-시누클레인을 만나 응집체를 형성하였음을 나타낸다. 오른쪽 그래프는 시그널의 세기를 나타낸 것이다. 9B11, 11F11, 및 3A9 각 처리군에서는 음성대조군인 IgG 대비 초록색 시그널을 나타내는 세포의 개수가 줄어듬을 알 수 있으며， 이는 본원에 따른 항체가 응집체의 세포간 전달을 효과적으로 억제할 수 있음을 2 ₀ 나타내는 것이다. 본원에 따른 항체 9B11, 3A9 및 11F11 처리군에서는 음성대조군인 IgG 대비 초록색 시그널을 나타내는 세포의 개수가 현저히 줄어들었으며， 이는 응집체에 높은 친화도로 특이적으로 결합하는 본원에 따른 항체가 알파-시누클레인의 세포간 전파를 효과적으로 억제할 수 있음을나타내는것이다.

₂₅

실시예 4. 항-알파-시누클레인 항체의 인비보에서 알파-시누클레인 응집체제거 효과분석

본원에서 제조된 알파-시누클레인 항체의 인비보에서 효과를 분석하기 위해, 인간알파-시누클레인을과발현하는형질전환� �쥐 (mThy-1 BO human a -synuclein, UC San Diego)에 10 mg/kg의 본원에 따른 항체 또는 IgG를 3개월 동안 매주 복강 투여하였다. 그룹 당 6마리의 생쥐를 사용하였으며 , 비형질전환 생쥐 (non- transgeni c l i ttermate)를 대조군으로 사용하였다. 이어 관류를다음과같이 수행하였다. 마지막 투여가 완료된 후 뇌 내의 병리 분석을 위하여， 인도적 규정에 의하여 해당 동물들은 chloral hydrate로 마취된 뒤, 0.9 %의 생리식염수로 심장 관류되었다. 이어 관류된 뇌의 반쪽 (saggital section)은 인산완충액 중의 4%파라포름알데하이드 (pH7.4， 4C)에 분석 시점까지 보관하였으며， 다른반쪽은바로냉동상태로보관하였다 (-70C). 병리학적 분석은 다음과 같이 이루어졌다. 파라포름알데하이드에 고정된 뇌 반쪽은 Vibratome을 이용하여 free-floating 방식으로 40 ym 두께의 연속절편으로 잘라내었다. 각 투여군의 뇌 내 알파-시누클레인 의 발현 정도를 확인하기 위해, cortex, striatum, hippocampus를 포함한 절편을 알파-시누클레인 항체 (응집체의 마커인 pl29 a -syn항체， abeam, ab59264 또는 총 알파-시누클레인 항체， Cell Signaling Technology, #2642)와 4°C에서 밤새 배양하였다.또는성상세포 (astrocyte)의 활성 정도, 소교세포 (microglia)의 활성 정도 확인을 위해， 상기 절편을 GFAP(glial fibrillary acidic protein) (AB5804, mi 11 ipore) 혹은 Ibal에 대한 항체 (019-19741， Wako)를 각각 처리하였다. 또한 뇌염증 (neuro inf 1 animation) 정도를 확인하기 위해， IL-6 (NB600-1131, Novus Biologicals) 또는 IL_1|3에 대한 항체 (ab9722, abeam)를 각각 처리하였다. 1차항체와의 배양후에 바이오틴이 결합된 goat anti -rabbit IgG (1:100, Vector Laboratories) 및 Avidin D-horseradish peroxidase (1:200, ABC Elite, Vector Laboratories)를 처리하고

DAB(diaminobenzidine)로 검출하였다. 면역염색된 각 절편은 명시야 현미경으로 관찰하여 광학밀도를 측정하였다. 결과는 도 6a 및 도 6b에 개시되어 있다.도 8a는본 발명의 일예에서 제조된 단일클론 항체가 인간 a-Syn을 과발현하는 마우스 동물모델 (TG)에서 알파-시누클레인 응집체를 제거할 수 있는 지를, 마우스에 항체 투여 후 p-129 a-Syn 항체를 이용하여 마우스 뇌 조직을 염색하여 측정한 결과이다. 도면에서 HP는

Hippocampus이고， p-129 a -syn은 129번째 잔기가 인산화된 형태의 응집체의 마커이며， 화살표는인산화된알파-시누클레인을나타낸� �.

도 6a는 알파-시누클레인 응집체의 마커인 p-129 a-Syn 항체 (Ser 129번에 인산화가 일어난 알파-시누클레인을 인식하는 항체)로 분석한 결과로본원에 따른항체가투여된 TG(TransGenic)마우스는 IgG만투여된 대조군 마우스와 비교하여 cortex 및 hippocampus의 CA1 및 CA3에서 응집체에 양이 현저하게 줄어든 것으로나타났다 (해당부위는 IgG시료에서 화살표 머리로 표시됨) . 이는 본원에 따른 항체가 알파-시누클레인을 현저하게 제거할 수 있음을 나타내는 결과이다. WT 및 IgG는 음성대조군이며， 항체 274는단량체와응집체 모두에 결합하는비교군이다. 이러한 결과는 본원에 따른 항체는 응집체 알파-시누클레인의 축적을 효과적으로 억제할 수 있어， 알파-시누클레인 병인과 관련된 질환의 예방 및/또는치료에 효과적으로사용될수있음을나타낸다.

도 6b는 도 6a와 동일한 실험이나， 마커로서, 총 알파-시누클레인 항체로 염색한 결과이며, 화살표는 인간 알파-시누클레인을 나타낸다. TG mouse에서 증가한 인간 알파-시누클레인 은 항체 투여에 의해 효과적으로 제거되었으다이러한결과는본원에 따른항체가알파-시누클레인응집체를 효과적으로 감소시켜， 파킨슨 질환과 같은 시누클레인병의 치료에 효과적으로사용될 수 있음을 나타내는 것이다. 9B11, 11F4, 11F11항체는 총 알파-시누클레인의 축적을 효과적으로 억제하였다. 총 알파-시누클레인 검출은 본원에 따른 항체가 알파-시누클레인 자체의 제거능 (clear ing) 및 항체의 세포 간 전달 (cel l to cel l transmi ss ion) 억제능이 있음을 나타내는 것이다. 또한 다른 측면에서 단량체의 응집체로의 형성의 억제， 또는단량체를모두제거할수있는것으로해석될 수있다. 실시예 5. 항-알파-시누클레인항체의 Microgl iosis및 Astrogl iosis 감소및염증성사이토카인방출감소효과분석

글리오시스 (gl iosi s)는 BBB의 손상， TGF-베타또는 인터류킨과 같은 물질에 의해 촉발되는， 중추신경계에 손상이 있는경우 이에 대한반응으로 교세포 (gl ial cel l)에서 일어나는 비특이적 반응이다. 대표적인 것으로，

Mi crogl iosi s 및 Astrogl iosi s를 포함하며, 각각 Iba-1 및 GFAP 단백질이 마커로사용된다. 이에 실시예 4에 기술된 바와 같이 본원에 따른 항체를 마우스에 투여하여 Microgl iosi s 및 Astrogl iosi s 감소 및 이를 촉발하는 염증성 사이토카인 방출감소에 미치는영향을분석하였다. 분석 결과는도 7a, 도 7b, 도 7c및도 7d에 개시되어 있다.

도 7a는 본 발명의 일예에서 제조된 단일클론 항체가 인비보 ( in vivo)에서 microgl iosi s를 감소시킬 수 있는지를, 마우스에 항체 투여 후 마커로서 Iba-l(mi crogl iosi s) 항체를 이용하여 마우스의 뇌 조직을 염색으로 측정한 결과이다. 화살표는 활성화된 마이크로글리아를 의미하는 것으로 3A9, 9B11, 11F11 항체를 투여한 쥐의 뇌에서 마이크로글리아 활성화가현저하게 감소되어 있음을알수있다.

도 7b는 본 발명의 일예에서 제조된 단일클론 항체가 인비보에서 astrogl iosi s를 감소시킬 수 있는지를, 마우스에 항체 투여 후 마커로서 GFAP (astrogl iosi s) 항체를 이용하여 마우스의 뇌 조직을염색으로측정한 결과이다. 화살표는활성화된 에스트로사이트를의미하는것으로 3A9, 9B11, 11F11 항체들이 효과적으로 유의한 수준으로 astrogl iosi s를 억제함을 확인할수있었다.

도 7c는 본 발명의 일예에서 단일클론 항체가 인비보에서 염증성 사이토카인을 감소시킬 수 있는지를, 마우스에 항체 투여 후마커로서 IL- 1베타 항체를 이용하여 마우스의 뇌 조직을 염색으로 측정한 결과이다. 화살표는 IL-1베타를발현하고 있는세포를나타낸다. IL-1베타는 염증을 유발하여 다양한신경세포의 사멸 및 염증반응을유도하게 되는데, 본원에 따른 항체를 투여한 쥐의 뇌조직에서 IL-1 베타가 현저하게 감소한 것을 나타낸다.

도 7d는본발명의 일예에 따른단일클론항체가인비보에서 염증성 사이토카인을감소시킬수 있는지를, 마우스에 항체 투여 후마커로서 IL-6 항체를 이용하여 마우스의 뇌 조직을 염색으로 측정한 결과이다. 화살표는 염증성 사이토카인인 IL-6를 발현하는 세포를 나타낸다. 본원에 따른 항체를투여한쥐의 뇌조직에서 IL-6가감소한것을나타낸다.

상기 도면에 나타난 바와 같이 본원에 따른 항체는 대조군과 비교하여， Mi crogl iosi s 및 Astrogl iosis를 감소시키며， 이를 촉발하는 염증성 사이토카인 IL-lbeta및 IL-6의 방출을감소시키는것으로나타났다. 실시예 6. 항-알파-시누클레인 항체의 인간 뇌 조직에서 루이소체 검출분석

10 마이크로미터 두께의 파라핀 포매된 파킨슨 질환으로 사망한 환자의 뇌조직절편을실시예 5에 사용된본원에 따른항체를 이용하여 조직 절편내 루이소체와루이 신경돌기 (neur i te)를다음과같이 염색하였다. 90% 포름산으로조직 절편을 3분간처리하여 ant igen retr ieval을진행한다음, 1% H202 (50% ethanol base)를 이용하여 조직 자체의 peroxidase 활성을 억제하였다. 조직의 non-speci f ic binding을막기 위하여 10% normal horse serum을 처리하였다. 이어 인산완충액으로 세척한 후 본원에 따른 3A9, 11F11 및 11F11 항체를 adj acent sect ion에 4 C에서 밤새 처리하였다. 인산완충액으로 세척 후, 바이오틴이 결합된 ant i-인간 IgG 항체를 37°C에서 30분간 처리한 뒤， avidin-biot in complex를 상온에서 30분간 반응시켰다 (Vectastat in El i te ki t； Vector Laborator ies) . 이어 0.005% H202를 포함한 DAB로 발색하였고， 해당 sect ion을 0.5% cresyl violet으로 카운터 염색하여 각세포를구분하였다. 결과는도 8a및 도 8b에 개시되어 있다.

도 8a및도 8b는각각본발명의 일예에 따른단일클론항체 3A9및 11F11가 인간 뇌조직에서 루이소체 (Lewy body) 및 루이 신경돌기 (Lewy neur i tes)를 특이적으로 인식할 수 있는 지를 각각 측정한 결과이다. 본원에 따른항체가루이소체 (화살표) 및 루이 신경돌기 (왼쪽아래 실 같은 모양)에 결합하는것을나타낸다.

도 8a 및 8b에 나타난 바와 같이 본원에 따른 항체는 루이소체 및 루이 신경돌기에 효과적으로 결합 (화살표로 표시)하는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 인간 뇌조직에 있는 루이소체의 구성 성분인 알파- 시누클레인 응집처 Hᅵ 효과적으로 결합할수 있음을 의미하는 것이다. 인간 뇌로 전달된 항체가 효과적으로 알파-시누클레인 응집체에 특이적으로 결합할 수 있음을 보여주는 것이다. 이러한 결과는 본원의 항체가 실제 인간 뇌조직에 존재하는 알파-시누클레인 응집체와 특이적으로 결합할 수 있음을 나타내는 것으로, 알파-시누클레인 병인과 관련된 질환의 예방 및/또는치료에 효과적으로사용될수있음을나타낸다. 실시예 7.항-알파-시누클레인항체의 에피토프분석

본원에 따른 3A9 및 11F11 항체에 대한 에피토프 맵핑은 PEPSCAN (The Nether lands)에 펩타이드어래이 분석을의뢰하여 수행되었다. 결과는 도 9에 개시되어 있다. 도 9은 본 발명의 일예에 따른 항체의 에피토프 맵핑 결과를도식적으로나타낸것이다.

도 9에 나타난 바와 같이 본원에 따른 항체는 C-말단을 인식하는 것으로 나타났다. 본원에 따른 항체들은 대부분 C-말단 부위에 결합하는 것으로 나타났다. N-말단을 인식하는 알파-시누클레인 항체들은 알파_ 시누클레인 관련 질환을 통칭하는 시누클레인병에 속하는 다계통위축증와 같은다른질병의 응집체는인식하지 못하는반면, C-말단부위를 인식하는 알파-시누클레인 항체들은파킨슨 병뿐아니라기타다양한시누클레인병의 응집체도 인식한다는 장점을 가진다. 특히 앞서 설명한바와 같이 110 122 사이를인식하는경우응집체선호적인결합을나 타냈다 . 실시예 8.항알파-시누클레인 (키메릭)항체의 제조

클로닝

인간화를 진행 후 확보한 중쇄가변영역 및 경쇄가변영역의 항체 nucleot ide 서열을 이용하여， 짧은 단편의 nucleot ide인 gblockOn. biotech)을 합성하였고, 이를 이용하여 동물세포 배양용 벡터 (pcDNA3.4)에 클로닝하였다. 가변영역 앞뒤에 중첩된 nucleot ide를 약 20 bp 정도 포함하여 gblock을 합성하였고， pcDNA3.4 vector의 가변영역을 제외한 부분을 PCR로 증폭 후 준비하여， Gibson assembly 방법으로 클로닝하였다.

Transfection및발현

상기 제조된 벡터를 maxi-prep(Qi agen) 하여， 다량의 plasmid DNA를 확보 후， 다음과 같이 세포에 도입하였다. 형질주입 전날, ExpiCHO™

(Gibco, Cat : A29127)세포를 ExpiCHO™ expression medium (Gibco, Cat : A29100-01) 배지에 3 x 10E6 ~ 4 x 10E6 vi able cel ls/mL농도를맞춘후， 8% C02, 37 t , 120 rpm에서 1일 동안배양하였다. DNA형질주입 당일 7 x 10E6 ~ 10 x 10E6 vi able cel l s/mL, 생존율은 95% 이상으로 자란 세포를 신선한배지를이용하여 6 x 106 vi able cel l s/mL로희석하여 준비하였다. 준비된모세포에 형질주입을위해 Exp i Feet amine™ CH0 transfect ion kit(Gibco, Cat : A29129)를사용하여, Exp i Feet amine™ CH0 & plasmid DNA 복합체를 준비하였다. 차가운 Opt iPR0™SFM® (Gibco, Cat： 12309019) 배지를 각각 분주하여， 적정농도로 준비한 DNA 및 ExpiFectamine™CH0 시약을 각각 접종 후， mix 하여 상온에서 5분간 정치하고, 모세포에 접종하여 형질주입 후 배양을 시작하였다. 형질주입 다음날에는

ExpiFectamine™ CH0 transfect ion ki t에 포함된 enhancer 및 feed를 형질주입 세포에 접종하였고, 5일 후에는 feed를 추가 접종 후， 8% C02, 37 °C , 120 rpm조건에서 10일간배양하여 생산을완료하였다.

생산이 완료된 배양액의 수득을 위해 원심분리용 병에 배양액을 옮기고 4 °C , 6500 rpm 에서 30분간 원심분리 후， 0.2 y m 의 크기인 필터로 필터링을 진행하여， 부유물을 제외한 배양액을 확보하여 이후 정제과정을진행하였다. 항체의 정제

HiTrap MabSelectSure (GE Heal thcare, 11-0034-94)을 사용하여 배양액을 정제하였다. 평형화 버퍼 (50 mM Tr i s-HCl pH7.2, 100 mM NaCl )을 사용하여 평형화 시킨 후， 회수된 배양액을 컬럼에 로딩하였다. 로딩이 완료되면 50 mM Sodium Ci trate pH 5.0으로 중간세척 후, 50 mM Sodium Ci trate pH 3.4를이용하여 용출을하였다. 용출액에 1M Tr i s-HCl pH 9.0을 첨가하여 pH 6.0이 되도록 중화하였다. 이후 용출액을 PBS (phosphate buf fered sal ine, pH 7.4)로 버퍼교환 및 농축하여 사용시까지 4°C에 보관하였다. 추가정제가필요할경우, Hi Load 26/600 superdex 200컬럼에 IX PBS를 버괴로 1차정제분을통과시켜 용출시료의 크기를 바탕으로 2차 정제를수행하였다. 상기 정제된 항체의 아미노산서열을질량분석방법으로 분석하였으며， mouse유래 단일클론항체의 가변영역과 일치함을확인하였다. 상기 방법으로 확인된 3A9, 9B11, 11F11 항체들의 가변영역을 인간 IgGl아이소타입의 backbone가변영역 부분에 치환하여 키메릭 형태의 인간 IgGl 항체를 제작하였다. 상기 엳어진 키메릭 항체 중에서， 특히 ChllFll 항체는 IgG 형태의 항체로서 서열번호 90의 중쇄 가변영역 서열 (chllFll- VH)과서열번호 109의 경쇄 가변영역 서열 (chllFll-VL)의 조합을포함하며， Ch 3A9 항체는 IgG 형태의 항체로서， 서열번호 102의 중쇄 가변영역 서열 (chllFll-VH)과 서열번호 116의 경쇄 가변영역 서열 (chllFll-VL)의 조합을포함한다. 실시예 9： 인간화항체의 제조

라이브러리 파아지 (Library phage)준비

키메릭 항체의 CDR1, CDR2, CDR3 residue에 human framework을 결합시키면서 각 CDR residue에 mouse 혹은 인간 유래 sequence가 도입된 mini 라이브러리를 제작하였다. 해당 라이브러리의 competent cel l을 클로람페니콜 (Sigma, ⑶ 857) 34 y g/ml , 2%글루코스 (Sigma, G5400) 및 5 mM MgCl _{2 (} Sigma，M2393)이 포함된 2X YT [Tryptone (C0NDA, 1612.00) 17g, 이스트 추출물 (C0NDA, 1702.00) 10g， NaCl (Sigma, S7653) 5g] 배지에 접종후, 37°C에서 3시간정도배양하여 0D600 값이 0.5에서 0.7이 되도록 한후, 헬퍼 파아지 (helper phage)를감염시킨후, 클로람페니콜 34 u g/ml , 5 mM MgCl _2, 카나마이신 (Sigma, K1876) 70 p g/ml , 1 mM IPTG (ELPISBI0, IPTG025)를 첨가한 2X YT 배지에서 30 °C , 16시간 동안 배양하여 파아지 패킹을 유도하였다. 이어 배양액을 4500 rpm, 4 ^° C 조건에서 15분 동안 원심분리한후, 상등액에 4% PEG 6000 (Fluka, 81253)과 3% NaCl (Sigma, S7653)을 첨가하여 잘 녹인 후, 얼음에서 1시간 동안 반응시켰다. 이를 다시 4 ^° C 조건에서 8000 rpm , 20분간원심분리한후， 펠렛을 PBS로 현탁한 후, 다시 4 ^° C 조건에서 12000 rpm, 10분간 원심분리 하여 라이브러리 파아지를 포함하는 상등액을수득하여 새 튜브에 넣어 사용시까지 4°C에서 보관하였다. 파아지 디스플레이 패닝 (panning)

구체적으로 면역시험관 (immunotube, maxi sorp 444202)에 10 g/m名 농도의 재조합 알파-시누클레인 응집체를 PBS에 첨가하여 4 ^° C에서 밤새 시험관 표면에 단백질을 흡착시킨 후 우혈청 알부민 (BSA， Bovine serum albumin) 3%용액을시험관에 첨가하여 알파-시누클레인응집체가흡착되지 않은표면을보호하였다. 시험관을비운후 BSA 3%용액에 분산된 10 ¹² CFU의 항체 파지 라이브러리를 알파-시누클레인 단량체 단백질이 흡착되어 있는 면역시험관에 넣고 상온에서 1시간 반응시켰다 (네거티브 선별) . 알파- 시누클레인 단량체에 비결합된 파지들을 회수하여 알파-시누클레인 응집체가 부착된 면역시험관에 상온에서 2시간 결합시켰다. 이어 비특이적으로 결합한 파지를 PBS-K0.05% Tween 20)용액으로 5회 30회 씻어낸 후 남아있는 항원 특이적 파지항체를 100mM 트리에틸아민 용액을 이용하여 회수하였다. 회수된 파지를 1M 트리스 버퍼 (pH 7.4)로 중화시킨 후 ER2537 대장균에 37 ^° C에서 1시간 감염시키고 감염된 대장균을 카베니실린을 함유하는 2X YT 한천배지에 도말하여 37 ^° C에서 밤새 배양하였다. 다음날 배양된 대장균을 4mi의 2X YT 카베니실린 배양액에 현탁하고 15%글리세롤을 첨가하여 일부는 -80°C에 보관하고나머지는다음 라운드의 패닝을 위해 파아지를 제조하였다. 이러한 과정을 총 3라운드 반복하여 항원 특이적인 항체를 증폭시켰다. 패닝 라운드가 진행될수록 PBS-T를 이용한 세척회수를 증가시켜 항원특이적 파지를 증폭 및 농축하였다. 단일클론파아지 항체선별 (single c lone screening)

상기 패닝을 통해 수득한 파아지 풀 (phage pool)로부터 알파- 시누클레인 응집체에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 선별하기 위해 다음과같은실험을수행하였다.

농축된 풀로부터 단일클론을 분리하기 위해, LB- 테트라사이클린/카베니실린 한천배지에 상기 파아지 풀을 도말한 후 5 배양하여 단일 콜로니를 확보하였다. 이어 단일 클론을 웰당 400 의 2 X YT-테트라사이클린/카베니실린 배지가 들어간 96 깊은 웰 플레이트에 접종하여 밤새 키운 후, 배양액 10成를 새로운 390 의 2 X YT- 테트라사이클린/카베니실린 배지가 포함된 96 깊은 웰 플레이트에 넣어 37 ^° C에서 4시간 배양했다. 상기 배양액에 ImM IPTG 되게 넣어 주고 ₁₀ 30°C에서 밤새 배양했다. 밤새 배양한 배양액을 원심분리하여 상등액을 취하였다.

이어 다음과같이 ELISA방법을사용하여 알파-시누클레인 응집체와 결합하는 단일클론 가용성 scFv를 발현하는 클론을 선택하였다 (Steinberger . Rader and Barbas I I I . 2000. Phage di splay vectors . In: ₁₅ Phage Di splay Laboratory Manual lsted. ColdSpr ing Harbor Laboratory Press. NY. USA. pp.11.9-11.12) . 구체적으로 96 웰플레이트에 실시예 1- 1에서 선별된 7B7 항체를 넣고， 4°C에서 밤새 코팅하였다. 3% BSA를 각 웰당 200 u L씩 넣어 37 ^° C에서 2시간 블록킹하였다. 이어 알파-시누클레인 응집체와 단량체를 100ng/wel l의 농도로 각각 로딩 한 후 37°C에서 2시간 ₂₀ 반응시켰다. 이어 PBS-T 300 u L로 5회 세척하였다. 상기 준비된 단일 클론 상등액은 3% BSA와 l: l(vol :vol )로섞은후 이를상기 응집체 및 단량체와 결합시킨플레이트에 100 u L씩 로딩한뒤 37°C에서 2시간반응시켰다. 이어 PBS-T 300 로 5회 세척한 후， 항- HA HRP 결합 항체를 넣고 37°C에서 1시간 반응시킨 후, PBS-T로 5회 세척하였다. TMBCTetramethylbenzidine, ₂₅ Sigma, T0440) lOO y L를 넣어 발색한 후， IN H ₂ S0 _{4 50} 를 넣어 반응을 정지한후， 450nm에서 흡광도를측정하였다. 흡광도가 0.5이상인 클론들을 결합에 의한 양성반응으로 간주하였으며 BSA 비특이적으로 결합하는 클론들은배제시켰다.

- 라이브러리에서 발견된 클론의 CDR residue들은 in si l i co방식으로

₃₀ 분석을 병행하여 framework과의 결합에 심각한 문제가 생기거나 CDR을 제외한 framework 부분에 T-cel 1 epi tope, B cel l epi tope 및 MHCI I epi tope이 존재하지 않는클론을선별하였다.

이후 다음과 같은 중쇄， 경쇄의 가변영역의 조합으로 만들어진 5개 항체에 대해서， 의 인간화 항체의 가변영역을 인간 IgGl 아이소타입의 backbone 가변영역 부분에 치환하여 5개의 IgGl backbone의 인간화항체를 제작하였다. 구체적으로， HullFll_(ABL2-4)는 IgG 형태의 항체로서， 서열번호 92의 중쇄 가변영역 서열 (HullFll-VH2)과 서열번호 113의 경쇄 가변영역 서열 (HullFll-VL4)의 조합을 포함하며, HullFll_(ver .1)는 IgG 형태의 항체로서， 서열번호 98의 중쇄 가변영역 서열 (HullFll-VH-vl)와 서열번호 115의 경쇄 가변영역 서열 (HullFll-VLv3 4c)의 조합을포함하며， HullFll_(ver .2)은 IgG형태의 항체로서 서열번호 99의 중쇄 가변영역 서열 (HullFll-VH-v2) 와 서열번호 115의 경쇄 가변영역 서열 (HullFll_VLv3 4c)의 조합을 포함하며， HullFll_(ver .3)는 IgG 형태의 항체로서 서열번호

100의 중쇄 가변영역 서열 (HullFll-VH-v3)와 서열번호 115의 경쇄 가변영역서열 (HullFll-VLv3 4c)의 조합을포함한다.

HullFll(ver .4)은 서열번호 101의 중쇄 가변영역 서열 (HullFll-VH- v4)와서열번호 115의 경쇄 가변영역서열 (HullFll-VLv3 4c)의 조합임 . 실시예 10. 인간화항체의식세포촉진능분석시험

실시예 8에서 얻어진 키메릭 항체 및 실시예 9에서 얻어진 인간화 항체들인 . hullFlKver .1) , hullFlKver .2) , hullFlKver .3) , hullFll(ver .4) 및 ABL2-4가 미세교세포에 의한 세포 밖 알파-시누클레인 응집체의 식세포 작용을 촉진하는 효능을 평가하기 위하여 식세포 촉진능 분석시험을다음과같이 수행하였다.

구체적으로, 마우스 미세아교세포주인 BV-2 를 RPMI1640 과 10%

FBS로 배양하다가 2X10 6 cel l s/ml의 농도로 준비한 후 U-bottom 96 웰 플레이트에 100 ul씩 분주하였다. 별도의 용기에 알파-시누클레인 응집체 와 실시예 8 및 실시예 9에서 제작된 키메릭 11F11 혹은

HullFll_llFll(ver . l) 혹은 HullFll_llFll (ver .2) 혹은 HullFll_llFll(ver .3) 혹은 HullFll_llFll(ver .4) 혹은 HullFll_ABL2-4 항체들을상온에서 20분간반응시킨 뒤， 해당 mixture를 96 웰 플레이트의 W-2에 첨가 후 15분간 반응하였다. 1,200 rpm으로 5분간 centr i fuge하여 결합하지 않은 알파-시누클레인 응집체와 항체를 제거한 뒤 4% formaldehyde로 세포를 고정시키고 3회 PBS wash 이후 0.5 % tr i ton X- 100으로 세포를 permeabl ize한다. 시누클레인을 인지하는 항체 (Santa Cruz)를 1시간 동안 incubat ion 한뒤 0.1% Tween20이 포함된 PBS로 3회 wash 투 ant i -r abb i t -A 1 exa-488 항체를 1시간 incubat ion하고, wash 후 FACS cal iber로 분석하였다. 실험결과를 도 12a 및 도 12b에 나타내며， 이는본발명의 일예에 따른키메릭 항체 및 인간화항체들의 미세교세포의 알파-시누클레인 응집체에 대한 식세포 작용 촉진능 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 10a는 인간화 11F11 항체에 관한 것이고， 도 10b는 인간화 3A9에 관한것이다.

도 10a 및 도 10b에 나타낸 바와 같이, IgG 대조군 대비 본원에 기재된 키메릭 항체는 약 2배， 인간화 항체들은 BV-2에 의한 알파- 시누클레인 응집체의 uptake를 4배까지 증가시켰다. 이 중 11F11의 인간화 항체 var i ant들, 즉 HullFll_ABL2-4 (HullFll_VH2와 HullFll_VL4의 조합) , HullFll_ver . l(HullFll-VH-vl 와 HullFll-VLv3 4c의 조합)， HullFll_(ver .2)(HullFll-VH-v2 와 HullFll-VLv3 4c의 조합)은 키메릭 11F11 항체대비 BV-2의 식세포 촉진 능력이 탁월하였다. HullFll_ver .3)(HullFll-VH-v3 와 HullFll_VLv3 4c의 조합) , hullFll(ver .4)(HullFll-VH-v4와 HullFll-YLv3 4c)은 키메릭 11F11 항체와 유사한식세포촉진능을보였다. 실시예 11: Fibri l binding assay

알파-시누클레인 응집체가 세포 간 전파를 통하여 이웃 신경세포로 전염되는 현상의 전초 단계인 신경세포 결합을 억제하는 항체의 효능을 분석하기 위하여 f ibr i l binding assay를수행하였다.

구체적으로， 신경세포주인 SH-SY5Y세포에 알파-시누클레인응집체를 luM, 키메릭 11F11 항체， 인간화 11F11 var i ant , 즉 HullFll_verl, HullFll_ver2, HullFll_ver3, HullFll_ver4, HullFll_ABL2-4를 각 20 nM 으로 10분간처리한 뒤 세포를 4% formaldehyde로고정하였다. Wash이후 non-permeable 조건에서 모든 형태의 알파-시누클레인을 인지하는 알파- 시누클레인 항체 (BD)를 1:250으로 처리한 뒤 wash하고 confocal microscope으로 이미징하였다. 이미징 직전에 DAPI를 처리하여 세포 핵을 나타내었다.

그 결과， 본원의 항체들은 IgG 대조군 대비 알파-시누클레인 응집체의 세포막 결합 정도를 효과적으로 감소시켰으며, 특히 11F11의 인간화 항체들은 11F11 키메릭 항체 대비 유사하거나 더 효율적으로 결합 정도를감소시켰다. 도 11은본발명의 일예에 따른키메릭 항체 및 인간화 항체들이 알파-시누클레인 응집체의 신경세포 표면에의 결합을 저해하는 능력에 관한분석 결과이다 _.

도 11에 나타낸바와같이， 본원의 항체들은 1成대조군 대비 알파- 시누클레인 응집체의 세포막 결합 정도를 최대 23배까지 효과적으로 감소시켰으며， 특히 11犯1의 인간화 항체들은 11 1 키메릭 항체 대비 유사하거나 더 효율적으로 결합 정도를 감소시켰다.

항체 대비 우수한 효능을 보였으며， 새 -4 （ 1 11 - \¾2와 恥1 11- 4의 조합）， 血11 11（八 .2）（加1 11-쌔12 와 此1正11 - \0方3 4。의 조합）은 키메릭 1^11항체와유사한감소능을보였다. 실시예 12 : Dual chamber assay

본 발명에 따른 인간화 항체가 알파-시누클레인 응집체의 세포 간 전파를 억제하는 효능을 보다 직접적으로 분석하기 위하여 dual chamber assay를 수행하였다. permeable membrane이 있는 insert에 알파- 시누클레인을과발현하는 SH-SY5Y세포 （donor cel l）를， 정상 SH-SY5Y세포 （recipient cel l）를 12 웰 플레이트 안의 covers 1 ip 위에 각각 plat ing한 뒤 알파-시누클레인 과발현 세포주가 배양된 insert를 위에 올려 겹쳐 overnight 동안배양하였다. 동시에 recipient 세포쪽에 본원의 항체를 20 nM 처리하였다. 이후 4% formaldehyde로 recipient 세포를 고정하고 wash 한 뒤 0.5% TrtonX-100을 처리하여 permeable condi t ion을 만들었다. Wash 후 실시예 14와 동일한 detect ion 항체 및 DAPI를 처리하고 confocal mi croscope로이미징하였다. 상기 분석된이미지는도 12에 나타냈다.

그 결과， 본 발명에 따른 인간화 항체들은 IgG 대초군 대비 알파- 시누클레인 응집체의 recipi ent 세포로의 전파 정도를 효과적으로 감소시켰으며， 특히 11F11의 인간화 항체들은 11F11 키메릭 항체 대비 유사하거나 더 효율적으로 알파-시누클레인 응집체의 recipient 세포로의 전파를감소시켰다.

도 12는 본 발명의 일예에 따른 키메릭 항체 및 인간화 항체들이 알파-시누클레인을 과발현하는 신경세포에서 분비되어 정상 신경세포로 알파-시누클레인 응집체가 이동하는 세포 간 전파를 억제하는 효능 분석 결과이다. top chamber에 pl at ing된 알파-시누클레인 과발현 SH-SY5Y신경 세포주는 알파-시누클레인을 세포 밖으로 분비하며, 이는 아래의 12 웰 플레이트에 pl at ing된 정상 SH-SY5Y 세포주로 전달된다. 당사의 항체들은 IgG 대조군 대비 아래 플레이트의 정상 SH-SY5Y 세포주 내로 유입되는 알파-시누클레인의 양을현저히 감소시켰다. 특히 본원의 인간화항체들중 11F11 클론의 인간화 항체들은 키메릭 항체 대비 아래 플레이트의 recipi ent 세포내로 알파-시누클레인유입의 감소정도를더욱증가시키는 것으로 확인되었다. 보다 구체적으로 hullFll（ver .2）（HullFll-VH-v2 와 HullFll-VLv3 4c의 조합）， hullFlKver 4）（HullFll-VH-v4 와 HullFll_VLv3 4c의 조합）은키메릭 항체 대비 우수한억제능을, hullFlKver . lKHullFll-

VH-vl 와 HullFll-VLv3 4c의 조합）， hullFlKver .3）（HullFll-VH-v3 와 HullFll-VLv3 4c의 조합）은키메릭 항체와유사한억제능을보였다.

IgG대조군대비 알파-시누클레인응집체의 전파정도를약 22배까지 효과적으로 감소시켰으며, 특히 11F11의 인간화 항체들은 11F11 키메릭 항체 대비 유사하거나 더 효율적으로 알파-시누클레인 응집체의 recipient 세포로의 전파를감소시켰다. 실시예 13. 인간화항체의 ELISA분석시험

상기 실시예 2-2와 실질적으로 동일한 방법으로， 실시예 8에서 얻어진 키메릭 항체 및 실시예 9에서 얻어진 인간화 항체들의 결합력을 정량적으로분석하기 위하여 sandwi ch ELISA를수행하였다.

구체적으로， 각각 항체들을 0.04-400이의 농도로 1/10씩 희석하여 96웰 플레이트에 코팅한 뒤， 여기에 2000 ng/ml의 응집체를 각 웰에 처리하였다. 1XPBS로 세척 후 이어 바이오틴이 결합된 capture 항체 및 HRP가 결합된 스트렙타빈을 처리한 뒤 기질로서 TMB와 반응시킨 뒤 그 흡광도를측정하였다. 결과는도 13에 기재되어 있다.

도 13에 나타낸 것과 같이， 본 발명에 다른 인간화된 항체들， 특히 키메릭 11F11에서 유래된 인간화 항체（인간화 11F11 항체）들은 키메릭 11F11 클론과동등한 결합력을 보이는 것으로 확인되었다. 인간화항체들， 특히 11F11 유래 var i ant들인, hullFlKver .1） , 즉 HullFll-VH-vl 와

HullFll-VLv3 4c의 조합, hullFlKver .2） , 즉 HullFll-VH-v2 와 HullFll- VLv3 4c의 조합， hullFlKver .3）, 즉 HullFll-VH-v3 와 HullFll-VLv3 4c의 조합， hullFlKver .4）, 즉 HullFll-VH-v4 와 HullFll-VLv3 4c 은 키메릭 1 11클론과유사한결합력을보이는것으로확인되� ��으며， 그 ₅₀ 는 11.5 15.1虛로， 키메릭 1내11항체의此 ₅₀ 인 12.5이와유사한값을보였다. 실시예 14: 항알파-시누클레인항체를이용한이此이 분석

상기 실시예 2-3과 실질적으로 동일한 방법으로， 실시예 8에서 얻어진 키메릭 항체 및 실시예 9에서 얻어진 인간화 항체들의 결합력을 이쇼(： ₀ ^를 사용하여 정량적으로 분석하였다. 상기 분석 결과를 도 14와 하기 표에 나타낸다.

[표 10]

그결과， 본원에 기재된 인간화항체들， 특히 11F11의 var iant들， 즉, hullFll(ver .2)(HullFll-VH-v2 와 HullFll-VLv3 4c의 조합)， hullFll(ver .3)(HullFll-VH-v3 와 HullFll-VLv3 4c의 조합)， hullFll(ver .4)(HullFll-VH-v4 와 HullFll-VLv3 4c) 은 키메릭 11F11 클론과 유사한 KD 값을 보이는 것으로 확인되었으며, 그 결합 정도로는 인간화클론들이 0.02 0.06 X 10 ^-9 M의 KD, 키메릭 11F11클론이 0.02 X 10一 ⁹ M의 낮은 KD값， 즉응집체에 대한높은결합력을보였다. 실시예 15. 인간화항체의 생산성 평가

11F11 키메릭 항체 및 11F11의 인간화 항체 var iant

4종 (HullFll(ver . l) , HullFlKver .2) , HullFlKver .3) , HullFll(ver .4))을 실시예 8에 기재된 대로 transfect ion및 배양, 1차및 2차정제까지 완료 후최종적으로정제된시료의 항체량및순도를분석하였다.

항체량은 Thermo Sci ent i f i c™ NanoDrop™ spectrophotometer을 이용하여 측정하였는데， 먼저 1XPBS를 loading하여 영점을 확정한 뒤 일정량의 정제 시료를 loading 하고 단백질 정량에 사용되는 280 nm의 UV 파장에서 시료를측정하였다. NanoDrop™에서 확인된 시료의 농도를시료의 총 부피와 곱하여 총 수득량을 구하는 동시에， 총 수득량을 총 부피로 나누어 생산성 (yield (g/U)를도출하였다.최종정제산물의 순도는 HLC- OOKAgilent 1200 series)HPLC 로 분석하였는데， TSK gel G3000SWXL 에사 IX PBS, 200mM Arginine-HCl (pH 6.8)의 mobile phase를 사용하여 그 main peak의 비율을정량하였다.상기 생산성 분석 결과를하기 표에 나타냈다.

[표 11]

그 결과, 키메릭 11F11 항체 및 11F11의 인간화 variant들인 hullFll(ver.l), 즉 hullFlKver .1) (HullFll-VH-vl 와 HullFll-VLv3 4c의 조합)， hullFll(ver.2)(HullFll-VH-v2 와 HullFll_VLv3 4c의 조합)， hullFlKver .3) (HullFll-VH-v3 와 HullFll-VLv3 4c의 조합)， hullFll(ver.4)(HullFll-VH-v4 와 HullFll-VLv3 4c)의 생산성은 0.068 - 0.423 g/L로서 transient transfect ion으로 생산되는 통상의 항체 생산 수율보다우수하였다.특히 hullFlKver.2), 즉 HullFll-VH-v2와 HullFll- VLv3 4c의 조합은 0.423 g/L의 생산성을보여줌으로서 키메릭 11F11항체의 0.282 g/L보다높은생산성을보여주었다. 실시예 16.키메릭항체의 알파-시누클레인특이적 결합평가 키메릭 항체 3A9, 9B11, 11F11 3종을실시예 8에 따라생산후해당 항체들의 알파-시누클레인의 결합 특이성을 그 호몰로그인 베타-, 감마_ 시누클레인과의 ELISA과비교하였다.

이를위해 인간베타-시누클레인 (Uniprot: Q16143)단백질 (CUSABI0, Cat： CSB-EP624090HU) , 혹은 인간 감마-시누클레인 (Uniprot: 076070) 단백질 (CUSABI0, Cat： C況- EP021915HU)을 각각 100 / 의 농도로 96웰 플레이트에 코팅한 후, wash 한 다음에 5% BSA로 2시간 동안 blocking 하였다.이 때 알파， 베타， 감마-시누클레인에 모두결합하는 pan-Syn항체 (santacruz , Cat : FL-140 , sc-10717 , rabbi t )를 양성 대조군으로 사용하였다. Wash 후, 여기에 400 nM에서 0.04 이까지 1/10씩 희석된 키메릭 항체 (3A9 , 9B11 , 11F11)를 2시간동안처리한후， PBS로세척하고， 이어 goat ant i-hFc항체에 HRP가 결합된 detect ion 항체를 처리한 후 기질로서 TMB와 반응한 후 450nm, 650nra에서 흡광도를 측정하였고， 양성 대조군의 경우 detect ion항체로 goat ant i -rabbi t 항체에 HRP가 결합된 항체를사용하였다 _.

실험결과를 도 15a 및 도 15b에 나타내며， 이는 본 발명의 일예에 따른 키메릭 항체들 (3A9, 9B11, 11F11)의 인간 베타-시누클레인 및 인간 감마-시누클레인에 대한매우낮은결합력을 ELISA로분석한결과를나타낸 것이다. 이와 반대로 양성 대조군인 pan-Syn 항체는 베타- 및 감마- 시누클레인에 대하여 높은 결합력을 나타냈다. 도 15a는 인간 베타- 시누클레인에 관한것이고, 도 15b는인간감마-시누클레인에 관한것이다. 또한상기 3가지 항체를 아밀로이드 베타 _{H2 (} Uniprot： P05067； CAS number : 107761-42-2) 및 타우 (Uniport : P10636-8) 단백질로 만들어진 응집체와 닷블롯으로 반응시켜 해당 항체들의 알파-시누클레인 응집체에 대한 특이적인 결합력을 분석하였다. 그 이유는 다음과 같다. 아밀로이드 베타 1-42 및 타우는 응집체를 형성하여 퇴행성 신경질환， 특히 알츠하이머병에 중요한 병인으로 생각되며， 해당 응집체는 알파- 시누클레인의 응집체와 유사하게 올리고머， 프로토피브릴, 피브릴 등의 구조를 가진다고 알려져 있다. 따라서 해당 닷블롯은 키메릭 항체 3A9, 9B11, 11F11들이 알파-시누클레인의 특이적인 시퀀스를 인식하고 알파- 시누클레인， 아밀로이드 베타, 타우 유래 응집체가 응집체로서 가지는 공통적인구조를인식하지 않는것을확인하기 위한것이다.

본 실시예의 닷블롯 방법은 상기 실시예 2-3과 실질적으로 동일한 방법으로， 수행되었으며， recombinant 아밀로이드 베타 및 타우 단백질 및 이에 대한응집체는서울대학교 이승재 교수 lab에서 제조되었다. Syn-1, 6E10, Tau5는 각각 알파-시누클레인, 아밀로이드 베타 ， 타우 단백질에 결합하는것으로알려진항체들이다. 분석 결과는도 15c에 기재되었다. 실험결과를 도 15c에 나타내며， 이는 본원의 키메릭 항체들인 3A9 , 에 11 , 11F11이 알파-시누클레인 유래 응집체에만 특이적으로 결합하며, 아밀로이드 베타 및 타우 유래 응집체에는 결합하지 않음을 보여준 결과이다 _. 이와 상이하게 아밀로이드 베타 및 타우에 각각 결합하는 2019/098763 1»（：1^1{2018/014123

것으로알려진 6射0및 1 _&115 항체는닷블롯상에서 해당응집체에 결합함을 보여주었다.

상기의 결과에 따라, 해당 키메릭 항체들이 알파-시누클레인의 호몰로그및 상이한단백질유래 응집체에 결합하지 않음은， 해당항체들이 타겟 단백질에만 효율적으로 결합하여 호몰로그 및 상이한 단백질 유래 응집체에 결합하는 항체 혹은 약물 대비 그 효능이 뛰어날 수 있음을 시사한다.

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