Memoria Descriptiva

Campo de la invención

La presente invención proporciona un anticuerpo para detectar la presencia del hongo Chondrostereum purpureum en una muestra vegetal, donde dicho anticuerpo se une específicamente a la enzima endopoligalacturonasa que produce Chondrostereum purpureum (en adelante, anticuerpo anti-endoPG. Es parte de la invención, un kit y método para detectar antigenos fúngicos, en particular, para detectar la presencia de la enfermedad del plateado (causado por el hongo Chondrostereum purpureum) en árboles frutales, mediante la detección de la enzima endoPG a través de la unión de este antigeno con el anticuerpo parte de la invención, funcionalizado con nanoparticulas de oro, donde la unión se detecta mediante ensayos de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) o un inmunoensayo de flujo lateral.

Antecedentes de la invención

El "plateado" o "mal del plomo" en los frutales es una enfermedad ampliamente conocida, que ataca principalmente a árboles frutales como duraznero, nectarino, cerezo, peral, kiwi, frambueso, arándano, algunos árboles leñosos, entre otros (Grinbergs et al. 2019, 2020, 2021) .

En chile, en cultivos de manzano se ha detectado que la enfermedad del plateado o el mal del plomo se encuentra presente en más del 90% de los huertos, lo que ha generado disminución del rendimiento de los cultivos, particularmente, la disminución del rendimiento en manzanos, representa costo de CLP$200.939/ha, y CLP$ 602.813/ha en retorno al productor. En el caso del arándano, la reducción en

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HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) el rendimiento oscila en torno al 40%, las pérdidas por esta enfermedad podrían llegar a CLP$4.501.005/ha en retorno al productor (France et al. , 2016) . Es necesario señalar que, el principal problema de esta enfermedad es su paso inadvertido en viveros, ya que es asintomática durante los primeros años de la vida de la planta, por este motivo, en el momento de la detección de la enfermedad, las pérdidas de cultivo pueden alcanzar un 80%, lo que tiene un costo aproximado de CLP$20.505.818/ha, en manzano y entre CLP$9.227. 614 y CLP$12.987.013/ha en arándano (INIA, 2018) .

Los árboles que presentan la enfermedad del plateado presentan sintomas como ramas con menor vigor, cambios de color en sus hojas desde un tono plateado o plomizo. Inicialmente, el hongo germina sobre la herida en la madera, coloniza el tejido leñoso y decolora y necrosa el xilema. Después del segundo o tercer año después de la infección, comienzan a desarrollarse los sintomas foliares que corresponden a la coloración plomizao o grisácea de las hojas, debida a la actividad de la endopoligalacturonasa producida por el hongo, que produce la desorganización de los tejidos foliares e induce la escición de la epidermis de la hoja y el mesófilo, produciendo una capa de aire que al refractar con la luz solar produce la coloración plateada de las hojas (France et al. , 2016. , Grinbergs et al. , 2019, 2021a, 2021b.

Inicialmente, cuando la infección ocurre en ramas laterales, los sintomas mencionados comienzan a afectar a pocas ramas hasta cubrir la planta por completo. Cuando la planta se infecta en vivero, es muy probable que muestre sintomas foliares temprano y de forma generalizada .

La enfermedad del plateado es producida por el hongo Chondrostereum purpurean, patógeno de alta distribución en climas mediterráneos. Los daños que causa este hongo en las plantas se deben principalmente a la secreción de una toxina endopoligalacturonasa (endoPG) , la cual migra a través del xilema hacia los hojas, produciendo desprendimiento foliar del parénquima en empalizada, lo que genera cámaras de aire, las que debido al efecto óptico de la luz ( refracción) confieren a las hojas un aspecto plateado. (Rojo et al. , 2017) . Por otro lado, el hongo puede sobrevivir en árboles enfermos y posteriormente a la muerte de los mismos, puede crecer sobre la madera muerta, produciendo los basidiocarpos característicos de esta especie (estructuras formadoras de esporas) (Portal Fruticola, 2019) .

Generalmente, el control de esta enfermedad es preventivo y consiste en la prevención de la generación de heridas en plantas nuevas de huerto o vivero, como, por ejemplo, la protección de las heridas realizadas en la injertación y/o decapitación, con pasta protectora de cortes a base de fungicidas, para evitar el ingreso del hongo a la planta (Portal Fruticola, 2019) . Otro tipo de control de este patógeno es a través del control biológico con organismos como Tríchoderma o Gliocladium, mediante la adición de pellets de estos hongos en los troncos o ramas enfermas o la inyección de una formulación liquida de los agentes controladores, esta última ha presentado resultados prometedores (Portal Fruticola, 2019) . Además, como se mencionó anteriormente, esta enfermedad es asintomática los primeros años de vida de la planta, por lo que no es posible detectarla a simple vista. Por ello, es de gran importancia el desarrollo de sistemas de detección del hongo con el fin de disminuir la perdida de cultivo y las pérdidas económicas asociadas . Hasta ahora, existen ensayos para la detección de presencia de analitos mediante ensayos de flujo lateral inmunocromatográf ico o basados en la unión antigeno anticuerpo.

En US 109007289 se presenta un análisis de respuesta y detección rápida a través de ensayos cromatográf icos de flujo lateral de antigenos específicos presentes en fluidos humanos o animales, o en productos agrícolas, microbianos o biológicos. Se incluye un dispositivo de flujo lateral que comprende una pluralidad de componentes, y un método para hacer que el dispositivo se presente en un formato similar a una cinta, de material dieléctrico.

En WO2018097796A1 se divulga un dispositivo para determinar o cuantificar la presencia de una molécula de analito, virus o célula de interés en una muestra. Se presenta además un método para determinar o cuantificar la presencia de una molécula de analito, virus o célula de interés en una muestra, un método para preparar el dispositivo de la invención, el uso del dispositivo de la invención para determinar o cuantificar la presencia de una molécula de analito, virus o célula de interés en una muestra y un kit de partes que comprende el dispositivo. Es parte del alcance del método la detección de hongos.

El documento WO2014174085 describe un dispositivo para medir la concentración de analitos en muestras liquidas tales como muestras corporales, donde es posible la detección de hongos. El dispositivo comprende una zona de aplicación, a la que se puede aplicar una muestra, y que contiene una molécula especifica capaz de unirse específicamente al analito de interés, estando dicha molécula especifica conjugada a un indicador que puede dar lugar a variaciones de impedancia. El complejo resultante migra por capilaridad y entra en una zona de detección, en la que se inmoviliza otra molécula capaz de unirse específicamente al analito de interés. La concentración de moléculas informadoras en la zona de detección es proporcional a la concentración de analito en la muestra, y las variaciones en la concentración de moléculas indicadoras producen un cambio medible en las propiedades eléctricas, como un cambio en la impedancia y/o capacitancia que puede correlacionarse con la concentración de analito. El dispositivo es útil para controlar las concentraciones de analitos que son marcadores biológicos de infecciones bacterianas, virales o fúngicas, enfermedades o afecciones médicas, o su gravedad, en animales como humanos, animales de granja, peces y mascotas, y en plantas .

Otro ejemplo es W02016035099, donde se provee un dispositivo de flujo continuo para la detección y diferenciación de múltiples bioanalitos de una sola muestra y el proceso que involucra su aplicación. El dispositivo es un analizador de inmunoensayo visual, rápido, sensible y confiable para la detección diferencial de múltiples bioanalitos en fluidos biológicos como sangre humana, suero o plasma inmovilizando las respectivas biomoléculas especificas de la enfermedad, es decir, antigenos, anticuerpos, péptidos, péptidos sintéticos o recombinantes y/o proteínas derivadas de microorganismos causantes de enfermedades en la membrana de reacción de inmunof iltración .

En US5563040 se describe un método y un aparato para detectar la descomposición fúngica prematura en madera mediante la detección de la unión de un anticuerpo monoclonal anti-xilanasa y un antigeno de un sustrato de madera. El dispositivo o aparato incluye al anticuerpo monoclonal anti-xilanasa inmovilizado en una zona de captura definida a un sustrato de ensayo de poliéster. El extracto de madera a analizar se aplica al extremo del sustrato de poliéster y se deja que fluya lateralmente a través de la zona de soporte y la zona de captura. Una prueba positiva resulta cuando el antigeno en el extracto de madera se une por los anticuerpos policlonales y monoclonales marcados para formar un complejo de partículas observables .

En el caso particular ensayos de flujo lateral inmunocromatográf ico para la detección de antígenos de hongos, el documento US 93613307 presenta el uso de un ensayo y un producto para la detección rápida de hongos en una variedad de muestras sospechosas de contenerlos. Si bien la invención está enfocada en muestras de hisopos del área vaginal humana, también se describe que puede ser configurada para otros entornos como alimentos humanos y de animales . La invención incluye un ensayo para la detección de la presencia de un hongo en una muestra, utilizando un anticuerpo que reacciona con un antígeno fúngico de glucano B (1-3) establecido en un sistema de ensayo de flujo lateral inmunocromatográf ico .

En CN201911121513 se divulga un kit para detectar rápidamente tres toxinas fúngicas diacetoxiscirpenol , aflatoxina B1 y esterigmatocistina, de forma simultánea. Este kit de fluorescencia con resolución temporal incluye una tira de prueba fluorescente inmunocromatográf ica y un frasco de reacción de muestra que contiene un anticuerpo monoclonal marcado con europio resistente a diacetoxiscirpenol, aflatoxina B1 y esterigmatocistina. En la tira se incluye una almohadilla de absorción de agua, una almohadilla de prueba y una almohadilla de muestra. La almohadilla de detección utiliza una membrana de nitrocelulosa como almohadilla de base, una línea de control de calidad y tres líneas de detección están dispuestas transversalmente en la membrana de nitrocelulosa.

Una de las nuevas alternativas o desarrollos tecnológicos descritos para inmunodetección de un antígeno mediante el uso de complejo de inmunodetección conjugados o funcionalizados con nanopartí culas .

W02017037408 divulga un ensayo para determinar la presencia y/o concentración de un antígeno en una muestra. Para esto, se proporcionan nanopartí culas f uncionali zadas con el antígeno, un anticuerpo especifico para el antigeno, y un complejo de metal luminiscente que puede ser un donante de FRET (Transferencia de energía de resonancia de Fórster) . Es parte del alcance de W02017037408 un ensayo para determinar la presencia y/o concentración del antigeno en una muestra comprende mezclar las nanoparticulas funcional! zadas con un aceptor FRET conjugado al otro del antigeno y el anticuerpo especifico para el antigeno, midiendo una primera señal de fluorescencia de la mezcla, agregando una cantidad de la muestra a la mezcla, y midiendo una segunda señal de fluorescencia de la mezcla. Cualquier diferencia entre la primera y la segunda señales de fluorescencia es indicativa de la presencia del antigeno en la muestra. No se hace alusión a la detección de antigenos de hongos o de Chandros tereum purpureum.

El documento US2016299136 describe un método para realizar ensayos de un solo paso para la determinación de la presencia o ausencia de un analito en una muestra liquida, sobre una superficie sólida. Se proveen partículas de sílice porosa recubiertas de aptámeros y cargadas de moléculas de señal inmovilizadas sobre un material sólido poroso. La interacción especifica del analito con los aptámeros recubiertos en las perlas de sílice provoca la liberación de las moléculas de señal que dan como resultado una señal detectable en el soporte sólido. También se proporcionan dispositivos de ensayo para la plataforma de detección. Se incluye en el alcance la detección de células y esporas de hongos.

Para detección de antigenos de hongos mediante complejos inmunocromatográf icos que incluyen nanoparticulas, en el documento US 2016273055 por ejemplo, se presenta un método eficiente y rápido para identificar un hongo en una muestra de tejido vegetal, donde el método se basa en nanoparticulas (nanoparticulas de oro o nanoparticulas de plata) que detectan la presencia de un ácido nucleico diana, el cual es especifico para un hongo, como por ej . : Raffaelea lauricola. El ensayo incluye los pasos para obtener ácidos nucleicos de la muestra, poner en contacto los ácidos nucleicos de la muestra con una sonda de ácido nucleico monocatenario (ssNA) complementaria a un ácido nucleico objetivo especifico para el hongo y agregar nanoparticulas a la mezcla. Cuando se detecta el ácido nucleico objetivo y por tanto la presencia del hongo, se observa cambió en la coloración asociada a la agregación de las nanoparticulas en la solución. Se propone también un kit de detección basado en el conjugado descrito.

En cuanto a la detección especifica de Chondrostereum purpureum, el documento US20200299752 propone un método para determinar las condiciones de cuantif icación de un microorganismo en una muestra, donde dicho método incluye en su alcance la detección de diferentes microorganismos, entre ellos, hongos del género Chondrostereum. Si bien este documento es genérico e incluye la posibilidad de detección mediante ELISA, el principal alcance del documento es un método basado en detección por PCR. El método descrito en este documento no está enfocado en detección rápida en campo.

Los métodos y kits descritos hasta ahora en el estado del arte para la detección inmunocromatográf ica incluyen la detección de analitos o antigenos de forma genérica, sin definirse específicamente a la detección de un antigeno fúngico particular. Además, si bien se han descritos complejos de detección inmunocromatográf ica basada en la conjugación o funcionalización de anticuerpos con nanoparticulas para exponer la reacción antigeno-anticuerpo, no se han anticipado métodos o kits particularmente dirigidos a la detección de Chondrostereum purpureum.

Tampoco existen antecedentes en el estado del arte o enseñanzas que permitan definir las condiciones para proponer un método y kit de detección de Chondrostereum purpureum en campo, en muestras directamente adquiridas de madera y hojas de especies de interés económico. No se disponen de kit y test de aplicación rápida y en campo .

Descripción de la invención

La invención incluye a un anticuerpo para detectar la presencia del hongo Chondrostereum purpurear en una muestra vegetal, donde dicho anticuerpo se une específicamente a la enzima endopoligalacturonasa de Chondrostereum purpureara (en adelante, anticuerpo anti-endoPG) . El anticuerpo de la presente invención se compone de una cadena pesada y una cadena liviana. La cadena pesada del anticuerpo tiene una secuencia nucleotidica representada por la SEQ ID. 1 y una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID. 2. Por su parte, la cadena liviana tiene una secuencia nucleotidica representada por la SEQ ID. 3 y una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID. 4.

El anticuerpo parte del alcance, puede ser sintetizado por medio de cualquier proceso que permita producir anticuerpos sintéticos. Es reconocido que con la definición de las secuencias nucleotidicas y de aminoácidos es posible realizar la sintesis del anticuerpo.

Es posible su sintesis química, sintesis mediante métodos moleculares para la transformación de microorganismos u organismos hospederos que producen el anticuerpo, métodos que utilizan células recombinantes bacterianas, animales, humanas o hibridomas para la producción de anticuerpos. Se incluyen una variedad de organismos hospederos diferentes, incluidos E. coli, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoría , células de insectos, algas, plantas y células de mamíferos. Se incluyen métodos libres de células como métodos de librerías genómicas y de producción denominados libres de células.

El anticuerpo parte de la invención puede estar conjugado o unido a nanopartí culas , en particular, nanopartí culas de oro. Es parte del alcance de la invención un anticuerpo que está unido o conjugado con nanopartí culas de oro a través de un residuo de L-cisteína para formar un complejo compuesto por las nanopartí culas de oro unidas por medio de un residuo de L-cisteína al anticuerpo (complejo NpsAu+Lc+Ab) .

Como parte del alcance de la invención, las nanopartí culas de oro que se conjugan al anticuerpo tienen un diámetro promedio de 25 nm y una carga superficial de -19, 9 mV.

La presente invención se refiere también a un método para detectar la presencia del hongo fitopatógeno Chondrostereum purpureum en una muestra vegetal y un kit inmunocromatográf ico de detección rápida del hongo Chondrostereum purpureum que incluyen al anticuerpo anti endoPG parte del alcance de la invención.

El método parte de la presente invención permite la detección de la enzima endopoligalacturonasa (endoPG) que produce el hongo Chondrostereum purpureum y que es la responsable de los síntomas foliares del plateado de los frutales. Para la detección del hongo, se proveen anticuerpos contra la enzima endoPG funcionalizados o conjugados con nanopartí culas , en particular, nanopartí culas de oro que se fijan o unen mediante un residuo de L-cisteína (Complejo anticuerpo anti EndoPG/L-cisteína/nanopartí culas de oro, en adelante NpsAu+Lc+Ab o complejo NpsAu+Lc+Ab) . Particularmente, el método para detectar la presencia del hongo Chondrostereum purpureum en una muestra vegetal comprende los siguientes pasos o etapas: a. Preparar la muestra de material vegetal o árbol de interés para obtener un sobrenadante de la muestra, b. Poner en contacto el sobrenadante de la muestra que se va a analizar con un anticuerpo que se une específicamente a la enzima endopoligalacturonasa (anti- endoPG) de Chondrostereum purpureum, donde dicho anticuerpo se encuentra a su vez conjugado con nanoparticulas de oro a través de un residuo de L-cisteina (complejo anticuerpo anti EndoPG/L-cis teina/nanoparticulas de oro NpsAu+Lc+Ab) , y c. evaluar la unión especifica del anticuerpo anti-endoPG, donde si el anticuerpo se une específicamente en la muestra, la muestra contiene al hongo.

Para evaluar la unión especifica del anticuerpo anti-endoPG, se utiliza un método o ensayo seleccionado del grupo que consiste en un procedimiento de inmunocromatográf ica de flujo lateral o ELISA.

Es también parte del alcance de la invención, un kit para la detección rápida en campo del hongo fitopatógeno Chondrostereum purpureum. El kit corresponde a un kit inmunocromatográf ico, en particular, corresponde a ensayos de flujo lateral inmunocromatográf ico .

El kit para la detección rápida del hongo Chondrostereum purpureum en una muestra vegetal comprende una tira reactiva compuesta de una membrana de nitrocelulosa en la cual se encuentran de manera diferenciada la zona para el depósito de la muestra, zona de prueba, zona de control y absorbente. En la zona de prueba y control están contenidos los anticuerpos primarios anti-EndoPG de Chondrostereum purpureum conjugados con nanoparticulas de oro y los anticuerpos secundarios de detección. Como anticuerpo secundario de detección se incluyen anticuerpos anti- rabbit IgG.

El kit comprende además las instrucciones para su uso.

El funcionamiento del kit comprende la difusión por una membrana de nitrocelulosa de nanoparticulas hacia un extracto enzimático, donde el complejo NpsAu+Lc+Ab se rehidrata y se mezcla con la muestra que se desea analizar. Cuando la muestra contiene endoPG es reconocido por el anticuerpo y este complejo difunde hasta ser retenida por un anticuerpo anti-endoPG, el cual se encuentra inmovilizado en la membrana.

Cuando existe exceso de complejo anti-endoPG, esta sigue difundiendo y reacciona con el anticuerpo secundario anti-rabbit IgG, formándose una nueva coloración roja la que es considerada como el control y validando la detección.

Cuando no exista la presencia de endoPG en la muestra, solo aparecerá la coloración roja en el área de control, debido a la no movilización del complejo anticuerpo anti-endoPG.

En particular, se considerará que la prueba de detección es positiva cuando luego de depositar la muestra en la zona de depósito de la membrana de nitrocelulosa y luego de esperar la reacción aparezcan dos lineas rojas, una en la zona de prueba y otra en la zona control .

La detección del kit entonces se basa en la difusión de las nanoparticulas de oro conjugadas a lo largo de la membrana de nitrocelulosa, que por medio de la fuerza de capilaridad se mueve hacia sitios específicos de adsorción para la detección de la enzima por parte de los anticuerpos primarios y secundarios que se encuentran fijados en ella. La reacción utilizó una endoPGl sintética, la cual reaccionó con las lineas del contenido complejo NpsAu+Lc+Ab en la tira de nitrocelulosa y linea control. El kit de detección permite la detección rápida de Chandros tereum purpurean en muestras vegetales en campo, de forma cualitativa.

Para demostrar el funcionamiento de detección del kit propuesto, los inventores validaron en laboratorio el prototipo en muestras de arándano provenientes de Vilcún, y manzano de Chillan, infectadas naturalmente con C. purpureun, y también plantas inoculadas artificialmente con cepas virulentas del hongo. Para el control negativo se utilizó hojas de planta in vitro. Se preparó una muestra de hojas de 1 g, la cual se procesó para obtener el sobrenadante. Luego, un extracto del sobrenadante se adicionó a la membrana de nitrocelulosa que contiene los anticuerpos .

Los resultados de la validación permiten establecer que, en ambas especies frutales evaluadas, se observó detección en un tiempo de reacción aproximado de 20 min (ejemplo 5) .

El método y kit permiten la detección rápida y en campo de la presencia del hongo C. purpureum en material vegetal, particularmente en frutales. Se propone el uso del kit porque sirve para la detección del hongo C. purpureum en campo y en tiempos de detección de 20-30 min. Estas características permiten establecer que el anticuerpo, método y kit permiten detectar al hongo C. purpureum en tiempos de respuesta muy cortos y en condiciones de campo, de tal forma, de lograr reconocer casi de inmediato los cultivos contaminados para la toma de decisiones rápida, efectiva e in situ. El anticuerpo, método y kit descritos como parte de la invención solucionan de mejor forma el problema técnico de disponer de una herramienta de detección rápida y en campo del hongo C. purpureum. En el estado del arte más cercano no existen soluciones equivalentes ni similares. Es parte del alcance de la invención un complejo conformado por el anticuerpo anti EndoPG conjugado con nanoparticulas de oro a través de un residuo de L-cisteina (complejo anticuerpo anti EndoPG/L- cisteina/nanoparticulas de oro) . Este complejo ha sido desarrollado por los inventores para formar parte del método de detección de la presencia del hongo Chondrostereum purpureum y kit de detección rápida ya descritos.

El anticuerpo anti EndoPG corresponde a un anticuerpo monoclonal definido por sus secuencias aminoacidicas y/o nucleotidicas .

En el complejo anticuerpo anti EndoPG/L-cisteina/nanoparticulas de oro, las nanoparticulas de oro tienen un diámetro promedio de 25 nm y una carga superficial de -19, 9 mV.

Las muestras para analizar por medio del kit y del método descrito corresponden a muestras de hoja o madera, preferentemente, hojas frescas. La muestra de hoja fresca a analizar, debe ser molida y procesada para obtener un sobrenadante, el que se deposita en la zona de muestra del sistema de detección. La preparación de la muestra incluye moler hojas o madera fresca (1 g) , macerarlo en buffer (PBS IX) y lavarlo con algún solvente orgánico como acetona. El residuo es resuspendido en buffer PBS IX y agitado. Finalmente, el pellet es descartado y se conserva el sobrenadante, que constituye el extracto enzimático que reacciona con los componentes del kit en la tira.

En la presente invención, el método y kit de detección incluye la identificación de endoPG en muestras de árboles frutales como manzano, kiwi, arándano, perales, frambueso. En otras realizaciones de la invención, el kit de detección puede incluir la identificación de endoPG en muestras de árboles frutales del género Malus sp, Vaccíníum sp, Pyrus sp, Actinidia sp, Rubus sp, Prunus sp, Definiciones

Cuando en la presente solicitud se hace referencia al término "material vegetal", "muestra vegetal" o "muestra de material vegetal", se indica toda aquella muestra para análisis que proviene de un organismo vegetal. De forma particular, una muestra vegetal puede ser obtenida a partir de una planta madura, planta joven, árbol, tronco, restos de madera, semillas, flores, tubérculos u otros tipos de materiales vegetales que pueden servir como muestra.

Cuando se hace referencia al término "presencia" o "presencia del patógeno" o "presencia del hongo", se indica que el hongo ha infectado, crecido y poblado la plata, La presencia del hongo se torna visible cuando daña al material vegetal. En el caso del "hongo patógeno" se hace referencia a hongos que infectan plantas y que causan enfermedades en esta.

Cuando se hace referencia a "nanoparticulas", se indica todo aquel material particulado que presente dimensiones de menos de 100 nm y que puede tener diversos usos. En este caso, las nanoparticulas corresponden a nanoparticulas de oro.

Cuando se menciona el término "anticuerpos" se refiere a aquellas proteínas que forman parte del sistema inmune y pueden encontrarse en la sangre y en otros fluidos en vertebrados. Tienen la capacidad para reconocer y reconocer sustancias extrañas o exógenas . En el caso de la presente invención el "anticuerpo" es utilizado para la detección de una sustancia que secreta el hongo patógeno, esto permite identificar la presencia del patógeno en muestra vegetal y determinar si la muestra proviene de una planta enferma.

Cuando se hace referencia al termino "conjugación" o "anticuerpo conjugado", se indica que el anticuerpo se encuentra ligado o unido químicamente a una sustancia en particular que puede ser una sustancia química. En el caso de la presente invención, el anticuerpo se encuentra conjugado con un compuesto que permite que este se una a la nanopartí cula y en conjunto poseer las propiedades de detección del hongo patógeno.

Cuando se indica el término "anticuerpo anti endoPG", se hace referencia a aquel anticuerpo que es capaz de reconocer la enzima lítica endoPG ( endopoligalacturonasas ) presente en el hongo y con ello indicar la presencia de la enfermedad causada por el patógeno en las plantas .

Se entiende por el término "agente reductor", todo compuesto químico que permite un intercambio de electrones, particularmente, un agente reductor libera electrones que son aceptados por un agente oxidante generando una reacción de oxido-reducción, en donde el agente reductor pierde electrones o se oxida.

Cuando se utiliza el término "detección" se hace referencia a la acción de buscar, rastrear, o explorar una molécula, compuesto, etc. dentro de una muestra determinada. Cuando se refiere a "detección rápida" se indica un método de búsqueda, rastreo y/o exploración de un agente, molécula o sustancia en particular que presenta un tiempo menor para la entrega de resultados . También se hace referencia al termino "detección de campo", señalando aquella acción de búsqueda, rastreo y/o exploración de un agente, molécula o sustancia en particular que puede ser encontrado en tiempo real y dentro de su hábitat.

Cuando en la presente invención se refiere a "tiempo de reacción" se indica el tiempo de respuesta o del tiempo que transcurre desde el inicio de una reacción química hasta obtener el resultado final provista de que la reacción química se realizó por completo.

Cuando se menciona el término "E1ISA", se hace referencia a la técnica de inmunoensayo para la detección de una sustancia, molécula o antígeno basado en la unión de éste con un anticuerpo que lo reconoce de forma especifica, el que a su vez se encuentra unido a una enzima capaz de generar un producto detectable mediante quimioluminiscencia, coloración u otra reacción química. Es parte del alcance del ensayo también, el uso de un segundo anticuerpo para la detección del primero, donde el segundo anticuerpo se encuentra enlazado a la enzima que genera un producto detectable que permite establecer la unión anti geno-anticuerpo .

El término "inmunocromatograf la" hace referencia a una técnica de diagnóstico basado en anticuerpos y cambio de color de la muestra positiva, la cual es rápida y sencilla. La inmunocromatograf la se basa en la adición de una muestra en una zona de conjugación en la membrana de nitrocelulosa, la cual comprende un anticuerpo especifico contra el antígeno a detectar y un reactivo para esta detección. Adicionalmente, cuando se menciona el término "inmunocromatograf ia de flujo lateral" comprende el fundamento de la técnica de inmunocromatograf ia (basándose en la unión antigeno anticuerpo) en donde la tira de reacción se sumerge en una muestra liquida para realizar la detección.

Cuando en la presente invención se hace referencia al termino "kit" se indica a todo conjunto de piezas, elementos, objetos, materiales y/o aparatos que se complementan en su uso y función, y que mediante un folleto de instrucciones puede ser utilizado por quien lo desee.

Descripción de las figuras.

Figura 1 : espectro UV/VIS de las nanoparticulas de oro obtenidas con la sintesis S5. A) el gráfico presenta la longitud de onda (nm) de la nanoparticula óptima para la sintesis de estas según lo descrito en la literatura (P. Preechakasedkit et al . , /Biosensors and Bioelectronics ( 2012 ) 562-566 ) ; b) el gráfico representa las características de longitud de onda de las nanoparticulas obtenidas mediante la síntesis de S5;donde ~ corresponde al inicio al espectro inicial y ^{: : : : ::} B al final. En B) , la flecha indica el peak de la solución a la 520 nm, el cual es equivalente al presentado en la literatura.

Figura 2: Observación de nanoparticulas de oro mediante TEM. Se observa las nanoparticulas que se generaron mediante la sintesis de S5. La observación se lleva a cabo mediante microscopía electrónica de alta resolución (TEM) con un diámetro promedio de 25 nm .

Figura 3: Determinación de la distribución del tamaño y dispersión de las NPsAu. a) el gráfico muestra el diámetro de las nanoparticulas de oro obtenidas de S5, por medio de dispersión de luz dinámica (DLS) . b) el gráfico muestra el potencial Z de las nanoparticulas de S5.

Figura 4: Espectro UV-VIS de las NPsAu funcionalizadas con L- cisteina. a) el gráfico presenta el espectro UV/Vis de L-cisteina pura 200 pM. b) se observa en el gráfico el espectro UV/Vis de las nanoparticulas funcionalizadas con L-cisteina, es posible observar un aumento de la absorbancia en las muestras funcionalizadas (rosado, celeste, verde, rojo) con respecto a la NPs-Au (amarillo) .

Figura 5: Espectro UV-VIS de las NPsAu funcionalizadas conjugadas con el anticuerpo, a) en la figura se presenta el espectro de UV/vis de los anticuerpos, b) la figura presenta el espectro UV- VIS de las nanoparticulas que fueron funcionalizadas y conjugadas con el anticuerpo. En azul, se observa las nanoparticulas funcionalizadas sin anticuerpos, mientras que en rojo se observa el complejo NPsAu-L-cisteina-Anticuerpo .

Figura 6: Aislamiento Chondrostereuia purpureuia desde muestras madera y hojas. A) se presenta la recolección de muestras de madera y el estado de estas, desde las cuales se aisló el hongo C. purpureum mediante siembre en agar aAPD. B) Se presenta las muestras de hojas que fueron recolectadas para el seguimiento de la aparición de signos de la enfermedad y generar una escala de severidad de sintomas, donde 1 corresponde a sano y 9 a la expresión máxima de los sintomas.

Figura 7: Kit de detección de plateado. A) componentes del dispositivo de flujo, b) detección de la enzima por parte del anticuerpo primario, c) esquema de interpretación de resultados del kit, d) prueba de validación en membrana de nitrocelulosa, a la izquierda muestra positiva de huerto y a la derecha control negativo .

Ejemplos de aplicación.

Ejemplo 1: Sintesis nanoparticulas de oro funcionalizadas y producción de anticuerpo inmovilizado sobre las nanoparticulas funcionalizadas .

El primer paso para el desarrollo del kit de detección comprende la sintesis de nanoparticulas de oro.

Parte del kit de detección comprende nanoparticulas de oro y un agente reductor, lo cual da lugar a una solución coloidal estable. Para ello, se sintetizó oro coloidal mono disperso mediante el método de Turkevich modificado. Se prepararon 6 diferentes soluciones acuosas de ácido tetracloroaurico y citrato trisódico, se evaluaron distintas concentraciones de HAUCI y citrato de sodio para seleccionar aquella solución que cumplía con las características deseadas para una solución de nanoparticulas de oro (NPs-Au) (Tabla 1) .

Tabla 1. Soluciones para la síntesis de nanoparticulas de oro.

Se determinaron las características de la solución, según sus propiedades colorimétricas , color rojo intenso y un pico de absorbancia mediante espectro de luz visible (UV-VIS) de 520 nm. Del total de combinaciones reactantes presentadas en la tabla 1, la solución 5 (S5) fue la seleccionada para la síntesis de NPsAu, ya que presento mayor estabilidad coloidal, un color rojo brillante intenso, los cuales son características de absorción descritas en la literatura (P. Preechakasedkit et al /Biosensors and Bioelectronics (2012 ) 562-566 (Fig. 1) . De todas formas, se realizaron otras combinaciones modificando la concentración de citrato, sin embargo, estas no presentaron la coloración rojiza esperada, por lo que fueron descartadas.

Por otro lado, las NPsAu obtenidas mediante la sintesis de S5 se caracterizaron por microscopía electrónica de alta resolución (TEM) , donde fue posible observar las partículas esféricas mono dispersas con un diámetro promedio de 25 nm (fig. 2) . La carga eléctrica o potencial Z de las nanoparticulas , el promedio del tamaño y s distribución se determinó por el método de dispersión de luz dinámica (DLS) empleando el equipo Malvern Zetasizer nano ZS (Fig. 3a; Tabla 2) . Los resultados de estas mediciones indicaron que la carga superficial de las NPaAu fue de -19, 9 mV, lo cual se explica por las cargas negativas que el citrato le entrega a la superficie, esto explica la buena dispersión de las nanoparticulas obtenidas las que presentaron un indice de poli dispersión menor a 0,3 (Fig. 3b; Tabla 3) .

Tabla 2. Tamaño de distribución por intensidad de NPaAu de S5.

Tabla 3. Distribución de potencial Z (carga superficial) de NPsAu de S5.

El segundo paso, corresponde a la funcionalización de las nanoparticulas , esto con el objetivo de obtener NPsAu que puedan emplearse como agentes de diagnóstico. Las superficies de las nanoparticulas (NPsAu) fueron adaptadas para que puedan ser conjugadas con una molécula o ligando que controla el tamaño de la partícula durante la sintesis y prevenir la aglomeración de estas. En este caso, la molécula con la cual se conjugaron las NPsAu corresponden a anticuerpos, los cuales fueron ligados a la NPsAu mediante L-cisteina ya que esta molécula posee un grupo carboxilo que puede mejorar la estabilidad de la conjugación.

Para la funcionalización de las nanoparticulas, se sintetizaron las NPsAu mediante el método de Turkevitch, y luego fueron conjugadas con soluciones de L-cisteina partiendo de un stock de 200 uM y realizando diluciones (0, 1; 0,2; 0,4; 1,2; 4 pM) . Esto con el fin de determinar la concentración óptima de ligando que permita mantener el tamaño de las partículas sin que estas presenten aglomeración. Las soluciones preparadas se agitaron por 2 horas a temperatura ambiente y luego se centrifugaron a 10000 rpm por 15 minutos. Finalmente, se verificó el espectro visible de las NPsAu-ci s teína , teniendo como control el espectro de absorbancia UV-VIS de la L-cisteina pura, donde se usaron 200 pM de esta (fig. 4a) . Las partículas funcionalizadas con L-cisteina presentan un aumento de la absorbancia en las muestras funcionalizadas (rosado, celeste, verde, rojo) con respecto a la NPs-Au (amarillo) (Fig.4b) .

- Anticuerpos Endo

El anticuerpo EndoPG parte del complejo NpsAu+Lc+Ab de la presente invención se compone de una cadena pesada y una cadena liviana. La cadena pesada del anticuerpo se encuentra compuesto por una cadena pesada que tiene una secuencia nucleotidica representada por la SEQ ID. 1 y una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID. 2

Por su parte, la cadena liviana tiene una secuencia nucleotidica representada por la SEQ ID. 3 y una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID. 4.

El anticuerpo puede ser sintetizado por medio de cualquier proceso que permita producir anticuerpos sintéticos. Es reconocido que con la definición de las secuencias nucleotidicas y de aminoácidos es posible realizar la sintesis del anticuerpo.

Es posible su sintesis química, sintesis mediante métodos moleculares para la transformación de microorganismos u organismos hospederos que producen el anticuerpo, métodos que utilizan células recombinantes bacterianas, animales, humanas o hibridomas para la producción de anticuerpos. Se incluyen una variedad de organismos hospederos diferentes, incluidos E. coli, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoría , células de insectos, algas, plantas y células de mamíferos. Se incluyen métodos libres de células como métodos de librerías genómicas y de producción denominados libres de células.

- Inmovilización de los anticuerpos sobre las NPsAu funcionalizadas . Para inmovilizar los anticuerpos en las NPsAu funcional! zadas , se preparó una solución de anticuerpos agregando 1 mL de agua estéril a los anticuerpos liof ilizados . Luego se realizó una dilución de 1:1000 (10 pL anticuerpo en 9990 pL agua estéril) la cual fue utilizada en los ensayos posteriores. Además, se preparó una solución de lavado que comprende 1 mL PBS lOx con 100 pL de BSA al 10% en 9 mL de agua estéril.

Se tomaron 5 tubos de 1, 5 mL a los cuales se les adicionó a cada uno, 1 mL de nanoparticulas con L-cisteina y se mezclaron con 8 pL de anticuerpo, se dejó incubar por 30 minutos a temperatura ambiente. Luego se agregaron 100 pL de BSA al 10% y se dejó incubando por 10 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente los tubos fueron centrifugados a 20000g por 1 hora a 4°C. Se extrajo el sobrenadante y se suspendió el precipitado en 1 mL de solución de lavado, se centrifugó y el pellet obtenido se resuspendió en agua ajustando el pH a 7.

Mediante absorbancia UV/VIS se observó el desplazamiento del peak de 520 a 530 nm y una intensidad de banda menor (menor absorbancia) (fig. 5b) . Esto último, en conjunto con la coloración rojiza que adoptó la solución, indican que la inmovilización del anticuerpo sobre la nanoparticula se realizó. Cabe mencionar que se verifico la absorbancia del anticuerpo sin conjugar (fig. 5a)

Ejemplo 2: Especificidad del anti-endoPG validada en distintos frutales .

Para determinar la especificidad de los anticuerpos en distintos frutales, se utilizó el protocolo de ELISA propuesto para la detección de la endoPGl que produce C. pupureum, en manzano, arándano, ciruelo, cerezo, duraznero y kiwi. Para validar la estandarización del ELISA en las diferentes especies frutales, se analizaron muestras provenientes de huertos comerciales que presentaban infección (colecta mensual: octubre 2017 a mayo 2018) (Tabla 4 ) .

Tabla 4. Sectores de recolección de muestras vegetales contaminadas con plateado para la evaluación de la especificidad a endoPG de las NPaAu funcionalizadas .

En cada uno de los sectores indicados en la tabla 4, se colectaron muestras de madera desde plantas que presentaban sintomas foliares para aislar el patógeno. El aislamiento del patógeno se realizó colocando las muestras sobre agar papa dextrosa 25% acidificado (aAPD 25%, Difeo) , luego se incubó en cámara húmeda para la aparición de signos de la enfermedad del plateado (Fig. 6a) . Además, se recolectaron hojas a una altura de 1,2 m desde el nivel del suelo para ser almacenadas a -20°C y analizadas posteriormente.

En primera instancia se utilizó una escala de severidad de sintomas el cual se determinó mediante la examinación de las hojas, la escala es de 1 a 9 donde 1 es sano y va aumentando la enfermedad hasta 9 (fig. 6b) . El total de muestras recolectadas fue de 432 en un periodo de 30 dias, analizando los sintomas foliares de cada una según lo que se indica en la figura fig. 6b.

A estas muestras se les realizó un análisis cromatográf ico en base a la detección la enzima endopoligalacturonasa (endoPG) que produce el hongo y que es la responsable de los síntomas foliares del plateado de los frutales (Senda et al. , 2001) .

El número total de muestras analizadas corresponde a 24 por especie, con tres repeticiones biológicas (correspondientes a 3 hojas diferentes de la planta) y dos repeticiones técnicas (sobrenadante de molienda de una misma repetición biológica) . El análisis se realizó mediante la técnica de ELISA, en donde las hojas fueron sometidas a molienda en realizó en buffer, luego se incubo con anticuerpo primario y secundario, para luego determinar la DO a una longitud de onda de 450 nm, con ello se calculó la concentración de endoPG (teniendo previamente la curva de calibración desarrollada con los péptidos sintéticos) .

Por otro lado, las plantas de vivero fueron utilizadas como control, estas fueron inocularon con cepas virulentas del patógeno, comprobando la presencia del patógeno mediante su aislamiento en medio de cultivo y detección por PCR, al igual que aquellas plantas con inoculación natural del patógeno. El anticuerpo fue capaz de detectar la enzima en todos los casos, a excepción del kiwi, el cual presenta algunas modificaciones en su protocolo de detección. Se consideraron como plantas enfermas a aquellas que presentaran el doble de la concentración de endoPG (Herrera et al. , 1995) , con respecto al promedio de 10 controles negativos. Los tratamientos utilizados se presentan a continuación (Tabla 5) y la concentración de endoPG detectada:

Tabla 5. Tratamientos utilizados para verificar las diferencias entre la concentración de endoPG presente en plantas con distintas intensidades de síntomas de plateado .

Los resultados muestran que, para ciruelo, cerezo, duraznero y arándano, el nivel mínimo de detección en plantas asintomáticas fue muy superior al doble de los niveles del control. Para manzano, por otra parte, fue superior en todos los casos, pero en algunos, no superior al doble.

Ejemplo 3: Preparación Kit para la detección precoz del plateado de los frutales: Determinación de Sensibilidad de nanoparticulas funcionalizadas en tiras reactivas Para determinar si las nanoparticulas son capaces de detectar la endoPGl se realizó un ensayo de evaluación en donde se colocaron las nanoparticulas sobre tiras de ni trocelulosa, uno de los extremos de este último fue sumergido en el sobrenadante de la molienda de muestras foliares de manzano provenientes de plantas infectadas con el patógeno. El sobrenadante avanzó por la tira de ni trocelulosa por capilaridad hasta las nanoparticulas, marcando una circunferenci en la tira donde estas últimas fueron adicionadas .

La especificidad del conjugado se determinó mediante la interacción de complejos enzimáticos que cumplen funciones similares a endoPGl mediante un ensayo colorimétrico en solución. Este ensayo se realizó haciendo reaccionar dos soluciones comerciales de complejos enzimáticos conteniendo mezclas de enzimas, correspondientes a los productos Natuzym DP Ultra compuesto de pectinliasa, poligalacturonasa , pectinestearasa y arbanasa, y DeltaZym VR ACIDO con celulasas y hemicelulasas . Las dos soluciones de complejos enzimáticos se llevaron a razones de 1:10 y 1:100 respectivamente con agua y buffer PBS. La reacción se llevó a cabo adicionando 6 mL de complejo enzimático con 200 pL de nanoparticulas . En los resultados de este ensayo se observó que no se presentó un cambio de color en ninguna de las reacciones con respecto al control de 1:10. Un análisis espectrof otométrico UV-VIS mostró que las curvas que presentan las distintas reacciones siguieron el mismo patrón de absorbencia entre ellas, indicando que no se presenta un reconocimiento del anticuerpo sobre las enzimas.

Ejemplo 4: Kit inmunoensayo y evaluación de su detección.

El kit de inmuensayo fue prototipado basándose en las enseñanzas de por Tucker et al. , 1980; Nogata et al. , 1993; Priya et al. , 199, y Srivastava y Dwivedi, 2000.

El kit de inmunoensayo comprende una tira reactiva de nitrocelulosa que se compone de cuatro partes o zonas, las cuales corresponden a una zona para el depósito de la muestra, zona de prueba, zona de control y absorbente (Fig.7a) . El complejo de las nanoparticulas se aplica en la parte inferior de la membrana. La zona de prueba y control contienen los anticuerpos primarios, secundario respectiva y finalmente se encuentra el área absorbente. La prueba de detección del kit se basa en la difusión de las nanoparticulas de oro conjugadas a lo largo de la membrana de nitrocelulosa, que por medio de la fuerza de capilaridad se mueve hacia sitios específicos de adsorción para la detección de la enzima por parte de los anticuerpos primarios y secundarios que se encuentran fijados en ella. La reacción utilizó una endoPGl sintética, la cual reaccionó con las lineas del contenido complejo NpsAu+Lc+Ab en la tira de nitrocelulosa y linea control. Los protocolos fueron optimizados para una velocidad de reacción de 15 a 20 minutos (Fig 7b) . Específicamente la función del kit comprende la difusión de las NPsAu hacia el extracto enzimático donde el complejo NpsAu+Lc+Ab se rehidrata y se mezcla con la muestra. Cuando la muestra contiene endoPG, la enzima es capturada por el anticuerpo y este nuevo complejo difunde hasta el área de "test", donde es retenida por el anticuerpo anti-endoPG inmovilizado en la membrana, que es detectado a través de una linea de color rojo. El exceso del complejo anti-endoPG/Np que sobrepasa el área de "test" llega hasta la zona de control y reacciona con el anticuerpo secundario anti-rabbit IgG, formándose una nueva coloración roja ("control") , indicando que el test es válido (fig. 7A) . Si aparece una coloración roja en la zona de control y de test, la muestra es positiva. En el caso que el kit no detecte endoPG en la muestra, sólo aparecerá una coloración roja en el área de control, ya que no se produce la inmovilización del complejo anticuerpo anti endoPG/Nps, debido a la ausencia de antigeno (Fig. 7D) .

Ejemplo 5: Prueba de concepto del kit en 6 frutales de importancia económica .

Para iniciar la prueba de concepto del kit se preparó un extracto enzimático que se adicionó a la membrana de nitrocelulosa que contiene los anticuerpos. Este extracto se preparó masando 1 g de muestra y cortando en trozos pequeños de forma manual. Luego, se macero con 3 mL de buffer PBS IX, el macerado se conservó y se lavó con acetona. El residuo fue resuspendido en buffer PBS IX y agitado. Finalmente, el pellet fue descartado y se conservó el sobrenadante, que constituye el extracto enzimático que reacciona con los componentes del kit en la tira.

El prototipo se validó en laboratorio para muestras de arándano provenientes de Vilcún, y manzano de Chillan, infectadas naturalmente con C. purpureum, y también plantas inoculadas artificialmente con cepas virulentas del hongo. Para el control negativo se utilizó hojas de planta in vitro.

En ambas especies se logró obtener un tiempo de reacción aproximado de 20 min.

Bibliografía

INIA, Instituto de investigaciones agropecuarias. (2018) . Investigadores INIA presentaron investigación en plateado de los frutales en Congreso de Fitopatología en EEUU, https : //www. inia . cl/bl o g/2018/09/ 13/investigadores-i nía- presen tur on-investigacion-en-plateado-de-1 os- fru tale s-en- congreso-de-f itopatologia-en-eeuu/

INIA. (2006) . Revista Tierra Adentro: frutales y viñas. http : //biblioteca. inia. cl/medios/biblioteca/ta/NR33449 ,pdf

P. Preechakasedki t et al /Biosensors and Bioelectronics (2012 ) 562- 566.

Portal frutícola (2019) . Enfermedad del plateado en carozos y arándanos . https : //www. por tal frutícola . com/noticias/2019/08/07/enfermedad- del -plateado -en- carozos -y- arándanos/

Rojo C, Becerra V, France A, Paredes M, Buddie A, Balzarini M. (2017) . Genetic diversity of Chondrostereum purpureum (Pers. ) Pouzar causing silverleaf disease on blueberries in Chile. Guyana Bot . 74 (1) : 176-188.

France, A. , Grinbergs, D. & Carrasco, J. (2016) . First detection of silverleaf (Chondrostereum purpureum) on rabbiteye blueberry (Vaccinium virgatum) and disease damages. XI International Vaccinium Symposium 1180.

Grinbergs, Duina & Chilian, J. & Lisboa, K. & France, Andrés. (2019) . First Report of Silverleaf Disease Caused by Chondrostereum purpureum on Murta (Ugni molinae) in Chile. Plant Disease. 103. 2140-2140. 10.1094/PDIS-12-lbakan, 8-2285-PDN. Grinbergs, D. ; Chilian, J. ; Carrasco-Fernandez, J. ; France, A. ; Moya-Elizondo, E. ; Gerding, M. A PCR-based method for the rapid detection of Chondrostereum purpureum in apple. Plant Dis. 2020, 104, 702-707.

Grinbergs, D. ; Chilian, J. ; Hahn, C. ; Reyes, M. ; Isla, M. ; France, A. ; Bbrve, J. Silverleaf (Chondrostereum purpureum) Effects on Japanese Plum (Prunus salicina) . Preprints.org 2021, 2021060160. https ://doi.org/10.20944 /preprints 202106.0160. vl