BALB/cマウスに抗原として酸化LDL/β ₂ GPI複合体を免疫して得られたモノクローナル 抗体の、固相抗原に対する反応性を示す図で ある。ヨコ軸は抗体濃度、縦軸には吸光度を 示す。 液中の抗原との競合性をアッセイ(競合 阻害試験)するための模式図である。 抗原による競合阻害試験を示すグラフである 。ヨコ軸は液中の抗原濃度、縦軸には阻害抗 原が存在しない場合の吸光度を100%としたと� �の阻害された%を示す。3H3、および4C12は、酸 化LDLに結合したβ ₂ GPIを認識する抗体で、遊離のβ ₂ GPIを認識していない。一方、2H6、3D4、2A12は� �遊離のβ ₂ GPIに反応する抗体である。 動脈硬化好発モデルマウス(高脂肪食を負荷� �たapoE ^-/- )の大動脈弁の免疫蛍光染色写真である。A)DAP I:核の染色、B)Mac3:マクロファージに特異的抗 体、C)3H3抗体、D)control。C57BL6系統のマウスを� ��通飼料で飼育したものに対し、3H3抗体。Mac3 を用いる免疫蛍光染色では、泡沫化マクロフ ァージが集族してできた粥腫が染まっている 。3H3によっても同様な部位が染まっている。 動脈硬化好発モデルマウス(高脂肪食を負荷� �たapoE ^-/- )の大動脈弁の免疫蛍光染色写真である。酸� �LDL/β ₂ GPI複合体抗体を用いた他の抗体の蛍光免疫染 色の結果を示す。粥腫の染色陽性例は、3H3お よび抗体Aのみである。 IVIS 200による特異抗体を用いた蛍光イ� ��ージング(反射蛍光観察)写真である。in vivo :高脂肪食6ヵ月以上負荷したApoE-/-マウスに、 イメージング剤を、脂肪食負荷ApoE-/-マウス� �尾静脈より投与し、2~24時間後に、IVIS 200に� ��麻酔吸入下でin vivo蛍光を観察・撮影した� �その際ApoE-/-マウスでは黒い体毛が蛍光を吸� ��するため体毛を剃って観察した。 ex vivo:� �ウスを安楽死させ、開胸して心臓と大動脈� �露出させ、右心耳に小さく切り込みを入れ� �後、左心室に針を挿入して冷PBS 10 mlで心灌 流し、心臓および大動脈を摘出して、IVIS 200 により反射蛍光画像を得た。 IVIS200によるイメージング写真である(Excitation :640 nm, Emission:720 nm.)。実験1:高脂肪食負荷ap oE ^-/- マウスに生理食塩水(PBS、対照)、Cy5.5標識抗� �A、Cy5.5標識3H3抗体を尾静脈より投与。24時間 後に胸部皮膚を剥がし、生きた状態で全身を 撮影。更に胸部大動脈が繋がった状態で心臓 を摘出して撮影。実験2:PBS、Cy5.5標識2A12抗体� ��Cy5.5標識3H3抗体投与マウスから摘出した心� �と胸部大動脈。3H3投与で大動脈起始部が強� �染まる。抗体Aでも幾分染まるが3H3の場合ほ� ��蛍光強度は強くない。2A12では全く染まらな い。 特異抗体を用いた動脈硬化の3次元画像 イメージング写真である。(A) IVIS 200による� ��異抗体を用いた蛍光イメージング(反射)、(B ) IVIS200による透過光 3D 画像(左図)と統合前 のCT-3D像(中央)と統合後の3D画像(右図)、(C) IV ISによる蛍光シグナルと3次元CTの統合画像で� ��る。 統合前のIVIS 200による蛍光3次元画像(� �段:A)及びIVIS 200による蛍光シグナルと3次元C Tの統合画像(下段:B)の写真である。 IVIS200で測定した際の大動脈起始部周� �のCy5.5に依存する蛍光量を示す図である。大 動脈起始部の一定面積あたりの蛍光強度を測 定した。PBSを投与した対照マウスの蛍光を1.O とした。3H3投与で、対照の3倍程度の蛍光が� �認されたその他の抗体投与では蛍光強度に� �きな変化は見られなかった。 3H3抗体アミノ酸配列図である。各CDRを 下線で示した。

[発明の実施の形態]
 本発明は、酸化変性LDL(酸化LDL)とβ ₂ -グリコプロテインIの複合体(酸化LDL/β ₂ GPI複合体)に結合する抗体を提供する。動脈� �化巣で酸化LDLと血漿糖タンパク質であるβ ₂ GPIとの複合体が形成される。本願発明に包含 される抗体は、この複合体に結合することを 特徴とする。

 本願発明に包含される抗体としては、具体� ��には以下の抗体が挙げられるが、これらに� ��定されるものではない。
(a)CDR1として配列番号:2に記載のアミノ酸配列 、CDR2として配列番号:3に記載アミノ酸配列、 及びCDR3として配列番号:4に記載のアミノ酸配 列を有する重鎖を含む抗体、
(b)重鎖可変領域として配列番号:1に記載のア� ��ノ酸配列を有する重鎖を含む抗体、
(c)CDR1として配列番号:7に記載のアミノ酸配列 、CDR2として配列番号:8に記載アミノ酸配列、 及びCDR3として配列番号:9に記載のアミノ酸配 列を有する軽鎖を含む抗体、
(d)軽鎖可変領域として配列番号:6に記載のア� ��ノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体、
(e)上記(a)または(b)に記載の重鎖、および、上 記(c)または(d)に記載の軽鎖の対を有する抗体 。

 また本発明は、酸化LDLとβ ₂ -グリコプロテインIの複合体(酸化LDL/β ₂ GPI複合体)に結合する本願発明の抗体が結合� �るエピトープと同じエピトープに結合する� �体も提供する。この抗体は、酸化LDLと複合� �を形成している酸化LDL/β ₂ GPI分子上の特定のエピトープを認識する。
 この限りではないが、例えばある抗体が他� ��抗体と同じエピトープを認識するか否かは� ��両者のエピトープに対する競合によって確� ��することができる。抗体間の競合は、競合� ��合アッセイによって評価することができ、� ��の手段としてELISA、蛍光エネルギー転移測� �法(FRET)や蛍光微量測定技術(FMAT(登録商標))な どが挙げられる。抗原に結合した該抗体の量 は、同じエピトープへの結合に対して競合す る候補競合抗体(被検抗体)の結合能に間接的� ��相関している。すなわち、同じエピトープ� ��対する被検抗体の量や親和性が大きくなる� ��ど、該抗体の抗原への結合量は低下し、抗� ��への被検抗体の結合量は増加する。具体的� ��は、抗原に対し、適当な標識をした該抗体� ��評価すべき抗体を同時に添加し、標識を利� ��して結合している該抗体を検出する。抗原� ��結合した該抗体量は、該抗体を予め標識し� ��おくことで、容易に測定できる。この標識� ��特には制限されないが、手法に応じた標識� ��法を選択する。標識方法は、具体的には蛍� ��標識、放射標識、酵素標識などが挙げられ� ��。

 ここでいう「同じエピトープを認識する抗� ��」とは、標識該抗体に対して、非標識の該� ��体の結合により結合量を50%低下させる濃度( IC ₅₀ )に対して、被検抗体が非標識該抗体のIC ₅₀ の通常、100倍、好ましくは80倍、さらに好ま� ��くは50倍、さらに好ましくは30倍、より好ま しくは10倍高い濃度で少なくとも50%、標識該� ��体の結合量を低下させることができる抗体� ��ある。

 本発明の抗体には、ポリクローナル抗体� ��よびモノクローナル抗体の両方が含まれる� ��モノクローナル抗体およびポリクローナル� ��体の調製および精製方法は、当分野で知ら� ��ており、例えば Harlow and Lane, Antibodies: A� �Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Labo ratory Press, 1988)に記載されている。

 本発明の抗体には、ヒト化(humanized)抗体� �たはキメラ(chimeric)抗体などの組換え抗体も� ��まれる。「ヒト化抗体」とは、ヒトの抗体� ��構造を類似させた抗体のことをいう。この� ��うなヒト化抗体またはキメラ抗体には、ヒ� ��型キメラ抗体(例えば抗体の一部がヒト化さ れた抗体、CH2領域がヒト化された抗体、Fc領� ��がヒト化された抗体、定常領域がヒト化さ� ��た抗体)、及び定常領域及び可変領域に存在 するCDR(相補性決定領域)以外の部分がヒト化� ��れたヒト型CDR移植(CDR-grafted)抗体(P.T.Johons et  al., Nature 321,522(1986))、完全ヒト化抗体など が含まれる。ヒト型CDR移植抗体の抗原結合活 性を高めるため、マウス抗体と相同性の高い ヒト抗体FRを選択する方法、相同性の高いヒ� ��化抗体を作製する方法、ヒト抗体にマウスC DRを移植した後さらにFRのアミノ酸を置換す� �方法の改良技術もすでに開発され(米国特許� ��5585089号、米国特許第5693761号、米国特許第56 93762号、米国特許第6180370号、欧州特許第451216 号、欧州特許第682040号、特許第2828340号など� �参照)、本発明のヒト型CDR移植抗体の作製に� ��用することもできる。

 ヒト型キメラ抗体は例えば、上記のH鎖可 変領域の構造及び/又はL鎖可変領域の構造を� ��する抗体の定常領域をヒト抗体の定常領域� ��置換することにより作製することができる� ��ヒト抗体の定常領域としては公知のものを� ��用することができる。以下に、ヒト型キメ� ��抗体の作製方法の一例を示す。

 まず、特定の対象抗原に対するマウス抗� ��を産生するハイブリドーマよりmRNAを抽出し 、常法に従ってcDNAを合成する。合成したcDNA� ��ベクターに組み込みcDNAライブラリーを構築 する。このcDNAライブラリーから、H鎖遺伝子� ��ラグメント及びL鎖遺伝子フラグメントをプ ローブとして用いることにより、H鎖遺伝子� �びL鎖遺伝子を含有するベクターを選択する� ��選択されたベクターの挿入配列のシークエ� ��シングを行うことにより、H鎖可変領域及び L鎖可変領域の遺伝子の配列が決定される。� �のようにして得られた配列データを基にH鎖� ��変領域をコードするDNAを化学合成、生化学� ��切断/再結合等により作製する。得られたH� �可変領域をコードするDNAを、ヒトH鎖定常領� ��をコードするDNAとライゲーションして発現� ��ベクターに組込むことによりH鎖発現ベクタ ーを作製する。発現ベクターとしては例えば SV40 virus basedベクター、EB virus basedベクタ� �、BPV(パピローマウイルス)basedベクターなど� ��用いることができるが、これらに限定され� ��ものではない。一方、同様の方法によりL鎖 発現ベクターを作製する。これらH鎖発現ベ� �ター及びL鎖発現ベクターにより宿主細胞を� ��形質転換する。宿主細胞としてはCHO細胞(チ ャイニーズハムスター卵巣)(A.Wright & S.L.M orrison, J.Immunol.160, 3393-3402 (1998))、SP2/0細胞(� ��ウスミエローマ)(K.Motmans et al., Eur.J.Cancer  Prev.5,512-519 (1996),R.P.Junghans et al., Cancer Res.5 0,1495-1502 (1990))などが好適に用いられる。ま� ��、形質転換にはリポフェクチン法(R.W.Malone  et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,6077 (1989), P.L.Felgne r et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84,7413 (1987))、エ� ��クトロポレーション法、リン酸カルシウム� ��(F.L.Graham & A.J.van der Eb,Virology 52,456-467( 1973))、DEAE-Dextran法等が好適に用いられる。

 形質転換体を培養した後、形質転換体の� ��胞内又は培養液よりヒト型キメラ抗体を分� ��する。抗体の分離、精製には、遠心分離、� ��安分画、塩析、限外濾過、アフィニティー� ��ロマトグラフィー、イオン交換クロマトグ� ��フィー、ゲル濾過クロマトグラフィーなど� ��方法を適宜組み合わせて利用することがで� ��る。

 一方、ヒト型CDR移植抗体は例えば以下の� ��法により作製することができる。まず、上� ��キメラ抗体の製造方法の欄で述べた方法に� ��り、特定の抗原に対する抗体のH鎖可変領域 及びL鎖可変領域のアミノ酸配列及びそれを� �ードする塩基配列を決定する。併せて各CDR� �域のアミノ酸配列及び塩基配列を決定する� �

 次に、CDR領域を挟んで存在するFR(フレー� ��ワーク領域)を選択する。FRの選択には、お� ��そ三つの方法が採用できる。1つめの方法は 、NEWM、REIなど既に三次元構造の明らかとな� �たヒト抗体フレームを用いる方法である(Riec hmann L. et al., Nature 332, 323-3Z7 (1988); Tempst,  PR. et al., Protein Engineering 7, 1501-1507 (1994) ; Ellis JH. etal., J. Immunol 155, 925-937 (1995))� �2つめの方法は、目的のマウス抗体可変領域� ��最も高いホモロジーを持つヒト抗体可変領� ��をデータベースより選択し、そのFRを用い� �方法である(Queen C. et al., Proc Natl Acad SciU SA 86, 10029-10033 (1989); Rozak MJ. et al., J Biol  Chem 271, 22611-22618 (1996); Shearman CW. et al.,� �J.Immunol 147, 4366-4373 (1991))。3つめの方法は� �ヒト抗体のFRで最も共通に用いられるアミノ 酸を選択する方法である(Sato K. et al., Mol I mmunol 31, 371-381 (1994); Kobinger F. et al., Prote in Engineering 6, 971-980 (1993); Kettleborough CA. e t al., Protein Engineering 4, 773-783 (1991))。本発 明ではこれらいずれの方法を用いることもで きる。

 尚、選択されたヒトFRのアミノ酸配列を� �変したアミノ酸配列であっても、最終的に� �られるヒト型CDR移植抗体が対象抗原に対す� �特異的結合性を有する限り、FRのアミノ酸配 列として利用することができる。特に、選択 されたヒトFRのアミノ酸の一部をCDRの由来と� ��った抗体のFRのアミノ酸に変更した場合、� �体の特性が維持される可能性が高い。改変� �れるアミノ酸の数は好ましくはFR全体の30%以 下であり、更に好ましくはFR全体の20%以下で� ��り、更に好ましくはFR全体の10%以下である� �

 次に、これらいずれかの方法により選択� ��たFRと上記CDRとを組み合わせることによりH� ��可変領域及びL鎖可変領域をコードするDNAを 設計する。この設計を基にH鎖可変領域をコ� �ドするDNAとL鎖可変領域をコードするDNAを化� ��合成、生化学的切断/再結合等によりそれぞ れ作製する。そしてH鎖可変領域をコードす� �DNAを、ヒト免疫グロブリンH鎖定常領域をコ� ��ドするDNAとともに発現ベクターに組み込みH 鎖発現ベクターを構築する。同様に、L鎖可� �領域をコードするDNAを、ヒト免疫グロブリ� �L鎖定常領域をコードするDNAとともに発現ベ� ��ターに組み込みL鎖発現ベクターを構築する 。発現ベクターとしては例えばSV40 virus based ベクター、EB virus basedベクター、BPV(パピロ� ��マウイルス)basedベクターなどを用いること� ��できるが、これらに限定されるものではな� ��。

 以上の方法で作製されたH鎖発現ベクター 及びL鎖発現ベクターにより宿主細胞を共形� �転換する。宿主細胞としてはCHO細胞(チャイ� ��ーズハムスター卵巣)(A.Wright& S.L.Morrison,� �J.Immunol.160, 3393-3402 (1998))、SP2/0細胞(マウス� ��エローマ)(K.Motmans et al., Eur.J.Cancer Prev.5,51 2-519 (1996),R.P.Junghans et al.,Cancer Res.50,1495-1502  (1990))などが好適に用いられる。また、形質 転換にはリポフェクチン法(R.W.Malone et al.,Pro c.Natl.Acad.Sci.USA 86,6077 (1989), P.L.Felgner et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84,7413 (1987))、エレクトロ� �レーション法、リン酸カルシウム法(F.L.Graham  & A.J.van der Eb,Virology 52,456-467(1973))、DEAE -Dextran法等が好適に用いられる。

 形質転換体を培養した後、形質転換体の� ��胞内又は培養液よりヒト型CDR移植抗体を分� ��する。抗体の分離、精製は、遠心分離、硫� ��分画、塩析、限外濾過、アフィニティーク� ��マトグラフィー、イオン交換クロマトグラ� ��ィー、ゲル濾過クロマトグラフィーなどの� ��法を適宜組み合わせて行うことができる。

 また、ヒト抗体の取得方法も知られてい� ��。例えば、ヒトリンパ球をin vitroで所望の� ��原または所望の抗原を発現する細胞で感作� ��、感作リンパ球をヒトミエローマ細胞、例� ��ばU266と融合させ、抗原への結合活性を有す る所望のヒト抗体を得ることもできる(特公� �1-59878参照)。また、ヒト抗体遺伝子の全ての レパートリーを有するトランスジェニック動 物を所望の抗原で免疫することで所望のヒト 抗体を取得することができる(国際特許出願� �開番号WO 93/12227, WO 92/03918,WO 94/02602, WO 94/ 25585,WO 96/34096, WO 96/33735参照)。

 更なる実施態様では、抗体又は抗体断片� ��、McCafferty等(Nature, 348:552-554 (1990))に記載さ れた技術を使用して産生される抗体ファージ ライブラリーから分離することができる。Cla ckson等(Nature, 352:624-628 (1991))及び Marks等(J. M ol. Biol., 222:581-597 (1991))は、ファージライブ ラリーを使用したマウス及びヒト抗体の分離 を記述している。続く刊行物は、鎖シャフリ ングによる高親和性(nM範囲)のヒト抗体の生� �(Marks等, Bio/Technology, 10:779-783[1992])、並びに� ��常に大きなファージライブラリーを構築す� ��ための方策としてコンビナトリアル感染と� ��ンビボ組換え(Waterhouse等, Nuc. Acids. Res., 21 :2265-2266[1993])を記述している。従って、これ� ��の技術はモノクローナル抗体の分離に対す� ��伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドー� ��法に対する実行可能な別法である。

 この点において、バクテリオファージ(フ ァージ)ディスプレイは、大きなオリゴペプ� �ドライブラリーを検索して、ポリペプチド� �的に特異的に結合する能力のあるこれらラ� �ブラリーのメンバーを同定することを可能� �するよく知られた技術の一つである。ファ� �ジディスプレイは、様々なポリペプチドが� �クテリオファージ粒子の表面上のコートタ� �パク質に融合タンパク質として提示される� �とによる技術である(Scott,J.K.及びSmith G. P.  (1990) Science 249:386)。ファージディスプレイ� �有用性は、選択的にランダム化されたタン� �ク質変異体(又はランダムクローンcDNA)の大� �なライブラリーを標的分子に高い親和性で� �合するこれらの配列について素早く効果的� �分類することができる点にある。ファージ� �のペプチド(Cwirla,S.E.等 (1990) Proc. Natl. Acad.  Sci. USA, 87:6378)又はタンパク質(Lowman,H.B.ら  (1991) Biochemistry, 30:10832; Clackson,T.ら (1991) Na ture, 352: 624; Marks,J.D.等 (1991), J. Mol. Biol.,� �222:581; Kang,A.S.等 (1991) Proc. Natl. Acad. Sci.  USA, 88:8363)ライブラリーのディスプレイは、� ��異的に結合する特性を有するものについて� ��数のポリペプチド又はオリゴペプチドをス� ��リーニングするために使用されている(Smith,  G.P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2:668)。ラ� �ダム突然変異体のファージライブラリーの� �類は、多数の変異体を構築して増殖させる� �法、標的レセプターを用いた親和性精製の� �法、及び結合増強の結果を評価する手段を� �要とする(米国特許第5223409号、同第5403484号� �同第5571689号、及び同第5663143号を参照)。

 ほとんどのファージディスプレイ法は繊� ��状ファージを使用していたが、λファージ� �ィスプレイシステム(WO95/34683;米国特許第56270 24号)、T4ファージディスプレイシステム(RenJ.� ��Gene 215:439 (1998); Zhuら Cancer Researc, 58(15):3 209-3214 (1998); Jiang等 Infection & Immunity, 65 (11): 4770-4777 (1997); Ren等, Gene, 195(2):303-311 ( 1997); Ren, Protein Sci. 5:1833 (1996); Efimov等 Vir us Genes 10:173(1995)及びT7ファージディスプレ� �システム(Smith及びScott Methods in Enzymology,217,  228-257(1993); 米国特許第5766905号)も知られて� ��る。

 現在、基礎的なファージディスプレイ法� ��多くの改良及び変形が開発されている。こ� ��らの改良により、選択された標的分子との� ��合性など、ペプチドライブラリーやタンパ� ��質ライブラリーから特性、能力などに基づ� ��てスクリーニングする方法が改善された。� ��ァージディスプレイ法のための組み換え反� ��手段については、WO98/14277に記載がある。フ ァージディスプレイライブラリーは、二分子 相互作用(WO98/20169;WO98/20159)及び拘束性へリッ� ��スペプチドの特性(WO98/20036)を分析及び制御� ��るために使用されている。WO97/35196には、リ ガンドが標的分子に結合しうる第一の溶液、 及び親和性リガンドが標的分子に結合しない 第二の溶液とファージディスプレイライブラ リーを接触させて結合リガンドを選択的に単 離する、親和性リガンドの単離方法が記載さ れている。WO97/46251は、親和性精製抗体でラ� �ダムファージディスプレイライブラリーを� �イオパニングし、次いで結合ファージを単� �し、続いてマイクロプレートのウェルでマ� �クロパニングして高親和性結合ファージを� �離する方法を記載する。黄色ブドウ球菌(Stap hlylococcus aureus)タンパク質Aの親和性タグとし ての使用も報告されている(Li等, (1998) Mol Bi otech., 9:187)。WO97/47314は、ファージディスプ� �イライブラリーでもよいコンビナトリアル� �イブラリーを用いて酵素特異性を識別する� �めの基質サブトラクションライブラリーの� �用を記載している。ファージディスプレイ� �用いる洗浄剤における使用に適した酵素を� �択する方法はWO97/09446に記載される。特異的� ��結合するタンパク質を選択する更なる方法� ��、米国特許第5498538号、同第5432018号、及びWO 98/15833に記載されている。ペプチドライブラ� ��ーの作製及びこれらのライブラリーのスク� ��ーニングの方法は、米国特許第5723286号、同 第5432018号、同第5580717号、同第5427908号、同第 5498530号、同第5770434号、同第5734018号、同第569 8426号、同第5763192号、及び同第5723323号に記載 される。

 さらに、ヒト抗体ライブラリーを用いて� ��パニングによりヒト抗体を取得する技術も� ��られている。例えば、ヒト抗体の可変領域� ��一本鎖抗体(scFv)としてファージディスプレ� ��法によりファージの表面に発現させ、抗原� ��結合するファージを選択することができる� ��選択されたファージの遺伝子を解析すれば� ��抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコー� ��するDNA配列を決定することができる。抗原� ��結合するscFvのDNA配列が明らかになれば、当 該配列を有する適当な発現ベクターを作製し 、適当な宿主に導入して発現させることによ りヒト抗体を取得することができる。これら の方法は既に周知であり、WO 92/01047、WO 92/20 791、WO 93/06213、WO 93/11236、WO 93/19172、WO 95/01 438、WO 95/15388を参考に実施することができる 。

 別法として、ファージディスプレイ技術( McCafferty等, Nature 348:552-553[1990])を使用して、 非免疫化ドナーの免疫グロブリン可変(V)ドメ イン遺伝子レパートリーから、インビトロで ヒト抗体及び抗体断片を産出させることがで きる。この技術によれば、抗体Vドメイン遺� �子を、フレーム単位で、繊維状バクテリオ� �ァージ、例えばM13又はfdのコートタンパク質 遺伝子のどちらかでクローニングし、ファー ジ粒子の表面で機能的抗体断片として提示さ せる。繊維状粒子がファージゲノムの一本鎖 DNAコピーを含むので、抗体の機能特性に基づ いた選択に基づいても、結果としてこれらの 特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択が 成される。よって、このファージはB細胞の� �くつかの特性を模倣している。ファージデ� �スプレイは多様な形式で行うことができる;� ��えばJohnson, Kevin S. 及びChiswell, David J., Cu rrent Opinion in Structural Biology 3:564-571(1993)を� ��照。V-遺伝子セグメントのいくつかの供給� �を、ファージディスプレイのために使用で� �る。Clackson等, Nature, 352:624-628(1991)は、免疫� ��したマウス脾臓由来のV遺伝子の小さいラン ダムなコンビナトリアルライブラリーから、 多様で多くの抗-オキサゾロン抗体を単離し� �。非免疫化ヒトドナーのV遺伝子のレパート� ��ーが構成可能であり、多様で多くの抗原(自 己抗原を含む)に対する抗体は、Marks等, J. Mo l. Biol. 222:581-597(1991)、又はGriffith等, EMBO J.� �12:725-734(1993)に記載の技術にそのまま従うこ� ��で単離することができる。また、米国特許� ��5565332号及び同5573905号を参照のこと。

 本発明の抗体には、Fab、Fab'、F(ab') ₂ 、Fv、scFv、dsFv、Diabody及びsc(Fv)2等の、抗体の 機能的断片も含まれる。また、これら機能的 断片の多量体(例えば、ダイマー、トリマー� �テトラマー、ポリマー)も、本発明の抗体に� ��まれる。
 Fabは、IgGをシステイン存在下パパイン消化� ��ることにより得られる、L鎖とH鎖可変領域� �並びにC _H 1ドメイン及びヒンジ部の一部からなるH鎖フ� ��グメントとから構成される分子量約5万の断 片である。本発明では、上記抗体をパパイン 消化することにより得ることができる。また 、上記抗体のH鎖の一部及びL鎖をコードするD NAを適当なベクターに組み込み、当該ベクタ� ��を用いて形質転換した形質転換体よりFabを� ��製することもできる。
 Fab'は、後述のF(ab') ₂ のH鎖間のジスルフィド結合を切断すること� �より得られる分子量が約5万の断片である。� ��発明では、上記抗体をペプシン消化し、還� ��剤を用いてジスルフィド結合を切断するこ� ��により得られる。また、Fab同様に、Fab'をコ ードするDNAを用いて遺伝子工学的に調製する こともできる。
 F(ab') ₂ は、IgGをペプシン消化することにより得られ る、L鎖とH鎖可変領域、並びにC _H 1ドメイン及びヒンジ部の一部からなるH鎖フ� ��グメントとから構成される断片(Fab')がジス� ��フィド結合で結合した分子量約10万の断片� �ある。本発明では、上記抗体をペプシン消� �することにより得られる。また、Fab同様に� �F(ab') ₂ をコードするDNAを用いて遺伝子工学的に調製 することもできる。
 Fvは、抗体を酵素、例えばパパイン、ペプ� �ンで処理し抗体断片を生成させるか、また� �、これら抗体断片をコードする遺伝子を構� �し、これを発現ベクターに導入した後、適� �な宿主細胞で発現できる(例えば、Co, M.S. et  al., J. Immunol.(1994)152, 2968-2976、Better, M. &am p;amp; Horwitz, A. H. Methods in Enzymology(1989)178,� �476-496、Plueckthun, A. ; Skerra, A. Methods in Enz ymology(1989)178, 476-496、Lamoyi, E., Methods in Enzy mology(1989)121, 652-663、Rousseaux, J. et al., Method s in Enzymology(1989)121, 663-669、Bird, R. E. et al ., TIBTECH(1991)9, 132-137参照)。
 scFvは、H鎖可変領域とL鎖可変領域とからな� ��Fvを、片方の鎖のC末端と他方のN末端とを適 当なペプチドリンカーで連結し一本鎖化した 抗体断片である。ペプチドリンカーとしては 例えば柔軟性の高い(GGGGS) ₃ などを用いることができる。例えば、上記抗 体のH鎖可変領域及びL鎖可変領域をコードす� ��DNAとペプチドリンカーをコードするDNAを用� ��てscFv抗体をコードするDNAを構築し、これを 適当なベクターに組み込み、当該ベクターを 用いて形質転換した形質転換体よりscFvを調� �することができる。
 dsFvは、H鎖可変領域及びL鎖可変領域の適切� ��位置にCys残基を導入し、H鎖可変領域とL鎖� �変領域とをジスルフィド結合により安定化� �せたFv断片である。各鎖におけるCys残基の導 入位置は分子モデリングにより予測される立 体構造に基づき決定することができる。本発 明では例えば上記抗体のH鎖可変領域及びL鎖� ��変領域のアミノ酸配列から立体構造を予測� ��、かかる予測に基づき変異を導入したH鎖可 変領域及びL鎖可変領域をそれぞれコードす� �DNAを構築し、これを適当なベクターに組み� �み、そして当該ベクターを用いて形質転換� �た形質転換体よりdsFvを調製することができ� ��。
 尚、適当なリンカーを用いてscFv抗体、dsFv� �体などを連結させたり、ストレプトアビジ� �を融合させたりして抗体断片を多量体化す� �こともできる。本発明の抗体(抗体断片を含� ��)に低分子化合物、タンパク質、標識物質な どを融合又は結合させることにより、融合抗 体又は標識化抗体を構成することができる。 標識物質としては ¹²⁵ I等の放射性物質、などを用いることができ� �。

 Diabodyは、遺伝子融合により構築された二価 (bivalent)の抗体断片を指す(Holliger P et al., Pr oc.Natl.Acad.Sci.USA 90: 6444-6448 (1993)、EP404,097号� ��WO93/11161号等)。Diabodyは、2本のポリペプチド 鎖から構成されるダイマーであり、通常、ポ リペプチド鎖は各々、同じ鎖中でVL及びVHが� �互いに結合できない位に短い、例えば、5残� ��程度のリンカーにより結合されている。同� ��ポリペプチド鎖上にコードされるVLとVHとは 、その間のリンカーが短いため単鎖可変領域 フラグメントを形成することが出来ず二量体 を形成するため、Diabodyは2つの抗原結合部位� ��有することとなる。Diabodyは、抗体を酵素、 例えば、パパイン、ペプシンなどで処理し、 抗体断片を生成させるか、又はこれら抗体断 片をコードするDNAを構築し、これを発現ベク ターに導入した後、適当な宿主細胞で発現さ せればよい(例えば、Co, M. S. et al., J. Immun ol. (1994) 152, 2968-2976; Better, M. and Horwitz, A . H., Methods Enzymol. (1989) 178, 476-496; Pluckthun , A. and Skerra, A., Methods Enzymol. (1989) 178, 4 97-515; Lamoyi, E., Methods Enzymol. (1986) 121, 652- 663 ; Rousseaux, J. et al., Methods Enzymol. (1986)� �121, 663-669; Bird, R. E. and Walker, B. W., Trend s Biotechnol. (1991) 9, 132-137参照)。
 sc(Fv)2は、2つのVH及び2つのVLをリンカー等で 結合して一本鎖にした低分子化抗体である(Hu dson et al、J Immunol. Methods 1999;231:177-189)。sc( Fv)2は、例えば、scFvをリンカーで結ぶことに� ��って作製できる。

 本発明の抗体には、本発明の抗体と他の� ��プチド又はタンパク質とが融合した融合タ� ��パク質も含まれる。融合タンパク質を作製� ��る方法は、本発明の抗体をコードするポリ� ��クレオチドと他のペプチド又はポリペプチ� ��をコードするポリヌクレオチドをフレーム� ��一致するように連結してこれを発現ベクタ� ��に導入し、宿主で発現させればよく、当業� ��に公知の手法を用いることができる。本発� ��の抗体との融合に付される他のペプチド又� ��ポリペプチドとしては、例えば、FLAG(Hopp, T . P. et al., BioTechnology (1988) 6, 1204-1210 )、6 個のHis(ヒスチジン)残基からなる6×His、10×His 、インフルエンザ凝集素(HA)、ヒトc-mycの断片 、VSV-GPの断片、p18HIVの断片、T7-tag、HSV-tag、E- tag、SV40T抗原の断片、lck tag、α-tubulinの断片� ��B-tag、Protein C の断片等の公知のペプチド� �使用することができる。また、本発明の抗� �との融合に付される他のポリペプチドとし� �は、例えば、GST(グルタチオン-S-トランスフ� ��ラーゼ)、HA(インフルエンザ凝集素)、β-ガ� �クトシダーゼ、MBP(マルトース結合タンパク� ��)等が挙げられる。

 本発明の抗体には、標識物質が結合した抗� ��も含まれる。
 標識物質としては、酵素発光(ルシフェラー ゼ)による発光、発光低分子を利用するもの� �、蛍光タンパクや蛍光低分子)を用いるもの� ��放射性核種等が挙げられるがこれらには限� ��されない。放射性核種としては ⁵¹ Cr、 ⁵⁹ Fe、 ⁵⁷ Co、 ⁶⁷ Ga、 ⁷⁵ Se、 ^81m Kr、 ^99m Tc、 ¹¹¹ In、 ¹²⁵ I、 ¹³¹ I、 ¹³³ Xe、 ²⁰¹ Tlなどのγ線放出核種や、 ¹¹ C、 ¹³ N、 ¹⁵ O、 ¹⁸ F、 ^35m Cl、 ⁷⁶ Br、  ⁴⁵ Ti、 ⁴⁸ V、 ⁶⁰ Cu、 ⁶¹ Cu、 ⁶² Cu、 ⁶⁶ Ga、 ⁸⁹ Zr、 ^94m Tc、 ¹²⁴ Iなどの陽電子放出核種などが挙げられるが� �れらには限定されない。なお当業者には自� �であるが"m"とは核異性体を示す。
 蛍光標識や発光標識としては酵素発光(ルシ フェラーゼ)による発光を利用するものと、� �光(GFP、DsRed、クサビラオレンジ等の蛍光タ� �パク質やFITCやCy5.5、Alexa Fluor 750などの蛍光 性低分子)を用いるものとのが使用できる。
 酵素発光(ルシフェラーゼ)による発光の場� �は基質投与が別途必要である。
 特に、動物本来の自家蛍光による影響を軽� ��したものが好ましく、さらには皮膚透過性� ��高いシグナルを発する標識が好ましい。

 また本発明は、本発明の抗体をコードす� ��DNA、該DNAが挿入されたベクター、及び該ベ� ��ターが導入された形質転換細胞を提供する� ��ベクターの例としては、M13系ベクター、pUC� ��ベクター、pBR322、pBluescript、pCR-Scriptなどが� ��げられる。また、cDNAのサブクローニング、 切り出しを目的とした場合、上記ベクターの 他に、例えば、pGEM-T、pDIRECT、pT7などが挙げ� �れる。本発明の抗体をコードするDNA、該DNA� �挿入されたベクター、及び該ベクターが導� �された形質転換細胞は公知の技術を用いて� �成される。

 本発明の酸化LDL/β ₂ GPI複合体に結合する抗体をコードするDNAとし ては、以下のDNAが挙げられる。
(a)配列番号:5に記載の塩基配列を有する、重� ��をコードするDNA
(b)配列番号:10に記載の塩基配列を有する、軽 鎖をコードするDNA
(c)CDR1として配列番号:2に記載のアミノ酸配列 、CDR2として配列番号:3に記載アミノ酸配列、 及びCDR3として配列番号:4に記載のアミノ酸配 列を有する重鎖をコードするDNA
(d)CDR1として配列番号:7に記載のアミノ酸配列 、CDR2として配列番号:8に記載アミノ酸配列、 及びCDR3として配列番号:9に記載のアミノ酸配 列を有する軽鎖をコードするDNA

 発現ベクターとしては、例えば、大腸菌� ��の発現を目的とした場合は、ベクターが大� ��菌で増幅されるような上記特徴を持つほか� ��、宿主をJM109、DH5α、HB101、XL1-Blueなどの大� �菌とした場合においては、大腸菌で効率よ� �発現できるようなプロモーター、例えば、la cZプロモーター(Wardら, Nature (1989) 341, 544-546 ;FASEB J. (1992) 6, 2422-2427)、araBプロモーター( Betterら, Science (1988) 240, 1041-1043 )、またはT 7プロモーターなどを持っていることが不可� �である。このようなベクターとしては、上� �ベクターの他にpGEX-5X-1(ファルマシア社製)、 「QIAexpress system」(キアゲン社製)、pEGFP、ま� �はpET(この場合、宿主はT7 RNAポリメラーゼを 発現しているBL21が好ましい)などが挙げられ� ��。

 また、ベクターには、ポリペプチド分泌� ��ためのシグナル配列が含まれていてもよい� ��蛋白質分泌のためのシグナル配列としては� ��大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、p elBシグナル配列(Lei, S. P. et al J. Bacteriol.  (1987) 169, 4379)を使用すればよい。宿主細胞� �のベクターの導入は、例えば塩化カルシウ� �法、エレクトロポレーション法を用いて行� �ことができる。

 大腸菌以外にも、例えば、哺乳動物由来� ��発現ベクター(例えば、pcDNA3 (インビトロゲ ン社製)や、pEGF-BOS (Nucleic Acids. Res.1990, 18(17 ),p5322)、pEF 、pCDM8)、昆虫細胞由来の発現ベ� �ター(例えば「Bac-to-BAC baculovairus expression sy stem」(ギブコBRL社製)、pBacPAK8)、植物由来の発 現ベクター(例えばpMH1、pMH2)、動物ウィルス� �来の発現ベクター(例えば、pHSV、pMV、pAdexLcw) 、レトロウィルス由来の発現ベクター(例え� �、pZIPneo)、酵母由来の発現ベクター(例えば� �「Pichia Expression Kit」(インビトロゲン社製)� ��pNV11、SP-Q01)、枯草菌由来の発現ベクター(例 えば、pPL608、pKTH50)が挙げられる。

 CHO細胞、COS細胞、NIH3T3細胞等の動物細胞� ��の発現を目的とした場合には、細胞内で発� ��させるために必要なプロモーター、例えばS V40プロモーター(Mulliganら, Nature (1979) 277, 10 8)、MMTV-LTRプロモーター、EF1αプロモーター(Mi zushimaら, Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322)、CMV� ��ロモーターなどを持っていることが不可欠� ��あり、細胞への形質転換を選抜するための� ��伝子(例えば、薬剤(ネオマイシン、G418など) により判別できるような薬剤耐性遺伝子)を� �すればさらに好ましい。このような特性を� �するベクターとしては、例えば、pMAM、pDR2、 pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV、pOP13などが挙げられる� �

 さらに、遺伝子を安定的に発現させ、か� ��、細胞内での遺伝子のコピー数の増幅を目� ��とする場合には、核酸合成経路を欠損したC HO細胞にそれを相補するDHFR遺伝子を有するベ クター(例えば、pCHOIなど)を導入し、メトト� �キセート(MTX)により増幅させる方法が挙げら れ、また、遺伝子の一過性の発現を目的とす る場合には、SV40 T抗原を発現する遺伝子を� �色体上に持つCOS細胞を用いてSV40の複製起点� ��持つベクター(pcDなど)で形質転換する方法� �挙げられる。複製開始点としては、また、� �リオーマウィルス、アデノウィルス、ウシ� �ピローマウィルス(BPV)等の由来のものを用い ることもできる。さらに、宿主細胞系で遺伝 子コピー数増幅のため、発現ベクターは選択 マーカーとして、アミノグリコシドトランス フェラーゼ(APH)遺伝子、チミジンキナーゼ(TK) 遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリ ボシルトランスフェラーゼ(Ecogpt)遺伝子、ジ� ��ドロ葉酸還元酵素(dhfr)遺伝子等を含むこと� ��できる。

 ベクターが導入される宿主細胞としては� ��に制限はなく、例えば、大腸菌や種々の動� ��細胞などを用いることが可能である。宿主� ��胞は、例えば、本発明の抗体の製造や発現� ��ための産生系として使用することができる� ��ポリペプチド製造のための産生系は、in vit roおよびin vivoの産生系がある。in vitroの産� �系としては、真核細胞を使用する産生系や� �核細胞を使用する産生系が挙げられる。

 真核細胞を使用する場合、例えば、動物� ��胞、植物細胞、真菌細胞を宿主に用いるこ� ��ができる。動物細胞としては、哺乳類細胞� ��例えば、CHO(J. Exp. Med. (1995) 108, 945)、COS� �3T3、ミエローマ、BHK(baby hamster kidney)、HeLa� �Vero、両生類細胞、例えばアフリカツメガエ� ��卵母細胞(Valle, et al., Nature (1981) 291, 358-3 40)、あるいは昆虫細胞、例えば、 Sf9、 Sf21� �� Tn5が知られている。本発明においては、CH O-DG44、CHO-DXB11、COS7細胞、BHK細胞が好適に用� �られる。動物細胞において、大量発現を目� �とする場合には特にCHO細胞が好ましい。宿� �細胞へのベクターの導入は、例えば、リン� �カルシウム法、DEAEデキストラン法、カチオ� ��ックリボソームDOTAP(ベーリンガーマンハイ� ��社製)を用いた方法、エレクトロポーレーシ ョン法、リポフェクションなどの方法で行う ことが可能である。

 植物細胞としては、例えば、ニコチアナ� ��タバカム(Nicotiana tabacum)由来の細胞が蛋白� �生産系として知られており、これをカルス� �養すればよい。真菌細胞としては、酵母、� �えば、サッカロミセス(Saccharomyces)属、例え� �、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces c erevisiae)、サッカロミセス・ポンベ(Saccharomyces  pombe)、糸状菌、例えば、アスペルギルス(Asp ergillus)属、例えば、アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger)が知られている。

 原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用� ��る産生系がある。細菌細胞としては、大腸� ��(E. coli)、例えば、JM109、DH5α、HB101等が挙げ られ、その他、枯草菌が知られている。本発 明のDNAにより形質転換された細胞をin vitroで 培養し、当業者が通常行う方法によって精製 することによって、本発明の抗体を得ること が可能である。

 また本発明は、本発明の抗体をコードす� ��核酸を含むベクターを有する宿主生物を提� ��する。本発明の宿主生物は、組換え型抗体� ��産生に有用である。本発明における宿主生� ��としては、ヤギなどが挙げられる。例えば� ��本発明のトランスジェニックヤギの作成は� ��のようにして行うことが可能である。即ち� ��抗体遺伝子が乳汁中に固有に産生されるタ� ��パク質(ヤギβカゼインなど)をコードする遺 伝子の内部にインフレームで挿入された融合 遺伝子を構築する。抗体遺伝子が挿入された 融合遺伝子を含むDNA断片をヤギの胚へ注入す れば、該注入胚が雌のヤギへ導入される。胚 を受容したヤギから生まれるトランスジェニ ックヤギ又はその子孫が産生する乳汁から、 本発明の抗体を取得することができる。トラ ンスジェニックヤギから産生される本発明の 抗体を含む乳汁量を増加させるために、ホル モンをトランスジェニックヤギに適宜使用す ることも可能である(Ebert, K.M. et al., Bio/Tech nology(1994)12, 699-702)。

 本発明は、本発明の酸化LDL/β ₂ GPI複合体に結合する抗体を含む、動脈硬化の 存在部位のイメージング剤を提供する。また 、本発明は、本発明の酸化LDL/β ₂ GPI複合体に結合する抗体を哺乳動物に投与す る工程を含む、動脈硬化の存在部位のイメー ジング方法を提供する。本発明のイメージン グ剤は、動脈硬化の存在部位をイメージング するために哺乳動物に投与される。哺乳動物 としては、ヒト、非ヒト哺乳動物(例えばマ� �ス、ラット、ハムスター、ウサギ、ブタ、� �ルなど)が挙げられる。本発明のイメージン� ��剤は、動脈硬化の診断において有用である� ��本発明のイメージング剤はin vivo用、in vitr o用のどちらとしても利用できる。
 動脈硬化には大きく分け、粥腫と石灰化病� ��の症状が存在するが、本発明のイメージン� ��剤によって、特に、動脈硬化粥腫部位が染� ��される。
 粥腫は、マクロファージが、コレステロー� ��を多量に含有する酸化LDLをレセプターを介� ��て特異的に取り込み、泡沫化することが知� ��れており、それが血管内膜に蓄積、プラー� ��(粥腫)を形成する、動脈硬化の一病態であ� �。

 本発明のイメージング剤は、酸化LDL/β ₂ GPI複合体に結合する抗体、特に好ましくは3H3 抗体に、直接、あるいは間接的に追尾できる 、イメージング用標識、プローブを結合させ たものである。
 前記プローブを生体に生体内投与(例えば静 脈内投与)した後、PETやSPECT、CCDカメラなどの 画像計測装置を用いて蓄積量や分布を測定す ることができる。

 また、近年、透過性線源により、物体を走� ��し、そのデータをコンピュータを用いて処� ��することで、物体の内部画像を構成する技� ��コンピュータ断層撮影(Computed Tomography:以下 、「CT」との記載もComputed Tomographyを意味す� �)の病状診断、臨床への応用がされている。
 そのようなCT技術は、ポジトロン断層法 (PE T)や単一光子放射断層撮影 (SPECT)、や核磁気� ��鳴画像法 (MRI) などの、断面像を得て、物� ��の(輪切りなどの)2次元断面画像を得る技術� ��あるが、これらの検査技術は単に断面画像� ��して用いられるだけでなく、コンピュータ� ��像処理技術向上によってその2次元画像を統 合し3次元グラフィックスとして表示される� �とも多く、3次元的な病変の位置の特定、診� ��、手術方針決定等に有力な技術となってい� ��。
 例えば、単純CTは、造影剤を使用せずにX線� ��射等の撮影を行うものであり、組織の浮腫� ��骨の形態異常、形態など造影剤を用いなく� ��も充分に観察でき、一方、造影CTとは、X線� ��収率の高い造影剤等を血管内に注射してか� ��撮影を行うものをいい、血管や血流が豊富� ��組織の形状を観察することができる。さら� ��、いわゆる次世代CT、例えば、線源がらせ� �状に動くヘリカルCT、検出器自体を対軸方向 に、分割した、多列検出器CT (MDCT)(マルチス� ��イスCT(MSCT)とも呼ぶ)なども、開発され、そ� ��らはいずれも特に制限なく、単独又は併用� ��発明のイメージング剤の検出に適用可能で� ��る。
 イメージング用標識プローブ(本発明のイメ ージング剤)がX線吸収率の高い放射線核種で� ��る場合は、検出器としてのCTの単独使用も� �能である。

 標識物質としては酵素発光(ルシフェラーゼ )による発光、発光低分子を利用するものと� �蛍光タンパクや蛍光低分子)を用いるもの、� ��射性核種等が挙げられるがこれらには限定� ��れない。放射性核種としては ⁵¹ Cr、 ⁵⁹ Fe、 ⁵⁷ Co、 ⁶⁷ Ga、 ⁷⁵ Se、 ^81m Kr、  ^99m Tc、 ¹¹¹ In、 ¹²⁵ I、 ¹³¹ I、 ¹³³ Xe、 ²⁰¹ Tlなどのγ線放出核種や、 ¹¹ C、 ¹³ N、 ¹⁵ O、 ¹⁸ F、 ^35m Cl、 ⁷⁶ Br、  ⁴⁵ Ti、 ⁴⁸ V、 ⁶⁰ Cu、 ⁶¹ Cu、 ⁶² Cu、 ⁶⁶ Ga、 ⁸⁹ Zr、 ^94m Tc、 ¹²⁴ Iなどの陽電子放出核種などが挙げられるが� �れらには限定されない。なお当業者には自� �であるが"m"とは核異性体を示す。特に、イ� �ジウム-111、テクネチウム-99mまたはヨウ素-13 1は、平面走査またはシングルフォトン断層� �影(SPECT)のために特に好ましく使用できる。� ��電子放射標識の例えばフッ素-19は、陽電子� ��射断層法において特に好ましく使用できる� ��常磁性イオンの例えばガドリニウム(III)ま� �はマンガン(II)は特に好ましく磁気共鳴映像� ��(MRI)において使用できる。

 蛍光標識や酵素(ルシフェラーゼ)による発� �系を利用するものと、蛍光(GFP、DsRed、クサ� �ラオレンジ等の蛍光タンパク質やFITCやCy5.5� �Alexa Fluor 750などの蛍光性低分子)を用いる� �のとのが使用できる。
 酵素発光(ルシフェラーゼ)による発光の場� �は基質投与が別途必要である。
 特に、動物本来の自家蛍光による影響を軽� ��したものが好ましく、さらには皮膚透過性� ��高いシグナルを発する標識が好ましい。

 イメージング検出器としては磁気共鳴映像� ��(MRI)PETやSPECTが用いられるが、特に、蛍光標 識プローブの観察において、低侵しゅう性の 観点で好ましく測定機器は、CCDカメラである 。
 それゆえ、CCDカメラで補足可能な波長、例� ��ばおよそ350~900 nmの光を、発する標識が好� �しい。さらにCCDカメラによる測定動物の体� �面における測定値から生体内の光源の強さ� �測定できる機械が好ましい。蛍光標識の場� �、反射蛍光画像、透過蛍光画像のいずれで� �良いが、両方の画像を捉えることが好まし� �。また、蛍光画像の多方面(反射、透過を問� ��ず)重ね合わせ、それに線源情報を統合して 処理し、立体画像(3次元)として捉えることが 、3次元的な位置、分布を正確に構成でき、� �ましい。こうして得た3次元画像は、さらにC T画像とさらに統合することもできる。

 イメージング用標識プローブがX線吸収率 の高い放射線核種を結合したものである場合 、前述したように イメージング検出器とし� ��の、CTの単独でも十分使用可能(例えばPETやS PECT)で動脈硬化病巣の位置、蓄積量や分布を� ��定することもできる。

 一方、前記イメージング用標識プローブ� ��生体に生体内投与(例えば静脈内投与)した� �、標識された前記プローブのCT観察、又はCCD との併用観察も可能である。併用観察の例と して、蛍光標識したプローブのCCD像を、単純 CT(及び/又は造影CTの像と重ね合わせる)を用� �ることができる。即ち 単純CTにより骨、肺� ��どの臓器像の抽出(及び/又は造影CTの血管、 組織像抽出)を行って得られたCT画像と、心臓 など主要な動脈疾患部分のCCDカメラによる蛍 光プローブ画像を統合し、その動脈硬化病巣 の位置、蓄積量や分布を3次元的な組織、血� �との相対的な位置関係、動脈硬化病巣の3次� ��(局在)イメージをより正確に把握すること� �できる。

 本発明のイメージング剤は、抗体に加え� ��医薬的に許容し得る担体を導入し、公知の� ��法で製剤化することが可能である。例えば� ��水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る� ��との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の� ��で非経口的に使用できる。例えば、薬理学� ��許容される担体もしくは媒体、具体的には� ��滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸� ��剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤� ��ベヒクル、防腐剤、結合剤などと適宜組み� ��わせて、一般に認められた製薬実施に要求� ��れる単位用量形態で混和することによって� ��剤化することが考えられる。これら製剤に� ��ける有効成分量は指示された範囲の適当な� ��量が得られるようにするものである。

 注射のための無菌組成物は注射用蒸留水の� ��うなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従� ��て処方することができる。
 注射用の水溶液としては、例えば生理食塩� ��、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液� ��例えばD-ソルビトール、D-マンノース、D-マ� ��ニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適� ��な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的� ��はエタノール、ポリアルコール、例えばプ� ��ピレングリコール、ポリエチレングリコー� ��、非イオン性界面活性剤、例えばポリソル� ��ート80(TM)、HCO-50と併用してもよい。

 油性液としてはゴマ油、大豆油があげら� ��、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベ� ��ジルアルコールと併用してもよい。また、� ��衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリ� ��ム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカ� ��ン、安定剤、例えばベンジルアルコール、� ��ェノール、酸化防止剤と配合してもよい。� ��製された注射液は通常、適当なアンプルに� ��填させる。

 投与は好ましくは非経口投与であり、具� ��的には、注射剤型、経鼻投与剤型、経肺投� ��剤型、経皮投与型などが挙げられる。注射� ��型の例としては、例えば、静脈内注射、筋� ��内注射、腹腔内注射、皮下注射などにより� ��身または局部的に投与することができる。

 また、患者の年齢、症状により適宜投与方� ��を選択することができる。本発明のイメー� ��ング剤の投与量としては、例えば、一回に� ��き体重1kgあたり0.0001mgから1000mgの範囲で選� �ことが可能である。あるいは、例えば、対� �あたり0.001から100000mg/bodyの範囲で投与量を� �ぶことができるが、これらの数値に必ずし� �制限されるものではない。
 投与量、投与方法は、対象の体重や年齢、� ��状、mg抗体あたりの蛍光標識の強度・検出� �械の検出感度などにより変動するが、当業� �であれば適宜選択することが可能である。

 また本発明は、本発明の酸化LDL/β ₂ GPI複合体に結合する抗体を含む、動脈硬化の 存在部位のイメージング用キットを提供する 。本発明のキットは、対象に投与されること により、動脈硬化の存在部位をイメージング することを特徴とする。上記キットには、本 発明の抗体に加えて、例えば、イメージング 剤投与用の注射(点滴)器具、非吸着吸着を抑� ��る補助剤(例えばアルブミン等)等が含まれ� �が、これらに制限されるものではない。
 また、上記キットには、イメージングに用� ��るための指示書、適当な容器、コントロー� ��試薬等、通常のキットに含まれるものを含� ��でいてもよい。

 本発明は、以下に記載の工程を含む、動脈� ��化治療剤の候補化合物のスクリーニング方� ��を提供する。
(a)本発明の酸化LDL/β ₂ GPI複合体に結合する抗体、及び、候補化合物 を動脈硬化疾患モデル非ヒト動物に投与する 工程、例えば、本発明の酸化LDL/β ₂ GPI複合体に結合する抗体が投与された動脈硬 化疾患モデル非ヒト動物に候補化合物を投与 する工程、
(b)該抗体、及び、該候補化合物を投与された 動脈硬化疾患モデル非ヒト動物と、該抗体を 投与されているが該候補化合物は投与されて いない動脈硬化疾患モデル非ヒト動物におい て、動脈硬化巣をイメージングする工程、
(c)該抗体、及び、該候補化合物を投与された 動脈硬化疾患モデル非ヒト動物と、該抗体を 投与されているが該候補化合物は投与されて いない動脈硬化疾患モデル非ヒト動物におい て、動脈硬化巣(例えば、動脈硬化巣の大き� �または存在部位)を比較する工程、及び
(d)該抗体、及び、該候補化合物を投与された 動脈硬化疾患モデル非ヒト動物において、該 抗体を投与されているが該候補化合物は投与 されていない動脈硬化疾患モデル非ヒト動物 と比較して、動脈硬化巣が減少または消失す る候補化合物を選択する工程。
 各工程は、上述した技術または公知の技術� ��用いて実施される。

 本発明のスクリーニング方法において利� ��することができる候補化合物には、精製蛋� ��質(抗体を含む)、遺伝子ライブラリーの発� �産物、合成ペプチドのライブラリー、DNAま� �はRNAライブラリー(アプタマー、siRNAなど機� �性核酸を含む)、細胞抽出液、細胞培養上清� ��及び合成低分子化合物のライブラリー等が� ��げられるが、これらに制限されない。

 本発明のスクリーニング方法において利用� ��ることができる疾患モデル非ヒト動物とし� ��は、マウス、ハムスター、ラット、ウサギ� ��ブタ、サル等が挙げられるが、これらに制� ��されない。
 例えば、動脈硬化疾患モデルマウスとして� ��遺伝子を過剰発現させるトランスジェニッ� ��マウスと、ある遺伝子を欠損させるジーン� ��ーゲッティングによるノックアウトマウス� ��例えば、動脈硬化モデルとしては悪玉コレ� ��テロールとして知られているLDLを形作って� ��るタンパク質(アポリポタンパク質E)のアポE 欠失(apoE ^-/- )、LDL受容体欠失(LDLR ^-/- )、ヒト型アポB導入、ドミナント変異アポE導 入モデルがある。さらには、2型糖尿病モデ� �マウス(KKAy)、あるいは、マウスのなかでも� �とも動脈硬化になりやすいC57BL6系統で、こ� �系統では高コレステロール食のみで動脈硬� �巣がみられる場合もあり、高コレステロー� �食等、その餌により作製された、動脈硬化� �デルマウスも用いることができる。
 ウサギは高コレステロール食により約2ヶ月 半で動脈硬化巣がみられる場合もあり、さら にLDL受容体欠損の動脈硬化疾患モデルウサギ としては、WHHLウサギなどが知られている。
 ブタでもアポBのLDL受容体結合部分のアミノ 酸配列異常により、動脈硬化をおこしやすい モデルがしられており、当業者であれば、血 栓症・動脈硬化モデル動物作製法 編著 鈴� � 宏治(株式会社 金芳堂)など参照して、動� �硬化モデル動物を作製、本発明に利用でき� �。

 本発明のスクリーニング方法によって選� ��される動脈硬化巣を減少または消失させる� ��合物は、動脈硬化治療剤の候補化合物とな� ��。即ち、本発明は、本発明のスクリーニン� ��によって選択された物質を有効成分として� ��有する動脈硬化治療剤を提供する。また本� ��明は、本発明のスクリーニング方法によっ� ��選択された化合物の動脈硬化治療剤製造に� ��ける使用に関する。本発明のスクリーニン� ��法により単離される物質を、治療剤として� ��いる場合には、公知の製剤学的製造法によ� ��製剤化して用いることができる。例えば、� ��理学上許容される担体または媒体(生理食塩 水、植物油、懸濁剤、界面活性剤、安定剤な ど)とともに患者に投与する。投与は、物質� �性質に応じて、経皮的、鼻腔内的、経気管� �的、筋内的、静脈内、または経口的に行わ� �る。投与量は、患者の年齢、体重、症状、� �与方法等により変動するが、当業者であれ� �適宜適当な投与量を選択することができる� �

 本明細書で開示した抗体の塩基配列および� ��ミノ酸配列は、以下の配列番号に従って配� ��表に記載されている。
<3H3抗体>
配列番号1:重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号2:重鎖CDR1のアミノ酸配列
配列番号3:重鎖CDR2のアミノ酸配列
配列番号4:重鎖CDR3のアミノ酸配列
配列番号5:重鎖可変領域の塩基配列
配列番号6:軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号7:軽鎖CDR1のアミノ酸配列
配列番号8:軽鎖CDR2のアミノ酸配列
配列番号9:軽鎖CDR3のアミノ酸配列
配列番号10:軽鎖可変領域の塩基配列
 なお、本明細書において引用された全ての� ��行技術文献は、参照として本明細書に組み� ��れられる。