Antikörper- Wirkstoff-Konj ogate (ADCs) von KSP-Inhibitoren mit anti-B7H3-Antikörpern Einleitung und Stand der Technik

Die Erfindung betrifft Binder-Wirkstoff-Konjugate (ADCs) von Kinesin Spindel Protein- Inhibitoren, wirksamer Metabolite dieser ADCs, Verfahren zur Herstellung dieser ADCs, die Verwendung dieser ADCs zur Behandluag und/oder Prävention von Krankheiten sowie die Verwendung dieser ADCs zur Hersteilung von Arzneimitteln zur Behandlung und/oder Prävention von Krankheiten, insbesondere von hyperproiiferativen und/oder angiogenen Erkrankungen wie beispielsweise Krebserkrankungen, Solche Behandlungen können als Monotherapie oder auch in Kombination mit anderen Arzneimitteln oder weiteren therapeutischen Maßnahmen erfolgen.

Krebserkrankungen sind die Folge unkontrollierten Zellwachstums verschiedenster Gewebe, in vielen Fällen dringen die neuen Zellen in bestehende Gewebe ein (invasives Wachstum), oder sie metastasieren in entfernte Organe. Krebserkrankungen treten in verschiedensten Organen auf und haben oft gewebespezifische Krankheitsverläufe. Daher beschreibt die Bezeichnung Krebserkrankung als Oberbegriff eine große Gruppe definierter Erkrankungen verschiedener Organe, Gewebe und Zelltypen.

Tumore früher Stadien lassen sich gegebenenfalls durch chirurgische und radiotherapeutische Maßnahmen entfernen. Metastasierte Tumore können im Regelfall durch Chemotherapeutika nur palliativ therapiert werden. Ziel hierbei ist, die optimale Kombination aus einer Verbesserung der Lebensqualität und der Verlängerung der Lebenszeit zu erreichen.

Konjugale von Binderproteinen mit einem oder mehreren Wirkstoffmolekülen sind bekannt, insbesondere in Form sogannter „antibody drug conjugates" (ADCs), in welchen ein internalisierender, gegen ein Tumor-assoziiertes Antigen gerichteter Antikörper auf kovalente Weise über eine Verknüpfungseinheit ("linker") mit einem cytotoxisch wirkenden Agens verbunden ist. Nach Einschleusung des ADCs in die Tumorzelle und anschließender Spaltung des Konjugats wird dann innerhalb der Tumorzelle entweder das cytotoxische Agens selbst oder ein anderer daraus gebildeter cytotoxisch wirksamer Metabolit freigesetzt, und kann dort seine Wirkung direkt und selektiv entfalten. Auf diesem Wege könnte die Schädigung von normalem Gewebe im Vergleich zu einer konventionellen Chemotherapie der Krebserkrankung in signifikant engeren Grenzen gehalten werden [siehe z.B. J. M. Lambert, Curr. Opin. Pharmacol. 5, 543-549 (2005); A. M. Wu und P. D. Senier, Nat. Biotedmol. 23, 1137-1146 (2005); P. D. Senter, Curr. Opin. Chem. Biol. 13, 235-244 (2009); L. Ducry und B. Stump, Bioconjugate Chern. 21, 5-13 (2010)]. So beschreibt WO2012/171020 ADCs, bei denen mehrere Toxophormoleküle über einen polymeren Linker an einen Antikörper verknüpft ist. Ais mögliche Toxophore werden in WO2012/171020 unter anderem die Substanzen SB 743921, SB 715992 (Ispinesib), MK-0371, AZD8477, AZ3146 und ARRY-520 erwähnt.

Die zuletzt genannten Substanzen sind sogenannte Kinesin Spindel Protein-inhibitoren. Kinesin Spindel Protein (KSP, auch bekannt als Eg5, HsEg5, KNSL1 oder KIF11) ist ein Kinesin-ähnliches Motorprotein, welches für die Funktion der bipolaren mitotischen Spindel essentiell ist. Die Inhibienmg von KSP führt zum mitotischen Stillstand und über einen längeren Zeitraum zur Apoptose (Tao et al., Cancer Cell 2005 Jul 8(1), 39-59). Nach dem Auffinden des ersten zeilgängigen KSP-lnhibitors, Monastrol, haben sich KSP-Inhibitoren als eine Klasse neuer Chemotherapeutika etabliert (Mayer et al., Science 286: 971-974, 1999) und sind Gegenstand einer Reihe von Patentanmeldungen (z.B. WO2006/044825; WO2006/002236; WO2005/05 922; WO2006/060737; WO03/060064; WO03/040979; und WO03/049527). Da KSP jedoch nur in einem kurzen Zeitraum der Mitosephase seine Wirkung entfaltet, müssen KSP-Inhibitoren in ausreichend hoher Konzentration während dieser Phase vorliegen. WO2014/151030 offenbart ADCs mit bestimmten KSP-Inhibitoren.

Zusammenfassung der Erfindung

Vor diesem Hintergrund ist es die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Substanzen bereitzustellen, die nach Verabreichung in relativ geringer Konzentration eine apoptotische Wirkung zeigen und damit für die Krebstherapie nützlich sein können.

Zur Lösung dieser Aufgabe stellt die Erfindung Konjugale eines glycosylierten oder Ε Ιγοο8>Ίΐβ!ΐ6η-3ηΐϊ-Β7Η3-Αηΐϊ1ςδφ6Γ8 mit Verbindungen der folgenden Formel (I) bereit, wobei eine oder mehrere der Verbindungen der Formel (1) mit dem Antikörper über einen Linker L verbunden ist bzw. sind. Dabei weisen aglycosylierte Antikörper keine Glycane an der konse -"vierten N-Bindungsstelle in der CH2 -Domäne der Fc-Region auf und binden daher nicht an NK-Zellen. Ein aglycosylierter Antikörper unterstützt daher nicht eine NK-Zell-vermittelte zelluläre Zytotoxizität. Der Antikörper ist vorzugsweise ein humaner, humanisierter oder chimärer monoklonaler Antikörper. Besonders bevorzugt ist ein anti-B 7H3 -Antikörper, der spezifisch die humane Ig4- und/oder die humane und/oder murine Ig2 -Isoform von B7H3 bindet, insbesondere der anti-B7H3-Antikörper TPP-5706 und seine humanisierten Varianten. Formel (I):

wobei

R ¹ H, -L-#l, -MOD oder -(CH ₂ )o-3Z darstellt, wobei Z -H, -NHY ³ , -OY ³ , -SY ³ , Halogen, - CO-NY'Y ² , oder -CO-OY ³ darsteilt,

wobei Y ¹ und Y ² unabhängig voneinander H, H ₂ , -(CH ₂ CH ₂ 0)o-3-(CH2)o-3Z'(z.B. -(CH ₂ ) ₀ -3Z'), oder -CH(CH ₂ W)Z' darstellen, und Y ³ H oder -<CH ₂ ) ₀ - ₃ Z' darstellt, wobei Z' H, NH ₂ , SO3H, COOH, ~NH-CO~CH ₂ -CH ₂ -CH(NH ₂ )COOH oder -(CO-NH-CHYVsCOOH darstellt; wobei W H oder OH darstellt,

wobei Y ⁴ lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit-NHCONH ₂ substituiertes, Cs -6 Alkyl oder gegebenenfalls mit -NH ₂ substituiertes Aryi oder Benzyl darsteilt;

R ² H, -MOD, -CO-CHY ⁴ -NHY ⁵ oder -(CH ₂ )o. ₃ Z darstellt,

wobei Z -H, Halogen, -OY ³ , -SY ³ , NHY ³ , -CO-NY'Y ² , oder -CO-OY ³ darsteilt,

wobei Y ¹ und Y ² unabhängig voneinander H, NH ₂ , oder -(CH ₂ )o-3Z' darstellen, und Y ^J H oder -

(CH ₂ ) ₀ - _; Z' darsteilt, wobei Ζ' H, SO ₃ H, NH ₂ oder COOH darsteilt;

wobei Y* lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit-NHCONH? substituiertes, Ci-β Alkyl oder gegebenenfalls mit -NH ₂ substituiertes Aryl oder Benzyl darstellt und Y ⁵ H oder -CO-CHY*-NH ₂ darstellt, wobei Y* lineares oder verzweigtes Cw Alkyl darstellt;

R ⁴ H, L #!, -SG _lys -(CO) ₀ .] _. -R ⁴ ' , -CO-CHY ⁴ -NHY ⁵ oder - ί ί Ί Ι · ) ^, . 7. darstellt,

wobei SGi _ys eine durch ein lysosomales Enzym spaltbare Gruppe darstellt, insbesondere eine Gruppe bestehend aus einem Di- oder Tripeptid, R ⁴ 'eine C i - io-Alkyl-, Cs- 10- Aryl- oder Ce-ιο- Aralkyl-, Cs-io-Heteroalkyl-, C i- io-Alkyl-O-Ce-io-Aryl-, Cs-io-Heterocycloalkyl-, Heteroaryl-, Heteroaryl-alkyl-, Heteroaryl-alkoxy-, Ci-io-Alkoxy-, Ce-io-Aryloxy- oder Ce-io-Aralkoxy-, C5- 10- Heteroaraikoxy-, Ci-io-Alkyl-O-Ce-io-Aryloxy-, C5-1 o-Heterocycloalkoxy-Gruppe, die ein oder mehrfach mit - NH ₂ , -NH-Alkyl, -N(Alkyl) ₂ , NH-CO-Alkyl, N(Alkyl)-CQ Alkyl, -SO3H, -SO2NH2, -S0 ₂ -N(Aikyi) ₂ , -COOH, -CONH ₂ , -CON(Alkyl) _2> oder -OH substituiert sein kann, -H oder eine Gruppe -^-(C^OH^O^-R ⁴ ' ^" darstellt, {wobei x 0 oder 1 und v eine Zahl von 1 bis 10 darstellt, und R ⁴ " -H, -Alkyi (vorzugsweise C _M2 -Alkyl), -CH2-COOH, -CH ₂ -CH ₂ -COOH, oder -CH ₂ - CH2-NH2 darstellt), wobei nach Spaltung eine primäre Amingruppe vorliegt (entsprechend R = H); wobei Z -H, Halogen, -OY ³ , -SY ³ , NHY ³ , -CO-NY'Y ² , oder -CO-OY ³ darstelit,

wobei Y ¹ und Y ² unabhängig voneinander H, NH ₂ , oder -(CH2V3Z' darstellen, und Y ³ H oder - CC ^' l I -).. ./.· darstelit, wobei Z ¹ H, SO ₃ H, NH ₂ oder COOH darstelit;

wobei Y ⁴ lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit -NHCONH2 substituiertes, Ci-s Alkyl oder gegebenenfalls mit -NH ₂ substituiertes Aryl oder Benzyi darstellt und Y ⁵ H oder ~CO-CHY ⁶ -NH ₂ darstellt, wobei Y ⁶ lineares oder verzweigtes Ci-e Alkyl darstellt;

oder R ² und R ⁴ gemeinsam (unter Bildung eines Pyrrolidinringes) -CH2-CHR ¹¹ - oder -CHR' '-CH2- darstellen, wobei R ¹ ' H, NH ₂ , SO3H, COOH, SH, Halogen (insbesondere F oder Cl), C _M Alkyi, Ci-*HaIoalkyl, Ci-4 Alkoxy, Hydroxyl-substituiertes C1-4 Alkyl, COO(C i- ₄ Alkyl)oder OH darstellt;

A CO, SO, SO2, SO2NH oder CNNH ₂ darstellt;

R' -L-#l, -MOD, oder eine gegebenenfalls substituierte Alkyl-, Cycloalkyl-, Aryl-, Heteroaryl- Heteroalkyl-, Heterocycloalkyl- Grappe darstellt, bevorzugt -L-#l oder eine C _M 0- Alkyl-, Ce-io- Aryl- oder Ce-io-Aralkyl-, Cs-io-Heteroalkyl-, Ci-io-Alkyl-0-C6-io-Aryl- oder C5- 10- Heterocycloalkyl -Gruppe, die mit 1-3 -OH Gruppen, 1-3 Halogenatomen, 1-3 halogenierten Alkylgruppen (die jeweils 1 -3 Halogenatome aufweisen), 1 -3 O-Alkyl Gruppen, 1-3 -SH Gruppen, 1-3 -S- Alkyl Gruppen, 1 -3 -O-CO-Alkyl Gruppen, 1-3 -Q-CO-NH-Alkyl Gmppen, 1-3 -NH-CO- Alkyl Gruppen, 1 -3 -NH-CO-NH-Alkyl Gruppen, 1-3 -S(0) _n - Alkyl Gruppen, 1 -3 -S0 ₂ -NH-Alkyl Gruppen, 1-3 -NH-Alkyl Gruppen, 1-3 -N(Alkyl)2 Gruppen, 1 -3 -NH ₂ Gmppen oder 1-3 -(CH ₂ )o- ₃ Z Gmppen, n für 0, 1 oder 2 steht, wobei Z -H, Halogen, -OY ³ , -SY ³ , -NHY ³ , -CO-ΝΥΎ ² , oder - CO-OY' darstellt, mit Y ¹ und Y ¹ unabhängig voneinander H, NH2, oder -(CH2)o-3Z' darsteilen, und Y ³ H, -(CH ₂ )o- ₃ -CH(NHCOCH ₃ )Z',-(CH ₂ )o- ₃ -CH(NH ₂ )Z', oder -( ( I i ·/ ^' : darstellt, wobei 7: H, SO ₃ H, NH ₂ oder COOH darstellt,

substituiert sein kann (wobei„Alkyl" bevorzugt Cj-io-Alkyl bedeutet);

R ⁵ H, MI,, NO2, Halogen (insbesondere F, Cl, Br), -CN, CF ₃ , -OCF ₃ , -CH ₂ F, -CH ₂ F, SH oder -(CHjjo-sZ darstellt, wobei Z -H, -OY ³ , -SY ³ , Halogen, NHY ³ , -CO-NY ^! Y ² , oder -CO-OY ³ darstellt,

wobei Y ¹ und Y ² unabhängig voneinander H, NH ₂ , oder -(CH ₂ )o-3Z ' darstellen, und Y ³ H oder - (Ci i ), ./.· darstellt, wobei Z' H, SO3H, NH ₂ oder COOH darstellt; darstellt,

R ⁶ und R' unabhängig voneinander H, Cyano, (ggf. fluoriertes) Ci-io-Alkyl, (ggf. fluoriertes) C ₂ -io-Alkenyl, (ggf. fluoriertes) C ₂ -io~Aikmyi, Hydroxy, N0 ₂ , NH ₂ , COOH oder Halogen (insbesondere F, Cl, Br) darstellen,

R ⁸ (ggf. fluoriertes) Ci-io-Alkyi, (ggf. fluoriertes) C ₂ - ₁₀ -Alkenyl, (ggf. fluoriertes) C2-10- Alkinyl, (ggf. fluoriertes) C4.10-Cycloalk.yi oder-(CH ₂ )o.. ₂ -(HZ ) darstellt, wobei HZ ein 4 bis 7- gliedriger Heterocyclus mit bis zu zwei Heteroatomen ausgewählt aus N, O und S darstellt, wobei jede dieser Gruppen mit -OH, CO2H oder NH? substituiert sein kann;

R ⁹ H, F, CH ₃ , CF ₃ , CH ₂ F oder CHF ₂ darstellt;

wobei einer der Substituenten R' , R ^~ oder R ⁴ -L-#l darstellt bzw. (im Falle von R ⁸ ) aufweist, L für den Linker steht und #1 für die Bindung zum Binder bzw. Derivat hiervon steht, wobei -MOD -(N ^l0 ) _n -(Gl) _o -G2-G3 darstellt, wobei R ^]0 H oder C i-C ₃ -Alkyl darstellt;

Ol -NHCO-, oder -CONH- darstellt (wobei wenn Gl -NHCO- darstellt, R ¹⁰ nicht NH ₂ ist);

n 0 oder 1 ist;

o 0 oder 1 ist; und

G2 eine geradkettige und/oder verzweigte Kohlenwasserstoffgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen ist, die einfach oder mehrfach durch eine oder mehrere der Gruppen -O-, -S-, -

SO-, SO2, -NRY-, -NRYCO-, CONRY-, -NRYNRY-, -S02 RYNRy-, -CONR 'NR -, (wobei R ^y H, Phenyl, C1 -C1 g-Alkyl, C2-C1 _Q -Alkenyl, oder C ₂ -C _{ Q- Alkinyl darstellt, die jeweils mit

NHCO H ₂ , -COOH, -OH, -NH ₂ , NH-CNNH ₂ , Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können), -CO-, oder -CR"=N-0- (wobei Rx H, C _j -C^-Alkyl oder Phenyl darstellt) unterbrochen sein kann, wobei die Kohlenwasserstoffkette einschließlich der Seitenketten, sofern vorhanden, mit - HCONH ₂ , -COOH, -OH, -Ni l... H-CN H ₂ , Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein kann, G3 -H oder -COOH darstellt, und wobei die Gruppe - MOD vorzugsweise zumindest eine Gruppe -COOH aufweist; sowie ihre Salze, Solvate, Salze der Solvate und Epimere.

Die erfindungsgemäßen Konjugale können ehemisch labile Linker, enzymatisch labile Linker oder stabile Linker aufweisen. Besonders bevorzugt sind stabile Linker und durch eine Protease spaltbare Linker.

Die Erfindung stellt ferner bereit Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Konjugale sowie Vorstufen und Intermediate zur Herstellung.

Die Herstellung der erfindungsgemäßen Konjugate umfasst regelmäßig die folgenden Schritte:

Herstellen einer ggf. Schutzgruppen tragenden Linkervorstufe mit einer reaktiven Gruppe, die an den Antikörper koppeln kann;

Konjugieren der Linkervorstufe an das ggf. Schutzgruppen tragende Derivat eines KSP-Inhibitors der Formel (i) , wobei in diesen Formeln eine Bindung an einen Linker noch nicht vorliegt), wobei ein ggf. Schutzgruppen tragendes reaktives KSP-Inhibitor-Linker-Konjugat erhalten wird;

Abspaltung der ggf. vorhandenen Schutzgruppen im KSP-Inhibitor-Linker-Konjugat und

Konjugieren des Antikörpers an das KSP-Inliibitor-Linker-Konjugat, wobei das erfindungsgemäße erhalten wird.

Die Anknüpfung der reaktiven Gruppe kann auch nach Aufbau einer ggf. geschützt vorliegenden KSP-Inhibitor-Lmkervorstufe Konj ugats erfolgen.

In Abhängigkeit vo Linker können Succinimid-verknüfte ADCs nach der Konjugation nach Schema 26 in die offenkettigenen Bernsteinsäureamide überführt werden, die ein vorteilhaftes Stabilitätspro il aufweisen.

Wie oben erläutert, kann das Konjugieren der Linkervorstufe an einen niedermolekularen KSP- lnhibitor durch Substitution eines Wasserstoffatoms an R ¹ , R ³ oder R ⁴ in Formel (Ϊ) durch den Linker erfolgen. In den Syntheseschritten vor der Konjugation können ggf. vorhandene funktionelle Gruppen auch in geschützter Form vorliegen. Vor dem Konjugationsschritt werden diese Schutzgruppen nach bekannten Methoden der Peptidchemie entfernt. Die Konjugation kann chemisch auf verschiedenen Wegen erfolgen, wie in den Schemata 20 bis 31 in den Beispielen exemplarisch dargelegt. Es ist insbesondere möglich, den niedermolekularen KSP-Inhibitor für die Konjugation an den Linker ggf, zu modifizieren, z.B. durch Einfahren von Schutzgruppen oder Abgangsgruppen zur einfacheren Substituierung.

Insbesondere stellt die Erfindung neue niedermolekulare KSP-Inhibitoren bereit, die an einen anti- B7H3 -Antikörper konjugiert werden. Diese KSP-Inhibitoren bzw. ihre Antikörper-Konjugate weisen die folgende allgemeine Formel (II) auf:

wobei

R ¹ H, -L-BINDER, -MOE) oder -(CH2V3Z darstellt, wobei Z -H, - HY ³ , -

OY ³ , -SY ³ , Halogen, -CO-NY'Y ² , oder -CO-OY ³ darstellt,

wobei

Y ¹ und Y ² unabhängig voneinander H, NH ₂ , -ίΠ ^' ίΚ))., Η(Ή·),..7 /,Η,

lCil-h ./:). oder -CH(CH ₂ W)Z' darstellen,

Y ³ H oder -(CH ₂ )o-3Z ^l darstellt,

Z' H, NH ₂ , SO ₃ H, COOK, - H-CO-CH ₂ -CH ₂ -CH( H ₂ )COOH

oder -(CO-NH-CHY^uCOOH darstellt;

W H oder OH darstellt,

Y* lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit -NH-C(=0)-NH ₂ substituiertes, Ci-e Alkyl oder gegebenenfalls mit -NH ₂ substituiertes Ar l oder Benzyl darstellt;

R ² H, -MOD, -C(-0)-CHY ⁴ -NHY ⁵ oder -(CH ₂ )o-3Z darstellt,

oder

R ² und R ⁴ gemeinsam (unter Bildung eines Pyrrolidinringes) -CH ₂ -CHR ^!l - oder

-CHR ⁿ -CH ₂ - darstellen. wobei

R" -H, -NI-I2, -SO3H, -COOK, -SH, Halogen (insbesondere F oder Cl),

C M Alkyl, C M Haloalkyl, G- ₄ Alkoxy, Hydroxyl- substituiertes C M Alkyl, COO(C. - ₄ Alkyl) oder -OH darsteilt;

Z -H, Halogen, -OY ³ , -SY ³ , HY ³ , -CO-NY'Y ² , oder -CO-

OY ³ darstellt,

Y ' und Y ² unabhängig voneinander H, NH ₂ , oder -(CH ₂ )o-3Z ' darstellen, und Y ³ H oder -(CH2V3Z' darstellt, wobei Z' H, Süd ! . H ₂ oder COOH darstellt;

wobei Y ⁴ lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit-NHCONtb substituiertes, Ci -6 Alkyl oder gegebenenfalls mit ~NH ₂ substituiertes Aryi oder Benzyl darsteilt und Y ⁵ H oder -CO-CHY ⁶ -NH ₂ darstellt, wobei Y ⁶ lineares oder verzweigtes Cw Alkyl darstellt;

R ⁴ H, -L-BINDER, -SG _lys -(CO) ₀ .i-R ⁴ ', -CQ-CHY ⁴ -NHY ⁵ oder - Ci M, . . darstellt,

wobei SG _j y _g eine durch ein lysosomales Enzym spaltbare Gruppe darstellt, insbesondere eine Gruppe bestehend aus einem Di- oder Tripeptid, R ^h eine Ci-10-Alkyl-, Cs-io-Aryl- oder Ce-io- Aralkyl-, Cs-io-Heteroalkyl-, Ci-io-Alkyl-O-Ce-io-Aryl-, Cs-io-Heterocycloalkyl-, Heteroaryl-, Heteoaryl-alkyl-, Heteroaryl-alkoxy-, Ci-io-Alfcoxy-, Ce-io-Aryloxy- oder Ce- ιο-Aralkoxy-, C5-10- Heteroaralkoxy-, Ci-io-Alkyl-O-Ce-io-Aryloxy-, Cs-io-Heteroeyeloalkoxy-Gruppe, die ein oder melärfach mit - NH ₂ , -NH-Alkyl, -N(Alkyl) ₂ , NH-CO-Alkyl, N(Alkyl)-CO Alkyl, -SO3H, -SO2NH2, -S0 ₂ -N(Alkyl) ₂ , -COOH, -CONH ₂ , -CON(Aikyl) ₂ , oder -OH substituiert sein kann, -H oder eine Gruppe -O _x -{CH2CH ₂ 0) _v -R ⁴ " darsteilt, {wobei x 0 oder 1 und v eine Zahl von 1 bis 10 darsteilt, und R ⁴ " -H, -Alkyl (vorzugsweise C _M 2-Alkyl), ·( I !; ·( ^{( )( )} ! !. -CH ₂ -CH ₂ -COOH, oder -CH ₂ - CH ₂ -NH2 darstellt), wobei nach Spaltung eine primäre Amingrappe vorliegt (entsprechend R ⁴ = H); wobei Z -H, Halogen, -OY ³ , -SY ³ , NHY ³ , -CO-NY'Y ² , oder -CO-OY ³ darstellt,

wobei Y ¹ und Y ¹ unabhängig voneinander H, NH ₂ , oder -(CH ₂ )o-3 ^l darstellen, und Υ' H oder -

(CH2 3 ' darsteilt, wobei Z' H, SO3H, NH ₂ oder COOH darsteilt;

wobei Y* lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit-NHCONH ₂ substituiertes, C1-6 Alkyl oder gegebenenfalls mit -NH ₂ substituiertes Aryi oder Benzyl darstellt und Y ⁵ H oder -CO-CHY ⁶ -NH ₂ darstellt, wobei Y ⁶ lineares oder verzweigtes Cw Alkyl darstellt;

oder R ² und R ⁴ gemeinsam (unter Bildung eines Pyrrolidinringes) -CH ₂ -CHR ^{] i} - oder -CHR ^{I ]} -CH ₂ - darstellen, wobei R ^{! i} H, NH ₂ , SO3H, COOH, SH, Halogen (insbesondere F oder Cl), C M Alkyl, Cw Haioalkyl, CwAlkoxy, Hydroxyl-substituiertes C M Alkyl, COO(Ci. ₄ Alkyl) oder OH darstellt;

A oder -CNNH ₂ - darstellt; R ³ -L-BTNDER, -MOD, oder eine gegebenenfalls substituierte Alkyl-, Cycioalkyl-, Ar l-, Heteroaryl- Heteroalkyl-, Heterocycloalkyl- Gruppe darstellt, bevorzugt -L-BINDER oder eine Ci- ₁₀ - Alkyl-, Ce-io-Aryi- oder ( ^' . ..-Araikvl -. C ₅ -io-Heteroalkyl-, ( _;! · ΛΙΚ l-OC. ., ·Λη. Ι· oder ( \ .,· Heterocycloalkyl-Gruppe, die mit 1 -3 -OH Gruppen, 1-3 Halogenatomen, 1-3 halogenierten Alkylgruppen (die jeweils 1-3 Halogenatome aufweisen), 1-3 O-Alkyl Gruppen, 1-3 -SH Gruppen, 1-3 -S- Alkyl Gruppen, 1-3 -O-CO-Alkyl Gruppen, 1 -3 -O-CO-NH- Alkyl Gruppen, 1 -3 -NH-CO- Alkyl Gruppen, 1-3 -NH-CO-NH- Alkyl Gruppen, 1-3 -S(0) _n -Alkyl Gruppen, 1-3 -S0 ₂ -NH-Aikyi Gmppen, 1 -3 -NH- Alkyl Gmppen, 1 -3 -N( Alkyl)? Gruppen, 1 -3 -NH2 Gruppen oder 1 -3 -(CH2 )o- ₃ Z Gruppen, wobei Z -H, Halogen, -OY ³ , -SY ³ , -NHY ³ , -CO-NY'Y ² , oder -CO-OY ³ darstellt, mit Y ^! und Y ² unabhängig voneinander H, NH2, oder -(CtbVsZ' darstellen, und Y ³ H, -(CH ₂ )o-3-CH(NHCOCH ₃ )Z',-(CH ₂ )o-3-CH(NH ₂ )Z', oder -{CH ₂ ) ₀ -3Z ' darstellt, wobei Z' H, SO ₃ H, NH ₂ oder COOH darstellt,

substituiert sein kann (wobei„Alkyl" bevorzugt Ο-10-Alkyi bedeutet);

n für 0, 1 oder 2 steht,

R ⁵ H, NH2, NO2, Halogen (insbesondere F, Cl, Br), -CN, CF ₃ , -OCF3, -CH ₂ F, -CH ₂ F, SH oder - (CH ₂ )o-3Z darstellt, wobei Z -H, -OY ³ , -SY ³ , Halogen, NHY ³ , -CO-NY'Y ² , oder -CO-OY ³ darstellt, wobei Y ¹ und Y ² unabhängig voneinander H, NH ₂ , oder -(CH2V3Z' darstellen, und Y ^J H oder - (CH ₂ J ₀ -3Z' darstellt, wobei Z' H, SO ₃ H, oder COOH darstellt.

R ⁵ (ggf, fluoriertes) Ci-10-AIkyl, (ggf. fluoriertes) C -io-AIkenyl, (ggf. fluoriertes) C2-io-AIkinyl, (ggf. fluoriertes) oder -(CH2)o-2-(HZ ² ) darstellt, wobei HZ ² ein 4 bis 7-gliedriger Heterocyclus mit bis zu zwei Heteroatomen ausgewählt aus N, O und S darstellt (vorzugsweise Oxetan), wobei jede dieser Gruppen mit -OH, CO2H oder NH ₂ substituiert sein kann;

R ⁹ H, F, CH ₃ , CF ₃ , CH ₃ F oder CHF ₂ darstellt; wobei L für einen Linker steht und BINDER für einen aglycosylierten anti-B7H3 -Antikörper steht, wobei der Binder ggf. an mehrere Wirkstoffmoleküle gebunden sein kann, wobei ein Vertreter von R ^! R ³ , und R ⁴ -L-Binder darstellt;

R° und R' unabhängig voneinander H, Cyano, (ggf. fluoriertes) C1-1»- Alkyl, (ggf. fluoriertes) C2-10- Alkenyl, (ggf. fluoriertes) C ₂ -io-Alkinyl, Hydroxy, NO2, NH2, COOH oder Halogen (insbesondere F, Cl, Br) darsteilen, wobei -MOD -(NR ¹⁰ ) _n -(Gl) _o -G2-G3 darstellt, wobei R ^iö H oder Ci-C ₃ -Alkyl darstellt;

Gl M ICO- oder -CONH- darstellt (wobei wenn Gl -NHCO- darstellt, R ¹⁰ nicht NH ₂ ist);

n 0 oder 1 ist;

o 0 oder 3 ist; und

G2 eine geradkettige und/oder verzweigte Kohlenwasserstoffgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen ist, die einfach oder mehrfach durch eine oder mehrere der Gruppen -O-, -S-, -

SO-, SO ₂ , -NRY-, - R ^} 'CO-, CONR>'-, -ΝΕΤΝίΟ'-, -S02NRWRy-, -CONR NRY-, (wobei R ^y H, Phenyl, C j -C i Q-Alkyl, C ₂ -C i Q-Alkenyl, oder C2-C1 g-Alkinyl darstellt, die jeweils mit

NHCONH ₂ , -COOH, -OH, -NH ₂ , i\H-CNi\H ₂ , Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können), -CO-, oder -CR"=N-0- (wobei R H, C 1 -C3-Alkyl oder Phenyl darstellt) unterbrochen sein kann, wobei die Kohlenwasserstoffkette einschließlich der Seitenketten, sofern vorhanden, mit -NHCONH ₂ , -COOH, -OH, -NH ₂ , NH-CNNH ₂ , Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein kann, G3 -H oder -COOH darstellt, wobei die Gruppe -MOD vorzugsweise zumindest eine Gruppe -COOH aufweist; sowie ihre Salze, Solvate, Salze der Solvate und Epimere.

Beschreibung der Figuren

Figur 1 : Internalisienmgsverhalten des spezifischen B7H3 Antikörpers TPP5706 in der humanen Nierenkrebs-Zellline A498 .

Dargestellt ist der kinetische Verlauf der Intemalisierung des fluoreszenzmarkierten B7H3- Antikörpers über 24 Stunden. Zur Detektion Target-unabhängiger Intemalisierung wurde eine fluoreszenmarkierte Isotyp-Kontrolie parallel verwendet. Detaillierte Versuchsbedingungen sind unter C-2b beschrieben (x-Achse: Zeit in Stunden; y-Achse: Granula-Anzahl pro Zelle)

Figur 2 : Sequenzprotokoll

Detaillierte Beschreibung der Erfindung Die Erfindung stellt Konjugale eines anti~B7H3 -Antikörpers wie TPP-5706 sowie aglycosyiierte und/oder humanisierte Varianten von TPP-5706 mit einem oder mehreren Wirkstoffmol ekülen bereit, wobei das Wirkstoffmoiekü! ein Kinesin Spindel Protein-Inhibitor {KSP-lnhibitor) ist, das mit dem Antikörper über einen Linker L verbunden ist.

Das erfindungsgemäße Konjugat kann durch die allgemeine Formel

BINDER L KSP

n dargestellt werden, wobei BINDER für den anti-B7H3 -Antikörper wie TPP-5706 sowie aglycosyiierte und/oder humanisierte Varianten von TPP-5706, L für den Linker, KSP für den KSP-lnhibitor, und n für eine Zahl von 1 bis 50, vorzugsweise 1,2 bis 20 und besonders bevorzugt 2 bis 8 steht. Hierbei ist n ein Mittelwert der Anzahl an KSP-Inbibitor-Linker-Konjugate pro BINDER. KSP-L weist vorzugsweise die oben aufgeführte Formel (I) auf. Weiterhin ist es bevorzugt, dass der Linker an verschiedene Aminosäuren des Antikörpers gebunden ist. Besonders bevorzugt ist eine Bindung an unterschiedliche Cysteinreste des Binders. Der Antikörper ist vorzugsweise ein aglycosylierter humaner, humanisierter oder chimärer monoklonaler anti-B7H3- Antikörper oder antigenbindende Fragmente davon. Besonders bevorzugt ist ein antt-B7H3- Antikörper, der spezifisch die humane 4Ig-Isoform bindet, insbesondere der anti-B7H3 -Antikörper TPP-5706 und seine humanisierten Varianten wie TPP-6642 und TPP-6850.

Im Folgenden werden erfindungsgemäß verwendbare Antikörper, erfindungsgemäß verwendbare KSP-Inhibitoren sowie erfindungsgemäß verwendbare Linker beschrieben, die ohne Einschränkung in Kombination verwendet werden können. Insbesondere können die jeweils als bevorzugt bzw. besonders bevorzugt dargestellten Binder in Kombination mit den jeweils als bevorzugt bzw. besonders bevorzugt, dargestellten KSP-Inhibitoren, ggf. in Kombination mit den jeweils als bevorzugt bzw. besonders bevorzugt dargestellten Linkern verwendet werden.

KSP-Inhibitoren und deren Binderkonjugate

Definitionen

Der Begriff„substituiert" bedeutet, dass ein oder mehrere Wasserstoffe an dem bezeichneten Atom bzw. der bezeichneten Gruppe durch eine Auswahl aus der angegebenen Gruppe ersetzt ist/sind, mit der Maßgabe, dass die normale Wertigkeit des bezeichneten Atoms unter den vorliegenden Umständen nicht überschritten wird. Kombinationen von Substituenten und oder Variablen sind zulässig.

Der Begriff„gegebenenfalls substituiert" bedeutet, dass die Anzahl an Substituenten gleich oder verschieden von Null sein kann. Wenn nicht anders angegeben, können gegebenenfalls substituierte Gruppen durch so viele fakultative Substituenten substituiert sein, wie sieh durch Ersetzen eines Wasserstoffatoms durch einen Nicht- Wasserstoff-Substituenten an einem beliebigen verfügbaren Kohlenstoff- oder Stickstoff- oder Schwefelatom unterbringen lassen. Normalerweise kann die Anzahl an fakultativen Substituenten (falls vorhanden) 1, 2, 3, 4 oder 5, insbesondere von 1 , 2 oder 3 sein.

So, wie hier verwendet, bedeutet der Ausdruck "ein- oder mehrfach", zum Beispiel in der Definition der Substituenten der Verbindungen der allgemeinen Formeln der vorliegenden Erfindung, "3 , 2, 3, 4 oder 5, bevorzugt 1, 2, 3 oder 4, besonders bevorzugt 1, 2 oder 3, ganz besonders bevorzugt 1 oder 2".

Sind Reste in den erfindungsgemäßen Verbindungen substituiert, so können die Reste, wenn nicht anders angegeben, ein- oder melirfach substituiert sein. Im Schutzbereich der vorliegenden Erfindung sind die Bedeutungen aller Reste, die melirfach auftreten, unabhängig voneinander. Eine Substitution durch ei en, zwei oder drei gleiche oder verschiedene Substituenten ist bevorzugt. Die Substitution durch einen Substituenten ist besonders bevorzugt.

Alkyl steht für einen linearen oder verzweigten, gesättigten, monovalenten Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen (Ci-Cio- Alkyl), in der Regel 1 bis 6 (C Ce-Alkyl), bevorzugt, 1 bis 4 (CV C4- Alkyl), und besonders bevorzugt 1 bis 3 Kohlenstoffatomen (Ci-Ca-Alkyl).

Beispielhaft und bevorzugt, seien genannt:

Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Butyl-, Pentyl-, Hexyl-, iso-Propyl-, iso-ßutyl-, sec-Butyl, tert-Butyl-, iso-Pentyl-, 2-Methylbutyl-, l-Methylbutyl-, 1 -Ethylpropyl-, 1 ,2-Dimethylpropyl, oeo-Pentyl-, 1,1-Dimethylpropyl-, 4-Methylpentyl-, 3-Methylpentyl-, 2-Methylpentyl-, 1-Methylpentyl-, 2-Ethylbutyl-, 1 -Ethylbutyl-, 3,3-Dirnethylbutyl-, 2,2-Dimethylbutyl-, 1, 1-Dimethylbutyl-, 2,3-Dimethylbutyl-, 1,3-Dimethylbutyl- und 1 ,2-Dimethylbutyl-.

Besonders bevorzugt ist ein Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Isopropyl- und iert-Butyirest, Heteroalkyl

Heteroalkyl steht für eine geradkettige und/oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 10

Kohlen Sto fatomen, die einfach oder mehrfach durch eine oder mehrere der Gruppen -O-, -S-,

-Ci OK -Si O K -S< O K-- -NRY-, -N ! > ( ( O l-. -Ci C»-\ ^' R. -. -NRYNRY-, -S< ( ⁾ ). -\ ^' Ri ^' \ R. -.

-C(=0)-NRyNRy-, -CR Sf-O- unterbrochen sein kann, und wobei die Kohlenwasserstoffkette einschließlich der Seitenketten, sofern vorhanden, mit -NH-C(=0)-NH2, -C(=0)-OH, -OH, -NH ₂ ,

-NH-C(=NNH ₂ )-, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein kann,

Hierbei steht R ^y jeweils für -H, Phenyl-, Ci -Ci Q-Alkyl-, C - ] Q-Alkenyl- oder C2-C] Q-AIkinyl-, die wiederum jeweils mit -NH-C(=0)-NH ₂ , -C(=0)-OH, -OH, -NH ₂ , -\ ! l-i ^' < NM ! K

Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können.

Hierbei steht R* für -H, Ci -C^-Alky]- oder Phenyl-.

Alkenyl

Alkenyl steht für eine geradkettige oder verzweigte einwertige Kohlenwasserstoffkette mit einer oder zwei Doppelbindungen und 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 Kohlenstoffatomen (C2-C10- Alkenyl), insbesondere 2 oder 3 Kohlenstoffatomen (C -Cj-Alkenyl), wobei es sich versteht, dass, wenn die Aikenylgruppe mehr als eine Doppelbindung enthält, die Doppelbindungen isoliert voneinander oder miteinander konjugiert sein können. Bei der Aikenylgruppe bandeit es sich zum Beispiel um eine Ethetiyl- (bzw. Vinyl-), Prop-2-en-l-yl- (bzw.„Allyl-"), Prop-1 -en-l-yl-, But-3-enyI-, But-2-enyl-, But-l-enyl-, Pent-4-enyl-, Pent-3-enyl-, Pent-2-enyl-, Pent-l-enyl-, Hex-5-enyl-, Hex-4-eny]-, Hex-3-eny]-, Hex-2-eny]-, Hex-l -eny]-, Prop-1 -en-2-yl- (bzw.„Isopropenyl-"),

2- Methylprop-2-enyl-, 1 -Methylprop-2-enyl-, 2-Methylprop- 1 -enyl-, 1 -Methylprop- 1 -enyl-,

3- Me lbut-3-enyl-, 2-Me lbut-3-enyl-, l-Methylbut-3-enyl-, 3-Me lbut-2-enyl-,

2- Methylbut-2-enyl-, l-Methylbut-2-enyl-, 3-Methylbut-l -enyl-, 2-Methylbut-i-enyl-,

1 -Methylbut-1 -enyl-, 1 -, 1 -Dimethylprop-2-enyl-, 1 -Ethylprop- 1 -enyl-, 1 -Propylvinyl-,

1 -Isopropylvinyl-, 4-Methylpent-4-enyl-, 3-Methylpent-4-enyl-, 2-Metliylpent-4-enyl-,

1 -Methylpent-4-enyl-, 4-Methylpent-3-enyl-, 3-Methylpent-3-enyl-, 2-Methylpent-3-enyl-, 1 -Methylpent-3-enyl-, 4-Methylpent-2-enyl-, 3-Methyipent-2-eny]~, 2-Methylpent-2-enyl-, l -Methylpent-2-enyl-, 4-Methyipent-l-enyl-, 3-Methylpent-l -enyl-, 2-Methylpent-l -enyl-, 3 ~Methy3pent-l~eny3-, 3-Ethyibut-3-eny3-, 2-Ethylbut-3-enyl-, 1 -Ethylbut-3-enyI-,

3- Ethylbut-2-enyl-, 2-Ethylbut-2-enyl-, 1 -Ethylbut-2-enyl-, 3-Ethylbut-l -enyl-, 2-Ethylbut-l -enyl-, 1 -Ethylbut-1 -enyl-, 2-Propylprop-2-enyl-, 1 -Propylprop-2-enyl-, 2-Isopropylprop-2-enyl-, l -Isopropylprop-2-enyi-, 2-Propylprop-l -enyl-, 1 -Propylprop-l-enyl-, 2-Isopropylprop-l -enyl-, 1 -Isopropylprop-1 -enyi-, 3,3-Dimethylprop-l -enyl-, 1 -(1 , 1-Dimethylethyl)ethenyl-,

Buta-l,3-dienyl-, Penta-l,4-dienyl- oder Hexa-1 -5-dienylgruppe. Insbesondere bandelt es sich be der Gruppe um Vinyl oder Ailyl.

Alkinvi

Aikinyl steht füi" eine geradkettige oder verzweigte einwertige Kohlenwasserstoffkette mit einer Dreifachbindung und mit 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 Kohlenstoffatomen (d-Cio-Alkinyl), insbesondere 2 oder 3 Kohlenstoffatomen (C2~C:rAikinyl), Bei der C ₂ -C6-Alkinylgruppe handelt sich zum Beispiel um eine Ethinyl-, Prop-l-inyl-, Prop-2-inyl- (bzw. Propargyl-), But-l-inyl-, But-2-inyl-, But-3-inyl-, Pent-l-inyl-, Pent-2-inyl-, Pent-3-inyl-, Pent-4 -inyl-, Hex-l-inyl-, Hex-2-inyl-, Hex-3-inyl-, Hex-4-inyl-, Hex-5-inyl-, l-Methylprop-2-inyl-, 2-Methylbut-3-inyl-, 1 -Methylbut-3-inyl-, 1 -Methylbut-2-inyl-, 3-Methylbut-l -inyl-, 1 -E iylprop-2-inyl-,

3-Methylpent-4-inyl-, 2-Methylpent-4-inyl-, 1 -Methylpent-4-inyl-, 2-Methylpent-3-inyl-, 1 -Methylpent-3-inyl-, 4-Methylpent-2-inyl-, 1 -Methylpent-2-inyl-, 4-Methylpent-l -inyl-, 3-Methylpent-l-inyl-, 2-Ethylbut-3-inyl-, l-Ethylbut-3-inyl-, l-Etliylbut-2-inyl-,

l-Propylprop-2-inyl-, 1 -Isopropylprop-2-inyl-, 2,2-Dimethylbut-3-inyl-, l,l-Dimethylbut-3-inyl- l,l-Dimethylbut-2-inyl- oder 3,3-Dimethylbut- l-inylgruppe. Insbesondere handelt es sich bei de Alkinylgruppe um Ethinyl, Prop-l-inyl oder Prop-2-inyl.

Cycloalkyl

Cycloalkyl steht für einen gesättigten einwertigen mono- oder bicyclischen Kohlenwasserstoffrest mit 3-12 Kohlenstoffatomen (Cs-Cn-Cycloalkyl).

Hierbei steht ein mo no cy clis eher Kohlen was s ers tof fre st für einen monovalenten

Kohlenwasserstoffrest mit in der Regel 3 bis 10 (C3-C !o-Cycloalkyl), bevorzugt 3 bis 8

(Cj-Cs-Cycloalkyl), und besonders bevorzugt 3 bis 7 (C3-C 7-Cycloaikyl) Kohlenstoffatomen. Beispielhaft und bevorzugt, für einen monocyclischen Kohlenwasserstoffrest seien genannt:

Cyciopropyl-, Cyclobutyl-, Cyclopentyl-, Cyclohexyl-, Cycioheptyl- und Cvclooctyl-.

Besonders bevorzugt ist ein Cyciopropyl-, Cyclobutyl-, Cylopentyl-, Cyclohexyl- und

Cycioheptyl-.

Hierbei steht ein bicyclischer Kohlenwasserstoffrest für einen Kohlenwasserstoffrest mit in der Regel 3 bis 12 Kohlenstoffatomen (Cs-C^-Cycloalkyl), wobei hierbei eine Fusion aus zwei gesättigten Ringsystemen zu verstehen ist, die sich gemeinsam zwei direkt benachbarte Atome teilen. Beispielhaft und bevorzugt für einen bicyclisehen Kohlenwasserstoffrest seien genannt: ßicycio[2.2.0]hexyi-, Bicycio[3.3.0]octyl-, Bicyclo[4.4.0]decyl-, Bicyclo[5.4.0]undecyl-, Bicyclo[3.2.G]heptyl-, Bicyclo[4.2.0]octyl-, Bicyclo[5.2.0]nonyl-, Bicycio[6.2,0]decyl-,

Bicyclo[4.3.0]nonyl-, Bicyclo[5.3.0]decyl-, Bicyclo[6.3.0]undecyl- und Bicyclo[5.4.0]undecyl-,

Hgterocycloalkyl

Heterocycloalkyl steht für ein nicht aromatisches mono- oder bicyclisches Ringsystem mit ein, zwei, drei oder vier Heteroatoinen, die gleich oder verschieden sein können. Als Heteroatome können Stickstoffatome, Sauerstoffatome oder Schwefelatome vorkommen.

Ein rnonocvclisches Ringsystem gemäß der vorliegenden Erfindung kann 3 bis 8, bevorzugt 4 bis 7, besonders bevorzugt 5 oder 6 Ringatome aufweisen.

Beispielhaft und bevorzugt für ein Heterocycloalkyl mit 3 Ringatomen seien genannt:

Aziridinyl-.

Beispielhaft und bevorzugt für ein Heterocycloalkyl mit 4 Ringatomen seien genannt:

Azetidinyl-, Oxetanyl-.

Beispielhaft und bevorzugt für ein Heterocycloalkyl mit 5 Ringatomen seien genannt:

Pyrrolidinyl-, Imidazolidinyi- , Pyrazolidinyl-, Pyrrolinyl-, Dioxolanyl- und Tetrahydrofuranyl-.

Beispielhaft und bevorzugt für ein Heterocycloalkyl mit 6 Ringatomen seien genannt:

Piperklinyl-, Piperazinyl-, Morpholinyl-, Dioxanyl-, Tetrahydropyranyl- und Thiomorpholtnyl-.

Beispielhaft und bevorzugt für ein Heterocycloalkyl mit 7 Ringatomen seien genannt:

Azepanyi-, Oxepanyl-, 1 ,3-Diazepanyl-, 1 ,4-Diazepanyl-.

Beispielhaft und bevorzugt für ein Heterocycloalkyl mit 8 Ringatomen seien genannt:

Oxocanyl-, Azocanyl-.

Unter mono eye iischem Heterocycloalkyl sind 4 bis 7-gliedrige, gesättigte Heterocyclylreste mit bis zu zwei Heteroatomen aus der Reihe O, N und S bevorzugt.

Besonders bevorzugt sind Morpholinyl-, Piperidinyl-, Pyrrolidinvi- und Tetrahydrofuranyl-.

Ein bicvclisches Ringsystem mit ein, zwei, drei oder vier Heteroatomen, die gleich oder verschieden sein können, können gernäß der vorliegenden Erfindimg 6 bis 12, bevorzugt 6 bis 10 Ringatome aufweisen, wobei ein, zwei, drei oder vier Kohlenstoffatome gegen gleiche oder verschiedene Heteroatome aus der Reihe O, N und S ausgetauscht sein können.

Beispielhaft seien genannt: Azabicyclo[3.3.0]octyl-, Azabicyclo[4.3.0]nonyl-,

Diazabicyclo[4.3.0]nonyl-, Oxazabicyclo[4.3.ö]nonyl-, Thiazabicyclo[4.3.0]nonyl- oder

Azabicyclo[4.4.0]decyl- sowie aus weiteren möglichen Kombinationen gemäß Definition abgeleitete Reste.

Besonders bevorzugt ist Perhydrocyclopenta[c]pyrrolyl-, Perhydrofuro[3,2-c]pyridinyl-,

Perhydropyrrolo [ 1 ,2-a]pyrazinyl-, Perhydropyrrolo [3 ,4-c]pyrrolyl - und 3 ,4-Methylenedioxyphenyl .

Aryl

Aryl bedeutet ein monovalentes, mono- oder bicyclisches, aus Kohlenstoffatomen bestehendes aromatisches Ringsystem. Beispiele sind aphthyi- und Phenyl-; bevorzugt ist Phenyl- beziehungsweise ein Phenylrest.

Ce-Cio-Aralkyl

Ce-io-Aralkyl- steht im Rahmen der Erfindung für ein monocyclisch.es aromatisches Aryl, bespielhaft Phenyl, an das eine C rtVAlkylgruppe gebunden ist.

Eine beispielhafte Ce- io-Aralkyl-Gruppe ist Benzyl.

Hcteroaryi

Heteroaryl bedeutet ein einwertiges monocyclisches, bicyclisches oder tricyclisches aromatisches Ringsystem mit 5, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13 oder 14 Ringatomen (eine„5- bis 14- gliedrige

Heteroaryl"gruppe), insbesondere 5, 6, 9 oder 10 Ringatomen, zu verstehen, das mindestens ein Ringheteroatom und gegebenenfalls ein, zwei oder drei weitere Ringheteroatome aus der Gruppe N, O und S enthält und das über ein Ringkohlenstoffatom oder gegebenenfalls (wenn es die Wertigkeit erlaubt) über ein Ringstickstoffatom gebunden ist.

Bei der Heteroarylgruppe kann es sich um eine 5-gliedrige Heteroarylgruppe wie zum Beispiel Thienyl, Fur l, Pyrrolyl, Oxazolyl, Thiazolyl, Imidazoiyi, Pyrazolyl, Isoxazolyl, Isothiazolyl, Oxadiazolyl, Triazolyl, Thiadiazolyl oder Tetrazolyl; oder eine 6-gIiedrige Heteroarylgrupoe wie zum Beispiel Pyiidinyl, Pyridazinyl, Pyrirnidinyl, Pyrazinyl oder Triazinyl; oder eine tricyciische Heteroarylgruppe wie zum Beispiel Carbazolyl, Aeridinyl oder Phenazinyl; oder eine 9-gliedrige Heteroarylgruppe wie zum Beispiel Benzofuranyi, Benzothienyl, Benzoxazolyl, Benzisoxazolyl, Benzimidazoiyl, Benzothiazolyl, Benzotriazolyi, Indazolyi, Indolyl, Isoindolyl, Indolizinyl oder Purinyl; oder eine 10-gliedrige Heteroarylgruppe wie zum Beispiel Chinolinyl, Chinazolinyl, Isochinolinyl, Cinnolinyi, Phthalazinyl, Chinoxalinyl oder Pteridinyl handeln.

Im Allgemeinen, und wenn nicht anders erwähnt, schließen die Heteroarylreste alle möglichen isomeren Formen davon ein, z. B. Tautomere und Positionsisomere in Bezug auf den

Anbindungspunkt zum Rest des Moleküls. Somit schließt, als erläuterndes, nicht einschließendes Beispiel, der Begriff Pyridinyl Pyridin-2-yl, Pyridin-3-yl und Pyridin-4-yl ein; oder der Begriff Thienyl schließt Thien-2-yl und Thien-3-yl ein.

C.s-C i o-Heteroaryl

Cs-io-Heteroaryl steht im Rahmen der Erfindung für ein mono-oder bicyclisches, aromatisches Ringsystem mit ein, zwei, drei oder vier Heteroatome, die gleich oder verschieden sein können. Als Heteroatome können vorkommen: N, O, S, S(=0) und/ oder Die Bindungsvalenz kann sich an einem beliebigen aromatischen Kohlenstoffatom oder an einem Stiekstoffätom befinden.

Ein monocyclischer Heteroarylrest gemäß der vorliegenden Erfindung hat 5 oder 6 Ringatome. Bevorzugt sind solche Heteroarylreste mit ein oder zwei Heteroatomen. Besonders bevorzugt sind hierbei ein oder zwei Stickstoffatome.

Heteroarylreste mit 5 Ringatomen umfassen beispielsweise die Ringe:

Thienyl, Thiazolyl, Furyl, Pyrrolyl, Oxazolyl, Imidazoiyi, Pyrazolyl, Isoxazolyl, Isothiazolyl, Oxadiazolyl, Triazolyl, Tetrazolyl und Thiadiazolyl .

Heteroarylreste mit 6 Ringatomen umfassen beispielsweise die Ringe:

Pyridinyl, Pyridazinyl, Pyrirnidinyl, Pyrazinyl und Triazinyl. Ein bicyclischer Heteroarylrest gemäß der vorliegenden Erfindung hat 9 oder 10 Ringatome.

Heteroarylreste mit 9 Ringatomen umfassen beispielsweise die Ringe:

Phthalidyl, Thiophthalidyl, Indolyl, Isoindolyl, Indazoiyl, Benzothiazolyl, Benzofuryl,

Benzothienyl, Benzimidazolyl, Benzoxazolyl, Azocinyl, Indolizinyl, Purinyl, Indolinyl.

Heteroarylreste mit 10 Ringatomen umfassen beispielsweise die Ringe:

Isochinolinyl, Chinolinyl, Chinoiizinyl, Chinazolinyl, Chinoxalinyi, Cinnoiinyl, Phthalazinyl, 1,7- und 1,8-Naphthyridinyl, Pteridinyi, ChromanyL

Heteroajkoxy

Heteroalkoxy steht für eine geradkettige und/oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, die über -O- an den Rest des Moleküls gebunden ist und die weiterhin einfach oder mehrfach durch eine oder mehrere der Gruppen -O-, -S-, - R- ^V -,

-NRyC(O)-, -C(=0)-NRy-, -NRWRy-, -S(=0) ₂ -NRyNRy-, -C(=0)-NRy Ry-, -CR M-O- unterbrochen sein kann, und wobei die Kohlenwasserstoffkette einschließlich der Seitenketten, sofern vorhanden, mit -NH-C(=0)-NH ₂ , -C(=0)-OH, -OH, -NH ₂ , -NH-C(=NNH ₂ )-, Sulfonamid,

Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein kann,

Hierbei steht R ^y jeweils für -H, Phenyl-, C } -C _{[ Q} -Alkyl-, C2-C _Q -Alkenyl- oder C2-C1 _Q -Alkinyl-, die wiederum jeweils mit - H-C(=0)-NH ₂ , -C(=0)-OH, -OH, -NH ₂ , -NH-C(=Ni\H ₂ )-,

Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können.

Hierbei steht R* für -H, Ci -C3~Alkyl- oder Phenyl-.

Halogen beziehungsweise Halogenatom steht im Rahmen der Erfindung für Fluor (-F), Chlor (-C1), Brom (-Br), oder lod (-1).

Fluor-Aikyl, Fluor-Alkenyl und Fluor-Alkinyl bedeutet, dass das Aikyl, Alkenyl und Alkinyl ein oder mehrfach durch Fluor substituiert sein kann.

Die Konjugation des KSP-Inhibitors an den Antikörper kann chemisch auf verschiedenen Wegen erfolgen, wie in den Schemata 20 bis 31 in den Beispielen exemplarisch dargelegt. Es ist insbesondere möglich, den niedermolekularen KSP-Inhibitor für die Konjugation an den Linker ggf, zu modifizieren, z.B. durch Einführen von Schutzgruppen oder Abgangsgruppen zur einfacheren Substituierung (so dass in der Reaktion diese Abgangsgruppe durch den Linker substituiert wird, und nicht ein H- Atom). Das so erhaltene KSP-Inhibitor - Linker - Molekül (wobei der Linker eine reaktive Gruppe zur Ankopplung an den Binder aufweist) kann dann mit dem Binder umgesetzt werden, um ein erfindungsgemäßes Binderkonjugat zu erhalten. Diese Vorgehensweise ist im experimentellen Teil anhand einer Vielzahl von Beispielen exemplarisch veranschaulicht.

Andere besonders bevorzugte Verbindungen weisen die folgende Formel (Ϊ) oder (la) auf:

Formel (I)

wobei

R ^! H, -L-#l , -MOD oder ~(CH ₂ )e-3Z darstellt, wobei Z -H, -NHY ³ , -OY ³ , -SY ³ , Halogen, -CO- ΝΥ ^' Ύ ² , oder -CO-OY ³ darstellt,

wobei Y ^! und Y* unabhängig voneinander H, NH ₂ , -(CH2CH ₂ 0)o-3-(CH2)o-3Z'(z.B. - Cft^wZ ¹ ), oder -CH(CH ₂ W)Z' darstellen, und Y ³ H oder -(CH2V3Z' darstellt, wobei Z' H, NH ₂ , SO3H, COOH, -NH-CO-CH2-CH2-CH(NH ₂ )COOH oder -(CO-NH-CHY ⁴ )i. ₃ COOH darstellt; wobei W H oder OH darstellt,

wobei Y ⁴ lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit~NHCONH2 substituiertes, Ci-e Alkyl oder gegebenenfalls mit -NH2 substituiertes Aryl oder Benzyl darstellt;

R ² H, -MOD, -CO-CHY ⁴ -NHY ⁵ oder -(CH ₂ )o- ₃ Z darstellt,

wobei Z -H, Halogen, -OY ³ , -SY ³ , NHY ³ , -CO-NY'Y ² , oder -CO-OY ³ darstellt,

wobei Υ' und Y ² unabhängig voneinander H, NH ₂ , oder -( ^' CH ₂ )o-3Z' darstellen, und Y ³ H oder -

(CH ₂ )o-3Z' darstellt, wobei Z' H, SO3H, NH ₂ oder COOH darstellt; wobei Y ⁴ lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit-NHCONH2 substituiertes, Ci-β Alkyi oder gegebenenfalls mit -NH2 substituiertes Ar l oder Benzyl darstellt und Y ³ H oder -CO-CHY ⁿ -NH ₂ darstellt, wobei Y* lineares oder verzweigtes G-e Affl yl darstellt;

R ⁴ H, L #1, -SG _lys -(CO) ₀ „ _i -R ⁴ ', -CO-CHY ⁴ -NHY ⁵ oder ·(( ! ! ;,, ./. darstellt,

wobei SG _]YS eine durch ein lysosomales Enzym spaltbare Gruppe darstellt, insbesondere eine Gruppe bestehend aus einem Di- oder Tripeptid, R ⁴ 'eine Cwo-Alkyl-, Cs-io-Aryl- oder Ce-ιο- Aralkyl-, Cs-io-Heteroalkyl-, Ci-io-Alkyl-O-Ce-io-Aryl-, Cs-io-Heterocycloalkyl-, Heteroaryl-, Heteroaryl-alkyl-, Heteroaryl-alkoxy-, Ci- -Alkoxy-, Ce-io-Aryloxy- oder Ce-io-Aralkoxy-, Cs-io- Heteroaralkoxy-, Ci- ιο-Alkyl-O-Ce-io-Aryloxy-, Cs- io-Heterocycloalkoxy-Grappe, die ein oder mehrfach mit - NH ₂ , -NH-Alkyl, -N(Alkyl) ₂ , NH-CO-Alkyl, N( Alkyi) -CO Alkyi, -S0 ₃ H, -S0 ₂ NH ₂ , -S0 ₂ -N(Alkyl) ₂ , -COOH, -CONH ₂ , -CON(Alkyl) ₂ , oder -OH substituiert sein kann, -H oder eine Gruppe - _X -(CH2CH20) _V -R4 darstellt, (wobei x 0 oder 1 und v eine Zahl von 1 bis 20 darstellt, und R ⁴ " I i . -Alkyi (vorzugsweise G-u-Alkyl), -CH ₂ -COOH, -CH ₂ -CH ₂ -COOH, oder -CH ₂ - CH. -NH - darstelit);

darstellt,

wobei Z -H, Halogen, -OY ³ , -SY ³ , NHY ³ , -CO- Y'Y ² , oder -CO-OY ³ darstellt,

wobei Y ¹ und Y ² unabhängig voneinander H, NH ₂ , oder -(CH _{2 3} Z' darstellen, und Y ³ H oder -

(CH2)o-3Z' darstellt, wobei Z' II, SO3H, H ₂ oder COOH darstellt;

wobei Y ⁴ lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit-NHCONHz substituiertes, C i -6 Alkyi oder gegebenenfalls mit - ^: H ₂ substituiertes Aryl oder Benzyl darstellt und Y ⁵ H oder -CO-CHY ⁶ -NH2 darstellt, wobei Y ⁶ lineares oder verzweigtes Cw Alkyi darstellt;

oder R ² und R ⁴ gemeinsam (unter Bildung eines Pyrrolidinringes) -CH2-CHR ^{1 !} - oder -CHR ^{1 1} -CH2- darstellen, wobei R ^{! l} H, NH ₂ , SO3H, COOH, SH, Halogen (insbesondere F oder CI), CM Alkyi, C!. ₄ Haloalkyl, d.^ Alkoxy, Hydroxyl-substituiertes C _M Alkyi, COO(C _w Aikyl) oder OH darstellt;

A CO, SO, SO2, SO2 H oder ( NM ! darstellt;

R ³ -L-#l , -MOD oder eine gegebenenfalls substituierte Alkyi-, Cycloalkyl-, Aryl-, Heteroaryl-, Heteroalkyl-, Heterocycloalkyl- Gruppe darstellt, bevorzugt eine Ci-io-Alkyl-, Cwo-Aryl- oder Ci- 10-Araikyl-, Cs-i o-Heteroalkyl-, Ci-io-Alkyl-O-Ce-io-Aryl- oder Cs-s o-Heterocycloalkyl-Gruppe, die mit 1-3 -OH Gruppen, 1-3 Halogenatomen, 1-3 halogenierten Alkyi gnippen (die jeweils 1-3 Halogenatome aufweisen), 1-3 O-Alkyl Gruppen, 1-3 -SH Gruppen, 1-3 -S-Alkyl Gruppen, 1-3 -

0- CO-Alkyl Grappen, 1-3 -O-CO-NH- Alkyi Gruppen, 1 -3 1 -3 -NH-CO- NH- Alkyi Gruppen, 1-3 -S(0) _n - Alkyi Gruppen, 1-3 -SO2- H- Alkyi Gruppen, 1-3 -NH-Alkyl Gruppen, 1-3 -N(Alkyl) ₃ Grappen, 1-3 -NH((CH ₂ CH ₂ 0) \ _ ₂ oH)-Gruppen, 1 -3 -NH ₂ Gruppen oder

1- 3 -(CHzVaZ Grappen, wobei n für 0, 1 oder 2 steht, Z -H, Halogen, -OY ³ , -SY ³ , -NHY ³ , -CO- NY'Y ² , oder -CO-OY ³ darstellt, mit Y' und Y ² unabhängig voneinander H, NH ₂ , oder -(CH ₂ )o-3Z ^l darstellen, und Y ³ H, -i W.-V..-( ^' · ·!·: M !ί ^' (Χ I ! :·/''.-ί (Ί I.V. ^■ ■-(. ^' ] ΐιΜΙ; )/ ^' . ^' . oder -(CH ₂ )o- ₃ Z' darstellt, wobei Z' H, SO3H, NH ₂ oder COOH darstellt, substituiert sein kann (wobei„Alkyl" bevorzugt C _O - Alkyl bedeutet);

R ^s H, -MOD, Nil;. NC , Halogen (insbesondere F, Cl, Br), -CN, CF ₃ , -OCF ₃ , ·( II I ·( Ii. F.. SH oder -(CH ₂ V ₃ Z darstellt, wobei Z -H, -OY ³ , -SY ³ , Halogen, NHY ³ , -CO- Y'Y ² , oder -CO-OY ³ darstellt,

wobei Y ¹ und Y ² unabhängig voneinander H, H ₂ , oder -(CH ₂ V ₃ Z' darstellen, und Y ³ H oder - (C!l;i, :/ darstellt, wobei Z' H, SO3H, Nli- oder COOH darstellt;

R ⁶ undR ⁷ unabhängig voneinander H, Cyano, (ggf. fluoriertes) CMO- Alkyl, (ggf. fluoriertes) C ₂ -io-Alkenyl, (ggf. fluoriertes) C ₂ -io-Alkinyl, Hydroxy, N0 ₂ , H ₂ , COOH oder Halogen (insbesondere F, Cl, Br) darstellen,

R° (ggf. fluoriertes) CMO- Alkyl, (ggf fluoriertes) C ₂ -io-Alkenyl, (ggf. fluoriertes) C2-10- Alkinyl, (ggf. fluoriertes) C ₄ -io-Cycloalkyl oder -(CH ₂ )o- ₂ »(HZ ² ) darstellt, wobei HZ ² ein 4 bis 7- gliedriger Heterocyclus mit bis zu zwei Heteroatomen ausgewählt aus N, O und S darstellt (vorzugsweise Oxetan), wobei jede dieser Gruppen mit -OH, CO2H oder H ₂ substituiert sein kann; wobei einer der Substituenten R ¹ , R ³ und R-L-#l darstellt,

L für den Linker steht und #1 für die Bindung zum Antikörper steht,

R ⁹ H, F, CH3, CF3, CH ₂ F oder CHF ₂ darstellt; wobei -MOD -(NR ^l0 ) _r {GI) _o -G2-G3 darstellt, wobei

R " II oder Ci-C,-Alkyl darstellt:

- --N N— CO

Gl -NHCO- , -CONH- oder \ / darstellt (wobei wenn Gl -NHCO- oder

/ \

— N; co

\....../ darstellt, R nicht MI? ist);

n 0 oder 1 ist;

o 0 oder 1 ist; und G2 eine geradkettige und/oder verzweigte Kohlenwasserstoffgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen ist, die einfach oder mehrfach durch eine oder mehrere der Gruppen -O-, -S-, -

SO-, SO2, -NR> ^' -, - RYCO-, CONRY-, -NR R -, -S02NRXNRy-, -CONR ^' Ry-, (wobei R ^y H, Phenyl, C \ -Cj Q-Alkyl, C^-Cj Q-Aikenyl, oder C2-C1 Q-Alkinyl darstellt, die jeweils mit

NHCONH ₂ , -COOH, -OH, -NH2, NH-CNNH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können), -CO-, oder -CR ^x = -0- (wobei Rx H, C -C3-Alkyl oder Phenyl darstellt) unterbrochen sein kann, wobei die Kohlenwasserstoffkette einschließlich der Seitenketten, sofern vorhanden, mit -NHCONH ₂ , -COOH, -OH, -NH ₂ , NH-CNNH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein kann, wobei G3 -H oder COOH darstellt, und wobei die Grappe -MOD vorzugsweise zumindest eine Gruppe --COOH aufweist; sowie ihre Salze, Solvate, Salze der Solvate und Epimere.

In einer bevorzugten Ausführungsfonn der Formel (I) stellt einer der Substituenten R ^! oder R ³ -L- #1 dar. In dieser Ausfulirungsfonn ist es besonders bevorzugt, wenn R ⁴ H oder -SG _[vs -(CO)Q..I -R ⁴ ' darstellt, wobei SG _lvs und R ⁴ 'dieselbe Bedeutung haben wie oben. In einer anderen bevorzugten Ausfulirungsfonn der Formel (I) stellt der Substituenten R ⁴ -L-#l dar, wobei der Linker ein Linker ist, der am Stickstoffatom, das an R ⁴ bindet, spaltbar ist, so dass nach Spaltung eine primäre Amingruppe vorliegt (entsprechend R ⁴ = H). Entsprechende spaltbare Gruppen werden unten näher beschrieben.

Wenn R ^! nicht H darstellt, ist das Kohlenstoffatom, an das R ¹ bindet, ein Stereozentrum, welches in der L- und/oder D-Konfiguration vorliegen kann, vorzugsweise in der L— Konfiguration.

Wenn R ² nicht H darstellt, ist das Kohlenstoffatom, an das R bindet, ein Stereozentrum, welches in der L- und/oder D-Konfiguration vorliegen kann.

Formel (la):

(la) wobei

R ^! H, -L-#I , oder -(CH ₂ )o-3Z darstellt, wobei Z -H, -NHY ³ , -OY ³ , -SY ³ , Halogen, -CO-NY'Y ² , oder -CO-OY ³ darstellt,

wobei Y ¹ und Y ² unabhängig voneinander H, NH ₂ , -(CH _z CH20)o-3-(CH2)o.3Z' (z.B. -(CH2V3Z'), oder -CH(CH ₂ W)Z' darstellen, und Y ³ H oder -(CH _{2 3} Z' darstellt, wobei Z' H, NH ₂ , SO ₃ H, COOK, -NH-CO-CH2-CH2-CH(Mi ₂ )COOH oder -(CO- H-CHY ^, )i _-3 COOH darstellt; wobei W H oder OH darstellt;

wobei Y ⁴ lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit-NHCONH2 substituiertes, Ci-e Alkyl oder gegebenenfalls mit -NH ₂ substituiertes Aryl oder Benz l darstellt.

R ² und R ⁴ unabhängig voneinander H,

-CO-CHY ⁴ -NHY ⁵ oder -(CH ₂ )o- ₃ Z darstellen,

wobei SG _|ys eine durch ein lysosomales Enzym spaltbare Gruppe darstellt, insbesondere eine Gruppe bestehend aus einem Di- oder Tripeptid, R ⁴ ' eine Ci-io-Alkyi-, Cs-io-Aryl- oder Ce-ιο- Aralkyl-, Cs-io-Heteroalkyl-, C i-io-Alkyl-0-C6-io-Aryl-, Cs-io-Heterocycloalkyl-, Heteroaryl-, Heteroaryl-alkyl-, Heteroaryl-alkoxy-, Ci- -Alkoxy-, Ce-io-Aryloxy- oder Ce-io-Aralkoxy-, C5.10- Heteroaralkoxy-, Ci-io-Alkyl-O-Ce-io-Aryloxy-, Cs-io-Heterocycloalkoxy-Gruppe, die jeweils ein oder mehrfach mit - NH ₂ , -NH-Alkyl, -N(Alkyl) ₂ , NH-CO-Alkyl, N(Alkyl)-COAlkyl, -SO3H, - SO2NH2, -S02-N(Alkyl) ₂ , -COOH, -CONH2, -CON(Aikyl) ₂ , oder -OH substituiert sein kann, -H oder eine Gruppe -O _x -(CH2CH20) _v -R darstellt (wobei x 0 oder 1 und v eine Zahl von 1 bis 20 darstellt, und R ⁴ " -H, -Alkyl (vorzugsweise Ci-n-Alkyl), -CH ₂ -COOH, -CH2-CH2-COOH, oder - CH2-CH2-NH2 darstellt); , oder R ² und R ⁴ gemeinsam (unier Bildung eines Pyrrolictinringes) -CH2-CHR ¹ '- oder -CHR ¹ '- CH ₂ - darstellen, wobei R" H, NH ₂ , SO3H, COOH, SH, Halogen (insbesondere F oder Cl), C _M Alkyi, C1-4 Haloalkyl, C1- Alkoxy, Hydroxyl-substituiertes C1-4 Alkyi, COO(C i 4 Alkyi) oder OH darstellt; oder R ² H, -CO-CHY ⁴ -NHY ⁵ oder -(CH ₂ )o- ₃ Z darstellt und R ⁴ -L-#l darstellt, wobei Z - H, Halogen, -OY ³ , -SY ³ , NHY ³ , -CO-NY'Y ² , oder -CO-OY ³ darstellt,

wobei Y' und Y ² unabhängig voneinander H, NH2, oder -(CH2)o-3Z' darstellen, und Y ^J H oder - i C i {. ),.· ;/ · darstellt, wobei Z' H, SO3H, NH2 oder COOH darstellt;

wobei Y ⁴ unabhängig voneinander lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit-NHCONH ₂ substituiertes, C 1-6 Alkyi oder gegebenenfalls mit -NH ₂ substituiertes Aryl oder Benzyl darstellt, wobei Y ⁴ lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit-NHCONtb substituiertes, C 1-6 Alkyi oder gegebenenfalls mit -NH ₂ substituiertes Aryl oder Benzyl darstellt und Y ⁵ H oder -CO-CHY ⁶ -NH ₂ darstellt, wobei Y ⁶ lineares oder verzweigtes Ci -β Alkyi darstellt;

A CO, SO, SO2, SO2 H oder CNNH darstellt;

R ³ eine gegebenenfalls substituierte Alkyi-, Aryl-, Heteroaryl- Heteroalkyl-, Helerocycloalkyl- Gruppe darstellt, bevorzugt -L-#l oder eine Cwo-Alkyl-, Ce- 10- Aryl- oder C6-io-Aralkyl-, C5-10- Heteroalkyl-, C o-Alkyl-O-Ce-io-Aryl- oder Cs-i o-Heterocydoalkyl-Gruppe, die mit 1-3 -OH Gruppen, 1 -3 Halogenatomen, 1-3 halogenierten Alkyigruppen (die jeweils 1-3 Halogenatome aufweisen),, 1 -3 O- Alkyi Gruppen, 1 -3 -SH Gruppen, 1 -3 -S-Alkyl Gruppen, 1 -3 -O-CO-Alkyl Gruppen, 1 -3 -O-CO-NH-Alkyl Gruppen, 1 -3 -NH-CO- Alkyi Gruppen, 1 -3 -NH-CQ-NH- Alkyi Gruppen, 1 -3 -S(0) _n - Alkyi Gruppen, 1 -3 -S0 ₂ -NH-Alkyl Gruppen, 1 -3 -NH-Alkyl Gruppen, 1 -3 - N(Alkyl)2 Gruppen, 1 -3 -NH ₂ Gruppen oder 1-3 -(CH ₂ ) ₀ -:;Z Gruppen, wobei n für 0, 1 oder 2 steht, Z -H, Halogen, -OY ³ , -SY ³ , -NHY ³ , -CO-N Y V ^' . oder -CO-OY ³ darstellt, mit Y ¹ und Y ² unabhängig voneinander H, NH ₂ , oder - CH ₂ )o-3Z ' darstellen, und Y ^J H, -(CH2V3-CH(NHCOCH ₃ )Z',-(CH2)o-3-CH(NH ₂ )Z', oder -(CH ₂ ) ₀ -3Z ' darstellt, wobei Z' H, SO ₃ H, NH ₂ oder COOH darstellt,

substituiert sein kann (wobei„Alkyi" bevorzugt C wo- Alkyi bedeutet);

R ⁵ H, F, NH ₂ , NO2, Halogen, SH oder -i( I N,. . . darstellt, wobei Z -H, Halogen, -OY ³ , -SY ³ , NHY ³ , -CO-NY ^! Y ² , oder -CO-OY ³ darstellt,

wobei Y' und Y ² unabhängig voneinander H, NH ₂ , oder -(CFi ₂ ) ₀ -3Z ' darstellen, und Y ³ Fi oder - i C} \. h .7: darstellt, wobei Z' H, SO3H, NH ₂ oder COOH darstellt;

R ⁶ und R' unabhängig voneinander Fi, Cyano, (ggf. fluoriertes) Ci -so-Alkyl, (ggf. fluoriertes) C2-10- Alkenyl, (ggf. fluoriertes) C ₂ .io- Alkinyl, Hydroxy oder Halogen darstellen, R ⁸ (ggf, fluoriertes) Ci-io-Alkyl, (ggf. fluoriertes) oder optional substituiertes Oxeian darstellt; und

R ⁹ H, F, CH ₃ , ( ^' ! ^' :. H I oder CHF ₂ darstellt; sowie ihre Salze, Solvate, Salze der Solvaie und Epimere.

Durch Substitution eines H- Atoms an R ¹ , R' oder R ⁴ kann in einer dem Durchschnittsfaehmann bekannten Weise eine Verbindung der Formel (I) oder (la), in der keiner der Substituenten R ^] , R ³ und R ⁴ -L-#l darstellt, mit einem Linker verbunden werden. Hierdurch werden Konjugale der Formel (i) oder (la) erhalten, wobei einer der Substituenten R ^! , R ³ oder R ⁴ -L-#l darstellt, L für den Linker steht und # 1 für die Bindimg zum Antiköiper steht. Wenn der KSP-Inhibitor nach Formel (I) oder (la) mit einem Antikörper konjugiert ist, stellt einer der Substituenten R ^! , R ³ oder R ⁴ also -L-#l dar, wobei L für den Linker steht und #1 für die Bindung zum Antikörper steht. D.h. im Falle der Konjugale stellt einer der Substituenten R ¹ , R ³ oder R ⁴ -L-#l dar, wobei -L-#l die Bindung an den Antikörper darstellt. In einer bevorzugten Ausführungsform der Formel (I) oder (la) stellt einer der Substituenten R ¹ oder R ³ -L-#l dar. In dieser Ausfuhrungsform ist es besonders bevorzugt, wenn R ⁴ H oder -SG _1vs -(CO)Q_] -R ⁴ ' darstellt, wobei SG _LVS und R ⁴ ' dieselbe Bedeutung haben wie oben. In einer anderen bevorzugten Ausfdhrungsforrn der Formel (I) stellt der Substituenten R ⁴ -L-#i dar, wobei der Linker ein Linker ist, der am Stickstoffatom, das an R ⁴ bindet, spaltbar ist, so dass nach Spaltung eine primäre Amingruppe vorliegt (entsprechend R ⁴ = H). Entsprechende spaltbare Gruppen werden unten näher beschrieben. Der Binder ist vorzugsweise ein humaner, humanisierter oder chimärer monoklonaler Antikörper oder ein Antigen-bindendes Fragment hiervon. Der Antikörper ist vorzugsweise ein aglycosylierter humaner, humanisierter oder chimärer monoklonaler anti-B7H3-Antikörper. Besonders bevorzugt ist ein anti-B7H3 -Antiköiper, der spezifisch die humane 4Ig-Isoform bindet, insbesondere der anti- B7H3- Antikörper TPP-5706 und seine humanisierten Varianten wie TPP-6642 und TPP-6850.

Anstelle von -L-#l kann auch die Gruppe -L-#3 in der Verbindung vorhanden sein, wobei L für den Linker steht und #3 fiir die reaktive Gruppe zur Bindung an Antiköiper steht. Verbindungen mit -L-#3 sind reaktive Verbindungen, die mit dem Antiköiper reagieren. #3 ist vorzugsweise eine Gruppe, die mit einer Amino- oder Thiolgruppe unter Bildung einer kovalenten Bindung reagiert, vorzugsweise mit dem Cysteinrest in einem Protein. Der Cysteinrest in einem Protein kann natürlich im Protein vorliegen, durch biochemische Methoden eingebracht werden oder vorzugsweise durch vorherige Reduktion von Disulfiden des Binders generiert werden kann.

Als A ist CO (carbonyi) bevorzugt.

Als R' ist bevorzugt -L-#l, H, -COOH, -CONHNH2, -(CH ₂ ) i- ₃ NH ₂ , -€ONZ ^{( (} (CH ₂ ) 3 NH ₂ und - CONZ' 'CH ₂ COOH, wobei Z" H oder NH ₂ .

Ais R ² und R ⁴ sind bevorzugt H oder R ² und R ⁴ steilen gemeinsam (unter Bildung eines Pyrrolidinringes) -CH2-CHR ^{1 1} - oder -CHR ^{i !} ~CH ₂ ~ darsteilen, wobei R" H darstellt. Als R ⁴ ist zudem -L-#l bevorzugt, wobei -L-#l ein spaltbarer Linker ist, vorzugsweise ein intrazellulär enzymatiseh spaltbarer Linker.

Als R ³ ist bevorzugt -L-#l oder eine C i-10-Alkyl-, die ggf. mit -OH, O-Alkyl, SH, S-Alkyl, O-CO- Alkyl, O-CO-NH-Alkyl, NH-CO-Alkyl, NH-CO-NH-Alkyl, S(0)n-Alkyl, S0 ₂ -NH-Alkyl, NH- Alkyl, (Alkyl) ₂ , oder NH ₂ substituiert sein kann (wobei Alkyl vorzugsweise C1..3 Alkyl bedeutet).

Als R ⁵ ist bevorzugt H oder F.

Als R ⁶ und R' sind unabhängig voneinander bevorzugt H, (ggf. fluoriertes) Cw-AikyL (ggf. fluoriertes) C ₂ -4-Alkenyl, (ggf. fluoriertes) C ₂ -4~Alkinyl, Hydroxy oder Halogen.

Als R ⁸ ist bevorzugt eine verzweigte C s .5- Alkyl-Gruppe, insbesondere eine Gruppe der Formel - C(CH ₃ ) ₂ -(CH ₂ )o- ₂ -R _y , wobei R _y -Ή, OH, C0 ₂ H, oder H ₂ , oder eine (ggf fluoriertes) C5-7- Cycloalkyl Besonders bevorzugt ist eine Gruppe der Formel oder eine Cyclohexylgruppe.

Als R ⁹ ist bevorzugt H oder F.

Insbesondere bevorzugt sind Verbindungen der Formel (I) oder (Ia), in der

A CO (carbonyi) ist;

R H, -L-#l , -COOH, -CO H H2, -(CH ₂ ) i. ₃ NH ₂ , -COS/ ^■■ ■ ⁽ : [ < ^■ ) und -CONZ"CH ₂ COOH ist, wobei Z" H oder NH ₂ ;

R ² und R ⁴ H ist, oder R ² und R ⁴ gemeinsam (unter Bildung eines Pyrrolidinringes) -CH ₂ -CHR ¹¹ - oder -CHR ^{! 1} -CH ₂ - darstellen, wobei R ^{1 !} H darstellt; oder R ⁴ -L-#l ist und R ² H ist; R' -L-#l oder eine Phenylgruppe, die ein oder mehrfach mit Halogen (insbesondere F) oder ggf. fluoriertes C\ .^ Aikyl substituiert sein kann, oder eine ggf. fluorierte Ci-io-Alkylgruppe darstellt, die ggf. mit -OY ⁴ , -SY ⁴ -O-CO-Y ⁴ -O-CO-NH-Y ⁴ , NH-CO-Y ⁴ , -NH-CO- H-Y ⁴ , S(0)„~ Y ⁴ ( wobei n 0, 1 oder 2 darstellt), -SO2- H-Y ⁴ , NH-Y ⁴ , oder N(Y ⁴ ) ₂ , substituiert sein kann, wobei Y4 H, Phenyl (ggf. ein oder mehrfach mit Halogen (insbesondere F) oder ggf. fluoriertes Aikyl substituiert), oder Alkyl (wobei die Alkylgrappe mit -OH, -COOK, und/oder -NHCO-C _!-3 - Alkyl substituiert sein kann, und wobei Alkyl vorzugsweise C1-3 Alkyl bedeutet) darstellt;

wobei insbesondere bevorzugt R ³ mit -OH, O-Alkyl, SH, S-Aikyl O-CO-Alkyl, O-CO-NH-Alkyl, NH-CO-Alkyl, NH-CO-NH- Alkyl, S(0) _n -Alkyl, S0 ₂ -NH-Alkyl, NH-Alkyl, N(Alkyl) ₂ , oder NH ₂ substituiert sein kann (wobei Alkyl vorzugsweise Ci-3 Alkyl bedeutet); wobei n 0, I oder 2 darstellt,

R ^' H oder F ist;

R° und R' unabhängig voneinander H, (ggf. fluoriertes) Ο-3-Alkyl, (ggf. fluoriertes) C ₂ . -Alkenyl, (ggf. fluoriertes) C ₂ -4-Alkinyl, Hydroxy oder Halogen darstellen;

R ⁸ eine verzweigte Ci-5-Alkyl-Gruppe oder Cyclohexyl ist; und

R ⁹ H oder F ist.

Weiterhin sind bevorzugt (allein oder in Kombination), wenn R ¹ -L-#l , COOH oder H darstellt,

R ² und R ⁴ H sind oder R ² und R ⁴ gemeinsam (unter Bildung eines PyriOlidinringes) -CH2-CHR ¹¹ - oder -CHR ^{l l} -CH ₂ - darstellen, wobei R" H darstellt, oder R ⁴ -L-#l ist und R ² H ist;

A CO darstellt,

R ³ ~(CH ₂ )OH, -CH(CH ₃ )OH, -CH ₂ SCH ₂ CH(COOH)NHCOCH ₃ , -CH(CH ₃ )OCH ₃ , eine Phenylgruppe, die mit 1 -3 Halogenatomen, 1-3 Aminogruppen oder 1 -3 Alkylgruppen (die ggf. halogeniert sein können, substituiert sein kann, oder -L-#l darstellt,

R ⁵ oder H darstellt,

R° und R ⁷ unabhängig voneinander H, Cw-Alkyl oder Halogen darstellen, insbesondere dass R ⁶ und R ⁷ F darstellen;

R ⁸ C 1-4- Alkyl (vorzugsweise tert-butyl) oder Cyclohexyl darstellt; und'' oder

R ^; H darstellt. Zudem ist es erfindungsgemäß bevorzugt, wenn

R -L-#l, COOK oder H darstellt,

R ² und R ⁴ H oder R ² und R ⁴ gemeinsam (unter Bildung eines Pyrrolidinringes) -CH2-CHR"- oder -CHR ^{! I} -CH ₂ - darstellen, wobei R ^{i !} H darstellt,

A CO darstellt,

R ³ -(CH ₂ )OH, -CH(CH ₃ )OH, ··( ^' ! I, S( ^' i 1 ( 1 COOl ί )N! K ^' ()( ^' ! . ··( ΠίΠ ί ΟΠ Ι .- eine Phenylgruppe, die mit 1-3 Halogenatomen, 1-3 Aminogruppen oder 1-3 Alkylgruppen (die ggf. halogeniert sein können, substituiert sein kann, oder -L-#l darstellt,

R ⁵ H darstellt,

R° und R ⁷ unabhängig voneinander H, Cu-AIkyl oder Halogen darstellen, insbesondere dass R ⁶ und R' F darstellen;

R ⁸ Ci-4-Alkyl (vorzugsweise tert-butyl) darstellt; und

R ⁹ H darstellt.

Andere besonders bevorzugte Verbindungen weisen die folgende Formel (II) oder (IIa) auf:

Formel (II):

wobei

R ^l H, -L-Binder, -MOD oder -(CH ₂ )o- ₃ Z darstellt, wobei Z -H, -NHY ³ , -OY ³ , -SY ³ , Halogen, -CO- NY'Y ² , oder -CO-OY ³ darstellt,

wobei Y ¹ und Y ² unabhängig voneinander H, H ₂ , -(CH ₂ CH ₂ 0)o-3-(CH ₂ ) ₀ -3Z'(z.B. -(CH ₂ ) ₀ - ₃ Z'), oder -CH(CH ₂ W)Z' darstellen, und Y ³ H oder -(CH ₂ ) ₀ .. ₃ Z' darstellt, wobei Z' H, NH ₂ , SO ₃ H, - COOH, -NH-CO-CH ₂ -CH ₂ -CH(NH ₂ )COOH oder - ^' O-Ni i-Ci IV ^' } ( ()()! ! darstellt; wobei W H oder OH darstellt, wobei Y ⁴ lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit-NHCONH2 substituiertes, Ci-β Alkyl oder gegebenenfalls mit -NH ₂ substituiertes Aryl oder Benzyl darstellt;

R ² H, -MOD, ~CO-CHY ⁴ ~NHY ⁵ oder -(CH ₂ )o- ₃ Z darstellt, wobei Y ⁴ Imeares oder verzweigtes, gegebenenfalls rnit-NHCO L substituiertes, Ci-e Alkyl oder gegebenenfalls mit -NH ₂ substituiertes Aryl oder Benzyl darstellt und Y ⁵ H oder -CO-CHY ⁶ -NH2 darstellt, wobei Y ⁶ lineares oder verzweigtes C _M Alkyl darstellt,

wobei Z -II, Halogen, -OY ³ , -SY ³ , NHY ³ , -CO-NY'Y ² , oder -CO-OY ³ darstellt,

wobei Y ¹ und Y ² unabhängig voneinander H, NH ₂ , oder -(CH ₂ )o-: _> Z' darstellen, und Y ³ H oder -

(C! l; i, :/ darstellt, wobei Z' H, SO3H, NH ₂ oder COOH darstellt;

R ⁴ H, -L-Binder,

-SG _j ys-iCO^^-R ⁴ ', -CO-CHY ⁴ -NHY ⁵ oder -(CH ₂ )o- ₃ Z darstellt,

wobei SG _j ys eine durch lysosomale Enzyme spaltbare Gruppe darstellt, insbesondere eine Gruppe bestehend aus einem Di- oder Tripeptid, R ⁴ 'eine C wo- Alkyl-, Cwo-Aryl- oder Ce-io-Aralkyl-, C5- 10- Heteroalkyl-, Ci-io-Alkyl-O-Cö-io-Aryl-, C5.10-Heterocycloalkyl-, Heteroaryl-, Heteroaryl-alkyl-, Heteroaryl-alkoxy-, Ci-io-Alkoxy-, Ce-io-Aryloxy- oder Ce-so-Aralkoxy-, Cs-io-Heieroaralkoxy-, G- lo-Alkyl-O-Ce- 10-Aryloxy-, Cs-io-Heterocycloalkoxy-Gruppe, die ein oder mehrfach mit ~NH ₂ , -ΝΉ- Alkyl, -N(Alkyl) ₂ , H-CO-Alkyl, N(Alkyl)-CQAlkyl, -SO3H, -S0 ₂ NH ₂ , -S0 ₂ -N(Alkyl) ₂ , -COOH, -CONH2, -CON(AlkyI)2, oder -OH substituiert sein kann, -H oder eine Grappe -O _x -(CH ₂ CH ₂ 0)y- R4 ^" darstellt, (wobei x 0 oder 1 und v eine Zahl von 1 bis 10 darstellt, und R ⁴ " -H, -Alkyl (vorzugsweise Ci-n-Alkyl), -CH ₂ -COOH, -CH2-CH2-COOH, oder -CH ₂ -CH2-NH ₂ darstellt); wobei Z -H, Halogen, -OY ³ , -SY ³ , NHY ³ , -CO-NY 'Y ² , oder -CO-OY ³ darstellt,

wobei Y ¹ und Y ² unabhängig voneinander H, NH ₂ , oder -(CH ₂ )o-3Z ' darstellen, und Y ³ H oder -

(CH ₂ )o- ₃ Z ^l darstellt, wobei Z' H, S0 ₃ H, NH ₂ oder COOH darstellt;

wobei Y ⁴ lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit-NHCONH ₂ substitiiiertes, Alkyl oder gegebenenfalls mit -NH ₂ substituiertes Aryl oder Benzyl darstellt und Y ⁵ H oder -CO-CHY ⁶ -NH2 darstellt, wobei Y ⁶ lineares oder verzweigtes Cs-6 Alkyl darstellt;

oder R ² und R ⁴ gemeinsam (unter Bildung eines Pyrrolidinringes) -CH2-CHR' ⁰ - oder -CHR ^{I 0} -CH2- darstellen, wobei R ¹⁰ H, NH ₂ , SO ₃ H, COOH, SH, oder OH darstellt;

A CO, SO, SO2, SO2NH oder ( NM ! darstellt;

R ³ -L-Binder, -MOD, oder eine gegebenenfalls substituierte Alkyl-, Cycloalkyl-, Aryl-, Heteroaryl- Heteroalkyl-, Heierocycloalkyl- Gruppe darstellt, bevorzugt -L-BINDER oder eine Cno-AIkyl-, Ce-io-Aryl- oder Ce-io-Aralkyl-, Cs-io-Heteroalkyl-, Ci-io-Alkyl-O-Ce-io-Aryl- oder Cs-io- Heterocydoalkyl -Gruppe, die mit 1 -3 -OH Gruppen, 1 -3 Halogenatomen, 1 -3 halogenierten Alkylgruppen (die jeweils 1 -3 Halogenaiome aufweisen), 1 -3 O-Alkyl Gruppen, 1 -3 -SH Gruppen, 1 -3 -S- Alkyl Gruppen, 1 -3 -O-CO-Alkyl Gruppen, 1-3 -O-CO-NH- Alkyl Grappen, 1-3 -NH-CO- Alkyl Gruppen, 1 -3 -NH-CO-NH-Alkyl Gruppen, 1 -3 ~S(0) _n -Alkyl Gruppen, 1-3 -S0 ₂ ~NH- Alkyl Gruppen, 1 -3 -NH-Alkyl Gruppen, 1 -3 -N(Alkyl) ₂ Gruppen, 1 -3 - H ₂ Gruppen oder 1 -3 -(CEfeV ₃ Z Gruppen, wobei Z -H, Halogen, -OY ³ , -SY ³ , -NHY ³ , -CO-NY'Y ² , oder -CO-OY ³ darstellt, mit Y' und Y ² unabhängig voneinander H, NH ₂ , oder ~(CH ₂ )o-r.Z' darstellen, und Y ' H, -(CH ₂ )o. ₃ -CH(NHCOCH3)Z',-(CH ₂ )o.3-CH(NH ₂ )Z', oder -(CH ₂ )o- ₃ Z' darstellt, wobei Z' H, SOsH, NH ₂ oder COOH darsteilt,

substituiert sein kann (wobei„Alkyl" bevorzugt Ci-io-Alkyi bedeutet);

R ⁵ H, H ₂ , N0 ₂ , Halogen (insbesondere F, Cl, ßr), -CM, CF ₃ , -OCF ₃ , -CH ₂ F, -CH ₂ F, SH oder - (CH ₂ )Ö-3Z darsteilt, wobei Z -FI, -OY ³ , -SY ³ , Halogen, NHY ³ , -CO-NY'Y ² , oder -CO-OY ³ darstellt, wobei Y ¹ und Y ² unabhängig voneinander H, NH ₂ , oder -(CH _{2 3} ' darstellen, und Y ³ H oder - C C ^' l I. ).. /· darstellt, wobei Z' H, SO3H, NH ₂ oder COOH darstellt;

R" und R' unabhängig voneinander H, Cyano, (ggf. fluoriertes) Cwo-Alkyl, (ggf. fluoriertes) C2-10- Alkenyl, (ggf. fluoriertes) CVio-Aikinvi, Hydroxy, NO2, NFI ₂ , COOH oder Halogen (insbesondere F, Cl, Br) darsteilen,

IV (ggf. fluoriertes) C ₁ - ₁₀ - Alkyl, (ggf. fluoriertes) C ₂ -io~Aikenyi, (ggf. fluoriertes) C ₂ -io-Aikinyi, (ggf. fluoriertes) Ci-io-Cycloaikyl oder~(CH ₂ )o- ₂ -(HZ ² ) darstellt, wobei HZ" ein 4 bis 7-gliedriger Heterocyclus mit bis zu zwei Heteroatomen ausgewählt aus N, O und S darsteilt, wobei jede dieser Gruppen mit -OH, CO2H oder NH? substituiert sein kann darstellt;

R ⁹ H, F, CH ₃ , CF3, CH ₂ F oder CHF ₂ darstelit; wobei -MOD -(NR ^l0 ) _r (G! ) _o -G2-G3 darstellt, wobei

R " H oder C -C _: - .\ il,> I darstellt;

Gl -NHCO- oder -CONH- darstellt (wobei wenn Gl -NHCO- darstelit, R'° nicht NH ₂ ist);

n 0 oder 1 ist;

o 0 oder 1 ist; und

G2 eine geradkettige und/oder verzweigte Kohlenwasserstoffgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen ist, die einfach oder mehrfach durch eine oder mehrere der Gruppen -O-, -S-, - SO-, S0 ₂ , - R -, - RYCO-, CONRY-, -NR.YNRY-, -S02 \ Ri ^' N R ^} -. -CONRJ'NRy-, (wobei R ^y II, Phenyl, C _j -CiQ-Alkyl, C2-C| o-Alkenyl, oder C2-C _| 0-Alkinyl darstellt, die jeweils mit

NHCONH ₂ , -COOH, -OH, - I2, NH-CNNH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können), -CO-, oder -CR ^x =N-0- (wobei R ^x H, C1 -C^-Alkyi oder Phenyl darstellt) unterbrochen sein kann, wobei die Kohlenwasserstoffkette einschließlich der Seitenketten, sofern vorhanden, mit \H( ONi b. -COOH, -OH, -NH ₂ , NH-CNNH ₂ , Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein kann, wobei die Gruppe -MOD vorzugsweise zumindest eine Gruppe -COOH aufweist; sowie ihre Salze, Solvate, Salze der Solvate und Epimere.

Im Falle von Binderkonjugaten der KSP- nhibitoren der Formel (II) kann maximal ein Vertreter von R ^! , R ³ und R ⁴ (aitemativ zu einer der oben angegebenen Bedeutungen) -L-Binder darstellen, wobei L für einen Linker steht und BINDER für den Antikörper steht, wobei der Antikörper ggf. an mehrere Wirkstoffmoleküle gebunden sein kann.

Formel (IIa):

wobei

Rl -L-BINDER, H, oder -(CH ₂ )o- ₃ Z darstellt, wobei Z -H, -NHY ⁵ , -OY ³ , -SY ³ , Halogen, -CO- ΝΥ ^' Ύ ² , oder -CO-OY ³ darstellt,

wobei Y ¹ und Y ² unabhängig voneinander H, NFI2, oder -CH(CH ₂ W)Z' darstellen, und Y ³ H oder -(CH ₂ )o- ₃ Z' darstellt, wobei Z' H, NH ₂ , SO3H, COOH, -NH-CO-CH2- (Ί ! ··( ^' ! !ί Ν! ί )(·()()! I oder -(CO-NH-CHY ⁴ ),. _; COOH darstellt; wobei W H oder OH darstellt; wobei Y ⁴ lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit-NHCONtfc substituiertes, Ci-eAJkyl oder gegebenenfalls mit -NH2 substituiertes Aryl oder Benzyl darstellt; R ² und R ⁴ unabhängig voneinander H, -SG _lys -(CO) ₀ -R ⁴ ', -CO-CHY ⁴ -NHY ³ oder -(CH ₂ )o-3Z darstellen,, oder R ¹ und R ⁴ gemeinsam (unter Bildung eines Pyrrolidinringes) -CH2-CHR ¹¹ - oder - CHR ^{i !} ~CH ₂ ~ darstellen, oder R ² H, ~CO-CHY ⁴ ~NHY ⁵ oder -(CH2V3Z darstellt und R ⁴ -L-#l darstellt, wobei R ^{1 !} H, NH ₂ , SO3H, COOK, SH, Halogen (insbesondere F oder CT), C _M Alkyi, C1- ₄ Haioalkyi, C i-4 Alkoxy, Hydroxyl-substituiertes CwAlkyL COO(Ci-4 Alkyl) oder OH darstellt; wobei SG _j y _g eine durch lysosomaie Enzyme spaltbare Gruppe darstellt, insbesondere eine Gruppe bestehend aus einem Di- oder Tripeptid, R 'eine Ci-10-Alkyl-, Cs-io-Aryl- oder Ce-io-Aralkyl-, C5- 10- Heteroalkyl-, Cs- 10-HeterocycloalkyI-, Heteroaryl-, Heteroaryl-alkyl-, Heteroaryl-alkoxy-, C 1-10- Alkoxy-, Ce-io-Aryloxy- oder Ce- so-Aralkoxy-, Cs-io-Heteroaralkoxy-, Ci- lo-Alkyl-O-Ce- 10-Aryloxy-, Cs-io-Heterocycloalkoxy-Gruppe darstellt, die ein oder mehrfach mit - NH ₂ , -NH-Alkyl, - N( Aikyi ).. NH-CO-Alkyl, (Alkyi)-COAlkyl, -SO ₃ H, -S0 ₂ NH ₂ , -S0 ₂ - N(Alkyl) ₂ , -COOH, -CONH ₂ , -CON(Alkyl) ₂ , oder -OH substituiert sein kann, -H oder eine Gruppe -O _x -(CH2CH20) _y -R ⁴ ' ' darstellt, (wobei 0 oder 1 und v eine Zahl von 1 bis 10 darstellt, und R ⁴ " -H, -Alkyl (vorzugsweise Ci-i2-Alkyl), -CH2-COOH, -CH ₂ -CH ₂ -COOH, oder -CH2-CH2- NH ₂ darsielit); wobei Z -H, Halogen, -OY ³ , -SY ³ , NHY ³ , -CO-NY'Y ² , oder -CO-OY ³ darstellt,

wobei Y ¹ und Y ² unabhängig voneinander H, H ₂ , oder -(CH2V3Z' darstellen, und Y ^J H oder -

CC ^' l I -).. /· darstellt, wobei Z' H, SO3H, NH ₂ oder COOH darstellt;

wobei Y ⁴ lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit-NHCONH ₂ substituiertes, Ci-β Alkyl oder gegebenenfalls mit -NH ₂ substituiertes Aryl oder Benzyl darstellt und Y ⁵ H oder ~CO-CHY ⁶ -NH ₂ darstellt, wobei Y ⁶ lineares oder verzweigtes Ci-e Alkyl darstellt;

A CO, SO, SO2, S -M ! oder CNNH ₂ darstellt;

R ^J -L-BINDER oder eine gegebenenfalls substituierte Alkyl-, Aryl-, Heteroaryl- Heteroalkyl-, Heterocycloalkyl- Gruppe darstellt, bevorzugt; -L-BINDER oder eine CMO- Alkyl-, Ce-io-Ar l- oder Ce-io-Aralkyl-, Cs-io-Heteroalkyi-, C 1. io-Alkyl-O-Ce-ι o-Aryi- oder Cs-io-Heterocycloalkyl-Gntppe, die mit 1 -3 -OH Gruppen, 1 -3 Halogenatomen, 1-3 halogenierten Alkyigruppen (die jeweils 1-3 Halogenatome aufweisen),, 1-3 O- Alkyl Gruppen, 1-3 -SH Gruppen, 1 -3 -S-Alkyl Gruppen, 1-3 - O-CO-Alkyl Gruppen, 1 -3 -O-CO-NH- Alkyl Gruppen, 1 -3 -NH-CO-Alkyl Gruppen, 1-3 -NH-CO- NH-Alkyl Gruppen, 1-3 -S(0) _n - Alkyl Gruppen, 1-3 -S0 ₂ -NH-Alkyl Gruppen, 1-3 -NH-Alkyl Gruppen, 1 -3 -N(Alkyl) ₂ Gruppen, 1 -3 -NH ₂ Gruppen oder 1 -3 -(CH ₂ ) ₀ -:;Z Gruppen, wobei Z -H, Halogen, -OY ³ , -SY ³ , -NHY ³ , -CO-NY ^] Y ² , oder -CO-OY ³ darstellt, mit Y ¹ und Y ² unabhängig voneinander H, NH ₂ , oder -(CH ₂ )o_3Z' darstellen, und Y' H, -(€Η2)ο-3-ΟΗ(ΝΗ( θΓ;Η3)Ζ',-(Γ;Η ₂ )ο-3-€Η(ΝΗ ₂ )Ζ', oder -(CH2V3Z' darstellt, wobei Z' H, SO3H, NH2 oder COOH darstellt,

substituiert sein kann (wobei„Aikyi" bevorzugt Cwo-Alkyl bedeutet);

R ⁵ H, F, NI-I2, N0 ₂ , Halogen, SH oder -iCH ), ; ' darstellt, wobei Z -H, Halogen, -OY ³ , -SY ³ , - NHY ³ , -CO-NY'Y ² , oder -CO-OY ³ darstellt,

wobei Y ¹ und Y ² unabhängig voneinander H, NH ₂ , oder -(CH ₂ V ₃ Z' darsteilen, und Y ³ H oder - (CH ₂ )o-.3Z' darstellt, wobei Z' H, SO3H, NH ₂ oder COOH darstellt;

wobei L für einen Linker steht und BINDER für Binder bzw. Derivat biei'von stellt, wobei der Binder ggf. an mehrere Wirkstoffmoleküle gebunden sein kann,

R ⁶ und R' unabhängig voneinander H, Cyano, (ggf. fluoriertes) Cwo-Alkyl, (ggf. fluoriertes) C2-10- Alkenyl, (ggf. fluoriertes) C2-io-Alkmyl, Hydroxy oder Halogen darstellen,

R ⁵ (ggf. fluoriertes) Ci-10-Alkyl, (ggf. fluoriertes) Gt-io-Cycloalkyl oder optional substituiertes Oxetan darstellt; und

R ⁹ H, F, CH ₃ , CF3, CH ₂ F oder CHF ₂ darstellt; sowie ihre Salze, Solvate, Salze der Solvate und Epimere.

Weiterhin sind erfindungsgemäß bevorzugt folgende KSP -Inhibitoren- Antikörper-Konjugate:

Formel (IIb):

wobei R ¹ , R ² , R ⁴ , R ³ , R ⁶ , R ⁷ , R ⁸ und R ⁹ die gleiche Bedeutung wie in Formel (II) oder (IIa) aufweisen, A CO darstellt, ß eine Einfachbindung, -O-CH2-- oder --CH2-O- darstellt, und R ²⁰ H2, F, CF3, oder CH ₃ , und n 0, I , oder 2 darstellt. Forme! (IIc):

wobei A, R ¹ , R ³ , R ⁶ , R ⁷ , R ^s , und R ⁹ die gleiche Bedeutung wie in Formel (II) oder (IIa) aufweisen, wobei A vorzugsweise CO und R ³ -CH ₂ OH, -CH ₂ OCH ₃ , CH(CH3)OH oder CH(CH ₃ )OCH ₃ darstellt.

Formel (Tid):

wobei A, R ^J , R ⁶ , R', R ⁸ und R ^& die gleiche Bedeutung wie in Formel (II) oder (IIa) aufweisen, wobei A vorzugsweise CO und R ^J -CH2-S _x -(CH2)o-4-CHY ⁵ -COOH auf, wobei x 0 oder 1 ist, und Y ^s H oder NHY ⁶ darstellt, wobei Y ⁶ H oder -COCH3 darstellt.

Formel (He):

wobei A, R ² ,R ^J , R ⁴ , R ⁶ , R ⁷ , R ^s und R ⁹ die gleiche Bedeutung wie in Formei (II) oder (IIa) aufweisen, und R^ -L-B INDER darstellt,

Formel (Iii):

wobei A, R', R ² , R ³ , R ⁶ , R ^? , R ⁸ und R ⁹ die gleiche Bedeutung wie in Formel (II) oder (IIa) aufweisen, und R ⁴ -L---BINDER darstellt, vorzugsweise einen enzy atiseh spaltbaren Binder, so dass nach Spaltung R ⁴ =H.

Formel (Iii) aufweist:

(Hj)

wobei

R ' -L-#l darstellt;

A CO darstellt; und

R ⁶ , R ⁷ , R ⁸ und R ⁹ die gleiche Bedeutung wie in Formel (I) aufweisen Formel (ilk):

(Ilk) wobei

R -L-#l darstellt:

A CO und R ³ ( I i Oi i - darstellt;

R', R ⁶ , R ⁷ , R ⁸ , und R ⁹ die gleiche Bedeutung wie in Formei (I) aufweisen.

Weiterhin sind bevorzugt in den Verbindungen der Formeln (IT), (IIa), (IIb), (Tic), (TId), (Tie), (Iii), (Iii) und (Ilk) (allein oder in Kombination), wenn:

Z Cl oder Br darstellt; R ^l -(CH ₂ )o- ₃ Z darstellt, wobei Z COOH oder -CO-NY'Y ² darstellt, wobei Y ² -(CH ₂ CH ₂ O

(CH ₂ ) ₀ .Z' und Υ' H, NH2, oder -i CS l. CM Ο ί,.· H ( ^' M ) _{n ;} Z darstel lt :

Y ¹ H darstellt, Y ² -(CftCftOyCifeCHbZ' darstellt und Z' -COOH darstellt;

Y ^! H darstellt, Y ² -CH ₂ CH ₂ Z' darstellt und Z' ~(CONHCFiY ⁴ ) ₂ COOH stellt;

Y ¹ H darstellt, Y ² -CH ₂ CH ₂ Z' darstellt, Z' -(CONHCHY ⁴ ) ₂ COOH stellt und eine Y* /-propyi darstellt und der andere ein -(CH ₂ ):t-NHCONH ₂ darstellt ;

Y ¹ H darstellt, Y ² -CH ₂ CH ₂ Z' darstellt, Z' -(CONHCHY ⁴ ) ₂ CQQH stellt und eine Y ⁴ -CH ₃ darstellt und der andere ein -(CH ₂ )3-NHCO I-I ₂ darstellt ;

Y ⁴ lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit -NHCONH2 substituiertes, CM Alkyl darstellt; mindestens ein Vertreter von Y ⁴ ausgewählt wird aus z ^' -propyi oder -CH3.

Y ¹ H darstellt, Y ² -CH ₂ CH ₂ Z' darstellt, Z' -CONHCHY ⁴ COOH darstellt und Y gegebenenfalls mit

-NH ₂ substituiertes Aryl oder Benzyl darstellt;

Y ⁴ Aminobenzyl darstellt;

R ² ~(CH ₂ )o-3Z darstellt und Z -SY ³ darstellt;

R ⁴ -CO-CHY ⁴ -NHY ⁵ darstellt und Y ⁵ H darstellt;

R ⁴ -CO-CHY ⁴ -NHY ⁵ darstellt und Y ⁵ -CO-CHY ⁶ - H ₂ darstellt;

Y ⁴ lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls substituiertes mit -NHCONH2 C 1-6 Alkyl darstellt.

Weiterhin ist es bevorzugt, wenn R', R ² oder R' in Formel (I) oder (II) -MOE) darstellt,

Besonders bevorzugt stellt R ³ -MOD und R ¹ oder-L-#l bzw. -L-Bf DER dar, wobei -MOD -(NR ^l0 ) _ir {GI ) _o -G2-G3 darstellt, wobei

R " H oder Ci-C ₃ -Alkyl darstellt;

Gl -NHCO- oder -CONH- darstellt (wobei wenn Gl -NHCO- darstellt, R ¹⁰ nicht NH ₂ ist);

n 0 oder 1 ist;

o 0 oder 1 ist; und

G2 eine geradkettige und/oder verzweigte Kohlenwasserstoffgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen ist, die einfach oder mehrfach durch eine oder mehrere der Gruppen -O-, -S-, -

SO-, SO2, -NR> ^' -, -NRYCO-, CONRY-, -NR NRY-, -S02NR> y-, -CONRYNRY-, (wobei R ^y H, Phenyl, C \ -Cj Q-Alkyl, C^-Cj Q-Alkenyl, oder C2-C1 g-Alkinyl darstellt, die jeweils mit

NHCONH ₂ , -COOH, -OH, -NH ₂ , NH-CNNH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können), -CO-, oder -CR ^x =N-0- (wobei Rx H, C 1 -C3- Alkyl oder Phenyl darstellt) unterbrochen sein kann, wobei die Kohlenwasserstoffkette einschließlich der Seitenketten, sofern vorhanden, mit -NHCONH ₂ , -COOH, -OH, -NH ₂ , NH-CNNH ₂ , Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein kann, wobei G3 -H oder -COOH darstellt, und wobei die Grappe -MOD vorzugsweise zumindest eine Gruppe -COOH aufweist;

Besonders bevorzugt weist die Gruppe -MOD eine (vorzugsweise terminale) -COOH-Grappe auf, z.B. in einer Betaingruppe. Vorzugsweise weist die Grappe -MOD die Formel -CH2-S _x -(CH2)o--4- CHY ⁵ -COOH auf, wobei x 0 oder 1 ist, und Y ⁵ H oder NHY ⁶ darstellt, wobei Y6 H oder -GOCH-, darstellt.

Andere besonders bevorzugte Verbindungen weisen die folgende Forme] (III) auf:

wobei

R 1 -L-BINDER, i L oder ~ Ί ί ), : ' darstellt, wobei Z -I i. -NHY ³ , -OY ³ , -SY ³ , Halogen, -CO- NY'Y ² , oder -CO-OY ' darstellt,

wobei Y' und Y ² unabhängig voneinander H, NH ₂ , oder -(CH ₂ CH ₂ 0)o- ₃ -(CH ₂ ) ₀ ,Ζ' oder - CH(CH ₂ W)Z' darstellen, und Y ³ H oder -{ U - ^■ ■/ darstellt, wobei Z' H, Ni l;. S0 ₃ H, COOH, - NH-CO-CH ₂ -CH ₂ -CH(NH ₂ )COOH oder -(CO-NH-CHY ⁴ ) , _-3 COOH darstellt;

wobei Y ⁴ lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit -NHCONH ₂ substituiertes, oder gegebenenfalls mit -NH ₂ substituiertes Aryl oder Benzyl darstellt;

R ² und R ⁴ unabhängig voneinander H,

-SGi^-(CO) ₀ .i-R ⁴ ', -CO~CHY ⁴ -NHY ⁵ oder -(CH ₂ ) ₀ . ₃ Z darstellen,

, oder R ² und R ⁴ gemeinsam (unter Bildung eines Pyrrolidinringes) -CH ₂ -CHR"- oder -CHR ¹ '- CH ₂ - darstellen, wobei R ^H H, NH ₂ , S0 ₃ H, COOH, SH, Halogen (insbesondere F oder Cl), C Aikyl, Ci-4 Haloalkyl, Ci- ₄ Alkoxy, Hydroxyl-substituiertes Ci- ₄ Alkyl, COO(C M Alkyl) oder OH darstellt; wobei SG _jvs eine durch lysosomaie Enzyme spaltbare Gruppe darstellt, insbesondere eine Gruppe bestehend aus einem Di- oder Tripeptid, R 'eine CMO- Alkyl-, Cs-io-Aryl- oder Ce-io-Aralkyl-, C5.10- Heteroalkyl-, Cj .10- Alk l-0-Ce-io-Aiyl-, C5.10-Heterocycloalkyl-, Heteroaryl-, Heteroaryl-alkyl-, Heteroaryl-alkoxy-, Ci-io-Alkoxy-, Ce-io-Aryloxy- oder Ce-io-Aralkoxy-, Cs-io-Heteroaralkoxy-, Ci- lo-Allcyl-O-Cß-io-Aryloxy-, Cs-io-Heterocycloalkoxy-Gruppe, die ein oder mehrfach mit - NH ₂ , - NH-Alkyl, -N(Alkyl)2, NH-CO- Alkyl, N(Alkyi)-COAlkyl, -SO3H, -SO2NH2, -S0 ₂ -N(Alkyl} ₂ , - COOK, -CO H2, -CON(Alkyi) ₂ , oder -OH substituiert sein kann, -H oder eine Gruppe -O _x - (CH2CH20) _V -R' ⁺ darstellt, (wobei x 0 oder 1 und v eine Zahl von 1 bis 10 darstellt, und R ^"f H, -Alkyl (vorzugsweise Ci.i2-AÜkyl), -CH2-COOH, -CH2-CH2-COOH, oder -CH2-CH2-NH2 darstellt);

wobei Z -H, Halogen, -OY ³ , -SY ³ , NEY ³ , -CO-NY ^] Y ² , oder -CO-OY ³ darstellt,

wobei Y ¹ und Y ² unabhängig voneinander H, H ₂ , oder -(CH2V3Z' darstellen, und Y ³ H oder -

(CH2)ö-3Z' darstellt, wobei Z' H, SO3H, NH ₂ oder COOH darstellt;

wobei Y ⁴ lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit-NHCONH2 substituiertes, C1-6 Alkyl oder gegebenenfalls mit -NH2 substituiertes Aryl oder Benzyl darstellt und Y ⁵ H oder -CO-CHY*-NH2 darstellt, wobei Y* lineares oder verzweigtes Cw Alkyl darstellt;

A CO, SO, SO2, SO M l oder C NH ₂ darstellt;

R ³ -L-BTNDER, eine gegebenenfalls substituierte Alkyl-, Aryl-, Heteroaryl- Heteroalkyl-, Heterocycloalkyl- Gruppe, oder---CH ₂ -Sx-(CH ₂ )o- ₄ -CHY ^s -COOH darstellt, wobei x 0 oder 1 ist, und Y ^s H oder NHY ⁶ darstellt, wobei Y6 H oder -COCH ₃ . darstellt, bevorzugt -L -BINDER oder eine C MO- Alkyl-, Cö-io-Aryl- oder Ce-io-Aralkyl-, Cs-i o-Heteroalkyl-, d-io-AIkyl-O-Ce-io-Aryl- oder Cs- 10-Heterocycloalkyl-Gruppe, die mit 1-3 -OH Grappen, 1-3 Halogenatomen, 1-3 halogenierten Aikylgruppen (die jeweils 1-3 Halogenatome aufweisen),, 1 -3 O- Alkyl Gruppen, 1 -3 -SH Grappen, 1-3 -S-Alkyl Gruppen, 1-3 -O-CO-Alkyl Gruppen, 1 -3 -O-CO-NH-Alkyl Grappen, 1-3 - NH-CO-Alkyl Gruppen, 1-3 -NH-CO-NH-Alkyi Grappen, 1-3 -S(0) _n - Alkyl Gruppen, 1-3 -S0 ₂ - NH-Alkyl Grappen, 1-3 -NH-Alkyl Gruppen, 1-3 -N(Alk:yl) ₂ . Grappen, 1 -3 -NH ₂ Gruppen oder 1- 3 -(CH ₂ )o- ₃ Z Οηφρεη, wobei Z -H, Halogen, -OY ³ , -SY ³ , -NHY ³ , -CO-ΝΥ'Υ ² , oder -CO-OY ³ darstellt, mit Y' und Y unabhängig voneinander H, NH ₂ , oder -(CH ₂ ) ₀ -3Z ' darstellen, und Y' H, -(CH ₂ )(w-CH(NHCOCH; _; )Z ¹ ,-(CH ₂ )o- ₃ -CH(NH ₂ )Z ¹ , oder -·;(Ί 1 · ), 7: darstellt, wobei Z' H, SO ₃ H, NH ₂ oder COOH darstellt,

substituiert sein kann (wobei„Alkyl"' bevorzugt Cwo-Alkyl bedeutet);

R ⁵ H, F, NH ₂ , N0 ₂ , Halogen, SH oder -(CH ₂ ) ₀ - ₃ Z darstellt, wobei Z -H, Halogen, -OY ³ , -SY ³ , - NHY ³ , -CO-NY'Y ² , oder -CO-OY ³ darstellt, wobei Y ¹ und Y ² unabhängig voneinander H, NH2, oder -(CH2V3Z' darstellen, und Y ³ H oder - (CH ₂ )Ö-3Z' darstellt, wobei Z' H, SO3H, NH ₂ oder COOH darsteilt; wobei L für einen Linker steht und BINDER für den Antikörper steht, wobei der Binder ggf. an mehrere Wirkstoffmoleküle gebunden sein kann,

R ⁶ und R' unabhängig voneinander H, Cyano, (ggf. fluoriertes) Cwo-Alkyl, (ggf. fluoriertes) C2-10- Alkenyl, (ggf. fluoriertes) C2-io-Alldnyl, Hydroxy oder Halogen darstellen,

R ^s (ggf. fluoriertes) Ci -10- Alkyl, (ggf. fluoriertes) Ci-io-Cycioalkyl oder optional substituiertes Oxetan darstellt; und

R ⁹ H, F, CH ₃ , CF ₃ , CH2F oder CHF ₂ darstellt; sowie ihre Salze, Solvate, Salze der Solvate und Epimere.

Weiterhin sind bevorzugt (allein oder in Kombination), wenn in Formel (I), (la), (II), (IIa), (IIb), (IIc), (IM), (He), (Iii), U l i s. (Ilk) oder (III):

Z Cl oder Br darstellt;

R ^! -(CH ₂ )( Z darstellt, wobei Z -CO-NY'Y ² darstellt, wobei Y ² -K l 1 ( Ί ! () )■, ;- C ^' H. ) _n .· und Y ¹ H, NH2, oder -(CFIzCHzOjo-HCHz^Z'darstellt;

Y ¹ H darstellt, Y ² ^C^CftO^-CftCHbZ' darstellt und Z' -COOH darstellt;

Y ¹ H darstellt, Y ² -CH ₂ CH ₂ Z' darstellt und Z ¹ -(COi\HCHY ⁴ ) ₂ COOH stellt;

Y ^! H darstellt, V -ί ϋ Π ί. /.' darstellt, Z' ~(CONHCFIY ⁴ ) ₂ COOH stellt und ein Vertreter von Y ⁴ i- propyl darstellt und der andere -(CH ₂ vNHCONH ₂ darstellt ;

Y ^! H darstellt, Y ² -CH ₂ CH ₂ Z' darstellt, Z' -(CONHCHY ⁴ ) ₂ COOH stellt und ein Vertreter vo Y ⁴ - CH ₃ darstellt und der andere -(CH ₂ ) ₃ -NHCONH ₂ darstellt ;

Y ⁴ lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit -NHCONH2 substituiertes, Cw Alkyl darstellt; mindestens ein Vertreter von Y ⁴ ausgewählt wird aus -propyl or -CH3.

Y ^! H darsteilt, Y ² -CH ₂ CH ₂ Z' darstellt, Z' -CONHCHY ⁴ COOH darsteilt und Y ⁴ gegebenenfalls mit -NH ₂ substituiertes Aryl oder Benzyl darstellt;

Y ⁴ eine Ammobenzyl darstellt;

R ² -(CH ₂ )o-3Z darstellt und Z -SY ³ darsteilt;

R ⁴ -CO~CHY ⁴ -i\HY ⁵ darstellt und Y ⁵ H darstellt;

R ⁴ -CO-CHY ⁴ -NHY ⁵ darsteilt und Y ⁵ -CO-CHY ⁶ -NH ₂ darstellt;

Y ⁴ lineares oder verzweigtes gegebenenfalls mit -NHCONH ₂ substituiertes C ₁ -6 Alkyl darsteilt. Weiterhin sind bevorzugt Verbindungen der Formel (Ϊ), (ia), (Ii), (IIa) oder (III),

wobei

R ¹ H, -L-#! bzw. -L-BINDER, -MOD oder -(CHjjo-.Z darstellt, wobei Z -H, -NHY ³ , -OY ³ , -SY ³ , Halogen, -CO-NY ^! Y ² , oder -CO-OY ³ darstellt,

wobei Y ^! und Y ² unabhängig voneinander H, NH ₂ , -(CH ₂ CH ₂ 0)o-3-(CH2)o-3Z'(z.B. -(CH ₂ )o-3Z ^l ), oder -CH(CH ₂ W)Z' darstellen, und Y ³ H oder -(CH ₂ )o-3Z' darstellt, wobei Z' H, NH , SO3H, COOH, -NH~CO-CH ₂ -CH ₂ -CH(NH ₂ )COOH oder -(CO-NH-CHY )i _-3 COOH darstellt; wobei W H oder OH darstellt,

wobei Y ⁴ lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit-NHCONH ₂ substituiertes, Ci-eAJkyl oder gegebenenfalls mit -NH ₂ substituiertes Aiyl oder Benzyi darstellt;

R ² H, -CO-CHY ⁴ -NHY ⁵ oder -(CH ₂ )«Z darstellt,

wobei Z -II, Halogen, -OY ³ , -SY ³ , NHY ³ , -CO-NY'Y ² , oder -CO-OY ³ darstellt,

wobei Y ¹ und Y ² unabhängig voneinander H, NH ₂ , oder -(CH ₂ )o-3Z ' darstellen, und Y ³ H oder -

(Ci i )., ·/.· darstellt, wobei Z ¹ H, SO3H, NH ₂ oder COOH darstellt;

wobei Y* unabhängig voneinander lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit-NHCONH? substituiertes, Cw Aikyl oder gegebenenfalls mit -NH substituiertes Aiyl oder Benzyi darstellt und Y ^S H oder -CO-CHY*-NH ₂ darstellt, wobei Y° lineares oder verzweigtes CM Aikyl darstellt;

R ⁴ H oder -L-#l bzw. -L-BINDER darstellt (wobei -L-#l bzw. -L-BINDER ein enzymatisch spaltbarer Linker ist, der zur Umwandlung von R ⁴ zu H fuhrt);

A CO, SO, SQ.. SOzNH oder CNNH ₂ darstellt;

R ³ -L-#l bzw. -L-BINDER, -MOD oder eine gegebenenfalls substituierte Aikyl-, Cycloalkyl-, Aryl-, Heteroaryl-, Heteroalkyl-, Heteroeycloalkyl- Gruppe darstellt, bevorzugt eine Ci-io- Aikyl-, Ce-10-Aryl- oder Ce- io-Aralkyl-, C5-.10-Heteroalk.yl-, Ci- io-Alkyl-O-Ce-io-Aryl- oder C5- 10- Heterocycloalkyl -Gruppe, die mit 1-3 -OH Gruppen, 1-3 Halogenatomen, 1-3 halogenierten Alkylgruppen (die jeweils 1 -3 Halogenatome aufweisen), 1 -3 O-Alkyl Gmppen, 1-3 -SH Gmppen, 1-3 -S- Aikyl Gruppen, 1-3 -O-CO-Alkyl Gruppen, 1-3 -O-CO-NH-Alkyl Gmppen, 1-3 -NH-CO- Alkyl Gmppen, 1-3 -NH-CO-NH- Aikyl Gmppen, 1 -3 -S(0)n-Alkyl Gmppen, 1-3 -SO2- H- Aikyl Gmppen, 1-3 - H-Alkyl Gruppen, 1-3 -N(Alkyl) ₂ Gruppen, 1-3 -NH((CH ₂ CH ₂ 0)i. ₂ oH)-Gruppen, 1-3 -NI-I2 Gruppen oder 1-3 -(CH ₂ )o. ₃ Z Gruppen, wobei Z -H, Halogen, -OY ³ , -SY ³ , -NHY ³ , -CO- NY'Y ² , oder -CO-OY ³ darstellt, mit Y' und Y ² unabhängig voneinander H, NH ₂ , oder -(CH ₂ )o-3Z ' darstellen, imd Y ³ H, -(CH ₂ )o-3-CH(NHCOCH3)Z\-(CH ₂ )o-3-CH(NH ₂ )Z', oder -(CH ₂ )o-3Z ' darstellt, wobei Z' H, SO ₃ H, NH ₂ oder COOH darstellt, substituiert sein kann (wobei„Aikyl" bevorzugt Cwo-Alkyl bedeutet); R ⁵ H, -MOE), NH ₂ , N0 ₂ , Halogen (insbesondere F, Cl, Br), -CN, CF ₃ , -OCF ₃ , -CH ₂ F, -CH ₂ F, SH oder -(CH ₂ )o- ₃ Z darstellt, wobei Z -H, -OY ³ , -SY ³ , Halogen, NHY ³ , -CO-NY'Y ² , oder -CO-OY ³ darstellt,

wobei Y ¹ und Y ¹ unabhängig voneinander H, NH ₂ , oder -(CH ₂ V ₃ Z' darstellen, und Υ' H oder - (ΟΗ ₂ )ο-:·,Ζ' darstellt, wobei Z' H, SO3H, NH ₂ oder COOH darstellt;

R ⁶ und R' unabhängig voneinander H, Cyano, (ggf. fluoriertes) Ci-10-Alkyl, (ggf. fluoriertes) C2-10- Alkenyl, (ggf. fluoriertes) C ₂ _!o-Alkinyl, Hydroxy, N0 ₂ , H ₂ , COOH oder Halogen (insbesondere F, Cl, Br) darstellen,

R ⁸ (ggf. fluoriertes) O- io-Alkyl, (ggf. fluoriertes) C ₂ _!o-Alkenyl, (ggf. fluoriertes) C ₂ _!o-Alkinyl, oder (ggf. fluoriertes) Ci-io-Cycloalkyl; wobei einer der Substituenten R ¹ und R ³ -L-#l bzw. -L-BI DER darstellt,

L für den Linker steht und #1 für die Bindung zum Antikörper und BINDER für den Antikörper steht,

R ⁹ H, F, CHj, CF ₃ , CH ₂ F oder CHF ₂ darstellt; wobei -MOD -(NR ^l0 ) _ir {Gf ) ₀ -G2-G3 darstellt, wobei

R " H oder Ci-C ₃ -Aikyl darstellt;

Gl -NHCO- oder -CONH- darstellt (wobei wenn Gl -NHCO- darstellt, R ¹⁰ nicht NH ₂ ist);

n 0 oder 1 ist;

o 0 oder 1 ist; und

G2 eine geradkettige und/oder verzweigte Kohlenwasserstoffgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen ist, die einfach oder mehrfach durch eine oder mehrere der Gruppen -O-, -S-, -

SO-, SO2, -NR> ^' -, -NRYCO-, CONRY-, -NR NRy-, -S02NRyNR> ^' -, -CONs NRy-. (wobei R ^y H, Phenyl, C\ -C _{j Q} -Alkyl, C^-C _{j Q} -Alkenyl, oder C2-C1 _Q -Aikinyl darstellt, die jeweils mit

NHCONH2, -COOH, -OH, -NH ₂ , NH-CNNH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können), -CO-, oder -CR ^x =N-0- (wobei Rx H, Ci -C3-Alkyl oder Phenyl darstellt) unterbrochen sein kann, wobei die Kohlenwasserstoffkette einschließlich der Seitenketten, sofern vorhanden, mit -NHCONH ₂ , -COOK, -OH, -NH ₂ , NH-CNNH ₂ , Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein kann, wobei G3 -H oder -COOH darstellt, und wobei die Gruppe -MOD vorzugsweise zumindest eine Gruppe -COOH aufweist; sowie ihre Salze, Solvate, Salze der Solvate und Epimere.

Weiterhin sind bevorzugt Verbindungen der Formel Formel (I), (la), (II), (IIa) oder (III), in denen

R ^! H, -L-#l bzw. -L-BINDER, -MOD oder ~(CH ₂ ) ₀ - ₃ Z darstellt, wobei Z -H, -NHY ³ , -OY ³ , -SY ³ , Halogen, -CO-NY ^! Y ² , oder -CO-OY ³ darstellt,

wobei Y ^! und Y ² unabhängig voneinander H, NH ₂ , -(CH ₂ CH ₂ 0)o-3-(CH ₂ ) ₀ -3Z ¹ (z.ß. -(CH ₂ )o- ₃ Z'), oder -CH(CH ₂ W)Z' darstellen, und Y ³ H oder -(CH ₂ ) ₀ - ₃ Z' darstellt, wobei Z' H, NH ₂ , SO ₃ H, COOH, -NH-CO-CH ₂ ^» CH ₂ ^» CH(NH ₂ )COOH oder -(CO-NH-CHY ⁴ ),. ₃ COOH darstellt; wobei W H oder OH darstellt,

wobei Y ⁴ lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit- HCONH ₂ substituiertes, Ci-β Alkyl oder gegebenenfalls mit -NH ₂ substituiertes Aryl oder Benzyl darstellt;

R ² H, -CO-CHY ⁴ -NHY ⁵ oder -(CH ₂ ) ₀ . ₃ Z darstellt,

wobei Z -H, Halogen, -OY ³ , -SY ³ , NHY ³ , -CO-NY'Y ² , oder -CO-OY ³ darstellt,

wobei Υ' und Y ² unabhängig voneinander H, NH ₂ , oder -(CH ₂ )o- ₃ Z' darstellen, und Y ³ H oder -

(CH ₂ )o- ₃ Z' darstellt, wobei Z' H, SO3H, NH ₂ oder COOH darstellt;

wobei Y ⁴ lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit-NHCONHo substituiertes, Ci-e Alkyl oder gegebenenfalls mit -NFI ₂ substituiertes Aryl oder Benzyl darstellt und Y ^s H oder -CO-CHY ⁶ -NH ₂ darstellt, wobei Y* lineares oder verzweigtes Ci-e Alkyl darstellt;

R ⁴ H darstellt,

A CO, SO, S0 ₂ , SO M ! oder CNNH ₂ darstellt;

R ³ -L-#l bzw. -L-BTNDER, -MOD oder eine gegebenenfalls substituierte Alkyl-, Cycloalkyl-, Aryl-, Heteroaryl-, Heteroalkyl-, Heterocycloalkyl- Gruppe darstellt, bevorzugt eine Cwo- Alkyl-, Ce-io-Aryl- oder Ce-io-Aralkyl-, Cs-io-Heteroalkyl-, Ci-io-Alkyl-O-Ce-io-Aryl- oder C5-10- Heterocycloalkyl-Gruppe, die mit 1-3 -OH Gruppen, 1 -3 Halogenatomen, 1 -3 halogenierten Alkylgruppen (die jeweils 1 -3 Halogenatome aufweisen), 1 -3 O-Alkyl Gruppen, 1 -3 -SH Gruppen, 1 -3 -S-Alkyl Gruppen, 1 -3 -O-CO- Alkyl Gruppen, 1-3 -O-CO-NH-Alkyl Grappen, 1-3 -NH-CO- Alkyl Gruppen, 1 -3 -NH-CO-NH- Alkyl Grappen, 1 -3 -S(O Alkyl Grappen, 1 -3 -SO2-NH- Alkyl Gruppen, 1-3 -NH-Alkyl Gruppen, 1 -3 -N(Alkyl) ₂ Gruppen, 1 -3 -NH((CH2CH.20)] _2 ₍₎ H)-Gruppen, 1-3 -NH ₂ Gruppen oder 1-3 -(CH ₂ )o-3Z Gruppen, wobei Z -II, Halogen, -OY ⁵ , -SY ³ , -NHY ³ , -CO- NY'Y ² , oder -CO-OY ³ darstellt, mit Y ¹ und Y ² unabhängig voneinander H, NH ₂ , oder -(CH ₂ )o-3Z' darstellen, und Y ³ I L -(CH ₂ )o- ₃ -CH(NHCOCH ₃ )Z ⁱ ,-(CH ₂ )o- ₃ -CH(NH ₂ )Z ⁱ , oder -iCi i darstellt, wobei Z' H, SO ₃ H, H ₂ oder COOH darstellt, substituiert sein kann (wobei„Alkyl" bevorzugt C uo-Alkyi bedeutet);

R ⁵ H, -MOE), NH ₂ , NO2, Halogen (insbesondere F, Cl, Br), -CN, CF ₃ , -OCF ₃ , -CH ₂ F, -CH ₂ F, SH oder -(CH ₂ )o-3Z darstellt, wobei Z -H, -OY ³ , -SY ³ , Haiogen, NHY ³ , -CO-NY'Y ² , oder -CO-OY ³ darstellt,

wobei Y ¹ und Y ² unabhängig voneinander H, NH ₂ , oder -(CH ₂ )o-3Z ' darstellen, und Y ^J H oder - (CH ₂ ) ₀ -;;Z' darstellt, wobei Z' H, SO ₃ H, NH ₂ oder COOH darstellt;

R ⁶ und R' unabhängig voneinander H oder Halogen (insbesondere F, Cl, Br) darstellen;

R° (ggf. fluoriertes) C i-10-Alkyl darstellt; wobei einer der Substituenten R ^! und R ³ -L-#l bzw. -L-BINDER darstellt,

L für den Linker steht und #1 für die Bindung zum Antikörper und BINDER für den Antikörper steht,

R ⁹ H, F, CH-„ CF ₃ , CH ₂ F oder CHF ₂ darstellt; wobei -MOD -CH ₂ -Sx-(CH -CHY ⁵ -COOH auf, wobei x 0 oder 1 ist, und Y ⁵ H oder NHY ⁶ darstellt, wobei Y6 H oder -COCH ₃ darstellt, sowie ihre Salze, Solvate, Salze der Solvate und Epimere.

Weiterhin sind die folgenden Verbindungen bevorzugt, die ggf. gemeinsam mit einer Säure wie z.B. Trifluoressigsäure vorliegen können. Diese Verbindungen können über die Positionen entsprechend den Positionen R ¹ , R' und R ⁴ über einen Linker an den Antikörper gebunden werden (wobei ein Wasserstoffetom durch den Linker substituiert wird):

N-(3-Aminopropyl)-N-{(lR)-l-[l -be zyl-4-(2,5-diIluo henyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}-2-hydroxyacetamid;

(2S)-2-ainino-4-[{(3 R)- l -[3 ~benzyl-4-(2,5-difluorph

dimethylpropyl } (gly coloy l)amino] -N-methyl butanamid( 1 : 1 ) ; N-(3-Aminopropyl)-N-{(lS)-l -[1 ~benz>']~4-{2,5~difluoi-pher _! yl)-lH-pyrro]-2yl]-2,2- dime thylpropyl } acetamid.

N-(3-Aminopropyl)-N-{(lS)-l-[l-beTizyl-4-(2 _^ ^

dimethylpropyl}-2-hydroxyacetamid;

dime1hylpropyl}(glycoloyl)amino]butanoy

L-cystein;

dimethy ipropyi } (gly coloyl)amino]butanoyl } -b eta-alany l)amino j elhy 1 }-2,5-dioxopyrrolidin-3-yl)- L-cystein;

S-[l-(2-{[2-({(2S)-2-Am _m o-4-[{(lR)-i-[l-ben^

dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]butanoyl}amm^

3-y!]-L-cystem;

N-[19-(3(R/S)-{[(2R)-2-Ajnino-^^

4,7,10,13-tetraoxa-16-azanonadecan-l-oyl]-R/S-{2-[(3-aminopr opyl){(l R)-l -[1.-benzyl-4-(2,5- difluo^henyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}ainino]-2-o xoethyl}homocystein;

S-{(3R/S)-l-[2-({(2S)-2-Amitio-4-[{(lR^

dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]bu1anoy

S-[(3R/S 1 -(2-{[6-({2-[(3-Aminopropyl){(lR)-l-[I -to

2,2-dimethyipropyi}amino]-2-oxoethyi}sulfanyl)hexarioyl]ammo

L-cystein;

S-{l-[2-({[(lR,3S)-3-({(2S)-2-Amino^-[{(lR)-l-[l-benzyM-(2,5 -difluorphenyl

2,2-dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]butanoyl}am

dioxopyrrolidin-3-yl} -L-cystein;

S-(2-{[2-({(2S)-2-Amino-4-[{(lR)-l-[l-bra^

dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]butanoyl}amino)e1hyl]aini no}-2-oxoethyl)-L-cystein;

]^] ⁶ -(Ή-{(2S)-2-Amino-4-[{(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluo henyl)-lH-pyIτol-2-yl]-2,2- diniethylpropyl}(glycoloyl)amino]butanoyl}-beta-alanyl)-N ² -{N-[6-(3-{[(2R)-2-amino-2- carboxyethyl]sulfanyl}-2,5-dioxopyrrolidin-l -yl)hexanoyl ]-L-valyl-L-alanyl}-L-lysin;

N-[2-({(2S)-2-Amino-4-[{(lR)-l-n^^

dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]butanoyl}ainino)ethyl]-L- glutainm;

ΝΗΝ-{(28)-2-Αηύηο-4-[{(!Κ)-1-Π^

dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]butanoyl}-beta-alanyl)-L- lysin; N-(3-Ammopropyl)-N- i(lR) ^

dimethylpropyl } -3 ,3 ,3 -trifluorpropanamid;

N-(3-Aminopropyl)-N-{(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluorpheny l)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} -4-fluorbenzamid;

N-(3-Aminopropyl)-N-{(lR) -[l-bet^^

dimethylpropyl} aeeiamid;

N-(3 - Aminopropyl)-N- {( 1 R)- 1 - [ 1 -benzyi-4-(2,5-difluoipher _iy l)- 1 H-pyrroi-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}-4-(trifluoromethyl)benzamid;

(2 S)-2- Amino-4 - [ { ( 1 R)- 1 - [ 1 -benzy i-4-(2,5 -difluoiphenyl)- 1 H-pyrrol -2-yl]-2,2-dimethylpropyl} (glycoloyl)amino]butansäure;

(2S)-2-amino-N-(2-aminoelhyl)-4-[ {(1R)-1 -[! -benzyl-4-(2 -difluorphenyi)-lH-pynOl-2-yi]-2,2- dimet]iylpropyl}{giycoloyi)amrao]butanamid;

4-[(2- { [2-( {(2S)-2-Amino-4-[ {(1 R)-l - [ 1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyi)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]butaTioyl}a]iiino)ethyl]ammo }-2-oxoethyl)amm

amino-2-caiboxyeihyl]sulfanyl}-4-oxobutansäuTe;

4-[(2-{[2-({(2S)-2-Aimno-4-[{(lR)-l-[l^

dime thylpropyl } (gly coloy l)amino] butanoy 1 } amino)ethyl] amino } -2-oxoethyl)amino] -2- { [(2R)-2- amino-2-carboxye1 yl]sulfanyl}-4-oxobutamäure;

N- {(2S)-2-Amino-4-[ {(lR)-l-[l -benzyl-4-(2,5-difluo henyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimetliylpropyl}(glycoloyl)ammo]butanoyl}-beta-alanm;

N-{(2S)-2-Amino-4-[{(lR)-l -[l -benzyl-4-(2,5-difluo^henyl) H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]butaTioyl}-L-seriii;

N- {(2S)-2-Amino-4-[ {(lR)-l-[l -benzyl-4-(2,5-difluo henyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimetliylpropyl}(glycoloyl)ammo]butanoyl}-L-alaiim;

N- {(2S)-2-Amino-4-[ {( 1 R)- 1 -[ 1 -benzyl-4-(2,5-difli^henyl)-l H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]butaTioyl}glycm;

N-(3-aminopropyl)-N-{(lR)-l-[l-ben2yi-4-(2,5-difluo^henyl )-lH-py

d im ethylp ropy i } - 4 - m ethyib enzam id; N-(3-aminopropyl)-N- {( 1 R) - 1 - [ 1 -benzyi-4-(2,5-difluoiphenyi)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimetbylpropyl } -4 - (methylsulfanyl)benzamid ;

(2S)-N-{3 -aminopropyl)-N- {( 1 R)- 1 - [ 1 -benzyl-4-(2,5 -difluorphenyl)- 1 H-p nol-2-yl]-2,2 - dimethylpropyl} -2-hydroxypropanamid;

N-(3-aminopropyl)-N-{(lR)-l -[l -benzyl-4-(2,5-difluo heΐlyl) H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}-2-(methylsulfanyl)acetamid;

(2S)-N-( 3 -aminopropyl)-N- { ( 1 R)- 1 ^■ [4-benzyl- 1 -(2,5-diflu<^henyl)- 1 H-pyrazol-3 -yi] -2,2- dimethylpropyl}-2-hydroxypropanamid;

Me1hyl- -[(3-aminopΓop l){(lR)-l -[l -benzyl- -(2,5-difluoφhenyl)-lH-p rΓol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} amino] -4-oxobutanoai;

4-[(3-AminopΓopyl) {(lR)-l -[l -bellzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} amino] -4-oxobutansäure;

(2R)-22-[(3R''S)-3- {[{2R)-2-Ammo-2-carboxyethyl]sulfanyl}-2,5-dioxopym>iidm- aminopropyl) {(1R)- 1 -[1

dimethylpropyl}iimino]-2-oxoethyl} sdfanyl)me1byl]-4,20-dioxo-7,l 0,l 3,l 6-tetraoxa-3,l 9- diazadocosan- 1 -säure;

N-Acetyl-S-{2-[(3-aminopropyl){(l R)-l -[l -bm

dimethylpropyl}amino]-2-oxoethyl} -L-cystein;

N-Acetyl-S-[2-([3 -(L-alanylammo)propyl] {(1R)-1-[I

yl]-2,2-dimethylpropyl}amino)-2-oxoethyl]-L-cystein;

(2S)-N-(3 -aminopropyl)-N- {( 1 R)- 1 - [ I -benzyl-4-(2,5-difhraphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethy ipropyi } tetrahydrofuran-2-carboxamid;

3- ({2-[(3-Aminopropyl){(lR)-l -[l-be^

dimethylpropyl}amino]-2-oxoethyl} sulfanyl)propansäure;

S~{2~[(3~Amim)propyl){(lR)-l-[l ^

dimethylpropyl}amino]-2-oxoethyl}homocystein;

4- amjno-N-(3-amitiopropyl)-N- { ( 1 R)- 1 - [ 1 -benzyl-4-(2,5-diflu(^henyl)- 1 H-pyrrol-2-yl j-2,2- dime thy lpropy 1 } b enzamid;

4-[(2-{[(2R)-2-( {(2S)-2-A ino-4-[ {(!R ^

dimethyipropyi}(giyco]oyl)amino]butatioyi}amino)-2-carbox yetby]]amirio}-2-o

{[(2R)-2-ammo-2-carboxyeihyi]sulfaiiyl}-4-oxobutansäui"e ;

4^(2- {[(2R)-2-({(2S)-2-Ammo-4-[{0

dirnethylpropyl}(glycoloyl)amino]butan^

{ [(2R)-2-airäino-2-carboxyeihyl]sulfanyl -4-oxobuiansäure. Erfmdungsgemäß besonders bevorzugt sind die folgenden Verbindungen der Formeln IV, wobei R', R , R ³ , R ⁴ und R ^Ä die oben genannten Bedeutungen (wie z.B. fiü- Formel (I) oder (II) angegeben) haben:

Formel IV

Besonders bevorzugt sind die Verbindungen der Formeln IV, wobei R ¹ und R ⁵ H oder -L-#l darstellen; R ² und R ⁴ H oder R ¹ und R ⁴ gemeinsam (unter Bildung eines Pyrrolidinringes) -CH ₂ - CHR ^!0 - oder ~CHR ^I0 -CH ₂ - darstellen, wobei R ^!0 H darstellt; und R ³ CTI2OH, CH(CH ₃ )OH oder - L-#l darstellt, wobei einer der Substituenten R ¹ , und R-' -L-#l darstellt. Zudem sind besonders bevorzugt die Verbindungen der Formeln IV, wobei R ¹ H oder COOH darsteilt; R ² und R ⁵ H darstellen; R ⁴ -L-#l darstellt; und R ³ CH2OH, oder CH(CH ₃ )OH darstellt, wobei-L-#l ein enzymatiseb spaltbarer Linker ist, der zur Umwandlung von R ⁴ zu H führt darstellt.

Linker

Aus der Literatur sind verschiedene Möglichkeiten der kovalenten Kopplung (Konjugation) von organischen Molekülen an Binder wie z.B. Antikörper bekannt (siehe z.B. K. Lang and J. W. Chin. Chem. Rev. 2814, 114, 4764-4806, M. Rashidian et al. Bioconjugate Chem. 2013, 24, 1277-1294). Erfindungsgemäß bevorzugt ist die Konjugation der KSP-Inhibitoren an einen Antikörper über ein oder mehrere Schwefelatome von Cystein-Resten des Antikörpers, die entweder als freie Thiole bereits vorliegen oder durch Reduktion von Disulfidbrücken generiert werden, und/oder über eine oder mehrere NH-Gruppen von Lysin-Resten des Antikörpers. Es ist jedoch auch möglich, den KSP-Inhibitor an den Antikörper über Tyrosinreste, über Gluta inreste, über Reste unnatürlicher Aminosäuren, über freie Carboxylgruppen oder über Zuckerreste des Antikörpers zu binden. Zur Kopplung werden sogenannte Linker verwendet. Linker lassen sich in die Gruppe der in vivo spaltbaren Linker und in die Gruppe der in vivo stabilen Linker unterteilen (siehe L. Ducry und B. Stump, Bioconjugate Chem, 21, 5- 33 (2010)). Die in vivo spaltbaren Linker weisen eine in vivo spaitbare Gruppe auf, wobei wiederum zwischen chemisch in vivo spaltbaren und enzymatiseh in vivo spaltbaren Gruppen unterschieden werden kann. „Chemisch in vivo spaltbar" bzw. „enzymatiseh in vivo spaltbar" bedeutet, dass die Linker bzw. Gruppen im Blutkreisiauf stabil sind und erst an bzw. in der Zielzeile durch die dort veränderte chemische bzw. enzymatische Umgebung (niedrigerer pH-Wert; erhöhte Glutathion-Konzentration; Vorliegen lysosomaler Enzyme wie Cathepsin oder Plasmin, oder Glyosidasen wie beispielsweise ß-Glucuronidasen) sich spalten, um so den niedermolekularen KSP-Inhibitor oder ein Derivat davon freizusetzen. Die chemisch in vivo spaltbaren Gruppen sind insbesondere Disulfid, Hydrazon, Acetal und A inal; die enzymatiseh in vivo spaltbaren Gruppen sind insbesondere 2-8 -Oligopeptid gruppe, insbesondere eine Dipeptidgruppe oder Glycoside. Peptidspaltstellen sind in Bioconjugate Chem. 2002, 13, 855-869, sowie Bioorganic & Mediana! Chemistry Leiters 8 (1998) 3341-3346 sowie Bioconjugate Chem. 1998, 9, 618-626 offenbart. Hierzu gehören z.B. Valin-Alanin, Valin-Lysin, Valm-Citrullin, Alanin-Lysin und Phenylalanin-Lysin (ggf. mit zusätzlicher Amidgruppe).

Die in vivo stabilen Linker zeichnen sich durch eine hohe Stabilität aus (weniger als 5 % Metabolite nach 24 Stunden in Plasma) und weisen die oben genannten chemisch oder enzymatiseh in vivo spaltbaren Gruppen nicht auf.

Der Linker -L- weist vorzugsweise eine der folgenden Grundstrukturen (i) bis (iv) auf:

(i) -(C=0) _m -SG1 -Ll -L2- (ü) -(00„ -L1-SG-L1-L2-

(iv) -(C=0) _m -LI -SG-L2 wobei m 0 oder I ist; SG eine (chemisch oder enzymatiseh) in vivo spaltbare Gruppe (insbesondere Disulfid, Hydrazon, Acetal und Aminal; oder eine mit einer Protease spaltbare 2-8- Qiigopeptidgruppe) ist, SGI eine Oligopeptidgruppe oder vorzugsweise eine Dipeptidgruppe ist, LI unabhängig voneinander für in vivo stabile organische Gruppen stehen, und L2 für eine Kopplungsgruppe an den Binder oder eine Einfachbindung steht. Die Kopplung erfolgt hierbei vorzugsweise an einen Cysteinrest oder einen Lysinrest des Antikörpers. Alternativ kann die Kopplung an einen Tyrosinrest, Glutaminrest oder an eine unnatürliche Aminosäure des Antikörpers erfolgen. Die unnatürlichen Aminosäuren können beispielsweise Aldehyd- oder Ketogruppen (wie z.B. Formylglycin) oder Azid- oder Alktngruppen enthalten (siehe hierzu Lan & Chin, Cellular incorporation of Unnatural Amino Acids and Bioorthogonal Labeling of Proteins, Chem.Rev. 2014, 114, 4764-4806). Erfmdungsgemäß bevorzugt, ist insbesondere die Linker-Gamdstruktur (iii). Die Verabreichimg eines erfinöungsgemäßen Konjugats mit einer Linker-Gmndstruktur (iii) und Kopplung des Linkers an einen Cystein- oder Lysinrest des Antikörpers fuhrt durch Metabolisiertmg zu Cystein- bzw. Lysinderivaten der folgenden Formeln:

wobei LI jeweils an den niedermolekularen KSP-Inhibitor gebunden ist, z.B. einer Verbindung der FoiTnel (I), (Ja), (II), (IIa), (IIb), (Ilca), (IM), (Ile) , (Ilf), (III) oder (IV).

Erfindungsgemäß bevorzugt sind auch die Linker-Grundstrukturen (ii) and (iv), insbesondere bei Anbindung an die Position Rl, insbesondere wenn die Gruppe LI eine der folgenden Strukturen aufweist:

(a) --NH-(CH ₂ )o-4-(CHCH ₃ )o-4-CHY ⁵ -CO-Y ⁷ , wobei Y ⁵ H oder NHY ⁶ darstellt, wobei Y ⁶ H oder - COCH3 darstellt, und Y ⁷ eine Einfachbindung oder - H -(CH ₂ )o- -CHNH ₂ -CO- darstellt, so dass nach der Spaltung die entsprechende Struktur bzw. -NH- (CH ₂ )o-4-(CHCH3)o-4-CHY ⁵ -CO-NH ~(CH ₂ ) ₀ - ₄ -CHNH ₂ -COOH erhalten wird.

(b) ~CH ₂ -Sx-(CH ₂ )(,4-CHY ^Ä -CO~ auf, wobei x 0 oder 3 ist, und Y ⁵ H oder NHY ⁶ darstellt, wobei Y6 H oder -COCH3 darstellt, so dass nach der Spaltung die entsprechende Struktur -CH ₂ -S _X - (CH ₂ )Ö-4-CHY ⁵ -COOH erhalten wird.

Erfindungsgemäß bevorzugt ist auch die Liiiker-Gmndstruktur(i) bei Anbindung an die Position R4, insbesondere wenn m=0.

Wenn der Linker an eine Cystein- Seitenkette bzw. einen Cysteinrest gebunden ist, leitet sich L2 vorzugsweise von einer mit der Sulfhydryl-Gruppe des Cysteins reaktiven Gruppe ab. Hierzu zählen Haloacetyle, Maleimide, Aziridine, Acryloyle, Arylierende Verbindungen, Vinylsulfone, Pyridyldisulfide, TNB-thiole and Disulfid-reduzierende Mittel. Diese Gruppen reagieren in der Regel elektrophil mit der Suifhydryl-Bmdung unter Bildung einer Sulfid (z.B. Thioether)- oder Disulfid-Brücke. Bevorzugt, sind stabile Sulfidbrücken. 1.2 ist vorzugsweise

wobei

#' die Verknüpfungsstelle mit dem Schwefeiatom des Antikörpers kennzeichnet, # ² die Verknüpfungsstelle mit der Gruppe V kennzeichnet, und

R ₂ 2 COOK, COOR, COR, CONHR, CONR ₂ (mit R jeweils Cl-3-Alkyl), CONH2, vorzugsweise COOH darstellt.

Besonders bevorzugt als L2 ist:

Formel A3 bzw.

Formel A4 wobei # ^! die Verknüpfungsstelle mit dem Schwefelatom des Antikörpers kennzeichnet, # ² die Verknüpfungsstelle mit der dem Wirkstoff kennzeichnet, x 1 oder 2 darstellt, und R22 COOH, COOR, COR, CONR ₂ , CONHR (mit R jeweils Cl -3-Alkyl), CONH2, vorzugsweise COOH darstellt. Bevorzugt, ist es, wenn x=l und R22 COOH darstellt.

In einem erfindungsgemäßen Konjugat bzw. in einem Gemisch der erfindungsgemäßen Konjugate liegen die Bindungen an einen Cysteinrest des Antikörpers vorzugsweise zu über 80 %, besonders bevorzugt zu über 90 % (jeweils bezogen auf die Gesamtanzahl von Bindungen des Linkers an den Antikörper), besonders bevorzugt in einer der beiden Strukturen der Formel A3 oder A4 vor. Hierbei liegen die Strukturen der Formel A3 oder A4 in der Regel gemeinsam vor, vorzugsweise in einem Verhältnis von 60:40 bis 40:60 bezogen auf die Anzahi der Bindungen an den Antikörper. Die restlichen Bindungen liegen dann in der Struktur

vor.

Erfindungsgemäß wird LI vorzugsweise durch die Formel

dargestellt, wobei

R ⁱ⁰ H, NFI2 oder Ci-C,-Alkyl darstellt; Gl -NHCO- , -CONH- oder \ / darstellt; (R ^1U ist vorzugsweie nicht Nt , wenn Gl

/ \

N N CO NHCO oder V..../ ).

n 0 oder 1 ist;

0 0 oder 1 ist; und

G2 eine geradkettige oder verzweigte Kohlen wasserstoffkette mit 1 bis 100 Kohlenstoffatomen aus Arylengruppen und ^/ oder geradkettigen und/oder verzweigten und/oder cyclischen Alkylengruppen ist, die einfach oder mehrfach durch eine oder mehrere der Gruppen -O-, -S-, -SO-, SO ₂ , - R> ^' -, -

\ - ^V ( ·()··. -C(NH)NRy-, -CONRY-, -NRYNRY-, -S02NR>'NR>'-, -CONRYNRY-, (wobei R ^y I i. Phenyl, C1 -Ci _Q -Alkyl, C2-C _| o-Alkenyl, oder C2~C _{] Q} -Alkinyl darstellt, die jeweils mit

NHCONH ₂ , -COOH, -OH, - I2, NH-CNNH2, Sulfonamid, Sulfo , Suifoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können), -CO-, -CR ^* =N-0- (wobei Rx H, Ci -C^-Alky! oder Phenyl darstellt) und oder einen 3 bis 10-gliedriger, aromatischen oder nicht aromatischen Heterozyklus mit bis zu 4 Heteroatomen ausgewählt aus N, O und S, -SO- oder -S02- unterbrochen sein kann (vorzugsweise

/ \

— N N-CO—

\ / ), wobei die Kohlenwasserstoffkette einschließlich der Seitenketten, sofern vorhanden, mit -NHCONH ₂ , -COOH, -OH, -NH ₂ , NH-CN H2, Sulfonamid, Sulfon, Suifoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können.

G2 eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 300 Kohlenstoffatomen aus Arylengruppen und/oder geradkettigen und/oder verzweigten und/oder cyclischen Alkylengruppen ist, die einfach oder mehrfach durch eine oder mehrere der Gruppen -O-, -S-, -SO-, S02, -NH-, - CO-, -NHCO-, -CONH-, -NMe-, -ΝΉΝΗ-, -S02NHNH-, -CONHNH- und einen 5 bis

1 Ogliedriger, aromatischen oder nicht aromatischen Heterozyklus mit bis zu 4 Heteroatomen ausgewählt aus N, O und S, oder -SO- unterbrochen sein kann (vorzugsweise

/ \

— N N—CO—

\ / ), wobei die Seitenketten, sofern vorhanden, mit -NHCONH2, -COOH, -

OH, -NH ₂ , NH-CNNH2, Sulfonamid, Sulfon, Suifoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können.

G2 ist vorzugsweise eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 100 Kohlenstoffatomen aus Arylengruppen und/oder geradkettigen und/oder verzweigten und/oder cyclischen Alkylengruppen ist, die einfach oder mehrfach durch eine oder mehrere der Gruppen - O-, -S-, -SO-, S02, -NH-, -CO-, -NHCO-, -CONH-, -NMe-, -NHNH-, -S02NHNH-, -CONHNH-, -CR ^x =N-0- (wobei Rx H, C j-C3-Alkyl oder Phenyl darstellt) und einen 3 bis 10-gliedriger, z.B. 5 bis lOgliedriger aromatischen oder nicht aromatischen Heterozyklus mit bis zu 4 Heteroatomen ausgewählt aus N, O und S, -SO- oder -S02- unterbrochen sein kann (vorzugsweise

/ \,

— N N-CO—

\ J ), wobei Kohlenwasserstoffkette einschließlich der Seitenketten, sofern vorhanden, mit -NHCONH ₂ , -COOH, -OH, -NH ₂ , NH-CNNH2, Sulfonamid, Sulfbn, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können.

Weitere unterbreche de Gruppen in G2 sind vorzugsweise

wobei Rx H, C _j -C^-Alkyl oder Phenyl darstellt.

Hierbei ist #'- die Bindung zum KSP-Inhibitor und die Bindung zur Kopplungsgruppe zum Antikörper (z.B. L2).

Eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette aus Arylengruppen und/oder geradkettigen und/oder verzweigten und/oder cycüschen Alkylengrappen umfassi in der Regel einen α,ω-divalenten Alkylrest mit der jeweils angegebenen Zahl von Kohlenstoffatomen. Beispielhaft und vorzugsweise seien genannt: Methylen, Ethan-l,2-diyl (1 ,2-Ethyien), Propan-1,3- diyi ( 1 ,3-Propylen), Butan- 1 ,4-diyl ( 1 ,4-Butylen), Pentan-l,5-diyl (1,5-Pentylen), Hexan- 1 ,6-diyi (1 ,6-Hexylen), Heptan-l ,7-diyl (1 ,7-Hexylen), Octan-l,8-diyl (1,8-Octylen), Nonan-l ,9-diyl (1,9- Nonylen), Decan-l,10-diyl (1,10-Decylen). Die Aikylengruppen in der Kohlenwasserstofflcette können jedoch auch verzweigt sein, d.h. ein oder mehrere H-Atome der oben genannten linearen Aikylengruppen können ggf. durch Cl-10-Alkylgruppen substituiert sein und so Seitenketten bilden. Die Kohlenwasserstoffkette kann weiterhin cyclische Aikylengruppen (Cycloalkandiyl) enthalten, z.B. 1 ,4-Cyclohexandiyl oder 1,3-Cyclopentandiyl. Diese cyclischen Gruppen können ungesättigt sein. Insbesondere können in der Kohienwasserstoffgruppe aromatische Gruppen (Arylengruppen) vorliegen, z.B. Phenylen. Auch in den cyclischen Aikyiengruppen und den Aryiengruppen können wiederum in oder mehrere H-Atome ggf. durch Cl-10-Alkylgruppen substituiert sein. Es wird so eine Kohienwasserstofflcette gebildet, die ggf. verzweigt ist. Diese Kohlenwasserstoffkette weist insgesamt 0 bis 100 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 1 bis 50, besonders bevorzugt 2 bis 25 Kohlenstoffatome auf.

Die Seitenketten können, sofern vorhanden, mit -NHCONH ₂ , -COOK, -OH, -NB ₂ , NH-C H ₂ ,

Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure ein- oder mehrfach, gleich oder verschieden substituiert sein.

Die Kohlenwasserstoffkette kann einfach oder mehrfach, gleich oder verschieden durch eine oder mehrere der Gruppen -O-, -S-, -SO-, S02, -NH-, -CO-, -NHCO-, -CONH-, -NMe-, -NHNH-, - S02NHNH-, -CONHNH- und einen 5 bis 1 Ogliedriger, aromatischen oder nicht aromatischen Heterozyklus mit bis zu 4 Heteroatomen ausgewählt aus N, O und S, -SO- oder -S02- unterbrochen sein.

Weitere unterbrechende Gruppen in G2 sind vorzugsweise

Vorzugsweise entspricht der Linker der folgenden Fonriel:

§-(CO)m-Ll-L2-§§ wobei

m 0 oder 1 ist; § die Bindung an das Wirkstoffmolekül darstellt und

§§ die Bindung an das Bmderpeptid oder -protem darstellt, und

LI und L2 die oben genannten Bedeutungen aufweisen.

Besonders bevorzugt weist LI die Fonnei ~NR* ^B- auf, wobei

H oilcr Ni l; darstellt;

B -[(CH _{2 x} -(X ⁴ ) _y ] _w -(CH ₂ ),- darstellt,

x = 0 bis 5 ist;

x = 0 bis 5 ist;

y = 0 oder 1 ist;

z = 0 bis 5 ist; und

-CONH-,-NHCO- oder darstellt.

Erfindungsgemäß be vorzugte Linker L weisen die folgende Formel auf:

wobei

#3 die Bindung an das Wirkstoffmolekül darstellt,

#4 die Bindung an das Binderpeptid oder -protein darstellt,

R ^{1 1} H oder NH2 darstellt;

B -[(CH ₂ )x-(X ⁴ ) _y ] _w -(CH ₂ )z- darstellt,

w = 0 bis 20 ist;

x = 0 bis 5 ist;

y = 0 oder 3 ist;

z = 1 bis 5 ist; und X ⁴ ()-. -CONH-, --NHCO- oder darstellt.

Die oben genannten Linker werden insbesondere bevorzugt in Konjugaten der Formel (I) oder (II), in denen der Linker durch Substitution eines H-Atoms an Rl oder in Verbindung mit einem spaltbaren Linker SGI an R4 ankoppelt, d.h. Rl-L-#1 darstellt oder R4 -SG1-L-#1, wobei #1 die Bindung an den Antikörper darstellt.

Weiterhin sind die folgenden Linker erfindungsgemäß bevorzugt: In einem erftndungsgemäßen Konjugat bzw. in einem Gemisch der erfindungsgemäßen Konjugate liegen die Bindungen an einen Cysteinrest des Antikörpers vorzugsweise zu über 80 %, besonders bevorzugt zu über 90 % (jeweils bezogen auf die Gesamtanzahl von Bindungen des Linkers an den Antikörper), besonders bevorzugt in einer der beiden Strukturen der Formel A5 oder A6 vor:

Formel A5

Formel A6 wobei

#' die Verknüpfungsstelle mit dem Schwefelatom des Antikörpers kennzeichnet, # ² die Verknüpfungsstelle mit der Gruppe L ¹ kennzeichnet, und

R ²² COOH, COOR, COR, CONR ₂ , CONHR (mit R jeweils Cl-3-Alkyl), CONH ₂ , vorzugsweise COOH darstellt. Hierbei liegen die Strukturen der Formel A5 oder A6 in der Regel gemeinsam vor, vorzugsweise in einem Verhältnis von 60:40 bis 40:60 bezogen auf die Anzahl der Bindungen an den Antiköiper. Die restlichen Bindungen liegen dann in der Struktur

vor.

Andere Linker -L-, die an eine Cystein-Seitenkette bzw. Cysteinrest gebunden sind, weisen die folgende Formel auf

wobei

§ die Bindung an das Wirkstoffmolekül darstellt und

§§ die Bindimg an das Binderpeptid oder -protein darstellt,

m 0, 1 , 2, oder 3 ist;

n 0, 1 oder 2 ist;

p 0 bis 20 beträgt; und

L3

wobei

o 0 oder 1 ist;

und eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstofikette mit 1 bis 100 Kohienstoffatornen aus

Aryiengruppen und/oder geradkettigen und/oder cyclischen Aikylengruppen ist, die einfach oder mehrfach durch eine oder mehrere der Gruppen -O-, -S-, -SO-, S02, -NH-, -CO-, -NHCO-, - CONH-, -NMe-, -NHNH-, -SO2 HNH-, -CONHNH- und einen 3 bis lOgliedriger (vorzugsweise 5 bis lOgliedriger), aromatischen oder nicht aromatischen Heterozyklus mit bis zu 4 Heteroatomen ausgewählt aus N, O und S, -SO- oder -S02- unterbrochen sein kann, wobei die Seitenketten, sofern vorhanden, mit -NHCONH ₂ , -COOH, -OH, -NH ₂ , NH-CNNH ₂ , Sulfonamid, Sulfon, Suifoxid oder Sulfonsäure substituiert sein können.

Bevorzugt ist in der obigen Formel

m 1 ist;

p 0 ist;

n 0 ist;

und L3

darstellt;

wobei

o 0 oder 1 ist; und

G3 -( ⁽ Ή.-Π ΚΗιΠ Η ^' ΟΝΉ ). CH ₂ CH20)v(CH ₂ )w- darstellt, wobei

s, t, v und w jeweils unabhängig voneinander 0 bis 20 betragen, und u 0 oder 1 beträgt.

Bevorzugte Gruppen LI in der obigen Formel §-(CO)m-Ll-L2-§§ sind die folgenden, wobei r jeweils unabhängig voneinander eine Zahl von 0 bis 20, vorzugsweise von 0 bis 15, besonders bevorzugt von 1 bis 20, insbesondere bevorzugt von 2 bis 10 aufweist:

o H

N-C-

Weitere Beispiele für LI sind in Tabelle C angegeben, in denen diese Gruppe in einem Kasten hervorgehoben ist.

In den folgenden Tabellen A und A' sind Beispiele für einen Linkerteil LI angegeben. In der Tabelle ist weiterhin angegeben, mit welcher Gruppe L2 diese Beispiele für LI vorzugsweise kombiniert werden, sowie die bevorzugte Ankopplungsstelle (R ¹ oder R ³ oder R ⁴ ) sowie der bevorzugte Wert für , also ob vor L I eine Carbonyigruppe vorliegt oder nicht (vgl. §-(CO)m-Ll - L2-§§). Diese Linker werden vorzugsweise an einen Cy steinrest gekoppelt. Wenn L2 ein Bernsteinsäureimid ist bzw. sich hiervon ableitet, kann dieses Imid ganz oder teilweise auch in Form des hydrolysierten offenkettigen Berasteinsäureamids vorliegen, wie oben beschrieben. In Abhängigkeit von LI kann diese Hydrolyse zu offenkettigen Bemsteinsäureamiden mehr oder weniger stark oder gar nicht ausgeprägt sein.

**Besonders bevorzugt werden die in diesen Zeilen angegebenen Linker LI mit einem Linker L2 verknüpft, der ausgewählt ist aus:

Formel A7

und/oder

Formel A8 vor, wobei # ^! die VerknüpfungssteUe mit dem Schwefelatom des Binders kennzeichnet, # die Verknüpfungsstelle mit der Gruppe V kennzeichnet, R.22 vorzugsweise COOH darstellt. In einem erfindungsgemäßen Konjugat bzw. in einem Gemisch der erfindungsgemäßen Konjugale liegen die Bindungen an einen Cysteinresi des Binders vorzugsweise zu über 80 %, besonders bevorzugt zu über 90 % (jeweils bezogen auf die Gesamtanzahl von Bindungen des Linkers an den Binder), besonders bevorzugt in einer der beiden Strukturen der Formel A7 oder A8 vor. Hierbei liegen die Strukturen der Formel A7 oder A8 in der Regel gemeinsam vor, vorzugsweise in einem Verhältnis von 60:40 bis 40:60 bezogen auf die Anzahl der Bindungen an den Binder. Die restlichen Bindungen liegen dann in der Struktur

vor.

Tabelle A'

3

und

**: Siehe Anmerkung ** zu Tabelle A.

***: Bei Vorhandensein dieser Struktur L2 kann zugleich eine Stnikiur L2 der folgenden Formel vorliegen:

Beispiele für Konjugale mit entsprechenden Linkern weisen folgende Strukturen auf, wobei XI CH, X2 C, und X3 N darstellt, und LI die oben angegebenen Bedeutung aufweist, L2 und L3 dieselbe Bedeutung wie LI hat, AK1 für einen (anti~B7H3-Antikörper steht, der über einen Cysteinrest gebunden ist, und n eine Zahl von 1 bis 10 ist. Bevorzugt ist AK1 ein humaner, humanisierter oder chimärer monoklonaler Antikörper oder ein Antigen-bindendes Fragment hiervon. Besonders bevorzugt ist AK1 ein aglycosylierter anti-B7FI3 -Antikörper, der spezifisch die humane Ig4- und/oder die humane und/oder murine Ig2 -Isoform von B7H3 bindet, insbesondere der anti-B7FÖ -Antikörper TPP-5706 und seine humanisierten Varianten wie TPP-6642 und TPP- 6850.

Wenn der Linker an eine Lysin-Seitenkette bzw. einen Lysinrest gebunden ist, weist er vorzugsweise die folgende Formel aufweist:

-§-(SG) _x -L4-C(=0)-§§, wobei

§ die Bindung an das Wirkstoffmolekül darstellt und

§§ die Bindung an das Binderpepüd oder -protein darstellt,

x 0 oder 1 darstellt,

SG eine spaltbare Gmppe, vorzugsweise ein 2-8 Oligopeptid, besonders, bevorzugt ein Dipeptid darstellt,

und

L4 eine Einfachbindung oder eine Gruppe -(CO) _y -G4- darstellt, wobei y 0 oder 1 darstellt, und G4 eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 100 Kohlenstoffatomen aus Arylengruppen und/oder geradkettigen und/oder verzweigte und/oder cyclischen Alkylengruppen ist, die einfach oder mehrfach durch eine oder mehrere der Gruppen -O-, -S-, -SO-, SO ₂ , -NH-, - CO-, -NHCO-, -CONH-, -NMe-, - ΗΝΉ-, -SO2NHNH-, -CONHNH- und einen 5 bis 10- gliedriger, aromatischen oder nicht aromatischen Heierozyklus mit bis zu 4 Heteroatomen ausgewählt aus N, O und S, -SO- oder -S02- unterbrochen sein kann, wobei die Seitenketten, sofern vorhanden, mit -NHCONH ₂ , -COOK, -OH, -ML, NH-CNNfL, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid oder Sulfonsäure substituiert sein können.

in der folgenden Tabelle B sind Beispiele für Linker an einen Lysinrest angegeben. In der Tabelle ist weiterhin die bevorzugte Ankopplungsstelle (R'-R ⁵ ) angegeben. In der ersten Spalte sind weiterhin die Beispielnummern angegeben, in denen entsprechende Linker Anwendung finden.

Tabelle B: Lysin-Linker

-§-(SG) _x -L4-C(===0)-§§,

Beispiele für Konjugate mit entsprechenden Linkern weisen folgende Strukturen auf, wobei XI CH, X2 C, und X3 N darstellt, und L4 die oben angegebenen Bedeutungen aufweisen, AK2 für einen Antikörper steht, der über einen Lysinrest gebunden ist, und n eine Zahl von 1 bis 10 ist. Bevorzugt als AK2 ist ein humaner, humanisierter oder chimärer monoklonaler, anti-B7H3- Antikörper oder ein Antigen-bindendes Fragment hiervon. Besonders bevorzugt ist ein aglycosyüerter anti-B7H3 -Antikörper, der spezifisch die humane 4Tg-Isoform bindet, insbesondere der anti-B7H3-Antikörper TPP-5706 und seine humanisierten Varianten wie TPP-6642 und TPP- 6850..

Weiterbin ist erfindungsgemäß bevorzugt die Grundstruktur (i), (ii), oder (iv), wobei SGI bzw. SG eine durch eine Protease spaltbare Gmppe darstellt, und LI und L2 die oben aufgeführten Bedeutungen aufweisen. Besonders bevorzugt sind die folgenden Gruppen:

-Val-Ala-CONH- (hierdurch Spaltung der Amid-Bindung am C-terminalen Amid von Alanin) -NH-Val-Lys-CONH- (Spaltung der Amid-Bindung am C-terminalen Amid von Lysin)

-NH- Val-Cit-CONH- (Spaltung der Amid-Bindung am C-terminalen Amid von Citruilin) -NH-Phe-Lys-CONH (Spaltung der Amid-Bindung am C-terminalen Amid von Lysin)

-NH-Ala-Lys-CONH- (Spaltung der Amid-Bindung am C-terminalen Amid von Lysin)

-NH-Ala-Cit-CONH- (Spaltung der Amid-Bindung am C-terminalen Amid von Citruilin)

SGI bzw. SG ist besonders bevorzugt

bzw. wobei X H, eine Ci-io-Alkylgnippe ist, die gegebenenfalls mit - HCO th, -COOH, -OH, H2, NH-C H2, oder Sulfotisäure substituiert sein kann.

In der folgenden Tabelle C sind Beispiele für einen Linkerteil -SGI -LI- bzw. -Ll-SG-Ll- angegeben, wobei SGI bzw. SG eine durch eine Protease spaltbare Grappe ist. In der Tabeile C ist weiterhin angegeben, mit welcher Grappe L2 diese Beispiele für -SGI -LI- bzw. -Ll -SG-Ll- vorzugswetse kombiniert werden, sowie die bevorzugte Ankopplungsstelle (R'-R ⁵ ) sowie der bevorzugte Wert für m, also ob vor LI eine Carbonylgruppe vorliegt oder nicht (vgl. §-(CO)m-Ll - L2-§§). Diese Linker werden vorzugsweise an einen Cysteinrest gekoppelt. Die LI -Grappe ist in einem Kasten hervorgehoben. Diese Gruppen LI können jedoch durch eine der Gruppe LI , die für die obige Formel §-(CO)m-Ll-L2-§§ angegeben ist, ausgetauscht werden. Wenn L2 ein Bernsteinsäureamid ist bzw. sich hiervon ableitet, kann dieses Amid ganz oder teilweise auch in Form des hydrolysierten offenkettigen Bemsteinsäureamids vorieigen, wie oben beschrieben.

Tabelle C

Beispiele für Konjugate mit der Grundstruktur (i) weisen die folgende Struktur auf, wobei XI CH, X2 C, und X3 N darstellt,, L4 dieselbe Bedeutung wie LI hat, AK1 für einen antt-B7H3- Antikörper steht, der über einen Cvsteinrest gebunden ist, und n eine Zahl von 1 bis 10 ist. Der Antikörper ist vorzugsweise ein aglycosylierter humaner, humanisierter oder chimärer monoklonaler anti-B7H3-Antikörper oder ein Antigen-bindendes Fragment hiervon. Besonders bevorzugt ist ein anti-B7H3-Antikörper, der spezifisch die humane 4Ig-Isoform bindet, insbesondere der anti-B7H3 -Antikörper TPP-5706 und seine humanisierten Varianten wie TPP- 6642 und TPP-6850..

KSP-Inhibitor - Linker-Intermediate und Herstellung der Konjugate

Die erfindungsgemäßen Konjugale werden hergestellt, in dem zunächst der niedermolekulare KSP- Inhibitor mit einem Linker versehen wird. Da so erhaltene Intermedia!; wird dann mit dem Binder (vorzugsweise Antikörper) umgesetzt,.

Für die Kopplung an einen Cysteinrest wird vorzugsweise eine der folgenden Verbindungen mit dem Cystein-haltigen Binder wie z.B. einem Antikörper, der dazu ggf. partiell reduziert wurde, umgesetzt:

TFA

TFA

wobei R -H oder -COOH darstellt,

wobei K lineares oder verzweigtes, gegebenenfalls mit Ci-Ce Alkoxy oder -OH substituiertes Ci- C ₆ Alkyl darstellt, und

wobei XI CH, X2 C, und X3 N darstellt, SG I, LI, L2, L3 und L4 die gleiche Bedeutung haben wie oben beschrieben.

In jeder der obigen Verbindungen wie auch den folgenden Verbindungen kann die tert.-butyl- Gruppe durch Cyclohexyl ersetzt sein.

Die Verbindung kann z.B in Form ihres Trifluoressigsäuresalzes verwendet werden. Zur Reaktion mit dem Binder wie z.B. dem Antikörper wird die Verbindung vorzugsweise in 2 bis 12 fächern molaren Überschuss gegenüber dem Binder verwendet.

Für die Kopplung an einen Lysinrest wird vorzugsweise eine der folgenden Verbindungen mit dem Lysin-haltigen Binder wie z.B. einem Antikörper umgesetzt:

wobei XI CH, X2 C, und X3 N darstellt,, und L4 die gleiche Bedeutung wie LI hat, und LI die gleiche Bedeutung hat wie oben beschrieben,

Für ein an einen Cysteinrest ankoppelndes Intermediat können die Reaktionen wie folgt veranschaulicht werden:

Die anderen Intermediate und andere Antikörper können entsprechend umgesetzt werden.

Für ein an einen Lysinrest ankoppelndes Tntermediat kann die Reaktion wie folgt veranschaulicht werden:

- 141 -

In Abhängigkeit vom Linker können Suceinimid-verknüfte ADCs nach der Konjugation in die offenkettigen Bemsteinsäureamide überfuhrt werden, die ein vorteilhaftes Stabilitätsprofii aufweisen.

Diese Umsetzung (Ringöffhung) kann bei pH 7.5 bis 9, vorzugsweise bei pH 8, bei einer Temperatur von 25 ° C bis 37 °C erfolgen, z.B. durch Rühren. Die bevorzugte Rührzeit beträgt 8 bis 30 Stunden.

In den obigen Formeln stellen XI CH, X2 C, und X3 N dar,), SGI und LI die gleiche Bedeutung haben wie oben beschrieben, und L2, L3 und L4 die gleiche Bedeutung wie LI ; R und K die gleiche Bedeutung haben wie oben beschrieben. AKl ist ein über einen Cysteinrest gekoppelter anti-B7H3 - Antikörper oder ein Antigen-bindendes Fragment hiervon, und AK2 ist ein über einen Lysinrest gekoppelter anti-B7H3 -Antikörper oder ein Antigen-bindendes Fragment hiervon. Bevorzugt handelt es sich hei AK1 und AK2 um aglycosy erte anti-B 7H3 -Antikörper. Besonders bevorzugt ist AK1 und AK2 ein anti-B 7H3 -Antikörper, der spezifisch die humane 4Ig-Isoform bindet, insbesondere der anti-B7H3 -Antikörper TPP-5706 und seine humanisierten Varianten wie TPP-6642 und TPP-6850.

Anti-B7H3-Antikörperkonjugate

Der Antikörper ist vorzugsweise ein aglycosylierter humaner, humanisierter oder chimärer monoklonaler anti-B7H3-Antikörper oder ein Anügen-bindendes Fragment hiervon. Besonders bevorzugt ist ein anti-B7H3-Antikörper oder ein Antigen -bindendes Fragment hiervon, der spezifisch die humane 4Ig-Isoform bindet, insbesondere der anti-B7H3 - Antikörper TPP-5706 und seine humanisierten Varianten wie TPP-6642 und TPP-6850 Dabei weisen aglycosyl bzw. aglycosylierte Antikörper keine Glycane an der konservierten N-Bindungsstelle in der CH2- Do äne der Fc-Region auf .Aus der Literatur sind verschiedene Möglichkeiten der kovalenten Kopplung (Konjugation) von organischen Molekülen an Antikörper bekannt. Erfindungsgemäß bevorzugt ist die Konjugation der Toxophore an den Antikörper über ein oder mehrere Sehwefelatome von Cystein-Resten des Antikörpers und/oder über ein oder mehrere NH-Gruppen von Lysin-Resten des Antikörpers. Es ist jedoch auch möglich, das Toxophor an den Antikörper über freie Carboxylgruppen oder über Zuckerreste des Antikörpers zu binden.

Der Antikörper kann über eine Bindung mit dem Linker verknüpft werden. Die Verknüpfung des Antikörper kann mittels eines Heteroatoms des Binders erfolgen. Erfindungsgemäße Heteroatome des Antikörper, die zur Verknüpfung verwendet werden können, sind Schwefel (in einer Ausfuhrungsform via einer Sulfhydrylgruppe des Antiköiper), Sauerstoff (erfindungsgemäß mittels einer Carboxyl oder Hydroxylgruppe des Antikörper) und Stickstoff (in einer Ausfuhrungsform via einer primären oder sekundären Amingruppe oder Amidgatppe des Antikörper). Diese Heteroatome können im natürlichen Antikörper vorhanden sein oder durch chemische oder molekularbiologische Methoden eingeführt werden. Erfindungsgemäß hat die Verknüpfung des Antikörper mit dem Toxophor nur einen geringen Einfluß auf die Bindeaktivität des Antikörper zum Zielmoiekül. In einer bevorzugten Ausfuhrungsform hat die Verknüpfung keinen Einfluß auf die Bindeaktivität des Antikörper zum Zielmolekül. Der Begriff "Antikörper" wird gemäß der vorliegenden Erfindung in seinem breitesten Sinne verstanden und umfasst Immunglobulinmoleküle, beispielsweise intakte oder modifizierte monoklonale Antikörper, polyklonale Antikörper oder multispezifische Antikörper {z.B. bispezifische Antikörper). Ein Immunglobulinmolekül umfasst bevorzugt ein Molekül mit vier Polypeptidketten, zwei schwere Ketten (H Ketten) und zwei leichte Ketten (L Ketten), welche typischerweise durch Disulfidbrücken verknüpft sind. Jede schwere Kette umfasst eine variable Domäne der schweren Kette (abgekürzt VH) und konstante Domäne der schweren Kette. Die konstante Domäne der schweren Kette kann beispielsweise drei Domänen CHI , CH2 und CH3 umfassen. Jede leichte Kette umfasst eine variable Domäne (abgekürzt VL) und eine konstante Domäne. Die konstante Domäne der leichten Kette umfasst eine Domäne (abgekürzt CL). Die VH und VL Domänen können weiter unterteilt werden in Regionen mit Hypervariabilität, auch Komplementaritäts-bestimmende Regionen genannt („complementarity determining region", abgekürzt CDR) und Regionen mit geringerer Sequenzvariabilität („framework region", abgekürzt FR). Jede VH und VL Region setzt sich typischerweise aus drei CDRs und bis zu vier FRs zusammen. Beispielsweise vom Aminoterminus zum Carboxyterminus in der folgenden Reihenfolge FR1, CDR1 , FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Ein Antikörper kann aus jeder dafür geeeigneten Spezies erhalten werden z.B. Kaninchen, Lama, Kamel, Maus, oder Ratte. In einer Aus führungs form ist der Antikörper humanen oder murinen Ursprungs. Ein Antikörper kann z.B. human, humanisiert oder chimär sein.

Der Begriff „monoklonaler" Antikörper bezeichnet Antikörper, die aus einer Population substantiell homogener Antikörper erhalten wurde, d.h. individuelle Antikörper der Population sind bis auf natürlich auftretende Mutationen, welche in geringfügiger Anzahl auftreten können, identisch. Monoklonale Antikörper erkennen mit hoher Spezifität eine einzige anttgene Bindestelle. Der Begriff monoklonaler Antikörper bezieht sich nicht auf ein bestimmtes Herstellungsverfaliren.

Der Begriff„intakter" Antikörper bezieht sich auf Antikörper, die sowohl eine Antigen-bindende Domäne als auch die konstante Domäne der leichten und schweren Kette umfassen. Die konstante Domäne kann eine natürlich vorkommende Domäne sein, oder eine Variante davon, bei der mehrere Aminosäurepositionen verändert wurden.

Der Begriff „modifizierter intakter" Antikörper bezieht sich auf intakte Antikörper, die mit einem weiteren Polypeptid oder Protein, welche nicht von einem Antikörper stemmen, über ihren Aminoterminus oder Carboxyterminus mittels einer kovalenten Bindung (z.B. einer Peptidverknüpfung) fusioniert wurden. Des Weiteren können Antikörper dahingehend modifiziert werden, dass an definierten Steilen reaktive Cysteine eingeführt werden, um die Kopplung an ein Toxophor zu erleichtern (siehe Junutula et al. Nat Biotechnol. 2008 Aug;26{8):925~32). Der Begriff „humaner" Antikörper bezeichnet Antikörper, die aus einem Menschen erhalten werden können oder synthetische humane Antikörper sind. Ein „synthetischer" humaner Antikörper ist ein Antikörper, der in Teilen oder schweren als ganzes von synthetischen Sequenzen in siiico erhältlich ist, die auf der Analyse humaner Antikörpersequenzen basieren. Ein humaner Antikörper kann z.B. durch eine Nukleinsäure kodiert sein, die aus einer Bibliothek von Antikörpersequenzen, die humanen Ursprungs sind, isoliert wurde. Ein Beispiel solcher Antikörper ist in Söderlind et al, Nature Biotech. 2000, 18:853-856 zu finden.

Der Begriff „humanisierter" oder„chimärer" Antikörper beschreibt Antikörper, die aus einem nicht-humanen und einem humanen Sequenzanteil bestehen. Bei diesen Antikörpern wird ein Teil der Sequenzen des humanen Immunoglobulins (Rezipient) durch Sequenzanteile eines nichthumanen Immunoglobulins (Donor) ersetzt. Der Donor ist in vielen Fällen ein murines Immunoglobulin. Bei humanisierten Antikörpern werden Aminosäuren der CDR des Rezipienten durch Aminosäuren des Donors ersetzt. Manchmal werden auch noch Aminosäuren des Frameworks durch korrespondierende Aminosäuren des Donors ersetzt. In machen Fällen enthält der humanisierte Antikörper Aminosäuren, die weder im Rezipient noch im Donor enthalten waren und die während der Optimierung des Antikörpers eingefügt wurden. Bei chimären Antikörpern werden die variablen Domänen des Donor-Immunoglobulins mit den konstanten Regionen eines humanen Antikörpers fusioniert.

Der Begriff Komplementaritäts-bestimmende Region (CDR) wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf diejenigen Aminosäuren einer variablen Antikörperdomäne, die ür die Bindung an das Antigen notwendig sind. Jede variable Region hat typischerweise drei CDR Regionen, welche als CDR1, CDR2 und CDR3 bezeichnet werden. Jede CDR Region kann Aminosäuren nach der Definition von Rabat und oder Aminosäuren eines Hypervariablen Loops definiert nach Chotia umfassen. Die Definition nach Rabat umfasst zum Beispiel die Region von ungefähr Aminosäureposition 24 - 34 (CDR1), 50 - 56 (CDR2) und 89 - 97 (CDR3) der variablen leichten Kette und 31 - 35 (CDR 3), 50 - 65 (CDR2) und 95 - 302 (CDR3) der variablen schweren Rette (Rabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991 )). Die Definition nach Chotia umfasst zum Beispiel die Region von ungefähr Aminosäureposition 26 - 32 (CDR1), 50 - 52 (CDR2) und 91 - 96 (CDR3) der variablen leichetn Rette und 26 - 32 (CDR1), 53 - 55 (CDR2) und 96 - 101 (CDR3) der variablen schweren Rette Chothia and Lesk; J Mol Biol 196: 901-917 (1987)). In manchen Fällen kann eine CDR Aminosäuren aus einer CDR Region definiert nach Rabat und Chotia umfassen. Abhängig von der Aminosäure-Sequenz der konstanten Domäne der schweren Kette können Antikörper in verschiedene Klassen eingeteilt werden. Es gibt fünf Hauptklassen von intakten Antikörpern: IgA, IgD, IgE, IgG und IgM, wobei mehrere davon in weitere Unterklassen aufgegliedert werden können. (Isotypen), z.B. IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl und IgA2. Die konstante Domäne der schweren Kette, die zu den unterschiedlichen Klassen korrespondieren, werden als [aipha/a], [delta/δ], [epsilon/ε], [gamma/y] und [my/μ] bezeichnet. Sowohl die dreidimensionale Struktur als auch die Untereinheitenstruktur von Antikörpern sind bekannt.

Der Begriff „funktionales Fragment" oder „antigen-bindendes Antiköiperfrag ent" eines Antikδφers/Irnmunoglobuίtns ist definiert als ein Fragment eines Antikörpers/Immunoglobulins (z.B. die variable Domänen eines IgG), welches die Antigen-Bindedomänen des Antiköipers/Immunogiobulins noch umfasst. Die „Antigen-Bindedomäne" eines Antikörpers umfasst typischerweise eine oder mehrere Hypervariable Regionen eines Antikörpers, z.B. die CDR, CDR2 und/oder CDR3 Region. Allerdings kann auch die„Framework" oder die„Gerüst" Region eines Antikörpers zur Bindung des Antikörpers an das Antigen eine Rolle spielen. Die Framework Region bildet das Gerüst für die CDRs. Vorzugsweise umfasst die Antigen- Bindedomäne mindestens die Aminosäuren 4 bis 103 der variablen leichten Kette und Aminosäure 5 bis 109 der variablen schweren Kette, bevorzugter die Aminosäure 3 bis 107 der variablen leichten Kette und 4 bis 1 11 der variablen schweren Kette, besonders bevorzugt sind die kompletten variablen leichten und schweren Ketten , also Aminosäure 1 - 109 der VL und 1 bis 3 13 der VH (Nummerierung nach WO97/08320).

„Funktionale Fragmente" oder„antigen-bindende Antiköiperfragmente" der Erfindung umfassen nicht abschliessend Fab, Fab', F(ab')/: und Fv Fragmente, Diabodies, Single Domain Antibodies (DAbs), linerae Antikörper, Einzelketten Antikörper (single-chain Fv, abgekürzt seFv); und multispezifische, wie z.B. bi- und tri-spezifische, Antikörper, gebildet aus C. A. K Borrebaeck, editor (3995) Antibody Engineering (Breakthroughs in Molecular Biology), Oxford University Press; R. Kontermann & S. Duebel, editors (2001) Antibody Engineering (Springer Laboratory Manual), Springer Verlag). Andere Antikörper als„multi-spezifische" oder „multi-funktionale" sind solche mit identischen Bindestellen. Multispezifische Antikörper können spezifisch für unterschiedliche Epitope eines Antigens sein oder spezifisch für Epitope von mehr als einem Antigen sein (siehe z.B. WO 93/17715; WO 92/08802; WO 91/00360; WO 92/05793; Tutt, et al., 1993 , J. Immunol. 147:60 69; U. S. Pat. Nos. 4,474,893; 4,7 14,68 1 ; 4,925,648; 5,573,920; 5,601,8 19; oder Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 148: 1547 1553). Ein F(ab') ₂ oder Fab Molekül kann so konstruiert werden, dass die Zahl der intermolekularen Disulfidinteraktionen, die zwischen den Chi und den CL Domänen stattfindet, reduziert oder oder komplett verhindert werden kann. „Epitope" bezeichnen Proteindeterminanten, die eine spezifische Bindung mit einem Immunglobulin oder T -Zell-Rezeptoren eingehen können. Epitopische Determinanten bestehen normalerweise aus chemisch aktiven Oberflächengruppen von Molekülen wie Aminosäuren oder Zuekerseitenketten, oder Kombinationen hiervon, und weisen normalerweise spezifische 3- dimensionale Struktureigenschaften wie auch spezifische Ladungseigenschaften auf.

„Funktionale Fragmente" oder „antigen-bindende Antikörperfragmente" können mit einem weiteren Polypeptid oder Protein, weiche nicht von einem Antikörper stammen, über ihren Aminoterminus oder Carboxyterminus mittels einer kovalenten Bindung (z.B. einer Peptidverknüpfung) fusioniert werden. Des Weiteren können Antikörper und antigen-bindende Fragmente dahingehend modifiziert werden, dass an definierten Stellen reaktive Cysteine eingeführt werden, um die Kopplung an ein Toxophor zu erleichtern (siehe Junutula et al. Nat Biotechnol. 2008 Aug; 26(8):925-32).

Polyklonale Antikörper können durch für den Durchschnittsfachmann bekannte Methoden hergestellt werden. Monoklonale Antiköper können durch für den Durchscbnittsfachmann bekannte Methoden hergestellt werden (Köhler und Milstein, Nature, 256, 495-497, 1975). Humane bzw. humanisierte monoklonale Antiköper können durch für den Durchschnittsfachmann bekannte Methoden hergestellt werden (Olsson et al., Mefh Enzymol. 92, 3 -16 bzw. Cabilly et al US 4,816,567 oder Boss et al US 4,816,397).

Der Durchschnittsfachmann kennt vielfältige Methoden, um humane Antikörper und deren Fragmente herzustellen, wie beispielsweise mittels transgener Mäuse (N Lonberg und D Huszar, Int Rev Immunol. 1995; 13(l):65-93) oder Phage Display Technologien (Clackson et al., Nature. 1991 Aug 15;352(6336):624-8). Antikörper der Erfindung können aus rekombinanten Antikörperbibliotheken erhalten werden, die z.B. auf den Aminosäuresequenzen einer Vielzahl von Antikörpern besteht, die aus einer großen Anzahl gesunder Freiwilliger erstellt wuixien. Antikörper können auch mittels bekannter rekombinanter DNS-Technologien hergestellt werden. Die Nukleinsäuresequenz eines Antikörpers kann durch Routinesequenziemng erhalten werden, oder ist aus öffentlich zugänglichen Datenbanken erhältlich.

Ein „isolierter" Antikörper oder Binder wurde von anderen Bestandteilen der Zelle gereinigt. Kontaminierende Bestandteile einer Zelle, welche mit einer diagnostischen oder therapeutischen Verwendung interferieren können, sind z.B. Enzyme, Hormone, oder andere peptidische- oder nicht-peptidische Bestandteile einer Zelle. Bevorzugt ist ein Antikörper oder Binder, der zu mehr als 95 Gew-% bezogen auf den Antikörper bzw. Binder aufgereinigt wurde (bestimmt durch z.B. Lowry Verfahren, UV- is Spektroskopie oder durch SDS-Kapillargelelektrophorese). Ausserdem ein Antikörper, der soweit aiifgereinigt wurde, dass mindestens 15 Aminosäuren des Aminoterminus oder einer internen Aminosäuresequenz bestimmt werden können, oder zur Homogenität aufgereinigt wurde, wobei die Homogenität bestimmt wird durch SDS-PAGE unter reduzierenden oder nicht-reduzierenden Bedingungen (die Detektion kann mittels Coomassie Blau Anfärbung oder bevorzugt durch Silberfärbung bestimmt werden). Jedoch wird ein Antikörper normalerweise durch einen oder mehrere Reinigungsschritte hergestellt.

Der Begriff„spezifische Bindung" oder„bindet spezifisch" bezieht sich auf einen Antikörper oder Binder, der an ein vorbestimmtes Antigen/Zielmolekül bindet. Spezifische Bindung eines Antikörpers oder Binders beschreibt typischerweise einen Antikörper bzw. Binder mit einer Affinität von mindestens 10 ^' ' M (als Kd-Wert; also vorzugsweise solche mit kleineren Kd-Werten als 10 ^" M), wobei der Antikörper bzw. Binder eine mindestens zweifach höhere Affinität zum vorbestimmten Antigen/Zielmolekül als zu einem nicht-spezifischen Antigen/Zielmolekül hat (z.B. Rinder Serumalbumin, oder Casein), welches nicht das vorbestimmte Antigen/Zielmolekül oder ein eng verwandtes Antigen/Zielmolekül ist. Die Antikörper weisen vorzugsweise eine Affinität von mindestens 10 ^" '' M (als Kd-Wert; also vorzugsweise solche mit kleineren Kd-Werten als 10 ^" '' M), vorzugsweise von mindestens 10 ^" ^ M, besonders bevorzugt in dem Bereich von 10 ^" ^ M bis 10 ^" ^ M auf. Die Kd-Werte können durch z.B. Oberflächenplasmonresonanzspektroskopie bestimmt werden.

Die erfindungsgemäßen Antikörper- Wu'kstoff-Konjugate weisen ebenfalls Affinitäten in diesen Bereichen auf. Durch die Konjugation der Wirkstoffe wird die Affinität vorzugsweise nicht wesentlich beeinflusst (in der Regel wird die Affinität weniger als eine Größenordnung verringert, also z.B. maximal von 10 ^"8 M auf 10 ^'"7 M).

Die erfindungsgemäßen verwendeten Antikörper zeichnen sich weiterhin vorzugsweise durch eine hohe Selektivität aus. Eine hohe Selektivität liegt vor, wenn der erfindungsgemäße Antikörper eine mindestens um den Faktor 2, bevorzugt Faktor 5 oder insbesondere bevorzugt Faktor 10 bessere Affinität am Zielprotein aufweiset als an einem unabhängigen anderen Antigen, z.B. humanem Serumalbumin (die Affinität kann z.B. durch Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie bestimmt werden).

Zudem sind die erfindungsgemäßen verwendeten Antikörper vorzugsweise kreuzreaktiv. Um präklinische Studien, z.B. toxikologische oder Wirksamkeitsstudien (z.B. in Xenograft-Mäusen), zu erleichtem und besser interpretieren zu können, ist es von Vorteil, wenn der erfindungsgemäß verwendete Antikörper nicht nur das humane Zielprotein bindet, sondern auch in der für die Studien verwendeten Spezies das Spezies-Zielprotein bindet. In einer Ausführungsform ist der erfinduiigsgeinäß verwendete Antiköiper zusätzlich zum humanen Zielprotein kreuzreaktiv zum Zielprotein mindestens einer weiteren Spezies. Für toxikologische und Wirksamkeitsstudien werden bevorzugt Spezien der Familien Nager, Hunde und nicht-humane Primaten, verwendet. Bevorzugte Nager Spezien sind Maus und Ratte. Bevorzugte nicht-humane Primaten sind Rhesusaffen, Schimpansen und Langschwa zmakaken.

In einer Ausführungsform ist der erfindungsgemäß verwendete Antikörper zusätzlich zum humanen Zielprotein kreuzreaktiv zum Zielprotein mindestens einer weiteren Spezies ausgewählt aus der Gruppe von Spezien bestehend aus Maus, Ratte und Langschwanzmakak (Macaca fascicularis). Insbesondere bevorzugt sind erftndungsgemäß verwendete Antikörper, die zusätzlich zum humanen Zielprotein mindestens kreuzreaktiv zum Maus-Zielprotein sind. Bevorzugt sind kreuzreaktive Antiköiper, deren Affinität zum Zielprotein der weiteren nicht-humanen Spezies sich nicht um mehr als den Faktor 50, insbesondere nicht mehr als den Faktor zehn von der Affinität zum humanen Zielprotein unterscheidet.

Gesen ein Krebs-Zielmolekül gerichtete Antikörper

Bevorzugt ist das Zielmolekül, gegen das der Binder, z.B. ein Antikörper oder ein Antigen bindendes Fragment davon, gerichtet ist, ein Krebs-Zielmolekül. Der Begriff„Krebs -Zielmolekül" beschreibt ein Zielmolekül, welches auf einer oder mehreren Krebszellarten im Vergleich zu nichtKrebszellen des gleichen Gewebetypus vermehrt vorhanden ist. Bevorzugt ist das Krebs- Zielmolekül auf einer oder mehreren Krebszellarten im Vergleich zu nicht-Krebszellen des gleichen Gewebetypus seiektiv vorhanden, wobei selektiv eine mindestens zweifache Anreicherung auf Krebszellen im Vergleich zu nicht-Krebszellen des gleichen Gewebetypus beschreibt (ein „selektives Krebs-Zielmolekül"). Die Verwendung von Krebs-Zielmolekülen erlaubt die selektive Therapie von Krebszellen mit den erfindungsgemäßen Konjugalen.

Besonders bevorzugt ist hierbei das extrazelluläre Krebs-Zielmolekül B7H3 (SEQ 1D NO: Q5ZPR3 (Protein); SEQ ID NO: 80381 (DNA).

Antikörper, die Krebs-Zielmoleküle binden, können vom Durchschnittsfachmann mit bekannten Verfahren hergestelit werden, wie z.B. chemische Synthese oder rekombinante Expression. Binder für Krebs-Zielmoleküle können kommerziell erworben werden oder können durch den Durchschnittsfachmann mit bekannten Verfahren hergestelit werden, wie z.B. chemische Synthese oder rekombinante Expression. Weitere Verfahren zur Herstellung von Antikörpern oder antigen- bindenden Antikörperfragmenten sind in WO 2007/070538 beschrieben (siehe Seite 22 „Antibodies"). Der Fachmann kennt Verfahren wie sogenannte Phage-Display Bibliotheken (z.B. Morphosys HuCAL Gold) erstellt und zur Auffindung von Antikörpern oder antigen-bindenden An1ikόφerfragmenten verwendet werden können (siehe WO 2007/070538, Seite 24 ff und AK- Beispiel 1 auf Seite 70, AK-Beispiel 2 auf Seite 72). Weitere Verfahren zur Herstellung von Antikörper, die DNA Bibliotheken aus B-Zellen verwenden, sind zum Beispiel auf Seite 26 (WO 2007/070538) beschrieben. Verfahren zur Humanisierung von Antikörpern sind auf Seite 30-32 von WO2007070538 und im Detail in Queen, et al.,.Pros. Natl. Aead. Sei. USA 86: 10029- 10033,1989 oder in WO 90/0786 beschrieben. Des Weiteren sind dem Fachmann Verfahren zur rekombinanten Expression von Proteinen im allgemeinen und im speziellen von Antikörpern bekannt (siehe z.B. in Berger and Kimme! (Guide to Moiecuiar Cloning Techniques, Methode in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, Inc.); Sambrook, et al., (Moiecuiar Cloning: A Laboratory Manual, (Second Edition, Gold Spring Harbor Laboratory Press; Cold Spring Harbor, N.Y.; 1989) Vol. 1-3); Current Protocols in Moiecuiar Biolony, (F. M. Ausabel et al. [Eds.], Current Protocols, Green Publishing Associates, Inc. / John Wiley & Sons, Inc.); Hariow et al., (Monoclonal Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (19881 , Paul [Ed.] ); Fundamental Immunology, (Lippmcott Williams & Wiikins (1998)); and Hariow, et al., (Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)). Der Fachmann kennt die entsprechenden Vektoren, Promotoren und Signalpeptide die zur Expression eines Proteins/Antikörpers notwendig sind. Gebräuchliche Verfahren sind auch in WO 2007/070538 auf den Seiten 41 - 45 beschrieben. Verfahren zur Herstellung eines IgGl - Antikörpers sind z.B. in WO 2007/070538 in Beispiel 6 auf Seite 74 ff beschrieben. Verfahren, mit denen die Internalis terung eines Antikörpers nach Bindung an sein Antigen bestimmt werden kann, sind dem Fachmann bekannt und sind z.B. in WO 2007/070538 auf Seite 80 beschrieben. Der Fachmann kann die in WO 2007/070538 beschriebenen Verfahren, die zur Herstellung von Carboanhydrase IX (Mn)- Antikörpern verwendet wurden, anlog zur Herstellung für Antikörper mit anderer Zielmolekülspezifität verwenden.

Die erfindungsgemäßen Antikörper sind glycosyliert oder aglycosyliert, d.h. sie weisen in letzterem Fall keine Glycane an der konservierten N-Bindungssteile in der CH2 -Domäne der Fc-Region auf.

Anti-B7H3-Antikörper

Erfmdungsgemäß wird ein anti-B7H3 -Antikörper oder ein antigenbindendes Fragment davon verwendet, vorzugsweise TPP5706 oder ein davon abgeleiteter Antikörper. Darüber hinaus sind de Fachmann Antikörper, die an B7H3 binden bekannt, siehe z.B. US6965018 . EP2121008 beschreibt den anti-B7H3 Antikörper 8H9 sowie seine CDR Sequenzen. TPP3803 enthält diese CDR Sequenzen im Kontext eines humanen IgOl.

Die Erfindung betrifft insbesondere Konjugate mit Antikörpern oder antigenbindende AntiköiperfragiOente davon oder Varianten davon, die folgende Eigenschaften aufweisen: Spezifische Bindung an humanes B7H3, d.h. keine Bindung an humanes B7H2 oder humanes B7H4; effektives und spezifische Abtöten von B7H3 exprimierenden Tumorzelien in vitro und in vivo. Die erfindungsgemäßen Antikörper binden an Epitope, welche besonders für die Internal, isierung nach erfolgter Bindung geeignet sind. Gleichzeitig zeichnen sich die erfindungsgemäßen Antikörper durch eine niedrige Iinmunogenität bei der Anwendung im Menschen aus, was durch eine weitgehende Homologie in der Aminosäuresequenz der erfindungsgemäßen Antikörper mit den entsprechenden humanen Keimbahnsequenzen erreicht wird.

Erzeugung von TPP57Ö6 und seinen Derivaten

Anti-B7H3 Antikörper sind in der einschlägigen Literatur beschrieben, so offenbart z.B. US 6965018 den von dem Hybridom PTA-4058 sezernierten murinen anti-B7H3 Antikörper. Wir haben mit Standardverfähren die Aminosäuresequenz dieses Antikörpers bestimmt. TPP5706 ist die Chimäre des von diesm Antikörper abgeleiteten murinen Fv mit der Chl-Ch3 Region eines humanen IgGl. Die entsprechenden DNA Sequenzen wurden in einen Säuger-IgG- Expressionsvektor inseriert und als Volllängen-TgGs exprimiert. Diese Konstrukte wurden zum Beispiel transient in Säugerzeilen exprimiert, wie von Tom et al., Kapitel 12 in Methods Express: Expression Systems herausgegeben von Micheal R. Dyson and Yves Durocher, Selon Publishing Ltd, 2007 beschrieben. Der Antikörper wurde durch Protein-A-Chomatographie gereinigt und seine Bindung an humanes B7H3 sowie humanes B7H2 und B7H4 mittels Elisa charakterisiert, wie in AK-Beispiel 1 beschrieben. Weiterhin wurde die Wirksamkeit von Wirkstoffkonjugaten mit TPP5706 in vitro und in vivo getestet wie in Beispiel C-l, C-2 und C-6 beschrieben.. Im Zuge der anschließenden Humanisierung des Binders wurden mehrere humanisierte Derivate von TPP5706 identifiziert, insbesondere TPP6642 und TPP6850, wie in AK-Beispiel 1 beschrieben. In diesen Antikörpern sind die murinen Sequenzen weitgehend durch humane Sequenzen ersetzt, ohne dass die B7H3 Bindungseigenschaften signifikant verändert wurden. Ein Vergleich der .Aminosäuresequenzen dieser Antikörper mit häufig auftretenden menschlichen Keimbahn Sequenzen identifizierte weiterhin eine Reihe von Aminosäuresubstitutionen, die eine Erhöhung des Grades an Homologie zwischen diesen Antikörpern und den humanen Keimbahnsequenzen ermöglichen.

Besondere Ausführungsformen von anti-B7H3-Antikörpern in dieser Anmeldung wird auf die folgenden bevorzugten Antikörper Bezug genommen, wie in der nachstehenden Tabelle gezeigt: TPP-5706, TPP-6642, TPP-6850 und TPP-3803.

TPP-5706 ist ein Antiköiper umfassend eine Region der schweren Kette entsprechend SEQ ID NO: 9 sowie eine Region der leichten Kette entsprechend SEQ ID NO: 10.

TPP-6642 ist ein Antikörper umfassend eine Region der schweren Kette entsprechend SEQ ID NO: 19 sowie eine Region der leichten Kette entsprechend SEQ ID NO: 20.

TPP-6850 ist ein Antikörper umfassend eine Region der schweren Kette entsprechend SEQ ID NO: 29 sowie eine Region der leichten Kette entsprechend SEQ ID NO: 30.

TPP-3803 ist ein Antikörper umfassend eine Region der schweren Kette entsprechend SEQ ID NO: 39 sowie eine Region der leichten Kette entsprechend SEQ ID NO: 40.

TPP-5706 ist: ein Antikörper umfassend eine variable Region der schweren Kette entsprechend SEQ ID NO: 1 sowie eine variable Region der leichten Kette entsprechend SEQ ID NO: 5.

TPP-6642 ist: ein Antikörper umfassend eine variable Region der schweren Kette entsprechend SEQ ID NO: 1 1 sowie eine variable Region der leichten Kette entsprechend SEQ TD NO: 15. TPP-6850 ist: ein Antikörper umfassend eine variable Region der schweren Kette entsprechend SEQ ID NO: 21 sowie eine variable Region der leichten Kette entsprechend SEQ ID NO: 25.

TPP-3803 ist: ein Antikörper umfassend eine variable Region der schweren Kette entsprechend SEQ ID NO: 31 sowie eine variable Region der leichten Kette entsprechend SEQ ID NO: 35.

Bevorzugte AusfQhrungs formen des anti-B7H3-Antikörpers zur Kopplung mit erfindungsgemäßen Linkern und / oder Toxophoren sind die folgenden Antikörper:

1. Ein anti-B7H3-Antikörper der durch das Hybridom PTA-4058 produziert wird, oder ein antigen-bindendes Fragment hiervon.

2. Eine chimäre oder humanisierte Variante des anti- B7B3-Antikörpers, der durch das Hybridom PTA-4058 produziert wird, oder ein antigenbindendes Fragment davon.

3. Ein anti-B7H3 -Antikörper oder antigenbindendes Fragment hiervon gemäß einer der Ausfuhrungsformen 1. oder 2, weicher an ein Polypeptid wie dargestellt durch SEQ ID NO: 41bindet. SEQ ID NO: 41 repräsentiert die Aminosäuresequenz der extrazeliulären Domäne des humanen B7H3 Polypeptids.

4. Ein Antikörper oder ein antigenbindendes Fragment, welcher an B7H3 bindet, umfassend: eine variable schwere Kette umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 2, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 3 und die variable CDR3- Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 4 sowie eine variable leichte Kette umfassend die variable CDR1 -Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 6, die variable CDR2-Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 7 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ TD NO: 8, oder eine variable schwere Kette umfassend die variable CDR1 -Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 12, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 13 und die variable CDR3- Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 14 sowie eine variable leichte Kette umfassend die variable CDR1 -Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 16, die variable CDR2-Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 17 und die variable CDR3-Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 18, oder eine variable schwere Kette umfassend die variable CDRl -Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 22, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 23 und die variable CDR3- Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 24 sowie eine variable leichte Kette umfassend die variable CDRl -Sequenz der leichten Kette dargestellt diirch SEQ ID NO: 26, die variable CDR2-Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 27 und die variable CDR3 -Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 28, oder eine variable schwere Kette umfassend die variable CDRl -Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 32, die variable CDR2-Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 33 und die variable CDR3- Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 34 sowie eine variable leichte Kette umfassend die variable CDRl -Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 36, die variable CDR2-Sequenz der leichten Kette dargestellt diirch SEQ ID NO: 37 und die variable CDR3 -Sequenz der leichten Kette dargestellt durch SEQ ID NO: 38. Der Antikörper oder ein anti genbindendes Fragment davon gemäß Ausführungsform 4 umfassend: eine variable Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:l , sowie eine variable Sequenz der leichten Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:5 oder eine variable Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 1 1 , sowie eine variable Sequenz der leichten Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 15 oder eine variable Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt diirch SEQ ID NO:21 , sowie eine variable Sequenz der leichten Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:25 oder eine variable Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:31 , sowie eine variable Sequenz der leichten Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:35. Konjugal gemäß einer der vorhergehenden Ansprüche, wobei der anti-B7H3 -Antikörper ein IgG Antikörper ist. er Antikörper gemäß einer der vorhergehenden Ausfuhrimgsformen, umfassend: eine Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:9 , sowie eine Sequenz der leichten Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 10 oder eine Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 19 , sowie eine Sequenz der leichten Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:20 oder eine Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:29 , sowie eine Sequenz der leichten Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:3ü oder eine Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:39 , sowie eine Sequenz der leichten Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:4ö. Der Antikörper gemäß einer der vorhergehenden Ausfuhrungsformen, wobei der anti- B7H3-Antikörper eine humanisierte Variante eines der Antikörper TPP6642 und TPP6850 ist. er Antikörper gemäß einer der vorhergehenden Ausfuhrungsformen, umfassend: eine Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO: 19, die mindestens eine Aminosäuresubstitution enthält, ausgewählt aus einer Gruppe enthaltend die Substitutionen B I S, N33Y, V34M, T50I, F52N, G54S, N55G, D57S, N61A, K65Q, D66G, K67R, T72R, A79V sowie eine Sequenz der leichten Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:20, die mindestens eine Aminosäuresubstitution enthält, ausgewählt aus einer Gruppe enthaltend die Substitutionen E27Q, N28S, N30S, N31 S, T34N, F36Y, Q40P, S43A, Q45K, H50A, K52S, T53S, A55Q, E56S, H90Q, H91 S, G93S, P96L, oder eine Sequenz der schweren Kette, wie dargestellt durch SEQ ID NO:29, die mindestens eine Aminosäuresubstitution enthält, ausgewählt aus einer Gruppe enthaltend die Substitutionen 13 I S, N33G, V34I, H35S, 137V, T50W, F52S, P53A, G54Y, D57N, S59N, 61A, F64L, K65Q, D66G, A68V, L70M, K74T, K77S, A107Q sowie eine Sequenz der leichten Kette, wie dargestellt durch SEQ IE) NQ:30, die mindestens eine Aminosäuresubstitution enthält, ausgewählt aus einer Gruppe enthaltend die Substitutionen E27Q, N28S, N30S, N31S, T34N, F36Y, V48I, H50A, K52S, T53S, A55Q, E56S, Q70D, H90Q, H91 S, G93S.

9. Der Antikörper gemäß einer der vorhergehenden Ausruhrungsformen, der ein IgO Antikörper ist.

10. Der Antikörper gemäß einer der vorhergehenden Ausfuhrungsformen, umfassend: Das antigenbindende Fragment gemäß einer der vorhergehenden Ausfiihrungsforrnen oder ein antigenbindendes Fragment eines Antikörpers gemäß einer der vorhergehenden Ausfuhrungsformen, das ein scFv-, Fab-, Fab ' -Fragment oder ein F(ab )2-Fragment ist.

11. Der Antikörper oder das antigenbindende Fragment gemäß einer der vorhergehenden Ausführungsformen, der ein monoklonaler Antikörper oder ein antigenbindendes Fragment davon ist.

12. Der Antikörper oder das antigenbindende Fragment gemäß einem der vorhergehe den Ansprüche, der ein humaner, humanisierter oder chimärer Antikörper oder ein antigenbindendes Fragment ist.

Besonders bevorzugt sind die anti-B7H3-Antikörper TPP-5706, TPP-6642, TPP-6850 und TPP- 3803. Der Gegenstand der vorliegeneden Erfindung umfasst demnach ebenfalls die humanisierten Derivate TPP6642 und TPP6850 mit den folgenden Aminosäuresubstitutionen, wobei E27Q eine Substitution von E durch Q an Aminosäure-Position 27 der jeweiligen Kette des jeweiligen humanisierte Derivates bedeutet, N28S eine Substitution von N durch S an Position 28 der jeweiligen Kette des jeweiligen humanisierten Derivates, etc.

Humanisierte Variante Lokalisierung Aminosäuresubstitutionen

von TPP5706

TPP6642 leichte Kette E27Q, N28S, N30S, N31S, T34N, F36Y, Q40P, S43A,

Q45K, H50A, K52S, T53S, A55Q, E56S, H90Q, H91S, G93S, P96L schwere Kette I31S, N33Y, V34 , T50I, F52H, G54S, iM55G, D57S,

N61A, K65Q, D66G, K67R, T72R, A79V

TPP6850 leichte Kette E27Q, N28S, N30S, INS31S, T34N, F36Y, V48I, H50A,

K52S, T53S, A55 E56S, Q70D, H90Q, H91S, G93S schwere Kette I31S, N33G, V34I, H35S, 137V, T50W, F52S, P53A,

G54Y, D57N, S59N, N61A, F64L, K65Q, D66G, A68V, L70 , K74T, K77S, A107Q

Isotope, Salze, Soivate, isotopische Varianten

Die vorliegende Erfindung umfasst auch alle geeigneten isotopischen Varianten der erfindungsgemäßen Verbindungen, Unter einer isotopischen Variante einer erfindungsgemäßen Verbindung wird hierbei eine Verbindung verstanden, in weicher mindestens ein Atom innerhalb der erfindungsgemäßen Verbindung gegen ein anderes Atom der gleichen Ordnungszahl, jedoch mit einer anderen Atommasse als der gewöhnlich oder überwiegend in der Natur vorkommenden Atommasse ausgetauscht ist. Beispiele für Isotope, die in eine erfindungsgemäße Verbindung inkorporiert werden können, sind solche von Wasserstoff, Kohlenstoff, Stickstoff, Sauerstoff, Phosphor, Schwefel, Fluor, Chlor, Brom und lod, wie Ή (Deuterium), ^J H (Tritium), ^l3 C, ^l4 C, " , ^l7 0, ¹⁸ 0, ³² P, ³³ P, ³³ S, ³⁴ S, ³⁵ S, ³⁶ S, ^l8 F, ³⁶ CL ^S2 Br, ¹²³ I, ^m l, ⁱ²⁹ I und ^,3, I. Bestimmte isotopische Varianten einer er findung gemäßen Verbindung, wie insbesondere solche, bei denen ein oder mehrere radioaktive Isotope inkorporiert sind, können von Nutzen sein beispielsweise für die Untersuchung des Wirkmechanismus oder der Wirkstoff- Verteilung im Körper; aufgrund der vergleichsweise leichten Herstell- und Detektierbarkeit sind hierfür insbesondere mit Ή- oder ^l4 C- Isotopen markierte Verbindungen geeignet. Darüber hinaus kann der Einbau von Isotopen, wie beispielsweise von Deuterium, zu bestimmten therapeutischen Vorteilen als Folge einer größeren metabolischen Stabilität der Verbindung führen, wie beispielsweise eine Verlängerung der Halbwertszeit im Körper oder eine Reduktion der erforderlichen Wirkdosis; solche Modifikationen der erfindungsgemäßen Verbindungen können daher gegebenenfalls auch eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung darsteilen. Isotopische Varianten der erimdungsgemäßen Verbindungen können nach den dem Fachmann bekannten Verfaliren hergestellt werden, so beispielsweise nach den weiter unten beschriebenen Methoden und den bei den Ausführungsbeispielen wiedergegebenen Vorschriften, indem entsprechende isotopische Modifikationen der jeweiligen Reagenzien und/oder Ausgangsverbindungen eingesetzt werden. Ais Salze sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung physiologisch unbedenkliche Salze der erfindungsgemäßen Verbindungen bevorzugt. Umfasst sind auch Salze, die für phannazeutische Anwendungen selbst nicht geeignet sind, jedoch beispielsweise für die Isolierung oder Reinigung der erfindungsgemäßen Verbindungen verwendet werden können.

Physiologisch unbedenkliche Salze der erfindimgsgemäßen Verbindungen umfassen Säureadditionssalze von Mineralsäuren, Carbonsäuren und Sulfonsäuren, z.B. Salze der Chlorwasser- stoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Methansulfonsäure, Ethansulfon- säure, Benzolsulfonsäure, Toluolsulfonsäure, Naphthaltndtsulfonsäure, Essigsäure, Trifluoressig- säure, Propionsäure, Milchsäure, Weinsäure, Äpfeisäure, Zitronensäure, Fumarsäure, Maleinsäure und Benzoesäure.

Physiologisch unbedenkliche Salze der erfindungsgemäßen Verbindungen umfassen auch Salze üblicher Basen, wie beispielhaft und vorzugsweise Alkalimetallsalze (z.B. Natrium- und Kaliumsalze), Erdalkalisalze (z.B. Calcium- und Magnesiumsalze) und Ammoniumsalze, abgeleitet von Ammoniak oder organischen Aminen mit 1 bis 16 C-Atomen, wie beispielhaft und vorzugsweise Ethylamin, Diethylarain, Triethylamin, Ethyldiisopropylamin, Monoethanolamin, Diethanolamin, Triethanolamin, Dicyclohexylamin, Dimethylaminoethanol, Prokain, Dibenzylamin, N-Methyl- piperidin, Λ-Methylmorpholin, Arginin, Lysin und 1 ,2-Ethylendiamin.

Als Solvate werden im Rahmen der Erfindung solche Formen der erfindungsgemäßen Verbindungen bezeichnet, welche in festem oder flüssigem Zustand durch Koordination mit Lösungsmittelmolekülen einen Komplex bilden. Hydrate sind eine spezielle Forin der Solvate, bei denen die Koordination mit Wasser erfolgt. Als Solvate sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung Hydrate bevorzugt.

Außerdem umfasst die vorliegende Erfindung auch Prodrugs der erfindungsgemäßen Verbindungen. Der Begriff "Prodrugs" bezeichnet hierbei Verbindungen, welche selbst biologisch aktiv oder inaktiv sein können, jedoch während ihrer Verweilzeit im Körper zu erfindungsgemäßen Verbindungen umgesetzt werden (beis ielsweise metabolisch oder hydrolytisch). Besondere Ausfiihmngsformen

Die folgenden Ausfiihmngsformen sind besonders bevorzugt:

Ausführungsform A:

Ein ADC der Formel

BINDER L-— KSP

n wobei KSP-L- eine Verbindimg der folgenden Formel (I), (la), (II), (IIa), (IIb), (IIc), (Ild), (Ile) (Iii), (Ilj), (Ilk) oder der folgenden Formel (Ilf) ist, der Binder ein antkB7H3 -Antikörper ist, der bevorzugt aglycosyliert ist. Besonders bevorzugt ist ein anti-B7H3 -Antikörper, der spezifisch die humane Ig4- und/oder die humane und oder murine Ig2-isoform von B7H3 bindet, insbesondere der anti-B7H3 -Antikörper TPP-5706 und seine humanisierten Varianten wie TPP-6642 und TPP-6850. , wobei n eine Zahl von 1 bis 10 ist:

Formel (Ilf):

(Iii) wobei

A ·( ··: «: ))· ist;

R -L-#l, I L -COOH, -CONFINH ₂ , -iCH ) ·( ()ΝΖ ^' ;( ! ! ) = N i l - und

-CONZ''CH ₂ COOH ist, wobei Z" H ode:r NH ₂ ; R ² und R ⁴ H ist, oder R und R ⁴ gemeinsam (unter Bildung eines Pyrrolidinringes) -CH2-CHR ^{1 1} - oder -CHR ^U -CH ₂ - darsteilen, wobei R ^{1 !} H darstellt;

R ³ -L-#l oder eine CM O-Alkyl-, die ggf. mit -OH, O-Alkyl, SH, S-Alkyl, C K < )· \ik s l . O-CO- NH-Alkyl, NH-CO-Alkyl, NH-CO-NH-Alkyl, S(0>Alkyl, S0 ₂ -NH-Alkyl, NH-Alkyl, N(Alkyl) ₂ , oder NH ₂ substituiert sein kann (wobei Alkyl vorzugsweise C1.3 Alkyl bedeutet) ist;

R ⁵ H oder F ist;

R° und R' unabhängig voneinander H, (ggf. fluoriertes) Ci.3- Alkyl, (ggf. fluoriertes) C ₂ .4-Alkenyl, (ggf. fluoriertes) C ₂ -4-Alkinyl, Hydroxy oder Halogen darstellen;

R ^s eine verzweigte Ci -s-Alkyl-Gruppe ist; und

R ⁹ H oder F ist, wobei einer der Substituenten R ^] und R ³ -L-#l darstellt, und

-L-den Linker und #1 die Bindung zum Antikörper darstellt, sowie Salze, Solvate und Salze der Solvate des ADCs. Der Linker ist vorzugsweise ein Linker

§-<C=0)m--I/i -L2-§§

wobei

m 0 oder 1 ist:

§ die Bindung an KSP darstellt und

§§ die Bindung an den Antikörper darstellt, und

L2

darstellt, wobei

#' die Verknüpfungsstelle mit dem Sehwefeiatom des Antikörpers kennzeichnet, # ² die Verknüpfungsstelle mit der Gruppe L ^! kennzeichnet, und LI durch die Formel

# ¹ -( R ^{1 0} )- _il -(Gl) _o ~G2-# ²

dargestellt wird,

wobei

R ¹⁰ H, M i. oder Cl -C3-Alkyl darstellt;

/ \

N CO

G l -NHCO- oder \....../ darstellt;

n 0 oder 1 ist;

o 0 oder 1 ist; und

G2 eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 100 Kohlenstoffatomen aus Ar lengruppeo. und/oder geradkettigen und/oder verzweigten und/oder cyclischen Alkylengruppen ist, die einfach oder mehrfach durch eine oder mehrere der Gruppen -O-, -S-, -SO-, S02, -NH-, - CO-, -NHCO-, -CONH-, -NMe-, -NHNH-, -S02NHNH-, -CO HNH- und einen 3 bis lOgliedriger, aromatischen oder nicht aromatischen Heterozyklus mit bis zu 4 Heteroatomen

/ λ

N N CO

ausgewählt aus N, O und S, oder -SO- unterbrochen sein kann (vorzugsweise \ / ), wobei die Seitenketten, sofern vorhanden, mit - HCONH2, -COOH, -OH, -NH ₂ , NH-CNNH2, Sulfonamid, Suifon, Suifoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können.

Hierbei ist #1 die Bindung zum KSP-Inhibitor und die Bindung zur Kopplungsgruppe zum Antikörper (z.B. L2).

Aujffih angsfoiTO Bi

ADC der Formel wobei KSP-L- eine Verbindung der folgenden Formel (1), (la), (II), (IIa), (IIb), (ITc), (TTd), (ITe), (Iii), (IIj), (Ilk), (Iii) oder der folgenden Formel (II ^' g) oder der folgenden Formel (Ilg)ist, der Binder ein anti-B7H3- Antikörper ist, der bevorzugt aglycosyliert ist. Besonders bevorzugt ist hierbei ein anti-B7H3-Antikörper, der spezifisch die humane Ig4- und/oder die humane und/oder murine Ig2 -Isoform von B7H3 bindet, insbesondere der anü-B7H3 -Antikörper TPP-5706 und seine humanisierten Varianten wie TPP-6642 und TPP-6850, wobei n eine Zahl von 1 bis 10 ist:

Formel (Hg):

wobei

A CO (carbonyl) ist; R ¹ -L-# i , H, -COOK, -CONHNH2, -(CH ₂ )i-3NH ₂ , -CONZ"(CH ₂ )i-3 H ₂ und ^~ -CONZ"CH ₂ COOH ist, wobei Z" H oder NH ₂ ;

R ² und R ⁴ H ist, oder R ² und R ⁴ gemeinsam (unter Bildung eines Pyrrolidinringes) -CH ₂ -CHR ^I! - oder -CHR ⁿ -CH ₂ - darstellen, wobei R ¹⁰ H darstellt;

R/ ³ ! . ··' ^■ i oder eine C _M e-Alkyk die ggf, mit -OH, O-Alkyl, SH, S- Alkyl, O-CO-Alkyi, O-CO- NH-Alkyl, NH-CO-Alkyl, NH-CO-NH-Alkyl, S(0) _n -Alkyl, S0 ₂ -NH-Alkyl, NH- Alkyl, N(Alkyl) ₂ , oder H ₂ substituiert sein kann (wobei Alkyl vorzugsweise C1-3 Alkyl bedeutet) ist;

R ⁵ H oder F ist;

R ⁶ und R ⁷ unabhängig voneinander H, (ggf. fluoriertes) Ci-3-AlkyI, (ggf. fl510riert.es) C ₂ -4-Alkenyl, (ggf. fluoriertes) C ₂ -4-Alkinyl, Hydroxy oder Halogen darstellen;

R ⁸ eine verzweigte C s-Alkyl-Gruppe ist; und

R ⁹ H oder F ist, wobei einer der Substituenten R ¹ und R'-L-#l darstellt, und

-L-den Linker und #i die Bindung zum Antikörper darstellt,

wobei -L- dargestellt wird durch

§-(CO)m-Ll -I,2-§§

wobei

m 0 oder 1 ist;

§ die Bindung an KSP darstellt und

§§ die Bindung an den Antikörper darstellt, und

L2

darsteiit, wobei

#' die Verknüpfungsstelle mit dem Sehwefeiatom des Antikörpers kennzeichnet, # ² die Verknüpfungsstelle mit der Gruppe L ^! kennzeichnet, und LI durch die Formel

# ¹ -( R ^{1 0} )- _il -(Gl) _o ~G2-# ²

dargestellt wird,

wobei

R ¹⁰ H, N l i; oder Cl -C3-Alkyl darstellt;

/ \

N CO

Gl -NHCO- oder \....../ darstellt;

n 0 oder 1 ist;

o 0 oder 1 ist; und

G2 eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 100 Kohlenstoffatomen aus Arylengruppeo. und/oder geradkettigen und/oder verzweigten und oder cyclischeo. Alkylengruppen ist, die einfach oder mehrfach durch eine oder mehrere der Gruppen -O-, -S-, -SO-, S02, -NH-, - CO-, -NHCO-, -CONH-, -NMe-, -NHNH-, -S02NHNH-, -CO HNH- und einen 3 bis lOgliedriger, aromatischen oder nicht aromatischen Heterozyklus mit bis zu 4 Heteroato en

/ λ

N N CO

ausgewählt aus N, O und S, oder -SO- unterbrochen sein kann (vorzugsweise \ / ), wobei die Seitenketten, sofern vorhanden, mit - HCONH2, -COOH, -OH, -NH ₂ , NH-CNNH2, Sulfonamid, Suifon, Suifoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können,

- die Bindung zum KSP-Inhibitor und #2 die Bindung zur Kopplungsgruppe zum Antikörper ist (z.B. L2),

sowie Salze, Solvate und Salze der Solvate des ADCs.

A 11 sfuhrungsf 0 nnjCl

Ein ADC der Formel wobei KSP-L- eine Verbindung der folgenden Formel (II), (IIa), (IIb), (IIc), (Ild), (Ile), (Iii), (Ilg) (Iii), (IIj), (Ilk) oder der folgenden Formel (Ilh)ist, der Binder ein aglycosylierter anti-B7H3- Antikörper, und n eine Zahl von 1 bis 10 ist:

Forme] (Uli):

(Uli) wobei

A ··( ί ( ) !·· ist;

R ^! -L-#l ist,;

R ² und R ⁴ H ist, oder R ² und R ⁴ gemeinsam (unier Bildung eines Pyrrolidinringes) -CH2-CHR ¹¹ - oder -CHR"-CH2- darstellen, wobei R ^{! l} H darstellt;

R ³ eine CMO- Alkyl-, die ggf. mit -OH, O-Alkyi, SH, S-Alkyl, O-CO-Alkyl, O-CO-NH-Alkyl, NH-CO-Alkyl, Ni l -Cü-NH - \ikyl. S(0) _n -Alkyl, S0 ₂ -NH-Alkyl, NH-Alkyl, N(Aikyl) ₂ , oder NH ₂ substituiert sein kann (wobei Alkyl vorzugsweise C1-3 Alkyl bedeutet), oder -MOD ist;

wobei -MOD -(NR ¹⁰ ) _n -(Gl) _o -G2-G3 darstellt, wobei

R ^!0 H oder Ci-C ₃ -Alkyl darstellt;

Gl -NHCO- oder -CONH- darstellt (wobei wenn Gl -NHCO- darstellt, R ⁱ⁰ nicht NH ₂ ist);

n 0 oder 1 ist;

o 0 oder 1 ist; und

G2 eine geradkettige und/oder verzweigte Kohlen wasserstoffgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen ist, die einfach oder mehrfach durch eine oder mehrere der Gruppen -O-, -S-, -

SO-, S0 ₂ , -NRy-, ·\ ;··;> ( ·< )·, CONRY-, -NRYNRY-, -S02 \ Ri ^' N R ^} -. -CONRYNRY-, (wobei R ^y II, Phenyl, C -C1 Q-Alkyl, C2-C1 Q-Alkenyl, oder C2-C { Q- Alkinyl darstellt, die jeweils mit

NHCONH ₂ , -COOH, -OH, ~NH ₂ , NH-CNNH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können), -CO-, oder -CR"=N-0- (wobei R ^x H, Ci -C3~Alkyl oder Phenyi darstellt) unterbrochen sein kann, wobei die Kohlenwasserstoffkette einschließlich der Seitenketten, sofern vorhanden, mit -NHCQNI-i ₂ , -COOH, -OH, -NH ₂ , NH-CNNH ₂ , Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein kann, G3 -H oder -COOH darstellt, wobei die Gruppe -MOD vorzugsweise zumindest eine Gruppe -COOH aufweist;

R ⁵ H oder F ist;

R° und R' unabhängig voneinander H, (ggf. fluoriertes) Ci-3-Alkyl, (ggf. fluoriertes) C2-4-Alkenyl, (ggf. fluoriertes) C2- ₄ -Alkinyl, Hydroxy oder Halogen darstellen;

R ^s eine verzweigte Ci-s-Alkyl-Gruppe ist; und

R ⁹ H oder F ist, wobei -L-den Linker und #1 die Bindung zum Antikörper darstellt, wobei -L- dargestellt wird durch

§-(CO)m-Ll -L2-§§

wobei

m 0 oder 1 ist;

§ die Bindung an KSP darstellt und

§§ die Bindung an den Antikörper darstellt, und

darstellt, wobei

#' die Verknüpfungsstelle mit dem Schwefelatom des Antikörpers kennzeichnet, # ² die Verknüpfungsstelle mit der Gruppe L' kennzeichnet, und LI durch die Formel

# -(NR ¹ 0) _n -(G 1 ) ₀ -G2-# ²

dargestellt wird,

wobei

R ¹⁰ H, NH ₂ oder Cl-C3-Alkyl darstellt;

/ \

— N CO

Gl -NHCO- oder \....../ darstellt;

n 0 oder 1 ist;

o 0 oder 1 ist; und G2 eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 300 KohlenstofFatomen aus Arylengrappen und/oder geradkettigen und/oder verzweigten und/oder cyclischen Alkylengruppen ist, die einfach oder mehrfach durch eine oder mehrere der Gruppen -O-, -S-, -SO-, S02, -NH-, - CO-, -NHCO-, -CONH-, -NMe-, -NHNH-, -S02NHNH-, -CO HMH-, -CR ^* =N-0- (wobei Rx H, C _[ -C3-Alkyi oder Phenyl darstellt) und einen 3 bis 10-gliedriger, aromatischen oder nicht aromatischen Heteroz klus mit bis zu 4 Heteroatomen ausgewählt aus N, O und S, -SO- oder -

/ \

CO

S02- unterbrochen sein kann (vorzugsweise \ / ), wobei Kohlenwasserstoffkette einschließlich der Seitenketten, sofern vorhanden, mit -NHCONH2, -COOH, -OH, ~NH ₂ , NH- CNNH2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können,

- die Bindung zum KSP-Inhibitor und #2 die Bindung zur Kopplungsgruppe zum Antikörper ist (z.B. L2),

sowie Salze, Solvate,Salze der Solvate sowie Epimere des ADCs.

Ausfühmngsform D:

Die Erfindung stellt auch Binder- Wirkstoff-Konjugate-der folgenden allgemeinen Formel bereit:

wobei BINDER für den (in einer bevorzugten Ausführungsform aglycosylierten) anti-B7H3- Antikörper , L für den Linker, WS für den Wirkstoff, vorzugsweise einen KSP-Inhibitor, wie z.B. ein erfindungsgemäßer KSP-Inhibitor einer der Formeln (I), (la), (II), (IIa), (IIb), (11c), (IM), (Tie), (Ilf), (Ilg) (Ilh) oder (Iii) ist, m für eine Zahl von 1 bis 2, vorzugsweise 1 , und n für eine Zahl von 1 bis 50, vorzugsweise 1 ,2 bis 20 und besonders bevorzugt 2 bis 8 steht, wobei L eine der folgenden Strukturen aufweist. Hierbei ist m die Zahl der Wirkstoffmoleküle pro Linker und n ein Mittelwert der Anzahl an Wirkstoff- Lmker-Konjugaten pro BINDER. Die Summe aller WS, die in einem Konjugatmolekül vorliegen, ist also das Produkt von m und n.

WS ist ein Wirkstoff, der in Tieren, bevorzugt Menschen, eine lokale oder systemische Wirkung therapeutische Wirkung zeigt. Diese Wirkstoffe haben in der Regel ein Molekulargewicht von unter 5 kDa, bevorzugt unter 1.5 kDa. Bevorzugte Wirkstoffe sind Vinca-Alkaloide, Auristatme, Tubulysine, Duoearmycine, Kinase-Inhibitoren, MEK-Inhibitoren und KSP-Inhibitoren.

Hierbei steht L für eine der folgenden Formeln A3 oder A4

Formel A3

Formel A4 wobei #' die Verknüpfungsstelle mit dem Schwefelatom des Binders kennzeichnet, # ² die Verknüpfungssteile mit der dem Wirkstoff kennzeichnet, x 1 oder 2 darstellt, und R~ COOH, COOK, COR (mit R jeweils Cl-3-Alkyl), CONH2, Br, vorzugsweise COOH darstellt.

LI weist dieselbe Bedeutung wie oben auf. Vorzugsweise wird -Ll -#2 durch die folgende Formel dargestellt:

# ³ -(NR ^] °) _n -(G 1 ) ₀ -G2-# ²

dargestellt, wobei

#3 die Verknüptungssteile mit dem Stickstoffatom kennzeichnet

R ^!0 H, \Ί ί. oder C -C .-,\ikyl darstellt; N N- CO

Gl -NHCO- -CONH- oder darstellt; (wobei wenn Gl NHCO oder

IM N -CO

darstellt, RIO nicht H2 ist),

n 0 oder 1 ist;

o 0 oder 1 ist; und

G2 eine geradkettige oder verzweigte Kohlen wasserstoffkette mit 1 bis 100 Kohlenstoffatomen aus Aryiengruppen und/oder geradkettigen und/oder verzweigten und/oder cyciischen Alkylengruppen ist, die einfach oder mehrfach durch eine oder mehrere der Gruppen -O-, -S-, -SO-, SO2, -NR>'-, - NRYCO-, -C( H)NRy-, -CONRY-, -NRYNRY-, -S02NR NR ^v -, -CO RYNRY-, (wobei R ^y H, Phenyl, Ci-CiQ-Alkyl, C2-Ci0-Alkenyl, oder C2-C1 g-Alkinyl darstellt, die jeweils mit NHCONH ₂ , -COOK, -OH, -NH2, NH-CNNH ₂ , Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können), -CO-, -CR ^x=: N-0- (wobei Rx H, Ci -C3-Aikyl oder Phenyl darstellt) und/oder einen 3 bis 10-güedriger, aromatischen oder nicht aromatischen Heterozykius mit bis zu 4 Heteroatomen ausgewählt aus N, O und S, -SO- oder -S02- unterbrochen sein kann (vorzugsweise

⁾ , wobei die Kohlenwasserstoffkette einschließlich der Seitenketten, sofern vorhanden, mit -NHCONH ₂ , -COOK, -OH, -NH ₂ , NH-CN H ₂ , Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können.

Weitere unterbrechende Gruppen in G2 sind vorzugsweise

wobei Rx H, Cj -C^-Alkyl oder Phenyl darstellt. In dem erfindungsgemäßen Konjugal bzw. in einem Gemisch der erfindungsgemäßen Konjugale liegen die Bindungen an einen Cysteinrest des Antikörpers Hegen vorzugsweise zu über 80 %, besonders bevorzugt, zu über 90 %, besonders bevorzugt (bezogen auf die Gesamtanzahl von Bindungen des Linkers an den Antikörper) in einer der beiden Strukturen der Formel A3 oder A4 vor.

Die Konjugale mit den Linkern der Formel A3 bzw. A4 können durch Kupplung der Antikörper an die entsprechenden Bromderivate der folgenden Formeln A3' bzw. A4' erhalten werden:

Formel A3 '

Formel A4'

Diese Bromderivate der Formel A3' bzw. A4' können durch Reaktion von HOOCCH ₂ CHBrCOOR ₂ 2 bzw. HOOCCHBrCH ₂ COOR ₂ 2 mit einer Ammgruppe des Binders erhalten werden, wie in den folgenden Schemata 30 bis 32 beispielhaft veranschaulicht.

[a)i 2-Brom-l -ethylpyridinium-Tetrafluoroborat (BEP), DCM, Pyridin, RT; b) Zinkchlorid, Trifluorethanol, 50°C, EDTA; c) 3-4 Äquivalente TCEP, PBS Puffer; d) PBS Puffer, 20h RT.]

chema 31 :

[a): 2-Brom-l-ethylp ridinium-Tetrafluoroborat (BEP), DCM, Pyridin, RT; b) Zinkchlorid, Trifluoreihanol, 50°C, EDTA; c) 3-4 Äquivalente TCEP, PBS Puffer; d) PBS Puffer, 20h RT.]

AusführungsforiM E:

Die Erfindung stellt auch Binder- Wirkstoff-Konjugate der folgenden allgemeinen Formel bereit:

wobei BINDER für den bevorzugt aglyeosylierten anti-B7H3 -Antikörper , L für den Linker, WS für den Wirkstoff, vorzugsweise einen KSP-Inhibitor, wie z.B. ein erfindungsgemäßer KSP- Inhibitor einer der Formeln (I), (Ia), (II), oder (IIa), m für eine Zahl von 1 bis 2, vorzugsweise 1 , und n für eine Zahl von 1 bis 50, vorzugsweise 1,2 bis 20 und besonders bevorzugt 2 bis 8 steht, wobei L eine der folgenden Strukturen aufweist. Hierbei ist m die Zahl der Wirkstoffmoleküle pro Linker nd n ein Mittelwert der Anzahl an Wirkstoff-Linker-Konjugaten pro BINDER. Die Summe aller WS, die in einem Konjugatmolekül vorliegen, ist also das Produkt von m und n.

Hierbei steht L für:

Formel A wobei # ^! die Verknüpftmgsstelle mit dem Schwefelatom des Antikörpers kennzeichnet, die Verknüpfungsstelle mit der dem Wirkstoff kennzeichnet, und R^2 COOH, COOR, COR (mit R jeweils Cl -3-Alkyl), CÖ H2, Br, vorzugsweise COOH darstellt, darstellt. Die Verknüpfung mit dem Schwefelatom des Binders kann somit eine der folgenden Strukturen aufweisen:

Formel AI

Formel A2

Bei Wirkstoff-Antikörper-Konjugaten, die mehr als ein Wirkstoffmolekül WS pro Wirkstoff- Antikörper -Konjugal enthalten, können beide Strukturen gemäß den Formeln AI und/oder A2 in einem Wirkstoff- Antikörper -Konjugal; vorliegen. Da es sich bei den erfindungsgemäßen Wirkstoff- Antikörper -Konjugalen um eine Mischung unterschiedlicher Wirkstoff- Antikörper - Konjugate handeln kann, ist es auch möglich, dass in dieser Mischung Wirkstoff- Antikörper - Konjugale sowohl mit der Formel AI oder Formel A2 als auch mit der Formel AI und A2 enthalten sind.

Ls ist eine Gruppe ausgewählt aus -(CH2 _. ) _m -(CHRS) _n -(OCH2CH2) ₀ -(X)p-(CH2)q-, wobei m, n, o, p und q unabhängig voneinander die folgenden Werte aufweisen: m=0-l 0; n=0 oder 1 ; o=0-10; p=0 oder 1 ; und q=0-10, wobei m+n+o=l-15, vorzugsweise 1-6 ist. X stellt einen 5- oder 6-gliedrigen, aromatischen oder nicht-aromatischen Hetero- oder Homocyclus dar, vorzugsweise -C H4- oder -

CgHi Q- . R^ stellt eine Säuregruppe, vorzugsweise -COOH oder SO3H dar. sgewählt aus --CONH-, -OCONH-, -NHCO-, -NHCOO-, wobei r 1 , 2 oder 3 ist.

L _? ist eine Einfächbindung oder eine Gruppe ausgewählt aus einer geradkettige oder verzweigten Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 100 (vorzugsweise 1 bis 10) Kohlenstoffatomen aus Arylengruppen und/oder geradkettigen und/oder verzweigten und/oder cyclischen Alkylengruppen ist, die einfach oder mehrfach durch eine oder mehrere der Gruppen -O-, -S-, -SO-, SO2, -NR-"'-, -

NR.VCO-, -C(NH)NR.V-, -CONRY-, -NRYNRY-, -SÜ2 \ ^' - N R- -. ·( i)N R> \ R> --. (wobei R ^y FI, Phenyl, C 3 -Cj Q-Alkyl, C ₂ -C] Q-Alkenyl, oder C ₂ -Ci g-Alkinyl darstellt, die jeweils mit

NHCONH ₂ , -COOK, -OH, -NFL, H-C H2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können), -CO-, -CR ^x =N-0- (wobei Rx H, Ci -C^-Alkyl oder Phenyl darstellt) und/oder einen 3 bis 10-gliedriger, vorzugsweise 5 bis 10-gliedriger, aromatischen oder nicht aromatischen Heterozyklus mit bis zu 4 Heteroatomen ausgewählt aus N, O und S, -SO- oder - S02- unterbrochen sein kann, wobei die Kohlenwasserstoffkette einschließlich der Seitenketten, sofern vorhanden, mit -NHCONH ₂ , -COOK, -OH, -NH ₂ , NH-CN H2, Sulfonamid, Sulfon, Sulfoxid, oder Sulfonsäure substituiert sein können.

L ₅ ist bevorzugt eine Gruppe -(CH ₂ ) _m -(CHR ^i> ) _n -(OCH2CH2) ₀ -( )p-(CH2)q-, wobei m=l-3, n=0, o=0-7, p=0, und q=0 oder 1 darstellt. Besonders bevorzugt ist eine Gruppe -(CH ₂ ) _m -(CHRS) _n - (OCH ₂ CH ₂ ) ₀ -(X)p-(CH ₂ ) _a -, wobei m=l oder 2, n=0, o=0 oder l, p=0, und q=0 oder 1 darstellt. L ₆ ist bevorzugt eine Gruppe ausgewählt aus -CONH- und -NHCO-.

L ₇ ist bevorzugt eine Einfachbindung oder ^• ~[(CH2) -(X ⁴ ) _y ] _w -(CH2)z-,

wobei

w = 0 bis 20 ist;

x = 0 bis 5 ist;

y = 0 oder 1 ist; NH darstellt.

Besonders bevorzugt ist L? eine Einfachbindung oder eine Gruppe -[(Ciijx-NHCO-)], wobei x = 1 bis 5 ist.

Besonders bevorzugt stellt -L ₅ - -L ₇ - -(CH ₂ ) _m -(CHR ^s ) _n -(OCH2CH2) ₀ -(X)p-(CH2) _q ---NHCO---

[(CH2) _x - HCO-)] dar, wobei m=l oder 2, n=0, o==0 oder 1, p=0, und q= ^: 0 oder 1, und x=l-5 darstellt.

Es ist jedoch auch möglich, dass diese beiden Strukturen gemeinsam in dem erfindungsgemäßen Konjugal; vorliegen.

Diese Antikörper -Wirkstoff-Konjugate können erfindungsgemäß aus den Verbindungen der Formel

wobei L die folgende Formel A' aufweist, hergesteilt werden:

Formel A'

Vorzugsweise erfolgt die Umsetzung von A' zu A durch Rühren in einem pH-Puffer mit einem pH- Wert von 7.5 bis 8.5, vorzugsweise 8, bei einer Temperatur unterhalb 37°C, vorzugsweise 10 bis 25 °C, über einen Zeitraum von bis zu 40 Stunden, vorzugsweise 1 bis 15 Stunden.

Ausfuhrungsform I:

Ein Antikörper-Konjugat der Formel

wobei

R2, R4 und R5H darstellen;

R3 -CH20H darstellt;

Rl -LI -L2-BINDER darstellt, wobei

Li

darstellt, wobei #2 die Verknüfung mit der L2 darstellt, und f l die Verknüfung mit die andere Verknüpfung darstellt; und L2 eine oder beide der folgenden Strukturen der Formeln A5 und A6 darstellt:

Formel A5

Formel A6

WODCi

#' die Verknüpfungssielle mit dem Schwefeiatom des Antikörpers kennzeichnet, if die Verknüpfungsstelle mit der Gruppe L' kennzeichnet, und

R ²² COOK, COOK, COR, CONHR (mit R jeweils Cl -3-Alkyl), C , vorzugsweise COOH darstellt.

In einem erfindungsgemäßen Konjugat bzw. in einem Gemisch der erfindungsgemäßen Konjugate liegen die Bindungen an einen Cysteinrest des Antikörpers vorzugsweise zu über 80 %, besonders bevorzugt zu über 90 % (jeweils bezogen auf die Gesamtanzahl von Bindungen des Linkers an den Antikörper), besonders bevorzugt in einer der beiden Strukturen der Formel A5 oder A6 vor: Hierbei liegen die Strukturen der Formel A5 oder A6 in der Regel gemeinsam vor, vorzugsweise in einem Verhältnis von 60:40 bis 40:60 bezogen auf die Anzahl der Bindungen an den Antikörper. Die restlichen Bindungen liegen dann in der Struktur

vor.

Der Antikörper ist vorzugsweise ein anti-B7H3-Antikörper, oder em Antigen-bindendes Fragment hiervon, der spezifisch die humane lg4- und/oder die humane und/oder murine Ig2-Isofonn von B7H3 bindet, insbesondere der anti~B7FI3 -Antikörper TPP-5706 und seine humanisierten Varianten wie TPP-6642 und TPP-6850. In einer bevorzugten Axisfuhrungsform liegt der anti- B7H3 -Antikörper aglycosyliert vor.

Spezielle AusfUhrungsformen

Es werden folgende bevorzugte Antiköiper-Konjugaie gemäß einer der folgenden Formeln bereitgestellt, wobei n eine Zahl von 1 bis 20 ist und AKl (wie auch AKla, AKlb, usw.) bzw. AK2 (wie auch AK2a, AK2b usw.) einen Antikörper darstellen. AKl stellt einen über Cystein verknüpften Antikörper, AK2 einen über Lysin verknüpften Antikörper dar.

Der Antikörper (AKl oder AK2) in einer der folgenden Formeln ist vorzugsweise ein chimärer oder humanisierter anti-B7H3-Antikörper, oder ein Antigen-bindendes Fragment hiervon, der spezifisch die humane Ig4- und/oder die humane und/oder murine Ig2 -isoform von B7H3 bindet, insbesondere der anti-B7H3 -Antikörper TPP-5706 und seine humanisierten Varianten wie TPP- 6642 und TPP-6850 sowie der anti-B7H3 -Antikörper TPP-3803. In einer bevorzugten Aiisführungsform liegt der anti-B7H3 -Antikörper aglycosyliert vor.

- 183 -

wobei

A 1 einen über Cystein verknüpften und

AK2 einen über Lysin verknüpften anti-B7H3 -Antikörper darstelit, weicher eine chimäre oder humanisierte Variante des Antikörpers TPP-5706 oder TPP-3803 ist,

n eine Zahl von 1 bis 20 darstelit; und

Li eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit 1 bis 30

Kohlenstoffatomen, die einfach oder mehrfach, gleich oder verschieden durch -O-, -S-, -C(=0)-, -S{=0} ₂ -, -NH-, Cyclopentyl, Piperidinyi, Phenyl unterbrochen sein kann,

wobei die geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffkette mit -COOK, oder - H2 substituiert sein kann,

sowie ihre Salze, Solvate, Salze der Solvate und Epimere. Hierbei steht der Linker Li vorzugsweise für die Gruppe

§-NH-(CH ₂ ) ₂ -§§:

§--NH-(CH ₂ V§§;

§-NH-(CH ₂ ) ₂ -0-(CH ₂ ) ₂ -§§;

§ - I-i-CH(COOH)-(CH ₂ )4-§ §

§ -i\H-NH-C(=0)-(CH ₂ ) _s -§ § ;

§-NH-(CH ₂ ) ₂ -C(=0)-0-(CH ₂ ) ₂ -§§;

§ ΛΉ··ι(ΊΙ·).··( i ⁽⁾ !-\!i-!Ci! ) -i § ;

§-NH-(CH ₂ ) ₂ -NH-C O)-CH ₂ -§§;

§ -NH-(CH ₂ )3-NH-C(-0)-CH ₂ -§ § ;

§ -NH-(CH ₂ ) ₂ -NH-C(=0)-{CH _{2 2} -§ § ;

§-NH-(CH ₂ )2-NH-C(=0)-(CH ₂ ) ₅ -§§;

§-NH-(CH2)2- H-C(=0)-CH(CH3)-§§;

§-NH-(CH ₂ ) ₂ -0-(CH ₂ ) ₂ - H-C O)-CH ₂ -§§;

§-NH-CH(COOH)-CH ₂ - H-C(=0)-CH ₂ -§§;

§-lMH-CH(COOH)-(CH2)2-NH-C(=0)-CH2-§§;

§ -NH-CH(COOH)-(CH ₂ )4-NH-C(===0)-CH2-§ § ;

§-NH-CH(COOH)-CH ₂ - H-C(=0)-(CH ₂ )2-§§;

§ -NH-(CH2)2- H-C(=0)-CH(C ₂ H4COOH)-§ § ;

S NI! (C I! ) NU C i ^{ )i-ii( ^' ii-) -Os-i( Ή·!···ί _: ί;

§-NH-(CH ₂ )2-S(=0)2-(CH ₂ )2-NH-C(=0)-CH2-§§;

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§ -NH-CH(COOH)-CH ₂ -NH-C( ))-CH(CH ₂ COOH)-§ § ;

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§ -NH-CH(COOH)-CH2-NH-C(=0)-(CH2)2-NH-C(=0)-CH2-§ § ;

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§-NH-CH[C(-0)-NH-(CH2)2-0) ₄ -{CH2)2COOH]-CH2- H-C(-0)-CH2-§§;

§ ^» NH-CH(COOH)-€H ₂ -^

§-NH-(CH _z )4-CH(COOH)-NH-C(=0)-CH(CH ₃ )-NH-C(=0)-CH( ^j soC ₃ H7)-§§; §-NH-{CH ₂ )4-CH(COOH)-NH-C(=O)-CH{CHr - H-C(<))-^^ §-NH-(CH ₂ )2-C(=0)- H CH -CH(COOH)- H-C( ))-CH(CH3)-NH-C(=0)-CH(isoC3H7)- H- C(=0)-CH ₂ -§§;

§-NH-{CH ₂ ) ₂ -C(-0)-NH-(CH ₂ )4-CH{COOH)- H-C(K3)-CH(CH i-\ji-(CH;):-C!ii( OOin-NM-Ci 0)-Π1[(Π1·}.··ΝΙί-0 ())·ΝΠ |·Ν!!·( ( OK MiisoiMi )-Nli-

C(=0)-(CH ₂ ) ₅ -§§;

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C(=€>)-(CH ₂ ) ₅ -§§;

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§-CH(CH ₃ )-NH-C(=0)-CH(isoC )-NH-C(=0)-CH ₂ -§§;

§ -CH(CH ₃ )-NH-C(=0)-CH(isoC )-NH-C{=0)-(CH2)5-§ § ;

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C(=0)-(CH ₂ ) ₂ -§§;

§-CH ₂ -S-(CH2) ₂ -C(=0)- H-(CH ₂ )2-§§;

§ -CH ₂ -S-(CH2)5-C(=0)-NH-(CH ₂ )2-§ § ;

§ jH2-S-CH2CH(COOH)-NH-C(-0)-CH ₂ -§ § ;

§-CH ₂ -S-CH ₂ CH(COOH)-NH-C(=0)-(CH ₂ ) ₅ -§§;

§-CH ₂ -S-(CH ₂ ) ₂ -C(=0)-NH-((CH ₂ ) ₂ -0) ₂ -(CH ₂ ) ₂ -§§;

§-CH2-S-(CH2)2-C(===0)- -I-((CH2)2-0)2-(CH2) ₅ -§§;

§-CH2-S-(CH ₂ ) ₂ -C(=0)-NH-(CH2)2-NH-C(=0)-CH2-§§;

§-CH2-S-(CH2)2-C(===0)-NH-(CH2)2-NH-C(-0)-CH ₅ -§§;

§ H ₂ -S-CH ₂ CH(C(X>H)-NH-C(<))-(CH2)2-NH-C(==0)-CH2-§§;

§-CH ₂ -S-CH ₂ CH( H ₂ ) :( ⁾ )-NH-(CH ₂ ) ₂ -NH-C(==0)-(CH ₂ )5-§§;

§-CH ₂ -S-(CH ₂ ) ₂ ( ))- H-CH(COOH)-CH ₂ -NH-C(==0)-CH ₂ -§§;

§-CH2-SHCH2)2-C(=0)- H-.({CH2)2- )2HCH2)2-NH--C{-0)~CH2 ^» §§;

i-C!l -S-iCli-S -Ci

§-CH ₂ -S-(CH ₂ )2-C(< ⁾ )-NH (CH2)2-0)2-(CH2)2- ^] ^-C( ))-(CH2)5-§§;

§-CH2-SHCH2)2-C O)-NH-({CH2)2-0)4-(CH2)2-NH-C{=0)-(CH ₂ )5-§§;

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§-CH2-S-CH2CH(COOH)-NH-C(==0) (CH ₂ )2-0) ₈ -(CH2)2-NH-C(===0)-CH2-§§; §-CH ₂ -S-CH ₂ CH(COOH)-NH-C(< ^^^

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§§;

§-CH ₂ -S-CH ₂ CH[NH-CH))-{CH ₂ ^^^^

§»CH ₂ -S-CH ₂ CH[C( ))-NH^^^

§-CH ₂ -S-CH ₂ CHCK3)-^

§§;

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C(=0)-CH ₂ -§§

§-CH ₂ -S-CH ₂ CH[C(=0)-NH-((^

C(=0)-CH ₂ -§§;

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CH(CH3)-NH-C(=0)-CH(isoC3H ₇ )-NH-C(=0)-(CH2)s-§§, steht,

wobei

§ die Bindung an das Wirkstoffmolekül darstellt und

§§ die Bindung an den Antikörper darstellt und

isoCsH? einen isoPropyl-Rest darstellt,

sowie ihre Salze, Solvate, Salze der Solvate und R/S-Enantiomeren.

Diese Konjugale umfassen auch ihre Salze, Solvate, Salze der Solvate und Epimere.

Therapeutische Verwendung

Zu den hyperproliferativen Erkrankungen, zu deren Behandlung die erfindungsgemäßen Verbindungen eingesetzt werden können, zählt insbesondere die Gruppe der Krebs- und Tumorerkrankungen. Hierunter werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung insbesondere die folgenden Erkrankungen verstanden, ohne jedoch auf sie beschränkt zu sein: Brustkarzinome und Brust- tumore (Mammakarzinome einschließlich ductaler und lobulärer Formen, auch in situ), Atemwegs- tumore (kleinzelliges und nicht-kleinzelliges Karzinom, Bronchiaikarzinome), Hirntumore (z.B. des Hirnstamms und des Hypothalamus, Astrocytoma, Ependymoma, Glioblastoma, Gliome, Medulloblastoma, Meningiome sowie neuro-ektodermale und pineale Tumore), Tumore der Verdauungsorgane (Speiseröhren-, Magen-, Gallenblasen-, Dünndarm-, Dickdarm-, Rektum- und Analkarzinome), Lebertumore (u.a. hepatozelluläres Karzinom, Cholangiokarzinom und gemischt- hepatozelluläres Cholangiokarzinom), Tumore des Kopf- und Halsbereiches (Larynx-, Hypo- pharynx-, Nasopharynx-, Oropharynx-, Lippen- und Mundhöhlenkarzinome, orale Melanome), Hauttumore (Basaliome, Spinaliome, Plattenepithelkarzinome, Kaposi-Sarkom, maligne Melanome, nicht-melanomartiger Hautkrebs, Merkelzell-Hautkrebs, Mastzelltumore), Tumore des Stütz- und Bindegewebes (u.a. Weichteilsarkome, Osteosarkome, maligne fibröse Histiozytome, Chondrosarkome, Fibrosarkome, Hämangiosarkome, Leiomyosarkome, Liposarkome, Lymphosarkome und Rhabdomyosarkome), Tumore der Augen (u.a. intraokuläres Melanom und Retino- blastom), Tumore der endokrinen und exokrinen Drüsen (z.B. der thyroiden und parathyroiden Drüsen, Bauchspeicheldrüsen- und Speicheidrüsenkarzinome, Adenokarzinome), Tumore des Harntrakts (Blasen-, Penis-, Nieren-, Nierenbecken- und Harnleitertumore) sowie Tumore der reproduktiven Organe (Endometrium-, Zervix-, Ovaria!-, Vaginal-, Vulva- und Uteruskarzinome der Frau sowie Prostata- und Hodenkarzinome des Mannes). Dazu gehören auch proliferative Erkrankungen des Blutes, des Lymphsystems und des Rückenmarks, in solider Form und als zirkulierende Zellen, wie Leukämien, Lymphome und myeloproliferative Erkrankungen, z.B. akute myeloide, akute lymphoblastische, chronisch-lymphozytische, chronisch-myelogene und Haarzell- Leukämie, sowie AIDS-korrelierte Lymphome, Hodgkin-Lymphome, Non-Hodgkin-Lymphome, kutane T-Zell-Lymphome, Burkitt-Lymphome und Lymphome im zentralen Nervensystem.

Diese gut charakterisierten Krankheiten des Menschen können mit vergleichbarer Ätiologie auch in anderen Säugetieren vorkommen und dort ebenfalls mit den Verbindungen der vorliegenden Erfindung behandelt werden.

Die Behandlung der zuvor genannten Krebserkrankungen mittels der erfindungsgemäßen Verbindungen umfasst sowohl eine Behandlung der soliden Tumore als auch eine Behandlung meta- stasierter oder zirkulierender Formen hiervon.

Der Begriff "Behandlung" oder "behandeln" wird im Rahmen dieser Erfindung konventionell verwendet und bedeutet die Versorgung, Pflege und Betreuung eines Patienten mit dem Ziel, eine Krankheit oder gesundheitliche Abweichung zu bekämpfen, zu verringern, abzuschwächen oder zu erleichtern und die Lebensbedingungen zu verbessern, die durch diese Krankheit beeinträchtigt werden, wie beispielsweise bei einer Krebserkrankimg.

Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Behandlung und'Oder Prävention von Erkrankungen, insbesondere der zuvor genannten Erkrankungen.

Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendimg der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prävention von Erkrankungen, insbesondere der zuvor genannten Erkrankungen.

Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen in einem Verfahren zur Behandlung und'Oder Prävention von Erkrankungen, insbesondere der zuvor genannten Erkrankungen.

Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Behandlung und'Oder Prävention von Erkrankungen, insbesondere der zuvor genannten Erkrankungen, unter Verwendung einer wirksamen Menge von mindestens einer der erfindungsgemäßen Verbindungen.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können allein oder bei Bedarf in Kombination mit einer oder mehreren anderen pharmakologisch wirksamen Substanzen eingesetzt werden, solange diese Kombination nicht zu unerwünschten und inakzeptablen Nebenwirkungen führt. Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher Arzneimittel, enthaltend mindestens eine der erfindungsgemäßen Verbindungen und einen oder mehrere weitere Wirkstoffe, insbesondere zur Behandlung und/oder Prävention der zuvor genannten Erkrankungen.

Beispielsweise können die Verbindungen der vorliegenden Erfindung mit bekannten anti-hyperproliferativen, zytostatischen oder zytotoxischen Substanzen zur Behandlung von Krebserkrankungen kombiniert werden. Als geeignete Kombinationswirkstoffe seien beispielhaft genannt:

1311-chTNT, Abarelix, Abirateron, Aciarubicin, Ado-Trastuzumab Emtansin, Afatinib,

Aflibercept, Aldesleukin, Alemtuzumab, Alendronsäure, Alitretinoin, Altretamin, Amifostine, Aminoglutethimid, Hexyl-5-Aminolevulinat, Amrubicin, Amsacrin, Anastrozol, Ancestim, Anethole dithiolethione, Angiotensin Ii, Antithrombin Iii, Aprepitant, Arcitumomab, Arglab in, Arsentrioxid, Asparaginase, Axitinib, Azaci tidin, Belotecan, Bendamustin, Belinostat,

Bevacizumab, Bexaroten, Bicalutamid, Bisantren, Bleomycin, Bortezomib, Buserelin, Bosutinib, Brentuximab Vedotin, Busiiifan, Cabazitaxel, Cabozantinib, Calciumfolinat, Calciumlevofolinat, Capecitabin, Capromab, Carboplatin, Carfilzomib, Carmofur, Carmustin, Catumaxomab, Celecoxib, Celmoleukin, Ceritinib, Cetuximab, Chlorambucil, Chlormadinon, Chlormethin, Cidofovir, Cinacalcet, Cisplatin, Cladribin, Ciodronsäure, Clofarabin, Copaniisib, Crisantaspase, Crizotinib, Cyclophosphamid, Cyproteron, Cytarabtn, Dacarbazin, Dactinotnycin, Dabrafenib, Dasatinib, Daunombicin, Deeitabm, Degarelix, Deniieukin-Diftitox, Denosumab, Depreotid, Desloreltn, Dexrazoxane, Dibrospidiumchlorid, Dianhydrogalactitol, Diclofenac, Docetaxel, Dolasetron, Doxifluridin, Doxorubicin, Doxorubicin + Estron, Dronabinol, Edrecolomab, Elliptiniumacetat, Endostatin, Enocitabin, Enzalutarnid, Epirubicin, Epitiostanol, Epoetin-alfa, Epoetin-beta, Epoetin-zeta, Eptaplatin, Eribuiin, Erlotinib, Esomeprazol, Estramustin, Etoposid, Everolimus, Exeinestan, Fadrozoi, Fentanyl, Fiuoxymesteron, Floxuridin, Fludarabin, Fluoruracil, Fkitamid, Folinsäure, Formestan, Fosaprepitanl, Fotemustin, Fuivestrant, Gadobutroi, Gadoteridol, Gadotersäure-Megluminsalz, Gadoversetamid, Gadoxetsäure Dinatriumsalz (Gd-EOB-DTPA Dinatriumsalz), Gallimrmitrat, Ganirelix, Gefitinib, Gemcitabin, Gemtuzumab, Glucarpidase, Glutoxim, Goserelin, Granisetron, Granulocyten Kolonie stimulierender Factor (G-CSF), Granulocyten Macrophagen Kolonie stimulierender Factor (GM-CSF), Histamindihydrochlorid, Histrelin, Hydroxycarbamid, I- 125-Seeds, Ibandronsäure, Ibritumomab-Tiuxetan, Ibrutinib, Idarubicin, Ifosfamid, Imatinib, Imiquimod, Improsulfan, Indisetron, Incadronic acid,

Ingenolmebutat, Interferon-alfe, Interferon-beta, Inierferon-gamma, lobitridol, Iobenguane (1231), lomeprol, Tpilimumab, irinotecan, itraconazole, Ixabepilon, Lanreotid, Lansoprazole, Lapatinib, Lasocholine, Lenalidomid, Lentinan, Letrozol, Leuprorelin, Levamisol, Levonorgestrel,

Levothyroxin-Natrium, Lipegfilgrastim, Lisurid, Lobaplatin, Lomustin, Lonidamin, Masoprocol, Medroxyprogesteron, Megestrol, Melarsoprol, Melphalan, Mepitiostan, Mercaptopuiin, Mesna, Methadon, Methotrexat, Methoxsalen, Methylaminolevulinat, Methyiprednisolon,

Methyltestosteron, Metirosin, Mifamurtid, Miltefosin, Miriplatin, Mitobronitol, Mitoguazon, Mitolactol, Mitomycin, Mitotan, Mitoxantron, Mogamulizumab, Molgramostim, Mopidamol, Morphinhydrochlorid, Morphinsulfat, Nabilon, Nabiximols, afarelin, Naloxon + Pentazocin, Naitrexon, Nartograstim, Nedapiatin, Nelarabin, Neridronsäure, Nivolumabpentetreotid, Nilotinib, Nilutamid, Nimorazol, Nimotuzumab, Ntmusttn, Nilracrin, Nivolumab, Obinutuzumab, Octreotid, Ofatumumab, Omacetaxin-Mepesuccinat, Omeprazol, Ondansetron, Orgotein, Orilotimod, Oxaliplatin, Oxycodon, Oxymetholon, Ozogamicin, p53-Gentherapie, Paclitaxel, Palladium- 103- Seed, Palonosetron, Pamidronsäure, Panitumumab, Pantoprozol, Pazopanib, Pegaspargase, Pembrolizumab, Peg-interferon-alfa-2b, Pemetrexed, Pentostatin, Peplomycin, Perflubutane, Perfosfamid, Pertuzumab, Picibanil, Pilocarpin, Pirarubicin, Pixantron, Plerixafor, Plicamycin, Poliglusam, Polyestradiolphosphat, Polyvinylpyrrolidone + Natriumhyaluronat, Polysaccharid-K, Pomalidomid, Ponatinib, Porfimer -Natrium, Praiatrexat, Prednimustin, Prednison, Procarbazin, Procodazoie, Propranolol, Quinagolid, Rabeprazol, Racotumomah, Radium-223-chlorid, Radotmib, Raloxifen, Ral itrexed, Ramosetron, Ramucirumab, Ranimustin, Rasburicase, Razoxan,

Refametinib, Regorafenib, Risedronsäure, Rhenium- 186 Etidronat, Riiuximab, Romidepsin, Romurtid, Roniciclib , Samarium (153Sm) lexidronam, Satumomab, Secretin, Sipuleucel-T, Sizoiiran, Sobuzoxan, Natriumglyeididazol, Sorafenib, Stanozolol, Streptozocin, Sunitinib, Talaporfin, Tamibaroten, Tamoxifen, Tapentadol, Tasonermin, Teceieukin, Technetium (99mTc) Nofetumomab Merpentan, 99mTc-ITYNIC-[Tyr3]-octreotid, Tegafur, Tegafur + Gimeracil + Oteraeil, Temoporfin, Temozolomid, Temsirolimus, Teniposid, Testosteron, Tetrofosmin, Thaiidomid, Thiotepa, Thymalfasin, Th rotropin alfa, Tioguanin, Toeilizumab, Topotecan, Toremifen, Tosiiumomab, Trabectedin, Tramadol, Trastuzumab, Treosuifan, Tretinoin, Tritluridine + Tipiracil, Trametinib, Triiostan, Triptorelin, Trofosfamid, Thrombopoietin, Ubenimex,

Vairubicin, Vandetanib, Vapreotid, Valatinib , Vemurafenib, Vinblastin, Vincristin, Vindesin, Vinflunin, Vinorelbin, Vismodegib, Vorinostat, Yttrium-90~Glasmikrokugein, Zinostatin, Zinostatin-Stimalamer, Zoledronsäure, Zorubicin.

Darüber hinaus können die Verbindungen der voriiegenden Erfindung beispielsweise mit Bindern kombiniert werden, die beispielhaft an die folgenden Targets binden können: OX-40, CD137/4- 1BB, DR3, ID01/ID02, LAG-3, CD40.

Darüber hinaus können die erfindungsgemäßen Verbindungen auch in Kombination mit einer Strahlentherapie und/oder einer chirurgischen Intervention eingesetzt werden.

Generell können mit der Kombination von Verbindungen der vorliegenden Erfindung mit anderen, zytostatisch oder zytotoxisch wirksamen Agenzien folgende Ziele verfolgt werden: eine verbesserte Wirksamkeit bei der Verlangsamung des Wachstums eines Tumors, bei der Reduktion seiner Größe oder sogar bei seiner völligen Eliminierung im Vergleich zu einer Behandlung mit einem einzelnen Wirkstoff; die Möglichkeit, die verwendeten Chemotherapeutika in geringerer Dosierung als bei der Monotherapie einzusetzen; die Möglichkeit einer verträglicheren Therapie mit weniger Nebeneffekten im Vergleich zur Einzelgabe; die Möglichkeit zur Behandlung eines breiteren Spektrums von Tumorerkranlcungen; das Erreichen einer höheren Ansprechrate auf die Therapie; eine längere Überlebenszeit der Patienten im Vergleich zur heutigen Standardtherapie.

Darüber hinaus können die erfindungsgemäßen Verbindungen auch in Kombination mit einer Strahlentherapie und oder einer chirurgischen Intervention eingesetzt werden.

Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Arzneimittel, die mindestens eine erfindungsgemäße Verbindung, üblicherweise zusammen mit einem oder mehreren inerten, nichttoxischen, pharmazeutisch geeigneten Hilfsstoffen enthalten, sowie deren Verwendung z den zuvor genannten Zwecken.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können systemisch und/oder lokal wirken. Zu diesem Zweck können sie auf geeignete Weise appliziert werden, wie beispielsweise, parenteral, möglicherweise inhalativ oder als Implantat bzw. Stent.

Für diese Applikationswege können die erfindungsgemäßen Verbindungen in geeigneten Applikationsformen verabreicht werden.

Die parenterale Applikation kann unter Umgehung eines Resoiptionsschrittes geschehen (z.B. intravenös, intraarteriell, intrakardial, intraspinal oder intralumbal) oder unter Einschaltung einer Resorption (z.B. . intramuskulär, subkutan, intrakutan, perkutan oder intraperitoneal). Für die parenterale Applikation eignen sich als Applikationsformen u.a. Injektions- und Infusionszubereitungen in Form von Lösungen, Suspensionen, Emulsionen oder Lyophilisaten. Bevorzugt ist die parenterale Applikation, insbesondere die intravenöse Applikation.

Im Allgemeinen hat es sich als vorteilhaft erwiesen, bei parenteraler Applikation Mengen von etwa 0.001 bis 1 mg kg, vorzugsweise etwa 0.01 bis 0.5 mg kg Körpergewicht zur Erzielung wirksamer Ergebnisse zu verabreichen.

Trotzdem kann es gegebenenfalls erforderlich sein, von den genannten Mengen abzuweichen, und zwar in Abhängigkeit von Körpergewicht, Applikationsweg, individuellem Verhalten gegenüber dem Wirkstoff, Art der Zubereitung und Zeitpunkt bzw. Intervall, zu welchem die Applikation erfolgt. So kann es in einigen Fällen ausreichend sein, mit weniger als der vorgenannten Mindestmenge auszukommen, während in anderen Fällen die genannte obere Grenze überschritten werden muss. Im Falle der Applikation größerer Mengen kann es empfehlenswert sein, diese in melireren Einzelgaben über den Tag zu verteilen. BBeeiissppiieellee

DDiiee nnaacchhffoollggeennddeenn B Beeiissppiieellee eerrllääuutteerrnn ddiiee EErrfifinndduunngg.. DDiiee E Errfifinndduunngg iisstt nniicchhtt aauuff ddiiee BBeeiissppiieellee bbeesscchhrräännkktt..

DDiiee PPrroozzeennttaannggaabbeenn iinn ddeenn ffoollggeennddeenn TTeessttss uunndd BBeeiissppiieelleenn ssiinndd,, ssoofeferrnn nniicchhtt aannddeerrss aannggeeggeebbeenn,, GGeewwiicchhttsspprroozzeennttee;; TTeeiillee ssiinndd GGeewwiicchhttsstteeiillee.. LLöössuunnggssmmiitttteellvveerrhhäällttnniissssee,, VVeerrddüünnnnuunnggssvveerrhhäällttnniissssee uunndd KKoonnzzeennttrraattiioonnssaannggaabbeenn vvoonn f fllüüssssiigg//ffllüüssssiigg--LLöössuunnggeenn bbeezziieehheenn ssiicchh jjeewweeiillss aauuff ddaass VVoolluummeenn..

WWeennnn bbeeii VVeerrssuucchhssbbeesscchhrreeiibbuunnggeenn kkeeiinnee AAnnggaabbeenn bbzzggll.. eeiinneerr TTeemmppeerraattuurr ggeemmaacchhtt wweerrddeenn,, bbeeii ddeerr ddiiee RReeaakkttiioonn dduurrcchhggeettüürrhhii wwiirrdd,, iisstt v voonn RRaauummtteemmppeerraattuurr aauusszzuuggeehheenn..

Exemplarisch für die AusfQhrungsbeispiele sind in folgenden Schemata beispielhafte Synthesewege zu den Ausführangsbeispielen dargestellt:

Schema 20: Synthese von Cvstein-verknüpften ADCs

ja): beispielsweise Natriumtriacetoxyborhydrid, Essigsäure, DCM, RT; b) beispielsweise Acetoxyacetylchlorid, NE13, DCM, RT; c) beispielsweise LiOH, THF/Wasser, RT; d) beispielsweise H ₂ , Pd-C, EtOH, RT; e) beispielsweise Teoc-OSu, NEt3, Dioxati, RT; f) beispielsweise Frnoc-Cl, Diisopropylethylamin, Dioxan/Wasser 2: 1, RT]

[a): beispielsweise Benzylbromid, CS2CO3, DMF, RT; b) beispielsweise Pd(dppf Cl2, DMF, Na ₂ C0 ₃ , 85 °C: c) beispielsweise L1AIH4, THF, 0 °C; Mn0 ₂ , DCM, RT; d) beispielsweise Ti(iOPr THF, RT; e) beispielsweise tßuLi, THF, -78 °C; MeOH, NH4CI; f) beispielsweise HCl/1, 4-Dioxan]

chema 25: Synthese von Cy stein- verknüpften ADCs

Schema 26: Synthese von CysteLn-verknüpften ADCs über hydrolysierte Bernsteinsäureamide Dieses Verfahren wurde insbesondere bei ADCs mit LI = CH2 angewendet, um diese ADCs in die offenketüge Verknüpfungsform zu überführen.

[a): Natriumtriacetoxyborhydrid, Essigsäure, DCM, RT; b) Acetoxyacetylehlorid, Diisopropylethylamin, DCM, RT; c) LiOH, MeOH, RT; d) Triflxioressigsäure~l -(2-aminoethyl)- 1 H-pyrrol-2,5-dion (1 : 1 ) HATU, DMF, Diisopropylethylamin, RT; e) Zinkchlorid, Trifluorethanol, Ü°C. EDTA.l

II I

[a): HATU, DMF, Diisopropylethylamm, RT; b) Zmkchlorid, Trifluorethanol, 50°C, EDTA.] hema 29:

[a): Natriumtriaeetoxyborhydrid, Essigsäure, DCM, RT; b) Acetoxyacetylchlorid, Triethylamin, DCM, RT; c) LiOH, MeOH, RT; d) Influoressigsäure--l-(2-ainmoethyi)-lH-pym>i-2,5-dion (1 : 1) HATU, DMF, Diisopropylethylamin, RT; e) Zinkchlorid, Trifluorethanol, 50°C, EDTA.]

Schema 30:

[a): 2-Brom- i -ethyipyridinium-Tetrafluoroborat (BEP), DCM, Pyridin, RT; b) Zinkchlorid, Trifluorethanol, 50°C, EDTA; c) 3-4 Äquivalente TCEP, PBS Puffer; d) PBS Puffer, 20h RT.]

chema 31 :

[a): 2-Brom-l-ethylpyridinium-Tetrafluoroborat (BEP), DCM, Pyridin, RT; b) Zinkchlorid, Trifluoreihanol, 50°C, EDTA; c) 3-4 Äquivalente TCEP, PBS Puffer; d) PBS Puffer, 20h RT.]

Schema 32:

[a) beispielsweise Dimethyizmk, CyhexviMgCi, , THF, -78 °C; NH ₄ C1; b) beispielsweise HCl/1,4- Dioxan]

Schema 33:

la): Natriuratriacetoxyborhydrid, Essigsäure, DCM, RT; b) Acetoxyacetylchiorid, Trietbylamiti, DCM, RT; c) L-Csytein, NaHCOs, DBU, isopropanol/Wasser , RT; d) 3-Siilfenylpropansäitre, KaC03,RT; e) Linker, HATU, DMF, Diisopropyiethyiamin, RT; e) Zinkchlorid, Trifluorethanol, 50°C, EDTA.]

A. Beispiele

Abkürzungen und Akronvmei

A43iNS humane Tumorzelllinie

A549 humane Tumorzelllinie

A498 huinane Tumorzelllinie

ABCB1 ATP-binding cassette sub-family B member 1 (Synonym für P-gp

und MDR1)

abs. Absolut

Ac Acetyi

ACN Acetonitril

aq, wässrig, wässrige Lösung ATP Adenosintripnosphat

BCRP Brustkrebs-Resistenz-Protem, ein Efflux-Transporter

BEP 2-Brom- 1 - thylpyridinium-Teti-afluoroborat

Boe ieri. -Butoxyearbonyl

br. breit (bei NMR)

Bsp. Beispiel

ca. circa, ungefähr

CI chemische Ionisation (bei MS)

d Dublett (bei NMR)

d Tag(e)

DC Dünnschichtchromatographie

DCI direkte chemische Ionisation (bei MS)

dd Dublett von Dublett (bei NMR)

DMAP 4-A ^r ,A ^r -DiiTiethylarninopyridin

DME 1 ,2-Dimethöxy e than

DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium (standardisiertes Nähnnedium f r die Zellkultur)

DMF N.N-Dimethylformamid

DMSO Dimethylsulfoxid

DPBS, D-PBS, PBS Dulbecco's Phosphat-gepufferte Salz-Lösung

PBS = DPBS = D-PBS, pH7,4, Fa. Sigma, No D8537

Zusammensetzung:

0,2 g KCl

0,2 g KH2PO4 (anhyd)

8,0 g NaCl

1,15 g Na ₂ HPO,, (anhyd)

ad 1 1 mit H. _; 0 auffüllen

dt Dublett von Triplett (bei NMR)

DTT DL-Dithiothreitol

d. Th. der Theorie (bei chemischer Ausbeute )

EDC N - S-DimethylaininopiOpylViV-ethylcailxidiimid-Hydrochlorid

EGFR Epidermal growth factor receptor - Epidermaler Wachstumsfaktor

Rezeptor

EI Elektronenstoß-Ionisation (bei MS) ELISA Enzyme-linked. Immunosorbeiit Assay

eq. Äquivalent(e)

ESI Eleklxospray-Ionisation (bei MS)

ESI-MicroTofq ESI- MicroTofq (Name des Massenspektrometer mit Tof = Time Of

Fiight und q = Quadrapol)

PCS totales Kälberserum

Fmoc (9H-Fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl

ges. gesättigt

G TP Guano s in- 5 ' - trip ho s ph at

h Stunde(n)

HATU O-iT-Azabenzottiazol-l-y -NNN^N'-tetramethyluronixjm- hexafluorophosphat

HCT- 116 HumaneTumorzelllinie

REPES 4-(2-Hydroxyethyl)piperazir _! -l-ethar _! su]fonsäure

HOAc Essigsäure

HOAt I -Hydroxy-7-azabenzotriazol

HOB t 1 -Hydroxy- 1 H-benzotriazol-Hydrat

HOSu N-Hydroxysuccinimid

HPLC Hochdruck-, Hochleistungsflüssigchromatognaphie

HT29 humane Tumorzelllinie

IC so halbmaximale Inhibitionskonzentration

i.m. intramuskulär, Applikation in den Muskel

i.v. intravenös, Applikation in die Vene

konz. konzentriert

LC-MS Flüssigchromatographie-gekoppelte Massenspektrometrie

LLC-PKl-Zellen Lewis lung Carcinoma pork kidney cell iine

L-MDR Human MDR1 transfizierte LLC-PK1 Zellen

m Multiplett (bei NMR)

Me Methyl

MDR1 Multidrug resistence protein 1

MeCN Acetonitril

min Minute(n)

M S Mas s ensp ektrometrie

MTT 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2Ä-tetrazoliumbi mid ^» 17

NCI-H292 humane Tumorzelllinie

NCI-H520 humane Tumorzelllinie

NMM N-Me thy Imorpho lin

NMP N-M.etbyl-2-pyrrolidinon

NMR Kernresonanzspektrometrie

NMRI Mausstamm, Herkunft aus dem Naval Medical Research Institute

(NMRI)

Nude Mäuse Nacktmäuse (Versuchstiere)

NSCLC Non small cell lung cancer ( icht-kleiiizelliges Bronchialkarzinom) PBS Phosphat-gepufferte Salz-Lösung

Pd/C Pal ladium auf Aktivkohle

P-gp P-Glycoprotein, ein Transporterprotein

PNGaseF Enzym zur Zuckerabspaltung

quant. quantitativ (bei Ausbeute)

quart Quartett (bei Ni

quint Quintett (bei N

Rr Retentionsindex (bei DC)

RT Raumtemp eratur

R _t Retentionszeit (bei HPLC)

s Singulett (bei NMR)

s.c. subcutan, Applikation unter die Haut

SCC-4 Humane Tumorzelllinie

SCC-9 Humane Tumorzelllinie

SCID Mäuse Versuchsmäuse mit einem schweren kombinierten Immundefekt

(severe combined immunodeficiency)

Triplett (bei NMR)

TBAF T etra-n- buty 1 ammoniumfluorid

TEMPO (2,2,6,6-Tetrameihyl-piperidin- 1 -yI)oxyl

tert. tertiär

TFA Trifluoressigsäure

THF T etrahy dro furan

T3P ^® 2,4,6-Tripropyl-l ,3,5,2,4,6-trioxatriphosphinan-2,4,6-trioxid

UV Ultraviol ett-Spektrometrie

v/v Volumen zu Volumen -Verhältnis (einer Lösung) Z Benzyloxycarbonyl

786-0 humane Tumorzelllinie

HPLC- und LC-MS-Methoden:

Methode 3 (LC-MS):

Instrument: Waters ACQUITY SQD UPLC System; Säule: Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8 μ 50 I mm; Elueni A: 1 ί Wasser + 0.25 mL 99%ige Ameisensäure , Eluent B: 1 1 Acetonitril + 0.25 mL 99%ige Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 90% A --> 1.2 min 5% A 2.0 min 5% A Ofen: 50°C; Fluss: 0.40 mL/min; UV-Detektion: 208 - 400 nm.

Methode 2 (LC-MS):

Gerätetyp MS: Waters Synapt G2S; Gerätetyp UPLC: Waters Acquity I-CLASS; Säule: Waters, BEH300, 2.1 x 150 mm, C18 1.7 μιη; Eluent A: 1 1 Wasser + 0.01% Ameisensäure; Eluent B: 1 1 Acetonitril + 0.01 % Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 2% B— » 1.5 min 2% B— »· 8.5 min 95% B— » 10.0 mm 95% B; Ofen: 50°C; Fluss: 0.50 mL/min; UV-Detektion: 220 nm

Methode 3 (LC-MS):

Instrument MS: Waters (Micromass) QM: Instrument HPLC: Agilem 1 100 Serie; Säule : Agient ZORBAX Extend-C1 8 3.0x50mm 3.5-Micron; Eluent A: 1 1 Wasser + 0.01 mol Ammoniumcarbonat, Eluent B: 1 1 Acetonitril; Gradient: 0.0 min 98% A --> 0.2min 98% A — » 3.0 min 5% A- 4.5 min 5% A ; Ofen: 40°C; Fluss: 1.75 mL/min; UV-Detektion: 210 nm

Methode 4 (LC-MS):

Gerätetyp MS: Waters Synapt G2S; Gerätetyp UPLC: Waters Acquity I-CLASS; Säule: Waters, HSST3, 2.1 x 50 mm, C18 1.8 μιη; Eluent A: 1 1 Wasser + 0.01% Ameisensäure; Eluent B: 1 1 Acetonitril + 0.01% Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 10% ß -» 0.3 min 10% B -» 1.7 min 95% B --> 2.5 min 95% B; Ofen: 50°C; Fluss: 1.20 mL/min; UV-Detektion: 210 nm

Methode 5 (LC-MS):

Instrument: Waters ACQUITY SQD UPLC System; Säule: Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8 μ 50 x 1 mm; Eluent A: 1 1 Wasser + 0.25 mL 99%ige Ameisensäure , Eluent B: 1 1 Acetonitril + 0.25 ml, 99%ige Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 95% A — »· 6.0 min 5% A — » ^■ 7.5 min 5%) A Ofen: 50 ^c C; Fluss: 0.35 mL/min; UV-Detektion: 210 - 400 nm.

Methode 6 (LC-MS):

Instrument: Micromass Quattro Premier mit Waters UPLC Acquity; Saide: Thermo Hypersil GOLD 1.9 μ 50 x 1 mm; Eluent A: 1 1 Wasser + 0.5 ml, 50%ige Ameisensäure, Eluent B: 3 1 Acetomtril + 0.5 mL 50%ige Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 97% A --> 0.5 min 97% A --> 3.2 min 5% A ~- 4.0 min 5% A Ofen : 50°C: Fluss: 0.3 mL/min; UV-Detektion: 210 nm.

Methode 7 (LC-MS :

Instmment: Agilent MS Quad 6150;HPLC: Agilent 1290; Säule: Waters Acquity UPLC FISS T3 1.8 μ 50 2.1 mm; Eluent A: 1 3 Wasser + 0.25 mL 99%ige Ameisensäure , Eluent B: 1 1 Acetomtril + 0.25 mL 99%ige Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 90% A — > 0.3 min 90% A—> 1.7 min 5% A -» 3.0 min 5% A Ofen: 50°C; Fluss: 1,20 mL/min; UV-Detektion: 205 - 305 nm.

Methode 8 (LC-MS):

Gerätetyp MS: Waters Synapt G2S; Gerätetyp UPLC: Waters Acquity I-CLASS; Säule: Waters, HSST3, 2.1 x 50 mm, C18 1.8 μτη; Eluent A: 1 1 Wasser + 0.01 % Ameisensäure; Eluent B: 3 1 Acetonitril + 0.01% Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 2% B 2.0 min 2% B -» 13.0 min 90% B -- 15.0 min 90% B; Ofen: 50°C; Fluss: 1.20 ml/min; UV-Detektion: 210 nm

Methode 9: LC-MS-Prep Reinigungsmethode für die Beispiele 181-191 (Methode LIND-LC-MS- Prep)

Instrument MS: Waters, Instmment HPLC: Waters (Säule Waters X-Bridge C18, 19 mm x 50 mm, 5 μιη, Eluent A: Wasser + 0.05%) Ammoniak, Eluent B: Acetonitril (ULC) mit Gradient; Fluss: 40 ml/min; UV-Detektion: DAD; 210 - 400 nm). bzw. :

Instrument MS: Waters, Instrument HPLC: Waters (Säule Phenomenex Luna 5μ C18(2) 100A, AXIA Tech. 50 x 21.2 mm, Eluent A: Wasser + 0.05% Ameisensäure, Eluent B: Acetonitril (ULC) mit Gradient; Fluss: 40 ml/min; UV-Detektion: DAD; 210 - 400 n ). 20

Methode 10: LC-MS-Analytik-Melhode für die Beispiele 181-191 (LBSfD_SQD_SB_AQ)

Instrument MS: Waters SQD; Instrument HPLC: Waters UPLC; Säule: Zorbax SB-Aq (Agilent), 50 min x 2.1 mm, 1.8 μιη; Elueni A: Wasser + 0.025% Ameisensäure, Eiuent B: Acetonitril (ULC) + 0.025% Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 98%A - 0.9 min 25%A - 1.0 min 5%A - 1.4 min 5%A - 1.41 min 98%A - 1.5 min 98%A; Ofen: 40°C; Fluss: 0.600 ml/min; UV-Detektion: DAD; 210 nm.

Methode 11 iHPLO:

Gerät: HP1100 Serie

Säule: Merck Chromolith SpeedROD RP-18e, 50-4,6mm, Best.-

Nr.1.51450.0001, Vorsäule Chromolith Guard Cartridge Kit, RP-18e, 5-4,6mm, Best. -Nr. 1.51470.0001

Gradient: Flow 5mL/ Min

Injection Volume 5μί

Solvent A: HCL04 (70%ig) in Wasser (4mL/ 1)

Solvent B: Acetonitril

Start 20% B

0.50 Min 20% B

3.00 Min 90% B

3.50 Min 90% B

3.51 Min 20% B

4.00 Min 20% B

Säulentemperatur: 40°C

Wellenlänge: 21 Onm

Methode 12 (LC-MS MCW-FT-MS-Ml)

Gerätetyp MS: Thermo Scientific FT-MS; Gerätetyp UHPLC+: Thermo Scientific UitiMate 3000; Säule: Waters, HSST3, 2.1 x 75 mm, C18 1 .8 μπι; Eiuent A: 1 1 Wasser + 0.01% Ameisensäure; Eiuent B: 1 1 Acetonitril + 0.01% Ameisensäure; Gradient: 0.0 min 10% B --> 2.5 min 95%:- B --> 3.5 min 95% B; Ofen: 50°C; Fluss: 0.90 ml/min; UV-Detektion: 210 n / Optimum Integration Path 210-300 nm Methode 33: (MCW-QM-BAS1)

Instrument MS: Waters (Micromass) Quattro Micro; Instrument Waters UPLC Acquity; Säule : Waters BEH C18 1.7 μ 50 x 2.1 mm; Eluent A: 1 1 Wasser + 0.01 mol Ammoniumformiat, Eluent B: 1 1 Acetonitril; Gradient: 0.0 min 95% A -> 0.1 min 95% A -> 2.0 min 15% A -> 2.5 min 15% A-» 2.51 mm 10% A -- 3.0 min 10% A; Ofen: 40°C; Fluss: 0.5 ml/mm; UV-Detektion: 210 nm

Für alle Reaktanden oder Reagenzien, deren Herstellung im Folgenden nicht explizit beschrieben ist, gilt, dass sie von allgemein zugänglichen Quellen kommerziell bezogen wurden. Für alle übrigen Reaktanden oder Reagenzien, deren Herstellung im Folgenden ebenfalls nicht beschrieben ist und die nicht kommerziell erhältlich waren oder von Quellen bezogen wurden, die nicht allgemein zugänglich sind, ist ein Verweis auf die verö fentlichte Literatur angegeben, in der ihre Herstellung beschrieben ist.

Ausgangsverbindungen und Intermediate:

Intermediat C2 tert-Butyl-(2S)-4-({(l R)-l -[1-0βηζγ1-4-(2,5-<ϋί1αο Ιΐ6ηγ1)-1Η-ίιηϊ<ΐ3ζο1-2- dimethylpropyl}amino)-2-[(te -butoxycarbonyl)ammo]butanoat

4.22 g (14.5 mmol) tert-Butyl-N-(tert-butoxycarbonyl)-L-homoserinat wurden in 180 mL Dichlormethan gelöst und dann mit 3.5 mL Pyridin sowie mit 9.2 g (21.7 mmol) 1,1,1 -Triacetoxy- 1 iambda ⁵ ,2-benziodoxol-3( 1 H)-on versetzt. Der Ansatz wurde 1 h bei RT gerührt, anschließend mit 500 mL Dichlormethan verdünnt und zweimal mit 10%-iger Natriumtiosulfatlösung und dann nacheinander zweimal mit 5%-iger Zitronensäure und zweimal mit 1 0%~iger Natriumhydrogencarbonatlösung ausgeschüttelt. Die organische Phase wurde abgetrennt, über Magnesiumsulfat getrocknet und anschließend im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde in DCM aufgenommen und mit einer Mischung aus Diethylether und n-Pentan versetzt. Der Niederschlag wurde abfiltriert und das Filtrat anschließend einggengt und aus Acetonitril/Wasser lyophilisiert. Es wurden 3.7 g (93%) tert-Buryl-(2S)-2-[(tert-butoxycarbonyl)amino]-4-oxobutanoat erhalten, die ohne weitere Reinigung in die nächste Stufe eingesetzt wurden. (Rf-Wert: 0.5 (DCMy'Methanol 95/5).

3.5 g (9.85 mmol) von Intermediat Cl wurden in 160 mL DCM gelöst und mit 3.13 g (14.77 mmol) Natriumtriacetoxyborhydrid sowie mit 0.7 mL Essigsäure versetzt. Nach 5 min Rühren bei RT wurden 3.23 g (11.85 mmol) tert-Butyl-(2S)-2-f(tert-butoxycarbonyl)amino]-4-oxobutanoat zugegeben und der Ansatz weitere 30 min bei RT gerührt. Dann wurde das Lösunsgmittel im Vakuum eingedampft und der Rückstand in Acetonitril/Wasser aufgenommen. Der ausgefaliene Feststoff wurde abfiltriert und getrocknet und man erhielt 5.46 g (84%) der Titelverbindung.

HPLC (Methode 1 1): R _t = 2.5 min: LC-MS (Methode 1): R _t = 1.13 min; MS (ESIpos): m/z = 633 (M+H) ⁺ .

Injjg medfetjCll

R/S-( 11 - { ( 1 R)-l -[ 1 -Benzyl-4-( 2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimelhylpropyl} -2,2- dimethyl-6,12-dioxo-5-oxa-7,l l <liaza-2~silatridecan-13-yl)-homocystein~trifhioressigsä ure(l : 1 )

990.0 mg (2.79 mmol) (lR)-! -[l -Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-l H-pyTrol-2-y]]~2,2- dimethylpropan-l -amin wurden in 15.0 L Dichlormethan vorgelegt und mit 828.8 mg (3.91 mmol) Natriumtriaeetoxyborhydrid und 129.9 mg (3.21 mmol) Essigsäure versetzt und 5 min bei RT grührt. Es wurden 698.1 ing (3.21 mmol) 2-(Trimethylsilyl)ethyi-(3-oxopropyl)carbamat (Intermediat L58) gelöst in 15.0 mL Dichlormethan zugegeben und die Reaktionsmischung über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethyiacetat verdünnt und die organische Phase je zweimal mit ges. Natrimncarbonat-Lösimg und ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittels Kieseigel (Laufmittel: Dichiormethan/Methanoi 100:2) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 1 .25 g (73 % d. Th.) der Verbindung 2-(Trimethylsiiyl)ethyl-[3~( {(l R)~l - [l -benzyl-4-(2,5-difluo henyl)-lH-p rrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}amino)propyl]carbamat. LC-MS (Methode 1 ): R _t = 1.09 min; MS (ESIpos): m/z = 556 (M+H) ⁺ . 400.0 mg (0.65 mmol) 2-(Trtmethylsilyl)ethyl-[3-({( 1 R)-l -[l-benzyl■ ■(2,5-difluoφhenyl)-lH- pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}amino)propyl]carbamat wurden mit 151.4 mg (1.5 mmol) Triethylamin und mit 161.6 mg (1.43 mmol) Chloracetylchlorid versetzt. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat versetzt und die organische Phase dreimal mit Wasser und einmal mit ges. NaCl-Lösung gewaschen. Es wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittels Kieselgel (Laufmittel: Cyclohexan/Ethylacetat 3:1) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 254.4 mg (57 % d. Th.) der Verbindung 2-(Trimethylsilyl)ethyl-{3-[{(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluo� �henyl)-l H- pyiTol-2-yl]-2,2-diinethylpropyl}(chloracetyl)amino]pi pyi}carbamat.

LC-MS (Methode 1): R _t = 1.49 min; MS (ESIneg): m/z - 676 (M+HCOOy.

1 17.4 mg (0.19 mmol) 2-(Tmnethylsilyl)ethyl- {3-[ {(lR) -[l-benzyl-4-(2 iifluorphenyl)-lI-I- pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}(chloracetyl)ammo]propyl}car bamat wurde in 10.0 mL Isopropanol gelöst und mit 928.4 μΕ IM NaOH und 50.2 mg (0.37 mmol) DL-Homocystein versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 4.5 h bei 50 °C gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat versetzt und die organische Phase mit ges. Natriumhydrogencarbonat-Lösung und ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittles präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosii 250x40: 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1 % TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 75.3 mg (48 % d. Th.) der Titelverbindung.

LC-MS (Methode 1): R _t = 1.24 min; MS (ESIpos): m/z = 731 (M+H) ⁺ .

Ή-NMR (400 MHz, DMSO-ds): δ [ppm] - 0.03 (s, 9H), 0.40 (m, 1H), 0.75-0.91 (m, 11H), 1.30 (m, 1H), 1.99-2.23 (m, 2H), 2.63-2.88 (m, 41 I i. 3.18-3.61 (m, 5H), 3.79-4.10 ( , 3H), 4.89 (d, 1H), 4.89 (d, 1H), 5.16 (d, 1H), 5.56 (s, 1H), 6.82 (m, 1H), 6.91 (s, 1H), 6.97 (m, 1H), 7.13-7.38 (m, 6H), 7.49 (s, 1H), 7.63 (m, 1 H), 8.26 (s, 3H). 125

R/S-[(8S)-11 - {( I R)- 1 -[ 1 -Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yi]-2,2-dimethylpropyl } -8- carboxy-2,2-dimeih l-6, 12-dioxo-5-oxa-7, 1 i -diaza-2-silatridecan-l 3-yl]homocystein

Die Synthese erfolgte in Analogie zur Synthese von Intennediat Cl 1 mit

Methyl-(2S)-4-oxo-2-({[2-(trimethylsiiyl)ethoxy]carbonyl}ami no)butanoat (Intennediat L57) und Intermediat C52 als Edukten.

LC-MS (Methode 1): R, = 1.18 min; MS (ESIpos): m z = 775 (M+H) ⁺ . jjitgrmedtot_C52

( 1 R)- 1 - [ 1 ~ßenzyl~4-(2,5~difluoiphenyl)- 1 H-pyrroI-2-yl]-2,2-dimethylpropati- 1 -amiti

10.00 g (49.01 mmol) Methyl-4-brom-lH-pyrrol-2-carboxylat wurden in 100.0 mL DMF vorgelegt und mit 20.76 g (63.72 mmol) Cäsiumcarbonat und 9.22 g (53.91 mmol) Benzylbromid versetzt. Die Reaktionsmischung rührte über Nacht bei RT. Die Reaktionsmischung wurde zwischen Wasser und Ethylacetat verteilt und die wässrige Phase mit Ethylaeetat extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Ansatz wurde mit 90.0 g Methyl-4-brom-lH-pyrrol-2-carboxylat wiederholt.

Die Reinigung der vereinigten beiden Ansätze erfolgte mittles präp. RP-HPLC (Säule: Daiso

300x100; 10μ, Fluss: 250 mL/min, MeCN/Wasser). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 125.15 g (87 % d. Tb.) der

Verbindung Methyl-l -benzyl-4-brom-lH-pyrrol-2-carboxylat.

LC-MS (Methode 1 ): R, = 1.18 min; MS (ESIpos): m/z = 295 [M+H] ⁺ .

Unter Argon wurden 4.80 g (16.32 mmol) Methyl- i -beazyl-4-brom-lH-pyrrol-2-earboxylat in DMF vorgelegt und mit 3.61 g (22.85 mmol) (2,5-Difluorphenyl)boronsäure und 19.20 mL ges. Natriumcarbonat-Lösung und 1.33 g (1.63 mmol) [l ,T-Bis-(diphenylphosphino)-ferrocen]- dichio;^3aiIadium(il):Dic]ilormethan versetzt. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei 85 °C gerührt. Die Reaktionsmischung wurde über Celite filtriert und der Fiiterkuchen mit Ethylaceiat gewaschen. Die organische Phase wurde mit Wasser extahiert und dann mit ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittei im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittels Kieselgel (Laufmittel: Cyclohexan/Ethylacetat 1 00:3) gereinigt. Die Lösemittei wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 3.60 g (67 % d. Th.) der Verbindung Methyl- 1 -benzyl-4- (2,5-difluorphenyi)-l H-pyiToi-2-carboxylat.

LC-MS (Methode 7): Rt = 1.59 min; MS (ESIpos): m/z = 328 | \M ! | .

3.60 g (11.00 mmol) Methyl- i -benzyi-4-(2,5-difluoiphenyl)-lH-pyrroi-2-carboxyiat wurden in 90.0 mL TFIF vorgelegt und bei 0 °C mit 1.04 g (27.50 mmol) Lithiumaluminiumhydrid (2.4 M in THF) versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 30 Minuten bei 0 °C gerührt. Es wurde bei 0 °C ges. Kaliumnatriumtartrat-Lösung zugegeben und die Reaktionsmischung mit Ethylaceiat versetzt. Die organische Phase wurde dreimal mit ges. Kaliumnatriumtartrat-Lösung extrahiert. Die organische Phase wurde einmal mit ges. NaCI-Lösung gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösemittel wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand in 30.0 mL. Dichlormethan gelöst. Es wurden 3.38 g (32.99 mmol) Mangan(IV)oxid zugegeben und 48 h bei RT gerührt. Es wurden nochmals 2.20 g (21.47 mmol) Mangan(IV)oxid zugegeben und über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde über Celite filtriert und der Filterkuchen mit Dichlormethan gewaschen. Das Lösemittel wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand 2.80 g (l -Benzyl-4-(2,5- difluoiphenyl)-lH-pyrrol-2-carbaldehyd) wurde ohne weitere Reinigung in der nächsten Synthesestufe eingesetzt.

LC-MS (Methode 7): R _t = 1.48 min; MS (ESIpos): m/z = 298 [M+Hf. 28.21 g (94.88 mmol) 1 -Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyixol-2-carbaldehyd wurden zusammen mit 23.00 g (189.77 mmol) (R)-2-Meihylpropan-2-sulfinamid in 403.0 mL absol. THF vorgelegt und mit 67.42 g (237.23 mmol) Titan(IV)isopropylat versetzt und über Nacht bei RT gerührt. Es wurden 500.0 mL ges. NaCl-Lösung und 1000.0 mL Ethylacetat zugegeben und 1 h bei RT gerührt. Es wurde über Kieselgur filtriert und das Filtrat zweimal mit ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die org. Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemitte] wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand wurde mittels Biotage Isolera gereinigt (Kieselgel, Säule 1500+340 g SNAP, Fluss 200 mL/min, Ethylaeetat/Cyelohexan 1 : 10).

LC-MS (Methode 7): R, = 1.63 mm; MS (ESIpos): m z = 401 [M+H] ^1' .

25.00 g (62.42 mmol) (R)-N-{(E/Z)-[1-Ben^

methylpropan-2-sulfinamid wurden in absol. THF unter Argon vorgelegt und auf -78 °C abgekühlt. Dann wurden 12.00 g (187.27 mmol) tert.-Butyllithium (1 .7 M Lösung in Pentan) bei -78 °C zugegeben und 3 h bei dieser Temperatur gerührt. Dann wurden bei -78 °C 71.4 mL Methanol und 214.3 mL ges. Ammoniumchlorid-Lösung nacheinander zugegeben und die Reaktionsmischung wurde auf RT kommen lassen und 1 h bei RT gerührt. Es wurde mit Ethylacetat verdünnt und mit Wasser gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel wurde im Vakuum verdampft. Der Rückstand (R)-N-{(1R)-1-[1 -Benzyl-4-(2,5- difluoφhen l)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}-2-methylpropan-2-sulf lnamid wurde ohne weitere Reinigung in der nächsten Synthesestufe eingesetzt.

LC-MS (Methode 6): R, = 2.97 min; MS (ESIpos): m z = 459 [M+H] ⁺ .

28.00 g (61.05 mmol) (R)-N-{(lR)-l -[l-Benzyl-4-(2,5-difluo henyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} -2-memylpropan-2-sulfmamid wurden in 186.7 L 1,4-Dioxan vorgelegt und dann mit 45.8 mL HCl in 1,4-Dioxan-Lösung (4.0 M) versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 2 h bei RT gerührt und das Lösemittel wurde im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittles präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Kinetix 100x30; Fluss: 60 mL min, MeCN/Wasser). Das Acetonitril wurde im Vakuum verdampft und der wässrige Rückstand wurde mit Dichlormethan versetzt. Die organische Phase wurde mit Natiiumhydrogencarbonat-Lösung gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösemittel wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand wurde im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 16.2 g (75 % d. Th.) der Titelverbindung.

LC-MS (Methode 6): R, = 2.10 min; MS (ESIpos): m z = 338 [Μ~ΝΗ ₂ Γ, 709 [2M+H] ⁺ . Ή-NMR (400 MHz, DMSO-ds): δ [ppm] = 0.87 (s, 9H), 1.53 (s, 2H), 3.59 (s, 1H), 5.24 (d, 2H), 6.56 (s, 1 H), 6.94 (m, !H), 7.10 (d, 2H), 7.20 (m, 3 H), 7.26 (m, 2H), 7.34 (m, 2H), 7.46 (m, 1H).

Intermediat€53

(2S)-4-[{(lR) -[l-BenzyM-(2,5-difl^^^

dimemylpropyl}(glyeoloyl)amino -2- {[(9H-flu^

Zunächst wurde Intermediat C52 mit BenzyI-(2S)-2-{[(be!izyloxy)carbonyl]amino}-4-oxobutarioat in Analogie zu Intermediat C2 reduktiv alkyliert. Anschließend wurde die sekundäre Aminogruppe mit 2-Chlor-2-oxoethylacetat wie in Intermediat C27 beschrieben acyliert und schließlich mit 2M Lithiumhydroxidiösung in Methanol die Hydrolyse der beiden Estergruppen durchgerührt. Das so erhaltene Intermediat wurde in Ethanol gelöst, mit Palladium auf Kohle (10%ig) versetzt und bei RT mit Wasserstoff unter Normaldruck 1 h hydriert. Die entschützte Verbindung wurde in Dioxan/Wasser 2:1 aufgenommen und mit 9H-Fluoren-9-ylmethylchlorocarbonat in Gegenwart von Ν,Ν-Diisopropyiethylamm wurde im letzten Schritt die Fmoc-Schutzgruppe eingeführt.

LC-MS (Methode 1): R, = 1.37 min; MS (ESIpos): m/z = 734 (M-H) ^" . IntertnedfciLC54

N-[(2S)-4-[{(lR) -[l-Benzyl-4-(2,5-difl^^^

(glycoloyl)amino] -2- {[(9H-fl ren-9-ylmethoxy)carbonyl]amino}butanoyl]-beta-alanm

Zunächst wurde Intermediat C52 mit Benzyl-N-[(2S)-2-{[(benzyloxy)carbonyl]amino} -4- oxobutarjoyl]-beta-alaninat in Analogie zu intermediat C2 reduktiv alkyliert. Anschließend wurde die sekundäre Aminogruppe mit 2-Chlor-2-oxoelhylacetat wie in Intermediat C27 beschrieben acyliert. Das so erhaltene intermediat wurde in Methanoi gelöst, mit Palladium auf Kohle (10%ig) versetzt und bei RT mit Wasserstoff unter Normaldruck 1 h hydriert. Anschließend wurde mit 2M Lithiumhydroxidlösung in Methanol die Hydrolyse der Estergruppe durchgeführt. Die entschützte Verbindung wurde in Dioxan/Wasser 2: 1 aufgenommen und mit 9H-Fluoren-9- ylmethylchiorocarbonat in Gegenwart von Ν,Ν-Diisopropylethylamin wiirde im letzten Schritt die Fmoc-Sehutzgruppe eingeführt. Es wurden 48 mg der Titel Verbindung erhalten.

LC-MS (Methode 1): R _t = 1.38 min; MS (ESIpos): m/z = 807 (M+H) ⁺ .

Intermediat C58

(2S)-4-[{(l R)-l -[l-Benzyl-4-(2,5-difluo henyl)-lH- yτrol-2-yl]-2,2-dimeΐhyl ro yl}(glyc■oloyl) aimno]-2-({[2-(1ximethylsilyl ethoxy]carbonyl}ainino)butansäure

Zunächst wurde Intermediat C52 mit Benzyi-(2S)-2-{[(benzyioxy)earbonyl]amino}-4-oxobutanoat in Analogie zu Intermediat C2 reduktiv alkyliert. Anschließend wurde die sekundäre Aminogruppe mit 2-Chlor-2-oxoethylacetat wie in Intermediat C27 beschrieben acyliert und schließlich mit 2M Lithiumhydroxidlösung in Methanol die Hydrolyse der beiden Estergruppen durchgeführt. Das so erhaltene Intermediat wurde in Ethanol gelöst, mit Palladium auf Kohle (10%ig) versetzt und bei RT mit Wasserstoff unter Normaldruck 1 h hydriert.

500 mg (0.886 mmol) von diesem vollständig entschützten Intermediat wurden in 60 ml Dioxan aufgenommen und mit 253 mg (0.975 mmol) l-({[2-(Trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl}oxy) pyrrolidin-2,5-dion sowie 198 Triethylamin versetzt. Nach 24 h Rühren bei RT wurde der Ansatz eingeengt, und der Rückstand durch präparative HPLC gereinigt. Nach Vereinigung der entsprechenden Fraktionen, Einengen im Vakuum und Trocknen im Hochvakuum wurden 312 mg (50% d.Th.) der Titel Verbindung erhalten.

LC-MS (Methode 5): = 4.61 min; MS (ESIpos): m/z 658 (M+H)\ Intermediat C59

rnelhoxypropanoyl]amino)-2-{ -fliioren-9-ylmethoxy)carbonyl]amino

Zunächst wurde die sekundäre Aminogruppe von Benzyl-(2S)-4-({(lR)-l -[l-benzyl-4-(2,5- άίΑυοφη6Γ ί)-!Η-ρνΓΓθ1-2-ν1]-2,2-™

butanoat mit (2S)-2-Methoxypropanoylchlorid (Zwischenstufe aus intermediat C53) in Gegenwart von Triethyiamin wie in Intermediat C53 beschrieben acviiert. Das erhaitene Intermediat wurde in Ethanoi aufgenommen, mit Palladium auf Kohle ( 10%ig) versetzt und bei RT mit Wasserstoff unter Normaldruck 1 h hydriert. Die entschützte Verbindung wurde in Dioxan/Wasser 2:1 aufgenommen und mit 9H-Fluoren-9-ylmelhylchlorocarbonat in Gegenwart von N,N- Diisopropyleihyiamm wurde im letzten Schritt die Fmoc-Schutzgruppe eingeführt.

LC-MS (Methode 1): R, = 1.39 min; MS (ESIpos): m/z = 764 (M-H)\

Intermedia! C6Ö

(2S)-4-({(lR 1 -[1-Β6ηζγΜ-(2,5-ώΑ«θφΗβηγ1) Η-ρ^ο1-2-γ1]-2,2·4ϊηιβ 1ρΓοργ1} [(2S)-2- me1lioxypropimoyl]ammo)-2-{[(9H-fluoren-9-ylme1hoxy)citrbony l]ammo}butaiisäiire

Die Synthese erfolgte in Analogie zu Intermediai C53.

LC-MS (Methode 1): R _t = 1.41 mm; MS (ESIpos): m/z = 750 i M I I ) .

Intermediat C61

N-[(2S)-4-[{(lR)-l -[ l-Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH-pyrrol-2-yi]-2,2- dimethylpropyl } (glycoloyl)amino]-2-( { [2 -(trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl} amino)butanoyl]-beta- alanin

Die Titelverbindung wurde durch Kupplung von 60 mg (0.091 mmol) Intermediat C58 mit ß- Alaninmethylester und anschließender Esierspaltung mit 2m Lithiumhydroxidlösung hergesteilt. Es wurden 67mg (61 % d.Th.) der Titelverbindung über 2 Stufen erhaiten.

LC-MS (Methode 1): R _t = 1.29 min; MS (ESIpos): m/z = 729 (M+H) ⁺ .

34

Intermediat C62

N-[(2S)-4-[{(lR)-l-[l-Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH-pyr rol-2-yi]-2,2- dimethylpropyl } (glycoloyl)amino]-2- { { [2 -(trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl}amino)butanoyl]-D- alanin

Die Titelverbindung wurde in Analogie zu Tntermediat C61 aus Intermediat C58 und Methyl-D- alaninat hergestellt.

LC-MS (Methode 1): R _t = 1.32 min; MS (ESIpos): m/z = 729 (M+H) ⁺ .

Intermediat C64

Trifluoressigsäure --2-(trimethyisiiyi)ethyl-{(2^

(2,5-difluo^henyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dime1hylpropyl}(glyco loyl)ammo]-l-oxobutan-2- yl } carbamat (1 :1)

Die Titelverbindung wurde ausgehend von Intermediat C58 in Analogie zu Intermediat C63 hergesteilt.

HPLC (Methode 11): R, = 2.4 min;

LC-MS (Methode 1): R. _t = 1.01 min; MS (ESIpos): m/z = 700 (M+H) ⁺ .

Intgrtn ijiLC65

(glycoloyl)amino]em l} -2,2-dimetbyl-6, l l-dioxo-5-oxa-7,10-dtaza-2-stlatetradecan-14-säure

215 mg (0.59 mmol) von Intermediat L66 wurden in 25 mL Diehlormethan vorgelegt, und mit 377 mg (0.89 mmol) Dess-Martin Periodinan und 144 μί. (1.78 mmol) Pyridin versetzt. Man rührte 30 min bei RT. Anschließend wurde der Ansatz mit 300 ml Diehlormethan verdünnt und die organische Phase je zweimal mit 10%iger a ₂ S203-Lösung, 10%iger Citronensäure-Lösung und ges. Nairiumhydrogencarbonat-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsuifat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum abgedampit. Man erhielt 305 mg des Aldehyds, der ohne weitere Reinigung umgesetzt wurde.

375 mg (0.49 mmol) von Intermediat C52 wurden in 50 ml Diehlormethan gelöst und mit 147mg (0.69 mmol) Natriumtriacetoxyborhydrid sowie 32.5 μL Essigsäure versetzt. Nach 5 min Rübren bei RT wurden 214 mg (0.593 mmol) vom oben beschriebenen Aldehyd hinzugegeben und der Ansatz über Nacht bei RT gerührt. Dabei ist anstehe erwarteten Produktes 2-(Trimethy!silyl)ethyl- [(2S)-4-( { ( 1 R)- 1 - [ 1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl] -2,2-dimethylpropy 1} amino)- 1 - (2,5-dioxopyrroiidm-l-yi)butan-2-yl]carbamat entstanden. Da auch dieses Imid sich weiter zur Titelverbindung umsetzen lassen sollte, wurde der Ansatz eingeengt und der Rückstand durch präparative HPLC gereinigt. Nach Vereinigung der entsprechenden Imid-enthaltenden Fraktionen wurde das Lösungsmittel im Vakuum abgedampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. So wurden 195 mg (58%) des oben benannten Imids erhalten.

LC-MS (Methode 5): R, = 3.32 min; MS (ESIpos): m/z = 667 (M+H) ⁺ . 65 mg (97.5 μηιοί) dieses Imids wiirden in 15 ml Dichlormethan aufgenommen und mit 367 μΙ> (3.4 mmol) Acetoxyacetylchlorid sowie 595 μϋ NN-Diisopropyiethylamin versetzt. Nach 30 min Rühren bei RT wurde der Ansatz ohne Erwärmung im Vakuum eingeengt und der Rückstand durch präparative HPLC gereinigt. Die entsprechenden Fraktionen wurden vereinigt und nach Abdampfen der Lösungsmittel und Trocknung im Hochvakuum verblieben 28 mg (37% d. Th.) (8S) 1 - l i- i - ^; ! -Benzyl-4-(2,5-diflu<Hphenyl)- lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}-8-[(2,5- dioxopyrrolidin-1 -yl)methyl]-2,2~dimethyl~6,l 2-dioxo-5-oxa-7,l 1 -diaza-2-silatridecan-13-yl- acetat.

LC-MS (Methode 1): R, = 1.44 min; MS (ESIpos): m/z = 767 (M+H) ⁺ .

28 mg (37 μηιοΐ) von diesem Intermediat wurden in 3 mL Methanoi gelöst und mit 548 μΙ> einer 2M Li&iumhydroxidlösung versetzt. Nach 10 min Rühren bei RT wurde der Ansatz mit Trifluoressigsäure auf pH 4 gebracht und dann eingeengt. Der Rückstand wurde durch präparative HPLC gereinigt. Nach Vereinigung der entsprechenden Fraktionen, Abdampfen des Lösungsmittels und Trocknung des Rückstandes im Hochvakuum wurden 26 mg (96% d. Th.) der Titelverbindung als weißer Feststoff erhalten.

LC-MS (Methode 1): R _t = 1.33 min; MS (ESIpos): m/z = 743 (M+H) ⁺ .

Intgrtn ijiLC66

2-(Trimethylsilyl)ethyl- [(2S)-4- [ { ( 1 R)- 1 -[ 1 -benzyl-4-(2,5-difluoφhen l)- 1 H-pyrrol-2-yl ]-2,2- dimethylpropyl} lycoloyl)amino]-l -{[2^

Zuächst wairde aus N-[(benzyloxy)carboi!yl]glycin und tert-Butyl (2-aminoethyl)carbamat nach klassischen Methoden der Peptidchemie (HATU-Kupplung und Boc-Spaltung) Trifluoressigsäure - benzyl- {2-[(2-aminoe1hyl)am!no]-2-oxoethyi } carbamat (l : i) hergestellt,

13 mg (0.036 mmol) von diesem Intermediat sowie 25 mg (0.033 mmol) von Intermediat C58 wurden in 3 mL DMF aufgenommen und mit 19 mg (0.05 mmol) HATU und 17 μΐ Ν,Ν- Diisopropylethylamin versetzt. Nach 10 min Rühren bei RT wurde eingeengt und der Rückstand durch präparative HPLC gereinigt. Es wurden 17.8 mg (60% d. Th.) der Zwischenstufe erhalten. LC-MS (Methode 1): R. _t = 1.36 min; MS (ESIpos): m/z = 891 (M+H) ⁺ .

17 mg (0.019 mmol) dieser Zwischenstufe wurden in 10 ml Ethanol gelöst, mit Palladium auf Kohle (10%ig) versetzt und bei RT mit Wasserstoff unter Normaldruck 2 h hydriert. Der Katalysator wurde abfiltriert, die Lösemittel im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Es wurden 9 mg (62% d. Th.) der Titelverbindung erhalten.

LC-MS (Methode 1): R _t = 1.03 min; MS (ESIpos): m/z = 757 (M+H) ^1' . IntermgdjaJ !^

9Η-Ρ1αοΓ6η-9-γ^ε 1-[3-( {( Κ)-1 -[1- 6ηζγ1-4-(2,5-(1ίΑαο 1ΐ6ηγ1)-1Η-ρ ττο1-2-γ1]-2,2- dimethylpropyl amino)propyl] earbamat

605.3 mg (1 .71 mmol) (lR)-l -[l -Beiizyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH-p rrol-2-yl]-2,2- dtmethylpropan-1 -amin (Intermediat C52) wurden in 10.0 mL Diehlormethan vorgelegt und mit 506.7 mg (2.39 mmol) Natriumtriacetoxyborhydrid und 1 17.9 mg (1 .96 mmol) Essigsäure versetzt und 5 min bei RT grührt. Es wurden 580.0 mg (1.96 mmol) 9H-Fluoren-9-ylmethyl-(3- oxopropyl)carbamat (intermediat L70) gelöst in 10.0 ml, Dieblormethan zugegeben und die Reaktionsmischung über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat verdünnt und die organische Phase je zweimal mit ges. Natriumcarbonat-Lösurig und ges. NaCl- Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittels Kieselgel (Laufmittei: Cyclohexan/Ethylacetat 3 :1) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 514.7 mg (46 % d. Th.) der Titelverbindung. LC-MS (Methode 1): = 1.10 min; MS (ESIpos): m/z = 634 (M+H) ⁺ .

11 - {( 1 R)- 1 -[ 1 -Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyiTol-2-y 1] -2,2-dimethylpropyl} -2,2-dimethyl- 6, 12-dioxo-5-oxa- 14-i ia-7 1 l-diaza-2-silaheptadecan- i 7-säure

3 17.0 mg (0.19 mmol) (2-(Trimethylsilyl)ethyl- {3-[{(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH- p TiOl-2-y]]~2,2-diiriethylpropyl}(chloracetyI)amino]propy]}ca rbamai (Ititermediat C70) und 21 .6 mg (0.20 mmol) 3-Sulfanylpropansäure wurden in 3.0 L Methanol vorgelegt und mit 89.5 mg (0.65 mmol) Kaliumcarbonat versetzt und 4 h bei 50 °C gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethyiacetat verdünnt und die organische Phase wurde mit Wasser und ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Der Rückstand wurde ohne weitere Reinigung in der nächsten Synthesestufe eingesetzt. Man erhielt 106.1 mg (73 % d. Th.) der Titelverbindung.

LC-MS (Methode 1): R _t = 1.42 min; MS (ESIneg): m/z - 700 (M-H)\

Intgrtn ijiL TO

(2 Trime lsil l)e l- {3 {(lR) 1-benzyl-4 2,5-difluoφhenyl) H-p ΓΓol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}(chloracetyl)amino]propyl}carbamat

908.1 mg (1.63 mmol) 2-(Trimethylsilyl)ethyl-[3-(ί(lR)- -[l-benzyl-4-(2,5-difluo herlyl)-lH- pyrroi-2-yl]-2,2-dimethy3propyl}amino)propyl]carbamat (siehe Synthese Intermediat Ci l) und 545.6 mg (5.39 mmol) Tnetiiylamin w nde in 10.0 mL Dichlormethan vorgelegt und auf 0 °C abgekühlt. Bei dieser Temperatur wurden 590.5 mg (5.23 mmol) Chioracetylchlorid zugegeben und über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylaeetat verdünnt und die organische Phase wurde je dreimal mit ges. NatriumhydiOgencarbonat-Lösung und ges. Ammoniumehlorid-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde mit ges. NaCl-Lösung gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Der Rückstand wurde mittels präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 L/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 673.8 mg (65 % d. Th.) der Titelverbindung.

LC-MS (Methode 1): R, = 1.53 min; MS (ESIneg): m/z = 676 (M+HCOO ^" ) ^" . Intgrtn foL Tl

S-(l l-{(lR) -[l-Benzyl-4-(2,5-difluo^

6, 12-dioxo-5-oxa-7, 1 1 -diaza-2-silatridecan- 13 -yi)-L-cystein-trifluoressigsäure (1 :1)

536.6 mg (4.43 mmol) L-Cystein wurden in 2.5 mL Wasser zusammen mit 531.5 mg (6.33 mmol) Natriumhydrogencarbonat suspendiert. Dazu wurden 400.0 mg (0.63 mmol) (2- (Trime lsilyl)e l-{3-[{^

dimethylpropyl}(ehloracetyl)amino]piOpyi}carbamat (Intermediat C70) gelöst in 25.0 mL iso- Propanol und I . I 6 g (7.59 mmol) l,8-Diazabicyclo(5.4.0)undec-7-en gegeben. Die Reaktionsmischung wurde 1.5 h bei 50 °C gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat versetzt und die org. Phase wurde mehrmals mit ges. Nalriumhydrogencarbonat-Lösimg und einmal mit ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Der Rückstand wurde mittels präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL min, MeCN/Wasser, 0.1 % TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 449.5 mg (86 % d. Th.) der Titelverbindung.

LC-MS (Methode 1): R _t = 1.20 min; MS (ESIpos): m/z = 717 (M+H) ⁺ . (9S)-9-{[ {(lR)- l-[l -Benzyl-4-(2,5-difluorphe

amiriojmethyl}-2,2-dimeth l-6, l i -dioxo-5-oxa-7, 10-diaza-2-silatetradecaQ-l 4-säure

90 mg {0.212 mmol) von Intermedia! L72 wurden in 6 mL Dichiormethan vorgelegt und mit 86 μΐ _^ ( 1.06 mmol) Pyridin sowie 135 mg (0.318 mmol) D es s -Marl; in Periodinan versetzt. Man rührte 30 min bei RT. Anschließend wurde der Ansatz mit 30 ml Dichiormethan verdünnt und die organische Phase zweimal mit 10%iger und einmal mit 5%iger Citronensäure-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakmun abgedampft. Der so erhaltene Aldehyd wuixle ohne weitere Reinigung umgesetzt.

63 mg (0.177 mmol) von Intermediat C52 wurden in 15 ml Dichiormethan gelöst und mit 52.4 mg (0.247 mmol) Natriuintriacetox borbydrid sowie 20.2 [iL Essigsäure versetzt. Nach 5 min Rühren bei RT wurden 89.6 mg (0.212 mmol) vom oben beschriebenen Aldehyd hinzugegeben und der Ansatz 20 min bei RT gerührt. Der Ansatz wurde im V akuum eingeengt und der Rückstand durch präparative HPLC gereinigt. Nach Vereinigung der entsprechenden Fraktionen wurde das Lösungsmittel im Vakuum abgedampft und der Rückstand aus Acetomtril/Wasser lyophilisiert. So wurden 71 mg (53% d. Th. Über 2 Stufen) Benzyi-(9R)-9-[({(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5- difluoφhe yί)-!H-pyrrol-2-yl]-2,2-dm l -dioxo-5- oxa-7,10-diaza-2-silatetradecan-l 4-oat erhalten.

LC-MS (Methode 1): R _t = 1.21 min; MS (ESIpos): m/z = 761 (M+H) ^" . 70 mg (92 μηιοΐ) dieses Intermediats wurden in 15 ml Diehlormethan aufgenommen, auf I0°C abgekühlt und mit 54 μΕ Triethyiamin sowie mit 25.5 μί {0.23 mmol) Acetoxyacetylchioriü versetzt. Nach 1 h Rühren bei RT wurden nochmals gleiche Mengen an Säurechlorid und Triethyiamin zugegeben und nach einer weiteren Stunde Rühren bei RT erneut. Der Ansatz wurde anschließend für weitere 30 min bei RT gerührt und dann im Vakuum eingeengt und der Rückstand durch präparative HPLC gereinigt. Die entsprechenden Fraktionen wurden vereinigt und nach Abdampfen der Lösungsmittel und Lyophilisation des Rückstandes aus Acetonitril/Wasser verblieben 46.5 mg (59% d. Th.) des acylierten Intermediats.

LC-MS (Methode 1): R, = 1.53 min; MS (ESIpos): m/z = 861 i ! · ü ! .

46 mg (53 μηιοΐ) von diesem Intermediat wurden in 5 mL Methanol gelöst und mit 2.7 mL einer 2M Lithiumhydroxidlösung versetzt. Nach 10 min Rühren bei RT wurde der Ansatz mit Essigsäure auf pH 3-4 gebracht und dann mit 15 ml Wasser verdünnt. Die wäßrige Phase wurde mit Ethylacetat extrahiert und die organische Phase über Magnesiumsulfat getrocknet und eingeengt.. Der Rückstand wurde aus Acetronitril Wasser lyophilisiert und nach Trocknung des Rückstandes im Hochvakuum wurden 37 mg (90% d. Th.) der Titelverbindung als weißer Feststoff erhalten.

LC-MS (Methode 1): R _t = 1.32 min; MS (ESIpos): m/z = 729 (M+H) ⁺ .

Intermed|at€73

S-( 1 1 - {( 1 R)- 1 - [ 1 -Benzyi-4-(2,5-difiuorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl] -2,2-dimethylpropyl } -2,2-dimethyl- 6, 12-dioxo-5-oxa-7, 1 1 -dtaza-2-silatridecao.- 13 -yl)-N-[3 -(trimethylsilyl)propanoyl]-L-eystein

619 mg (0.86 mmol) 8-(11-{(1Κ)-1-[1 -Β6ηζν1-4-(2,5-ώΑυο Η

dimetiiylpropyi } -2,2-dimetiiyi-6, 12-dioxo-5-oxa-7, 11 -diaza-2-silatridecan- 13 -yl)-L-cystein- irifluoressigsäure (1 :1) (Intermediat C71) wurden in 8.8 ml Dichlormethan vorgelegt und mit 87 mg (0.86 mmol) Trietfaylamin und 224 mg (0.86 mmol) N-[2-(Trimetfaylsiiyl)-ethoxycarbonyloxy]- pyrroüdin-2,5-dion versetzt. Nach lh wurden 45 mg (0.17 mmol) N-[2-(Triniethylsilyl)- ethoxycarbonyk>xy]-pyrrolidin-2,5-dion zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde 1 b bei RT gerührt. Das Gemisch wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand in Dichlormethan aufgenommen und dann wurde die organische Phase zweimal mit Wasser und einer gesättigten Natriumhydrogenkarbonat-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet, am Rotationsverdampfer eingeengt und im Hochvakuum getrocknet. Der Rückstand wurde ohne weitere Reinigung weiter eingesetzt. Man erhielt 602 mg (71%, Reinheit 87%) der Titelverbindung.

LC-MS (Methode 1): R _t = 1.58 min; MS (ESIpos): m/z = 861 (M+H) ⁺ . Intejrmedfc|t C7

Triffuoressigsäure --2-(trimethylsilyi)ethyl-3-amino-N-[(2S)-4-[{(lR)-l-[l -benzyl-4-(2,5- difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}(glycoloyl )amino]-2-( {[2- (trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl}amino)butanoyl]-D-alaninat (1 : 1)

75mg (0.1 14 mmol) von Intermediat C58 wurden in 12.5 mi DMF aufgenommen und mit 78 mg (0.171 mmol) von Intermediat L75 in Gegenwart von 65 mg (0.11 mmol) HATU und 79 μΐ. NN- Diisopropylethylamin gekuppelt. Nach Reinigung durch präparative HPLC wurde das Intermediat in 20 ml Ethanol aufgenommen und über 10%-igem Palladium auf Alctivkohle 1 h bei RT unter Wasserstoff-Normaldruck hydriert. Der Katalysator wurde danach abfiltriert und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt und das Produkt durch präparative HPLC gereinigt. Nach Lyophilisation aus Aeetonitril/Wasser 1:1 wurden 63 mg (64% d.Th. über 2 Stufen) der Titelverbindung erhalten. LC-MS (Methode 1): R, = 1.16 min; MS (EIpos): m/z = 844 [M+H] ⁺ .

Intermediat C75

MethyH2S}-4-[(acetoxyacetyi){^ ^{^} ^

dimethylpropyl} amino] -2-( { [2-(trimethyl silyl)ethoxy]carbonyl} amino)butanoat

4.3 g (12.2 mmol) von Intermediat C52 wurden in 525 mL DCM gelöst und mit 3.63 g (17.12 mmol) Natrium triacetoxyborhydrid sowie mit 8.4 mL Essigsäure versetzt. Nach 5 min Rühren bei RT wurden 3.23 g (1 1.85 mmol) Methyl-(2S)-4-oxo-2-( { [2-(trimethylsilyl)ethoxy]carbonyI } amino) butanoat (hergestellt aus (3S)-3-Amino-4-methoxy-4-oxobutansäure nach klassischen Methoden) gelöst in 175 mL DCM zugegeben und der Ansatz weitere 45 min bei RT gerührt. Der Ansatz wurde dann mit DCM verdünnt und zweimal mit 100 mL gesättigter Natriumhydrogencarbonatiösung und dann mit gesättigter Natriumchloridlösung ausgeschüttelt. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und anschließend eingeengt. Der Rückstand wurde mittels präparativer HPLC aufgereinigt. Nach Vereinigung der entsprechenden Fraktionen, Einengen und Trocknen des Rückstandes im Hochvakuum erhielt man 4.6 g (6184% d. Tb.) des Intermediats. LC-MS (Methode 12): R, = 1.97 min; MS (ESIpos): m/z = 614.32 (M+H) ⁺ .

200 mg (0.33 mmol) dieses Intermediats wande in 10 ml. DCM gelöst und dann mit 105 μΐ. Triethylamin sowie mit 77 μί (0.717 mmol) Acetoxyacetylchlorid versetzt. Der Ansatz wurde über Nacht bei RT gerührt und dann im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde in Ethylacetat aufgenommen und zweimal mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung und dann mit gesättigter Natriumchloridlösung ausgeschüttelt. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und anschließend eingeengt. Es wurden 213 mg (75%) der Titelverbindung als beiger Schaum erhalten.

LC-MS (Methode 1): R _t = 1.46 min; MS (ESIpos): m/z = 714 (M+H) ⁺ . Intcrmediat C76

N- [(Benzyloxy)carbonyl] -L-valyl-N- { ( 1 S)-3 - [ { ( 1 R ·· 1 - [ 1 -benzyl-4-(2,5 -difluorphenyl) - 3 H-pyrrol- 2-yl]-2,2-dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]-l-carboxypropyl}- L-alanmamid

Die Titelverbindung wurde ausgehend von Intermediat C75 nach klassischen Methoden der Peptidchemie hergestellt (Spaltung der Teoc-Schutzgruppe mit Zinkchlorid, Acyiierung mit N- [(Benzyloxy)carbonylj-L-valyl-L-alanin in Gegenwart von HATU und Esterspaltung mit Lithiumhydroxid in THF/Wasser).

LC-MS (Methode 1): R _t = 1.23 min; MS (ESIpos): m/z = 818 (M+H) ^1' .

Intermedia! C77

SHl i-{(lR) -[l-Benzyl-4-(2,5-dm^^^

6, 12-dioxo- -oxa-7, 11 -diaza-2-silatridecan- i 3 -yi)-N-(4-teri-butoxy-4-oxobutanoyl)-L-cystein

4- tert-Butoxy-4-oxobutansäure (8.39 mg, 48.1 μιηοΐ) wurde in 1.0 mL DMF vorgelegt, mit 7.37 mg (48.1 jimol) 1 -H.ydroxy-l.H-benzotriazol Hydrat, 15.5 mg ((48.1 μχηοΐ) (Benzotriazol-l - yioxy)bisdiinethylaminomethyliumfluoroborat und 8.60 μΐ (48.1 μιηοί) Ν,Ν- Diisopropylethylamin versetzt und 10 Minuten bei RT gerührt. 40.0 mg (0.048 mmol) S-(11-{(1R)- 1 -[1 -Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} -2,2-dimethyl-6, 12-dioxo-

5- oxa-7,l l-diaza-2-silalridecan-13-yl)-L-cystein -trifluoressigsäure (1 :1) (Intermediat C71) wurden in 1.0 mL DMF vorgelegt, mit 25.4 μί (141.9 μηιοΐ) Ν, -Diisopropyiethylamin versetzt, zum Ansatz gegeben und 4 h bei RT gerülirt. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP- HPLC (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 35.0 mg (83 % d. Th.) der Titelverbindung.

LC-MS (Methode 12): R, = 2.76 min; MS (ESIpos): m/z = 873 [M+Hf

Intgrtn ijiL 8

1 1 - {( 1 R)- 1 -[ 1 -Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyiTol-2-y 1] -2,2-dimethylpropyl} -2,2-dimethyl- 6, 12-dioxo-5-oxa-7 1 1 -diaza-2-silapentadecan-l 5-säure

1 97 mg (0.354 mmol) 2-(Trinlethylsilyl)ethyl-[3-(ί( lR)- -[l- enzyl-4-(2,5-difluo hellyl)-l H- pyrrol-2-yl]~2,2-dimetliylpropyl}ami:no)propyl]carba.mat (siebe Synthese Intermediat C 1 1 ) wurden in 5.0 m ^' L Dichlormethan vorgelegt und auf 40°C erhitzt. Bei dieser Temperatur wurden 240 μΐ (3.0 mmol) Pyridin und 220 μΐ (1.8 mmol) Methyl-4-chlor-4-oxobutanoat zugegeben und 1 h bei RT gerührt. Dann wurden 240 μΐ (3.0 mmol) Pyridin und 220 μΐ ( 1.8 mmol) Methyl- -cblor-4- oxobutanoat zugegeben und 1 hbei RT gerührt. Dann wurden 240 μΐ (3.0 mmol) Pyridin und 220 μί (1.8 mmol) Methyl-4-chlor-4-oxobutanoat zugegeben und 1 h bei RT gerührt. Die Reaktionsmisehung wurde mit Ethylacetat verdünnt und die organische Phase wurde je dreimal mit 5%iger KHS VLösung extrahiert. Die organische Phase wurde mit ges. NaCl-Lösung gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittels präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 74.1 mg (31 % d. Th.) Methyl- 11- {( 1R)- i -[1 - 06ηζν1-4-(2,5-ώΑυο ηεην1)-1Η- νΓτο1-2^

7,1 l -diaza-2-silapentadecan-l 5-oat.

LC-MS (Methode 1): R _: = 1.49 min; MS (ESIpos): m/z = 670 [ Vi ! { |

78.3 mg (1 17 μιηοΐ) Methyl-l l - {(lR) -[l -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH-pyiTol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} -2,2-dimethyl-6,l 2-dioxo-5-oxa-7, 11 -diaza-2-silapentadecan-l 5-oat wurden in 4.0 mL THF vorgelegt, mit 800 μΐ Methanol, 160 μΐ Wasser und 230 μΐ (230 μιηοΐ) wässnger LiOH- Lösung (IM) versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 3 h bei RT gerührt, mit Essigsäure gequencht und direkt, mittels präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 64.8 mg (85 % d. Th.) der Titel Verbindung. LC-MS (Methode 12): R _t - 2,61 min; MS (ESIneg): m/z = 654 [M-H] ^' jfatennediat_C79

Trifluoressigsäure 2~(trimethyisiiyi)ethyi~3-a ino-N-(l 1 -{(1R)-1-[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- lH-pyrrol-2-yl]-2,2 limemylpropyl}-2,2-dim l-diaza-2- silaheptadecan- 17- i)-D-alaninat (1 :1)

57.4 mg (81.8 μηιοΐ) 3 l -{(lR)-l-[l -Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimetbylpropyl}-2,2-dimethyi-6,12-dioxo-5-oxa-14-thia-7,l l-diaza-2-silaheptadecan-l 7-säure (Intermediat C69) wurden in 5.7 rnL DMF vorgelegt, mit 74.0 mg (164 μηιοΐ) Trifluoressigsäure 2- (trimethylsiiyi)ethyi-3- {[(benzyloxy)carbonyi]amino} -D-alani (1 : 1) (Intermediat L75), 43 μΐ (250 μιηοΐ) Ν, -Diisopropyiethylamin und 62.2 mg (164 μτηοΐ) HATU versetzt und 1 Ii bei RT nachgerührt. Die Reaktionsmischung wurde 1 h bei RT gerührt, mit Essigsäure gequencht und direkt mitteis präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 52.4 mg (63 % d. Th.) der Verbindimg 2- (Trimethylsilyl)etliyl-N-(l l-{(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difl^

dimethylpropyl}-2,2-dimethyl-6, 12, 17~trioxo-5~oxa-i 4-thia-7, 11 -diaza-2-silalieptadecan-17-yl)-3- { [(benzyloxy)carbonyi]amino} -D-alaninat. LC-MS (Methode 1): R _t = 1.64 min; MS (ESIpos): m/z ----- 1022 [Mf

Unter Argon wurden 6.23 mg (27.7 μπιοΐ) Palladium(II)acetat: in 3.0 ml Dichioromethan vorgelegt, mit 12 p,L (83 _, umo3) Triethylamin und 89 μϊ., (550 μηιοΐ) Triethylsilan versetzt und 5 Minuten, gerührt. Dann wurden 56.7 mg (55.5 μιηοΐ) 2-(Trimethylsilyl)ethyl-N-(l 1 - {(1R)-1 -[1 - benzyi-4-(2,5-difluoiphenyi)-l H-p\nTol-2-yl]-2,2-dimethyipiOpy

oxa- 14-thia-7,l 1 -diaza-2-silaheptadecan- 17-yl)-3 - { [(bea3z loxy)carbonyl]araino} -D-alaninat in 3.0 mL Dichioromethan zugegeben und über Nacht bei RT gerührt. Der Ansatz wurde bis fast zur Trockene eingeengt, mit Acetonitril/Wasser versetzt, filtriert und mittels präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1 % TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 37.4 mg (67 % d. Th.) der Titel Verbindung.

LC-MS (Methode 12): ): R, = 2.15 min; MS (ESIpos): m z = 888 [M+Hf

jjitgrmedtot_C80

S-(l l- {(lRH -[l -Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH-^^

6, 12-dioxo~5-oxa~7, 1 1 -diaza-2-silatridecan- 13 -yl)-N- [ 1 5-(glycyiamino)-4,7, 10,13- tetraoxapentadec - 1 -oyi]-L-cystein -trifluoressigsäure (1 : 1)

Unter Argon, wurden 43.4 mg (95.1 μπιοΐ) l -( {N-[(Benzyioxy)carbonyl]glycyi}amino)-3,6,9,12- tetraoxapentadecan-15-säure (InteiTnediat L90) in 2.5 mi DMF vorgelegt, mit 14.6 mg (95.1 μmol) 1 -Hydroxy- i H-beazotriazol Hydrat, 30.5 mg (95.1 μαηοΐ) (Benzotriazol-1 - yloxy)bisdimethylaminometliyliumfiuoroborat und 16.5 μΐ (95.1 μπιοΐ) Ν,Ν-Diisopropylethylamin versetzt und 10 min gerührt. 79.0 mg (95.1 μιηοΐ) S-(l l- {( lR)-l-[l-Benz}' -4-(2,5-difluorphenyi)- 1 H-p rrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyI} -2,2-dimethyl-6,l 2-dioxo-5-oxa-7, 11 -diaza-2-silatridecan-l 3 - yl)-L-cystein -trifluoressigsäure (1 : 1) (Intermediat C71) winden in 2.5 ml DMF gelöst mit 49.5μ1 (285.3 μπ»1) Ν,Ν-Diisopropylethylamin versetzt und zum Ansatz gegeben. Die Reactionmischung wurde 2 h bei RT gerührt und direkt, mitteis präp. RP-HPLC (Säule: Reprosii 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 44.2 mg (40 % d. Th.) der Verbindung S-(l 1 -{(1R)-1-[1 -Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-l H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}-2,2-dimethyl- 6, 12-dioxo-5-oxa-7, 11 -diaza-2-silatridecan- 13 -yl)-N- [ 15-( {N- [(benzyloxy)carbonyl]glycyl }amino)-4,7, 10, 13-tetraoxapentadecan- 1 -oyl]-L-eystein.

LC-MS (Methode 12): R _t = 2.57 min; MS (ESIpos): m/z = 1156 [M+H

60.2 mg (52.1 μηιοΐ) S-(l l-{(lR)-l -[l-ßenzyl-4 2,5-difluo henyl) H-pyπ·ol-2-yl]-2,2- dimethyipropyl} -2,2-dimethyl-6, 12-dioxo-5 -oxa-7, 11 -diaza-2-silatridecan- 13 ~yl)-N-[ 15 -( {N- [(benzyloxyicarbonyljglycyl } amino)-4,7, 10, 13-tetraoxapentadecan- 1 -oyl]-L-cystein winden in 3.0 ml, Ethanol suspendiert und mit 6.0 mg Palladium auf Aktivkohle (10%ig) versetzt und bei RT 1 h lang mit Wasserstoff unter Normaldruck hydriert. Zweimal wurden 6.0 mg Palladium auf Aktivkohle (10%ig) versetzt und bei RT 1 h lang mit Wasserstoff unter Normaldruck hydriert. Der Katalysator wurde abfiltriert und die Reaktionsmischung im Vakuum vom Lösemittel befreit und im Hochvakuum getrocknet. Der Rückstand wurde mittels präp. RP-HPLC (Säule: Reprosii 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Valcuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 29.4 mg (50 % d. Th.) der Titel Verbindung.

LC-MS (Methode 5): R = 3.77 min; MS (ESIpos): m/z = 1021 [Μ+ΗΓ

Intermediat C81

(R)~ 1 - [ 1 -Benzyl-4-(2 ,5 -difiuorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yi] - 1 -cyclohexylmethanamin

Eine Lösung von 3.12 ml (6.24 mmol) Dimethylzmk in Toluol (2.0 M) unter Argon bei -78 °C wu de mit 18.7 ml (37.45 mmol) Cyclohexyimagnesiumchiorid in Diethylether (2M) versetzt und die Mischung wurde 30 Minuten bei -78 °C gerührt. Anschließend wurde eine Lösung von 5.0 g (12.48 mmol) (R)-N- {(E/Z)-[l -Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- lH-pyrrol-2-yl]methylen} -2- methylpropan-2-sulfmamid in THF bei -78 °C zugegeben und das Reaktionsgemisch wurde 1 h bei dieser Temperatur gerührt und dann 4 h bei RT. Dann wurden bei -78 °C mL ges. Ammoniumchlorid-Lösung zugegeben und die Reaktionsmischung wurde auf RT kommen lassen. Es wurde mit Ethylacetat verdünnt und mit Wasser gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel wurde im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittels Biotage Isolera gereinigt (Kieseigel, Ethylacetai/Cyclohexan 25:75). Man erhielt 1.59 g (26% d. Th.) der Zwischenstufe erhalten.

LC-MS (Methode 12): R _t = 2.76 min; MS (ESIneg): m/z = 483 [M-HT

264.0 mg (0.54 mmol) dieser Zwischenstufe wurden in 0.5 mL 1,4-Dioxan unter Argon vorgelegt und dann mit 1.36 mL HCl in 1,4-Dioxan-Lösung (4.0 M) versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 1 h bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Dichlormethan versetzt und mit einer was. IM Natriumhydroxid-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde mit Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel wurde im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittels Biotage Isolera gereinigt (Kieselgel, Methanol/Dichlomethan 98:2). Das Lösemittel wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand wurde in Dichlormethan gelöst und mit einer Natriumhydrogencarbonat-Lösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Das Lösemittel wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand wurde im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 148 mg (72% d. Th.) der Titelverbindung.

LC-MS (Methode 13): R _t = 2.07 min; MS (ESlpos): m/z = 364 [M-NH ₂ f

Intennedjaj_C82

2-(Trimethylsilyl)ethyl-(3 - { [(R)- [ 1 -benzyl-4-(2,5 -difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2- yl](cyclohexyl)methyl]amino}propyl)carbamat

Eine Lösung von 503.0 mg (1.32 mmol) 3 -Tl- 5enzyl~4-(2,5- ifli!orpheny3)-4H^yrrol-2-yl]- l~ eyclohexylmethanamin (Intemiediat C81 ) in 1.4 ml Dichlormethan unter Argon wurde mit 392.2 mg (1.85 mmol) Natriumtriacetoxyborhydrid und 91.29 mg (1.52 mmol) Essigsaure versetzt und das Reaktionsgemisch wurde 10 Minuten bei RT gerührt. Ansehließend wurde eine Lösung von 574.6 (2.38 mmol) 2-(Trimethylsilyl)ethyl-(3-oxopropyl)carbamat in Dichionnethan hinzugegeben und das Gemisch wurde über Nacht bei RT gerührt. Nach Zugabe von 143 mg (0.66 mmol) 2- (Trimethylsilyl)ethyl-(3-oxopropyl)carbamat wurde die Mischung noch 2 h weiter gerührt. Das Reaktionsmgemisch wurde mit Dichlormethan verdünnt und die organische Phase wurde je zweimal mit ges. Natriu carbonat-Lösung und mit ges. NaCl-Lösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wurde mittels präparative HPLC gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt g (50% d. Th.) der Titelverbindung. Man erhielt 488 g (63 % d. Th.) der Titelverbindung.

LC-MS (Methode 12): R _t - 1.89 mm; MS (ESIpos): m/z = 582 (M+H) ⁺ . Intennedjaj_C83

2-(Trimeώ lsilyl)ethyl-(3-{ [(R)-[l-benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH-p rrol-2- yl](cyclohexyl)methyl](chloracetyl)amino}propyl)carbamat

Zur eine Lösung von 487,9 mg (0.84 mmol) 2-(Trimethylsilyl)ethyl-(3-{[(R)-[l-benzyl-4-(2,5- difluoφhenyί -lH-pym1l-2-yl](cyclohexyl)irlethyl]amino} ro yl)carbamaί (Intermediat C82) in 8.40 ml Diehlormethan mit Mol Sieb 4 Ä wurden 280.0 mg (2.77 mmol) Triethylamin und 397.8 ing (3.52 mmol) Chloracetylchlorid zugegeben und das Reakionsgemisch wurde 6 h bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Dichlormethan verdünnt und die organische Phase wurde mit ges. Natriumhydrogencarbonat-Lösung und ges. Ammoniumchlorid-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wurde ohne Reinigung weiter eingesetzt. Man erhielt 470 mg (85 % d. Th.) der Titel Verbindung.

LC-MS (Methode 12): R _t = 2.88 min; MS (ESIpos): m/z = 680 (M+Na) ⁺ .

Intennedjaj_C84

S-{ l H(R)-[l-Benzyl-4-(2,5-dinuo^henylHH^^

6, 12-dioxo-5-oxa-7, 1 1 -diaza-2-silatridecan- 13 -yl} -L-cystein

322.1 mg (2.66 mmol) L-Cystein wurden in 0.19 mL Wasser zusammen mit 319.0 mg (3.80 mmol) Natriumhydrogencarbonat suspendiert. Dazu wurden 250.0 mg (0.38 mmol) 2- (Trimeώylsilyl)e1ilyl-(3-{[(R)-[l-berlzyl-4-(2,5-difluoφhe nyl)-lH-pyrrol-2- yl](cyciohexyl)methyl](chloraeetyi)amino}propyl)earbamat (Intermediat C83) gelöst in 1.90 mL z ^' so-Propanol und 693.8 mg (4.56 mmol) l,8-Diazabicyclo(5.4.0)undee-7-en gegeben. Die Reaktionsmischung wurde 3.5 h bei 50 °C gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat versetzt und die org. Phase wurde mehrmals mit ges. Natriumhydrogenearbonat-Lösung und mit ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Natrium sulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde ohne weitere Reinigung weiter eingesetzt. Man erhielt 276 mg (97 % d. Th.) der Titelverbindung.

LC-MS (Methode 12): R _t - 2,34 min; MS (ESIpos): m/z - 744 (M+H) ^' Intermediat C85

6, 12-dioxo-5-oxa-7, 1 1 -dtaza-2-silatridecao.- 13 -yl} -N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dthydro- lH-pyrrol-1 - yljhexanoyi] -L-cy siein

Zu einer Mischung von 100 mg (0.13 mmol) S-{ i 1-[(R)-[1 -Benzyl-4-(2,5 üfluorphenyl)-lH- pyrroi~2-yl](eyelohexyl)metlw^

L-cystein (1 : 1 ) (Intermediat C84) und 41.5 mg ( 0.13 mmol) 1 ^■ {6-[(2,5-Dioxopyrrolidin- 1 -yl)oxy]- 6-oxohexyl } - 1 H-pyrrol-2,5 -dion in 4.0 ml DMF wurden 34.8 mg ( 0.27 mmol) N,N- diisopropylethylamin hinzugegeben und das Reaktionsgemisch wurde 3 h bei RT gerührt. Die Mischung wurde ohne Aufarbeitung mittels präparative HPLC gereinigt. Man erhielt 88 mg (70% d. Th.) der Titelverbindung.

LC-MS (Methode 12): Rt = 2.71 min; MS (ESIpos): m/z = 936 (M+HT Intermedia! C86 l H(R)-[l-BenzyM-(2,5-&^^

dioxo-5-oxa-l 4

Eine Mischung von 220.0 mg (0.33 mmol) 2-(Trimethylsilyl)ethyl-(3-{[(R)-[l-benzyl-4-(2,5- dtfluoφhenyl)-lH- yτrol-2-yl](c clohe yl)mefi ιyl](chloracet l)amino} ro y^

(Intermediat C83) und 39.02 mg (0.37 mmol) 3-Sulfanylpropansäure in 7.45 ml Methanol und einige Tropfen Wasser wurde mit 161.65 mg (1.17 mmol) aliumearbonat versetzt. Das Reaktionsgemiseh wurde 4 h bei 50 °C gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat versetzt und die org. Phase wurde melirmais mit Wasser und mit ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Natriu msulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde ohne Aufarbeitung weiter eingesetzt. Man erhielt 201 mg (83 % d. Th.) der Titelverbindung.

LC-MS (Methode 12): R _t = 2.72 min; MS (ESIneg): m/z - 726 (M-H)\

Intermedia! C87

2-(Trimethylsilyl)ethyl- { 13-[(R)-[l -benzy1-4-(2,5-difluorphenyr)-lH-pyrrol-2- yl](eyclohexyi)methyl] ^

triazahexadecan- 16-yl } earbamat

Zu einer Lösung von 100 mg (0.14 mmol) i l -[(R)-[l-Benzyl-4-(2,5-difluorphenyi)-lH-pyrrol-2- yl](cyciohexyI)metiiyl]-2,2-d ^j methyl-6,l 2-dioxo-5-oxa-14-thia-7,l 1 -diaza-2-silaheptadecan-17- säure (Intermedial C87) in 1.37 ml DMF wurden 54.18 mg (0.28 mmol) N-(2-Aminoethyl)-2-

(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)aceiainid (Intermediat LI), 71.01 mg (0.50 mmol) N,N- diisopropyiethyiamin, 104.46 mg (0.27 mmol) HATU und 0.23 ml (0.14 mmol) l-Hydoxy-7-

Azabenzotriazole 0.5 M in DMF hinzugegeben. Das Reaktionsgemisch wiirde 5 h bei RT gerührt.

Die Mischung wurde ohne weitere Aufarbeitung mittels wurde mittels präparative HPLC gereinigt.

Man erhielt 41 mg (33 % d. Th ) der Titelverbindung.

LC-MS (Methode 12): R _t - 2.61 min; MS (ESIpos): m/z = 907 (M+H . Intennedfat C88 iert-Butyl-3 -[( {( 1 R)-l -[ I -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}ammo)meth^^ (I

Mischung aus Stereoisomeren

Eine Lösung von 2.04 g (5.75 mmol) (lR)-l-[ l -Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropan-l -amin in 51 ml Dichlormethan wurde mit 1.71 g (8.05 mmol) Natiiumtriacetoxyborhydrid und 0.40 g (6.61 mmol) Essigsaure versetzt und die Reaktionsgemisch wurde 5 Minuten bei RT gerührt. Anschließend wurde eine Lösung von 1.32 g (6.61 mmol) tert- Butyl-3-formylpyiTolidin-l -carboxylat in 20 ml Dichlormethan hinzugegeben und die Mischung wurde über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat verdünnt und die organische Phase wurde je zweimal mit ges. Natriumcarbonat-Lösung und mit ges. NaCl-Lösung gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet und eingeengt. Der Rückstend wuixie mittels präparative HPLC gereinigt.. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 1.86 g (50% d. Th.) der Titelverbindung.

LC-MS (Methode 1): R» = 0.99 min; MS (ESIpos): m/z = 538 ( +H-CF3CO_H) ⁺ . Intennedfat_C89 tert-Butyl-3- {[{(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difli^henyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}(chloracetyl)amino]methyl}pyrrolidm-l -carboxylat

Eine Lösung von 2,89 g (4.19 mmol, 80 Reinheit) von tert-Butyl-3■ [( {( 1R)- 1 -[l-benzyl-4-(2,5- difluo 3henyi)-l H-pyrrol-2~yl]-2,2-dimethyipropyi}amino)metbyi]py ro

(Intermediat C90) in 42 ml Dichlormethan mit Molsieb 4 Ä wurde mit 1.36 g (13.42 mmol) Triethylamin und 2.13 g (1 8.87 mmol) Chloracetylchlorid versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde bei RT 5 h gerührt. Die Mischung wurde einroliert und der Rückstand wurde mittels präparative HPLC gereinigt. Man erhielt 449 mg (17 % d. Th.) von Isomere 1 und 442 mg (17 % d. Th) von isomere 2 der Titelverbindung.

Isomer 1 LC-MS (Methode 12): R _t - 2.74 min; MS (ESIpos): m/z = 636 (M+NH ₄ . Isomer 2 LC-MS (Methode 12): R, - 2.78 min; MS (ESIpos): m/z = 636 (Μ+ΝΗ ₄ ^' Τ. Intermediat€90

S-[2-( {(lR)-1 1-Benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-m-pyrrol-2-yl]-2,2-dime lpΓopyl} {[l-(teΓt- butoxycarbonyi)pymiiidiri-3-yi]niiethyl}amino)-2-oxoet yI]-L-cysteir _! (Isomer 1)

357.3 mg (0.58 mmol) L-Cystein wurden in 2.3 mL Wasser zusammen mit 488.7 mg (4.07 mmol) Natriumhydrogencarbonat suspendiert. Dazu wurden 357.0 mg (0.58 mmol tert-Butyl-3-{[ {( 1R)-1 - [l-benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH^yrrol-2-yl]-2,2- dimethyipropyi} (chloracetyl)amino]metliyl}pyrrolidiii-l -carboxylat (Isomer 1)

(Intermedia! C93 , Isomer 1) in 23.0 mL so-Propanol gelöst und 1.06 g (6.98 mmol) 1 ,8- Diazabicyclo(5.4.0)undec-7-en gegeben. Die Reaktionsmischung wurde 3 h bei 50 °C gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat versetzt und die org. Phase wurde mehrmals mit ges. Natriumhydrogencarbonat-Lösung und einmal mit ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde ohne Reinigung weiter eingesetzt. Man erhielt 255.0 mg (62 % d. Th.) der Titelverbindung. LC-MS (Methode 1): R _t = 1.09 min; MS (ESIpos): m/z = 699 (M+H) ⁺ .

InjjgjTMgd^ tjC91

S 2-( {(lR) 1-Benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dime lpΓopyl} {[l-(teΓt- butoxycarbonyi)pymiiidin-3-yi]methyl}amino)-2-oxoethyI]-L-cy stein (Isomer 2)

453.5 mg (3.74 mmol) L-Cystein wurden in 2.1 mL Wasser zusammen mit 449.2 mg (5.35 mmol) Natriumhydrogencarbonat suspendiert. Dazu wurden 3287.4 mg (0.54) mmol tert-Butyl-3- { [ {(1 R)- l -[l -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethyipropyi}(chioracetyl)amino]met]iyl}pyiToiidin-l-earbo xyiat (Tntermediat C91 , Isomer 2) in 21.1 mL so-Propanol gelöst und 0.98 g (6.42 mmol) l,8-Diazabicyclo(5.4.0)undec-7-en gegeben. Die Reaktionsmischung wurde 3 h bei 50 °C gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat versetzt und die org. Phase wurde mehnnals mit ges. NatriumhydiOgencarbonat- Lösung und einmal mit ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde ohne Reinigung weiter eingesetzt. Man erhielt 221.0 mg (59 % d. Th.) der Titeiverbindung.

LC-MS (Methode 1): R _t = 1.12 min; MS (ESIpos): m 'z = 699 (M+H) ⁺ . Intermedia! C92

S-[2H{(lRH-[i-Benzyl-4-(2,5-difl^^^

butoxyearbonyl)pyrrolidin-3-yl]m

pyrrol-l-yl)hexanoyl]-L-cystein (isomer 1)

Eine Mischung von 50 mg { 0,07 mmol) S■[2-({(lR)-l-[l■Benzyί■4-(2,5-difluoφhenyί -iH- yπΌl- 2-y!]-2,2-dimethylpropyl} {[l-(tert-butoxycarbonyl)pyrrolidin-3-yl]methyl}iirnino)-2-o xoethyl]-L- cystein ( ermediat C92) und 22.06 mg (0.07 mmol) 1 - {6-[(2,5-Dioxopyrrolidin- 1 -yl)oxy]-6- oxohexyl}-lH~pyTrol~2,5-dion in 3.3 ml DMF wurde mit 18.49 mg (0.14 mmol) Ν,Ν- Diisopropylethyla in versetzt und das Reaktionsgemisch wurde bei RT 45 Minuten gerührt. Die Mischung wurde ohne Aufarbeitung mittels mittels präparative HPLC gereinigt. Man erhielt 65 mg (100 % d. Th, 71 % Reinheit) der Titelverbindung.

LC-MS (Methode 1): R _t = 1.31 min; MS (ESlpos): m/z = 892 (M+H) ⁺ . Intermedia! C93

S-[2H{(lRH-[i-Benzyl-4-(2,5-difl^^^

butoxycarbonyl)pynolidin-3-yl]me^^

pyrrol-l-yl)hexanoyl]-L-cystein (isomer 2)

Eine Mischimg von 50.0 mg ( 0.07 mmol) S-[2-( {(lR)-l-[l-Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH- pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} {[l-(tert-butoxycarbonyl)pyrrolidin-3-yl]me1hyl}am

oxoethylj-L-cystein (Intermediat C93) und 22.06 mg {0.07 mmol) l-{6-[(2,5-Dioxopyrrolidin-l - yl)oxy]-6-oxohexyl}-lH-pyrrol-2,5-dion in 3.0 ml DMF wurde mit 18.49 mg (0.14 mmol) N,N- Diisopropylethylamin versetzt und das Reaktiorisgemisch wurde bei RT 90 Minuten gerührt. Die Mischung wurde ohne Aufarbeitung mittels präparative HPLC gereinigt. Man erhielt 63 mg (98 % d. Th, 73 % Reinheitjder Titelverbindung.

LC-MS (Methode 1): R _t = 1.34 min; MS (ESIpos): m z = 892 (M+H) ⁺ . Intermediat C94

S-[2-( {(lR)-l-[ i-Benzyl-4-(2,5-di^^^

butoxyearlx)nyl)pyrrolidin-3-yl]m

l -yl)acetyl]-L-cystein (Isomer 1)

Eine Mischung von (50.0 mg, 0.07 mmol) S-f2-( {(! R)-l -[l -Benzy'i-4-(2,5-difluo 3henyi)-l H- pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} {[(3R)-l -(tert-butoxycarbonyl)pyrrolidin-3-yl]methyl}animo)-2- oxoethyl]-L-cystein (Intermediat C92) und 3 8.0 mg (0.07 mmol) ^■ {2-[(2,5-Dioxopyrrolidtn-l- yi)oxy]-2-oxoethyl}-lH-pyrrol-2,5-dion in 3.3 ml DMF wurde mit 18.5 mg (0.14 mmol) N,N- Diisopropylethylamin versetzt und das Reaktionsgemisch wurde 30 Minuten bei RT gerührt. Die Reaktio smischung wurde mit Ethyiaeetat versetzt und die organische Phase wurde mehrmals mit ges. NHiCi-Lösung und mit ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde ohne weitere Reinigung eingesetzt. Man erhielt 57 mg (81 % d. Th, 85 % Reinheit) der Titelverbindung.

LC-MS (Methode 1): R, = 0.96 min; MS (ESIpos): m/z = 836 (M+H) ^1" Intermedia! C95

3 - { [2 -( {( 1 R)- 1 - [ 1 -Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-p rrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl } { [ 1 -(tert- butoxyc^bonyl)pynOlidm-3-yi]melhyl}amino)-2-oxoelhyl]sxJfany l}p (Isomer 1)

Eine Mischung von 384.0 mg (0.62 mmol) tert-Butyl-3-{[{(lR)-l -[l~benzyi-4-(2,5~difluorphenyi)~ l H-pyiToi-2-yij-2,2-dimethyipropyi} (chioracetyl)aminojmethyl}pyiTo!idin

(Intermediat C9I , Isomer 1) und 73.0 mg (0.69 mmol) 3-Sulfanylpropansäure in 14 ml Methanol und einige Tropfen Wasser wurde mit 302.5 mg (2.19 mmol) Kaliumcarbonat versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 2.5 h bei 50 °C gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat versetzt und die organische Phase wurde mehrmals mit Wasser und mit ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wuixie über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Der Rückstand wurde ohne Aufarbeitung weiter eingesetzt. Man erhielt 358.0 mg (84 % d. Th.) der Titelverbindung.

LC-MS (Methode 1): R _t = 1.33 min; MS (ESIpos): m/z = 684 (M+H) ⁺ . Intermedia! C96

3 - { [2 -( {( 1 R)- 1 - [ 1 -Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-p rrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl } { [ 1 -(tert- butoxycarbonyl)pyrrolidm-3-y (Isomer 2)

Eine Mischung von 287.0 mg (0.45 mmol) tert-Butyl-3-{[{(lR)-l -[l-benzyi-4-(2,5-difluorphenyi)- l H-pyiToi-2-yij-2,2-dimethyipropyi} (chioraeetyl)ammojmethyl}pyiTo!idin-l-c

(Intermedia! C91 , Isomer 2) und 54.6 mg (0.51 mmol) 3-Sulfanylpropansäure in 14 ml Methanol und einige Tropfen Wasser wurde mit 226.0 mg (1.64 mmol) Kaliumcarbonat versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 2.5 h bei 50 °C gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat versetzt und die org. Phase wurde mehrmals mit Wasser und mit ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Der Rückstand wurde ohne Aufarbeitung weiter eingesetzt. Man erhielt 318.7 mg (88 % d. Th., 88 % Reinheit) der Titelverbindung.

LC-MS (Methode l): R _t = 1.36 min; MS (ESIpos): m/z = 684 (M+H) ⁺ . Intermedia! C97 tert-Butyl-3-[2- {(lR) -[l-benzyi-4-(2^

(2,5-cüoxo-2,5-dmydro-lH-pyrrol-l-yl)-3,8,l^^

1 -carboxylat (Isomer 2)

Zu einer Lösung von 25.0 mg (0.04 mmol) von 3-{[2-( {(lR)-l-[l-Benzy -4-(2,5-difluorphenyi)- lH-pyrrol-2-yl]-2,2-diraethyipropyl} { [1 -(tert-butoxycarbonyl^)yrrolidii!-3 -yl]me1hyl}amtno)-2- oxoethyl]sulfanyl}propansäure (Intennediat C102) in 2.81 ml DMF unter Argon wurden 14.17 mg (0.1 1 mmol) N.N-diisoprylethylamin und 27.80 mg (0.07 mmol) HATU hinzugegeben. Das Reaktionsgemiscii wurde 10 Minuten bei RT gerührt. Anschließend wurde eine Lösung von 22.75 mg (0.07 mmol) N-(2-Ammoemyl)-2-(2,5-dioxo-2,5-dmydro- lH-pyrrol- 1 -yl)acetamid -ethan (1 : 1) Trifluoressigsäure (Ititermediat LI) in 1 .4 ml DMF und 5 mg (0.04 mmol) N,N- diisopropylethylamin hinzugegeben und das Gemisch wurde ü.N bei RT gerührt. Die Mischimg wurde mit Wasser versetzt und mit Dichlormethan extrahiert. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittei im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde ohne Aufarbeitung weiter eingesetzt. Man erhielt 318.7 mg (88 % d. Th.) der Titelverbindung. LC-MS (Methode 5): R _t = 4.39 min; MS (ESIpos): m/z = 863 (M+H) ⁺ . lüteraiediat C98 tert-Butyl-3 ~[2~ {( 1 R)-l - [ 1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyirol-2-yl] 2-dime lpropyl}-18- (2,5 -dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol-1 -yl)-3 ,8,13 -trioxo-5-thia-2,9,12-triazaoctadec-l-yl]pyrrolidin-l- carboxylat (Isomer 2)

Zu einer Lösung von 25.0 mg (0.04 mmol) von 3- {[2-({(lR)-l-[i -Beozyl-4-(2,5-difluorphenyl)- lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} {[l -(tert-butoxycarbonyl)pyrrolidm-3-yl]metliyl}amino)-2- oxoethyljsulfanyljpropansäure (Intermediat C102) in 2.81 ml DMF unter Argon wurden 14.17 mg (0.1 1 mmol) Ν,Ν-diisoprylethylamin und 27.80 mg (0.07 mmol) HATU hinzugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 10 Minuten bei RT gerührt. Anschließend wurde eine Lösung von 37.30 mg (0.07 mmol) N-(2-Aminoethyl)-6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro- lH-pyrrol-l-yl)hexanamid -ethan (1 : 1 ) Trifluoressigsäure in 1 .4 ml DMF und 5 mg (0.04 mmol) N,N-diisopropyletiiylamm hinzugegeben und das Gemisch wurde üN bei RT gerührt. Die Mischung wurde mit Wasser versetzt und mit Dichlormethan extrahiert. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde ohne weitere Reinigung eingesetzt. Man erhielt 318.7 mg (88 % d. Th.) der Titelverbindung.

LC-MS (Methode 5): R _t = 4.54 min; MS (ESIpos): m/z === 919 (M+H) ^" .

Intermediat€99 tert-Butyl-3-[2-{(I R)-l -[l -benzy]-4-(2,5^

(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol-1 -yl)-3,8 ,19-trioxo- 12, 15-dioxa-5-thia-2,9, 18-triazatetracos- 1- yl]p yrrolidin-1 -carboxylat (Isomer 2)

Zu einer Lösung von 25.0 mg (0.04 mmol) von 3-{[2-( {(lR)-l-[l-Benzy -4-(2,5-difluorphenyr)- lH-p rrol-2-yl]-2,2-dimethyipropyl} { [1 -(tert-butoxycarbonyl^)yrrolidii!-3 -yl]me1hyl}amtno)-2- oxoethyl]sulfanyl}propansäure (Intermediat C102) in 2.81 ml DMF unter Argon wurden 14.17 mg (0.11 mmol) N,N-diisoprylethylamin und 27.80 mg (0.07 mmol) HATÜ hinzugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 10 Minuten bei RT gerührt. Anschließend wurde eine Lösung von 35.05 mg (0.07 mmol) N-{2-[2-(2-Aminoethoxy)ethoxyjethyl}-6-(2,5-dioxo-2,5-dihydr o-l H-pymil-l- yl)hexanamid -ethan (1:1 )Trifluoressigsäure (Intermediat L82) in 1.4 ml DMF und 5 mg (0.04 mmol) N.iN-diisopropylethylamin hinzugegeben und das Gemisch wurde üN bei RT gerührt. Die Mischung wurde mit Wasser versetzt und mit Dichlormethan extrahiert. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Der Rückstand wurde ohne Aufarbeitung weiter eingesetzt.

Man erhielt 25 mg (36 % d. Th.) der Titelverbindung.

LC-MS (Methode 1): R _t = 4.52 min; MS (ESIpos): m/z = 1007 (M+H) ^"

Intenngdjat ClOO

2-(Trimethylsilyl)ethyl-{(2S)-4-[{(lR^

yl]-2,2-dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]-l-[(2-{[(2R)-2-( 2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH- pyrrol-l-yl)propanoyl]amino}ethyl)amino]-l-oxobutan-2-yl}car bamat

Zu einer Lösung von 45 mg (0.068 mmol) (2S)-4-[ {(lR)-l-[l-Benzyl-4-(2,5- difluorphenyl)-lH^yi ol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} (glycoloyl)amino]-2-({[2- (trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl } amino)butansäure in 5.8 ml DMF wurden 22.2 mg (0.068 mmol) (2R)-N-(2-arninoethyl)-2-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-l .H-pyrrol-1 -yOpropanamid (1 :1 ) Trifluoressigsäure zugegeben. Nach 30 Minuten Rühren bei RT die Mischung wurde mit 39 mg (0.10 mmol) ITATU und 36 mg (0.27 mmol) Ν,Ν-Diisopropylethylamin versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 1 h bei RT gerührt. Das Gemisch wurde ohne Aufarbeitung mittels präparative HPLC gereinigt. Man erhielt 7 mg (12 % d. Th) der Titelverbindung.

LC-MS (Methode 1): R, = 1.41 min; MS (ESIpos): m/z 851 (M+H) ⁴ Γ/3

Intermediat LI

Trifluoressigsäure--N-(2-aminoethyl)-2^

Die Titelverbindung wurde nach klassischen Methoden der Peptidchemie aus kommerziell erhältlicher (2,5-Dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)essigsäure und tert-Butyl-(2-aminoethyl) earbamat hergestellt.

HPLC (Methode ! 1): R _t = 0.19 min;

LC-MS (Methode 1): R _t = 0.17 min; MS (ESipos): m/z = 198 (M+HJ

jhitgrmgdiat_L2_

Trifluoressigsäure--rel-(lR,2S)-2-amino-N-[2-(2,5-dioxo- 2,5-dihydro-lH-pyTO

yl)ethyl] cyclopentancarboxamid( 1 :1)

Die Titelverbindung wurde ausgehend von 50 mg (0.214 mmol) von kommerziell erhältlicher eis- 2-[(tert-Butoxycarbonyi)amino]-l-cyclopentaiicarbonsäure mit 60 mg (0.235 mmol) von ebenso kommerziell erhältlichem Trifluoressigsäure—1.-(2-aminoethyl)-l H-pyrrol-2,5-dion(l :1) durch Kupplung mit EDC/HOBT und anschließender Entschützung mit TFA hergestellt. Es wurden 36 mg (38% d.Th. über 2 Stufen) der Titelverbindung erhalten.

HPLC (Methode 11): R, = 0.2 min;

LC-MS (Methode 1): R, = 0.17 min; MS (ESIpos): m z = 252 (M+H) ⁺ . Intermedia! L3

Trifluoressigsäure--(lS,2R)-2-ammo-N^

yl)ethyl]cyclopentancarboxamid( 1 : 3 )

Die Titelverbindung wurde ausgehend von 50 mg (0.214 mmol) von kommerziell erhältlicher (lS,2R)-2-[(tert-Butoxycarbonyl)amino]cyclopeniancarbonsäx3 re mit 72 mg (0.283 mmol) von ebenso kommerziell erhältlichem TrifluoressigsäiU"e--l-(2-aminoethyl)-lH-pyTiOl-2,5-dion(l :l) durch Kupplung mit EDC/HOBT und anschließender Entschützung mit TFA hergestellt. Es wurden 13 mg (16% d.Th. über 2 Stufen) der Titelverbindung erhalten.

HPLC (Methode 11): R _t = 0.2 min;

LC-MS (Methode 1): R, = 0.2 min; MS (ESIpos): m/z - 252 (M+H)' ^' .

liitermediat L4

T ^' rifluoressigsäui"e--N-(2-aminoethyi)-4-(2,5-dioxo-2 ,5 -dihydro- 1 H-pyrrol- 1 - yl)cy clohexancarboxamid( 1 : 1 )

Die Titelverbindimg wurde nach klassischen Methoden der Peptidchemte aus kommerziell erhältlichem l-[(4-{[(2,5-Dioxopyrroli(Hn-l-yl)oxy]carbonyl}cyclohexyl)me myl]-lH-pyrrol-2,5- dion und tert-Butyl-(2-aminoethyl) carbamat hergestellt.

HPLC (Methode 1 1): R _t = 0.26 min;

LC-MS (Methode 1): R _t = 0.25 min; MS (ESIpos): m/z = 280 (M+H) Intejrjnediajj S

Trifluoressigsäure-N- [4-(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yOphenyl] -beta-alaninamid( 1 :1)

Die Titelverbindung wurde nach klassischen Methoden der Peptidchemie aus kommerziell erhältlichem 1 -(4-Aminopheriyl)-l H-pyrrol-2,5-dion und N~(tert-Butoxycarbonyl)~beta-alanin hergestellt.

HPLC (Methode 1 1): R _t = 0.22 min;

LC-MS (Methode 1): R _t = 0.22 min; MS (ESIpos): m/z = 260 (M+H) ⁺ .

Intejmiediat L6

Trifluoressigsäure--tert-butyl-N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihyd ro-lH-pyrrol-l-yl)hexanoyl]i

alanyi-L-lysinat

Die Titel Verbindung wurde zunächst durch Kupplung von kommerziell erhältlicher 6-(2,5-Dioxo- 2,5-dihydro-lH-pyrroi-l-yl)hexansäure mit dem nach klassischen Methoden der Peptidchemie hergestellten partiell geschützten Peptid tert-Butyl-L-valyl-L-alanyl-N ⁶ -(tert-butoxycarbonyl)-L- lysinat in Gegenwart von EDC/HOBT hergestellt. Anschließend erfolgte die Entschützung an der Aminogaippe unter schonenden Bedingungen durch Rühren in 5%iger Trifluoressigsäure in DCM bei RT, wobei in 37%iger Ausbeute die Titel Verbindung erhalten wurde. HPLC (Methode 1 1): R _t = 1.29 min;

LC-MS (Methode 1): \l ----- 0.62 min; MS (ESIpos): m/z = 566 (M+H) ⁺ .

Intermediat iL 7

Trifluoressigsäure--beta-alany^

yl)phenyl] -L-ornithinamid( 1 : 1)

Die Titelverbindung wurde nach klassischen Methoden der Peptidchemie ausgehend von kommerziell erhältlichem l-(4-Aminophenyl)- lH-pyrrol-2,5-dion durch sequentielle Kupplung mit N ² -(tert-Butoxycarbonyl)-N ⁵ -carbamoyl-L-omithm in Gegenwart von HATIJ, Entschützung mit TFA, Kupplung mit 2 -Dioxopyrrolidin-l -yl-N-(tert-butoxycarbonyl)-L-valinat, Entschützung mit TFA, Kupplung mit 2,5-DioxopyTrolidin~l -yl-N~(tert~butoxycarbonyl)-beta~alaninat und erneute Entschützung mit TFA hergestellt. Es wurden 32 mg der Titel Verbindung erhalten.

HPLC (Methode 1 1): R _t = 0.33 min;

LC-MS (Methode 1): === 0.47 min; MS (ESIpos): trv'z === 516 (M+H) \

:77

IntennedjajJLg

Trifluoressigsäure--L-aiar -N ⁵ -carbam

L-ornithinamid( 1 : 1 )

Die Titelverbindung wurde nach klassischen Methoden der Peptidehemie ausgehend von kommerziell erhältlichem l-(4-Aminophenyl)-lH-pyrrol-2,5-dion durch sequentielle Kupplung mit N ² -(tert-Bx3toxycarbonyl)-N ⁵ -c^amoyi-L-onü1hiQ in Gegenwart von HATU, Entschmutzung mit TFA, Kupplung mit 2,5-Dioxopyrrolidm-l -yl-N-(tert-butoxycarbonyl)-L-alaninat und erneute Entschützung mit TFA hergestellt. Es wurden 171 mg der Titelverbindung erhalten.

HPLC (Methode 1 ): R _t = 0.23 min;

LC-MS (Methode 7): R _t = 0.3 min; MS (ESIpos): m/z - 417 (M+HV\

Intermediat L9

Trifluoressigsäure--beta-alanyl-L-valyl-N^

omithinamid( 1 : 1)

:78

Die Titelverbindung in Analogie zu Intermediat L7 ausgehend von kommerziell erhältlichem Memyl-(4-aminophenyl)acetat hergesteilt. Es wurden 320 mg der Titelverbindung erhalten.

HPLC (Methode ! 1): R _t = 0.45 inin;

LC-MS (Methode 1): R _t = 0.48 min; MS (ESTpos): m/z = 493 ( \1 I I ) .

Intermediat L1Ö

N-[6-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro H^ytxol-l -yl)hexanoyl]-L-valyl-L-alanyl-rel-N*-{[(l^

ammocyelopentyl]carbonyl}-L-lysin rifluoressigsäure(l :2)

Die Titelverbindung wurde ausgehend von Intermediat 1,6 durch Kupplung mit cis-2-[(tert- Bi!toxycarbonyl)amino]-l-cyclopentancarbonsäui-e mit EDC/ΉΟΒΤ und anschließender Entschützung mit TFA hergestellt. Es wurden 12 mg (52% d.Th. über 2 Stufen) der Titelverbindung erhalten .

HPLC (Methode i 1): R _t = 1.45 min;

LC-MS (Methode 1): R, = 0.73 min; MS (ESIpos): m/z = 677 (M+H) ⁺ . Intenn ij iJLll

N- [6-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro- 1 H-p rrol- 1 -yl)hexanoyl] -L-valyl-L-alanyl-N ⁶ - { [( 1 S,2R)-2- ammocyclopentyl]carbonyl}-L-lysin-trifluoressigsäure(l :2)

Die Titelverbindung wurde ausgehend von Intermediat L6 durch Kupplung mit (l S,2R)-2-[(tert- Butoxycarbonyi)amirio]cyciopentancarbonsäure mit EDC/HOBT und anschließender Entsehützung mit TFA hergesteilt. Es wurden 1 1 mg (39% d.Th. über 2 Stufen) der Titelverbindung erhalten. HPLC (Methode 1 1): R _t = 1.45 min;

LC-MS (Methode 1 ): R _t = 0.74 min; MS (ESipos): m/z = 677 (M+H) ⁺ .

Intermediat L12

Trifluoressigsäure— 1 - [2-(2-aminoethoxy)ethyl] - 1 H-pyrrol-2,5 -dion( 1 : 1)

Zu 228 mg ( 1.12 mmol) tert-Butyl-[2-(2-aminoethoxy)elhyl]carbamat gelöst in 7 mL Dioxan/Wasser 1 : 1 gelöst wurden 381 mg (2.46 mmol) Meihyl-2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol- 1 -carboxylat gegeben. Dann wurden 1.2 mL einer gesättigten Natriumhydrogencarbonat Lösung zugesetzt und der Ansatz bei RT gerührt. Nach insgesamt 5-tägigem Rühren bei 2 weiteren Zugaben von gleichen Mengen der Natriumhydrogencarbonat Lösung wurde der Ansatz durch Ansäuern mit Trifluoressigsäure, Einrotieren und Reinigung des Rückstandes durch präparative HPLC aufgearbeitet. Die entsprechenden Fraktionen wurden vereinigt, das Lösungsmittel im Vakuum entfernt und der Rückstand aus Acetonitrii/Wasser 1 : 1 lyophilisiert.

Der Rückstand wurde in 3 mL Diehiormeihan aufgenommen und mit 1 mL Trifluoressigsäure versetzt. Nach 15 min Rühren bei RT wurde das Lösungsmittel im Vakuum entfernt und der Rückstand aus Acetonitrii/Wasser 1 : 1 lyophilisiert. So wurden 70 mg (67% d.Th. über 2 Stufen) der Titelverbindung als harziger Rückstand erhalten.

HPLC (Methode 3 1): = 0.2 min;

LC-MS (Methode 1): R _t = 0.18 min; MS (ESIpos): m z = 185 (M+H) ⁺ .

In eraiediaLL13

Trifluoressigsäure- ert-buty ² -[(2,5-dioxo-2,5-dihydro-l H-p yrrol- 1 -yi)acetylj-L-lysinat( 1 : 1)

Die Titelverbindung wurde durch Kupplung von (2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol- l -yl)essigsäure mit tert-Butyl-N ⁶ -(tert-butoxycarbonyl)-L-lysinathytiiOchlorid(l : l) in Gegenwart von EDC/HOBT und anschließender schonender Abspaltung der tert-Butoxycarbonyl Schutzgruppe in Analogie zu Intermediat L6 hergestellt.

HPLC (Methode 1 1): R, = 0.42 min;

LC-MS (Methode 1): R _t = 0.43 min; MS (ESIpos): m/z = 340 (M+H) ⁺ . Intermedia! L14

Trifluoressigsäure-- 1 - [2-(4-amino H-pyrrol-2,5-dion( 1 :1)

Die Titel Verbindung wurde in Analogie zu Intermediat L2 über 2 Stufen aus tert-Butyl-piperazin-1 - yicarbamat und {2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrroi-l -yl)essigsäure hergestellt.

HPLC (Methode 1 1): R, = 0.2 min;

LC-MS (Methode 3): = 0.25 min; MS (ESIpos): m/z = 239 (M+H) ⁺ .

In eraiedUaLL15

Trifluoressigsäure--N-(2-aininoelhyl)-3-(2-{2-[2-(2,5-di oxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol- yljethoxy] ethoxy } ethoxy )propananiid( 1 : 1 )

2.93 g ( 10.58 mmol) tert-Butyl-3 - {2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethoxy}propanoat wurden in 100 mL Dioxan/Wasser 1 : 1 gelöst und mit 3.28 g (21.15 mmol) Methyl-2,5-dioxo-2,5-dihydro-l H- pyrroi- 1 -carboxylat sowie einer gesättigten Natriutnhydrogencarbonatlösung bis zum Erreichen eines pH-Wertes von 6-7 versetzt.. Die Lösung wurde 30 min bei RT geröhrt und anschließend wurde das 1 ,4-Dioxan im Vakmun abgedampft. Dann wurden 200 mL Wasser zugegeben und die Mischung dreimal mit jeweils 300 mL Elhyiacetat ausgeschüttelt. Die organischen Extrakte wurden vereinigt, über Magnesiumsulfat getrocknet und filtriert. Nach Einengen wurde tert-Butyl-3-(2- {2- [2-(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)ethoxy] ethoxy} ethoxy)propanoat als braunes Öl erhalten, das anschließend im Hochvakuum getrocknet wurde.

HPLC (Methode 1 1): R _t = 1.5 mm; LC-MS (Methode 3): R _t = 0.88 min; MS (ESIpos): m/z = 375 (M+NH,) ^"

Dieses Intermeöiat wurde nach Standard verfahren (Enischützung mit TFA, Kupplung mit terl- Butyl-(2-aminoethyl)carbamat und erneute Enischützung mit TFA) in die Titelverbindung überführt.

HPLC (Methode i 1): R _t = 0,2 min;

LC-MS (Methode 3): R _t = 0.25 min; MS (ESIpos): m/z = 344 ·; \! · ϋ ί .

In eraiediaOJjj;

N- [6-(2,5-Dioxo-2 ,5 - yi-L-ornithm

Zu einer Lösung von 266 mg (1.33 mmol) L-Valyl-N5-carbamoyl-L-ornithin in 2,4 mL DMF wurden 535 mg (1 .73 mmol) von kommerziell erhältlichem l-{6-[(2,5-Dioxopyrrolidin-l -yl)oxy]- 6-oxohexyl } - lH-pyrrol-2,5-dion sowie 930 mL NN-Diisopropylethylamin hinzugegeben. Der Ansatz wurde 24 h im Ultraschallbad behandelt und anschließend im Vakuum bis zur Trockene eingeengt. Der verbliebene Rückstand wurde mittels präparativer HPCL gereinigt und nach Einengen der entsprechenden Fraktionen und Trocknung des Rückstandes im Hochvakuum verblieben 337 mg (50% d.Th.) der Titelverbindurig.

HPLC (Methode 1 1): R _t = 0.4 min;

LC-MS (Methode 3): R, = 0.58 min; MS (ESIpos): m/z = 468 < \M Ü . IntejttnjgdjajJLTZ

Trifluoressigsäure--tert-butyl-N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihy( iro-lH-pyrrol-l -yl)hexanoy

earbamoyl-L-omithyl-L-lysinat(l : I )

Die Titelverbindung wurde zunächst durch Kupplung von 172 mg (0.37 mmol) Mermediat L16 und 125 mg (0.37 mmol) tert-Butyl-N6-(tert-b«toxycarbon.yl)-L-lysinat hydrochlorid(l : i ) in Gegenwart von EDC/HOBT und Λ',Λ'-Diisopropyiethyiamin und anschließende Entschützung der Aminogruppe unter schonenden Bedingungen durch 2h Rühren in 10%iger Trifluoressigsäure in DCM bei RT hergestellt. Nach Gefriertrocknung aus Acetonitril/ Wasser wurden 194 mg (49% d.Th.) der Titelverbindung über 2 Stufen erhalten.

HPLC (Methode 1 1): R _t = 1.1 min;

LC-MS (Methode 1): = 0.58 min; MS (ESIpos): m z = 652 (M+H) ⁺ .

Intermediat L18

Trifluoressigsäure--beta-alanyl-L-alanyl->J ⁵ -carbamoyl-N-[4-(2-methoxy-2-oxoethyl)phenyl]-L- ornithinaniid( 1 : 1)

Die Titelverbindung wurde ausgehend von Methyl-(4-aminophenyi)acetat analog Intermediat L sequentiell nach klassischen Methoden der Peptidchemie durch Anknüpfung von N ² -(tert- ButoxycarbonyiVN^-carbamoyl-L-oraiihin in Gegenwart von HATU, Entschützung mit TFA, Kupplung mit 2,5-Dioxopyrrolidin- 1 -yl-N-(tert-butoxy carbonyl)-L-aianinat, Entschützung mit TFA, Kupplung mit 2,5-Dioxopyrrolidin-l-yl-N-(tert-butoxyearbonyl)-beta-alanin at und erneute Entschützung mit TFA hergestellt. Es wurden 330 mg der Titelverb indung erhalten.

HPLC (Methode 11): R, = 0.29 min;

LC-MS (Methode 1): R _t = 0.41 min; MS (ESIpos): m 'z = 465 (M+HJ

liiterraediat L 19

Trifluoressigsäure--L-alanyl-N5-c^^

yl)acetyl]amino}phenyl)-L-ornithmamid(l : 1 )

Die Titelverbindung wurde ausgehend von 1,4 Phenylendtamin sequentiell nach klassischen Methoden der Peptidchemie hergestellt. Im ersten Schritt wurden 942 mg (8.72 mmol) 1 ,4 Phenylendiamin mit 0.8 g (2.9 mmol) N ² -(tert-Butoxycarbonyl)-N ^:1 -carbamoyl-L-ornithin in Gegenwart von HATU und NN-Diisopropylethylamin monoacyliert. Im zweiten Schritt wurde in analoger Weise die zweite anilinische Aminogruppe mit (2,5-Dioxo-2,5-dihydro-l H-pyrrol-1 - yl)essigsäure in Gegenwart von HATU und NN-Diisopropylethylamin acyliert. Entschützung mit TFA, Kupplung mit 2,5-Dioxopyrrolidin-l-yl-N-(tert-butoxycarbonyl)-L-alaninat und erneute Entschützung mit TFA führten dann in 3 weiteren Syntheseschritten zur Titelverbindung, von der auf diesem Weg 148 mg erhalten wurden.

LC-MS (Methode 1): === 0.21 min; MS (ESIpos): m/z === 474 (M+H) ⁺ .

LC-MS (Methode 4): R, = 0.2 min; MS (ESIpos): m/z = 474 (M+H) i ßJ SÜl lQ.

Trifluoressigsäiire--L-valyi- ^" -carbarnoyl- -[4-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-ir^

ornithinamid(l : l)

Die Titelverbindung wurde nach klassischen Methoden der Peptidchemie anaiog zu Intennediat L8 ausgehend von kommerziell erhältlichem 1 -(4-Aminophenyl)-l H-p rrol-2,5-dioH durch sequentielle Kupplung mit rN^-itert-ßutoxycarbony^-N'-carbamoyl-L-oniithin in Gegenwart von HATU, Entschuldung mit TFA, Kupplung mit 2,5-Dioxopyrrolidin-l-yl-N-(tert-butoxycarbonyl)- L-valinat und erneute Entschützung mit TFA hergestellt. Es wurden 171 mg der Titel Verbindung erhalten.

HPLC (Methode 1 1): R _t = 0.28 min;

LC-MS (Methode 1): R _t = 0.39 min; MS (ESIpos): m/z = 445 (M+H) ⁺ .

Intejmi igtLll

L-Valyl-N ⁶ -(tert-butoxycarbonyl)-N-[4-(2-methoxy-2-oxoethyl)phen yl]-L-lysinainid

Die Titelverbindung wurde nach klassischen Methoden der Peptidchemie ausgehend von kommerziell erhältlichem 0.42 g (2.56 mmol) Methyl-(4-aminophenyl)acetat durch sequentielle Kupplung mit N6-(iert-Butoxycarbonyi)-N2-[(9H-fluoreai-9-ylmethoxy)carbon yl]-L-lysin in Gegenwart von HATU, und N,A-Diisopropylethylamin, Entschützung mit Piperidin, Kupplung mit 2,5-Dioxopyrrolidin-l-yl-N-[(benzyloxy)carbonyl]-L-valinat in Gegenwart von N,N-Diisopropyl- ethylamin und anschließende hydrogenolytische Abspaltung der Benzyloxycarbonylschutzgruppe über 10%-Palladium- Aktivkohle. Es wurden 360 mg (32% d.Th. über 4 Stufen) der Titel Verbindung erhalten.

HPLC (Methode 1 1 ): R _t = 1.5 min;

LC-MS (Methode 1): R _t = 0.73 min; MS (ESIpos): m/z = 493 (M+H) ⁺ .

Intermediat L22

Trifluoressigsäure - -N- [(9H-fluoren -9-ylmethoxy)carbonyl ] -L-valyl-N- {4-[(2 S)-2 -amino-3 - methoxy-3 -oxopropyljphenyl} -N ⁵ -carbamoyl-L-omithinamid( l : 1 )

Die Titelverbindung wurde ausgehend von N-(tert-Butoxycarbonyl)-4-nitro-L-phenylalanin sequentiell nach klassischen Methoden der Peptidchemie hergestellt. 2.5 g (8.06 mmol) von diesem Edukt wurde im ersten Schritt zunächst in das Caesiumsaiz und dann mit Iodmethan in DMF in den Methyl ester überführt.

Hydrogenolytisch wurde dann in Methanol über 10% Palladium- Aktivkohle die Nitrogruppe in eine Aminogruppe überführt.

Die so generierte Aminogruppe wurde dann mit N5-Carbamoyl-N2-[(9H-fluoren-9- ylmethoxy)carbonyl]-L-ornithin in DMF in Gegenwart von HATU und NN-Diisopropylethylamin acyliert. Im nächsten Schritt wurde die Fmoc-Gruppe mit Piperidin in DMF abgespalten.

Anschließend erfolgte in DMF die Kupplung mit N-[(9H-Fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl]-L-valin in Gegenwart von I -(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiiniid-Hydrochlo:rid, 1 -Hydroxy-IH- benzotriazol-Hydrai und N,N-Diisopropylethylamtn und schließlich die Abspaltung d Butoxycarbonylgruppe mit Trifluoressigsäure.

HPLC (Methode ! 1): R _t = 1.6 min;

LC-MS (Methode 1): R _t = 0.77 min; MS (ESipos): m/z = 673 (M+H) ⁺ .

liitermediat L23

Trifluoressigsäin"e--N-[2-(2,5-dioxo-2,5-dihydTO-lH-pyrr ol-l-yl)ethyI] 1 : 1

Die Titelverbindung wurde ausgehend von kommerziell erhältlichem Trifluoressigsäure— 1 -(2- aminoethyl)-lH-pyrrol-2,5-dion(l :1) durch Kupplung mit N-(tert-Butoxycarbonyl)-beta-alanin in Gegenwart von EDCI/HOBT und NN-Diisopropylethylarnin und anschließende Entschützung mit Trifluoressigsäure hergestellt.

HPLC (Methode 1 1): R _t = 0.19 min.

Intermedia! L24

Trifluoressigsäure--l-amino-N-[2-^^ _^

cyclopropancarboxamid(l : 1 )

114 mg (0.67 mmol) von kommerziell erhältlicher l-[(tert-Butoxycarbonyl)amino]cyclopropan carbonsäure wurden in 25 mL DCM gelöst und mit 110 mg (0.623 mmol) von kommerziell erhältlichem Trifluoressigsäure-! -(2 -aminoethyl)-lH-pyiTol-2,5-dion(l : l) sowie mit 395 μί Ν,Ν- Diisopropylethylamin versetzt und auf -10°C abgekühlt. Dann mirden 217 mg (0,793 mmol) 2- Brom-1 -ethylpyridiniitmtetrafliioroborat zugegeben und der Ansatz 2 h bei RT gerührt. Anschließend wurde mit Ethylacetat verdünnt und nacheinander mit 10%-iger Zitronensäure, gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung un gesättigter Natriumchioridlösubng ausgeschüttelt, dann über Magnesiumsulfat getrocknet und eingeengt. Nach Trocknung im Hochvakuum wurden 352 mg des geschützten Intermediats erhalten.

Diese wurden anschließend in 10 mL DCM aufgenommen und mit 1 mL Trifluoressigsäure entschützt. Nach LyophiHsation aus Acetonitril/Wasser wurden 358 mg (71% d.Th. über 2 Stufen) der Titelverbindung erhalten.

HPLC (Methode 1 1): R _t = 0.19 min.

LC-MS (Methode 3): R _t = 0.98 min; MS (ESIpos): m/z = 224 (M+H) ⁺ .

Intejrm igtL25

N-[31 -(2,5-Dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol-l-yl)-29-oxo-4,7, 10,13,16,19,22,25-octaoxa-28- azahentriacontan- 1 -oyl] -L-valyl-L-alanin

31.4 mg (0.17 mmol) Valyl-L-alanin wurden in 3.0 mL DMF gelöst und mit 115.0 mg (0.17 mmol) 3 -(2,5 -Dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol - 3 -yl)-N- {27-[(2,5-dioxopyrrolidin- 1 -yl)oxy] -27-oxo- 3,6,9,12, 15, 18,21,24-octaoxaheptacos-l -yl}propanamid und mit 33.7 mg (0.0.33 mmol) Triethylamin versetzt. Es wurde über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde direkt über die präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 74.1 mg {58 % d. Tfa.) der Titelverbindung.

LC-MS (Methode 1): R _t = 0.61 min; MS (ESIpos): m/z = 763 [ V! ! ! | .

Intejrm igtL26

L-Valyl-N6-(tert-butoxycarbonyl)-L-ly

600.0 mg (1.58 mmol) N2-[(Benzyloxy)carbonyl]-N6-(tert-butoxycarbonyl)-L-iysin wurden in 25.0 mL Wasser/Ethanoi/THF (1 :1 :0.5) suspendiert und mit Palladium auf Kohle (10%ig) versetzt und bei RT mit Wasserstoff unter Normaldruck 5 h hydriert. Der Katalysator wurde abfiltriert und die Lösemittel im Vakuum verdampft. Die erhaltene Verbindung wurde ohne weitere Reinigung in der nächsten Stufe eingesetzt.

LC-MS (Methode 1): R _t = 0.42 min; MS (ESIpos): m/z = 247 [M+H] ⁺ .

180 mg (0.73 mmol) N6-(tert-Butoxycarbonyl)-L-lysin wurden in 5.0 mL DMF gelöst und mit 74.0 mg (0.73 mmol) Triethyiamin versetzt. Dann wurden 254.6 mg (0.73 mmol) 2,5-Dioxopyrrolidin- 1 -yi-N-[(benzyloxy)carbonyl]-L-valinat und 74.0 mg (0.73 mmol) Triethyiamin zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde 3.5 h bei RT gerührt. Die Reaktionslösung wurde direkt über die präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1 % TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 294.1 mg (76 % d. Th.) N-[(Benzyloxy)carbonyl]-L-valyl-N6-(tert-butoxycarbonyl)-L- lysin.

LC-MS (Methode 1): R _t = 0.97 min; MS (ESIpos): m/z = 480 [M+H] ⁺ . 272.2 mg (0.57 mmol) N-[(Benzyloxy)carbor!yi]-L-val} -N6-(tert-buioxycarboiiyl)-L-tysin wurden in 20.0 mL Ethylacetat/Ethanol/THF (1 : 1 : 1) vorgelegt und mit 27.2 mg Palladium auf Aktivkohle versetzt. Man hydrierte mit Wasserstoff bei RT unter Normaldruck 5 h. Es wurde mit Hilfe von Celite ^(R - abfiltriert und der Filterkuchen mit

Ethylacetat/Ethanol/THF (1 :1 :1) nachgewaschen. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Die Titelverbindung (182 mg, 72 % d. Th.) wurde in der nächsten Reaktionsstufe ohne weitere Reinigung eingesetzt.

LC-MS (Methode 1): R. _t = 0.53 min; MS (ESIpos): m/z = 346 [M+H] ⁺ .

Intermediat L27

N-[31 -(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-l H-pyrrol- 1 -yl)-29-oxo-4,7,l 0, 13,16, 19,22,25-octaoxa-28- azahentriacontan- 1 -oyl] -L-valyl -N6-(tert-butoxycarbonyI)-L-]ysin

30 mg (0.07 mmol) L-Valyi-N6-(tert-butoxycarbonyl)-L-iysin (Intermediat L26)

und 46.1 mg (0.07 mmol) 3-(2,5-Dioxo-2,5-dmy<iro-lH-pyrrol-l-yl)^

1 -yl)oxy]-27-oxo-3,6,9, 12,15, 18,21 ,24-octaoxaheptacos- 1 -yl}propanamid wurden in 1.5 mL DMF vorgelegt und mit 6.8 mg (0.07 mmol) 4-Methylrnorphoiin versetzt. Die Reaktionslösung rührte bei RT über Nacht. Die Reaktionsmischung wurde direkt über die präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 rnL/rnin, MeCN/Wasser). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 55.6 mg (90 % d. Th.) der Titelverbindung.

LC-MS (Methode 1): R _t = 0.77 min; MS (ESIpos): m/z = 920 [M+H] ⁺ . jfatennediatjL28 tert-Butyl-3-formyl-4-({[2-(1rimethylsilyl)ethoxy

461 ,7 mg (1.15 mmol) l-iert-Butyl-3-ethyl-4-({[2-

(trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl}amino)pyrrolidin-l ,3-dicarboxyiat (Diese Verbindung wurde gemäß Literaturvorschrifl WO 2006/066896 hergestellt) mirden in 5.0 mL absol. Dichionriethan vorgelegt und auf -78 °C abgekühlt. Dann wurde langsam 326.2 mg (2.29 mmol)

Diisobutyiahuniniurnhydi'id-Lösung (1 M in THF) zugetropft und 2 h bei -78 °C gerührt

(Dünnschichtchromatographische Kontrolle (Petrolether/Ethylacetat = 3: 1). Es wurden 1.3 g (4.59 mmol) Kaliumnatriumtartrat gelöst in 60 mL Wasser zugetropft und die Reaktionsmischung auf RT kommen gelassen. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat versetzt und die wässrige Phase dreimal mit Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden einmal mit ges. NaCl-Lösung gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösemittel wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 629.0 mg der

Titelverbindung als Rohprodukt, welches ohne weitere Reinigung sofort in der nächsten

Reaktionsstufe eingesetzt wurde.

tert-But l-3 -formyl-4-[( { [2-(trimethylsilyr)ethoxy]carbony

Mischung aus Diastereomeren.

807.1 mg (2.34 mmol) tert-Butyl-3-( {[tert-butyl(dimethyl)silyl]oxy}methyl)-4- (hydroxymethyi)pyrroiidin-I -carboxyiat (Die Herstellung erfolgte gemäß der Literaturvorschrift WO 2006/100036) wurden in 8.0 mL Dichlormethan vorgelegt, und 236.4 mg (2.34 mmol) Triethylamin zugegeben. Bei 0 °C wurden 267.6 mg (2.34 mmol) Methansulfonsäurechlorid zugetropft und die Reaktionsmischung über Nacht bei RT gerührt. Es erfolgte eine weitere Zugabe von 133.8 mg (1.17 mmol) Methansulfonsäurechlorid und 118.2 mg (1 .17 mmol) Triethylamin. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT gerührt. Es wurde mit Dichlormethan verdünnt und die organische Phase je einmal mit ges. Nalriumhydrogencarbonat-Lösung, 5%iger KaliumhydiOgensulfat-Lösurig und ges. NaCl-Lösung gewaschen. Nach der Trocknung über Magnesiumsulfat wurde das Lösemittel im Vakuum verdampft und der Rückstand wurde mittels Biotage Isolera gereinigt (Kieselgel, Säule 50 g SNAP, Fluss 66 mL/min, Cyclohexan/Ethylacetat). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 402.0 mg (41 % d. Th.) der Verbindung tert-Butyl-3-({[tert- butyl(dimethyl)silyl]oxy}memyl)-4-{ [(methylsulfonyl)oxy]methyl}pyrrolidin-l-carboxylat LC-MS (Methode 1): R, = 1.38 min; MS (ESIpos): m z = 424 [M+H] ⁺ .

400.0 mg (0.94 mmol) tert-Butyl-3 -( {[tert-butyl(dimethyl)silyl]oxy}methyl)-4- {[(methylsulfonyl)oxy]methyl}pyrrolidin-l-carboxylat "wurden in 5.0 ml, DMF vorgelegt und mit 98.2 mg (1.51 mmol) Natriumazid versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 10 h bei 40 °C gerührt. Dann wurden nochmals 30.7 mg (0.47 mmol) Natriumazid zugegeben und weitere 10 h bei 40 °C gerührt. Es wurde Ethylacetat zugegeben und die organsiche Phase mehrmals mit Wasser gewaschen. Nach der Trocknung der organischen Phase über Magnesiumsulfat wurde das Lösemittel im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 309.5 mg (89 % d. Th.) der Verbindung tert-Buiyl-3-(azidome1hyl)-4-( { [tert- butyl(dimethyl)silyl]oxy}methy])py^olidin-l~carboxylat. Die Verbindung wurde ohne weitere Reinigung in der nächsten Synthesestufe eingesetzt.

LC-MS (Methode 1): R _t = 1.50 min; MS (ESIpos): m/z = 371 [M+H] ⁺ .

250 mg (0.68 mmol) tert-Butyl-3-(azidomethyl)-4-({[tert- butyl(dimethyl)silyl]oxy}methyl)pyiTolidin-l-carboxylat wurden in 10.0 mL Ethyiac etat/Ethanol (1 : 1) gelöst und mit 25.0 mg Palladium auf Aktivkohle (10%) versetzt. Man hydrierte mit Wasserstoff bei RT unter Normaldruck 8 h. Die Reaktion wurde über Celite^ filtiert und der Filterkuchen intensiv mit Ethylacetat gewaschen. Das Lösemittel winde im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 226.2 mg (82 % d. Th.) der Verbindung tert-Butyl-3 ~(aminomethy!)-4~( { [tert-butyl(dimethyl)silyl]oxy}methyl)pyrrolidin- 1 -carboxyiat. Die Verbindung wurde ohne weitere Reinigung in der nächsten Synthesestufe eingesetzt.

LC-MS (Methode 1): R. ₍ = 0.89 min; MS (ESIpos): m/z = 345 [M+H] ⁺ .

715.0 mg (2.08 mmol) tert-Butyl-3-(arainomethyl)-4-( { [tert- butyl(dimethyl)silyl]oxy}methyl)pyiTolidin-l -carboxyiat wurden in 15.0 mL THF gelöst und mit 2.28 mL (2.28 mmol) TBAF -Lösung (IM in TFIF) versetzt. Die Reaktionsmischung wurde bei RT über Nacht gerührt. Das Lösemittel wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand (1.54 g) ohne weitere Reinigimg in der nächsten Synthesestufe eingesetzt.

LC-MS (Methode 1): R _t = 0.41 min; MS (ESIpos): m/z = 231 [M+H] ⁺ .

1.54 g (4.88 mmol) tert-Buiyl-3-(ammomethyl)^-(hydroxymemyl^yrrolidin-l-carboxy lat wurden in 1,4-Dioxan vorgelegt mit 541 .8 mg (4.88 mmol) Calciumchlorid (wasserfrei) und 488.6 mg (4.88 mmol) Calciumcarbonat versetzt und kräftig gerührt. Dann wurden 592.8 mg (5.86 mmol) Triethylamin und 1.52 g (5.86 mmol) l-({[2-(TrimemyIsilyl)ethoxy]carbonyl}oxy)pyrrolidin-2,5- dion zugegeben und die Reaktionsmischung über Nacht bei RT gerührt. Es wurden 644.9 mg (10.7 mmol) HOAc und Ethylacetat zugegeben. Die organische Phase wurde zweimal mit Wasser und einmal mit ges. NaCl-Lösung gewaschen. Nach der Trocknung über Magnesiumsulfat wurde das Lsöemittel im Vakuum verdampft und der Rückstand mitteis Kieseigel (Laufmittel: Dichlormethan/Methanol = 100: 1) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 346.9 mg (19 % d. Th.) der Verbindung tert-Bu1yl-3-(hydroxymethyl)-4-[(^

carboxylat.

LC-MS (Methode 1): R _t = 1.08 min; MS (ESIpos): m/z = 375 [M+H] ⁺ .

804.0 mg (2.15 mmol) tert-Butyi-3-(hydi xymetiiyl)-4-[( {[2-

(trimemylsilyl)ethoxy]carbonyl}amino)memyl]pyrrolidin-l -carboxylat wurden in 20.0 mL Chloroform und 20.0 mL 0.05 N Kaliumcarbonat/0.05 N Natriumhydrogenearbonat-Lösung (1 : 1) vorgelegt. Dann wurden 59.7 mg (0.22 mmol) Tetra-n-butylammoniumehlorid, 429.9 mg (3.22 mmol) N-Chlorsuccinimid und 33.5 mg (0.22 mmol) TEMPO zugegeben und die Reaktionsmischung kräftig über Nacht bei RT gerührt. Die organische Phase wurde abgetrennt und im Vakuum vom Lösemittel befreit. Der Rückstand wurde mittels Kieseigel (Lausfmittel: Cyclohexan/Ethylacetat = 3: 1) gereinigt. Man erhielt 517.0 mg (46 % d. Th.) der Titelverbindung. LC-MS (Methode 1): R, = 1.13 min; MS (ESIpos): m z = 373 [M+H] ⁺ .

Intermediat L30 tert-Buty 1-3 -( { [tert-butyl(dimethyl)silyl]oxy } methy l)-4-formylpyrrolidin- 1 -carboxylat

Mischung aus Stereoisomeren

250.0 mg (0.72 mmol) tert-Butyl-3-({[tert-butyl(dimethyl)silyl]oxy}methyl)-4- (hydroxymethyl)pyrrolidin-l -carboxylat (Die Verbindung wurde gemäß der Literaturvorschrift WO2006/100036 hergestellt.) wurde in 12.5 mL Dichlormethan/DMSO (4:1) vorgelegt und mit 195

219.6 mg (2.17 mmol) Triethyiamm versetzt. Bei 2 °C wurde 345.5 mg (2.17 mmol) Schwefeltrioxid-Pyridin-Kompiex portionsweise zugegeben und 3 h bei 2 °C gerührt. Es wurden nochmals 345.5 mg (2.17 mmol) Schwefeltrioxid-Pyridin-Komplex portionsweise zugegeben und 17 h bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde zwischen Dichiormethan und Wasser verteilt. Die wässrige Phase wurde dreimal mit Dichiormethan extrahiert und die vereinigten organischen Phasen einmal mit Wasser gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösemittel wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Die Rückstand wurde ohne weitere Reinigung in der nächsten Synthesestufe eingesetzt (Dünnschichtcliromatographie: Petrolether/Ethylacetat 7:3).

Intermedia! L31

Di-tert-butyl- { [(tert-butoxycarbonyl)amino]methyl}maionat

Zu 600 mL Wasser wurden 57.2 g (488.27 mmol) iert-Butylcarbamat, 51.2 mL (683.57 mmol) einer 37%-igen Lösung von Formaldehyd in Wasser und 25.9 g (244.13 mmol) Natriumcarbonat addiert. Das Gemisch wurde erwärmt, bis eine Lösung entstand und dann bei RT für 16 h gerührt. Die entstandene Suspension wurde mit 500 mL Dichiormethan extrahiert, die organische Phase abgetrennt, mit gesättigter Natriumchlorid-Lös ng gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Es wurde am Rotationsverdampfer eingeengt und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet, wobei ein kristalliner Feststoff anfallt. Der Rückstand wurde in 1000 mL absoluten THF aufgenommen und bei RT ein Gemisch aus 322 mL (3.414 mol) Essigsäureanhydrid und 138 mL ( 1.707 mol) Pyridin zugetropft. Die Reaktionsmischung wurde bei RT für 16 h gerührt und anschließend am Rotationsverdampfer eingenegt, wobei das Wasserbad Raumtemperatur hatte. Der Rückstand wurde in Diethylether aufgenommen und drei mal mit einer gesättigten Natriumhydrogencarbonat-Lösung sowie ein mal mit einer gesättigten Natriumchlorid-Lösung gewasehen. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet, am Rotationsverdampfer eingeengt und der Rückstand 2 d im Hochvakuum getrocknet. Der Rückstand wurde in 2000 mL absolutem THF aufgenommen und linier Eiskühlung mit 456 mL (456.52 mmol) einer 1 M Lösimg von Kalium-tert-butanolat in THF versetzt. Es wurde 20 Min. bei 0°C gerührt und anschließend 100.8 g (456.52 mmol) Di-tert-butylmalonat gelöst in 200 mL absolutem THF zugetropft. Es wurde 48 h bei RT gerührt und anschließend Wasser addiert. Das Reaktionsgemisch wurde am Rotationsverdampfer eingeengt und in 500 mL Essigsäureethylester aufgenommen. Das Gemisch wurde mit 500 L Wasser und 100 mL einer gesättigten Natriumchlorid-Lösung gewaschen und die organische Phase über Natriumsulfat getrocknet. Die organische Phase -wurde am Rotationsverdampfer eingeengt und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Der Rückstand wurde mittels Filtration über Kieselgel (Eluent: Cylohexan Essigsäureethylester, Gradient = 30: 1 --> 5:1) gereinigt. Es wurden 37.07 g (22% d. Th.) der Zielverbindung erhalten.

LC-MS (Methode 6): R _t = 2.87 min; MS (ESIpos): m/z = 346 [M+H] ⁺ .

lntennediatJL32 tert-Butyl-[3-hydroxy-2-(hydroxymethyl)propyl]carbamat

37.0 g (107.1 1 mmol) Di-tert-butyl-(acetoxymethyl)malonat wurden in 1000 ml, absolutem THF gelöst und unter Eiskühlung mit 535.5 mL (1071.10 mmol) einer 2 M Lösung von Lithiumborhydrid in THF tropfenweise versetzt. Es wurden 19.3 mL (1071.10 mmol) Wasser zugetropft und 4.5 h bei RT gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde am Rotationsverdampfer eingeengt und im Hochvakuum getrocknet. Der Rückstand wurde in 1500 mL Essigsäureethylester aufgenommen und mit 100 mL Wasser versetzt und 30 Min. unter Wasserkühlung gerührt (leicht exotherm). Die organische Phase wurde abgetrennt und die wässrige Phase zwei mal mit 500 mL Essigsäureethylester extrahiert. Die organische Phase wurde am Rotationsverdampfer eingeengt 97 und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Es wurden 20.7 g (94% d. Th.) der Zeilverbindung erhalten.

LC-MS (Methode 6): R, = 1.49 min; MS (EIpos): m/z = 106 [Μ-0 ₅ Η ₈ Ο ₂ Γ.

Intermediat L33 tert-Butyl-[3-{[tert-butyl(dimethyl)s

20.00 g (97.44 mmol) tert-Butyl-[3-hydroxy-2~(hydroxymetliyl)propyljcarbamat wurden in 1000 ml, absolutem DichloiTnethan gelöst und bei RT mit 6.63 g (97.44 mmol) imidazol sowie 16.16 g (107.18 mmol) iert-Butyl(chior)dimethylsüan versetzt. Es wurde 16 h bei RT gerührt und das Reaktionsgemisch mit halbkonzentrierter Natriumchlorid-Lösung gewaschen. Die wässrige Phase wurde mit Essigsäureethylester extrahiert und die vereinigten oranischen Phasen über Natrium sulfat getrocknet, am Rotationsverdampfer eingeengt und im Hochvakuum getrocknet. Es wurden 28.50 g (92% d. Th.) der Zielverbindung erhalten.

Ή-NMR (400 MHz, DMSO-de): δ [ppm] - 0.02 (s, 6H), 0.86 (s, 9H), 1.37 (s, 9H), 1.58-1.73 (m, 1H), 2.91 (q, 2H), 3.33-3.36 [m, (2H, verdeckt)], 3.53-3.58 (m, 2H), 6.65-6.72 (m, 1H). InteMn _ _j iJL34 tert-Bulyl-(3-{[tert-butyl(dimethyl)silyl]oxy} -2-fonrj lpropyl)carbamat

12.65 g ( 39.591 mmol) t^-Butyl-[3-{[tert-bu1yl(4ime l)silyl]oxy} -2-(hydroxymetliyl)pro- pyllcarbamat wurden in 200 mL Diehlormethan gelöst und bei RT mit und mit 19.31 g (45.53 mmol) Dess-Martin-Periodinan gelöst in 150 mL Diehlormethan tropfenweise versetzt. Das Gemisch wurde 2 h bei Raumtemperatur gerührt und anschließend mit 250 L einer halbkonzentrierten Natriumhydrogencarbonat-Lösung sowie mit 250 mL einer 10%-igen Natriummiosulfat-Lösung versetzt, und für 20 Min. gerührt. Die organische Phase wurde abgetrennt und die wässrige Phase mit Essigsäureethylester extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden mit 300 mL Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet, am Rotationsverdampfer eingeengt und im Hochvakuum getrocknet. Es wurden 11.35 g ( 90% d. Th.) der Zielverbindung erhalten.

Ή-NMR (400 MHz, DMSO-ds): 5 [ppm] = 0.02 (s, 6H), 0.84(s, 9H), 3 .36 (s, 9H), 1.48- 1 .51 (m, 1H), 3.08-3.32 [m, ( 3 H, verdeckt)], 3.50-3.58 (m, 2H), 3.83 -3,91 (m, 3 H), 6.71 (t, 3 H), 9.60 (d, 1H).

Intermediat L35 tert-Butyl-(3-oxopropyl)carbamat

Die Titelverbindung wurde nach literaturbekannten Verfahren hergestellt (z.B. Jean Bastide et ai. J. Med. Chem. 2003, 46( 16), 3536-3545).

Intermediat 136

N-[(Benzyloxy)carbonyl]-L-valyl-]N5-carbamoyl-L-ornithin

100 mg (0.57 mmol) N5-Carbamoyl-L-omithirj wurden in 4.0 raL DMF aufgenommen und mit 0.08 mL (0.57 mmol) Triethylamin versetzt. Dann wurden 199.0 mg (0.57 mmol) 2,5- Dioxopyrrolidin-l -yl-N-[(benzyIoxy)carbonyl]-L-valin und 0.08 mL (0.57 mmol) Triethylamin zugesetzt. Es wurde 48 h bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde direkt über die präp. RP- HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser mit 0.1 % TFA). Die Lösemitte] wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 75.7 mg (33 % d. Th.) der Titelverbindung.

LC-MS (Methode 1): R, = 0.69 in; MS (ESIpos): m/z = 409 [ M - ! i ] \ Intermedia! L37

L-Valyl-N5 -carbamoy 1-L -Ornithin

75.7 mg {0.19 mmol) von Intenneüiat L36 wurden in 25 mL Wasser/Ethanol/THF suspendiert und mit 7.5 mg Palladium auf Akti vkohle (10%ig) versetzt und bei RT 4.5 h lang mit Wasserstoff unter Normaldruck hydriert. Der Katalysator wurde abfiltriert und die Reaktionsmischung im Vakuum vom Lösemittel befreit und im Hochvakuum getrocknet. Der Rückstand wurde ohne weitere Reinigung in der nächsten Stufe eingesetzt.. Man erhieit 64.9 mg (93 % d. Th.) der Titelverbindung. LC-MS (Methode 6): \l = 0.25 min; MS (ESIpos): m/z = 275 [ V! ! ! | .

Intejrmediat L38

N-[31 -(2,5-Dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol-l-yl)-29-oxo-4,7, 10,13,16,19,22,25-octaoxa-28- azahentriacontan-l-oyl]-L-valyl-N5-carbamoyl-L-ornithin

38.3 mg (0.14 mmol) von Intermediat L37 wurden in 3.0 mL DMF vorgelegt und mit 96.4 mg (0.14 mmol) 3-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-l H-pyrrol- 1 -yl)-N- {27-[(2,5-dioxopyrrolidin- 1 -yl)oxy]- 27-oxo-3,6,9, 12,15, 18,21 ,24-octaoxaheptacos- 1 -yl }propanamid und mit 39.0 μΐ, (0.28 mmol) Triethyiamin versetzt. Es wurde über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde anschließend mit 16.0 p.L (0.28 mmol) HOAc versetzt und direkt über die präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 58.9 mg (45 % d. Th.) der Titelverbindung.

LC-MS (Methode 1): R _t = 0.61 mm; MS (ESIpos): m/z = 849 | Vi ! 1 1 .

Intermediat L39

2-(Trimethylsilyl)ethyl-(2-sulfanylethyl)carbamat

300 mg (2.64 mmol) 2-Aminoethanthiolhydrochlorid (1 : 1) wurden in 3.0 mL Dichiormethan vorgelegt und mit 668.0 mg (6.60 mmoljTriethylamin mit 719.1 mg (2.77 mmol) l-({[2- (Trimethyisilyr)ethoxy]carbonyl}oxy)pyrroiidin-2,5-dion versetzt. Es wurde 2 Tage bei RT gerührt. (Dünnschichtchromatograpbische Kontrolle: Dichlo methan/Methanol = 100: 1.5) Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylaeetat versetzt und dreimal mit Wasser gewaschen. Die organische Phase wurde zweimal mit ges. NaCl-Lösung gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösemittel wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Einsatz der Verbindung ohne weitere Reinigung in der nächsten Synthesestufe. Intenn ij jj U)

N-[31 -(2,5-Dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol-l-yl)-29-oxo-4,7, 10, 13, 16, 19,22,25-octaoxa-28- azahentriacoHtan-l-oyl]-L-valyl-N6-(tert-butoxycarbonyl)-L-l ysin

600 mg (1.58 mmol) N2-[(Benzyloxy)carbonyl]-N6-(tert-butoxycarbonyl)-L-lysin wurden in 25.0 mL Wasser/Ethanol/THF (1 : 1 :0.5) mittels Palladium auf Kohle (10 %) bei RT unter Normaldruck mit Wasserstoff hydriert. Die Verbindung N6-(tert-Butoxycarbonyl)-L-lysin wird ohne weitere Reinigung in der nächsten Synthesestufe eingesetzt.

LC-MS (Methode 1): R _t = 0.99 min; MS (ESIpos): m/z = 247 [M+H] ⁺ .

1 80.0 (0.73 mmol) N6-(tert-Butoxycarbonyl)-L-lysin wurden in 5.0 mL DMF gelöst und mit 74.0 mg (0.73 mmol) Triethylamin versetzt. Es wurden 254.6 mg (0.73 mmol) 2,5-Dioxopyrrolidin-l - yl-N- [(benzyloxy)earbonyl]-L-valinat und 74.0 mg (0.73 mmol) Triethylamin zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde 3.5 h bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/mm, MeCN/Wasser, 0.1 % TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 294.1 mg (76 % d. Th.) der Verbindung N-[(Benzyloxy)carbonyl]-L-vaiyl-N6-(tert- butoxycarbonyl)-L-lysin.

LC-MS (Methode 1): R _t = 0.97 min; MS (ESIpos): m/z = 480 [ \1 · 111 .

272.2 mg (0.57 mmol) N-[(Benzyloxy)c^onyl]-L-valyl-N6-(tert-butoxycaibonyl)-L-lys tn wurden in 20 L Ethylacetat/Ethanol/THF (1 :1 :1) gelöst und mit 27.2 mg Palladium auf Aktivkohle versetzt und unter Normaldruck und bei RT mit Wasserstoff hydriert. Es wurde über Celite^ filtriert und der Filterkuchen intensiv mit Ethylacetat/Ethanol/THF (1:1:1) gewaschen. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 182.0 mg (72 % d. Th. ) der Verbindung L-Valyl-N6-(tert-butoxycarbonyl)-L-lysin.

LC-MS (Methode 1): R _t = 0.53 min; MS (ESIpos): m/z = 346 [M+H] ⁺ .

30.0 mg (0.07 mmol) L-Valyl-N6-(tert-butoxycarbonyl)-L-lysii! und 46.1 mg (0.07 mmol) 3-(2,5- Dioxo-2,5-dihydro-l H-pyrrol-l -yl)-N-{27-[(2,5-dioxopyrrolidiri-l -yl)oxy]-27-oxo- 3,6,9,12,15, 18,21,24-octaoxaheptacos-l -yi}propanamid wurden in 1.5 mL DMF gelöst und mit 6.8 mg (0.07 mmol) 4-Methylmorpholin versetzt. Dir Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN Wasser). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 55.6 mg (90 % d. Th.) der Titelverbindung.

LC-MS (Methode 1): R = 0.77 min; MS (ESIpos): m/z = 920 [M+Hf.

N- [ 19-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)-l 7-oxo-4,7, 10, 13 -tetraoxa- 16-azanonadecan- 1 - oyl]-L-valyl-N6-(tert-butoxycarbonyl)-L-l sin

600 mg (1.58 mmol) N2- [(Berizyloxy)carbonyl] -N6-(tert-butoxycarboHyl)-L-lysin wurden in 25.0 mL Wasser/Ethanoi/THF (1 :1 :0.5) mittels Palladium auf Kohle (10 %) bei RT unter Normaldruck mit Wasserstoff hydriert. Die Verbindung N6-(tert-Butoxycarbonyl)-I -lysin wird ohne weitere Reinigung in der nächsten Synthesestufe eingesetzt,.

LC-MS (Methode 1): = 0.99 min; MS (ESIpos): m/z = 247 | \1 · ! ! ] .

180.0 (0.73 mmol) N6~(tert-ßutoxycarbonyi)~L~lysm wurden in 5.0 mL DMF gelöst und mit 74.0 mg (0.73 mmol) Triethylamin versetzt. Es wurden 254.6 mg (0.73 mmol) 2,5-Dioxopyrrolidin-l - yl-N-[(benzyloxy)carbonyl]-L-valinat und 74.0 mg (0.73 mmol) Triethylamin zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde 3.5 h bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1 % TFA). Die Lösemittel wurden dann im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 294.1 mg (76 % d. Th.) der Verbindung N-[(Beaz loxy)carbonyl]-L-valyl- N6-(tert-butoxycarbonyl)-L-lysm.

LC-MS (Methode 1): R _t = 0.97 min; MS (ESIpos): m/z = 480 [ V! ! ! | .

272.2 mg (0.57 mmol) N-[(Benzyioxy)carbonyl]-L-vaiyl-N6-(tert-butoxycarbonyi)-L-l ysin wurden in 20.0 mL Ethyiacetat/Ethanol/THF (1 :1:1) gelöst und mit 27.2 mg Palladium auf Aktivkohle versetzt und unter Normaldruck und bei RT mit Wasserstoff hydriert. Es wurde über Celite ^(R) filtriert und der Filterkuchen intensiv mit Ethylacetat/Eihanol/THF (1 :1 :1) gewaschen. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 182.0 mg (72 % d. Th.) der Verbindung L-Valyl-N6-(tert-butoxycarbonyl)-L-lysin.

LC-MS (Methode 1): R _t = 0.53 min; MS (ESIpos): m/z = 346 [M+H] ⁺ .

30.0 mg (0.07 mmol) L-Valyl-N6-(tert-butoxycarbonyl)-L-lysin und 34.3 mg (0.07 mmol) 3-(2,5- Dioxo-2,5-dihydro-l H-pyrrol-l -yl)-N-{ 15-[(2,5-dioxopyrrolidin-l -yl)oxy]-l 5-oxo-3,6,9,12- tetraoxapentadec-l-yl}propanamid wurden in 1.5 mL DMF gelöst und mit 6.8 mg (0.07 mmol) 4- Methylmorpholin versetzt. Dir Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosii 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 40.6 mg (82 % d. Th.) der Titelverbindung. LC-MS (Methode 1): R _t = 0.73 min; MS (ESIpos): m/z = 744 [ VS ! ! | .

^■ 30'

Intermedia! L42

N- [ 19-(2,5 -Dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)- 17-oxo-4,7, 10, 13 -tetraoxa- 16-azanonadecan- 1 - oyl]-L-valyl-N5-carbamoyl-L-ornithin

50.0 mg (0.18 mmol) L-Vaiyl-N5-carbainoyi-L-omithm (Imermediat L37) wurden in DMF vorgelegt und mit 93.6 mg (0.18 mmol) 3-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro- lH-pyrrol-l -yl)-N-{ 15-[(2,5- dioxopyrrolidin-1 -yl)oxy]-15-oxo-3,6,9,12-tetraoxapentadec-l -yl}piOpanamid und 36.9 mg (0.37 mmol) Triethylamin versetzt. Die Reaktionsmischung rührte bei RT über Nacht. Es wurden 21.9 mg (0.37 mmol) HOAc hinzugefügt und die Reaktionsmischung direkt, über die präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 20.6 mg (14 % d. T ^' h.) der Titelverbindung.

LC-MS (Methode 1): R _t = 0.55 min; MS (ESIpos): m/z = 673 [M+H] ⁺ .

Intermedia! L43

N-[67-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)-65-oxo-

4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61 -icosaoxa-64-azaheptahexacont oyl]-L-valyl-N5-carbamoyl-L-ornithin

3 1.3 mg (0.04 mmol) L-Valyl-N5-carbamoyl-L-ornithin (Intermediat L37) wurden in DMF vorgelegt und mit 50.0 mg (0.04 mmol) 3-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrroi-l -yl)-N-{63-[(2,5- dioxopyrrolidin-1 -yl)oxy]-63-oxo-3,6,9,12,l 5, 18,21 ,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51 ,54,57,60- icosaoxatrihexacont-l -yl}propanamid und 8.3 mg (0.08 mmol) Triethylamin versetzt,. Die Reaktionsmischung nihrte bei RT über Nacht. Es wurden 4.9 mg (0.08 mmol) HOAc hinzugefügt und die Reaktionsmischung direkt über die präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 L/min, MeCN/Wasser). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 15.8 mg (20 % d. Th.) der Titelverbindung. LC-MS (Methode 4): R _t = 0.94 min; MS (ESipos): m/z = 1377 [Μ+ΗΓ. Intenn ij tL

N- [ 19-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)-l 7-oxo-4,7, 10, 13 -tetraoxa- 16-azanonadecan- 1 - oyi ] -L- valy 1 - L -alanin

73.3 mg (0.39 mmol) L-Valyl-L-alanin wurden in 7.0 mL DMF gelöst und mit 200.0 mg (0.39 mmol) 3 -(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-l H-pyrrol-1 -yl)-N- { 15-[(2,5-dioxopyrrolidin- 1 -yljoxyj- 15-oxo- 3,6,9,12-tetraoxapentadec-l-yl}propanamid und 78.8 mg (0.78 mmol) Triethyiamin versetzt. Die Reaktionsmischung wurde bei RT über Nacht gerührt. Die Reaktionsmischung wurde direkt über die präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 103.3 mg (45 % d. Th.) der Titelverbindung.

LC-MS (Methode 1): R _t = 0.58 min; MS (ESIpos): m/z = 587 [M+H] ⁺ . lntennediatJL45 tert-B«1yl-(2S)-2-[(tert-butoxycarboHyl)aaiino]-4-oxobutari oat

2,00 g (7.26 mmol) tert-Butyl-N-(tert-butoxycarboHyl)-L-homoserinat wurden in 90 mi Dichlormethan gelöst und dann mit 1.76 ml Pyridin sowie mit 4.62 g (10.90 mmol) 1,1,1 - Triacetoxy-llambda^2-benziodoxol-3(lH)-on (Dess-Martin-Periodinan) versetzt. Der Ansatz wurde 2 h bei RT gerührt, anschließend mit 200 ml Dichlormethan verdünnt und zweimal mit 10%- iger Natriumtiosulfat-Lösung und dann nacheinander zweimal mit 5%-iger Zitronensäure und zweimal mit gesättigter Nairiurnhydrogencarbonat-Lösung ausgeschüttelt. Die organische Phase wurde abgetrennt, über Natriumsulfat getrocknet und anschließend im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde mit 100 ml Diethylether und Cvclohecan (v v=l : l) versetzt, etwas eingeengt, wobei ein weißer Niederschlag ausfiel. Dieser wurde abgesaugt. Das Filtrat wurde am Rotationsverdampfer eingeengt und im Hochvakuum getrocknet, wobei 1.74 g (88% d. Th.) der Zielverbindung als hellgelbes Öl erhalten wurden.

LC-MS (Methode 1): R, = 0.85 min; MS (ESIpos): m/z = 274 [M+Hf.

'H-NMR (400 MHz, DMSO-de): δ [ppmj = 1.38 (s, 18H), 2.64-2.81 (m, 2H), 4.31-4.36 (m, 1 H), 7.23 (d, 1 H), 9.59 (s, 1H).

Intermediat L46

Trifluoressigsäure--tert-butyl-N-[2-(2,5-cu\xxo

Die Titelverbindung wurde zunächst durch Kupplung von 200 mg (0.79 mmol) Trifluoressigsäure- -l-(2-aminoethyl)-l H-pyrrol-2,5-dion(l :l) mit 263 mg (0.87 mmol) (4S)-5-tert-Butoxy-4-[(tert- butoxycarbonyi)amino]-5-oxopentansäure-trifluoressigsäure( l :l) in Gegenwart von EDC/HOBT und N,N-Diisopropylethylamin und anschließende Entschützung der Aminogruppe unter schonenden Bedingungen durch lh Rühren in 10%iger Trifluoressigsäure in DCM bei RT hergestellt. Nach Gefriertrocknung aus Acetonitril/ Wasser wurden 85 mg (20% d.Th.) der Titelverbindung über 2 Stufen erhalten.

LC-MS (Methode 1): R _t = 0.37 min; MS (ESIpos): m/z = 326 [ Μ · ! Ι | . Intermediat L47

Trifluoressigsäiu"e--beta-alanyl-L-alanyl-N ⁵ -carbaiiioyl-N-[4-(2,5-dioxo-2,5-dihydro

yi)pheny!]-L-omithmamid(l : 1)

Die Titelverb indung wurde durch Kupplung von Intermediat 1,8 mit 2,5-Dioxopyrrolidin- (tert-butoxycarbonyl)-beta-aIaninat und anschließender Entschützung mit TFA hergestellt.

LC-MS (Methode 3): R, = 1.36 min; MS (ESIpos): m/z = 488 (M+H) ⁺ .

Intermediat L48

Trifluoressigsäure--(lR,2S)-2-ainino-N-[2-(2,5-dioxo-2,5-(� �hydro-lH-pyrrol-l- yl)ethyl]cyclopentancarboxamid( 1 : 3 )

Die Titelverbindung wurde ausgehend von kommerziell erhältlicher (1R, 2S)-2-[(tert- Butoxycarbonyi)amino]cyciopentancarbonsäure in Analogie zu Intermediat L2 hergestellt.

LC-MS (Methode 3): R _t = 1.22 min; MS (ESIpos): irv'z = 252 (M+H) ⁺ . Intermedia! L49

Trifluoressigsäure--tert-b

Die Titeiverbindung wurde zunächst durch Kupplung von kommerziell erhältlichem

Bromessigsäureanhydrid mit dem nach klassischen Methoden der Peptidchemie hergestellten partiell geschützten Peptid tert-Butyl-L-valyl-L-alanyl-N ⁶ -(tert-butoxycarbonyl)-L-lysinat in Gegenwart von NN-Diisopropylemylamin in Dichlorrneihan hergestellt. Anschließend erfolgte die Entschmutzung an der Aminogruppe unter schonenden Bedingungen durch Rühren in ! 0%iger Trifluoressigsäure in DCM bei RT, wobei in 49%-iger Ausbeute über 2 Stufen die Titelverbindung erhalten wurde.

LC-MS (Methode 1): R _t = 1.09 min; MS (ESIpos): m/z = 593 und 595 i Vi · ί 1 ! .

Intermediat L50

Tri fluoressigsäure— { 1 S,3R)-3 -amino-N - [2-(2,5 -dioxo-2 ,5-dihydro- lH-pyrrol-1 - yl)ethyl] cyclopentancar 1 : 1)

o

Die Titelverbindung wurde ausgehend von kommerziell erhältlicher (lS,3R)-3-[(tert- ButoxycarbonyOaminojcyciopentancarbonsäure und ebenso kommerziell erhältlichem Trifluoressigsäure--l-(2-amirioethyl)-lH-pyTrol-2,5-dion(l : l) durch Kupplung mit HATU in Gegenwart von NN-Düsopropylethylamin und anschließender Entschützung mit TFA hergesteilt.

HPLC (Methode 11): R _t = 0.2 min;

LC-MS (Methode 3): R, = 0.88 min; MS (ESIpos): m z = 252 (M+H)\

Intermediat L51

Trifluoress igsäure— ( 3 R,3 R)-3 -amino-N- [2 -(2,5 -dioxo-2 ,5 -dihy dro- 1 H -pyrrol- 1- yljethyl] cyclopentan carboxamid( 1 :1)

Die Titelverbindung wurde ausgehend von kommerziell erhältlicher (lR,3R)-3-[(tert- Birtoxycarbonyl)amino]cyclopentancarbonsäure und ebenso kommerziell erhältlichem Trifluoressigsäure~l-(2-aminoethyl)-l H-pyrrol-2,5-dion(l :l) durch Kupplung mit HATU in Gegenwart von NN-Msopropylethylamin und anschließender Entschützung mit TFA hergestellt.

LC-MS (Methode 3): === 0.98 min; MS (ESIpos): m/z === 250 (M-H) ^" . Intermedia! L52

Trifluoressigsäure --N-(2-aminoethyl)-2-broniacetamid. (1 :1)

420 mg (2.62 mmol) tert-Butyl-(2-aminoethyl)carbamat wurden in 50 ml Dichlormethan aufgenommen und mit 817 mg (3.15 mmol) Bromessigsäureanhydrid sowie 913 μΐ (5.24 mmol) Λ',/V-Diisopropylethyiamin versetzt,. Der Ansatz wurde 1 h bei RT gerührt und anschließend im Vakmun eingeengt. Der Rückstand wurde duch präparative HPLC gereinigt.

Es wurden 577 mg der geschützten Zwischenstufe erhalten, die anschließend in 50 ml Dichlormethan aufgenommen und mit 10 ml Trifluoressigsäure versetzt wurde. Nach 1 Ii Rühren bei RT wurde der Ansatz im Vakuum eingeengt und der Rückstand aus Acentonitril/Wasser lyophilisert. So wurden 705 mg (65% d. Th.) der Titeiverbindung erhalten.

LC-MS (Methode 3): R, = 0.34 min; MS (ESIpos): m/z = 181 und 183 (M+H) ⁺ .

liiterraediat L53

Trifluoressigsäure--(lS,3S)-3-amm^

yl)ethyl] cyclopentancar 1 :1)

Die Titelverbindung wurde ausgehend von kommerziell erhältlicher (l S,3S)-3-[(tert- Butoxycarbonyl)amino]cyclopentancarbonsäure und ebenso kommerziell erhältlichem Trifluoressigsäure- 1 -(2-aminoethyi)- 1 H-pyrrol-2,5-dion( 1 :1) durch Kupplung mit HATU in Gegenwart von NN-Diisopropylethylamin und anschließender Entsehützung mit TFA hergestellt,

HPLC (Methode 1 1): R _t = 0.19 min;

LC-MS (Methode 3): R _t = 0.88 min; MS (ESIpos): m/z = 250 (M-H)\

Intermedia! L54

Trif!uoressigsäure--( 1R,3 S)-3 -amino-Ν- [2-(2,5 -dioxo-2 ,5 -dihydro- 1 H-pyrroI- 1 - yOethyl] cyclopentancarboxamidi 1 :1)

Die Titelverbindung wurde ausgehend von kommerziell erhältlicher (lR,3S)-3-[(tert- Butoxycarbonyl)amino]cyclopentancarbonsäure und ebenso kommerziell erhältlichem Trifluoressigsäure--l-(2-anTanoethyl)-lH-pyrrol-2,5-dioi!(l : i) durch Kupplung mit HATU in Gegenwart von N.N-DiisopropyleÜiylamin und anschließender Entsehützung mit TFA hergestellt.

LC-MS (Methode 3): R _t = 0.89 min; MS (ESIpos): m/z = 252 (M+H) ⁺ .

Intermedia! L55

T rifliioressigsäuxe - eri

yl)hexiinoyl]-L-valyl-L-alanyl}-L-lysinat (1 : 1)

Die Titelverbindung wurde zunächst durch Kupplung von Intermedia!; L6 mit N-(tert- Butoxycarbonyl)-D-alanin in Gegenwart von HATU und anschließender Entschützung an der Aminogruppe unter schonenden Bedingungen durch 90 minütiges Rühren in 5%iger

Trifluoressigsäure in DCM bei RT hergestellt.

HPLC (Methode 1 1): R _t = 1 .35 min;

LC-MS (Methode 1): \l = 0.67 min; MS (ESIpos): m/z = 637 (M+H) ⁺ .

Intermedia! L56

Trifluoressigsäure - ert-bu1y1-N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrroI-l -yl)bexaiioyI]-L-vaiyl-L- alanyi-N ⁶ - { [( 1 R,3 S)-3 -aminocyclopentyl] carbonyl} -L-iysinat (1 : 1)

Die Titelverbindung wurde zunächst durch Kupplung von Intermediat L6 mit (lR,3S)~3-[(tert~ Butoxycarbonyl)amino]cyclopentan carbonsäure in Gegenwart von HATU und anschließender Entschützung an der Aminogruppe unter schonenden Bedingungen durch 15 minütiges Rühren in 25%-iger Trifluoressigsäure in DCM bei RT hergesteilt.

HPLC (Methode 1 1): R _t = 1.4 mm;

LC-MS (Methode 1): R _t = 0.7 min; MS (ESlpos): m/z = 677 (M+H) ⁺ .

Intermediat L57

Methyl-(2S)-4-oxo-2-({[2-(trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl} amino)butanoat

500.0 mg (2.72 mmol) L-Asparaginsäuremethylester Hydrochlorid und 706.3 mg (2.72 mmol) 2- (Tiimethylsilyl)ethyl-2,5-dioxopyiTolidin-l-carboxylat wurden in 5.0 mL 1,4-Dioxan vorgelegt und mit 826.8 mg (8.17 mmol) Triethylamin versetzt. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 250x40; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1 % TFA). Die Lösemittel wurden dann im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 583.9 mg (74 % d. Th.) der Verbindung (3 S)-4-Methoxy-4 -oxo-3 -( { [2-(1rimethylsilyl)ethoxy] carbonyl } arnino) butansäiire.

LC-MS (Methode 1): \l = 0.89 min; MS (ESIneg): m/z = 290 (M-H) ^" .

592.9 mg (3S)-4-Methoxy-4-oxo-3-( {[2-(trimethylsilyl)ethoxy]carbonyi}amino)butansäure wurden in 10.0 mL 1 ,2-Dimetboxyethan vorgelegt und auf -15 °C abgekühlt und mit 205.8 mg (2.04 mmol) 4-Methylmoipholiti und 277.9 mg (2.04 mmol) Isobutylchlorformiat versetzt. Der Niederschlag wird nach 15 min abgesaugt und zweimal mit je 10.0 mL 1 ,2-Dimethoxyethan gewaschen. Das Filtrat wird auf -1 0 °C abgekühlt und mit 115.5 mg (3.05 mmol) Natriumborhydrid gelöst in 10 mL Wasser unter starkem Rühren versetzt. Die Phasen werden getrennt und die organische Phase je einmal mit ges. Natriumhydrogenearbonat-Lösung und ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 515.9 mg (91 % d. Th.) der V erb indung Methyl-N- { [2 -(trimethyl silyOethoxy] carbonyl } -L-homoserinat.

LC-MS (Methode 1): = 0.87 min; MS (ESIpos): m/z = 278 (M+H) ⁺ .

554.9 mg (2.00 mmol) Methyl-N- {[2-(trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl} -L-homoserinat wurden in 30.0 mL Dichlormethan vorgelegt und mit 1 .27 g (3.0 mmol) Dess-Martin periodinan und 474.7 mg (6.00 mmol) Pyridin versetzt,. Man rührte über Nacht bei RT. Nach 4 h wurde der Ansatz mit Dichlormethan verdünnt und die organische Phase je dreimal mit 10%iger NaiSiQs-Lösu g, 10%iger Citronensäure-Lösung und ges. Natriumhydrogencarbonat-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Man erhielt 565.7 mg (97 % d. Th.) der Titelverbindung.

Ή-NMR (400 MHz, DMSO-de): δ [ppm] - 0.03 (s, 91 1 1 0.91 (m, 2H), 2.70-2.79 i m. U l i. 2,88 (dd, 1H), 3.63 (s, 3H), 4.04 (m, 2H), 4.55 (m, 1H), 7.54 (d, 1H), 9.60 (t, 1 H).

Intermediat L58

2-(Trimethylsilyl)ethyl-(3-oxopropyl)carbamat

434.4 mg (5.78 mmol) 3-Amino-l-propanol und 1.50 g (5.78 mmol) 2-(Trimethylsilyl)ethyl-2,5- dioxopyrrolidin- 1 -carboxylat wurden in 10.0 mL Dichlormethan gelöst und mit 585.3 mg (5.78 mmol) Triethylamin versetzt und über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Dichlormethan verdünnt und die organische Phase mit Wasser und ges. Natriumhydrogencarbonat- Lösung gewaschen und anschließend über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösemittel wurde im Vakuum verdampft. Der Rückstand 2-(TrimethylsilyI)ethyI-(3-hydroxypropyl)carbamat (996.4 mg, 79 % d. Th.) wurde im Hochvakuum getrocknet und ohne weitere Reinigung in der nächsten Synthesestufe eingesetzt.

807.0 mg (3.68 mmol) 2-(Trimethylsilyl)ethyl-(3-hydroxypropyl)carbamat wurden in 15.0 mL Chloroform und 15.0 mL 0.05 N Kaliumcarbonat/0.05 N Natriumhydrogencarbonat-Lösung (1 : 1) vorgelegt. Dann wurden 102.2 mg (0.37 mmol) Tetra-n-butylammoniumcWorid, 736.9 mg (5.52 mmol) N-Chlorsuccinimid und 57.5 mg (0.37 mmol) TEMPO zugegeben und die Reaktionsmischung kräftig über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Dichlormethan verdünnt und die organische Phase wurde mit Wasser und ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde im Hochvakuum getrocknet und ohne weitere Reinigung in der nächsten Synthesestufe eingesetzt (890.3 mg).

IntejttnejdjajJL59

Trifluoressigsäure-- 1 - {2- [2-(2-aminoe thoxy)ethoxy] ethyl } - 1 H-pyrrol-2,5-dion( 1 :1)

300.0 mg (0.91 mmol) tert-Butyl-(2-{2-[2-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l- yl)ethoxy]ethoxy}ethyl)carbamat wurden in Dichlormethan vorgeiegt und mit 4.2 g {36.54 mmol) TFA versetzt und 1 h bei RT gerührt (DC -Kontrolle: Dichlormeihan/Methanol 10: 1). Die flüchtigen Bestandteile wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand viermal mit DichloiTnethan kodestüliert. Der Rückstand wurde im Hochvakuum getrocknet und ohne weitere Reinigung in der nächsten Synthesestufe eingesetzt.

LC-MS (Methode 1): R _t = 0.19 min; MS (ESIpos): m/z = 229 (M+H) ⁺ .

liiterraediat L6Ö

6-(2,5 -Dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol - 1 -yl)hexanoylchlorid

200.0 mg (0.95 mmol) 6-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)hexansäure wurden in 4.0 mL Dichlormethan gelöst und mit 338.0 mg (2.84 mmol) Thionylchlorid versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 3 h bei RT gerührt und dann mit 1 Tropfen DMF vesetzt. Es wurde nochmal 1 h gerührt. Das Lösemittel wurde im Vakuum verdampft und es wurde dreimal mit DichloiTnethan kodestüliert. Das Rohprodukt wurde ohne weitere Reinigung in der nächsten Synthesestufe eingesetzt. Trifluoressigsäure --2-(trimethylsilyl)ethyl-N-[6-(2,5-d^

L-valyl-L-alanyl-L-lysinat (1 : 1)

Zunächst wurde ausgehend von N2-[(Beazyloxy)caAonyl]-N6-(teat-butoxycarbonyl)-I -lysin nach klassischen Methoden der Peptidchemie (Veresterung mit 2-(Trimethylsilylethanol mittels EDCI/DMAP, Hydrogenoiyse, Kupplung mit N-[(Benzyloxy)carboHyl]-L-valyl-L-alanin in Gegenwart von HATU und erneute Hydrogenoiyse) das Tripeptidderivat 2-Trimemylsilyl)ethyl-L- valyl-L-alanyl-N6-(tert-butoxycarbonyl)-L-lysinat hergestellt. Die Titelverbindung wurde durch

Kupplung dieses partiell geschützten F ;rivats mit kommerziell erhältlicher 6-(2,5-Dioxo-2,5- dihydro-lH-pyrrol-l -yl)hexansäure in Gegenwart von HATU und Λ',Λ'-Diisopropylethylamin hergestellt. Anschließend erfolgte die Entsehützung an der Aminogruppe unter schonenden Bedingungen durch 2.5 stündiges Rühren in 5%iger Trifluoressigsäure in DCM bei RT unter Erhalt der Esterschutegruppe. Nach Aufarbeitung und Reinigung durch präparative HPLC wurden 438 mg der Titelverbindung erhalten.

HPLC (Methode ! 1): R _t = 1.69 min;

LC-MS (Methode 1 ): R _t = 0.78 min; MS (ESTpos): m/z = 610 (M+H) ⁺ .

Trifluoressigsäiire --2-(1ximethylsilyl)ethyl-N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH^> ;^ol-l-yl)hexan L-valyl-N'-carbamoyl-L-ornithyl-L-lysinai ( 1 : 1 )

Zunächst wurde ausgehend von N2-[(Betizyloxy)carbonyl]-N6-(tert-butoxycarbonyl)-L-lysin nach klassischen Methoden der Peptidchemie 2-(Trimethylsilyl)ethyl-N6-(tert-butoxycarbonyl)-L- lysinat hergestellt. 148 mg (0.43 mmol) von diesem Intermediat wurden dann in Gegenwart von 195 mg (0.51 mmol) HATIJ und 149 μΕ NN-Diisopropylethylamin mit 200 mg (0.43 mmoi) von Intermediat Li 6 gekuppelt. Nach Einengen und Reinigung des Rückstandes mittels präparativer HPLC wurde das geschützte Intermediat in 20 mL DCM aufgenommen und durch Zugabe von 2 L Trifluoressigsäure und 1 h Rühren bei RT die tert. Butoxycarbonyl-Schutzgmppe abgelöst. Nach Einengen und Lyophilisation des Rückstandes aus Acetonitril/Wasser wuixien 254 mg (63% d. Th. über 2 Stufen) erhalten.

HPLC (Methode 11): R _t

LC-MS (Methode 1): R _t = 0.68 min; MS (ESIpos): m/z = 696 (M+H) ⁺ .

Interai igtL

(4S)-4- { [(2S)-2 - { [(2S)-2 - {[6-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro- lH-pyrrol-1 -yl)hexanoyl]amino } -3 methylbutanoyl]amino}propanoyl]amino} -5-oxo-5 -[2-(trimethylsilyl)ethoxy]pentansäure

Zunächst wurde ausgehend von (2S)-5-(Ben^ioxy)-2-[(tert-butoxycarbonyl)amino]-5- oxopentan säure nach klassischen Methoden der Peptidchemie (Veresterung mit 2- (TrimeÜiylsilyleihanol mittels EDCI/DMAP, Abspaltung der Boe-Schutzgruppe mit Tiifluoressigsäure, Kupplung mit -[(Benzyloxy)carbonyl]-L-valyl-L-aianin in Gegenwart von HATU und Hydrogenolyse in Methanol über 1 0%-igem Palladium auf Aktivkohie) das Tripeptidderivat (4S)-4-{[(2S)-2- {[(2S)-2-Amino-3-methylbutanoyl]ammo}propanoyl]amino} -5- oxo-5-[2-(trimethy]silyl)ethoxy]penlansäuje hergestellt. Die Titelverbindung wurde durch Kupplung dieses partiell geschützten Peptidderivats mit kommerziell erhältlichem l -{6-[(2,5- D!oxopyrroHdin-l-yl)oxy]-6-oxohexyl}-lH-pyrrol-2,5-dion hergestellt. Nach Aufarbeitung und Reinigung durch präparative HPLC wurden 601 mg der Titeiverbindung erhaiten.

LC-MS (Methode 1): \l === 0.96 min; MS (ESIpos): m/z === 611 (M+H) ⁺ .

Intermediat L64

(4S)-4-{[(2,5-Dioxo-2,5-dihydi -l H-p>nTol-l-yl)acetyl]amino}-5-oxo- pentansäure

Die Titelverbindung wurde ausgebend von (2S)-5-(Benzyloxy)-2-[(tert-bx3toxycarbonyl)amiQo]-5- oxopentansäure nach klassischen Methoden der Peptidchemie {Veresterung mit 2- (Trimethylsilylethanol mittels EDCI/DMAP, Abspaltung der Boc-Schutzgruppe mit Trifluoressigsäure, hydrogenolytische Spaltung des Benzylesters in Methanol über 10%-igem Palladium auf Aktivkohle und Kupplung mit l-{2-[(2,5-Dioxopyrroiidin-l-yl)oxy]-2-oxoethyl}- 1 H-pyrrol-2,5-dion in Gegenwart von N,N-Diisopropylethylamin) hergestellt.

LC-MS (Methode 1): R _t = 0.84 min; MS (ESTpos): m/z = 385 (M+H) ⁺ .

liitermediat L6S

Trifluoressigsäure --2-(trimethyisiiyl)ethy]-3^ (1 :5 )

Die Titelverbindung wurde ausgehend von 3-{[(BenzyIoxy)cart)onyl]amino}-N-(tert- butoxycarbonyl)-L-alanin nach klassischen Methoden der Peptidchemie (Veresterung mit 2- (Trimethylsilylethanol mitteis EDCI/DMAP und Abspaltung der Boc-Schutzgruppe mit Trifluoressigsäure hergestellt. Man erhielt 373 mg (79 % d. Th. über 2 Stufen) der Titeiverbindung.

LC-MS (Methode 1): R, = 0.72 min; MS (ESIpos): m z = 339 (M+H) ⁺ .

Intejrjnediajj tö

Methyl-(8S)-8-(2-hydroxyethyl)-2,2-dimethyl-6, 1 1 -dioxo-5-oxa-7, 10-diaza-2-silatetradecan- 14-oat

1000 mg (2.84 mmol) (3S)-3-{[(Benzyloxy)carbonyl]arnmo}-4-[(tert-butoxycarbonyl) arnino] butansäure wurden in 10.0 mL 1 ,2-Dimethoxyethan vorgelegt und mit 344.4 mg (3.4 mmol) 4- Methyimorpholin und 504 mg (3.69 mmol) Isobutylchiorformiat versetzt. Nach 10m in Rübren bei RT wurde der Ansatz auf 5°C abgekühlt und portionsweise mit 161 mg (4.26 mmol) Natriumborhydrid gelöst in 3 mL Wasser unter starkem Rühren versetzt. Nach 1 h erfolgte nochmals eine Zugabe der gleichen Menge an Natriumborhydrid und der Ansatz wurde anschließend langsam auf RT erwärmt. Es wurden 170 ml Wasser zugegeben und der Ansatz dann viermal mit jeweils 200 ml Ethyiacetat extrahiert. Die Phasen wurden getrennt und die organische Phase einmal mit Citronensäure und anschließend mit gesättigter Natriumhydrogencarbonat- Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im V akuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 760 mg (78 % d. Th.) der Verbindung Benzyl-tert-butyl-[(2S)-4-hydroxybutan-l ,2-diyl]biscarbamat. LC-MS (Methode 1): R, = 0.84 min; MS (ESIpos): m z = 339 (M+H) ⁺ .

760 mg (2.16 mmol) von diesem Intermediat wurden in 13 ml Chlorwasserstoff/Dioxan gelöst 20 min bei RT gerührt. Anschließend wurde der Ansatz auf 5 ml aufkonzentriert und mit Diethylether versetzt. Der Niederschlag wurde abfiltriert und aus Acetonitril/Wasser 1 : 1 lyophilisiert.

Das so erhaltene Produkt wurde in 132 ml DMF gelöst und mit 345.5 mg (2.35 mmol) 4-Methoxy- 4-oxobutan säure, 970 mg (2.55 mmol) HATU und 1025 μΐ N, N-Diisopropylethylamin versetzt. Die Mischung wurde 5 min bei RT gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und der verbliebene Rückstand mittels präparativer HPLC gereinigt. Die entsprechenden Fraktionen wurden vereinigt und das Acetonitril im Vakuum abged mpft. Die verbleibende wässrige Phase wurde zweimal mit Ethyiacetat extrahiert und die organische Phase anschließend einggengt und im Hochvakuum getrocknet. Das so erhaltene Zwischenprodukt wurde in Methanol aufgenommen und über 10%-igem Palladium auf Aktivkohle 1 h lang bei RT unter Wasserstoff-Normaldruck hydriert. Der Katalysator wurde danach abfiltriert und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt.

247 mg von dieser entschützten Verbindung wurden in 20 ml DMF aufgenommen und mit 352 mg (1.36 mmol) l-({[2-(Trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl}oxy)pyrrolidin-2,5-di on sowie 592 μΤ N,N- Diisopropylethylamin versetzt. Die Reaktionsmischung wurde lh bei RT gerührt, anschließend eingeengt und der Rückstand mittles präparativer HPLC gereinigt. Die Lösemittel wurden dann im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt über diese 5 Reaktionsschritte in einer 21%-igen Gesarntausbeute 218 mg der Titelverbindung.

LC-MS (Methode 1): R, = 0.74 min; MS (ESIpos): m/z = 363 (M+H) ⁺ .

Intermediat L67

Trifluoressigsäure— 2-(2,5-dioxo-2,5-dthydro-lH-pyrrol-l-yi)ethyl-beta-aianinat (1 :1)

Die Titelverbindung wurde ausgehend von 50 mg (0.354 mmol) von kommerziell erhältlichem 1- (2-Hydroxyethyl)-lH-pyrrol-2,5-dion durch Kupplung mit 134 mg (0.71 mmol) N-(tert- Butoxycarbonyl)-beta-alanin in 10 ml Dichlormethan in Gegenwart von 1.5 Equivalenten EDO und 0.1 Equivalent 4-/V, Λ-Dimethylaminopyridin und anschließende Entschützung mit Trifluoressigsäure hergestellt.

Ausbeute: 56 mg (48% d. Th. über 2 Stufen)

LC-MS (Methode 3): R» = 1.15 min; MS (ESIpos): m z = 213 (M+H) ⁺ . Intenn ij iJLijS

Trifluoressigsäure--N-(2-amm^

Die Titelverbindung wurde in Analogie zu Intermediat LI nach klassischen Methoden der Peptidchemie aus kommerziell erhältlicher (2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol- 1 -yl)propansäure und tert-Butyl-(2-aminoethyl) carbainat hergestellt.

LC-MS (Methode 1): R, = 0.17 min; MS (ESIpos): m z = 212 (M+H) ⁺ .

Intermediat L69

Triiluoressigsäijre-~l -[(benzyioxy)carbonyl]piperidin-4-yl-L-va]yi-N ⁵ -c (1 :1)

Die Tiielverbindung wurde nach klassischen Methoden der Peptidchemie aus kommerziell erhältlichem Benzyi-4-hydroxypiperidin-l -carboxylat durch Veresterung mit N2-(tert- ßutoxycarbonyi)-N5-carbamoyl-L-omithin mittels EDCI/DMAP, anschließende Boc-Spaltung mit TFA, dann folgende Kupplung mit N-[(tert.-Butoxy)earbonyl]-L-vaiin in Gegenwart von HATU und Λ',Λ'-Diisopropyletlryiamin und schließlich erneute Boc-Abspaltung mit TFA hergestellt.

LC-MS (Methode 1): R _t = 0.62 min; MS (ESIpos): m/z = 492 (Μ+ΗΪ Intermedia! L70

9H-Fluoren-9-ylmethyl-(3-oxopropyl)carbamat

1000.0 mg {3.36 mmol) 9H-Fiuoren-9-yimethyl-(3-hydroxypiOpyi)carbamat wurden in 15.0 mL Chlorofonn und 15.0 mL 0.05 N Kaliumcarbonat/0.05 N Natriumhydrogencarbonat-Lösung (1 : 1) vorgelegt. Dann wurden 93.5 mg (0.34 mmol) Tetra-n-butylammoniumchlorid, 673.6 mg (5.04 mmol) N-Chlorsuccinimid und 52.5 mg (0.34 mmol) TEMPO zugegeben und die Reaktionsmischung kräftig über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Dicblormethan verdünnt und die organische Phase wurde mit Wasser und ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde im Hochvakuum getrocknet und mittels Kieselgel (Laufmittel: Cyclohexan Etfaylacetat 3: 1-1 :1 ) gereinigt. Die Lösemitte! wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 589.4 mg (58 % d. Th.) der Titelverbindung.

LC-MS (Methode 6): R _t = 2.15 min; MS (ESIpos): m z = 296 (M-Fff . Intermed|ai L71 tert-Butyl-[4-(chlorcarbonyl)phenyl]carbamat

100.0 mg (0.42 mmol) 4-[(tert-Butoxycarbonyl)amino]benzoesäure wurden in 2.0 mL Dichlonnethan vorgelegt und mit 64.2 mg (0.51 mmol) Oxalsäuredichlorid versetzt. Die Reaktionsmischung rührte bei RT 30 min (DC -Kontrolle: Dichlormethan/Methanol). Dann wurden nochmals 192.6 mg (1.53 mmol) Oxalsäuredichlorid und 1 Tropfen DMF zugegeben und 1 h bei RT gerührt. Das Lösemittel wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand mehrmals mit Dichlormethan kodestilliert. Der Rückstand wurde ohne weitere Reinigung in der nächsten Synthesestufe eingesetzt. liiterraediat L72

Benzyl-(9S)-9-(hydroxymemyl)-2,2-dimethyl-6,l l -dioxo-5~oxa-7,10-diaza~2-silatetradecan-14~oat

O H

OH

O

O NH CH..

H ₃ C

O ^' O CH,

Die Titelverbindung wurde ausgehend von kommerziell erhältlichem Benzyl-tert-butyl-[(2S)-3- hydroxypropan-l,2-diyl]biscarbamat nach klassischen Methoden der Peptidchemie durch hydrogenolytische Abspaltung der Z-Schuizgruppe, anschließende Kupplung mit 4-(Benzyloxy)-4- oxobutansäure in Gegenwart von EDC1/HOBT, dann Abspaltung der Boc-Schutzgruppe mit TFA und schließlich durch Umsetzung mit l -({[2-(Trimethylsilyi)ethoxy]carbonyl}oxy)pyrrolidin-2,5- dion in Gegenwart von Triethylamin hergestellt.

LC-MS (Methode 1): R, = 0.94 min; MS (ESIpos): m/z = 425 [M+H] ⁺ .

Intermediat L73

-(2-aminoemyl)-6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)he xanamide

32c

Zu einer Lösung von 300 mg (1.87 mmol) tert-butyl (2-arrnnoethyl)carbamate in 20 ml Dimethyiformamid wurden 395.5 mg (1.87 mmol) 6-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 - yl)hexansäure, 1.21 g ( 9.36 mmol) Ν,Ν-Diisopropylethylamin und 854.3 mg (2.25 mmol) HATU zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde 5 Minuten bei Rt gerührt. Nach Einengen der Mischimg wurde der Rückstand in DCM aufgenommen und mit Wasser gewaschen. Die organische Phase wurde mit Brine gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet, abfiltriert und eingeengt. Man erhielt 408 mg (33%, Reinheit 53%) der Titel Verbi dung, die ohne weitere Reinigung eingesetzt wurden.

LC-MS (Methode 1): R _t = 0.75 min; MS (ESIpos): m/z = 354 (M+H) ⁺ .

Zu einer Lösung von tert-butyl (2-{[6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-l H-pyrrol-l- yl)hexanoyl]amino}ethyl)carbamate (408 mg, 0.365 mmol) in 7 ml dichlonnethan wurde 1 ml TFA zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird 0.5 h bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand wurde zweimal mit Dichlormelhan kodestilliert. Der Rückstand wurde ohne weitere Reinigung weiter eingesetzt. Man erhielt 384 mg (94%, Reinheit 57%) der Titelverbindung.

LC-MS (Methode 1): R _t = 0.26 min; MS (ESIpos): m/z = 254 (M+H) ⁺ .

IntejrmediajJL74

3-[2-[ -[2-[2-[[2-(2,5-dkixopyiTol-l-yl)acetyl]ammo]ethoxy]ethoxy]e thoxy]ethoxy

107 mg (0.335 mmol) tert-butyl 3-[2-[2-[2-(2-amtnoeihoxy)ethoxy]ethoxy]ethoxy]propanoate und 93 mg (0.369 mmol) (2,5-dioxopyrrolidin-l-yl) 2-(2,5-dioxopyrrol-l-yl)acetate wurden in 5 mi Dimethyifonnamid gelöst und mit 0.074 mL (0.671 mmol) N-Melhylmorpholin versetzt. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT gerührt. Es wurde 0.048 mL (0.838 mmol) Essigsäure zugegeben und die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCNAVasser/0.1 %TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 133 mg (86%, Reinheit 100%) ferf-butyl 3-[2-[2-[2-[2-[[2-(2,5-dioxopyrrol-l- yl)acetyl]amino]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]propanoate.

LC-MS (Methode 1): R, = 0.82 min; MS (ESIpos): m/z = 459 (M+H) ⁺ .

Zu einer Lösung von teri-butyl 3-[2-[2-[2-[2-[[2-(2,5-dioxopyrrol-l- yl)acetyl]amino]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]propanoate (130 mg, 0.284 mmol) in 5 ml dichlormethan wurde 0.5 ml TFA zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischling wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand wurde in Wasser aufgenommen und lyophilisiert. Der Rückstand wurde ohne weitere Reinigung weiter eingesetzt. Man erhielt 102 mg (90%, Reinheit 100%) der Titelverbindung.

LC-MS (Methode 1): R _t = 0.52 min; MS (ESIpos): m/z = 402 (M+H) ⁺ .

IntejrmediajJL75

Trifluoressigsäure ~2-(trimethylsilyl)ethyl-3- {[(benzyloxy)carbonyl]amino}-D-alaninat (1 :1)

Die Titelverbindung wurde ausgehend von 3-{[(Benzyloxy)carbonyl]amino}-N-(tert- butoxycarbonyi)-D-alanin nach klassischen Methoden der Peptidchemte (Veresterung mit 2- (Trimethylsilylethanol mittels EDCI/DMAP und Abspaltung der Boc-Schutzgruppe mit Trifluoressigsäure hergestellt. Man erhielt 405 mg (58 % d. Th. über 2 Stufen) der Titelverbindung. LC-MS (Methode 1): R _t = 0.75 min; MS (ESIpos): m/z = 339 (M+H) ⁺ . Intermedia! L76

(2S)-2-Brom-4-oxo-4-[2-(trimethylsilyl)etlioxy]butansäur e

Zunächst wurde ein geeignet geschütztes Asparaginsäurederivat ausgehend von (3S)-4- (Benzyloxy)-3-{[(benzyloxy)carbonyl]amirio} -4-oxobutansäure nach kiassischen Metiioden der Peptidchemie (Veresterung mit 2-(Trimethyisilyiethanoi mitteis EDCI/DMAP und hydrogenol ttsche Abspaltung der Z-Schutzgruppe und des Benzyiesters hergestellt.

470 mg (1.8 mmol) der so erhaltenen (2S)-2-Amino-4-oxo-4-[2-(trimethyisilyl)ethoxy]butansäure wurden in 30 ml Wasser suspendiert und mit 1.8 mL einer 1 molaren Salzsäure sowie 0.5 ml konzentr erter Schwefelsäure und anschließend mit 863 mg (7.25 mmol Kaliumbromid versetzt. Dann wurden bei 10°C über einen Zeitramri von 30 min eine Lösung aus 150 mg (2.175 mmol) Natriumnitrit in 1 ml Wasser zugetropft und der Ansatz 2 Ii bei 10-15°C gerührt. Anschließend wurde der Ansatz mit 50 mL Ethylacetat ausgeschüttelt. Die organische Phase wurde mit gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Nach Abdampfen des Lösungsmittels und Reinigung durch präparative HPLC wurden 260 mg (48% d.Th.) der Titelverbindung erhalten.

LC-MS (Methode 1): R, = 1.03 min; MS (ESIneg): m/z - 295 und 297 (M-HY.

'H-NMR (400 MHz, CDCL): δ [ppm] = 0.03 (s, 9H), 0.95 (t, 2H), 2.94 und 3.2 (2dd, 2H), 4.18 (t, 2 ! . 4.57 (t, 1 H).

Intermediat L77

Trifluoressigsäure— N-[2-(2-aminoethoxy)ethyl]-2-bromacetamid (1 : 1 )

Zunächst wurden 418 mg (2.05 mmol) iert-Bx3tyl-[2-(2-aininoethoxy)ethyl]carbamat mit 638 mg (2.46 mmol) Bromessigsäureanhydrid umgesetzt und anschließend die Boc-Schutzgrappe mit Triiluoressigsäure entfernt. Man erhielt 551 mg (63 % d. Th. über 2 Stufen) der Titelverbindung.

LC-MS (Methode ): R _t - 0.32 min; MS (ESIpos): m/z - 227 und 225 (M+H) ^f .

Intermediat L78

N-[(2,5 3ioxo-2,5-dihydro-lii-pyrroi-l -yr)acetyi]-beta-alanin

Die Titelverbindung wurde ausgehend von kommerziell erhältlichem (2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH- pyrrol-l -yl)essigsäure durch Kupplung mit teri-Butyl-beta-alaninathydrochlorid (1 : 1) in Gegenwart von EDCI/HOBt und N ₍ N-Diisopropylethylamin und anschließende Entschützung mit Triiluoressigsäure hergestellt.

LC-MS (Methode 1): R _t = 0.32 min; MS (ESIpos): m/z = 227 (M+H) ⁺ .

IntejrmediajJL79

Ν- [6-(2,5-Dioxo-2,

64.8 mg (0.357 mmol) ieri-Butyl-beta-alaninathydrochlorid (1 : 1) und 1 00 mg (0.324 mmol) l- {6- [(2,5-Dioxopyrrolidin-l-yr)oxy]-6-oxohexylj -lH-pyiTol-2,5-dion wurden in 4 ml Dimethylformamid gelöst und mit 65,6 mg (0.649 mmol) N-Methylmorpholin versetzt. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT gerührt. Es wurde 0.048 L (0.838 mmol) Essigsäine zugegeben und die Reaktionsmischung wurde direkt mitties präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCNAVasser/0.1 %TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 84.5 mg (77%, Reinheit 100%) tert-Butyl-N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l -yl)hexanoyl]-beta- aianinat.

LC-MS (Methode 1): R. _t = 0.78 min; MS (ESIpos): m/z = 339 (M+H) ⁺ .

Zu einer Lösung von i^-Butyl-N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dmydiO-lH-pyrrol-l-yl)hexanoyl] -beta- alaninat (82.8 mg, 0.244 mmol) in 8 ml dichlormethan wurde 1.62 ml TFA zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird 2 Stunden bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand wurde in Wasser aufgenommen und lyophilisiert. Der Rückstand wurde ohne weitere Reinigung weiter eingesetzt. Man erhielt 62.7 mg (87%, Reinheit 95%) der Titelverbindung.

LC-MS (Methode 1 ): R. ₍ = 0.75 min; MS (ESIpos): m/z = 283 (M+H) ⁺ .

Intermediat L8ö

2-(Trimethylsilyl)ethyi-3-[(15-aim

butoxycarbonyi)-D-alanin

Die Titelverbindung wurde ausgehend von kommerziell erhältlichem 3- {[(Benzyloxy)carbonyl] amino}-N-(tert-butoxycarbonyl)-D-alanm --N-cyclohexylcyclohexanamiri (1 :1 ) nach klassischen Methoden der Peptidchemie (Freisetzung aus dem Salz und Veresterung mit 2- (Trimethylsilylethanol mittels EDCI/DMAP, hydrogenolytische Abspaltung der Z-Schutzgruppe, Kupplung mit kommerziell erhältlicher 3-Oxo-l -phenyl-2,7, 10,13, 16-pentaoxa-4-azanonadecan- 19-säure in Gegenwart von HATU und N, N-Diisopropylethylainin und erneute hydrogenolytische Abspaltung der Z-Schutzgruppe) hergestellt.

LC-MS (Methode 1): R, = 0.70 min; MS (ESIpos): m z = 552 (M+H) ^'

Intermedia! L81

Trifluoressigsäure -benzyi- {2-[(2-arninoethyl)sulfonyl]ethyl }carbamat (1 : 1)

250 mg (1 .1 1 mmol) 2,2'-Suifonyldiethanamin wurden mit 92.3 mg (0.37 mmol) 1 - {[(Benzyloxy)carbonyl] oxy}pyrrolidin-2,5-dion in Gegenwart von N, N-Diisopropylethylamin in DMF gekuppelt. Nach anschließender HPLC Reinigung wurden 70 mg (47% d. Th.) der Titelverbindung erhalten.

( ^' ••MS (Methode 12): R _t = 0.64 min; MS (ESIpos): m/z = 257.1 1 (M+Hf .

Intermedia! L82

Tiifluoressigsäure N-{2-[2-(2-ammoethoxy)ethoxy]elhyl} -6-(2,5-(Hoxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l - yl)hexanamid (1 : 1)

88.6 mg (0.357 mmol) N-Boc-2,2'-(ethylenedioxy)dietliylamme und 100 mg (0.324 mmol) N- Succinimidyl 6-maleimidohexanoate wurden in 4.0 ml Dirnethvifonnamid gelöst und mit 0.071 mL (0.650 mmol) N-Methylmorpholin versetzt. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT gerührt. Es wurde 0.048 mL (0.838 mmol) Essigsäure zugegeben und die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fiuss: 75 mL/min, MeCN/Wasser/0.1%TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 127 mg (81 % d. Th) tert-Butyl- {2-[2-(2 - { [6-(2,5-dioxo-2,5- dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -ylihexanoyljamino } ethoxy)ethoxy ] ethy 1 } carbamat.

LC-MS (Methode 1): R _t = 0.78 min; MS (ESIpos): m/z = 442 (M+H) ⁺ .

Zu einer Lösung von 123 mg (225 μπιοΐ) tert-Butyl- {2-[2-(2-{[6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH- pyrroi-i -yl)hexanoyi]amino}ethoxy)ethoxy]etöyl}carbamat in 7.5 ml dichlormetban wurde 2.0 ml TFA zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird 2 h bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand wurde in Wasser aufgenommen und lyophilisiert. Der Rückstand wurde ohne weitere Reinigung weiter eingesetzt. Man erhielt 111 mg (100% d. Th) der Titelverbindung.

LC-MS (Methode 1): R _t = 0.31 min; MS (ESIpos): m z = 342 (M+H) ⁺ .

'H-NMR (400 MHz, DMSO-de): δ [ppm] = 1.17 (m, 2H), 1.47 (m, 4H), 2.04 ( , 2H), 2.98 (m, 2H), 3.19 (m, 2H), 3.39 (m, 4H), 3,56 (m, 6H), 7.01 (s, 2H), 7.72 (bs, 3H), 7.80 (m, 1H). Intermedia! L83

Trifluoressigsäure N-{2-[2-(2-ammoethoxy)ethoxy]elhyl) -2-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l - yl)acetamid (1 :1)

200 mg (0.805 mmol) tert-Butyl- {2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethyi} carbamat, 150 mg (0.966 mmol) (2,5-EHoxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)essigsäure und 560 μί (3.2 mmol) N,N- Diisopropylethylamin wurden in 10 ml Dimethylformamid gelöst und mit 459 mg (1 ,21 mmol) HATU versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 30 Minuten bei RT gerührt. Die Lösemittel wuixien im Vakuum verdampft und der Rückstand in Dichloromethan gelöst. Die organische Phase wurde zweimal mit 5%iger Citronensäure-Lösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittels Biotage Isolera gereinigt (Kieselgel, Säule 25 g SNAP, Dischloromethan Methanol 98:2). Man erhielt 276 mg (89 % d. Th) tert-Buryl-{2-[2-(2-{[(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l- yl)acetyl]amino} efhoxy )ethoxy]efhy3 } carbamat.

LC-MS (Methode 1): R _t = 0.67 min; MS (ESIpos): m 'z = 386 (M+H) ⁺ .

Zu einer Lösung von tert-Butyl-{2-[2-(2-{[(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l - yl)acetylja!i3ino}ethoxy)ethoxy]ethyl}carbama.t (275 mg, 714 μιηοΐ) in 15 ml dichlormethan wurde 4 mi TFA zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird 30 Minuten bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand wurde in Wasser aufgenommen und lyophilisiert. Man erhielt 281 mg (99% d. Th) der Titelverbindung.

LC-MS (Methode 1): R, = 0.17 min; MS (ESIpos): m/z = 286 (M+H)\

Intermedia! L84

Trifluoressigsäure N-( 14-amino-3 ,6,9, 12-tetraoxatetradec- 1 -yl)-6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H- pvrrol- 1 ~yl)hexanami

200 mg (0,594 mmol) iert-Butyl-(14-amino-3,6,9,l 2-tetraoxatetradec- i -yl)carbamat und 202 mg (0.654 mmol) 1 -{6-[(2,5-Dioxopyrrolidin-l-yl)oxy]-6-oxohexyl}-lH-pyrrol-2, 5-dion wurden in 4.0 ml Dirnethylformamid gelöst und mit 0.130 mL (1.2 mmol) N-Methylmorpholin versetzt. Die Reaktion smischung wurde über Nacht bei RT gerührt. Es wurde 0.085 ml (1.5 mmol) Essigsäure zugegeben und die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fiuss: 50 rnL/min, MeCN/Wasser/0.1 %TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 275 mg (73% d. Th) tert-Butyl-[21 -(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol-1 -yl)- 16-oxo-3,6,9, 12-tetraoxa- 15 - azahenicos- 1 -yljcarbamat.

LC-MS (Methode 1): R _t = 0.81 min; MS (ESTpos): m/z = 530 (M+H) ⁺ .

Zu einer Lösung von tert-Butyl-[21-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)-16-oxo -3,6,9,12- tetraoxa- 15 -azahenicos- 1 -yljcarbamat (268 mg, 505 μιηοΐ) in 5.0 ml dichiormethan wurde 780 μί (10 mmol) TFA zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand wurde in Wasser aufgenommen und lyophilisiert. Der Rückstand wurde ohne weitere Reinigung weiter eingesetzt. Man erhielt 266 mg (97% d. Th) der Titelverbindung.

LC-MS (Methode 1): R _t = 0.46 min; MS (ESIpos): m/z = 430 (M+H) ⁺ .

Ή-NMR (400 MHz, DMSO-de): δ [ppm] = 1.17 (m, 2H), 1.47 (m, 4H), 2.03 ( , 2H), 2.99 (m, 2H), 3.18 (m, 2H), 3.38 (m, 4H), 3,52 (in, 8H), 3,58 (m, 6H), 7.01 (s, 2H), 7.73 (bs, 3H), 7.80 (m, 1H). Intermedia! L85

Trifluoressigsäure N-(14-ammo-3,6,9,12-tetraoxatelxadec-l-yi)-2-(2,5-dioxo-2,5- _' ro-lH- pyrrol- 1 - vl)acetamid (1 : 1)

200 rag (0,594 mmol) iert-Butyl-( 14-amino-3 ,6,9,12-tetraoxatetradec- 1 -yl)carbamat, 1 1 3 mg (0.713 mmol) (2,5-Dioxo-2,5-dihydro-l H-pyrrol-l -yl)essigsäure und 410 μΐ (2.4 mmol) N,N- Diisopropylethylamin wurden in 6 ml Dimethylformamid gelöst und mit 339 mg (0.892 mmol) HATU versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 1 h bei RT gerührt und direkt mittles präp. RP- HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser/0.1%TFA). Die Lösemittel wurden im Vakumri verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 130 mg (43% d: Th) tert-Butyl-[l 7-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol- 1 -yl)- 16-oxo- 3 ,6,9, 12-tetraoxa- 15-azaheptadec- 1 -vi] carbamat.

LC-MS (Methode 1): , = 0.71 min; MS (ESIpos): m/z ----- 474 (M+H) ⁺ .

Zu einer Lösung tert-Butyl-[l 7-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l -yl)-l 6-oxo-3,6,9, 12-tetraoxa- 15-azaheptadec-l-yl]carbamat (126 mg, 267 umol) in 4.0 mi Dichlormethan wurde 410 μΐ (5.3 mmol) TFA zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand am Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 124 mg (95% d: Th) der Titelverbindung.

LC-MS (Methode 13): Rt = 0.74 min; MS (ESTpos): m/z = 374 (M+H .

'H-NMR (400 MHz, DMSO-de): δ [ppm] = 2.99 (m, 2H), 3.22 (m, 2H), 3.41 (m, 2H), 3,53 (m, 8H), 3,58 (m, 6H), 4.02 (s, 2H), 7.09 (s, 2H), 7.73 (bs, 3H), 8.21 (m, 1H). Intermedia! L86

N-[(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)acetyl]-L-valyl-L-a lanin

100 mg (0,531 mmol) L-Valyl-L-alanin und 134 mg (0.531 mmol) l-{2-[(2,5-Dioxopyrrolidm-l - yl)oxy]-2-oxoethyl}-lH-pyrrol-2,5-dion wurden in 3 ml Dimethylfonnamid gelöst und mit 0.150 mL (1.1 mmol) Triethylamin versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 8 h bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 71.5 mg (41 % d. Th.) der Titelverbindung. LC-MS (Methode 1): R, = 0.42 min; MS (ESIpos): m/z = 326 < \M Ü .

Intermediat L87

3 - [2 -(2- { [(2,5-D ioxo-2,5 -dihydro-l H -py rrol- 1 -yl)acetyl]amino} ethoxy )ethoxy]propansäure

250 mg (1.07 mmol) tert~Butyl~3-[2-(2~ammoethoxy)ethoxy]propanoat, 151 mg (0.974 mmol) 2- (2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)acetic acid, 224 mg (1.46 mmol) 1-Hydroxy-lH- benzotriazol Hydrat und 224 mg (3 .17 mmol) l-(3-Dimethylaminopropyl)-3- ethylcarbodiimidhydrochlorid wurden in 5.0 mi Dimethylformamid gelöst. Die Reaktionsmischung wurde 1 h bei RT gerührt. Der Ansatz wurde mit Ethylacetat versetzt, zweimal mit 5%iger Citronensäure-Lösung und mit ges. Natriumhydrogencarbonat-Lösung extrartiert. Die organische Phase wurde zweimal mit ges. Natriumchlorid-Lösung gewaschen,, über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakumri abgedampft. Der Rückstand wuixie über die präp. RP- HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 250x40; 10μ, Fluss: 50 m ^' L/min, MeCN ^' /Wasser/0.1%TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 267 mg (64% d: Th) tert-B«tyl-3-[2-(2-{[(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l- y Oacetyl ] amino } ethoxy) ethoxy ] propanoat .

LC-MS (Methode 1): Rt = 0.73 min; MS (ESIpos): m/z = 371 (M+Fff.

Zu einer Lösung von te3rt-Butyl-3-[2-(2-{[(2,5-dioxo-2,5-dihydro-l H-pyrrol-l- yl)acetyi]amino}ethoxy)ethoxy]propanoat (263 mg, 710 μηιοΐ) in 10 ml dichlormethan wurde 1.1 ml ( 14 mmol) TFA zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand am Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 240 mg (94% d: Th) der Titelverbindung.

LC-MS (Methode 12): R _t = 0.57 min; MS (ESIpos): m/z = 315 (M+H .

Intcrmediat L88

2,5-Dioxopyrrolidin- 1 -yl-N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)hexanoyl]-L-valyl-L- alaninat

150 mg (0.797 mmol) L-Valyl-L-alanin und 246 mg (0.797 mmol) l -{6-[(2,5-Dioxopyrrolidin-l - yl)oxy]-6-oxohexyl}-lH-pyrrol-2,5-dion wurden in 4.0 ml Dimethylformamid gelöst und mit 0.220 rat, (1.6 mmol) Triethylamin versetzt. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 rnL/min, MeCN/Wasser). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 302 mg (97 % d. Th.) N-[6-(2,5-Dioxo-2,5- diliydro-lH-pyrrol-l -yl)hexanoyl]-L-valyl-L-alanin.

LC-MS (Methode 12): = 1.02 min; MS (ESIpos): m/z = 382 (M+FI) ^" ,

Ή-NMR (400 MHz, DMSO-d«): δ [ppm] = 0.82 (dd, 6H), 1.17 (m, 2H), 1.27 (d, 3H), 1.48 (m, 4H), 1.94 (m, 1H), 2.13 (m, 2FI), 3.38 (t, 2H), 4.17 (m, 2H), 7.00 (s, 2H), 7.75 (d, 1H), 8.19 (d, 1H). 130 mg (0.531 mmol) N-[6-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)hexanoyl]-L-valyl -L-alanin wurden in 6.5 ml Diehloromethan gelöst und mit 58.8 mg (0.511 mmol) l-Hydroxypyrrolidin-2,5- dion und 78.4 mg (0.409 mmol) l-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimidhydrochlorid versetzt. 58.8 mg (0.511 mmol) 1 -Hydroxypyrrolidin-2,5-dion und 78.4 mg (0.409 mmol) l-(3- Dimethyiaminopropyl)-3-ethylcarbodiimidhydrochlorid wurden nocheinmai zugegeben. Der Ansatz wurde mit Diehloromethan versetzt une dreimal mit Wasser gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfot getrocknet, das Lösemittel im Vakuum abgedampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 172 mg (87 % d. Th.) der Titelverbindung. LC-MS (Methode 12): R _t - 1.28 min; MS (ESIpos): m/z - 479 (M+HV\

Intermedia! L89

1 -Benzyl-5-[2-(trimethylsilyl)ethyl]-L-glutamathydrochlorid (1 : 1)

Ci

H

1.00 g (2.96 mmol) (4S)-5-(ßenz>'loxy)~4-[(tert-butoxycarbonyl)amino]-5-oxo pentansäure wurden in 13.0 ml THF vorgelegt und mit 510 μΐ (3.6 mmol) 2-(Trimethylsilyl)ethanol und 109 mg (889 mol)

4-Dimethylaminopyridin versetzt. Die Reactionmischung wurde auf 0°C gekühlt und mit 682 mg (3.56 mmol) N-Ethyl-N'-3-(dimethylaminopropyl)carbodiimid hydrochlorid versetzt. Die Reactionmischung wurde über Nacht bei RT gerührt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand in Ethylacetat gelöst. Die organische Phase wurde zweimal mit 0.1N HCl-Lösung und ges. Natriumchlorid-Lösunggewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittels Biotage Isolera gereinigt (Kieselgei, Säule 25 g SNAP, Cyclohexan:Ethylacetat 80:20). Man erhielt 649 mg (50 % d. Th) der Verbindimg l-Benzyl-5-[2-(lrimemylsilyl)ethyl]-N-(tert-butoxycarbonyl)- L-glutamat.

LC-MS (Methode 1): R _t = 4.6 min; MS (ESIpos): m/z = 438 (M+HV\

649 mg (1.48 mmol) l-Benzyl-5-[2-(trimemylsilyl)eihyl]-N-(tert-butoxycarbonyl)- L^^ wurden in 7.0 ml Dioxan gelöst und unter Eisbadkühlung wurden 14 ml (59 mmol) 4N HCl in Dioxan dazugegeben. Die Reactionmischung wurde über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand am Hochvakuum getrocknet und mittels Biotage Isolera gereinigt (Kieseigel, Säule 25 g SNAP, Disehloromethan:Methanoi 90: 10). Man erhielt 320 mg (57 % d. Th) der Titel Verbindung.

LC-MS (Methode 1): R, = 0.79 min; MS (ESIpos): m z = 338 (M+H) ⁺ .

Intermediat L90

1 - (N-[(Benzyloxy )carbonyl]glycyl} amino)-3,6,9, 12-tetraoxapentadecan-l 5-säure

1 1 8 mg (566 pmol) N-[(Benzyloxy)carbonyl]glycin wurden in 5.0 ml DMF vorgelegt, mit 200 mg (622 μι ^η οΐ) tert-Butyl- 1 -amino-3 ,6,9,12-tetraoxapentadecan- 15 -oat, 130 mg (849 μι ^η οΐ) 1 - Hydroxy-lH-benzotriazol Hydrat und 130 mg (679 μι ^η οΐ) l-(3-Dime1hylaminopropyl)-3- ethylcarbodiimidhydrochlorid versetzt und 1 h bei RT gerührt. Der Ansatz wurde mit Etbylacetat versetzt, zweimal mit 5%iger Citronensäure-Lösung und mit ges. Natiiumhydrogencarbonat- Lösung extrartiert. Die organische Phase wurde zweimal mit ges. Natriumehlorid-Lösung gewaschen und. über Magnesiumsulfat getrocknet. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 274 mg (95% d: Th) tert-Butyl-l-({N- [^enzyloxy)c^bonyl]giycyl}arriino)-3,6,9,12-tetraoxapentadec an-15-oat.

LC-MS (Methode 12): Rt = 1.69 min; MS (ESIpos): m/z = 513 (M+H) ⁺ .

Zu einer Lösung von 274 mg (535 μmol)tert-Butyl-l -({N-[(benzyloxy)ca bo yl]glycyl}amino)- 3, 6, 9,12-tetraoxapentadecan- 15-oat in 5.0 ml dichlormethan wurde 820 μΐ (1 1 mmol) TFA zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 3 h bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand in Wasser aufgenommen und lyophilisiert.. Man erhielt 262 mg (100% d: Th) der Titelverbindung.

LC-MS (Methode 12): R _t = 1.12 min; MS (ESIpos): m/z = 457 (Μ+ΒΓ, Trifluoressigsäure --2-(trimethylsilyl)eihyM ^

3 ,6,9, 12-te

Die Titelverbmdung wurde ausgehend von kommerziell erhältlicher 3-Oxo- l-phenyl-2,7,10, 13,16- pentaoxa-4-azanonadecan-19-säure nach klassischen Methoden der Peptidchemie (Veresterung mit 2-Trimethylsilylethanoi mittels EDCI/DMAP, hydrogenolytische Abspaltung der Z-Schutzgruppe, Kupplung mit kommerziell erhältlichem N-(tert-Butoxycarbonyl)-3-{[(9H-fluoren-9-ylmetlioxy) carbonyl]amino}-D-alanm und Abspaltung der Fmoc-Schutzgmppe) hergestellt.

LC-MS (Methode 1): R _t = 0.74 mm; MS (ESIpos): m/z = 552 ? M H } .

Inter medial Fl 04

Trifluoressigsäure~(2S)-2-amino-4-[ {( 1 R)-l -[1 -benzyI-4-(2,5-difluorphenyl)-l H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]-N-(2- {[(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol- l- y l)ac ety ί ] amin o } eth l )butanam i d( 1 : 1 )

10 mg (0.014 mmol) von Intermedia! C53 wurden in 3.3 mL DMF gelöst und mit 8.5 mg (0.027 mmol) von Tntermediat LI sowie mit 7.8 mg (0.02 mmol) HATU und 12 μί Ν,Ν- Diisopropylethylamin versetz!. Der Ansatz wurde 15 min bei RT gerührt und anschließend eingeengt. Der Rückstand wurde durch präparative HPLC gereinigt und nach Lyophilisation wurden 5.6 mg (38% d. Th.) der geschützten Zwischstufe erhalten.

LC-MS (Methode 1): R, = 1.32 min; MS (ESIpos): m z = 915 (M+H) ⁺ .

5.6 mg (0.006 mmol) dieses Intermediats wurden in 2 ml DMF aufgenommen und mit 69 mg (0.61 mmol) l ,4-Diazabieyclo(2.2.2)octan versetzt. Der Ansatz wurde 2 h im Ultraschallbad behandelt. Anschließend wurden 35 μΐ Essigsäure zugegeben und der Ansatz im Hochvakuum eingeengt. Der Rückstand wurde durch präparative HPLC gereinigt. Es wurden 2.4 mg (48% d. Th.) der Titelverbindung erhalten .

LC-MS (Methode 1): R _t = 0.84 min; MS (EIpos): m/z - 693 [M+Hf. HPLC (Methode 11): R _t = 1.91 min;

Alternativ wurde die Titelverbindung auch ausgehend von Tntermediat C58 hergestellt. 15 mg (0.023 mmol) von Intermedia! C58 wurden zunächst mit 1 1 mg (0.036 mmol) Intermediat LI in Gegenwart von 13 mg ( 0.034 mmol) HATU sowie 10 μΐ NJSI-Diisopropylethylamin umgesetzt. Nach 60 min Rühren bei RT wurde eingeengt und der Rückstand durch präparative HPLC gereinigt. Es wurden 12.3 mg (63% d. Th.) des geschützten Intermediats erhalten.

LC-MS (Methode 1): R, = 1.3 min; MS (EIpos): m/z - 837 [M+Hf. im zweiten Schritt wurde dieses lntermediat in 3 mL 2,2,2-Trifluorethanol gelöst. Es wurden 12 mg (0.088 mmol) Zinkchlorid zugegeben und der Ansatz 2 h bei 50°C gerührt. Anschließend wurden 26 mg (0.088 mmol) Ethylendiamin-N,N,N',N'-tetraessigsäure sowie 2 mL einer 0.1%-igen wässrigen Trifluoressigsäurelösung zugesetzt. Der Ansatz wurde mittels präparativer HPLC gereinigt. Nach Einengen der entsprechenden Fraktionen und Lyophiiisation des Rückstands aus Acetonitrii/Wasser wurden 8.1 mg (68% d.Th.) der Titelverbindung erhalten.

LC-MS (Methode 1): R _t = 0.89 min; MS (ESIpos): m/z = 693 (M+H) ⁺ .

lntermediat F119

Trifluoressigsäure~(2S)-2-amino-4-[ {( 1 R)-l -[1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-l H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} ( 1 : 1 )

29 mg (0.044 mmol) von lntermediat C58 wurden in 3.4 mL DMF aufgenommen und mit 36 mg (0.087 mmol) von lntermediat L52 sowie mit 25 mg ( 0.065 mmol) HATU und 19 μΐ Ν,Ν- Diisopropylethyiamin versetzt. Nach 60 min Rühren bei RT wurde eingeengt und der Rückstand durch präparative HPLC gereinigt. Es wurden 26.4 mg (73% d. Th.) der Zwischenstufe erhalten.

LC-MS (Methode 1): R _t = 1.34 min; MS (ESIpos): m/z = 820 und 822 (M+Hf Dieses Intermediat wurde in 3 mL 2,2,2-Trifluorethanol gelöst. Es wurden 6.5 mg (0.048 mmol) Zinkchlorid zugegeben und der Ansatz 4 h bei 50°C gerührt. Dann wurden 13.9 mg (0.048 mmol) Emylendiamin-N,N,N',N'-te1raessigsäure sowie 2 mL einer 0.1 %-igen wässrigen Trifluoressigsäurelösung zugesetzt. Der Ansatz wurde mitteis präparativer HPLC gereinigt. Nach Einengen der entsprechenden Fraktionen und Lyophilisation des Rückstands aus Acetonitril/Wasser wurden 14.4 mg (58% d.Th.) der Titelverbindung erhalten.

LC-MS (Methode 1): R, = 0.88 mm; MS (ESIpos): m/z = 676 und 678 (M+H

Intermediat F127

Trifluoressigsäure --(2S)-2-ammo-4-({(lR) -[l -benzyM-(2,5-dif^^

dimethyipropyi} f(2S)-2-methoxypropanoyi]aniino)-N-(2- {[(2,5-dioxo-2,5-di

yl)acetyl]amino} ethyl)butanamid (1 : 1)

12 mg (0.015 mmol) von Intermediat C59 wurden in 2.4 mL DMF gelöst und mit 14.6 mg (0.046 mmol) von Intermediat LI sowie mit 6 mg (0.031 mmol) 1 -(3 - Dimefih laminopropyl)-3 ^■ ethyl- carbodiimid-Hydrochlorid, 5.9 mg (0.039 mmol) 1-Hydroxy-lH-benzotriazoI-Hydrat und 8 μΐ Ν, ^' Ν-

Diisopropyiethylamin versetzt. Nach 1 h Rühren bei RT wurde eingeengt und der Rückstand durch präparative HPLC gereinigt. 11 mg (70% d. Th.) dieser Zwischenstufe wurden erhalten.

LC-MS (Methode 1): R, = 1.34 min; MS (ESIpos): m/z = 942 < \ ! · 1 i ί .

11 mg (0.01 1 mmol) dieses Intermediats wurden in 2 ml DMF aufgenommen und mit 123 mg (1.1 mmol) l ,4-Diazabicyclo(2.2.2)octan versetzt. Der Ansatz wurde 2 h im Ultraschallbad behandelt. Anschließend wurden 63 μΐ Essigsäure zugegeben und der Ansatz im Hochvakuum eingeengt. Der Rückstand wurde durch präparaüve HPLC gereinigt. Es wurden 2 mg (22% d. Th.) der Titelverbindung erhalten .

LC-MS (Methode 1): R _t = 0.89 min; MS (EIpos): mz = 721 iVi-iii .

HPLC (Methode 11): R _t = 1.95 min;

Intermediat F153

Triluoressigsäure -»(2S)~2-amino-4-({(3R}-I-[l^^

dimethylpropyl}[(2S)-2-hyiiOx>qm>panoyljammo)-N-(2- {[(2,5

yi)acetyi]amino}ethyl)butanamid (1:1)

Die Synthese erfolgte in Analogie zu intermediat Fl 04 ausgehend von Intermediat C60.

LC-MS (Methode 1): R»= 1.1 min; MS (ESIpos): m/z = 707 (M+H) ⁺ .

Intermedia! F155

N ⁶ -(N-{(2S)-2-Ainino-4-[{^^

dnnethyipropyi}(giyco!oyi)ami

p rrol-1 -yl)hexanoyl]-L-valyi-L-aIatiyl}-L-lysin -trifluoressigsäure (1 : 1 )

Die Titelverbindung wurde durch Kupplung von 14 mg (0.019 mmol) des lntermediats C61 mit 15 mg (0.021 mmol) von Intennediat L61 in Gegenwart von 8.7 mg (0.023 mmol) HATU sowie 17 μί Ν,Ν-Diisopropylethylamin und anschließender Entschützung mit Zinkchlorid in Trifluorethanol wie in Intennediat Fl 19 beschlieben hergestellt. Nach Reinigung durch präparative HPLC wurden 13 mg (59% d. Th. über 2 Stufen) der Titelverbindung erhalten.

LC-MS (Methode 1): R _t = 0.86 min; MS (ESIpos): m/z = 1076 (M+HY

Intermedia! Fl 73

N- [6-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -ylihexanoyl] -L- valyl-L-alanyl-N-[2-( {(2S)-2-amino-4- [ {(lR) -[l-benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH^yiTol-2-yl]-2,2-dime1hyl propyl}(glycoloyl)amm^ butanoyl}amino)ethyl]-L-glutamin -trifluoressigsäure (1 :1)

Die Titelverbindung wurde ausgebend von 15 mg (0.018 mmol) Intermediat C64 durch Kupplung mit 12 mg (0.02 mmol) von Intemiediat L63 in Gegenwart von 7.7 mg ( 0.02 mmol) HATU sowie 16 μ! Ν, -Diisopropyiethylamin und anschließender Entschützung mittels Zinkchlorid in Trifluorethanol wie in intermediat Fl 19 beschrieben hergestellt. Nach Reinigung durch präparative HPLC wurden 12 mg (58% d. Th. über 2 Stufen) der Titelverbindung erhalten.

LC-MS (Methode 1): R _t = 0.91 mm; MS (EIpos): m/z = 1048 | Vi ! 11 .

Intermedia! F178

Trifluoressigsäiire- lR,2S)-2^;{(2S)-2-arnino-4^{(lR) -[l-benzyl-4-(2

pyrrol-2-yl]-2,2--dimethylpropyl}(^^

ethyi} eyelopentanearboxaniid (1:1)

Die Titelverbndimg wurde in Anlogie zu intemiediat Fl 77 hergestellt, wobei an Steile von Intermediat LI das Intermediat L52 eingesetzt wurde.

LC-MS (Methode 1): R _t = 0.89 min; MS (Elpos): m/z = 787 und 789 [M+H]

Intermedia! F180

N- [2-( {(2S)-2-Amino-4- [ {( I R)- 1 - [ 1 -benzyi-4-(2,5-difluoiphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}(giycoloy3)am

yl)ace i]-L-giutamin -trifluoressigsäure (1 : 1 )

Die Titelverbindung wurde durch Kupplung von 9.6 mg (0.012 mmol) Intermediat C64 mit 5 mg (0.013 mmol) von Intermediat L64 in Gegenwart von 7 mg ( 0.018 mmol) HATU sowie 6 μί Ν,Ν- Diisopropylethyiamin und anschließender Entschützung mittels Zinkchlorid in Trifluorethanol wie in Intermediat Fl 19 beschrieben hergestellt. Nach Reinigung durch präparative HPLC wurden 3.1 mg (28% d. Th. über 2 Stufen) der Titelverbindung erhalten.

LC-MS (Methode 1): R, = 0.85 min; MS (EIpos): m/z - 822 [M+H] ⁺ .

Intermediat F192

N- {(2S)-2-Amino-4-[ {( 1 R)- 1 -[ 1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-l H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]butanoyl} -3- {[(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol

yl)acetyl]amino}-L-alanin -trifluoressigsäure (1 :1 )

60mg (0.091 mmol) von Intermediat C58 wurden in 8 ml DMF aufgenommen und mit 45 mg (0.100 mmol) von Intermediat L65 in Gegenwart von 42 mg (0.1 1 mmol) HATIJ und 64 μΐ, Ν,Ν- Diisopropylethylamin gekuppelt. Nach Reinigung durch präparative HPLC wurde das Intermediat in 10 ml Ethanol aufgenommen und über 10%-igem Palladium auf Aktivkohle 45 min lang bei RT unter Wasserstoff-Normaldruck hydriert. Der Katalysator wurde danach abfiltriert und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt und das Produkt durch präparative HPLC gereinigt. Nach Lyophil isation aus Acetonitril/Wasser 1 :1 wurden 24.5 mg (31% d.Th. über 2 Stufen) von 2- (Tmnethyisilyl)ethyl-3-arn^

yl]-2,2-dimemylpropyl}(glycoloyl)amino]-2-( {[2-(trimethylsilyl)etboxy]cai'bonyl}aiiiino) butanoyl]-L-alaninat erhalten.

LC-MS (Methode 1): R, = 1.17 min; MS (EIpos): m/z = 844 [M+Hf.

Die Titel Verbindung wurde dann durch Kupplung von 10 mg (0.012 mmol) dieses Intermediats mit 2 mg (0.013 mmol) von kommerziell erhältlicher (2,5-Dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 - yOessigsäure Intermediat in Gegenwart von 5.4 mg ( 0.014 mmol) HATIJ sowie 8 μΐ Ν,Ν- Diisopropylethylamin und anschließender Enlschützung mit Zinkchlorid in Trifliiorethanol wie in Intermediat Fl 19 beschrieben hergestellt. Nach Reinigung durch präparative HPLC wurden 3.5 mg (33% d. Th. über 2 Stufen) der Titelverbindung erhalten.

LC-MS (Methode 1): R. ₍ = 0.81 min; MS (ESIpos): m/z = 737 (M+H) ⁺ . Intermedia! F193

N- {(2S)-2-Amino-4-[ {( 1 R)- 1 -[ 1 -benzyi-4-(2,5-difluorphenyl)-l H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]butanoyl} -3- {[(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol

yl)aeetyi]amino} -D-alanin -trifluoressi sä re (1 :1)

Die Synthese der Titelverbindutig erfolgte in Analogie zu Intermediat Fl 92 ausgehend von 3~ {[(Benzyloxy)carbonyl]amino} -N-(tert-butoxycarbonyl)-D-alanin - N-cyclohexylcyclohexanamine ( 1 : 3 ).

LC-MS (Methode 1): R _t = 0.87 mm; MS (ESIpos): m/z = 737 (M+H) ^1' .

Intcrmediat F194

N- {5-[(2,5-DioxopyiTolidin-l-yl)oxy]-5-oxopentanoyl} -L-valyl-N- {3-[ {(1R)-1 -11 -benzyl-4-( difluorphenyl)-lH-pyrrol-2-yll-2,2-dimethyipropyl}(glycoloyl )ammo]prop^

Die Titelverbindung wurde ausgehend von Beispiel M9 zunächst durch Kupplung mit N- [(Benzyloxy)carbonylj-L-valyl-L-alanin in Gegenwart von HATU und N,N-Diisopropylethy!amin hergestellt. Im nächsten Schritt wurde die Z-Schutzgruppe durch 1 -stündige Hydrierung über 10%- igem Palladium auf Aktivkohle bei RT unter Wasserstoff-Normaldruck entfernt und das entschützte Intermediat anschließend durch Umsetzung mit 1 ,1 '-[(1 ,5-Dioxopentan-l ,5- diyi)bis(oxy)] dipyrrolidin -2,,5-dion in die Titelverbindung überführt.

LC-MS (Methode 1): R _t = 1.19 min; MS (ESIpos): m z = 851 [M+H] ⁺ .

Intermediat F207

N ⁶ -(N-{(2S)-2-Amino-4-[{( l R)-l -[l-benzyl-4-{2,5-difluoiphenyl)-lH-pyrro^

<iimethy{propyi}(giycoloyl)amino]butanoyi}-beta-alany{ )-N ² -{N-[(2,^

pyrrol- 1 -yl)acetyl]-L-valyl-L-alanyl} -L-lysin -trifluoressigsäure ( 1 : 1)

Die Titelverbindung wurde in Analogie zu intermediat Fl 55 hergestellt. LC-MS (Methode 1): R _t = 0.81 min; MS (ESIpos): m/z = 1020 i VI - I i ) . Intermedia! F213

Trifluoressigsäure--3-({2-[(3-aininoprop

yi]-2,2-dunethylpropyl}ammo]-2-ox

yl)aeetyi]amino ethyl)propanamid (1 : 1 )

27.5 mg (0.04 mmol) 11-{(1R)-1 -[l-Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH-pynx)l-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} -2,2-dimethyl-6, 12-dioxo-5-oxa- 14-thia-7, 1 1 -diaza-2-silaheptadecaii- 17-säure (lntermediat C69) wurden zusammen mit 15.9 mg (0.05 mmol) Trifluoressigsäure ~ N-(2- aminoethyi)-2-(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)acetamid (1 : 1) (Intenrieöiat LI) in 1.8 L Acetonitril vorgelegt. Dann wurden 32.4 mg (0.31 mmol) Ν,Ν-Diisopropylethylamin zugegeben und 32.4 mg (0.05 mmol) T3P (50 % in Elhylacetat) zugetropft. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 11.9 mg (35 % d. Th.) der Verbindung

2,2-dimethylpropyl} - 1 -(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)-2,7, 12-trioxo- 10-thia-3 ,6, 13- triazahexadecan- 16-yl]carbamai.

LC-MS (Methode 1): R, = 1.39 min; MS (ESIpos): m z = 881 (M+H) ⁺ . 11.9 mg (0.01 mol) 2-(Trime lsilyl)ethyl-[13-{(l R) -[l-benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH- pyrroi-2 -yl] -2,2-dimethylpropyl } - 1 ~(2,5-dioxo-2,5~dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yi 2,7, 12-trioxo-l 0-thia- 3,6,13-iriazahexadecan-l 6-yl]carbamat wurden in 1.0 mL Trifluorethanol gelöst und mit 5.5 mg (0.04 mmol) Ztnkdichlorid versetzt. Die Reaktionsmischung rührte über Nacht bei 50 °C. Die Reaktionsmischung wurde mit 11.8 mg (0.04 mmol) Ethyiendiamin-N,N,N',N'-tetraessigsäure versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1% TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1 % TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 7.4 mg (60 % d. Th.) der Titelverbindung.

LC-MS (Methode 5): R _> = 2.75 mm; MS (ESIpos): m/z = 737 (M+H) ^1' .

Intermediat F216

S-{2-[(3-Ammopropyl){(lR)-l-[l-beti^

dimethylpropyl}aim^o]-2-oxoemyl} -N-[19-(2,5-dioxo-2,5-dihyä^o-lH-pyrrol-l -yl)- 17-oxo- 4,7,10,13 -tetraoxa- 16-azanonadecan- 1 -oylJ-L-cysteinyl-beta-alanin -trifluoressigsäure (1 :1)

-OH o

0--<"

Unter Argon wurden 30.2 mg (0.06 mmol) N,N ^, -Bis[(benzyloxy)carbonyl]-L-cystin in 2.0 mL Wasser und 2.0 mL wo-Propanol vorgelegt und mit 56.7 mg (0.20 mmol) TCEP versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 30 min bei RT gerührt. Es wurden dann 50.0 mg (0.08 mmol) 2- (Trimethylsilyl)ethyl- {3-[ {(1R)-1 -[1 -benzyl-4-(2,5 lifluorphenyl)-lH-pynOl-2-yi]-2,2- dimethylpropyl}(chloracety])amino]propyl}carbamat (Intermediat C70) gelöst in 2.0 mL iso- Propanol und 122.2 mg (0.48 mmol) 1 ,8-Diazabicycio(5.4.0)undec-7-en zugegeben und die Reaktionsmischung wurde 7 h bei 50 °C gerührt. Dann wurden nochmals 322.2 mg (0.48 mmol) 1 ,8-Diazabicyclo(5.4.0)undec-7-en zugegeben und die Reaktionsmischung wurde 1 h bei 50 °C gerührt. Es wurde mit Ethyiacetat verdünnt und die organische Phase wurde mit Wasser und ges. Natriiimhydrogencarbonat-Lsg. extrahiert und mit ges. NaCl-Lsg. gewaschen. Die organische Phase wurde über Magneskunsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosii 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeC /Wasser, 0.1 % TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 43.1 mg (64 % d. Th.) der Verbindung S-(l l- {( IR)- 1 -[ 1 -Benzyl-4-(2,5-difiuorphenyl)-l H-pyrrol-2 -yl]-2,2-dimethylpropyl } -2,2-dimethyl-6, 12- dioxo-5-oxa-7 ,1 1 -diaza-2-silatridecan-l 3-yl)-N-[(benzyioxy)carbonyl]-L-cystein.

LC-MS (Methode 1): R, = 1.46 min; MS (ESIpos): m/z = 851 (M+H) ^" .

16.5 mg (0.05 mmol) 4-Memylbenzolsulfonsäure-benzyl-beta-alaninat (1 :1) wurden zusammen mit 14.0 mg (0.11 mmol) Ν,Ν-Diisopropylethylamin in 1.5 mL Acetonitril vorgelegt. Die Reaktionsmischung wurde 3 min bei RT gerührt und dann wurden 30.8 mg (0.04 mmol) S-(l l- {( IR)- 1 -[ 1 -Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-l H-pyrrol-2 -yl]-2,2-dimethylpropyl } -2,2-dimethyl-6, 12- dioxo-5-oxa-7,l l-(iia2a-2-silairidecan-13-yl)-N-[(benzyioxy)carbonyl]-L-cys tein gelöst in 1.5 mL Acetonitril, 23.4 mg (0.18 mmol) Ν,Ν-Diisopropylethylamin und 29.9 mg (0.05 mmol) T3P (50 % in Ethyiacetat) zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT gerührt. Es wurde Wasser zugegeben und die Reaktionsmischung wurde direkt, mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosii 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Benzyl-S-(11- {(lR)-i-[l-benzyi-4-(2,5-difluoiphenyi)-!H-pymii-2-yl]-2,2-d ime

dioxo-5-oxa-7,l l-diaza-2-silatridecan-13-yl)-N-[(benzyloxy)carb

wurde als Verbindung erhalten.

LC-MS (Methode 1): R _t = 1.59 min; MS (ESIpos): m/z ----- 1012 i \i I i ) .

43.8 mg (43.3 μηιοΐ) Benzyl-S-(l l-{(lR)-l -[l-benzyM-(2,5-dfluo henyl) H yπol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} -2,2-diniethyl-6,12-dioxo-5-oxa-7,l i -diaza-2-silatrid

[(benzyloxy)carbonyl]-L-cysteinyl-beta-aianinat wurden in 8.0 L Ethanol gelöst, mit 4.4 mg Palladium auf Aktivkohle (10%) versetzt und bei RT und Normaldruck über Nacht hydriert. Die Reaktionsmischung wurde über einen Pappfilter filtriert und der Filterkuchen wurde mit einem Ethanol nachgewaschen. Das Lösemittel wurden im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde noch zweimal wie soeben beschrieben behandelt. Der Rückstand wurde mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosii 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 14.5 mg (37 % d. Th.) der Verbindung S-(l l-{(lR)-l-[l-Benzyi-4-(2,5-difluoiphenyi)-lH- pyrrol-2-yl] -2,2-dimethyipropyl } -2,2-dimethyl-6, 12-dioxo-5-oxa-7,l 1 -diaza-2-silatridecan- 13 -yl)- L-cysteinyl-beta-alanin -trifluoressigsäure (1 :1).

LC-MS (Methode 1): R, = 1.08 min; MS (ESIpos): m z = 788 ί VI · 1 ! ! .

14.5 mg (16.1 μηιοΐ) S-(l l-{(lR)-I -[l-Benzy]-4-(2,5-diita

dimethylpropyl} -2,2-dimethyl-6, 12-dioxo-5-oxa-7 ,11 -diaza-2-silatridecan-13-yl)-L-cysteinyl-beta- alanin-trifluoressigsäure (1 :1) wurden zusammen mit 9.1 mg (17.7 μτηοΐ) 3-(2,5-Dioxo-2,5- dihydro-1.H-pyrrol-1 ~yl)~N- { 15-[(2,5-dioxopyrrolidin-l -yl)oxy]-15-oxo-3,6,9,12-tetraoxaperitadec- 1 -yl}propanamid in 3 .0 mL DMF vorgelegt und mit 4.9 mg (48.2 μπιοΐ) 4-Methyln M"pholin versetzt. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT gerührt und dann mit 3.4 mg (0.06 mmol) Essigsäure versetzt. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosii 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA) gereinigt,. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 4.9 mg (50 % d. Th.) der Verbindung S-(3 l -{(lR)-l-[l -Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} -2,2-dimethyl-6, 12-dioxo-5 -oxa-7, 11 -diaza-2-silatridecan- 13 -yl)-L-cysteinyl-beta- alanin-trifluoressigsäure (1 :1).

LC-MS (Methode 1): R _t = 1.28 min; MS (ESIpos): m/z = 1 186 (M+H) ⁺ .

14.1 mg ( 1 1.9 μηιοΐ) S-(l l-{(lR)-l -[l-BenzyM-(2,5-difluo hOTyl)-m rrol-2- l]-2,2- dimetfaylpropyi } -2,2-dimethyi-6, 12-dioxo-5-oxa-7, 11 -diaza-2-silatridecan-l 3-yl)-N-[ 19-(2,5- dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)- 17-oxo-4,7, 10, 13 -tetraoxa- 16-azanonadecan- 1 -oyl j-L- cysteinyi-beta-aianin-trifluoressigsäure (1 :1) wurden in 1 .5 L Trifluorethanol gelöst und mit 9.7 mg (71.3 μπιοΓ) Zinkdichlorid versetzt. Die Reaktionsmischung rührte 3 h bei 50 °C. Es wurden nochmals 9.7 mg (71.3 μιηοΐ) Zinkdichlorid zugegeben und die Reaktionsmischung rührte 3 h bei 50 °C. Es wurden nochmals 9.7 mg (71.3 μιηοί) Zinkdichlorid zugegeben und die Reaktions ischung rührte 4 h bei 70 °C. Die Reaktionsmischung wurde mit 20.8 mg (0.07 mmol) Ethylendiamin-N,N,N',N'-tetraessigsäure versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1% TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosii 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA). Die Lösemitte] wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand wurde lyophilisiert. Man erhielt 6.2 mg (44 % d. Th.) der Titelverbindung.

LC-MS (Methode 1): R _t = 0.82 min; MS (ESIpos): m/z = 1042 (Μ+ΗΓ, Intermedia! F217

S-{2-[(3-Aminopropyl){(lR) -[l-ben^

dimethylpropyl}amino] -2-oxo

trifluoressigsäure (1 :1)

Unter Argon wurden 7.5 mg (0.05 mmol) (2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)essigsäure in 1.5 mL DMF vorgelegt und mit 7.5 mg (0.05 mmol) HOBt, 15.5 mg (0.05 mmol) TBTU und 6.2 mg (0.05 mmol) Ν,Ν-Diisopropylethylamin versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 10 min bei RT gerührt. Es wurden dann 40.0 mg (0.05 mmol) S-(l l-{(lR)-l-[l-Benzyl-4-(2,5-difluoiphenyl)-lH- pyrroi-2-yl]-2,2-dimethyIpropyl}-2,2-dimethyl-6,l 2-dioxo-5-oxa-7,l 1 -diaza-2-silatridecan-l 3-yl)- L-cystein-trifluoressigsäure (1 :1) (Intermediat C71) gelöst in 1.5 mL DMF und 18.7 mg (0.14 mmol) ,N-Diisopropylethylamin zugegeben und die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fiuss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1 % TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 11.2 mg (25 % d. Th.) der Verbindung S-( 11 - {( 1R)-1 - [1 -Benzyl-4-(2,5-diiluorphenyl)- 1 H~pyrrol~2-yl]-2,2~dimethylpropyl} - 2,2-dimethyl-6,12-dioxo-5-oxa-7,l l^iaza-2-silatridecan-13-yl)-N-[(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH- pyrrol- 1 -yl )acetyl] -L-cystein .

LC-MS (Methode 1): === 1.37 min; MS (ESIpos): irv'z === 854 (M+H) ⁺ .

10.9 mg (12.8 μηιοΐ) S-(l l-{(lR)-l -[l-BenzyM-(2,5-difluorphenyl)-lH-pynol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} -2,2-dimethyl-6,12-dioxo-5-oxa-7,l l -diaza-2-silatridecan-13-yl)-N-[(2,5-dioxo- 2,5-dihydro-3H-pyrrol-l-yl)acetyl]-L-cystem wurden in 2.0 mL Trifluorethanol gelöst und mit 10.4 mg (76.6 μιηοΐ) Zinkdichlorid versetzt. Die Reaktionsmischung rührte 4 h bei 50 °C. Die Reaktio smischung wurde mit 22.4 mg (0.08 mmol) Ethylendiamin-N,N,N',N'-tetraessigsäure versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1 % TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosü 250x30; 10μ, Fiuss: 50 mL/ in, MeCN/Wasser, 0.1% TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand wurde lyophilisiert. Man erhielt 7.5 mg (65 % d. Th.) der Titelverbindung.

LC-MS (Methode 1): R, = 0.92 min; MS (ESIpos): m/z = 710 (M+H) ⁺ .

Intermediat F241

Trifluoressigsäure --(2S)-2-ammo-4-[ {(lR)-l-[l-benzyM-(2,5-diflliOφhenyl)-lH- yrrol-2-yl]· dimethylp (1 :1)

Die Titelverbindung wurde aus Intermediat C66 durch Kupplung mit kommerziell erhältlichem 1- (2-Bromaeetoxy)pyrrolidin-2,5 -dion und anschließender Deblockierung mit Zinkclorid hergestellt.

LC-MS (Methode 1): R _t = 0.84 min; MS (EIpos): m/z - 733 und 735 [M+Hf

Intermedia! F242

Trifluoressigsäure --(2S)-2-ammo~4-[{(lR) ~[l-b^^

dimethylpropyl} (glycoloyl)amino]-N-(3-{[(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l- yl)acetyl]ammo}propyl)butanamid (1 :1)

Die Synthese der Titelverbindung erfolgte in Analogie zu Intermediat Fl 04. LC-MS (Methode 1): R _t = 0.84 min; MS (ESIpos): m/z = 707 (M+H) ⁺ .

Interraediat F243

Trifluoressigsäure --(2S)-2-ammo~4-[{(lR)-i~[l-benzyM^^

dimethylpropyl} (glycoloyl)amino]-N-[2-(2-{[(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-p>' rrol-l- yl)acetyl]ammo}ethoxy)ethyl]butanamid (1 :1)

Die Synthese der Tiielverbinöung erfolgte in Analogie zu Iniermediat F242. LC-MS (Methode 1): R, = 0.81 mm; MS (ESIpos): m/z = 737 (M+H) ^1' .

Intermedia^Fl S

Trifluoressigsäure— N-{(2S)-2-amino-4-f{(lR)-l -[l-benz>']-4-(2,5-difiuoi ^* phenyl)-lH-pyrroi-2-yl]-

2,2~dimethylpropyl}(giyeoioyl)amiTO^

yl)acetyl]amino}ethyl)succinamid (1 :1)

Die Titelverbindung mirde durch Kupplung von 10 mg (0.0135 mmol) von intermedia!; C65 mit 8 mg (0.027 mmol) von Intennediat LI in 8 ml DMF in Gegenwart von 15 mg ( 0.04 mmol) HATU sowie 9 μΐ Ν,Ν-Diisopropylethylamin und anschließender Entschützung mit Zinkchlorid in Trifluorethanol wie in Inte:rmediat F 119 beschrieben hergestellt. Nach Reinigung durch präparative HPLC wurden 8.8 mg (58% d. Th. über 2 Stufen) der Titelverbindung erhalten.

LC-MS (Methode 1.): R _t = 0.84 min; MS (ESIpos): m z = 778 (M+H) ⁺ .

Intennediat F247

Trifluoressigsäure -metbyl-4-[(2-{[2-({(2S)-2-amino-4-[ {(lR) -[l -benzyM

lH-p}TTol-2-ylj-2,2~dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]butan oyl}amino)ethyl]ami

oxoethyl)amino] -2-brom-4-oxobutanoat (1 : 1)

34 mg (0.018 mmol) von Intennediat C66 wurden in 14 mL DCM gelöst und mit 10.1 mg (0.037 mmol) 2-Brom-l -ethylpyridimum-Tetrafluoroborat (BEP) sowie portionsweise mit insgesamt 250 μΐ Pyridin versetzt, wobei der pH-Wert zwischen 5 und 6 gehalten wurde. Dann wurde mit Essigsäure ein pH-Wert von 4 eingestellt, der Ansatz eingeengt, und der Rückstand durch präparative HPLC gereinigt. Nach Vereinigung der entsprechenden Fraktionen, Lyophilisation und Trocknung wurden 4 mg (21 % d.Th.) der geschützten Zwischenstufe erhalten, die anschließend mit Zinkchlorid an der Aminofunktion entschützt wurde. Nach HPLC -Reinigung und Lyophilisation wurden 3 mg (72% d.Th.) der Titelverbindung als farbloser Schaum erhalten.

LC-MS (Methode 1): R _t = 0.88 mm; MS (ESIpos): m/z = 805 und 807(M+H) ⁺ . Interraediat F248

Trifluoressigsäure --(2S)-2-amino-4-[ {(lR)-l-[l -benzyl^^

dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]-N-{2-[2-(2,5-dioxo-2,5-d ihydro-lH-p rrol-l - yl)ethoxy]ethyl}butanamid 1 : 1

Die Titelverbindung wurde durch Kupplung von 1 0 ing (0.015 mmol) Intermediat C58 mit 5 mg (0.017 mmol) Intermediat LI 2 in Gegenwart von HATU und anschließende Entsehützung mit Zinkchlorid hergestellt. Es wurden 6.5 mg (52% d.Th. über 2 Stufen) der Titelverbindung erhalten. LC-MS (Methode 1): R = 0.91 min; MS (ESIpos): m/z 680 (M+H) ⁺ .

Intermediat F254

Trifluoressigsäure -methyl-(3S)-4- [(2-{ [2-( {(2S)-2-amino-4-[ {( 1 R)-l -[1 -benzyl-4-(2,5-difluor phenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}(glycoloyl)amino] butanoyl}amino)ethyl] amino}-2- oxoethyl)amin -3 -brom-4-oxobutanoat ( 1 : 1 )

Die Titelverbindung wurde in Analogie zu Intermediat 247 durch Kupplung von 15 mg (0.02 mmol) Intermediat C66 mit 21 mg (0.099 mmol) (2S)-2-Brom-4-methoxy-4-oxobutansäure, die wie in (J.Org.Chem. 200, 65, 517-522) beschrieben aus (2S)-2-Amino-4-rnethoxy-4- oxobutansäurehydrochlorid ( 1 : 1) synthetisiert wurde, hergestellt.

LC-MS (Methode 1): R, = 0.89 min; MS (ESIpos): m/z = 805 und 807(M+H) ⁱ .

Intermediat F255

R/S-(N- [ 19-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol - 1 -yl)- 17 -oxo-4,7, 10,13 -tetraoxa- 16-azanonadecan- 1 -oyl]-L-alpha-glutamyl-S- {2-[(3 -aminopropyl) {(lR)-l - [1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- lH- rrol-2-yl] -2,2-dimethylpropyl } amino] -2-oxoethyl } )- homocystein-trifluoressi gsäure (1 : 1)

13.1 mg (0.04 mmol) (2S)~5-(Benzy1.oxy)-2"{[(benzy3oxy)carbonyl]aniino}-5~oxopen tansäure wurden in 1.0 mL DMF vorgelegt und mit 5.4 mg (0.04 mmol) HOBt, 1 1.4 mg (0.04 mmol) TBTXJ und 4.6 mg (0.04 mmol) Ν,Ν-Diisopropylethylamin versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 10 min bei RT gerührt. 30.0 mg (0.04 mmol) ίυ5~(1 1-{( ΓΙΙ)~1 -[1 -Βεηζ>'1-4-(2,5^ίί^0φ1ΐ6η>'1)-1Η~ pyrroi-2 -yl] -2,2-dimethylpropyl } -2,2-dimethyl-6, 12-dioxo-5-oxa-7,l 1 -diaza-2-silatridecan- 13 -yl)- homocystein-trifluoressigsäure(l : l) (Intermediat C l l) gelöst in 12.9 mg (0. 1 mmol) N,N- Diisopropylethylamin und 1 mL DMF wurden dann zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT gerilhrt. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 niL/min, MeC /Wasser/0.1 %TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 32 mg (73 %) der Verbindung 4-[2-[[(lRH-[l-benzyl-4-(2,5-difl

(2 -trirnethylsilyiethoxy carbony iamino)propyl] amino] -2 -oxo-ethyl] sulfanyl-2-[[(2S)-5-benzyloxy-

2-(benzyloxycarbony3amino)-5-oxo-pentanoyi]amino]butansä ure.

LC-MS (Methode 1): R, = 1.53 min; MS (ESIpos): m/z = 1084 ( ! I i i .

41.4 mg (0.038 mmol) 4-[2-[[(lR)-! -[l -benzyl-4-(2,5-diflu^^

propyl]-[3-(2-lximemylsilylethoxycarbonylamino)propyl]ami no]-2-oxo-ethyl]sulfanyl-2 benzy4oxy-2-(benz>ioxycarbonylamino)-5-oxo-pentanoyljamin o]butansäure wird in 10 mL Ethanol, mit 4.2 mg Pd/C versetzt und mit Normaldruck hydriert. Die Reaktionsmischung wurde über einen Pappfilter filtriert und der Filterkuchen mit Ethanol nachgewaschen. Das Lösemittel wurde im Vakuum ohne Erwärmen verdampft. Der Rückstand wurde mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x40; 10μ, Fluss: 50 L/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 21.1 mg (56 %) der Verbindung R S-(L-alpha-Glutamyi-S-(l 1- {(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5- difluoφhen l)- lH-pyrrol-2-yl]-2,2 ^■ dimethyίpropyί}-2,2-dimeth l-6,12-dioxo-5 ^■ o a-7,l l-diaza-2- silatridecan- 13 -yl))-homocystein -trifluoressigsäure (1 : 1).

LC-MS (Methode 1): = 1.1 3 min; MS (ESIpos): m/z = 860 (M+H) ⁺ .

20.4 mg (20.94 μηιοΐ) R/S-(L-alpha-Glutinnyl-S-( l l - {(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH- pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}-2,2-dimethyl-6,12-dioxo-5-o xa-7,l l -diaza-2-silatrideean-13-yl))- homocystein -trifluoressigsäure (1 : 1) wurden zusammen mit 11 .8 mg (23.04 μιηοΐ) 3-(2,5-Dioxo- 2,5-dihydro- lH-pyrrol-1 -yl)-N- { 15-[(2,5-dioxopyrrolidin- 1 -yl)oxyj- 15-oxo-3,6,9, 12- tetraoxapentadec-l -yl}propanamid in 1 .0 mL DMF vorgelegt und mit 4.2 mg (41 .88 μπιοΐ) 4- Methylmorpholin versetzt. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT gerührt und dann mit 3.1 mg (0.05 mmol) Essigsäure versetzt. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP- HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser/0.1% TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 9.5 mg (36 %) der Verbindung R/S-(N-fl 9-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l -yl)-17-oxo- 4,7,10, 13 -tetraoxa- 16-azanonadecan- 1 -oyl]-L -alpha-glutamyl-S-( 1 1 - {( 1 R)- 1 -[ 1 -benzyl-4-(2,5- ditluoφhe yϊ)-lH- yπωl-2-ylj-2,2-dimethyl ro yl}-2,2-dimethyϊ-6,l ^ -diaza-2- silatridecan-13-yl))-homocystein.

LC-MS (Methode 1): R _t = 1.66 min; MS (ESIpos): m/z = 1259 (Μ+ΉΤ, 9.4 mg (7.47 μ ^η ιοί) R/S-(N-[19-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro- lH-pyrrol-l-yl)-17-oxo-4,7, 10,13- tetraoxa- 16-azanonadecan- 1 -oyl]-L-alpha-glutamyl-S-( 1 1 - {( 1 R)- 1 - [ 1 -benzyl~4-(2,5- difluorphenyl)- lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl } -2,2-dimethyl-6, 12-dioxo-5-oxa-7, l l -diaza-2- silatridecan- 13-yl))-hoinocystein wurden in 1.5 mL Trifluorethanol gelöst und mit 6.1 mg (44.81 jimol) Zinkdi ehlorid versetzt. Die Reaktionsmischung rührte 3 h bei 50 °C. Die Reaktionsmischung wurde mit 13.1 mg (0.05 mmol) Emylencüamm-N,N,N\N' etraessigsäure versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1% TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1 % TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 6.9 mg (75 %) der Titelverbindung

LC-MS (Methode 1): R _t = 0.87 min; MS (ESIpos): m/z = 1 3 14 (M+H ^' f . Intermediat F256

Trifluoressigsäure --N-{(2S)-2-amino-4-[{(lR)-l-[l -bCTz

2,2-dimethylpropyl} (glycoloyl)amino]butyl}-N'-[2-(2- {[(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l - yi)ac

Die Titelverbindung wurde durch Kupplung von 10 mg (0.014 mmol) von Intermediat C65 und 9.6 mg (0.027 mmol) Trifluoressigsäure --N-[2-(2-arninoemoxy)emyl]-2-(2,5-dioxo-2,5-dihydro- lH-pyrrol-l-yl)acet amid (1 : 1) in Gegenwart von HATU und Ν,Ν-Diisopropylethylamin und anschließender Entschützung mit Zinkchlorid in Trifluorethanol wie in Intermediat Fl 19 beschrieben hergestellt. Nach Reinigung durch präparative HPLC wurden 8 mg (64% d. Th. über 2 Stufen) der Titelverbindung erhalten.

LC-MS (Methode 1): R _t = 0.84 min; MS (ESIpos): m/z = 822 (M+H) ⁺ . Intermedia! F257 - {2-[(3 -Aminopropyl) {( 1 R)- 1 - [ 1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dime1hylpropyl}amino]-2-oxoethyl}-N-[l 8-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-l H-pyrrol-l-yl)- 17-oxo-

4,7,10,13 -tetraoxa- 16-azaoctadecan- 1 -oyl] -L-cystein-tri fluoressigsäure (1 :1)

50.0 mg (0.06 mmol) R-(l !-{( 1R 1 -[l-Benzy]-4-(2,5-difliäorpher ₁ y3)~lH-pyrro]-2-yl]-2,2- dimethylpropyl } -2,2-dimethyi-6, 12 -dioxo-5-oxa-7, 11 -diaza-2 -silatridecan- 13 -yi)~L-eystein- trifluoressigsäure (1:1) (Intermediat C71 ) und 29 mg (0.07 mmol) 3-[2-[2-[2-[2-[[2-(2,5- dioxopyrrol-l -yl)ace1yl]amirio]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]propaTisäure (Intermediat 1,74) wurden in 3.0 mL DMF gelöst und mit 27.3 mg (0.07 mmol) HATU und 23.3 mg (0.18 mmol) Ν,Ν-Diisopropylethylamin versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 2 Stunde bei RT geröhrt. Die Reaktionsmischung wurde direkt mitteis präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosii 125x30; 0μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser; 0.1 % TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 17.4 mg (26 %) der Verbindung -( 1 - {(^)-1 -[1-Β6η^1-4-(2,5-&ί ο ηε^1)-1Η-ρ ^

dioxo-5-oxa-7,l l-diaza-2-silatridecan- 13-yl)-N-[l 8-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l -yl)-l 7- oxo-4,7, 10,13 -tetraoxa- 16-azaoctadecan- 1 -oyl] -L-cys tein .

LC-MS (Methode 6): R _t = 1.34 min; MS (ESIpos): m/z === 1101 (M+H) ^' .

17 mg (0.02 mmol) R-(l l- {(lR)-l-[l-Benzyl-4-(2,5-difli^henyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimelhylpropyi }-2,2-dimethyI-6, 12-dioxo-5-oxa-7, 11 -diaza-2-silatridecan- 13 -yl)-N-[ 18-(2,5■ dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrroi- 1 -yl)- 17-oxo-4,7, 10, 13 -tetraoxa- 16-azaoctadecan- 1 -oyl] -L-cystein wurden in 1.0 mL Trifluorethanol gelöst und mit 6.3 mg (0.05 mmol) Zinkdiehlorid versetzt. Die Reaktionsmischung rührte über Nacht bei 50 °C. Die Reaktionsmischung wurde mit 13.5 mg (0.05 mmol) Eüiylendiamin-N,N,N',N'-tetraess!gsäure versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1 % TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 inL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 7.6 mg (46 %) der Titelverbindung.

LC-MS (Methode 1): R, = 0.91 min; MS (ESIpos): m z = 957 (M+H) ⁺ . Intcrmediat F258

Triffuoressigsäure --(2S)-2-ammo-4-[{(lR) -[l -betizyl-4-(2,5-(Ufl^

dimethylpropyl} (glycoloyl)iimino]-N-[3-({2-[(bromacetyl)amirio]ethyl}amino) -3- oxopropyijbutanamid ( 1 : 1)

Die Titelverbindung wurde durch Kupplung von Intcrmediat C58 mit Tri luoressigsäure -benzyl- [2-ibeta-alanylamino)ethyl]carbamat (1 :1) mittels HATU, anschließender Hydrogenolyse, dann folgender Kupplung mit 1 -(2-Bromacetoxy^)yrrolidii!-2,5-dioi! und schließlich durch Entschützung mit Zinkchlorid hergestellt.

LC-MS (Methode 1): R _t = 0.86 min; MS (ESIpos): m/z = 747 und 749(M+H) ^"

Intermedia! F259

N- { (2S)-2-Amino-4 - [ {(1 R)- 1 - [ 1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethyl propyl}(glycoloyl)amino]bulanoyl}-3-{[N-(bromacetyl)glycyl]a mino}-D-alaiiin -trifluoressigsäure

(1 :1)

75rng (0.114 mmol) von Intermediat C58 wurden in 12.5 ml DMF aufgenommen und mit 78 mg (0.171 mmol) von Intermediat L75 in Gegenwart von 65 mg (0.11 mmol) HATTJ und 79 μΕ NN- Diisopropylethylamin gekuppelt. Nach Reinigung durch präparative HPLC wurde das Intermediat in 20 ml Ethanol aufgenommen und über 10%-igem Palladium auf Aktivkohle 1 h bei RT unter Wasserstoff-Normaldruck hydriert. Der Katalysator wurde danach abfiltriert und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt und das Produkt durch präparative HPLC gereinigt. Nach Lyophilisation aus Acetonitril Wasser 1 :1 wurden 63 mg (64% d.Th. über 2 Stufen) von 2-(Trknethylsilyl)eth l-3- amino-N~[(2S)~4-[{(iR) ~[l-benzyl-4~(2 dm^

dimethylpropyl} (glycoloyl)amino]-2-( { [2-(trimethylsilyl)ethoxy]carbonyi} amino) butanoylj-D- aianinat erhalten.

LC-MS (Methode 1): R _t = 1.16 min; MS (EIpos): m/z - 844 [M+H] ^1" .

40 mg (0.047 mmol) von diesem Intermediat wurden dann wie oben beschrieben mit N- [(Benzyioxy)carbonyljglycin in Gegenwart von HATU gekuppelt und anschließend erneut hydrogenolytisch entschützt,.

Die Titelverbindung wurde dann durch Kupplung von 10 mg (0.012 mmol) dieses Intermediats mit 7.7 mg (0.032 mmol) von kommerziel] erbältlichem 1 -(2-Bromacetoxy)pyrrolidin-2,5-dion in Gegenwart von 4 μί Ν,Ν-Diisopropylethylamin und anschließender Entschützung mit Zinkchlorid in Trifluorethanol wie in Intermediat Fi 19 beschrieben hergestellt. Nach Reinigung durch präparative HPLC wurden 1.3 mg der Titelverbindung erhalten.

LC-MS (Methode 1): R, = 0.83 min; MS (ESIpos): m z = 777 und 779 (M+H) ⁺ .

Intermediat F261

Trifluoressigsäure H2S)-2-amino-4-[ {(lR) -[l-benzyI-4-(2,^^

dimethylpropyl}(giycoloyl)a!nino]-N-(2-{2-[(bromacetyl)am ino]ethox.y}e (1 : 1)

Die Titelverbindung wurde durch Kupplung von 20 mg (0.03 mmol) Intermediat C58 mit 25.8 mg (0.061 mmol) Intermediat L77 in Gegenwart von HATU und anschließende Entschützung mit Zinkchlorid hergestellt. Es wurden 11.9 mg (47% d.Th. über 2 Stufen) der Titelverbindung erhalten.

LC-MS (Methode 1): R _t = 0.84 min; MS (ESIpos): m/z 722 und 720 (M+H) ⁺ .

Intermediat F262

S-{2-[(3-Aminopropyl){(lR)-l-[l-benzyl-4^^

dime1hylpropyl}amino]-2-oxoethyl}-N-{3-[2-(2- {[3-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l - l)propanoyl]amino } ethoxy)ethoxy]propanoyl } -L-cystein -trifluoressigsäure (1 :1)

30 mg (36 μιηοΐ) S-{2-[(3-Ammopro yl){(lR) -[l -beΐlzyl-4-(2,5-difluo henyl)-l H- yΓrol-2-yl]- 2,2-dimethylpropyl}ammo]-2-oxoethyl}-L-cystein -trifluoressigsäure (1 :1) (Intermediat C71) wurden zusammen mit 16,9 mg (40 μι ^η οΐ) 3-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)-N-[2-(2-{3- [(2,5-dioxopyrrolidin-l-yl)oxy]-3-oxopropoxy}eihoxy)ethyl]pr opanamid in 1.5 L DMF vorgelegt und mit 10,9 mg (108 μπιοΐ) 4-Methylmorpholin versetzt. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT gerührt und dann mit 7.58 mg (0.13 mmol) Essigsäure versetzt. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosü 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 33,4 mg (80 % d. Th.) der Verbindung S- ( 1 1 - { ( 1 R)- 1 -[ 1 -Benzyl-4-(2,5 -difluorphenyl)- 1 H-py rrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}-2,2-dimefhyl- 6, 12-dioxo-5-oxa-7, 1 1 -diaza-2-silatndecan- 13 -yl)-N- { 3 -[2-(2- { [3 -(2,5-dioxo-2,5 -dihydro- 1 H- pyrrol-l-yl)propanoyl]amino}ethoxy)eihoxy]propanoyl}-L-cyste in.

LC-MS (Methode 1): R, = 1.34 min; MS (ESIpos): m z = 1027 (M+H) ⁺ .

32.8 mg (32 μπιοί) S-(l l- {(lR)-l-[l-Benzyl-4-(2,5-difli^henyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimetiiy3propyi}-2,2-dimethyi-6,12KÜoxo-5-oxa-7,U-diaza-2-s ilatridecan-33^

(2,5-dioxo-2,5-dihydro-l H-pyrrol- 1 -yl)propanoyl]amino} ethoxy)ethoxy]propanoyl} -L-cystein wurden in 3.0 mL Trifluorelhariol gelöst und mit 26.1 mg (192 μπ ιΐ) Zinkdiehlorid versetzt. Die Reaktionsmischung rülirte 2 h bei 50 °C. Die Reaktionsmischung wurde mit 56.0 mg (0.192 mmol) Ethylendiamin-N,N, ',N'-tetraessigsäure versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1% TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. P-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 30μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1 % TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand wurde lyophilisiert. Man erhielt 22.9 mg (71 % d. Th.) der Titelverbindung.

LC-MS (Methode 1): R _t = 0.88 min; MS (ESipos): m/z = 883 (M+H) ⁺ .

Interniediat F263

N- [(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-l H-pyrrol- 1 -yi)acetyl]-beta-alanyi-S- {2- [(3 -aminopropyl) {( 1 R)- 1 - [ 1 - 0εηζν1-4-(2,5-ώΑυο ηεην1)-1Η-ργπο1^ - trifluoressigsäur 1 :1)

30.0 mg (0.036 mmol) R-(l l- {(lR)-l-[l-Benzyl-4-(2,5-difli^henyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimelhylpropyi }-2,2-dimethyI-6, 12-dioxo-5-oxa-7, 11 -diaza-2-silatridecan- 13 -yl)-L-eystein- trifluoressigsäure (1 :1) (Intermediat C71) und 9.8 mg (0.04 mmol) N-[(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH- pyrrol-1 -yl)acetyl]-beta-alanin (Intermediat L78) wurden in 1.0 mL DMF gelöst und mit 16.4 mg (0.04 mmol) HATU und 14.0 mg (0.11 mmol) Ν,Ν-Diisopropyletiiylamin versetzt,. Die Reaktionsmischung wurde 2 Stunde bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittels präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser; 0.1 % TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 4.2 mg (13 %) der Verbindung N-[(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l- yl)acetyi]-beta-alanyl-S-(i 1 - {(1 R)-l -[ 1 -berizyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} -2,2-dimethyl-6, 12-dioxo-5-oxa-7, 11 -diaza-2-silatridecan- 13 -yl)-L-cystein.

LC-MS (Methode 6): R _t = 1.31 min; MS (ESIpos): m/z = 925 (M+H) ⁺ . 11.3 mg (0.011 mmol) N-[(2,5-Dioxo-2,5-dihydro H^yrrol -yl)ace1yl]-beta-alanyl-S l 1-{(1R)- 1 -[1 -benz l-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimelhylpropyl} -2,2-dimethyl-6, 12-dioxo- 5-oxa-7,l l-diaza-2-silatridecan-13-yl)-L-cystetn wurden in 2.0 mL Trifluorethanol gelöst und mit 5.0 mg (0.04 mmol) Zinkdichiorid versetzt. Die Reaktionsmischung rührte 2 Stunde bei 50 °C. Die Reaktionsmischung wurde mit 10.7 mg (0.04 mmol) Ethylendia in-N,N,N', ^! "tetraessigsaure versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1 % TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 4.4 mg (40 %) der Titelverbindung.

LC-MS (Methode 1): = 0.91 min; MS (ESIpos): m/z = 781 (M+FfT.

Intermediat F264

N - [6-(2,5 -Di .oxo-2 ,5 -dihydro-1 H-pyrrol- 1 -yl)hexanoyl] -beta-alanyl-S- {2-[(3-aminopropyl){(lR)-

1 - l-be zyl-4- 2,5-d ftuo henyl)-lH- ym>L^

cystein -trifl ressigsäure (1 :1)

30.0 mg (0.036 mmol) R-(l l -{(lR)-l-[l -Benzyl- -(2,5-difluorphenyl)-l H-p rrol-2-y1]-2,2- dimethylpropyl}-2,2-dimethyl-6 ,12-dioxo-5-oxa-7, 11 -diaza-2-silatridecan- 13-yl)-L-cystein- trifluoressigsäure (1 :1) (Intermediat C71) und 12.2 mg (0.04 mmol) N-[6-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)hexanoyl] -beta-aianin (Intermediat L79) wurden in 1.0 L DMF gelöst und mit 36.4 mg (0.04 mmol) HATU und 14.0 mg (0.1 3 mmol) Ν,Ν-Diisopropylemylamin versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 2 Stunde bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittels präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser; 0.1 % TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 8.9 mg (24 %) der Verbindung N-[6-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l- yl)hexanoyl]-beta-alanyl-S l l- {(l^^

dmethylpropyl}-2,2<ümemyl-6,12-dioxo-5-^^

LC-MS (Methode 6): R, = 1.38 min; MS (ESIpos): m/z = 981 { M i ! ) .

15.3 mg (0.035 mmol) N-[6-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)hexanoyl]-beta-aI atiyi-S-(l l-

{(lR) -[l-benzyί-4-(2,5 lifluoφhenyί) H-py

dioxo-5-oxa-7,l 3 -diaza-2-silatridecan-13~yl)~L~cystein wurden in 2.0 mL Trifluorethanoi gelöst und mit 6.3 mg (0.045 mmol) Zinkdichlorid versetzt. Die Reaktionsmischung rührte 2 Stunde bei 50 °C. Die Reaktionsmischung wurde mit 13.5 mg (0.045 mmol) Emylendiamin-Ν,Ν,Ν',Ν'- tetraessigsäure versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1% TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL min, MeCN/ Wasser, 0.1 % TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 9.1 mg (62 %) der Titelverbindung.

LC-MS (Methode 1): R, = 0.92 min; MS (ESIpos): m/z = 837 (M+H) ⁺ .

jh terTOgdjat_F265

Trifluoressigsäure N-(3-aminopropyl)-N- {( 1 R)- 1 -[1 -benzyl· -(2,5-diflliO henyl)-l H-pyrroi-2-yl]- 2,2 iimethyipropyi}-22-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l -yl)-6, 17-dioxo-10, 13-dioxa-3-thia- 7, 16-diazadocosan- 1 -amid 1 :1)

30.0 mg (42.7 μτηοΐ) l l-{(lR)-l-[l -Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl } -2,2-dimethyl-6, 12-dioxo-5-oxa- 14-lhia-7, 11 -diaza-2-silaheptadecan- 17-säure (Intermediat C69) und 25.3 mg (55.6 μηιοί) Trifluoressigsäure N-{2-[2-(2- aminoethoxy)e1hoxy]ethyl}-6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol -l -yl)hexananiid (1 :1) (Intermediat L82) wurden in 1.9 mL Acetonitni vorgelegt und mit 60 μί (340 μιηοΐ) Ν,Ν-Düsopropylethylarnin und 33 μΐ (56 μηιοί) 2,4,6-Tripropyl-l ,3,5,2,4,6-tn^xatriphosphinan-2,4,6-trioxid 50 % in Ethylacetat versetzt. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT nachgerührt. Es wurde Wasser (2.0 mL) zugegeben und die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fiuss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% T ^' FA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 26.7 mg (60 % d. Th.) der Verbindung 2~(Tnmethylsiiyi)ethyl-^^

pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl } -26-(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol-1 -yl)-5, 10,21 -trioxo-14, 17- dioxa-7-thia-4, 1 1 ,20-triazahexacos- 1 -yljcarbamat.

LC-MS (Methode 1): = 1.40 min; MS (ESIpos): m/z = 1025 i \i I i ) .

25.3 mg (24.7 μιηοΐ) 2-(Trime lsilyl)e l-[4-{(l R)-H^

pyrrol-2-yl]-2,2-dimethyipro^^^

dioxa-7-thia-4,l 1 ,20-triazahexacos- 1 -yljcarbamat wurden in 2.0 mL Trifluorethanoi gelöst und mit 20.2 mg (148 μιηοΐ) Zinkdichlorid versetzt. Die Reaktionsmischung rührte 1 h bei 50 °C. Die Reaktionsmischung wurde mit 43.3 mg (148 μηαοΐ) Ethylendiamin-N,N,N',N'-tetraessigsäure versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1% TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fiuss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 23.4 mg (95 % d. Th.) der Titel Verbindung.

LC-MS (Methode 1): R _t = 0.89 min; MS (ESIpos): m/z = 881 (M+H) ⁺ .

InteraiediaatJF266

Trifluoressigsäure N-(3-aminopropyi)-N-{(lR)-l -[l-ben^

2,2-dimethylpropyl} - 1 -(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)-2, 13-dioxo-6,9-dioxa- 16-thia-3 ,12- diazaoctadecan- 18-amid 1 : 1 )

30.0 mg (0.043 mmol) 11-{(1Κ)-1 -[1-Ββηζγ1-4-(2,5-<ϋί1«θφΗ6ηγ1)-1Η-ργπο 1-2-γ1]-2,2- dimethylpropyi} -2,2-dimethyi-6, 12 -dioxo-5-oxa- 14-thia-7, 1 1 -diaza-2-silaheptadecan- 17-säure (Intermediat C69) wurden zusammen mit 22.2 mg (0.056 mmol) Trifluoressigsäure N- (2-[2-(2- aminoethoxy)e1hoxy]ethyl}-2-(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)acetamid (1 : 1) (Intermediat L83) in 1.9 mL Acetonitril vorgelegt. Dann wurden 60 μΐ (0.34 mmol) N,N-Diisopropylethylamin zugegeben und 33 μΐ (0.056 mmol) T3P (50 % in Ethylacetat) zugetropft. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT gerührt. Es wurde Wasser (2.0 mL) zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA) gereinigt. Die Lösemittei wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 20.5 mg (49 % d. Th.) der Verbindung 2- (Trimethylsilyl)ethyl-[19-{(lR)-l -[l-berlzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyi } - 1 -(2,5 -dioxo-2,5 -dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)-2, 13,18-trioxo-6,9-dioxa- 16-thia- 3,12,19-triazadocosan-22-yl] carbamat.

LC-MS (Methode 1): R _t = 1.38 min; MS (ESIpos): m/z = 969 (M+H) ⁺ .

19.1 mg (19.7 μηιοΐ) 2-(Trimethylsilyl)ethyl-[19-{(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluo� �he yl)-l H- pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}-l -(2,5-dioxo-2,5-dihydro-l H-pyrrol- 1 -yl)-2,l 3, 18-trioxo-6,9- dioxa-16-i ia-3,12,19-iriazadocosaQ-22-yl]carbamat wurden in 2.0 mL Trifluorethanol gelöst und mit 16.1 mg (118 μηιοΐ) Zinkdichlorid versetzt. Die Reaktionsmischung rührte 1 h bei 50 °C. Die Reaktionsmischung wurde mit 34.6 mg (118 μιηοΐ) Ethylendiamin-N,N,N',N'-tetraessigsäure versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1 % TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosü 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 13.9 mg (75 % d. Th.) der Titel Verbindung.

LC-MS (Methode 1): = 0.86 min; MS (ESIpos): m/z = 825 (M+H) ⁺ .

Interaiedia F267

S~{2~[(3~Amim)propyl){(lR)-i-ri~ben^

dimethylpropyl}amino]-2-oxoeihyl}-N^

6,9,12,15-tetraoxa-3-azaoctadecan-l 8-yl]-L-cysteinyI-beta-alamn -trifluoressigsäure (1 :1 )

Unter Argon wurden 13.4 mg (33.3 μιηοΐ) l-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yi)-2-oxo- 6,9,12,15 -tetraoxa-3-azaoctadecan- 18-säure (Intermediat L74) in 1.0 ml DMF vorgelegt, mit 9.3 μί (54.4 μιηοΐ) Ν,Ν-Diisopropylethylamin und 12.6 mg (33.3 μιηοί) HATU versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 10 min bei RT gerührt. 25.0 mg (27.7 μτηοΐ) S-(l 1-{(1R)-1-[1-Benzyl- 4-(2,5-difluo henyl)-l H^yiroi-2-yl]-2,2-dime1hylpropyl } -2,2-dimethyl-6, 12-dioxo-5-oxa-7, 11- diaza~2-süatridecan~13~yi)~L~cysterayi-beta~alanm -trifluoressigsäure (1 :1) (siehe Synthese Intermediat F216) gelöst in 4,7 μΐ (27.7 μιηοΐ) Ν,Ν-Diisopropylethylamin und 1.0 mL DMF wurden dann zugegeben. Die Reaktionsmischimg wurde 90 Minuten bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosü 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 6.90 mg (19 % d. Th.) der Verbindung S-( 11 - {(lR) ~[l -Benzyl-4-(2,5~difluoii: hem

dioxo-5-oxa-7,l l-dia-«-2-si-aiiidecan 3-yl)-N-[l 18- dioxo-6,9,12,15-tetraoxa-3-azaociadecaQ-18-yl]-L-cysteinyl-b eta-alai!iQ.

LC-MS (Methode 5): R, = 4.44 min; MS (ESIpos): m z = 1 172 (M+H) ⁺ .

6.70 mg (5.71 μηιοΐ) 5-(1 1-{(1Κ)-1 -[1 -βεηζγ1-4-(2,5-ώί1υο Ηοηγ1)-1Η-ρνιτο1-2-γ1]-2,2- dimethylpropyl} -2,2-dimethyl-6, 12-dioxo-5-oxa-7, 1 1 -diaza-2-silatridecan-l 3-yl)-N-[ 1 -(2,5-dioxo- 2,5-dihydro- 1 H-pyrrol-1 -yl)-2, 18-dioxo-6,9, 12, 15-tetraoxa-3~azaoctadecan-18-yij-L-cysteinyl- beta-alanin wurden in 1.0 mL Trifluorethano! gelöst und mit 4.67 mg (34.3 μιηοί) Zinkdichlorid versetzt. Die Reaktionsmischuiig rührte 1 h bei 50 °C. Die Reaktionsmischung wurde mit 10 mg (34.3 μιηοΐ) Emylendiamin-N,N,N',N'-tetraessigsäure versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1% TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1 % TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 4.4 mg (67 % d. Th.) der Titel Verbindung.

LC-MS (Methode 1): R, = 0.85 min; MS (ESIpos): m/z = 1028 (M+H) ^† .

Intermediat F268

Trifluoressigsäure N-(3-aminopropyl)-N-{(lR)-l-[l -benzyM-(2,5-difluorphenyl)- lH-pyrrol-2-yl]- 2,2-dimethylpropyl} -28-(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)-6,23 -dioxo- 10,13,16,19-tetraoxa- 3 -ihia-7,22-diazaoctacosan- 1 -arnid ( 1 :1)

30.0 mg (0.043 mmol) 11- {(1Κ) -[1-ΒβηζγΜ^2,5-Λί1ιιθφ1ΐ6ηγ1)-1Η-ργΓΓθ1 -2-γ1]-2,2- dimethylpropyl} -2.,2-dimethyl-6, 12-dioxo-5-oxa- 14-lhia-7, 11 -diaza-2-silaheptadecan- 17-säure (Intermediat C69) wurden zusammen mit 30.2 mg (0.056 mmol) Trifluoressigsäure N-(14-amino- 3 ,6,9, 12-tetraoxatetradec- 1 -yl)-6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrroi- 1 -yl)hexanamid (1 :1) (Intermediat L84) in 2.0 mL Acetonitril vorgelegt. Dann wurden 60 μΐ (0.34 mmol) N,N- Diisopropylethylamin zugegeben und 33 μΐ (0.056 mmol) T3P (50 % in Ethylacetat) zugetropft. Die Reaktions ischung wurde über Nacht bei RT gerührt. Es wurde Wasser (2.0 mL) zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1 % TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 27.9 mg (59 % d. Th.) der Verbindung 2-(Trime lsilyl)e l-[4-{(lR)-l -[l-berlzyl-4-(2,5-difluo herlyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimemylpropyl}-32-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH^yrrol -yl)-5,10,27-trioxo 4,17,20,23-tetraoxa- 7-thia-4,l 1 ,26-triazadotriacont-l-yljcarbamat.

LC-MS (Methode 1): R _t = 1.41 min; MS (ESIpos): m/z = 1 114 i M I i ) . 25.6 mg (23.0 μιηοΐ)

pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}-32-(2,5-(iioxo-2,5-dihyd ro-lH-pyrrol-i -yl)-^

14,17,20,23-tetraoxa-7-thia-4,l 1 ,26-triazadotriacont-l-ylJcarbamat wurden in 2.5 mL Tiifluorethanol gelöst und mit 18.8 mg (138 μπιοΐ) Zinkdichlorid versetzt. Die Reaktionsmischung rührte 1 h bei 50 °C. Die Reaktionsmischung wurde mit 40.3 mg (138 μιηοΐ) Ethyiendiamin- Ν,Ν,Ν',Ν'-tetraessigsäure versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1% TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30: 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1 % TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 22.2 mg (88 % d. Th.) der Titel Verbindung.

LC-MS (Methode 1): R, = 0.94 min; MS (ESIpos): m/z = 969 (M+H) ⁺ .

Intermediat F269

4- { [(8R, 14R 13 -(3 - Ammopropyl)- 14-[ -henzy!^

dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l -yl)-l 5,15-dimethyl-2,7, 12-trioxo-l 0-thia-3,6, 13-triazahexadecan-8- yl]amino}-4-oxobutansäure -trifluoressigsäure (1 :1)

17.0 mg (0.0195 mmol) 8-(1 1-{(1Κ)-1-[1-Ββηζγ1-4-(2,5-ώί1αοφ1ιβηγ1 1Η-ργτπ)1-2-γ1]-2,2- dimetiiylpropyl}-2,2-dimethyl-6,12-dioxo-5-oxa-7,l l -diaza-2-silatridecan-13

4-oxobuianoyl)-L-cystein (Intermediat C77) wurden zusammen mit 4.99 mg (0.0253 mmol) N-(2- Aminoethyl)-2-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l -yl)acetamtd (Intermediat LI) in 1.0 mL Acetonitril vorgelegt. Dann wurden 27 μΐ (0.16 mmol) Ν,Ν-Diisopropylethylamin zugegeben und 15 μΐ (0.025 mmol) T3P (50 % in Ethylacetat) zugetropft. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT gerührt. Es wurde Wasser (2.0 mL) zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1 % TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 9.5 mg (46 % d. Th.) der Verbindung tert-Butyl-4-{[(16R)-l 1 -{(1R)-1 ~[1 - benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH-pyrrol-2^

pyrrol-l -yl)-2,2-dimethyl-6,12, l 7,22-tetraoxo-5-oxa-14-thia-7,l 1 ,18,21 -tetraaza-2-silatricosan-16- yl ^' Jamino} -4-oxobutanoat.

LC-MS (Methode 1): R _t = 1.47 min; MS (ESIpos): m/z = 1052 (Μ+ΒΓ,

8.3 mg (7.89 μπιοΐ) ί6Γΐ-Βαίγ1-4- { [(16Κ)-1 1 - {(1Κ) ^1 -06Γ^1-4-(2,5^ίΑαο 1ΐ6ηγ1)-1Η^π·ο1-2- yl]-2,2-dimethylpropyl}-23-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-l.H-pyrrol -l -yl)-2,2-dimethyl-6,l 2,17,22- tetraoxo-5-oxa- 14-thia-7, 11,18,21 -tetraaza-2-silatricosan- 16-yllamino} -4-oxobutanoat wurden in 1.0 rill, Trifiuorethanol gelöst und mit 6.45 mg (47.3 μιηοΐ) Zinkdichlorid versetzt. Die Reaktionsmischung rührte 6 h bei 50 °C. 6.45 mg (47.3 μι ^η ο!) Zinkdichlorid wurden zugegeben und die Reaktionsmischung rührte über Nacht bei 50 °C Die Reaktionsmischung wurde mit 27.7 mg (94.6 umol) FAhylendiamin-N,N,N',N ^! -tetraessigsäure versetet, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1 % TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprostl 125x30; 10μ, Fluss: 50 ml/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 1.10 mg (14 % d. Th.) der Titel Verbindung.

LC-MS (Methode 1): R _t = 0.89 min; MS (ESIpos): m/z = 852 (M+H) ⁺ .

Intermedia! F270

Tiifluoressigsäure ~N-(3-aminopropyl)-N- {( 1 Ri- 1 -[ 1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-l H-pyrrol-2- yl]-2,2-dimethylpropyl } -N'-(2 - { [(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 - yl)acetyl]amino etiiyl)succmamid (1 : 1)

Unter Argon wurden 15.0 mg (22.9 μιτιοί) 1 l -{(lR)-l -[l-Benzyl-4-(2,5-difluoiphenyl)-lIT-pyrrol- 2-yl]-2,2-dimethylpropyI } -2,2-dimethy]-6, 1 2-dioxo-5-oxa-7, 1 1 -diaza-2-silapentadecan-l 5-säure (Intermediat C78) in 1.0 ml DMF vorgelegt, mit 8.0 μΐ (45.8 μπιοΐ) Ν,Ν-Diisopropylelhylamin und 10.4 mg (27.4 μηιοΐ) HATU versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 10 min bei RT gerührt. 8.54 mg (27.4 μι ^η οΐ) Trifluoressigsäure N-(2-aminoethyl)-2-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l - yl)acetamid (l : 1) (Intermediat LI) gelöst in 4.0 μΐ (22.9 μιηοΐ) Ν,Ν-Diisopropylethylamin und 1.0 mL DMF wurden dann zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde 1 h bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosii 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1 % TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 14.7 mg (77 % d. Th.) der Verbindung 2- (ΤΓΜ6Λγΐ8Ϊ1γ1)6ώ Ι-[3-({(1Κ)-1 -[1-06ηζγ1-4-(2,5-άιί1υοφΗ6ηγ1)-1Η- νιτο1-2-γ1]-2,2- dimethylpropyl} {4-[(2-{[i2,5-dioxo-2,5-dihydro-lFi-pymii-l-yl)acetyllamino} ethyl)amino]-4- oxobutanoyl } am inojpropyl ] carbamat.

LC-MS (Methode 5): R. = 1.33 min; MS (ESIpos): m/z = 835 (M+H) ⁺ .

13.2 mg (15.8 μπιοί) 2-(Trimethylsilyl)e l-[3-({(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difΊuoφherJyl)-l H- pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} {4-[(2- {[(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH^yrrol-l- yl)acetyi]amino}ethyl)amino]-4-oxobirtanoyl}amino)propyl]car bamat wurden in 2.0 mL Trifluorethanol gelöst und mit 12.9 mg (94.8 μτηοΐ) Zinkdichlorid versetzt. Die Reaktionsmischung ri ^' ihrte 1 h bei 50 °C. Die Reaktionsmischung wurde mit 27.7 mg (94.6 μηιοΐ) Ethylendiamin- Ν,Ν,Ν',Ν'-tetraessigsäure versetzt, 30 min gerührt und dann mit Wasser (0.1 % TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-FIPLC (Säule: Reprosii 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 10.9 mg (83 % d. Th.) der Titel Verbindung.

LC-MS (Methode 1): R _t = 0.83 min; MS (ESIpos): m/z = 691 (M+H) ⁺ .

Interaiedia F271

4-{[(20R,26R)-25-(3-Aimnopropyl)-26^

dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)-27,27-dimethyl-2, 19,24-trioxo-6,9, 12,15-ietraoxa-22-thia- 3 18,25-triazaocta<x)san-20-yl]aimno}-4-oxobuiansäure -trifluoressigsäure (1:1)

Unter Argon wurden 19.4 mg (22.2 μπιοί) S-(l l-{(lR)-l-[l-Benzyi-4-(2,5-difluoiphenyl)-lH- pyiTOi-2-yl]-2,2-dimethyIpropyl}-2,2-dimethyl-6,l 2-dioxo-5-oxa-7,l 1 -diaza-2-silatridecan-l 3-yl)- N-(4-tert-butoxy-4-oxobutanoyl)-L-cystein (Intennediat C77) in 2.0 ml DMF vorgelegt und mit 21.7 mg (44.4 μηιοΐ) Trifluoressigsäure --N-(14-ainino-3,6,9,12-teiraoxatetradec-l-yl)-2-(2,5- dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrroi-l-yi)acetamid (1 :1) (Intermediat L74), 12 μί (67 μιηοΐ) Ν,Ν- Diisopropylethylamtn und 16.9 mg (44.4 mol) HATU versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 1 h bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde direkt, mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fiuss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 18.1 mg (66 % d. Th.) der Verbindung tert-Butyl-4 - { [( 16R) - 11 - {( 1 R)- 1 - [ 1 -benzyl-4-(2,5-difluoiphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} -35-(2,5-dioxo-2,5-dihydi-o- 1 H-pyrrol- 1 -yl)-2,2-dimethyl-6, 12, 17,34-tetraoxo- 5,21 ,24,27,30-pentaoxa-14-thia-7,l l,18,33-tetraaza-2-silapentatriacontan-16-yl]amino}-4- oxobutanoat.

LC-MS (Methode 4): R _t = 1.79 min; MS (ESIpos): m/z - 1250 (M+Na) ⁺ . 18.1 mg (14.7 μπιοί) tert-Butyl-4-{[(16R)-l l-{(lR)-l -[l-benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH-pyrrol- 2-yl]-2,2-dimethylpropyl } -35-(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yi)-2,2-dimeihyi-6, 12,17,34- tetraoxo-5,21 ,24,27,30-pentaoxa- 14-thia-7, 1 1,18,33 -tetraaza-2-silapentatriacontan- 16-yl]amino } -4- oxobutanoat wurden in 2.0 mL Trifluorethanoi gelöst und mit 12.0 mg (88.4 μιηοΐ) Zinkdichlorid versetzt. Die Reaktionsmischung rührte 4 h bei 50 °C. Die Reaktionsmischung wurde mit 25.8 mg (88.4 μηιοΐ) Emylendiamin-N,N,N',N'-tetraessigsäure versetzt, 30 min gerührt und dann mit Wasser (0.1% TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCNAVasser, 0.1% TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 12.3 mg (73 % d. T ^' h.) der Titel Verbindung.

LC-MS (Methode 1): = 0.87 min; MS (ESIpos): m/z = 1028 (M+Hf.

Intermediat F272

Trifluoressigsäure ~N-(3-aminopropyl)-N- {(1 R)- 1 -[ 1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2- yi]-2,2-dimethylpropy^^

15 -azahe tadec- 1 -vi] succinamid (1 :1)

Unter Argon wurden 15.0 mg (22.9 μηιοί) 1 l - {(lR)-l-[l -Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- lH-pyrrol- 2-yrj-2,2-dimethylpropyi} -2,2-dimethyl-6,12-dioxo-5-oxa-7,l l-diaza-2-silapentadecan-15-säure (Intermediat C78) in 1.0 ml DMF vorgelegt, mit 8.0 μί (45.8 μιηοί) Ν,Ν-Diisopropylethylamin und 10.4 mg (27.4 μΐΉθ!) HATU versetzt,. Die Reaktionsmischung wurde 10 min bei RT gerührt. 13.4 mg (27.4 μιτιοΐ) Triftuoressigsäure N-(l4-amino-3,6,9,l2 etraoxate1xadec-l-yi)-2-(2,5-dioxo-2,5- dihydro-1 H-pyrrol- 1 -yl)acetamid (1 :1) (Intermediat L85) gelöst in 4.0 μΐ (22.9 μιηοΐ) Ν,Ν- Diisopropylethylamin und 1.0 mL DMF wurden dann zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde 1 h bei RT gerührt. Die Reaktionsmischling wurde direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 15.8 mg (68 % d. Th.) der Verbindung 2-(Trimethylsilyi)e^^

2,2-dimethylpropyl} - 1 -(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrroi- 1 -yl)-2, 19,22-trioxo-6,9, 12,15-tetraoxa- 3, 18,23 -triazahexacosan-26-yl]carbamat.

LC-MS (Methode 1): R _t = 1.35 min; MS (ESIpos): m/z = 101 1 (M+H .

15.1 mg (14.9 μηιοΐ) 2-(Trimethylsiiyl)ethy]-[23-{ ^^

pyiTol-2-yl]-2,2-dimethyipropyl}-l -(2,5-dioxo-2,5-dihydro-l H-p>™

6,9, 12, 15-tetraoxa-3, i 8,23-triazahexacosan-26-yI]earbamat wurden in 2.0 mL Trifluorethanol gelöst und mit 12.2 mg (89.6 μΐηοί) Zinkdichlorid versetzt. Die Reaktionsmischung rührte 1 h bei 50 °C. Die Reaktionsmischung wurde mit 26.2 mg (89.6 μπιοΐ) Ethylendiamin-Ν,Ν,Ν',Ν'- tetraessigsäure versetzt, 10 min geriibrt und dann mit Wasser (0.1 % TFA) versetzt.. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 10.3 ing (70 % d. Th.) der Titel Verbindung.

LC-MS (Methode 1): R _t = 0.88 min; MS (ESIpos): m/z = 867 (M+H) ⁺ .

Interaiedia F273

Trifluoressigsäure N-(3-aminopropyi)-N-{(lR)-l -[l^^

2,2-dimethylpropyl} - 1 -(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol-1 -yl)-2, 19-dioxo-6,9, 12, 15-tetraoxa thia-3 , 18 -diazatetracosan-24-amid (1 : 1)

Unter Argon wurden 20,0 mg (28.5 μιτιοί) 1 l-{(lR)-l-[l-Benzyl-4-(2,5-difluoiphenyl)-lH-pyrrol- 2-yl]-2,2-dimethylpropyI } -2,2-dimethy1-6, 12-dioxo-5-oxa-l 4-thia-7, 11 -diaza-2-silaheptadecan-17- säure (Intermediat C69) in 1.0 ml DMF vorgelegt, mit 10.0 μΐ (57.0 μιηοΐ) Ν,Ν- Diisopropylethylamin und 13.0 mg (34.2 mol) HATU versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 10 min bei RT gerührt. 16.7 mg (34.2 μιηοΐ) Trifluoressigsäure N-(14-amino-3,6,9,12- tetraoxatetradec-l-yl)-2-(2,5-dioxo-2,5-dihydro^ (1 : 1) (Intermediat L85) gelöst in 5.0 μί (28.5 μιηοΐ) Ν,Ν-Diisopropyletliylamm und 1.0 mL DMF wurden dann zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde 1 h bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 18.6 mg (62 % d. Th.) der Verbindung 2-(Trimethylsilyl)ethyl-[25-{(lR)-l-[l-benzyl-4- (2,5-difluoφhen l)-lH-p rrol-2 ^■ ί]-2,2-di]ϊleti ιylpropyl}- 1 -(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol-1 - yi)-2,19,24-trioxo-6,9,12,15-tetraoxa-22-M

LC-MS (Methode 1): = 1.37 min; MS (ESIpos): m/z = 1057 (M+Hf .

17.1 mg (16.2 μιηοΐ) 2-(Trimethylsilyl)ethyl-[25- {(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH- pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}-l -(2,5-dioxo-2,5-dihydro-l H-pyrrol-1 -yl)-2,19,24-trioxo- 6,9,12,15-tetraoxa-22 Ma-3,i 8,25-triazaoctacosaQ-28-yl]carbamat wurden in 2.0 mL Trifluorethanol gelöst und mit 13.2 mg (97.0 μιηοΐ) Zinkdichlorid versetzt. Die Reaktionsmischimg ri ^' ihrte 1 h bei 50 °C. Die Reaktionsmischung wurde mit 28.4 mg (97.0 μιηοΐ) Ethylendiamin- Ν,Ν,Ν',Ν'-tetraessigsäure versetzt, 30 min gerührt und dann mit Wasser (0.1% TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeC /Wasser, 0.1% TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 9.80 mg (59 % d. Th.) der Titel Verbindung.

LC-MS (Methode 1): R = 0.88 min; MS (ESIpos): m/z = 913 (M+H) ⁺ .

Interinediat F274

N- [(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-l H-pyrroi- 1 ~yi)acetyl]-L-valyl-L-alanyi-S~ {2- [(3 -aminopropyl) {( 1 R)~ 1 -[1 -benzy1-4-(2,5-difluorphenyr)-lH-pyiTc -2-yl]-2,2-climethylpropyl } amino]-2-oxoethyl} -L- cystein -trifluoressi säure (1 :1)

13.9 mg (0.0167 mmol) S-(l l- {(lR)-l-[l-Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH-pyiTol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}-2,2-dimethyl-6,l .2-dioxo-5-oxa-7,l l-diaza-2-silatridecan-l 3-yl)-L-cystein trifluoressigsäure (1 : 1) (Inteimediat C71) wurden zusammen mit 7.07 mg (0.0217 mmol) N-[(2,5- Dioxo-2,5-dihydro-l H-pyrrol- 1 -yl)aeetyl] -L-valyl-L-alanin (Intermediat L86) in 2.0 mL Acetomtril vorgelegt. Dann wurden 23 μΐ (0.13 mmol) Ν,Ν-Diisopropylethylamin zugegeben und 33 μΐ (0.022 mmol) T3P (50 % in Ethylacetat) zugetropft. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/mm, MeCN/Wasser, 0.1 % TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 3.70 mg (19 % d. Th.) der Verbindung N-[(2,5-D xo-2,5-dihydro-lH-pyrroi- 1 -yl)acetyi]-L-valyl-L- alanyl~S~( 11 - { ( 1 R) - 1 - [ 1 ~benzyl~4-(2,5~difluorphenyl)~ 1 H-pyrrol-2 -yl]-2,2-dimethylpropyl } -2,2- dimethyi-6,12-dioxo-5-oxa-7,l l-dtaza-2-siiatridecan-13-yi)-L-cystein.

LC-MS (Methode 1): R _t = 1.34 min; MS (ESIpos): m/z = 1024 (M+H .

10.6 mg (10.3 μηιοΐ) N-[(2,5-Dioxo-2,5-cühydro-lH-pyrrol-l -yl)acetyl]-L-valyl-L-alanyl-S-(l 1 - {(1R)-1 -[1.-benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl) H-pyrrol-2-yl]-2,2-dime lpropyl}-2,2-dime l-6,12- dioxo-5 -oxa-7, 11 -diaza-2-silatridecan- 13-yl)-L-cystein wurden in 2.0 mL Trifluorethanoi gelöst und mit 8.46 mg (62.1 μΓηοί) Zmkdichiorid versetzt. Die Reaktionsmischung rülirte 1 h bei 50 °C. Die Reaktionsmischung wurde mit 18.1 mg (62.1 μιτιοΐ) Ethyiendiamin-N,N,N',N'-tetraessigsäure versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1 % TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 5.60 mg (54 % d. Th.) der Titel Verbindung.

LC-MS (Methode 12): R _t = 3 .69 min; MS (ESIpos): m/z = 880 (M+H ^' f .

Interaiedia F275

N-[3-({2-[(3-Aminapropyl){(lR ⁾ -H^

dimethylpropyi}ainmo]-2-oxoethyi}sulfanyi)propanoyi]-N-(2 -{[(2

l -yi)acet l]amtno ethyl)-L-alpha-gluiaoiin -trifluoressigsäure (1 :1)

39.0 mg (55.6 μτηοΐ) l l-{(lR)-l-[l -Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl } -2,2-dimethyl-6, 12-dioxo-5-oxa- 14-lhia-7, 11 -diaza-2-silaheptadecan- 17-säure (intermediat C69) wurden in 4.0 mL DMF vorgelegt, mit 41.6 mg (11 1 μπιοί) l~Benzy]~5-[2~ (trimelhylsilyl)ethyl]-L-glutamathydrochlorid (1 :1) (Intermediat L89), 29 μΐ (170 μπιοΐ) Ν,Ν- Diisopropylethylamin und 42.3 mg (I i i μιηοΐ) HATU versetzt und 1 Stunde bei RT nachgerührt. Die Reaktionsmischung wurde 1 Stunde bei RT gerührt, mit Essigsäure gequencht und direkt mittels präp. RP-HPLC (Säule: Reprosii 250x30; 30μ, Fluss: 50 mL/ in, MeCN/Wasser, 0.1% TFA) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 53.1 mg (93 % d. Th.) der Verbindung l-Benzyl-5-[2- l-{(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluo he yl)-lH- yrrol-2-y1]-2,2- dimetfaylpropyi } -2,2-dimethyi-6, 12,17-trioxo-5-oxa-l 4-thia-7, 1 l-diaza-2-silaheptadecan-17-yl)-L- glutamat.

LC-MS (Methode 1): R, = 1.71 mm; MS (ESIpos): m/z = 1021 [M+Hf Unter Argon wurden 7.60 mg (33,9 μηιοΐ) Palladium(II)acetat in 3.0 ml Dichiorome han vorgelegt und mit 14 μΐ (100 μιτιοί) Triethyiamin und 110 μΐ (680 μιηοΐ) Triethyisiian versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 5 min bei RT gerührt und mit 69.2 mg (67.7 μιηοΐ) l-Benzyl-5-[2- (trime lsilyi)eihyl]-N-( 1 1 - { ( 1 R)- 1-[1 -benzyl-4-(2 ,5 -difluorphenyl)- 3 H-pyrrol-2-yl] -2,2- dimetfaylpropyi } -2,2-dimethyi-6, 12,17-trioxo-5-oxa-l 4-thia-7, 1 l-diaza-2-silaheptadecan-17-yl)-L- glutamat gelöst in 3.0 raL, Dichlormethan versetzt. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde über einen Pappfilter filtriert und der Filterkuchen mit Dichlormethan nachgewaschen. Das Lösernittel wurde im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA) gereinigt. Die Lösemittel mixden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 38.4 mg (61 % d. Th.) der Verbindung 19S)-11- {(1R)-1 -[1- Benzyi-4-(2,5-difluoiphenyi)-lFl-pyrroi-2-yl]-2,2-dimethylpr opyl}-2,2-dime

19-{3-oxo-3-[2-(lximethylsilyl)ethoxy]propyl} -5-oxa-14-thia-7,l 1 ,18-triaza-2-silaicosan-20-säure. LC-MS (Methode 1): R _t = 1.53 min; MS (ESIpos): m/z = 931 ( \1 I I ) .

10.0 mg ( 10.7 μιηοΐ) (39S)- 3 1 -{(1R)-1-[1 -Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} -2,2-dimethyl-6, 12,17-trioxo- 19- {3 -oxo-3 - [2-(trimethylsilyl)ethoxy ^" jpropyi } -5- oxa- 14-thia-7, 11,18-triaza-2-silaicosan-20-säure wurden in 1.0 mL DMF vorgelegt, mit 6.73 mg (21.5 μιηοΐ) N-(2-Aminoetliyl)-2-(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l-yl)ac etamid 2,2,2- trifluorethan-l,l-diol (1 :1) (Intermediat LI), 5.6 μΐ (32 μπιοΓ) Ν,Ν-Diisopropylethylamin und 8.17 mg (21.5 μιηοΐ) HATU versetzt und 1 Stunde bei RT nachgerührt. Die Reaktionsmischung wurde 3 Stunde bei RT gerührt, mit Essigsäure gequencht und direkt mitteis präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA) gereinigt. Die Lösemittel mixden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 6.90 mg (58 % d. Th.) der Verbindung 2-(Trimethylsilyl)ethyl-N2-(l 1- {(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5- di fluorpheny 1) - 1 H-pyrrol-2 -yl 1 -2,2 - dimethylpropyl } -2,2-dimethyl-6,12,17-trioxo-5-oxa- 14-thia- 7,1 1 -diaza-2 -silaheptadecan- 17-yi)-N-(2- { [(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrroi- 1 - yl)acetyl]amino}ethyl)-L-alpha-glutaminat.

LC-MS (Methode 1): R _t = 1.57 min; MS (ESIpos): m z = 1 110 [M+Hf

6.90 mg (6.21 μηιοί) 2-(Trimethylsilyl)ethyl-N ² -(l l -{(l R)-l -[l -benzyl-4-(2,5-difluo henyl)-lH- pyrroi-2 -yl] -2,2-dimethylpropyl } -2,2-dimethyl-6, 12,17-trioxo-5-oxa- 14-thia-7, 1 1 -diaza-2- silaheptadecan- 17-yl)-N-(2- { [(2,5-dioxo-2,5-dihydro-l H-pyrrol-1 -yl)aceryl]amino} ethyl)-L-alpha- giutaminat wurden in 2.0 mL Trifluorethanol gelöst und mit 5.1 mg (37.2 μιηοΐ) Zinkdichlorid versetzt. Die Reaktionsmischung rührte 3 h bei 50 °C. 5.1 mg (37.2 μιηοΐ) Zinkdichlorid wurden zugegeben und die Reaktionsmischung rührte 3 h bei 50 °C. 5.1 mg (37.2 μιηοΐ) Zinkdichlorid wurden zugegeben und die Reaktionsmischung rülirte 3 h bei 50 °C. 10.1 mg (74.4 μιηοΐ) Zinkdichlorid wurden zugegeben und die Reaktionsmischung rührte über Nacht bei 50 °C und 72 h bei RT. Die Reaktionsmischung wurde mit 54.5 mg (186 μιηοΐ) Ethylendiamin-Ν,Ν,Ν',Ν'- tetraessigsäure versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1% TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 2.4 mg (39 % d. Th.) der Titel Verbindung.

LC-MS (Methode 1): R _t = 0.86 mm; MS (ESIpos): m/z = 866 i M I I ) .

Intermediat F276

S-{2-[(3-Amino ro yl){(lR)-l-[l -be zyl-4-(2,5-ώIluo henyl)-lH- yrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}amino]-2-oxoethyl}-N- {3-[2-(2-{[(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH^yrrol-l- yl)acetyi]amino ethoxy)ethoxy]propanoyl}-L-cystein -trifluoresstgsäure (1 : 1)

Unter Argon wurden 9.08 mg (28.9 μηιοΐ) 3-[2-(2-{[(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-l H-pyrrol-l - yl)acetyl]amino}elhoxy)ethoxy]propansäure (Intennediat L87) in 1.0 ml DMF vorgelegt, mit 8.33 μΐ (48.2 μηιοί) Ν,Ν-Diisopropylethylamin und 1 1.0 mg (28.9 μηιοΐ) HATU versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 10 min bei RT gerührt. 20.0 mg (27.7 μιτιοί) S-(11-{(1R)-1-[1-Benzyl- 4 ^■ (2,5-difluoφhen l)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl} -2,2-dimethyl-6, 12-dioxo-5-oxa-7, i 1- diaza-2-siiatridecan-l 3-yi)-L-cy stein -trifluoressigsäure (1 :1) (Intermedia! C71 ) gelöst in 4,67 μΐ (24.1 μηιοΐ) Ν,Ν-Diisopropylethylamin und 1.0 mL DMF wurden dann zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde 1 h bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 4.70 mg (19 % d. Th.) der Verbindung S-(l l ⁱ (lR)-l-[l-Benzyi-4-(2,5-difluoiphenyi)-l H- pyrroi-2-yl] -2,2-dimethylpropyl } -2,2-dimethyl-6, 12 -dioxo-5-oxa-7,l 1 -diaza-2 -s ilatridecan- 13 -yl)- N- {3-[2-(2- { [(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yl)acetyi]amino} ethoxy)ethoxy]propanoyl } -L- cystein.

LC-MS (Methode 12): R _t = 2.47 min; MS (ESlpos): m/z = 1013 (M+H .

13.9 mg ( 13.7 μηιοΐ) 8-(11-{(Μ)-1 -[1-ΒβηζγΜ-(2,5-άϊί1υο Ηωι^)-1Η ^1-2-γ1]-2,2- dimetfaylpropyi} -2,2-dimethyl-6, 12 -dioxo-5-oxa-7, 11 -diaza-2 -silatridecan- 13 -yl)-N- {3 - [2-(2- {[(2,5-dioxo-2,5-dihycko-lH-pyrrol-l-yl)acetyl]amino} ethoxy)ethoxy]propano

wurden in 2.0 mL Trifluorethanol gelöst und mit 5.6 mg (41.2 μιηοΐ) Zinkdichiorid versetzt. Die Reaktionsmischung rülirte 1 h bei 50 °C. 5.6 mg (41.2 μπιοΐ) Zinkdichiorid wurden zugegeben und die Reaktionsmischung rührte 30 Minuten bei 50 °C. Die Reaktionsmischung wurde mit 24.1 mg (82.4 μιηοΐ) Ethylendiamm-N,N,N', '-tetraessigsäui"e versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1% TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.3 % TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 10.8 mg (80 % d. Th.) der Titel Verbindung.

LC-MS (Methode 12): K- = 1.58 min; MS (ESlpos): m/z = 869 ( ! I i i .

Intermediat F277

N ^~ [3 ^~ ( {2 ^~ [(3 ^~ Aminopropyl){(lR) ^~ H

dimethylpropy 1} amino] -2-oxoethyl } sulfany l)propanoyl] -3 - [( bromacetyl)amino] -D-alanin trifluoressigsäure 1 : 1 )

8.90 mg (8.88 μτηοί) Trifluoressigsäure 2-(trimethylsilyl)ethyl-3-amino-N-(l l -{(rR)-l -[l -benzyl- 4-(2,5~diiluoiphenyi)~l H-pyrrol-2-yl]-2,2~dimethylpropyl } -2,2-dimethyl-6,12,17-trioxo-5-oxa-14- thia-7, 1 l -diaza-2-silaheptadecan-17-yl)-D-alaninat ( 1 : 1) (Intermediat C80) und 2.31 mg (9.77 μηιοΐ) l -(2-Bromacetoxy)pyrrolidin-2,5-dion wurden in 1 mi Dimethylformamid gelöst und mit 2.9 μί (27 μηιοΐ) N-Methylmorpholin versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 1 h bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittles präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser/ö. l %TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 5.80 mg (65% d. Th.) der Verbinfung 2- (Trimethylsilyl)ethyl-N-(l 1-{(1 R)-l -[l -benzyl-4-(2,5-difluoiphenyl)-lH-pyrrol-2-ylj-2,2- dimethylpropyl}-2,2-dimethyl-6, 12, 17-trioxo-5-oxa-l 4-thia-7, 11 -diaza-2-silaheptadecan-l 7-yl)-3- [(bromacetyl)amino]-D-alaninat.

LC-MS (Methode 1): R _t = 1.57 min; MS (ESIpos): m/z = 1008 ( ! I i i .

5.80 mg (5.75 μηιοΐ) 2-(Trimethylsilyl)ethyl-N-(l l -{(l R)-l -[l-benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH- pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl -2,2-dimethyl-6, 12, 17-trioxo-5-oxa- 14-thia-7, 1 1 -diaza-2- süaheptadec^- l7-yl)-3-[(bromace1yi)arriii!o]-D-alai3inat wurden in 2,0 mL Trifluorethanol gelöst und mit 4.70 mg (34.5 μηιοί) Zinkdichlorid versetzt. Die Reaktionsmischung rührte 3 h bei 50 °C. 4.70 mg (34.5 μπιοΓ) Zinkdichlorid wurden zugegeben und die Reaktionsmischung rührte 5 h bei 50 °C. Die Reaktionsmischung wurde mit 20.2 mg (69.0 μαιοΐ) Ethyiendiamm-Ν,Ν, ',Ν'- tetraessigsäure versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1 % TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 rnL/min, MeCN/ Wasser, 0.1 % TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 1.70 mg (34 % d. Th.) der Titel Verbindung.

LC-MS (Methode 1): R _t = 0.90 min; MS (ESIpos): m/z = 764 (M+H) ⁺ .

Intermedia! F278

N-[3-( {2-[(3-Aminopropyl) {(lR)-l -[l -benzyl-4^

dimethylpropyl}amino]-2-oxoethyl}sulfany

yl)acetyl]amino -D-alanin -trifluoressigsäure (1 : 1)

10.0 mg (9.98 μιηοΐ) Trifluoressigsäure 2-(trimethylsilyl)ethyi-3-amino-N-( l l -{(l R)-l -[l -benzyl- 4-(2,5-difluorphenyl)-l H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl } -2,2-dimethyl-6, 12, 17-trioxo-5-oxa-14- thia-7,1 l -diaza-2-silaheptadecan-17-yl)-D-alaninat (1 : 1) (Intermediat C80) und 2.77 mg (1 1.0 μιηοΐ) l- {2-[(2,5-Dioxopyrrolidin-l -yl)oxy]-2-oxoethyl}-lH-pyrrol-2,5-dion wurden in 1 ml Dime&ylformamid gelöst und mit 3.3 μΐ (30 μηιοΐ) N-Methylmorpholin versetzt. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht hei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit 2.0 μί (35 μιηοΐ) Essigsaeure versetzt und direkt mittles präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fiuss: 50 mL/min, MeCN/ Wasser/0.1 %TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 5.50 mg (54% d. Th.) der Verbinfung 2-(Trimetbylsilyl)ethyl-N-(l \ -{(\ R)A -[ l )enzy\A-(2,5-<3iüuoTpheayl)AH-pyrrol-2- yl]-2,2-dimethylpropyl } -2,2-dimethyl-6, 1 2,17-trioxo-5 -oxa-14-thia-7, 1 1 -diaza-2-silaheptadeean- 17-yl)-3 - { [(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol- 1 -yDacety 1 jamino } -D-alaninat .

LC-MS (Methode 1): R _t = 1 .51 min; MS (ESIpos): m z = 1024 (M+H) ⁺ .

5.50 mg (5.36 μηιοΐ) 2-(Trimetbylsilyl)ethyl-N-(l l - {( l R)-l -[l-benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH- pyrroi-2 -yl] -2,2-dimethylpropyl } -2,2~dimethyl~6, 12,17- trioxo-5-oxa- 14-thia-7, 1 1 -diaza-2- silaheptadecan-r7-yl)-3- {[(2,5-dioxo-2,5-dihy

wurden in 1.0 m ^' L Trifluorethanol gelöst und mit 4.39 mg (32.2 μηιοΐ) Zinkdichlorid versetzt.. Die Reaktionsmischung rührte 1 h bei 50 °C. 4.39 mg (32.2 μιηοί) Zinkdichlorid wurden zugegeben und die Reaktionsmischung rührte 1 h bei 50 °C. . 4.39 mg (32.2 μηιοΓ) Zinkdichlorid wurden zugegeben und die Reaktionsmischung rührte 4 h bei 50 °C. Die Reaktionsmischung wurde mit 28.2 mg (96.5 μ ^η ιοί) Eihylendiamin-N,N,N',N ^, -tetraessigsäure versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1 % TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1 % TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 2.70 mg (56 % d. Th.) der Titel Verbindung.

LC-MS (Methode 1): R _t = 0.89 min; MS (ESIpos): m/z = 781 (M+H) ⁺ .

Intermediat F279

difluorphenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpropyl}[({(2R) -2-carboxy-2-[(3- carbox ropanoyl)amino]emyl}sulfanyl)acety^^

12.2 mg (14 μηιοΐ) S-(l 1 -{(1R)-1-[1 -Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}-2,2~dimethyl~6 ,12-dioxo-5-oxa-7 ,1 1 -diaza-2-silatridecan-13-yl)-N-(4-tert-butoxy- 4-oxobutanoyl)-L-cystein (Intermediat C77) wurden in 2.0 rnL Trifluorethanoi gelöst und mit 1 1.4 mg (83.8 μ-ϊϊοΐ) Ziiikdi chlorid versetzt. Die Reaktion smischung rührte 3 h bei 50 °C. Die Reaktionsmischung wurde mit 24.5 mg (83.8 μιηοΐ) Ethylendiamin-N,N,N',N'-tetraessigsäu!"e versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1 % TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosü 125x30; 10μ, Fiuss: 50 mL/rnin, MeCN/Wasser, 0.1% TFA). Die Lösernittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 4.60 mg (42 % d. Tb.) der Verbindung 4-{[(lR)-2-({2-[(3- Aminopropyl) {( 1 R)-l -[ 1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dime&ylpropyi}amino]-2-oxoethyi}sulfanyl)-l-carboxyethyi ]ammo} -oxobuta^

trifluoressigsäure (1 :1).

LC-MS (Methode 1): R, = 0.88 min; MS (ESIpos): m/z = 673 (M+H) ⁺ .

10.0 mg (12.7 μιηοΐ) 4-{[(lR)-2-({2-[(3-Ammopropyl){(lR)-l-[l-benzyM-(2,5-difluor phenyl)- lH^yrrol-2-yl]-2,2^iimemylpropyl}amino]-2-oxoemyl}sulfanyl)- l-c^oxyemyl]

oxobutan säure -trifluoressigsäure (1 :1 ) und 7.41 mg (12.7 μχηοΐ) 2,5-Dioxopyrrolidin-l -yl-N-f6- (2,5-dioxo-2,5-dihydro-!H-pyrrol-l-yl)hexanoyl]-L-valyl-L-al aiiiaai (Iniermediat L88) wurden in 1 .5 ml Dimethylfonnamid gelöst und mit 4.4 μΐ (25 μιηοΐ) Ν,Ν-Diisopropylethyiamin versetzt. Die Reaktionsmischung wurde 2 h bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit 2.0 μΐ (35 μιηοΐ) Essigsaeure versetzt und direkt mittles präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 250x30; Ι Ομ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser/0.1%TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 5.20 mg (39% d. Th.) der Titel Verbinfung.

LC-MS (Methode 1): R _t = 1.11 min; MS (ESIpos): m z = 1036 i \i I i ) .

Trifluoressigsäure -N-[2-( ^' {(2S)-2-amino-4-[ {( 1 R)- 1 -[ 1 -benzyl-4-(2,5-difIuorphenyl)- 1 H-pyrrol-2- yl]-2,2-dimethylpropyl (glycoloyl)amino]butanoyl} amino)ethyl]-3-(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H- pyrrol-l-yl)benzamid (1 :1)

Die Titelverbindung wurde ausgehend von Intermediat C64 durch Kupplung mit kommerziell erhältlichem l-(3-{[(2,5-Dioxopy!roHdin-l-yi)oxy]c^onyl}phenyl)-lH-pyrrol -2,5-dion und anschließender Entschützung mit Zirikchlorid hergestellt.

LC-MS (Methode 1): R _t = 0.88 min; MS (ESIpos): m/z = 755 (M+H) ⁺ . Intermediat F281

N- { (2S)-2-Amino-4 - [ {(1 R)- 1 - [ 1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dime thylpropyl } (giy coloy l)amino] butanoyl } -3 - { [N-(bromacetyl)-beta-alanyl]amino} -D-alanin trifluoressigsäure

Zunächst wui'den die modifizierten Aminosäurebausteine N-(Bromacetyl)-beta-alanin sowie 2- (Trimethyisilyl)ethyi-3-amino-N-(tert-butoxycarbonyl)-D-a]an inat nach klassischen Methoden der Peptidchemie hergestellt. Anschließend wurden diese in Gegenwart von HATU und Morpholin miteinander gekuppelt. Dann wurde mittels 10%-iger Trifluoressigsäure in Dichlormethan die tert. Butoxycarbonyl-Schutzgruppe abgelöst und so das intermediat 2-(TrimethylsilyI) ethyi-3-{[N- (bromacetyl)-beta-alanyl]amino} -D-alaninat erhalten.

Schließiich wurde die Titelverbindung durch Kupplung dieses Intermediats mit Intermediat C58 in Gegenwart von HATU und 4-Methylmorpholin und anschließender Entschützung mit Zinkchlorid hergesteilt.

LC-MS (Methode 1): R _t = 0.87 min; MS (ESIpos): m/z = 791 und 793 (M+H) ⁺ .

Trifluoressigsäure - 2S)-2-ammo~4-[{(lR) ~[l-benzy^^

dimethylp (1 :1)

Zunächst wurde nach klassischen Methoden der Peptidchemie ausgehend von tert-Butyiglycinat und Bromessigsäiireanhydrid das Intermediat Trifluoressigsäure --N-(3-arnmopropyi)-N2- (bromacetyl)glycinamid (1 :1) hergestellt.

Schließlich wurde die Titelverbindung durch Kupplung dieses lntermediats mit Intermediat C58 in Gegenwart von HATU und 4-Methylmorpholin und anschließender Entschützung mit Zinkchlorid hergesteilt.

LC-MS (Methode 1): = 0.83 min; MS (ESIpos): m/z = 747 und 749 (M+H) ⁺ .

Intermediat F283

N-[(2R)-2-( {(2S)-2-Amino-4-[{(lR)-l -[l -te^

dimethylpropyl} (giycoloyl)amino

asparagin trifluoressigsäure (1 : 1 )

Zunächst wurde ausgehend von (2S)-2-Amino-4K)xo-4-[2-(1ximethylsilyl)ethoxy]buiansäure und Bromessigsäureanhydrid der modifizierten Aminosäurebaustein (2S)-2-[(Bromacetyl)amtno]-4- oxo~4-[2~(trimethyisiiyl)ethoxy]butansäure sowie ausgehend von kommerziell erhältlichem 3- {[(Ben2yloxy)carbonyl]amino}-N-(tert-butoxycarbonyl)-D-alamn ~ N-cyclohexylcyclohexanamin (1:1) der Aminosäurebaustein 2-(Trimethylsiiyl)ethyl-3-amino-N~(tei1~butoxycarbonyl)-D"al aninat hergestellt. Beide Bausteine wurden in Gegenwart von HATU und Morpholin miteinander gekuppelt und anschließend wurde mittels 5%-iger Trifluoressigsäure in Dichlormethan die tert. Butoxycarbonyl-Schutzgruppe unter Erhalt der Silylethylester-Schutzgruppen abgelöst und so das Intermediat Trifluoressigsäure ~2-(trimethylsilyl)ethyl-N- {(2R)-2-amino-3-oxo-3 -[2-

(trimethylsilyl)ethoxy] propyl } -N2-(bromacetyl)-L-aipha-asparaginat (1:1) erhalten.

Schließlich wurde die Titelverbindung durch Kupplung dieses Interraediats mit Intermediat C58 in Gegenwart von HATU und 4-Methylmorpholin und anschließender Entschützung mit Zinkchlorid hergestellt.

LC-MS (Methode 1): R, = 0.84 min; MS (ESIpos): m/z = 835 und 837 (M+H) Intermedia! F284

N- { (2S)-2-Amino-4 - [ {(1 R)- 1 - [ 1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dime thy Ipropyl } (gly coloy l)amino] butanoyl } -3 -{[ 1 -(2,5 -dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l -yl)-2,18- dioxo-6,9,12,15 (1 : 1)

Zunächst wurde Intermediat L80 mit kommerziell erhältlicher (2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol- l -yl)essigsäure in Gegenwart von HATU und Ν,Ν-Diisopropylemylamin gekuppelt und anschließend wurde mittels 16%-iger Trifluoressigsäure in Dichlormethan die tert. Butoxycarbonyl-Schutzgruppe unter Erhalt der Silylethylester-Schutzgruppe abgelöst.

Schließlich wurde die Titelverbindung durch Kupplung dieses intermediats mit Intermediat C58 in Gegenwart von HATU und N, N-Diisopropylethylamin und anschließender Entschuldung mit Zinkchlorid hergestellt.

LC-MS (Methode 12): Rt = 1.46 min; MS (ESIpos): m/z = 984.45 (M+HJ

Intermediat F285

N- { (2S)-2-Amino-4 - [ {(1 R)- 1 - [ 1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dime thylpropyl } (gly coloy l)amino] butanoyl } -3 - [( 18-brom- 17-oxo-4,7,l 0,13-tetraoxa-l 6- azaoctadecan-1 -oyl)amitio]-D-alaiiiii -trifluoressigsäure (1 : 1 )

Zunächst wurde Intermediat L80 mit kommerziell erhältlichem Bromessigsäureanhydrid gekuppelt und anschließend wurde mittels 20%-iger Trifluoressigsäure in Dichlormethan die tert. Butoxycarbonyl-Schutzgruppe unter Erhalt der Silylethylester-Schutzgmppe abgelöst.

Schließlich wurde die Titelverbindung durch Kupplung dieses Intermediats mit Intermediat C58 in Gegenwart von HATU und N, N-Diisopropylethylamin und anschließender Entschützung mit Zinkchlorid hergestellt.

LC-MS (Methode 1): R _t = 0.85 min; MS (ESIpos): m/z = 967 und 969 (M+H) ⁺ .

Intermedia! F286 i-[(N~{{2S)-2~Ammo~4 {(^

dime thy Ipropyl } (giy coloy

ace1yl]am (1

Zunächst wurde Interrnediat L91 mit (2,5-Dioxo-2,5-dihydro-l H-pyiToi-l-yl)essigsäure in Gegenwart von HATU und N, N Diisopropyiethylamin gekuppelt und anschließend wurde mit 12.5%-iger TFA in DCM die Boe-Schutzgruppe abgelöst. Das so erhaltene Interrnediat wurde mit Interrnediat C58 in Gegenwart von HATU und N, N Diisopropyiethylamin gekuppelt und anschließend durch Entschützung mit Zinkchlorid in die Titeiverbindung überführt.

LC-MS (Methode 1): , = 0.84 min; MS (ESIpos): m z = 984 (M+H) ⁺ .

Intermedia! F287 i-[(N~{{2S)-2~ATmno~4-[{(^

dime thylpropyl } (giy coloy l)amino] butanoyl } -3 - [(brornace tyl)ainmo]-D-alanyl)amino]-3,6,9,12- tetraoxapen

Zunächst wurde Intennediat L91 mit Bromessigsäureanhydrid in DCM acyiiert und anschließend wurde mit 10%-iger TFA in DCM die Boc-Schutzgaippe abgelöst. Das so erhaltene Intennediat wurde mit intennediat C58 in Gegenwart von HATIJ und Morpholin gekuppelt und anschließend durch Entschützung mit Zinkchlorid in die Titel Verbindung überfuhrt.

LC-MS (Methode 1): R _t = 0.87 min; MS (ESIpos): m/z = 967 und 969 (M+H) ⁺ .

Intermedia! F288

N- { (2S)-2-Amino-4 - [ {(1 R)- 1 - [ 1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} (glycoloyl)amino]butanoyl} -3-( {N-[(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l - yl)acetyi]-L-s

35 mg ( 39 μπιοΓ) von Intermediat C74 wurden in Gegenwart von HATU und N, N- Diisopropyethylamin mit N-[(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l -yl)acetyl]-L-serin gekuppelt, das zuvor ausgehend von tert-Butyl-O-tert-butyl-L-serinat und (2,5-Dioxo-2,5-dihydro-l H-pyrrol-l - yl)essigsäure hergestellt wurde. Nac Entschützung mit Zinkehlorid und HPLC Reinigung wurden 14 mg (38% d. Th.) der Titelverbindung erhalten.

LC-MS (Methode 32): R _t - 1.43 min; MS (ESlpos): m/z - 824.34 (M+H) ⁺ .

Intermedia! F289

N ² - {(2S)-2-Amino-4-[ {( 1R)-1 -[ 1 -benzyl-4-{2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}(glycoloyi)amino]bu^

lysiti -trifluoressigsäure (1 :1 )

Zunächst wurde Trifluoressigsäure --2-(1ximethylsilyl)ethyl-N ⁶ -[(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol- 1 -yi)acetyI]-D-lysinat (1 :1) nach klassischen Methoden der Peptidchemie ausgehend von N ⁶ ~ [(Benzyloxy)carbonyl]-N ² -(tert-butoxycarbonyl)-D-lysin hergesteilt.

12.5 mg (25 μτηοΐ) von diesem Intermediat wurden in Gegenwart von HATU und 4- Methylmorpholin mit 15 mg (23 μπιοΐ) von Intermediat C58 gekuppelt. Nach Entschützung mit Zinkchiorid und HPLC Reinigung wurden 14 mg (53% d. Th.) der Titelverbindung erhalten.

LC-MS (Methode 1): , === 0.83 min; MS (ESIpos): irv'z === 779 (M+H) ⁺ .

N ² - {(2S)-2-Amino-4-[ {( 1R)-1 -[ 1 -benzyl-4-{2,5-diiluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- (1 : 1)

Zunächst wurde Trifluoressigsäure -2-(trime1hylsilyl)eihyl-N6-(bromacetyl)-D-lysii!at (1 : 1 ) nach klassischen Methoden der Peptidchemie ausgehend von N ⁶ -[(ßenzyloxy)carbonyi]-N ² -(tert- butoxycarbonyl)-D-lysin hergestellt.

12 mg (25 μιηοΐ) von diesem Intermediat wurden in Gegenwart von HATU und 4- Metbylmorpholin mit 15 mg (23 μηαοΐ) von Intermediat C58 gekuppelt. Nach Entschützung mit Zinkchlorid und HPLC Reinigung wurden 7 mg (36% d. Th.) der Titelverbindung erhalten.

LC-MS (Methode 1): R _t = 0.86 min; MS (ESIpos): m/z = 762 und 764 (M+H)

N (2,5-Dioxo-2,5-dihydiO-m-p irol-l-yi)acetyl]-L-valyl-N-{3-[{(lR)-l- άϊί1υοφ

Die Titelverbindung wurde ausgehend von Beispiel M9 zunächst durch Kupplung mit N- [(Benzyloxy)carbonyl]-L-valyl-L-alanin in Gegenwart von HATU und Ν,Ν-Diisopropylethylamin hergestellt. Im nächsten Schritt wurde die Z-Schutzgruppe durch 1 -stündige Hydrierung über 10%- igem Palladium auf Aktivkohle bei RT unter Wasserstoff-Normaldruck entfernt und das entschützte Intermediat anschließend durch Kupplung mit (2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrrol-l - yl)essigsäure in Gegenwart von HATU und N, N Dii opropylethyiamin in die Titelverbindung überführt.

LC-MS (Methode 1): = 1.21 min; MS (ESIpos): m/z = 777 (Μ+ΗΪ

Intermedia! F292

(2S)-2-Amino-4-( {( 1 R)-l -[ 1 -0βηζγ1-4-( ,5-<ϋΑαο Ιΐ6ηγ1)- 1 H-pyrrol-2-ylj-2,2-dimethylpropyl} {5- [(2-{[(2,5-dioxo-2,5-dihydro-lH-p>Trol-l-yl)acetyl]mnino} ethyl)amino]-5-oxopentanoyl} amino)butansäure -trifluoressigsäure (1 : 1 )

Intermedia! F293

N- { (2S)-2-Amino-4 - [ {(1 R)- 1 - [ 1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}(giycoloyl)amino]bi!tanoyi}-3-{[3-(2,5-dioxo- 2,5-dihy

yl)benzoyl]amino} -D-alanin -trifluoressigsäure (1 :1 )

35 mg (39 μιηοΐ) von Tntermediat C74 wanden in 4 ml DMF gelöst und in Gegenwart von N, N- Diisopropylethylamin mit 13.5 mg (43 μιηοΐ) kommerziell erhältlichem l-(3-{[(2,5- Dioxopyrrolidin-1 -yl)oxy] carbon.yl}phenyl)-lH-pyrfol-2,5-dion gekuppelt. Nach Entschützung mit Zinkchlorid und HPLC Reinigung wurden 12 mg (34% d. Tb.) der Titelverbindung erhalten.

LC-MS (Methode 12): R _t = 0.93 min; MS (ESIpos): m/z = 799 (M+H ^' f .

Intermedia! F294

N- {5 (2,5-Dioxopyrrolidin -yl)oxy]

(2 -difluorphenyl)- Π

alan

41 mg (0.05 mmol) von intermedia! C76 gelöst in 12 mL Methanol wurden über 10 mg 10%-igem Pailadium auf Aktivkohle 1 h lang bei RT unter Wasserstoff-Normaldruck hydriert. Der Katalysator wurde danach abfiltriert und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Man erhielt 32 mg (92% d.Th.) des entschützten Intermediats.

1 5 mg (0.022 mmol) von diesem Tntermediat wurden in DMF gelöst und mit 13 mg (0.039 mmol) l, -[(l ,5-Dioxopentan-l ,5-diyl)bis(oxy)]dipyrrolidiri-2,5-diori und 7 μΐ _^ N, N-Diisopropylethyl amin versetzt. Nach 1 h Rühren bei RT wurde der Ansatz eingeengt und der Rückstand mittels HPLC gereinigt. So wurden 9 mg (45% d. Th.) der Titelverbindung erhalten.

LC-MS (Methode 1): R, = 1.08 min; MS (ESIpos): m/z = 895 (M+H) ⁺ .

Intermediat F295

N (2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-py^

difluoiphenyi)-lH-pymil-2-ylj-2,2-dm^

alaninamid

41 mg (0.05 mmol) von Intermediat C76 gelöst in 12 mL Methanol wurden über 10 mg 10%-igem Pailadium auf Aktivkohle 1 h lang bei RT unter Wasserstoff-NoiTnaidruck hydriert. Der Katalysator wurde danach abfiltriert und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Man erhielt 32 mg (92% d.Th.) des entschützten Tntennediats.

15 mg (0.022 mmol) von diesem Intermediat wurden in 4 mL DMF gelöst und mit 10 mg (0.039 mmol) l-{2-[(2,5-Dioxopyrrolidir]-l -yl)oxy]-2-oxoethyl}-lH-pyrrol-2,5-dion und 7 μί, Ί\, N- Diisopropylethyl amin versetzt. Nach 2 h Rühren bei RT wurde der Ansatz eingeengt und der Rückstand mittels HPLC gereinigt. So wurden 10 mg (56% d. Th.) der Titelverbindung erhalten.

LC-MS (Methode 1): R _t = 1.08 min; MS (ESIpos): m/z = 821 (M+H) ⁺ .

Intermedia! F296

Trifiuoressigsäure ~(2S)-2-amino-4- [ {(1 R)- 1 - [ 1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrroi dimethylpropyl} (giy coloyl)amino]-N- {2-[(2- { [(2,5-dioxo-2,5-dihydro- 1 H-pyrrol-1 - yl)aeetyi]amino} ethyl)sulfonyl]ethyl }butanamid (1 :1)

Die Titelverbindung wurde ausgehend von Intermediat L81 durch Kupplung mit Intermediat C58 in Gegenwart von HATU und Ν,Ν-Diisopropylemylamin hergestellt, im nächsten Schritt wurde die Z-Schutzgruppe durch 30-minütige Hydrierung über 10%-igem Palladium auf Aktivkohle in DCM/Methanol 1 :1 bei RT unter Wasserstoff-Normaldruck entfernt. Das entschützte intermediat wurde anschließend durch Kupplung mit (2,5-Dioxo-2,5-dihydro-lH-pynOl-l-yi)essigsäure in Gegenwart von HATU und N, N Dtxsopropyleihylamin und schließlich durch Entschützung mit Zinkchlorid in die Titelverbindung überführt.

LC-MS (Methode 1): R, = 0.83 min: MS (ESIpos): m/z = 785 (M+H) ^'

Intermediat F297

S-{2-[{(lR) -[l-Benzyl-4-(2,5 iifl^^

ylme1hyl)aaiino]-2-oxoethyl}-N-[6-(2,5-dioxo-2,5-dihydro H-p rrol-l-yi)hexan

trifluoressigsäure (1 :1) (Isomer 1)

Eine Lösung von 36 mg (0.03 mmol, 68% Reinheit) S-[2-({(lR)-l -[l-Benzyl-4-(2,5- difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2 -yl] -2,2-dtmethylpropyl} { [ 1 -(tert-butoxycarbonyl)pyrfolidin-3- yl]memyl}amino)-2-oxoethyl]-N-[6-(2,5-dioxo-2,5 ühya^

(Intermediat C95) in 0.74 ml 2,2,2-Trifluoroetbanol unter Argon wurde mit 15 mg (0.11 mmol) Zinkchlorid versetzt und das Reaktionsgemisch wurde 7 h bei 50 °C gerührt. Anschließend wurden 32 mg (0.11 mmol) EDTA hinzugegeben und die Mischung wurde 15 Minuten gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat versetzt, und die organische Phase wurde mehrmals mit Wasser und mit ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittels präparative HPLC gereinigt. Man erhielt 6,4 mg (25 % d. Th) der Titelverbindung.

LC-MS (Methode 1): R _t = 0.95 min; MS (ESIpos): m/z = 792 · Vi · ! i -Ci-CO i ! ί . Intermedia! F298

S-{2-[{(lR) -[l-Benzyl-4-(2,5 iifl^^

ylmethyljammo] -2,-ΌΧΟ

trifluoressigsäure (1 :1) (Isomer 2)

Eine Lösung von 45 mg (0.04 mmol, 71% Reinheit) S-[2-({(lR)-l-[l-Benzyl-4-(2,5- difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2 -yl] -2,2-dtmethylpropyl} { [ 1 -(tert-butoxycarbonyl)pyrrolidin-3- yi]methyl}amino)-2-oxoethyl]-N-[6-(2,5-dioxo-2,5 lihy iiO-l H^yi o!^

(Intermedia! C96) in 0.94 ml 2,2,2-Trifluoroetbanol unter Argon wurde mit 19 mg (0.14 mmol) Zinkchlorid versetzt und das Reaktionsgemisch wurde 3 h bei 50 °C gerührt. Anschließend wurden 42 mg (0.14 mmol) EDTA hinzugegeben und die Mischung wurde 15 Minuten gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat versetzt, und die organische Phase wurde mehrmals mit Wasser und mit ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittels präparative HPLC gereinigt. Man erhielt 5,7 mg (18 % d. Th) der Titelverbindung.

LC-MS (Methode 1): R _t = 0.96 min; MS (ESIpos): m / 791 · Vi · ! i -Ci-CO i ! ί . S-(2- {(3-Aimnopropyl)[(R)-[l -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH-pyrrol-2- yl](eyclohexyl)methyl]amino} -2-oxoetl

yl)hexanoyl]-L-cy siein -trifluoressigsäure (1 : 1 )

Eine Lösung von 88.0 mg (0.09 mmol) S-{ l l -[(R)-[l-Benzyl-4-(2,5-clifluo henyl)-lH- yΓΓol-2- yl](cyclohexyl)methyl]-2,2-dimethyl-6, 12-dioxo-5-oxa-7, 11 -diaza-2-silatridecan- 13-yl}-N-[6-(2,5- dioxo-2,5-dihydro-lH-pyrroi- 1 -yl)hexanoyl]-L-cystein (Intermediat C85) in 1 .88 ml 2,2,2- Trifluoroethanol wurde mit 76.8 mg (0.57 mmol) Zinkchlorid versetzt und das Reaktionsgeinisch wurde 3 h bei 50 °C gerührt. Anschließend wurden 164.6 mg (0.57 mmol) EDTA hinzugegeben und die Mischung wurde 15 Minuten gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat versetzt und die org. Phase wurde mehrmals mit Wasser und mit ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittels präparative HPLC gereinigt. Man erhielt 31 mg (35 % d. Th ) der Titelverbindung.

LC-MS (Methode 12): R _t = 1 .82 min; MS (ESIpos): m/z - 792 (M+B) Intermedia! F300

(2S)-2-Amino-4-[{(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-l H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]-N-(2-{[(2R)-2-(2,5-dioxo-2, 5-dihydro-lH-pyrrol-l- y!)propasioyl]amino}ethy!)buiai!aii]i!d

Eine Lösung von 7 mg (0.08 mmol)) 2-(Trimethylsiiyi)ethyl-{(2S)-4-[{{l R)-l -[l-benzyl-4-(2,5-

2,5~dihydro-l H-pynOl-l-y])propanoyl]amino}eihyi)amin

(Intermediat 100) in 0.2 ml 2,2,2-Trifluoroethanol unter Argon wurde mit 11 mg (0.08 mmol) Zinkchlorid versetzt und das Reaktionsgemisch wurde 8 h bei 50 °C gerührt. Ansehließend wurden 14 mg (0.05 mmol) EDTA hinzugegeben und die Mischung wurde 15 Minuten gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat versetzt und die organische Phase wurde mehrmals mit Wasser und mit ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittels präparative HPLC gereinigt. Man erhielt 1,6 mg (27 % d. Th) der Titelverbindung.

LC-MS (Methode 1): R. _t = 0.88 min; MS (ESIpos): m/z = 707 ( ! s ·( ! =( ⁾ Π i . Intermedia! F301

3 -[(2- { (3 -aminopropy 1)[(R)- [ 1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2

yi](cyclohexyl)meä3yi]ainino}-2-oxoethyi)suifan.yl]-N-(2 -{[(2,5-dioxo-2,

yl)acetyl]ammo}ethyl)propanamid (1 :1 ) Trifluoressigsäure (Isomer 1)

Eine Lösung von 41 ,40 mg (0.04 mmol) 2-(Trimethyisiiyl)ethy^^

άίί1υο ηε^1)-1Η-ρ^ο1-2^1]^ο^

2,7, 12-trioxo-l 0-lhia-3,6,l 3-triazahexadecan-16-yl} carbamat (Iniermediai C88) in 0.92 ml 2,2,2- Triffuoroethanol wurde mit 37.32 mg (0.27 mmol) Zinkchlorid versetzt und das Reaktionsgemisch wurde 3 h bei 50 °C gerührt. Anschließend wurden 80.02 mg (0.27 mmol) EDTA hinzugegeben und die Mischung wurde 15 Minuten gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat versetzt und die org. Phase wurde mehrmals mit Wasser und mit ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittels präparative HPLC gereinigt. Man erhielt 9.6 mg ( 24 % d. Th )der Titelverbindung.

LC-MS (Methode 12): R _t = 1.58 min; MS (ESIpos): m/z - 763 (M+H Intermedia! F302

S-{2-[ {(lR)-! -[l-benzyM-(2,5-difluoroph^^

ylmetliyl)amino]-2-oxoethyl}-N-[(2,5-dioxo-2,5-dihydro- lH-pyrrol-l-yl)acetyl]-L-cysteine trifluoroacelate (1 : 1) (Isomer 1)

Eine Mischung von 56.9 mg (58.2 mmol, 85 % Reinheit) S-[2-({(lR)-l -[l -Benzyl-4-(2,5- άϊί υοφΙιβηγΠ-ΙΗ-ργΓΓθΙ^-γ^^^-ίϋηιεΙΙι γΙρΓοργΙ} {[(l-(tert-butoxycarbonyl)pyrrolidin-3- yi]me1 l}amino)-2-oxoeihyl]-N-[(2,5^

(Intermediat C99) in 1.4 ml 2,2,2-Trifluoroethanol unter Argon wurde mit 31.7 mg (0.23 mmol) Zinkchlorid versetzt und das Reaktionsgemisch wurde 3 h bei 50 °C gerührt. Anschließend wurden 68.0 mg (0.23 mmol) EDTA hinzugegeben und die Mischung wurde 15 Minuten gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat versetzt und die organische Phase wurde mehrmals mit Wasser und mit ges. NaCi-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde präparative HPLC gereinigt. Man erhielt 7 mg (13 % d. Th) der Titelverbindung.

LC-MS (Methode 1): R, = 0.91 min; MS (ESIpos): m/z = 736 (M+H-CF ₃ CO_H) ⁺ . Intermedia! F303

3-( {2-[ {(lR)-l-[l-benzyl-4-(2,5-difluorphenyO^

ylme1hyl)aaiino]-2-oxoethyl}suifenyl)-N-(2-{[(2,5-dioxo-2 ,5-dihydro-lH^y!Toi-l- yl)acetyl]ammo}ethyl)propanamid Trifluoressigsäure (1 :1) (Isomer 2)

Eine Lösung von 26,4 mg (0.03 mmol) tert-Buiyl-3-[2- {( lR)-l-[l-benzyl-4^

1 H-pyrrol-2-y1]-2,2Kiimethyipr^

thia-2,9, 12-triazatetradec- 1 -yl]pyrrolidin-l -carboxylat (Inlermedial C103) in 0.80 ml 2,2,2- Trifiuoroethanol wurde mit 16.7 mg (0.12 mmol) ZmkcWorid versetzt und das Reaktionsgemisch wu de 8 h bei 50 °C gerührt. Anschließend wurden 35.76 mg (0.12 mmol) EDTA hinzugegeben und die Mischung wurde 15 Minuten gerührt. Die Reakttonsmisehung wurde mit Ethylacetat versetzt und die org. Phase wurde mehrmals mit Wasser und mit ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittels präparative gereinigt. Man erhielt 3.8 mg (14 % d. Th) der Titelverbindung.

LC-MS (Methode 1): R, = 2.98 min; MS (ESIpos): m/z - 763 (M+H-CF ₃ C0 ₂ H) ⁺ . Intermedia! F304

N-(2- {[3-({2-[{(lR) -[l -benzyl-4-(2,5-difluoiphenyl)-l H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl} (pyrrolidin-3-yline1iiyl)ainino]-2-oxo6lliyl}sulf^yl)prop2ff loyl]ainirio}cthyl)-6-

(2,5-dioxo-2,5-dihydro-l H-pyrrol-l -yl)hexanamid (1 : 1 ) Trifluoressigsäure (Isomer 2)

F

Eine Lösung von 22.3 mg (0.02 mmol) teri-Butyi-3-[2-{(lR)-l -[l ~benzyi-4-(2,5~difluorpbeny])~ lH-p Tol-2-ylj-2,2Hlimethyipropyi} 8-(2,5Hiioxo-2,5

thia-2,9, 12-triazaoctadec- 1 -yljpyrrolidin- 1 -carboxylat (Intermedia. 105) in 0.64 ml 2,2,2- Trifluoroethanol wurde mit 13.2 mg (0.10 mmol) Zinkchlorid versetzt und das Reaktionsgemisch wurde 8 h bei 50 °C gerührt. Anschließend wurden 28.36 mg (0.10 mmol) EDTA hinzugegeben und die Mischung wurde 15 Minuten geröhrt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat versetzt und die organische Phase wurde mehrmals mit Wasser und mit ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittei im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittels präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 250x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA) gereinigt. Man erhielt 5 mg ( 23 % d. Th ) der Titelverbindung.

LC-MS (Methode 5): R _t 3.05 min; MS (ESIpos): m/z = 819 ! \M i-C ί :( ü I i i . Intermedia! F305

N~ {ilR)~Hl~Benzyl~4-{2 d^^^^

2,5 lihydro H-pyrroM -yl)-6,17-dioxo-N^

diazadocosan-l -amid (1 : 1 ) Trifluoressigsäure (isomer 2)

Eine Lösung von 24,80 mg (0.02 mmol) tert-Butyl-3-[2-{(lR)-l -[l ~benzyl-4-(2,5~difluorpbenyl)~ lH-pyiTol-2-yl]-2,2-dimethylpropyi} -24-(2,5 lioxo-2,5-dihych-o-

12,1 5-dioxa-5-thia-2,9,18-triazatetracos-l -yl]pyrrolidin-l -carboxylat (Intermediat C l 07) in 0.65 ml 2,2,2-Trifiuoroethano! wurde mit 13.42 mg (0.10 mmol) Zinkchiorid versetzt und das Reaktionsgemisch wurde 8 h bei 50 °C gerührt. Anschließend wurden 28.78 mg (0.10 mmol) EDTA hinzugegeben und die Mischung wurde 15 Minuten gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat versetzt und die org. Phase wurde mehrmals mit Wasser und mit ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittels präparative HPLC gereinigt. LC-MS (Methode 5): Rt = 3.11 min; MS (ESIpos): m/z = 907 (M+H-CFsCC H . B: HensteUung^

B-l. Allgcmch]^

US6,965,018 beschreibt den von dem Hybridom PTA-4058 sezernierten murinen anti-B7H3 Antikörper. Wir haben mit Standardverfahren die Aminosäuresequenz dieses Antikörpers bestimmen lassen (Precision Antibodies) und den Fv-Teil mit den Regionen Chi, Ch2 und Ch3 eines humanen IgGl fusioniert. Hierfür wurden die DNA Sequenzen, welche die einzelnen Bereiche codieren in einen Säuger-IgG-Expressionsvektor inseriert und anschließend wie unter B-2 beschrieben exprimiert. Das Ergebnis ist die hierin mit TPP5706 bezeichnete Chimäre aus dem Fv- Teil des murinen PTA-4058 mit der Chi, Ch2 und Ch3 -Region eines humanen IgGl .

Die Antikörper, zum Beispiel TPP-3803 und TPP-5706 wurden in transienten Säugerzeilkulturen produziert, wie von Tom et al., Kapitel 12 in Methode Express: Expression Systems herausgegeben von Micheal R. Dyson and Yves Durocher, Scion Publishing Ltd, 2007 {siehe AK-Beispiel 1) beschrieben.

B-3. Allgemeines Verfahren zur Aufreinigung von Antikörpern aus Zellüberständen.

Die Antikörper, zum Beispiel TPP-3803 und TPP-5706 wurde aus den Zellkulturüberständen gewonnen. Die Zeliüberstände wurden durch Zentrifugation von Zeilen geklärt. Anschließend wurde der Zellüberstand durch Affinitätschromatographie auf einer MabSelect Sure (GE Healthcare) Chromatographiesäule gereinigt. Dazu wurde die Säule in DPBS pH 7.4 (Sigma/Aldrich) equillibriert, der Zeilüberstand aufgetragen und die Säule mit ca 10 Säulenvolumina DPBS pH 7.4 + 500 mM Natriumchlorid gewaschen. Die Antikörper wurden in 50 mM Natriumaeetat pH 3.5 + 500 mM Natriumchlorid eluiert und anschliessend durch Oelfiltrationschromatographie auf einer Superdex 200 Säule (GE Helthcare) in DPBS pH 7.4 weiter gereinigt.

In die Kupplungsreaktionen wurde folgender Antikörper eingesetzt: Anti-B7H3 AK _lA (TPP-3803) Anü-B7H3 AK _1B (TPP-5706)

Die Kupplungsreaktionen wurden üblicherweise unter Argon durchgeführt.

Zu einer Lösung des entsprechenden Antikörpers in PBS-Puffer im Konzentrationsbereich zwischen 1 mg/mL und 20 mg mL, bevorzugt im Bereich von ungefähr 10mg ml bis 15 mg ml wurden zwischen 2 und 5 Äquivalenten Tris(2-carboxyemyl)phospbin-Hychochlorid (TCEP), gelöst in PBS-Puffer, gegeben und 1h bei RT gerührt. Dazu kann die Lösung des jeweils eingesetzten Antikörpers in der in den Ausfuhrungsbeispielen angegebenen Konzentration eingesetzt werden oder gegebenenfalls auch mit PBS Puffer bis etwa auf die Hälfte der angegebenen Startkonzentration verdünnt werden, um in den bevorzugten Konzentrationsbereich zu kommen. Anschließend wurden, je nach angestrebter Beladung, zwischen 2 und 12 Äquivalenten, bevorzugt etwa 5-10 Äquivalente der zu kuppelnden Maleinimid- Vorläufer- Verbindung oder Halogenid-Vorläufer-Verblndung als Lösung in DMSO hinzugefügt. Dabei sollte die Menge an DMSO 10% des Gesamtvolumens nicht überschreiten. Der Ansatz wurde bei Maieinimid-Precursern 60-240 min bei RT und bei Haiogenid-Precursern zwischen 8 und 24 h bei RT gerührt und anschließend über in PBS equiliibierte PD 10-Säulen (Sephadex* G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer eluiert. Üblicherweise wurden, wenn nicht anders angegeben, 5 mg des entsprechenden Antikörpers in PBS-Puffer zur Reduktion und der nachfolgenden Kupplung eingesetzt. Nach Aufreinigung über die PD10 Säule wurden so jeweils Lösungen des entsprechenden ADCs in 3.5 mL PBS-Puffer erhalten. Anschließend wurde eine Aufkonzentration mittels Ultrazentrifugation durchgeführt und die Probe ggf. mit PBS-Puffer zurückverdünnt. Falls notwendig wurde zur besseren Abtrennung niedermolekularer Bestandteile die Aufkonzentration mittels LTtrafiltration nach Rückverdünnung mit PBS Puffer wiederholt. Für biologische Testungen wurden je nach Bedarf in den finalen ADC Proben ggf. durch Rückverdünnung Konzentrationen im Bereich von 0.5-15 mg/mL eingestellt. Für die ADC Lösungen wurde die in den Ausfuhrungsbeispielen jeweils angegebene Proteinkonzentration bestimmt. Weiterhin -wurde die Beladung des Antikörpers (Drug/mAb Ratio) nach den unter B-7. beschriebenen Methoden ermittelt. Wenn nicht anders angegeben wurden die in den Beispielen dargestellten immunokonjugate nach diesem Verfahren hergestellt. Die in den Beispielen dargestellten ADCs können in Abhängigkeit vom Linker gegebenenfalls auch mehr oder weniger stark ausgeprägt in Form der hydrolysierten offenkettigen Bernsteinsäureamide mit den Antikörpern verknüpft vorliegen.

Insbesondere die KSP-I-ADCs, die über die Linker-Substruktur

mit Thiolgruppen der Antikörper verknüpft sind, können auch ggf. durch Umpuffem im Anschluss an die Kupplung und ca. 20-24-stündiges Rühren bei pH 8 gemäß Schema 28 gezielt in die die über offenkettige Bersteinsäureamide verknüpften ADCs hergestellt werden.

#1 stellt die Schwefelbrücke zum Antikörper dar und #2 die Verknüpfungsstelle zum modifizierten KSP-lnhibitor

Solche ADCs, bei denen der Linker über hydrolysierte offenkettige Bernsteinsäureamide mit den Antikörpern verknüpft vorliegt, können gegebenenfalls auch gezielt nach einer exemplarischen Vorschrift wie folgt dargestellt werden:

60 mg des betreffenden Antikörpers in 5 ml PBS-Puffer (c~I2 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0,344mg TCEP in ΙΟΟμί PBS-Puffer versetzt.. Der Ansatz wurde 30min bei RT gerührt und anschließend wurden 0.003 mmol einer Mal einimid- Vorläuferverbindung gelöst in 600μί DMSO zugegeben. Nach weiteren 1.5h- 2h Rühren bei RT wurde der Ansatz mit 1075μ1 PBS-Puffer, der zuvor auf pH 8 eingestellt wurde, verdünnt.

Diese Lösung wurde dann über mit PBS-Puffer pH8 equillibrierte PD 1.0-Säulen (Sephadex ^® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer pH 8 eluiert. Das Eluat wurde mit PBS-Puffer pH8 auf ein Gesamtvolumen von 14 ml verdünnt. Diese Lösung wurde über Nacht bei RT unter Argon gerührt. Dann erfolgte ggf. wieder ein Unipuffern auf pH 7.2. Die ADC-Lösung wurde durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert, rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH7.2) und dann ggf. erneut bis auf eine Konzentration von etwa lOmg mL aufkonzentriert. Weitere potentiell hydrolyse-sensitive Thianylsuccinimid-Brücken zum Antikörper in den Ausf hrungsbeispielen enthalten folgende Linker- Substrukturen, wobei #1 die Thioelherverknüpfung zum Antikörper und #1 die Verknüpfungsstelle zum modifizierten KSP- Inhibitor darstellt:

Diese Linker-Substrukturen stellen die Verknüpfungseinheit zum Antikörper dar und haben (neben der weiteren Linkerzusammensetzung) einen signifikanten Einfliiß auf die Struktur" und das Profil der in Tumorzellen gebildeten Metabolite.

In den dargestellten Strukturformeln hat dabei AK _iA die Bedeutung AK- A = anti-B7H3 AK _1A (partiell reduziert)- S§ ^! AKIB = anti-B7H3 AKm (partiell reduziert)- S§ wobei die Verknüpfung mit der Suecinimkl-Gruppe oder mit ggf. daraus entstandenen isomeren hydroiysierten offenkettigen Bemsteinsäureamiden bzw. des Alkylenrestes bedeutet, und

S für das Schwefelatom eines Cystein-Restes des partiell reduzierten Antikörpers steht.

In die Kupplungsreaktionen wurden folgende Antikörper eingesetzt: Anti-B7H3 AK _iA (TPP-3803) Anti-B7H3 AK _iB (TPP-5706)

Die Kupplungsreaktionen wurden üblicherweise unter Argon durchgeführt.

Zu einer Lösung des entsprechenden Antikörpers in PBS-Puffer im Konzentrationsbereich zwischen 1 mg/mL und 20 mg/mL, bevorzugt etwa 10 mg/mL, wurden, je nach angestrebter Beladung, zwischen 2 und 8 Äquivalente der zu kuppelnden Vorlauf er- Verbindung als Lösung in DMSO gegeben. Nach 30 min bis 6 h Rühren bei RT wurde nochmals die gleiche Menge an Vorläufer- Verbindung in DMSO hinzugefügt. Dabei sollte die Menge an DMSO 10% des Gesamtvolumens nicht überschreiten. Nach weiteren 30 min bis 6 h Rühren bei RT wurde der Ansatz über in PBS equillibierte PD 10-Säulen (Sephadex® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer eluiert. Üblicherweise wurden, wenn nicht anders angegeben, 5 mg des entsprechenden Antikörpers in PBS-Puffer zur Reduktion und der nachfolgenden Kupplung eingesetzt. Nach Aufreinigung über die PD10 Säule wurden so jeweils Lösungen des entsprechenden ADCs in 3.5 rnL PBS-Puffer erhalten. Anschließend wurde eine Aufkonzentration mittels Ultrazentrifugation durchgeführt und die Probe ggf. mit PBS-Puffer zurückverdünnt. Falls notwendig wurde zur besseren Abtrennung niedermolekularer Bestandteile die Aufkonzentration mittels Ultrafiltration nach Ruckverdünnung mit PBS Puffer wiederholt. Für biologische Testungen wurden je nach Bedarf in den finalen ADC Proben ggf. durch Rückverdünnung Konzentrationen im Bereich von 0.5-15 mg/mL eingestellt.

Für die ADC Lösungen wurde die in den Ausführungsbeispielen jeweils angegebene Proteinkonzentration bestimmt. Weiterhin wurde die Beladung des Antikörpers (Drug mAb Ratio) nach den unter B-7. beschriebenen Methoden ermittelt.

In den dargestellten Strukturformeln hat dabei AK _2A die Bedeutung AK = anti-B7H3 AK _!A - NHf

AK = anti-B7H3 AK _iB - H§ ²

woDei

§ die Verknüpfung mit der Carbonylgruppe bedeutet, und

NH für die Seitenketten-Aminogruppe eines Lysin-Restes des Antikörpers steht.

B-6a. Allgemeines Verfahren zur Herstellung von geschlossenen Succimmid-Cvstein-

Addut :ten:

Tn einer beispielhaften Ausführung wurden 10 μπιοί der oben beschriebenen Maleinimid- Vorläuferverbindungen wurden in 3-5 mL DMF aufgenommen und mit 2.1 mg (20 μιηοΐ) L- Cystein versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde zwischen 2h und 24 h bei RT gerührt, anschließend im Vakuum eingeengt und dann mittels präparativer HPLC gereinigt.

B_-6giL__ !ge ^

Cy stein- A ddukten :

In einer beispielhaften Ausführung wurden 68 μιηοί der oben beschriebenen Maieinimid- Vorläuferverbindungen in 15 ml. DMF aufgenommen und mit 36 mg (136 μτηοΐ) N-{[2- (Trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl}-L-cystein versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde -20h bei RT gerührt, anschließend im Vakuum eingeengt und dann mittels präparativer HPLC gereinigt. Nach Vereinigung der entsprechenden Fraktionen und Abdampfen der Lösemittel im Vakuum wurde der Rückstand in 15 mL THF/Wasser 1 :1 gelöst. Es wurden 131 μΐ, einer 2M wässrigen Lithiumhydroxidlösung zugegeben und der Ansatz 1 h bei RT gerührt. Anschließend wurde der Ansatz mit einer IM Salzsäure neutral gestellt, das Lösemittel im Vakuum abgedampft und der Rückstand durch präparative HPLC gereinigt. Es wurden -50% d. Th. der regioisomeren geschützten Tntermediate als farbloser Schaum erhalten. Im letzten Schritt wurden 0.023 mmol von diesen regiosisomeren Hydrolyseprodukten in 3 mL 2,2,2-Trifluorethanol gelöst. Es wurden 12.5 mg (0.092 mmol) Zinkchlorid zugegeben und der Ansatz 4 h bei 50°C gerührt. Anschließend wurden 27 mg (0.092 mmol) Ethylendiamm-Ν,Ν,Ν',Ν'- tetraessigsäure zugesetzt und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der R ückstand wurde mittels präparativer HPLC gereinigt. Nach Einengen der entsprechenden Fraktionen und Lyophilisation des Rückstands aus Acetonitril/Wasser wurden die hydrolvsierten offenen Sulfanylbernstemsäure- amide als Regioisomerengemiscb erhalten.

Weitere Aufreimgung und Charakterisierung der erfindungsgemäßen Konjugale

Nach erfolgter Umsetzung wurde in einigen Fällen das Reaktionsgemisch beispielsweise durch Ultrafiltration aufkonzentriert und anschließend mittels Chromatographie, beispielsweise mittels einer Sephadex® G-25, entsalzt und gereinigt. Die Elution erfolgte beispielsweise mit Phosphatgepufferter Salzlösung (PBS). Anschließend wurde die Lösung sterilfiltriert und eingefroren. Alternativ kann das Konjugal lyophilisiert werden.

B-7. Bestimmung des Antikörpers, der Toxophorbeladung und des Anteils geöffneter Cystein-Addukte

Zur Protein-Identifizierung wurde neben der Molekulargewichtsbestimmung nach Deglykosilierung und/oder Denaturierung ein tryptischer Verdau durchgeführt, der nach Denaturierung, Reduktion und Derivatisierung die Identität des Proteins anhand der nachgewiesenen tryptisehen Peptide bestätigt,.

Von den erhaltenen Lösungen der in den Ausführungsbeispielen beschriebenen Konjugale in PBS Puffer wurde die Toxophorbeladung wie folgt bestimmt:

Die Bestimmung der Toxophor Beladung von Ly sin- verknüpften ADCs erfolgte nach massenspektrometrischer Bestimmung der Molekulargewichte der einzelnen Konjugatspezies. Hierbei wurden vorab die Antikörperkonjugate mittels PNGaseF deglycosylieri, die Probe angesäuert und nach HPLC -Trennung/Entsalzung massenspektrometrisch mittels ESI-MicroTotq (Bruker Daltonik) analysiert. Alle Spektren über das Signal im TIC (Total Ion Chromatogramm) wurden addiert und das Molekulargewicht der verschiedenen Konjugatspezies auf Basis von MaxEnt Deconvolution kalkuliert. Nach Signal Integration der verschiedenen Spezies wurde dann die DAR (= Drug/Antibody Ratio) berechnet. Die Bestimmung der Toxophorbeladung von Cystein-verknupften Konjugaten wurde über Reversed-Phase-Chromatograpfaie des reduzierten und denaturierten ADCs bestimmt. Zur ADC- Lösung ( Img/mL, 50μΕ) wurde Guanidinium-Hydrochlorid (GuHCl) (28.6 mg) und eine Lösimg von DL-Dithiomreitol (DTT) (500mM, 3 μΐ,) gegeben. Die Mischung wurde für eine Stunde bei 55 °C inkubiert und über HPLC analysiert.

Die HPLC-Analyse wurde auf einem Agilent 1260 HPLC-System mit Detektion bei 220 nm durchgeführt. Es wurde eine Polymer Laboratories PLRP-S Polymerie Reversed Phase Säule (Katalognummer PL1912-3802) (2.1 xl 50 mm, 8 μιη partiele size, 1000 Ä) bei einer Flussrate von 1 mL/min mit folgendem Gradienten verwendet: 0 min, 25 %B; 3 min, 25 %B; 28 min, 50 %B. Laufmittel A bestand aus 0.05 % Trifluoressigsäure (TFA) in Wasser, Laufmittel B aus 0.05 % Trifluoressigsäure in Aceton itril.

Die detektierten Peaks wurden durch Retenttonszeitvergleich mit der leichten Kette (L0) und der schweren Kette (HO) des nicht konjugierten Antikörpers zugeordnet. Peaks, die ausschließlich in der konjugierten Probe detektiert wurden, wurden der leichten Kette mit einem Toxophor (LI ) und den schweren Ketten mit einem, zwei und drei Toxophoren (Hl , H2, H3) zugeordnet.

Die durchschnittliche Beladung des Antikörpers mit Toxophoren wurde aus den durch Integration bestimmten Peakflächen als die zweifache Summe der Toxophor-Anzahl gewichteten Integrationsergebnisse aller Peaks geteilt durch die Summe der einfach gewichteten Integrationsergebnisse aller Peaks berechnet. In vereinzelten Fällen kann es vorkommen, dass die Toxophorbeladung aufgrund von Ko-Eiutionen einiger Peaks nicht exakt möglich ist.

In den Fällen, in denen keine ausreichende HPLC-Trennung von leichter und schwerer Kette möglich war, erfolgte die Bestimmung der Toxophorbeladung von Cystein verknüpften Konjugaten mittels massenspektrometrischer Bestimmimg der Molekulargewichte der einzelnen Konjugatspezies an leichter und schwerer Kette.

Zur ADC -Lösung (Img mL, 50μΕ) wurde Guanidinium-Hydrochlorid (GuITCT) (28.6 mg) und eine Lösung von DL-Dithiothreitol (DTT) (500mM, 3 μΐ,) gegeben. Die Mischung wurde für eine Stunde bei 55 °C inkubiert und massenspektrometrisch nach online Entsaltzung mittels ESI- MicroTofQ (Braker Daltonik) analysiert.

Zur DAR-Bestimmung wurden alle Spektren über das Signal im TIC (Total Ion Chromatogramm) addiert und das Molekulargewicht der verschiedenen Konjugatspezies an leichter und schwerer Kette auf Basis von MaxEnt Deconvolution berechnet. Die durchschnittliche Beladung des Antikörpers mit Toxophoren wurde aus den durch Integration bestimmten Molekulargewiehtsflächen als die zweifache Summe der Toxophor-Anzahl gewichteten Integrationsergebnisse aller Peaks geteilt durch die Summe der einfach gewichteten Integrationsergebnisse aller Peaks berechnet.

Zur Bestimmung des Anteils des geöffneten Cystein-Addukts wurde das Molekulargewichtsflächenverhältnis vom geschlossenen und offenen Cystein-Addukt (Molekulargewichtsdelta I SDalton) aller einfach konjugierten leichten und schweren Kettenvarianten bestimmt. Der Mittelwert über alle Varianten ergab den Anteil des geöffneten Cystem-Addukts.

B-8. Überprüfung der Aniigen-Bindong des ADCs

Die Bindefähigkeit des Binders an das Zielmolekül wurde nach erfolgter Kopplung überprüft. Dazu sind dem Fachmann vielfältige Methoden bekannt, beispielsweise kann die Affinität des Konjugats mittels ELISA-Technologie oder Oberflächenplasmonresonanzanalyse (BIAcore™ Messungen) überprüft werden. Die Konjugatkonzentration kann der Fachmann mit gängigen Methoden messen, beispieisweise für Antiköiper-Konjugate mitteis Proteinbestimmung, (siehe auch Doronina et al.; Nature Biotechnol. 2003; 21 :778-784 und Polson et al, Blood 2007; 1102:616-623).

Ausffihrungsbeispiele Metabolite

S-[l-(2-{[2-({(2S)-2-Ammo-4-[{(lR) -[l-te^

dimethylpropyl } (giy coioy l)amino]butanoy ί } amino)ethyl] iimino}-2-oxoethyl)-2,5-dioxopyrrolidin- 3-yl]-L-c stein -trifluoressigsäure (1:3)

3.8 mg (2 _f imol) von Tntermediat F104 wurden in 3 mi DMF aufgenommen und mit 2.7 mg (22 μπιοΐ) L-Cystein versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 20 h bei RT gerührt, anschließend im Vakuum eingeengt und dann mittels präparativer HPLC gereinigt. Es verblieben 0.6 mg (26% d. Th.) der Titelverbindung als farbloser Schaum.

LC-MS (Methode 1): R _t = 0.80 min; MS (EIpos): m/z = 814 iVMIi .

4-[(2- { [2-( {(2S)-2-Amino-4-[ {(1 R)-l - [ 1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}(glycoloyl)am

amino-2-carboxyethyl]sulfanyl}-4-oxobutansäure -trifluoressigsäure (1 :1)

und

4-[(2-{[2-({(2S)-2-Ammo-4-[{(l RM^

dimethylpropyl} (giycoloyl)amino]butanoyi} amino)ethyl]amino} -2-oxoethyl)amino]-2- i[(2R)-2-

LC-MS (Methode 1): R _t = 0.80 min; MS (EIpos): m/z - 814 [M+Hf.

Zunächst wurde L-Cystein mit l-({[2-(Trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl}oxy)pyrrolidme-2,5-di on in DMF in Gegenwart von A^N-Diisopropylethylamin in N-{[2-(Trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl}-L- cystein überführt.

406 mg (1.53 mmol) N-{[2-(TrimethyIsilyi)ethoxy]carbonyi}-L-cystein wurden in 10 ml DMF gelöst und mit 157.5 mg (1.606 mmol) Malemsäureanhydrid versetzt und der Ansatz 1 Stunde bei RT gerührt. 130 iL dieser Lösung wurden mit 7.5 mg (0.01 mmol) von Intermedia! C66 versetzt und der Ansatz 5 min bei RT gerührt, Anschließend wurde im Vakuum eingeengt und der Rückstand durch präparative HPLC gereinigt. Das Lösemeittel wurde im Vakuum abgedampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Es wurden 10 mg (89%) des geschützten Intermediats erhaiten, wobei weder im HPLC noch im LC-MS die Regioisomere aufgetrennt werden konnten.

LC-MS (Methode 1): R _t = 1.38 min; MS (EIpos): m/z = 1 120 [ Vi · 111

Im letzten Schritt wurden die 10 mg von diesem Intermediat in 2 mL 2,2,2-T ^' rifluorethanol gelöst. Es wurden 12 mg (0.088 mmol) Zinkchlorid zugegeben und der Ansatz 30 min bei 50°C gerührt. Anschließend wurden 26 mg (0.088 mmol) Ethylendiamin- ,N,N',N'-tetraessigsäure zugesetzt und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittels präparativer HPLC gereinigt. Nach Einengen der entsprechenden Fraktionen und Lyophilisation des Rückstands aus Acetonitril/Wasser wurden 8.3 mg (99% d. Th.) der Titeiverbindung als Regioisomerengemisch imVerhältnis 87: 13 erhalten.

LC-MS (Methode 5): Rt = 2.3 min und 2.43 min; MS (ESIpos): m/z - 832 (M+H) ^' .

Ί-Ι-NMR Hauptregioisomer: (500 MHz, DMSO-de): δ = 8.7 (m, I i ! ). 8.5 (m, 2H), 8.1 (m, 1H), 7.6 (m, 1 H), 7.5 (s, 1H) 7.4-7.15 (m, 6H), 6.9-7.0 (m, 1H), 6.85 (s, 1 H), 5.61 (s, 1H), 4.9 und 5.2 (2d, 2H), 4.26 und 4.06 (2d, 2H), 3.5-3.8 (m, 5H), 3.0-3.4 (m, 5H), 2.75-3.0 ( , 3H), 2.58 und 2.57 (dd, 1H), 0.77 und 1 ,5 (2m, 2H), 0.81 (s, 9H).

Alternativ wurden die regioisomereo. Titel Verbindungen wie folgt hergestellt:

Zunächst wurde dazu L-Cystein mit l -( {[2-(Tiimethylsilyl)ethoxy]carbonylj Oxy)pyrrolidine-2,5- dion in DMF in Gegenwart von N, N-Diisopropylethylamin in N-{ [2- (Trimethylsilyl)ethoxy]carbonyi}-L-cystein überführt.

55 mg (0.068 mmol) von Intermediat F104 und 36 mg (0.136 mmol) N-{[2-(Trimethylsilyl) ethoxyjcarbonyi} -L-cystein 15 ml DMF gelöst und der Ansatz 20 h bei RT gerührt. Anschließend wurde eingeengt und der Rückstand durch präparative HPLC gereinigt. Nach Vereinigung der entsprechenden Fraktionen und Abdampfen der Lösemittel im Vakuum wurde der Rückstand in 15 mL THF Wasser 1 : 1 gelöst. Es wurden 131 μΕ einer 2M wässrigen Lithiumhydroxidlösung zugegeben und der Ansatz 1 h bei RT gerüiirt. Anschließend wurde der Ansatz mit einer I M Salzsäure neutral gestellt, das Lösemittel im Vakuum abgedampft und der Rückstand durch präparative HPLC gereinigt. Es wurden 37 mg (50%) d. Th.) der regioisomeren geschützten lntermediate als farbloser Schaum erhalten.

LC-MS (Methode 5): R, = 3.33 min und 3.36 min; MS (ESIpos): m/z = 976 (M+H) ⁺ .

Im letzten Schritt wurden 25 mg (0.023 mmol) von diesem Intermediat in 3 mL 2,2,2- Trifluorethanol gelöst. Es wurden 12.5 mg (0.092 mmol) Zmkchiorid zugegeben und der Ansatz 4 h bei 50°C gerührt. Anschließend wurden 27 mg (0.092 mmol) Ethy3endiamin-N,N,N',N'- tetraessigsäure zugesetzt und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittels präparativer HPLC gereinigt. Nach Einengen der entsprechenden Fraktionen und Lyophilisation des Rückstands aus Acetonitril/Wasser wurden 18.5 mg (85% d. Th.) der Titeiverbindung als Regioisomerengemisch imVerhältnis 21 :79 erhalten. LC-MS (Methode 5): R, = 2.37 min und 3.44 min; MS (ESIpos): m z = 832 (M+H) ⁺ .

Die gezielte Herstellung der einzelnen Regioisomere der Titelverbindungen erfolgte folgendermaße :

Beispiel M3

4-[(2-{[(2R)-2~({(2SV2-Amino-4-[{(I R)-l -[l-benzyl~4 2,5~difl

dimethy ipropy ί } (giy coloy l)amino]butanoy ί } amino)-2 - carboxyethyl] amino } -2 -oxoethyliamino] -3 - {[(2R)-2-arfflno-2-carboxyethyl]sulfenyl}-4-oxobutansäure -trifluoressigsäure (1:1) und

4-[(2Y[(2R)-2-({(2S)-2-Amino-4-W

dimethylpropyl}(glycoloyl)iimino]butanoyl}ammo)-2-carboxy ethyl]amino} -2-oxoethyl)amino]-2- {[(2R)-2-ainino-2-carboxyeihyl]sulfanyl}-4-oxobutansäure -trifluoressigsäure (1:1)

Zunächst wurde L-Cystein mit l-({[2-(Triinethylsilyl)ethoxy]carbonyl}oxy)pyrrolidine-2,5- dion in DMF in Gegenwart von Λ',/V-Diisopropylethylamin in N-{[2-(Trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl}-L- cystein überfuhrt.

11 mg (0.013 mmol) von lntermediat Fl 93 und 8 mg (0.016 mmol) N-{[2-(Trimethylsiiyl) ethoxy]carbonyl} -L-cystein wurden 3 ml DMF gelöst und der Ansatz 20 h bei RT gerührt. Anschließend wurde eingeengt und der Rückstand durch präparative HPLC gereinigt.

Nach Vereinigung der entsprechenden Fraktionen und Abdampfen der Lösemittel im Vakuum wurde der Rückstand in 2 m ^' L THF/Wasser 1:1 gelöst. Es wurden 19 [iL einer 2M wässrigen Lithiumhydroxidlösung zugegeben und der Ansatz 1 h bei RT gerührt. Dann wurden nochmals 19 μΐ, der 2M wässrigen Lithiumhydroxidlösung zugegeben und der Ansatz über Nacht bei RT gerührt. Anschließend wurde mit einer I M Salzsäure neutral gestellt, das Lösemittel im Vakuum abgedampft und der Rückstand durch präparative HPLC gereinigt. Es wurden 4.1 mg (38% d. Th.) der regioisomeren geschützten Intermediate als farbloser Schaum erhalten.

LC-MS (Methode 1): R _t = 1.03 min (breit); MS (ESIpos): m/z = 1020 ( Vi I i i .

Im letzten Schritt wurden 4.1 mg (0.004 mmol) von diesem Mermediat in 3 mL 2,2,2- Trifluorethanol gelöst. Es wurden 3 mg (0.022 mmol) Zinkchlorid zugegeben und der Ansatz 1 h bei 50°C gerührt. Anschließend wurden 6 mg (0.022 mmol) Emylendiamin-Ν,Ν,Ν',Ν'- tetraessigsäure und 2 ml einer 0.1%-igen wässrigen Trifliioressigsäure zugesetzt und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittels präparativer HPLC gereinigt. Nach Einengen der entsprechenden Fraktionen und Lyophilisation des Rückstands aus Acetonitril/W asser wurden 5 mg (quant.) der Titel Verbindung als Regioisomerengemiseh im Verhältnis 20:80 erhalten.

LC-MS (Methode 1): R, = 0.78 min (breit); MS (ESIpos): m/z = 876 (M+H) ⁺ .

LC-MS (Methode 5): R _t = 2.36 mm und 2.39 min; MS (ESIpos): m/z = 876 (M+H) ^" .

Beispiel M4

S-(l- {2-[2-( {(2S)-2-Amino-4-[ {(lRH-[l-benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH-p^

dimethylpropyl}(glycoloyl)amino]butanoyl}amino)ethoxy]emy l}-2,5-dioxopyrrolidin-3-yl)-L- cystein -trifluo

3 mg (4 μιηοΐ) von Mermediat F248 wurden in 2 ml DMF aufgenommen und mit 0.9 mg (8 μιηοΐ) L-Cystein versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 18 Ii bei RT gerührt und dann im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde mittels präparativer HPLC gereinigt. Die entsprechenden Fraktionen wurden eingeengt und nach Lyophilisation des Rückstands aus Acetonitril/Wasser verblieben 1.1 mg (32% d. Th.) der Titelverbindung als weißer Feststoff. LC-MS (Methode 1): R _t = 0.78 min; MS (EIpos): m/z - 803 [M+Hf

(3R,7S)-7-Ammo-17-{[(2R)-2-arrtmo^

1 H-p rrol-2-yl]-4-glycoloyl-2,2-dimethyl-8,l 6-dioxo- 12-oxa-4,9, 15-triazanonadecan-l 9-säure trifluoressigsäure (1 :1 )

und

(3R,7S)-7-Ainino-18-{[(2R)-2-ainmo^

1 H-pyrrol-2-yl]-4-gIycoloyl-2,2-dimethyl-8, 16-dioxo-l 2-oxa-4,9, 15-triazanonadecan-l 9-säure trifluoressigsäure (1 :1)

8 mg (0.010 mmol) von der geschützten Zwischenstufe von Intermediat F248 und 5.1 mg (0.02 mmol) N-{[2-(Trimethylsilyl) ethoxy]carbonyi} -L-cystein 3 ml DMF gelöst und der Ansatz 18 h bei RT gerührt und anschließend 2 h im Ultraschall bad behandelt. Anschließend wurde eingeengt und der Rückstand durch präparative HPLC gereinigt. Nach Vereinigung der entsprechenden Fraktionen und Abdampfen der Lösemittel im Vakuum wurde der Rückstand in 2 mL THF/Wasser 1 :1 gelöst. Es wurden 15 μί- einer 2M wässrigen Lithiumhydroxidlösung zugegeben und der Ansatz 15 min bei RT gerührt. Anschließend wurde der Ansatz mit einer IM Salzsäure auf einen pH-Wert von ~3 eingestellt, mit 20 ml Kochsalzlösung verdünnt und zweimal mit 20 ml Ethylacetat extrahiert. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet, eingeengt und der Rückstand aus Aeetonitril/Wasser lyophilisiert. Es wurden 8.4 mg (78% d. Th. über 2 Stufen) der regioisomeren geschützten Intermediate als farbloser Schaum erhalten.

LC-MS (Methode 1): R _t = 1.44 min und 3.43 min; MS (ESIpos): m/z = 1 107 (M+Hf.

Im letzten Schritt wurden 8 mg (0.007 mmol) von diesem Intermediat in 5 mL 2,2,2- Trifluorethanol gelöst. Es wurden 9.8 mg (0.072 mmol) Zinkchlorid zugegeben und der Ansatz 1.5 h bei 50°C gerührt. Anschließend wurde Ethylendiamin-N,N,N',N'-tetraessigsäure zugesetzt und das Lösemittel im Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde mittels präparativer HPLC gereinigt. Nach Einengen der entsprechenden Fraktionen und Lyophilisation des Rückstands aus Acetonitril/Wasser wurden 4 mg (59% d. Th.) der Titelverbindung als Regioisomerengemisch im Verhältnis 31 :67 erhalten.

LC-MS (Methode 1): R, = 0.79 min und 0.81 min; MS (ESIpos): m z = 819 (M+H) ⁺ . Beispiel M6

2- {[(2R)-2-Amino-2-carboxye l]sulfanylH^

difluorphenyl)-! H-pyrrol-2-yl ]-l 5,15-dimethyl-2, 7 ,12-trioxo-10-thia-3,6,13-triazahexadec-l- yl}amino)-4-oxobutansäure -trifluoressigsäure (1 :2) und

3- { [(2R)-2-Amino-2-carboxyethyl]sulfanyl } -4-( {( 14R)-13-(3-aminopropyl)-14-[l-benzyl-4-(2,5- difluo^henyl)-lH-pyrrol-2-yl] 5,15-dimem^

yl}amino)-4-oxobutansäure -trifluoressigsäure (1 :2)

18 mg (0.021 mmol) von Intermediat F213 und 1 1.2 mg (0.04 mmol) N-{[2-(Trimethylsilyl) ethoxy]carbonyi}~L~cy stein 2 ml DMF gelöst und der Ansatz 18 h bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde im Vakuum verdampft. Der Rückstand (21.2 mg) wurde in 3 mL THF/Wasser 3 : 1 gelöst. Es wurden 0.04 L einer 2M wässrigen Lithiumhydroxidlösung zugegeben und der Ansatz 3 Stunden bei RT gerührt. Es wurden 0.02 mL einer 2M wässrigen Lithiumhydroxidiösung zugegeben und der Ansatz 1 Stunde bei RT gerührt. Anschließend wurde der Ansatz mit 7.2 mg (0.12 mmol) Essigsäure auf einen pH-Wert von ~7 eingesteht. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittels präp. RP-HPLC geremigt (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser; 0.1 % TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Es wurden 13 mg (57% über 2 Stufen) der regioisomeren geschützten Intermediate erhalten.

LC-MS (Methode 1): R, = 1.03 min; MS (ESIpos): m/z = 1020 (M+H) ⁺ . Im letzten Schritt wurden 13 mg (0.01 mmol) von diesem Intermedia! in 2 L 2,2,2- Trifluorethanol gelöst. Es wurden 6.2 mg (0.05 mmol) Zinkchlorid zugegeben und der Ansatz 7 h bei 50°C gerührt. Anschließend wurde 13.3 mg (0.05 mmol) Ethylendiamm-Ν, ,Ν',Ν'- tetraessigsäure zugesetzt und das Lösemitte wurde mittels präparativer HPLC gereinigt. Nach Einengen der entsprechenden Fraktionen und Lyophilisation des Rückstands aus Acetonitril/Wasser wurden 10.3 mg (81.4%) der Titelverbindung als Regioisomerengemisch erhalten.

LC-MS (Methode 1): R, = 1.03 min; MS (ESIpos): m/z = 875 (M+H) ⁺ .

Beispiel M7

S-(2- { [2-( {(2S)-2-Amino-4- [ {( 1 R)- 1 -[ 1 -benzyl-4-(2,5-diiluorphenyl)-l H-p nol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}(giycoloyl)am

trifluoressigsäure 1 :1)

6 mg (8 μηιοί) von Intermediat Fl 19 wurden in 3 mL DMF aufgenommen und mit 1.8 mg (15 μχηοΐ) L-Cystein versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 6 h bei RT gerührt und dann 3 Tage bei RT stehen gelassen. Anschließend wurde der Ansatz im Vakuum eingeengt und das Produkt mittels präparativer HPLC gereinigt,.

LC-MS (Methode 1): R _t = 0.81 min; MS (ESIpos): m z === 717 (M+H) ⁺ . Beispiel M8

16,16-dimethyl-2,5, 10-trioxo-3 ,6,9, 14-telxaazaheptadec - 1 -yl) -5 -oxothiomorpholin-3-carbonsäure - trifluoressigsäure (3 : 1)

4 mg (0.004 mmol) der Verbindung aus Beispiel 135 wurden in 4 mL THF/Wasser gelöst und mit 48 μΐ, einer 2molaren wässrigen Litfaiitmhydroxidiösung versetzt. Der Ansatz wurde 1 h bei RT gerührt und anschließend eingeengt und mittels präparativer HPLC gereinigt. Nach Vereinigung, Einengen und Lyophilisation aus Acetonitril/W asser der entsprechenden Fraktionen wurden 2.4 mg (60% d. Th.) der Titelverbindung erhalten.

LC-MS (Methode 1 ): R _t = 0.86 min; MS (Elpos): m z = 814 [M+H] ⁺ . Beispiel M9

N-(3-Aminopropy 1)-N- {( 1 R)- 1 - [ 1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}-2-hydroxyacetamid

o 150.0 mg (0.42 mmol) { 1Κ)-1 -[1-Ββηζγ1-4-(2,5-<ϋί1«0 Ηβηγ1)-1Η-ργπΌΐ-2-γ1]-2,2- dimethyipropan-l -amm (Intermediat C52) wurden in 2.0 mL DichloiTnethan vorgelegt und mit 29.2 mg (0.49 mmol) HOAc und 125.6 mg (0.59 mmol) Natriumtriacetoxyborhydrid versetzt und 5 min bei RT gerührt. Es wurden 98.9 mg (0.49 mmol) 3■( i ,3-Dioxo-l ,3-dihydro-2H soindol-2- yl)propanal zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat verdünnt und die organische Phase zweimal mit ges. Natriumcarbonat-Lösung und einmal mit ges. NaCl-Lösung gewaschen. Nach der Trocknung über Magnesiumsulfat wurde das Lösemittel im Vakuum verdampft und der Rückstand mittels Kieselgel (Laufmittel: Dichlormethan/Methanol 100:1) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 1 88.6 mg (74 %) der Verbindung 2-[3-({(lR)-l-[l-Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH-pyrrol-2-yl ]-2,2-dimethylpropyl} amino)propyl]-lH-isoindol-l,3(2H)-dion.

LC-MS (Methode 1): R _t = 1.00 min; MS (ESIpos): m/z = 541 [ V! ! ! | .

171.2 mg (0.32 mmol) 2-[3-( {(lR) -[l-Benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)-lH-pyiTol-2-yl]-2,2- dimethylpropyl}amino)propyl]-lH- isoindol-l,3(2H)-dion wurden in 5.0 mL Dichlormethan vorgelegt und mit 73.6 mg (0.73 mmol) Triethylamin versetzt. Bei 0 °C wurden 94.9 mg (0.70 mmol) Acetoxyessigsäurechlorid zugegeben und die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat verdünnt und die organische Phase zweimal mit ges. Natriumhydrogencarbonat-Lösimg und einmal mit ges. NaCl-Lösung gewaschen. Nach der Trocknung über Magnesiumsulfat wurde das Lösemittel im Vakuum verdampft und der Rückstand wurde mittels Biotage Isolera gereinigt (Kieselgel, Säule 10 g SNAP, Fluss 12 mL/min, Ethylacetat/Cyclohexan 1 :3) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 159.0 mg (77 %) der Verbindung 2-({(lR)-l- [1-Β6ηζγ1-4-(2,5-άίΑυοφη6ηγ1)-1Η γττο1-2-γ1]^

2H-isoindol-2-yl)propyl]amino)-2-oxoethylacetat.

LC-MS (Methode 1): R, = 1.35 min; MS (ESIpos): m/z = 642 [M+H] ^1' .

147.2 mg (0.23 mmol) 2-({(^)-1-[1 -Βεηζγ1-4-(2,5-(ϋι1υοφ1ΐ6ηγ1)-1 Η-ργπ·ο1-2-γ1]-2,2- dimethylpropyl} [3-( 1,3-dioxo-l -dilw

wurden in 4.0 mL Ethanol vorgelegt und mit 356.2 mg (4.59 mmol) Methanamin (40 % in Wasser) versetzt. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei 50 °C gerührt. Das Lösemittel wurde im Vakuum verdampft und der Rückstand dreimal mit Toluoi kodestilliert. Der Rückstand wurde mittels Kieselgel (Laufmittel: Dichlormethan/Methanol 10:1) gereinigt. Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 67.4 mg (63 %) der Titelverbindung.

LC-MS (Methode 1): \l = 0.91 min; MS (ESIpos): m/z = 470 [ VS ! ! | .

(2R,28R)-28-Ammo-2-[({2-[(3-ammoprop^

2-yl]-2,2-dirnethylpropyl} arnino]-2-oxoethy

7J 0,13,1 6-tetraoxa-26-thia-3,19,23-triazanonacosan-l ,29-disäure -trifluoressigsäure (1 :2) und (lR,28R,34R)-l-Arnmo-33-(3-ammopropyl)-34-[l-be^

35,35-dime l-6,l 0,26,32-tetraoxo- 14,17,20,23-tetraoxa-3,30-dithia-7, 1 1,27,33- tetraazafaexatriacontan-l,4,28-tricarbonsäure -trifluoressigsäure (1 :2)

20 mg (0.018 mmol) R-{2-[(3-Aminopropyl){(l R)~Hl-ben^

yl]-2,2-cümeftylpropyl}ammo]-2-oxo

oxo-4,7, 10, 13-tetraoxa- 16-azanonadecan-l -oyl]-L-cystein-trifluoressigsäure (1 :1 ) (Intermediat F209) und 9.78 mg (0.036 mmol) N-{[2-(Trimethylsilyl) ethoxy]carbonyl}-L-cystein wurden in 2 ml DMF gelöst und der Ansatz 18 h bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde im Vakuum verdampft. Der Rückstand (47.7 mg) wurde in 3 mL THF/Wasser 1 :1 gelöst. Es wurden 0.08 mL einer 2M wässngen Lithiumhydroxidlösung zugegeben und der Ansatz 1 Stunde bei RT gerührt. Anschließend wurde der Ansatz mit 9.26 mg (0.15 mmol) Essigsäure auf einen pH-Wert von ~7 eingestellt. Die Reaktionsmischung wurde direkt mittels präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 inL/min, MeCN/ Wasser; 0.1 % TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Es wurden 15.3 mg (29% über 2 Stufen) der regioisomeren geschützten Intermediate erhalten.

LC-MS (Methode 6): R = 12.26 min und 12.30min; MS (ESIpos): m/z = 1254 i \I I i ) .

Im letzten Schritt wurden 15.3 mg (0.01 mmol) von diesem Intermediat in 2 mL 2,2,2- Trifluorethanol gelöst. Es wurden 6.1 mg (0.05 mmol) Zinkchlorid zugegeben und der Ansatz 2 h bei 50°C gerührt. Anschließend wurde 13.1 mg (0.05 mmol) Ethylendiamin-Ν,Ν, ',Ν'- tetraessigsäure zugesetzt und das Lösemitte wurde mittels präparativer HPLC gereinigt. Nach Einengen der entsprechenden Fraktionen und Lyophilisation des Rückstands aus Acetonitril/Wasser wurden 1 1.9 mg (79.5%) der Titel Verbindung als Regioisomerengemisch erhalten.

LC-MS (Methode 1): R = 0.85 min; MS (ESIpos): m/z = 1 3 10 (M+H ^' f. Beispiel Mll

S- {2-[(3-Aminopropyl) {(lR)-l-[l -benz l-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2- dtmethylpropyl}amino]-2-oxoeth l} -L-cystein -triiluoressigsäure ( 1 :2)

15.0 mg (0.018 mmol) 8-(11-{(1Κ)-1 -[1-Ββηζγ1-4-(2,5-<ϋί1«0 Ηβηγ1)-1Η-ρ ΠΌΐ-2-γ1]-2,2- dimethylpropyi} -2,2-dimethyi-6, 12 -dioxo-5~oxa-7, 11 -diaza-2 -silatridecan- 13 -yi)~L-eystem trifluoressigsäure (1 : 1) (Intermediat C71) wurden in 1.0 mL Trifluoreihanol gelöst und mit 7.4 mg (0.054 mmol) ZinkdicWorid versetzt. Die Reaktionsmisehung rührte über Nacht bei 50 °C. Die Reaktionsmischung wurde mit 15.8 ing (0.054 mmol) Ethyiendiamin-N,N,N',N'-tetraessigsäure versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1% TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL/min, MeCN/Wasser, 0.1 % TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 1 1.1 mg (77 %) der Titelverbindung.

LC-MS (Methode 1): R, = 0.83 min; MS (ESIpos): m/z = 573 (M+H) ^1' .

4-{[(lR)-2-( i2-[(3-Aminopropyl) i(lR)-H^

dtmethylpropyl}amino]-2-oxoethyl} sulfanyl) -ca&oxyemyl]amino} -4-oxobutansäure trifluoressigsäure (1 :1

12.2 mg (0.014 mmol) S-(l H(lR)-i-[l-Benzyl-4-(2,5-difluorphen _y r

dimethylpropyl}-2,2Kiimethyi-0j^

4-oxobutanoyl)-L-cystein (Intermediat Cx) wurden in 2.0 mL Trifluoreihanol gelöst und mit 11.4 mg (0.084 mmol) ZinkdicWorid versetzt. Die Reaktionsmischung rührte 3 h bei 50 °C. Die Reaktionsmisehung wurde mit 24.5 ing (0.084 mmol) Ethyiendiamin-N,N,N',N'-tetraessigsäure versetzt, 10 min gerührt und dann mit Wasser (0.1% TFA) versetzt. Die Reinigung erfolgte direkt mittles präp. RP-HPLC (Säule: Reprosil 125x30; 10μ, Fluss: 50 mL min, MeCN/Wasser, 0.1% TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Man erhielt 4.6 mg (42 %) der Titelverbindung.

LC-MS (Methode 1): R _t = 0.88 min; MS (ESIpos): m/z = 673 (M+H) ⁺ .

Beispiel M13

4-[(2-{ [2-({(2S)-2-Arrino-4-[{(lR)-l-[l-ben^

dimethylpropyl} (glycoloyl)amino]butanoyl} amino)ethyl]amino} -2-oxoethyl)amino]-2- {[(2R)-2- amino-2-carboxyethyl]sulfanyl}-4-oxobutansäure -üifluoressigsäure (1 : 1)

Regioisomer 1 , Epimer 1 (2R) oder (2S)

LC-MS (Methode 5): R, = 2.44 min; MS (ESIpos): m/z = 832 [M+H] ⁺ .

Zunächst wurde Methyl-L-cysteinathydrochlorid (1 : 1) mit l -( { [2-(Trimethylsilyl)etboxy] earbonyl}oxy)pvrrolidine-2,5-dion in DMF in Gegenwart von Λ',Λ'-Diisopropylethylamm in Methyl-N- {[2-(1ximethylsilyl)ethoxy]carbonyl} -L-cysteinat überfuhrt.

408 mg (1.93 mmol) von kommerzieil erhältlicher 3-Brom-4-methoxy-4-oxobutansäure und 180 mg (0.644 mmol) Methyl-N- { [2-(trimethyisilyl)e1hoxy]carbonyl} -L-cysteinat wurden in 8 ml DMF gelöst und mit 147 mg (0.97 mmol) 1 ,8-Diazabicyclo(5.4.0)undec-7-en versetzt. Nach 18 h Rühren bei RT wurden nochmals 136 mg (0.64 mmol) 3-Brom-4-methoxy-4-oxobutansäure sowie 147 mg (0.97 mmol) 1 ,8-Diazabicyclo(5.4.0)undec-7-en hinzugefügt und der Ansatz weitere 12 h bei RT gerührt und anschließend im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde durch präparative HPLC gereinigt. Nach Vereinigung der entsprechenden Fraktionen und Abdampfen der Lösemittel im Vakuum wurden 151 mg (57% d. Th.) 4-Methoxy-3- {[(2R)-3-methoxy-3-oxo-2-( {[2- (trimethylsilyl)eihoxy]carbonyl }amino)propyl] suifanvi} -4-oxobutansäure erhalten. LC-MS (Methode 12): R, = 1.74 min; MS (ESIneg): m/z - 408 (M-H) ^" .

Von diesem Intermediat wurden 145 mg mittels übelkritischer Fluidchromatographie über chirale Säulen in die Einzeldiastereomere aufgetrennt (SFC; Säule: DAICEL, AD-H 5u 250x20 inm; Fluss: 80 mL/min; Methode: AD-25%ETOH-80ml; Druck: 100 bar; Wellenlänge: 210 nM) und dabei wurden von Epimer 1 63 mg (43%) und von Epimer 2 58 mg (40%) erhalten.

Epimer 1 wurde wie folgt charakterisiert:

LC-MS (Methode 5): R, = 2.94 min; MS (ESIneg): m/z = 408 (M-H) ^" .

Ή-NMR: (400 MHz, DMSO-d«): δ = 7.57 (d, IH), 4.24 i in. IH), 4.05 (t, 2H), 3.67 (t, IH), 3.65 (s, 3H), 3.62 (s, 3H), 3.05 (dd, IH), 2.70-2.88 (m, 2H), 2.59 (dd, IH), 0.93 (t, 2H), 0.02 (s, 9H).

Epimer 2 wurde wie folgt charakterisiert:

LC-MS (Methode 5): R, = 2.95 min; MS (ESIneg): m/z = 408 (M-H) ^' .

¹ H-NMR: (400 MHz, DMSO-d«): δ = 7.58 (d, I H), 4.16-4.23 (m, IH), 4.05 (t, 2H), 3.67 (dd, IH), 3.65 (s, 3H), 3.64 (s, 3H), 3.04 (dd, I H), 2.88 (dd, IH), 2.77 (dd, I H), 2.61 (dd, IH), 0.92 (t, 2H), 0.02 (s, 9H).

32.5 mg (0.079 mmol) von Epimer 1 wurden in Gegenwart von 30 mg (0.079 mmol) HATU und 13.4 mg (0.132 mmol) 4-Methylmorpholin mit 50 mg (0.066 mmol) von Intermediat C66 gekuppelt, wobei nach HPLC Reinigung 43 mg (57% d. Th.) vom voll geschützten Intermediat Methyl-4- { [( 8S)-8- { 2 - [ { ( 1 R)- 1 - [ 1 -benzyl-4-(2,5-difluorpheny 1)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethyl propyl}(glycoloyl)amino]ethyl } -2,2-dimethyl -6,9, 14-trioxo-5-oxa-7, 10, 13-triaza-2-silapentadecan- 15-yl]amino} -2- {[(2R)-3 -methoxy-3-oxo-2-( { [2-(trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl}amino)propyl] sulfanyl}-4-oxobutanoat erhalten wurden.

Anschließend wurden 40 mg (0.035 mmol ⁾ dieses Intermediats mit 0.9 ml, einer 2 molaren Lithiumhydroxidlösung in 1 1 ml Methanol 20 min lang bei RT gerührt, wobei beide Metbylestergruppen abgespalten wurden. Nach HPLC-Reinigung wurden 12 mg (31 % d. Th.) des Dicarbonsäurederivats erhalten.

LC-MS (Methode 5): R _t = 4.74 min; MS (ESIpos): m z = 1 120 i M I i i .

10 mg (0.009 mmol) dieses Intermediats wurden schließlich mit Zinkchiorid in Trifiuorethanol wie oben beschrieben vollständig entschützt. Der Rückstand wurde mittels präparativer HPLC gereinigt. Nach Einengen der entsprechenden Fraktionen und Lyophiiisation des Rückstands aus Aceton itril/W asser wurden 2.6 mg (30% d. Th.) der Titelverbindung erhaiten.

LC-MS (Methode 5): R _t = 2.44 min; MS (ESIpos): m/z = 832 i VM I i .

Beispiel Ml 4

4-[(2- { [2-( {(2S)-2-Amino-4-[ {(1 R)-l - [ 1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dimemylpropyl}(glyeoloyl)amino]butanoyl}amin^

amino~2-carboxyethyi]suifanyi}~4-oxobutansäure -trifluoressigsäure (1 :1)

Regioisomer 1, Epimer 2 (2R oder 2S)

LC-MS (Methode 5): R _t = 2.44 min; MS (ETpos): m/z = 832 [ M M ]

Das in Beispiel Ml 3 beschriebene Interrnediat Epimer 2 wurde in Analogie zu der Beschreibung in Beispiel Ml 3 umgesetzt:

32.5 mg (0.079 mmol) von Epimer 2 wurden in Gegenwart von 30 mg (0.079 mmol) HATU und 13.4 mg (0.132 mmol) 4-Methylrnorpholin mit 50 mg (0.066 mmol) von Interrnediat C66 gekuppelt, wobei nach HPLC Reinigung 43 mg (57% d. Th.) vom voll geschützten interrnediat Methyl~4- i[(8S)~8-{2-[{(lR)-i~[l-benzy^

propyl}(glycoloyl)amino]ethyl} -2,2-dimethyl-6,9, 14-trioxo-5-oxa-7 ,10, 13-triaza-2-silapentadecan- 15-yl]amino}-2-{[(2R)-3-m<rthoxy-3-oxo-2-({[2-(trimethyls ilyl)emoxy]carbonyl}amino)propyl] sulfanyl}-4-oxobutanoat erhalten wurden.

Anschließend wurden 40 mg (0.035 mmol) dieses Intermediats mit 0.9 mL einer 2 molaren Lithiumhydroxidlösung in 11 ml Methanol 20 min lang bei RT gerührt, wobei beide Methvlesiergruppen abgespalten wurden. Nach HPLC-Reinigung wurden 11 mg (28% d. Th.) des Dicarbonsäurederivats erhalten.

LC-MS (Methode 5): R, = 4.74 mm; MS (ESIpos): m z = 1 120 [M+Hf.

10 mg (0.009 mmol) von diesem Intermediat wurden schließlich mit Zinkchlorid in Trifluorethanol wie oben beschrieben vollständig entschützt. Der Rückstand wurde mittels präparativer HPLC gereinigt. Nach Einengen der entsprechenden Fraktionen und Lyophilisation des Rückstands aus Aceto itril/W asser wurden 4.4 mg (52% d. Th.) der Titelverbindung erhalten.

LC-MS (Methode 5): R, = 2.44 min; MS (ESIpos): m z = 832 [M+H] ⁺ .

Beispiel Ml 5

4-[(2- { [2-( {(2S)-2-Amino-4-[ {(1 R)-l - [ 1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl] dimethylpropyl}(giycoloyl)amino]butanoyl}amino)ethyl]amino}- 2-oxoethyl)amino]-3 ammo-2-carboxyethyl]suifanyl}-4-oxobutansäure -trifluoressigsäure (1:1)

Regioisomer 2, Epimer 1 (3R oder 3S)

LC-MS (Methode 5): R, = 2.45 min; MS (EIpos): m/z - 832 [M+H] ⁺ .

742.8 mg (3.3 mmol) von kommerziell erhältlicher 2-Brom-4-eihoxy-4-oxobutansäure und 802 mg (2.87 mmol) Methyl-N - { [2-(trimethyisiiyl)ethoxy] carbonyl } -L-cysteinat wurden in 32 ml DMF gelöst und mit 655.4 mg (4.31 mmol) 1 ,8-Diazabicyclo(5.4.0)undec-7-en versetzt. Nach 20 h Rühren bei RT wurde der Ansatz im Vakuum eingeengt und der Rückstand durch präparative HPLC gereinigt. Nach Vereinigung der entsprechenden Fraktionen und Abdampfen der Lösemittel im Vakuum wurden 521 mg (43% d. Th.) 4-Ethoxy-2-{[(2R)-3-methoxy-3-oxo-2-({[2- (trime&ylsüyl)e&oxy]carta erhalten.

LC-MS (Methode 5): R _t = 3.13 min; MS (ESIpos): m/z = 424 (M+H) ⁺ .

Von diesem Intermediat wurden 510 mg mittels überkritischer Fluidchromatogi'aphie über chirale Säulen in die Einzeldiastereomere aufgetrennt (SFC; Säule: DAICEL, AD-H 5u 250x20 mm; Fluss: 80 mL/min; Methode: AD-10%ETOH-80ml; Druck: 100 bar; Wellenlänge: 210 nM) und dabei wurden von Epimer 1 100 mg (20%) und von Epimer 2 141 mg (28%) erhalten.

Epimer 1 wurde wie folgt charakterisiert:

LC-MS (Methode 1): R, = 0.99 min; MS (ESIneg): m/z = 422 (M-H)\

'H-NMR: (400 MHz, DMSO-d ₆ ): δ = 7.60 (d, 1H), 4.18-4.26 ( , 1H), 4.01-4.08 (m, 4H), 3.63 (s, 3H), 3.59 (dd, 1H), 3.04 (dd, 1H), 2.92 (dd, 1H), 2.80 (dd, 1H), 2.63 (dd, 1H), 1.17 (t, 3H), 0.92 (t, 2H), 0.02 (s, 9H).

Epimer 2 wurde wie folgt charakterisiert:

LC-MS (Methode 5): R _t = 2.95 min; MS (ESIneg): m/z - 408 i .Vl-i l ) .

'H-NMR: (400 MHz, DMSO-de): δ - 7.56 (d, 1H), 4.21-4.29 (m, 1H), 4.01-4.1 (m, 4H), 3.64 (s, 3H), 3.58 (dd, 1H), 3.08 (dd, 1H), 2.85 (dd, 1H), 2.78 (dd, 1H), 2.60 (dd, 1H), 1.17 (t, 3H), 0.93 (t, 2H), 0.02 (s, 9H).

33.6 mg (0.079 mmol) von Epimer 1 wurden in Gegenwart von 30 mg (0.079 mmol) HATU und 13.4 mg (0.132 mmol) 4-Methylmorpholin mit 50 mg (0.066 mmol) von Intermediat C66 gekuppelt, wobei nach HPLC Reinigung 51 mg (63% d. Th.) vom voll geschützten Intermediat Ethyl-4- { [(8S)-8- {2-[ {(1 R)- 1 -[ 1 -benzyl-4-(2,5-difluorpheny1)-l H-pyrrol-2-yl]-2,2-dimelhyl propyl}(glycoloyl)amino]ethyl} -2,2-dimethyl-6,9, 14-trioxo-5-oxa-7, 10, 13-triaza-2-silapentadecan- 15-yl]amtno} -3- { [(2R)-3 -methoxy-3-oxo-2-( { [2-(trimethyisiiyl)elhoxy] carbonyl}amtno)propyl] sulfanyl}-4-oxobutanoat erhalten wurden.

Anschließend wurden 49 mg (0.042 mmol) dieses Intermediats mit 0.5 mL einer 2 molaren Lithiumhydroxidlösung in 32 ml THF/Wasser 3 : 1 30 min lang bei RT gerührt, wobei beide Methylestergruppen abgespalten wurden. Nach Ansäuern und HPLC -Reinigung wurden 11 mg

(24% d. Tb.) des Dicarbonsäurederivats erhalten.

LC-MS (Methode 5): R _t = 4.68 mm; MS (ESIpos): m/z = 1 120 j M l i j .

1 1 mg (0.01 mmol) dieses Intermediats wurden schließlich mit Zinkchlorid in Trifluorethanol wie oben beschrieben vollständig entschützt. Der Rückstand wurde mittels präparativer HPLC gereinigt. Nach Einengen der entsprechenden Fraktionen und Lyopbilisation des Rückstands aus Aceto itril/W asser wurden 3.7 mg (39% d. Tb.) der Titelverbindung erhalten.

LC-MS (Methode 5): Rt = 2.45 min; MS (ESIpos): m/z = 832 [M+H] ⁺ .

Beispiel Ml 6

4-[(2-{[2-( i(2S)~2-Ammo-4~[ i(l R)^^

dimethylpropyl} (glycoloyl)a!räino]butanoyl}amino)ethyl]amino} -2-oxoethyl)amino]-3-{ [(2R)-2- amino-2-carboxyethyi]sulfanyl}-4-oxobutansäure -trifluoressigsäure (1 :1)

Regioisomer 2, Epimer 2 (3R oder 3S)

LC-MS (Metbode 5): Rt = 2.44 min; MS (EIpos): m/z = 832 i VI - i l l .

Das in Beispiel Ml 5 beschriebene Tntermediat Epimer 2 wurde in Analogie zu der Beschreibung in Beispiel M15 umgesetzt: 33.6 mg (0.079 mmol) von Epimer 2 wurden in Gegenwart von 30 mg (0.079 mmol) HATU und 13.4 mg (0.132 mmol) 4-Methyl o 3hoiin mit 50 mg (0.066 mmol) von In terra ediat C66 gekuppelt, wobei nach HPLC Reinigung 51 mg (63% d. Th.) vom voll geschützten Intermediat Ethyl-4- { [(8S)-8- (2-[{(lR)-l-[l - 6ηζγί-4-(2,5-άίί1χ3θ Ηβηγ1) Η-ργΓτο1-2-γΙ]-2,2-άΐητ6 1 propyi }(glycoloyl)amino]ethyl} -2,2-dimethyl-6,9, 14-trioxo-5-oxa-7, 10, 13-triaza-2-silapentadecan- 15-yl]amino}-3- {[(2R)-3 -methoxy~3-oxo~2-( { [2-(trimethylsilyl)ethoxy] carbonyl} amino)propyl] sulfanyl} -4-oxobutanoat erhalten wurden.

Anschließend wurden 49 mg (0.042 mmol) dieses Intermediats mit 0.5 mL einer 2 molaren Lithiumhydroxidlösung in 12 ml THF/Wasser 1 :1 30 min lang bei RT gerührt, wobei beide Methylestergruppen abgespalten wurden. Nach Ansäuern und HPLC -Reinigung wurden 13.4 mg (28% d. Th.) des Dicarbonsäurederivats erhalten.

LC-MS (Methode 5): R _t = 4.66 min; MS (ESIpos): m/z - 1120 [M+Hf.

13.4 mg (0.012 mmol) dieses Intermediats wurden schließlich mit Zinkchlorid in Trifluorethanol wie oben beschrieben vollständig entschützt. Der Rückstand wurde mittels präparativer HPLC gereinigt. Nach Einengen der entsprechenden Fraktionen und Lyopiiiiisation des Rückstands aus Acetonitril/Wasser wurden 7.5 mg (66% d. Th.) der Titelverbindung erhalten.

LC-MS (Methode 5): R _t = 2.44 mm; MS (ESIpos): m/z = 832 [M+H] ⁺ .

Beispiel Ml 7

(glycoloyl)amino]butansäureh drochlorid (1 :1)

150 mg (0.2 mmol) von Intermediat C53 wurden in 15 mL DMF gelöst und mit 2.29 g (20.39 mmol) DABCO versetzt. Der Ansatz wurde 30 min im Ultraschallbad behandelt. Durch Zugabe von 1 ,17 ml Essigsäure wurde der Ansatz dann auf pH 3-4 gebracht und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde durch präparative HPLC gereinigt und die entsprechenden Fraktionen wurden bei RT im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde in Acetonitiil/Wasser 1 : 1 aufgenommen, mit 5 mL einer 4N Salzsäure versetzt und anschließend lyophilisiert. So wurden 81 mg {68% d. Th.) der Titelverbindung erhalten.

LC-MS (Methode 5): R _t = 2.69 min; MS (ETpos): m/z = 514 [ M M ] .

Beispiel Ml 8

N-[2-({(2S)-2-Amino-4-[{( lR)-l -[l -ben^

dim ethylpropyl } (giyeoloyl)ami ojbutanoyi } amino)ethyl ] -L-glutamin -trifluoressigsäure (1 :1)

Zunächst wurde nach klassischen Methoden der Peptidchernie Trifluoressigsäure -benzyl-N-(2- aminoethyl)-N ² ~[(benzyloxy)carbonyl]-L-glutaminat (1 :1) hergestellt. Diese Iniermediat wurde dann in Gegenwart von HATU mit Intermediat C58 gekuppelt. Anschließend wurde zunächst durch hydrogenolytische Spaltung die Benzyloxycarbonyl-Schutzgruppe sowie der Benzylester entfernt und anschließend mit Zinkchlorid die 2-(Trimethyisilyl)ethoxycarbonyi-Schutzgrupe. LC-MS (Methode 6): R _t = 1.91 min; MS (EIpos): nv ^' z - 685 [M+H] ⁺ .

Beispiel M19

N ⁶ -(N-{(2S)-2-Ainino-4-[{^

dimeä3yipropyi}( (1:1)

Zunächst wurde nach in der Peptidchemie bekannten klassischen Schutzgruppenoperationen Trifluoressigsäure --2-{trimethylsilyl)ethyl-N2-[(benzyloxy)carbonyi]-L-lysinat (1 : 1) hergesteilt. Dieses Intermediat wurde dann in Gegenwart von HATU mit Intermediat C61 gekuppelt. Anschließend wurde zunächst mit Zinkchlorid die 2-(Trimethylsilyl)ethoxycarbonyl-Schutzgrupe sowie der 2-(Trimelhylsilyl)ethylester gespalten. Schließlich wurde die Titelverbindung durch hydrogenolytische Spaltung der Benzyloxycarbonyl-Schutzgruppe und Reinigung durch präparative HPLC erhalten.

HPLC (Methode 1 1): R _t = ! .65 min;

Beispiel M20

(lR,4R,27R,33R)-l -Ammo-32-(3-amii^^

yi]-34,34-dimeihyl-6,9,25,31 -tetraoxo- 13, 16,19,22-tetraoxa-3,29-dithta-7, 10,26,32- tetraaza entatriacontan-1 ,4,27-tricarbonsäure -trifluoressigsäure (1 :2)

Zunächst wurde Methyl-L-cysteinathydrochlorid (1 : 1) mit l -( {[2-(Trimethylsilyl)ethoxy] carbonyl}oxy)pyrroh ^' dine-2,5-dicm in DMF in Gegenwart von <V, <V-DiisopropyIethylaniin in Methyl-N- {[2-(trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl} -L-cysteinat überfuhrt.

408 mg (1.93 mmol) von kommerziell erhältlicher 3-Brom-4-methoxy-4-oxobutansäure und 180 mg (0.644 mmol) Methyl-N- {[2-(triinethylsilyl)ethoxy]carbonyl} -L-cysteinat wurden in 8 ml DMF gelöst und mit 147 mg (0.97 mmol) 1 ,8-Diazabicyclo(5.4.0)undec-7-en versetzt. Nach 18 h Rühren bei RT wurden nochmais 136 mg (0.64 mmol) 3-Brorn-4-methoxy-4-oxobutansäure sowie 147 mg (0.97 mmol) 1 ,8-Diazabicyclo(5.4.0)undec-7-en hinzugefügt und der Ansatz weitere 12 h bei RT gerührt und anschließend im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde durch präparative FiPLC gereinigt. Nach Vereinigung der entsprechenden Fraktionen und Abdampfen der Lösemittel im Vakuum wurden 151 mg (57% d. Th.) 4-Methoxy-3-{[(2R)-3-methoxy-3-oxo-2-({[2- (trimethylsilyl)ethoxy]carbonyl }amino)propyl] sulfanyl} -4-oxobutansäure erhalten.

LC-MS (Methode 1 2): R _t = 1.74 min; MS (ESineg): m/z = 408 (M-HY. 3.66 mg (8.93 μιηοΐ) von 4-Methoxy-3- {[(2R)-3-methoxy-3-oxo-2-( {[2- (trimeftylsilyl)emoxy]carbonyl}amino)propylj sulfanyl} -4-oxobutansäure wurden in Gegenwart von 3.66 mg (8.93 μτηοΐ) HATU und 1.6 μΐ (15 μιηοί) 4-Methylmorpholin mit 13.0 mg (7.44 μηιοΐ) von S-(! 1-{(1R)-1 -[1 -BenzyM-(2,5-dtfluorphenyl)-l H-pyrrol-2-yl] -2,2-dimethylpropyl} - 2,2-dimethyl-6, 12-dioxo-5-oxa-7,l 1 -diaza-2-silatridecan-l 3-yl)-N-[ 15-(glycylamino)-4,7, 10, 13- tetraoxapentadecan- 1 -oyij-L-cystein -trifluoressigsäure (1 :1) (Intermediat C80) gekuppelt, wobei nach HPLC Reinigung 3.9 mg (37% d. Th.) vom voll geschützten Intermediat S-(11-{(1R)-1-[1- Benzyl-4-(2,5-difluoφhenyl)-lH- yrrol-2-yl]-2,2-dm

oxa-7, 11 -diaza-2-silatridecan- 13 -yl)-N-[ 15-( {N-[(8R, 1 lR)-8, 11 -bis(methoxycarbonyl)-2,2- dimethyl-6, 13 -dioxo-5-oxa-l 0-thia-7-aza-2-silatridecan- 13-yljglyeyl}amino)-4,7, 10,13- tetraoxapentadecan- 1 -oyij-L-cystein erhalten wurden.

Anschließend wurden 3.90 mg (2.76 μιηοΐ) dieses Intermediats mit 35 μΐ einer 2 molaren Lithiumhydroxidlösung in 1.0 ml THF/Wasser 3:1 15 min lang bei RT gerührt, wobei beide Methylestergruppen abgespalten wurden. Nach HPLC -Reinigung wurden 3.60 mg (94% d. Th.) des Dicarbonsäurederivats erhalten.

LC-MS (Methode 5): R _t = 4.83 min; MS (ESlpos): m/z = 1385 [M+Hf.

3.60 mg (2.60 μηιοί) dieses Intermediats wurden schließlich mit Zinkchlorid in Trifluorethanol wie oben beschrieben vollständig entschützt. Der Rückstand wurde mittels präparativer HPLC gereinigt. Nach Einengen der entsprechenden Fraktionen und Lyophiiisation des Rückstands aus Acetonitril/Wasser wurden 1.92 mg (55% d. Th.) der Titelverbindung erhalten.

LC-MS (Methode 5): R _t = 2.72 min; MS (ESIneg): m/z = 1094 [M-Hj\

Beispiel M21

(2R,24S,27R)-27-Amino-2-[({2-[(3-aminopropyl) {^

pyrrol-2-yl]-2,2<ümemylpropyl}am

trioxo-7,10, 1 3,16 sigsäure (1 :2)

742,8 mg (3.3 mmol) von kommerziell erhältlicher 2-Brom-4-ethoxy-4-oxobutansäure und 802 mg (2.87 mmol) Methyl-N- {[2-(trimethylsilyl)elhoxy]carbonyl}-L-cysteinat wurden in 32 ml DMF gelöst und mit 655.4 mg (4.31 mmol) 1 ,8-Diazabicyclo(5.4.0)undec-7-en versetzt.. Nach 20 h Rühren bei RT wurde der Ansatz im Vakuum eingeengt und der Rückstand durch präparative HPLC gereinigt. Nach Vereinigimg der entsprechenden Fraktionen und Abdampfen der Lösemittel im Vakuum wurden 521 mg (43% d. Th.) 4-Ethoxy-2- {[(2R)-3-methoxy-3-oxo-2-( {[2- (trimethy]silyl)ethox.y]ea^ erhalten.

LC-MS (Methode 5): R ₍ = 3.13 min; MS (ESIpos): m/z = 424 (M+H) ⁺ .

4.36 mg (10.3 pmol) von 4-Ethoxy-2- {[(2R)-3-methoxy-3-oxo-2-( {[2- (trimethy Isily l)ethoxy ] carbony i } amino)propyl] suifany 1 } -4-oxobutansäure wurden in G egenwart von 3.92 mg (10.3 μιηοΐ) HATU und 1.9 μΐ (17 μπιοΐ) 4-Methyimorpholin mit 15.0 mg (8.59 μηιοΐ) von S-(l 1-{(1 R)-l -[l-BenzyM-(2,5-difluo^henyI)-lH-pyrrol-2-yl]-2,2-dimethylpr opyl}- 2,2-dimethyl-6, 12-dioxo-5-oxa-7, 1 1 -diaza-2-silatridecan-13-yl)-N-[ 15-(glycylamino)-4,7, 10,13- tetraoxapentadecan- 1 -oyl]-L-cystein -trifluoressigsäure (1 : 1) (Interaiediat C80) gekuppelt, wobei nach HPLC Reinigung 3.6 mg (26% d. Th.) vom voll geschützten intermediat S-(1 1 - {(1R)-1 -[1 - Benzyl -(2,5 lifluorphenylH oxa-7,1 i -diaza-2-silatridecan-13-yl)-N-[15-({N-[(8R,l l S)-l l-(2-ethoxy-2-oxoethyl)-8- (methoxycarborxyl)-2,2-dimeth} -6J2-dioxo-5-oxa-10-thia-7-aza-2-siladodecan-12- yl]glycyl}aimno)-4,7,10,13-tetraoxapentadecan-l-oyl]-L-cyste in erhalten wurden.

Anschließend wurden 6.20 mg (2.82 μηιοΐ) dieses Intermediats mit 35 μί einer 2 molaren Lithiumhydroxidlösung in 1.0 ml THF/Wasser 1 :1 15 min lang bei RT gerührt, wobei beide Estergruppen abgespalten wurden. Nach Ansäuern und HPLC-Reinigung wurden 3.60 mg (92% d. Th.) des Dicarbonsäurederivats erhalten.

LC-MS (Methode 5): R _t = 4.71 min; MS (ESIpos): m/z - 1385 [M+Hf.

3.60 mg (1.69 μι ^η οΐ) dieses Intermediats wurden schließlich mit Zinkchlorid in Trifluorethanol wie oben beschrieben vollständig entschützt. Der Rückstand wurde mittels präparativer HPLC gereinigt. Nach Einengen der entsprechenden Fraktionen und Lyophilisation des Rückstands aus Acetonitril/Wasser wurden 0.88 mg (39% d. Th.) der Titelverbindung erhalten.

LC-MS (Methode 5): R, = 2.72 min; MS (ESineg): m/z = 1094 .

Beispiel M22

(2R,27 )-27-Amino-2-[( {2-[(3-aminopropyl) {( 1R)-1-[1 -bemyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol- 2-yl] -2,2-dimethylpropyl } amino j -2 - oxoethyl} sulfanyl)methyl]-24-(carboxymethyl)-4,20,23-trioxo- 7,l0,l3,l6-tetraoxa-25-1hia-3,l9,22 riazaoctac^ (1 :2) und

( lR,27R.33R) -Ammo-32-(3-arninopropy^

34,34-dime l-6,9,25,31-tetraoxo 3,16,19,22 etraoxa-3,29-ditliia-7,10,26,32- tetraazapentatriaeontan-1 ,4,27-tricarbonsäure-trifluoressigsäure (1 :2)

16.5 mg (0.015 mmol) S-{2-[(3-Aminopropyl){(lR)-l ~[l-ber _! zyi-4-(2,5<lifluo 3henyi)-l H-pyiTol- 2-yl]~2 dimethylpropyl}am^

dioxo-6,9,12,15-tetraoxa-3-azaocia(lecaQ-18-yl]-L-c stein -trifluoressigsäure (1: 1) (Iniermediat F257) und 8.18 mg (0.031 mmol) N-{[2-(Trimethylsilyi) ethoxyjcarbonyl}-L~cystein wurden in 2 ml DMF gelöst und der Ansatz 18 h bei RT geröhrt. Die Reaktionsmischung wurde im Vakuum verdampft. Der Rückstand (28.9 mg) wurde in 3 mL THF/Wasser 1 : 1 gelöst. Es wurden 0.046 mL einer 2M wässrigen Lithiurnhydroxidlösung zugegeben und der Ansatz 3 Stunde bei RT gerührt. Anschließend wurde der Ansatz mit 5.2 μΐ (0.092 mmol) Essigsäure auf einen pH-Wert von ~7 eingestellt. Die Reaktionsmischung wurde direkt mitteis präp. RP-HPLC gereinigt (Säule: Reprosil 125x30; 30μ, Fluss: 50 ml/min, MeC /Wasser; 0.1 % TFA). Die Lösemittel wurden im Vakuum verdampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Es wurden 12.1 mg (58% über 2 Stufen) der regioisomeren geschützten Intermediate erhalten. LC-MS (Methode 12): R, = 1.82 min; MS (ESIpos): m/z = 1240 (M+HJ

Im letzten Schritt wurden 12,1 mg (0.009 mmol) von diesem intermediat in 2 mL 2,2,2- Trifluorethanol gelöst. Es wurden 7.3 mg (0.054 mmol) Zinkchlorid zugegeben und der Ansatz 2 h bei 50°C gerührt. Anschließend wurde 15.7 mg (0.054 mmol) Ethylendiamm-Ν,Ν,Ν',Ν'- tetraessigsäure zugesetzt und das Lösemitte wurde mittels präparativer HPLC gereinigt. Nach Einengen der entsprechenden Fraktionen und Lyophilisation des Rückstands aus Acetonitril/Wasser wurden 6.4 mg (59%) der Titel Verbi dung als Regioiso erengemisch erhalten.

LC-MS (Methode 1): R _t = 0.86 min; MS (ESIpos): m/z - 1096 (M+H ^' f . Beispiel M23

N-{(2S)-2-Ammo-4-[{(l R.)-l-[l -henzy]-4^

propyl}(glyc»loyl)amino]butanoyl}-beta-alanyl-I _^ giiitaminsäure -trifluoressigsäure (1 :1)

Zunächst wurde Di-tert-butyl L-glutamate hydrochloride (1 : 1 ) in Gegenwart von HATU und N,N- Diisopropyiethylamin mit Intermediat C61 gekuppelt. Anschließend wurde das geschützte Intermediat in Trifluoreihanol aufgenommen und durch Rühren über Nacht bei 50°C in Gegenwart von Zinkchlorid vollständig entschützt. Die Aufarbeitung erfolgte nach Zugabe von EDTA durch Reinigung mittels präparativer HPLC.

LC-MS (Methode 12): R _t - 1.45 min; MS (ESIpos): m/z = 714 [M+Hf . Beispiel M24

N- { (2S)-2-Amino-4 - [ {(1 R)- 1 - [ 1 -benzyl-4-(2,5-difluorphenyl)- 1 H-pyrrol-2-yl]-2,2- dime thy Ipropyl } (gly coloy i)amino] biitanoyl } -b eta-alany 1-D-glutaminsäure -trifluoressigsäure ( 1 :1)

ZZuunnääcchhsstt wwuurrddee DDii--tteerrtt--bbuultyyll DD--gglluuttaammaatt HHyyddrroocchhllooriridd ((11 :: 11)) iinn GGeeggeennwwaarrtt vvoonn HHAATTUU uunndd NN,,NN-- DDiiiissoopprrooppyylleetthhyyllaammiinn mmiitt IInntteerrmmeeddiiaatt CC6611 ggeekkuuppppeelltt.. AAnnsscchhlliieeßßeenndd w wuurrddee ddaass ggeesscchhüüttzzttee I Inntteerrmmeeddiiaatt iinn TTrriiflfluuoorreetthhaannooll aauuffggeennoommmmeenn uunndd dduurrcchh RRüühhrreenn bbeeii 5500°°CC iinn GGeeggeennwwaartrt vvoonn ZZiinnkkcchhlloorriidd vvoollllssttäännddiigg eennttsseehhüüiizztt.. DDiiee AAuuffaarrbbeeiittuunngg eerrffoollggttee nnaacchh ZZuuggaabbee vvoonn EEDDTTAA dduurrcchh RReeiinniigguunngg mmiitttteellss pprrääppaarraattiivveerr HHPPLLCC..

LLCC--MMSS ((MMeetthhooddee 1122)):: RR,, == 11..4411 mmiinn;; MMSS ( (EESSIIppooss)):: mm//zz -- 771144 [[MM++HHff..

N-{(2S)-2-Amino-4-[{(l R.)-l-[l -henzy]-4^ _^

propyl}(glycoloyl)ammo]butanoyl}-L-glutaminsäure -trifluoressigsäure (1 :1)

Zunächst wurde Di-tert-butyl L-glutamat Hydrochloride (1 :1) in Gegenwart von HATU und N,N- Diisopropylethyiamin mit Intermediat C61 gekuppelt. Im nächsten Schritt wurde die Z- Schutzgruppe durch 45-minütige Hydrierung über 10%-igem Palladium auf Aktivkohle in Methanol bei RT unter Wasserstoff-Normaldruck entfernt. Anschließend wurde das partiell geschützie Intermediat in Trifluorethanol aufgenommen und durch 7 slündiges Rühren bei 50°C in Gegenwart von Zinkchiorid vollständig entschützt Die Aufarbeitung erfolgte nach Zugabe von EDTA durch Reinigung mittels präparativer HPLC.

LC-MS (Methode 12): R, = 1.44 min; MS (ESIpos): m/z - 643 [M+Hf.

4-[(2-{[2-({(2S)-2-Amino-4-[{(lR)-l-[l-benzy^^

dimethylpropyl} (glycoloyl)amino]butanoyl} amino)ethyi]amino} -2-oxoethyl)amino]-2- {[(2R)-2- amino-2-carboxyethyl]sulfanyl}-4-oxobutansäure -Irilluoressigsäure (1: 1)

Regioisomer 1 , Epimerengemisch

Dieses Beipiel beschreibt das Epimerengemisch der Verbindungen aus Beispiel 13 und Beispiel 14. Die Synthese erfolgte in Analogie zu Beispiel 13, wobei auf die Auftrennung der beiden Epimere durch überkritische Fluid-Chromatograpie verzichtet wurde und die Titelverbindung als Epimerengemisch hergestellt wurde.

LC-MS (Methode 5): R _t = 2.43 min; MS (ESIpos): m/z = 832 [M+H] ⁺ .

Beispiel M27

4-[(2- { [2-( { (2S)-2-Amino-4-[ R)-l -[ 1 -benzy\A-(2,5^ uoi^enyl)AH-pyrro\-2-yl]-2,2- dime thylpropyl } (gly coloy l)amino] butanoy 1 } amino)ethyl] ainmo} -2-oxoelhyl)ainino]-3-{[(2R)-2- aniino~2-carboxyeihyi]suifanyl}~4-oxobutansäure -trifluoressigsäure (1 : 1 )

Regioisomer 2, Epimerengemisch

Dieses Beipiel beschreibt das Epimerengemisch der Verbindungen aus Beispiel 15 und Beispiel 16. Die Synthese erfolgte in Analogie zu Beispiel 15, wobei auf die Auftrennung der beiden Epimere durch überkritische Fluid-Chrornatograpie verzichtet wurde und die Titelverbindung als Epimerengemisch hergestellt wurde.

LC-MS (Methode 5): R _t = 2.45 min: MS (EIpos): m/z = 832 i VI - i l l .

Ausffihrungsbeispiele ADCs

Die in den Strukturformen der Ausfuhrungsbeispiele dargestellten ADCs, die über Maleinimid- Reste an Cysteinseitenketten der Antikörper gekuppelt wurden, liegen in Abhängigkeit vom Linker und von dem Kupplungsprotokoll zum überwiegenden Teil in den jeweils dargestellten ring- geöffheten bzw. ring-gescblossenen Formen vor. Zu einem kleinen Anteil kann jedoch die jeweils andere Form in der Präparation enthalten sein.

Beispiel 104L1

40 mg Anti-B7H3AKiA in 41 24 uL ml PBS (c=9.7 mg/ml.) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.229 mg TCEP in 395 μί PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde 30min bei RT gerührt und anschließend wurden 1.72 mg (0.00027 mmol) von mtermediat F l 04 gelöst in 400 μί DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der Ansatz über mit PBS-Puffer pH 7.2 equilHbrierte PD 10-Säulen (Sephadex ^® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer pH 7.2 eluiert. Das Eluat anschließend durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert, rückverdünnt mit PBS- Puffer (pH 7.2) und erneut aufkonzentriert. Der erhaltene ADC Baten wurde folgendermaßen charakterisiert:

Protein Konzentration: 11 .67 mg ml, Drug/mAb Ratio: 3.3

Das ADC kann auch teilweise in Form der hydrolysierten offenkettigen Bernsteinsäurearnide mit de Antikörper verknüpft vorliegen.

Eingesetzt wurden hier zur Kupplung mit Intermediat F l 73 5 mg Anti-B7H3 AKIA in PBS (c=9.7 mg/mL) und der Ansatz wurde nach der Sephadex-Reinigung durch Uitrazentrifugaüon aufkonzenoiert und rückverdünnt mit PBS.

Protein Konzentration: 1.57 mg/mL Drug/mAb Ratio: 3.4

Eingesetzt wurden hier zur Kupplung mit Intermediat F194 5 mg Anti-B7H3 AKI _A in 515 μΕ PBS (c = 9.7 mg mL). Zunächst wurden 5Eq von Intermediat F194 gelöst in 50μΙ, DMSO zugesetzt und nach lh Rühren bei RT wurde nochmals die gleiche Menge hinzugefügt und der Ansatz eine weitere Stunde bei RT gerührt. Anschließend wurde der Ansatz über eine Sephadex-Säule gereinigt und dann durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS.

Protein Konzentration: 0.51 mg mL

Drug/mAb Ratio: 2.4

Eingesetzt wurden hier zur Kupplung mit Intermediat F194 5 mg Anti-B7H3 AKIB in 510 ytL PBS (c = 9.8 mg/mL). Zunächst wurden 5Eq von intermediat Fl 94 gelöst in SO-iL DMSO zugesetzt und nach lh Rühren bei RT wurde nochmals die gleiche Menge hinzugefugt und der Ansatz eine weitere Stunde bei RT gerührt. Anschließend wurde der Ansatz über eine Sephadex-Säule gereinigt und dann durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS.

Protein Konzentration: 1.02 mg/mL

Drug/mAb Ratio: 2.9

50 mg Anti-B7H3 AKIB in 4,9 mL ml PBS (0=10.2 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.287 mg TCEP in 0.5 ml PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde 30min bei RT gerührt und anschließend wurden 2.15 mg (0.00267 mmol) von Intermediat F l 04 gelöst in 500 μί DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der Ansatz mit 4100 μΐ PBS-Puffer, der zuvor auf pH 8 eingestellt wurde, verdünnt.

Diese Lösung wurde dann über mit PBS-Puffer pH8 equillibrierie PD 10-Säulen (Sephadex* G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer pH8 elutert. Das Eluat wurde mit PBS -Puffer pH 8 auf ein Gesamtvolumen von 15 ml verdünnt. Diese Lösung wurde über Nacht bei RT unter Argon gerührt und anschließend wieder mittel PD-10 Säulen auf pH 7.2 umgepuffert. Anschließend wurde durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert, rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2) und erneut auflconzen friert. Der erhaltene ADC Batch wurde folgendermaßen charakterisiert:

Protein Konzentration: 14.98 mg mL

Drug/rnAb Ratio: 2.9

5 mg Anti-B7H3 AKI _A in 516 [iL ml PBS (c=9.7 mg/mL) wurden unier Argon mit einer Lösung aus 0.029 mg TCEP in 50μ1 PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde mit 1 834 μΐ PBS -Puffer, der zuvor auf pH 8 eingestellt wurde, verdünnt und 1 h bei RT gerührt. Anschließend wurden 0.199 mg (0.00023 mmol) von Intermediat F240 gelöst in Ι ΟΟμί DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der Ansatz über mit PBS-Puffer pH8 equiilibrierte PD 10-Säulen (Sephadex* G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer pH8 eluiert. Das Eluat über Nacht bei RT unter Argon geriihrt und anschließend durch Uitrazentrifugation aufkonzentriert und riickverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2). Ein Teil des ADCs kann unter diesen Bedingungen auch in der ring- geschlossenen Form vorliegen. Der erhaltene ADC Batch wurde folgendermaßen charakteri iert: Protein Konzentration: 0.89 mg/mL

Drug/mAb Ratio: 2.7

BeisefeL OLl

5 mg Anti-B 7H3 AKJB in 510 μΐ _^ ml PBS (c=9.8 mg ^' mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.029 mg TCEP in 50μ1 PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde mit 1840 μΐ PBS-Puffer, der zuvor auf pH 8 eingestellt wurde, verdünnt und 1 h bei RT geriihrt. Anschließend wurden 0.199 mg (0.00023 mmol) von Intermediat F240 gelöst in ΙΟΟμΙ DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rüliren bei RT wurde der Ansatz über mit PBS-Puffer pH8 equiilibrierte PD 10-Säulen (Sephadex ^® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer pH 8 eluiert. Das Eluat über Nacht bei RT unter Argon gerührt und anschließend durch Uitrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2). Ein Teil des ADCs kann unter diesen Bedingungen auch in der ringgeschlossenen Form vorliegen. Der erhaltene ADC Batch wurde folgendermaßen charakterisiert: Protein Konzentration: 1.35 mg/mL

Drug/mAb Ratio: 3.5

Beispiel 257L1

5 mg Anti-B7H3 AKL _A in 516 μ]_ ml PBS (e ^~ 9.7 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.029 mg TCEP in 50μί PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde mit 1834 μΐ PBS-Puffer, der zuvor auf pH 8 eingestellt wurde, verdünnt und 1 h bei RT gerührt. Ansehließend wurden 0.250 mg (0.00023 mmol) von Intermediat F257 gelöst in ΙΟΟμΙ DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der Ansatz über mit PBS-Puffer pH8 eauillibrierte PD 10-Säulen (Sephadex* G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer pH 8 eluiert. Das Eluat über Nacht bei RT unter Argon gerührt und anschließend durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2). Ein Teil des ADCs kann unter diesen Bedingungen auch in der ringgeschlossenen Form vorliegen. Der erhaltene ADC Baten wurde folgendermaßen charakterisiert: Protein Konzentration: 0.91 mg/mL

Drug/mAb Ratio: 2.4

Beispiel 2S7L2

50 mg Anti-B7H3 AKJB in 4810 μL ml PBS (c=10.4 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.29 mg TCEP in 500μ1 PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde mit 4100 μΐ PBS- Puffer, der zuvor auf pH 8 eingestellt wurde, verdünnt und 1 h bei RT gerührt. Anschließend wurden 2.856 mg (0.007 mmol) von Intermediat F257 gelöst in 500μ1 DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rübren bei RT wurde der Ansatz über mit PBS-Puffer pH8 equillibrierte PT3 10- Säulen (Sephadex ^® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer pH8 eluiert. Das Eiuat über Nacht bei RT unter Argon gerührt und anschiießend durch Uitrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2). Ein Teil des ADCs kann unter diesen Bedingungen auch in der ring-geschlossenen Form vorliegen. Der erhaltene ADC Batch wurde folgendermaßen charakterisiert:

Protein Konzentration: 10.81 mg/mL

Drug/mAb Ratio: 4.5

Beispiel 259L1

Eingesetzt wurden hier zur Kupplung mit Intermediat F259 5 mg Anti-B7H3 AKIA in 515 μΕ PBS (c=9.7 mg/mL). Die Reduktionszeit des Antikörpers betrug 30 min und nach Zusatz von 0.245 mg (0.267 μιηοΐ) F259 wurde der Ansatz 20 h bei RT gerührt und anschließend über Sephadex gereinigt. Schließlich wurde mittels Uitrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS.

Protein Konzentration: 1.43 mg/mL

Drug/mAb Ratio: 3.0

5 mg Anti-B7H3 AKm in 510 ,iiL ml PBS (c= 9.8 mg/iriL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0,029 mg TCEP in 50μί PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde 30min bei RT gerührt und anschließend wurden 0.302 mg (0.00027 mmol) von Iniermediat F260 gelöst in 50μ1 DMSO zugegeben. Nach wetteren 90 min Ruhren bei RT wurde der Ansatz mit 1890 μΐ PBS-Puffer, der zuvor auf pH 8 eingestellt wurde, verdünnt.

Diese Lösung wurde dann über mit PBS-Puffer pH8 equillibrierte PD 10-Säulen (Sephadex* G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer pH8 eluiert. Das Eluat wurde über Nacht bei RT unter Argon gerührt und anschließend durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2). Ein Teil des ADCs kann unter diesen Bedingungen auch in der ringgeschlossenen Form vorliegen. Der erhaltene ADC Batch wurde folgendermaßen charakterisiert:

Protein Konzentration: 1.05 mg/mL

Drug/m Ab Ratio: 3.6

5 mg Anü-B7H3 AKm in 481 ,uL ml PBS (c=10.4 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.029 mg TCEP in 50μ1 PBS-Puffer versetzt und 30 min bei RT geriihrt.. Anschließend wurden 0.209 mg (0.00023 mmol) von Intermediat F263 gelöst in 50μ1 DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der Ansatz mit 1910 μΐ PBS-Puffer, der zuvor auf pH 8 eingestellt, verdünnt und über mit PBS-Puffer pH8 equillibrierte PD 10-Säuien (Sephadex ^® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer pH8 eiuiert. Das Eluat über Nacht bei RT unter Argon gerührt und anschließend durch IJltrazentri gation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS- Puffer (pH 7.2). Ein Teil des ADCs kann unter diesen Bedingungen auch in der ring-geschiossenen Form vorliegen. Der erhaltene ADC Batch wurde folgendermaßen charakterisiert:

Protein Konzentration: 1.50 mg/ml,

Drug/mAb Ratio: 3.6

5 mg Anti-B7H3 AKIA in 516 μΐ, ml PBS (0=9.7 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.029 g TCEP in 50μ1 PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde mit 1 834 μΐ PBS-Puffer, der zuvor auf pH 8 eingestellt wurde, verdünnt und 1 h bei RT gerührt. Anschließend wurden 0.188 mg (0.00023 mmol) von mtermediat F270 gelöst in Ι ΟΟμί DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der Ansatz über mit PBS-Puffer pH8 equillibrierte PD 10-Säulen (Sephadex ^® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer pH8 eluiert. Das Eluat über Nacht bei RT unter Argon gerührt und anschließend durch Uitrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2). Ein Teil des ADCs kann unter diesen Bedingungen auch in der Ring- geschlossenen Form vorliegen. Der erhaltene ADC Batch wurde folgendermaßen charakterisiert: Protein Konzentration: 1.02 mg/mL

Drug/mAb Ratio: 2,8

5 mg Anti-B7H3 AKI _A in 516 μΙ> !rii PBS (c=9.7 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.029 mg TCEP in 50μ1 PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde mit 1834 μΐ PBS -Puffer, der zuvor auf pH 8 eingestellt wurde, verdünnt und 1 h bei RT gerührt. Anschließend wurden 0.232 mg (0.00023 mmol) von Intermediat F274 gelöst in Ι ΟΟμΙ DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rüliren bei RT wurde der Ansatz über mit PBS-Puffer pH8 equillibrierte PD 10-Säulen (Sephadex ^® G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer pH 8 eluiert. Das Eluat über Nacht bei RT unter Argon gerührt und anschließend durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2). Ein Teil des ADCs kann unter diesen Bedingungen auch in der Ring- geschlossenen Form vorliegen. Der erhaltene ADC Baten wurde folgendermaßen charakterisiert: Protein Konzentration: 1.13 mg/mL

Drug/mAb Ratio: 2.9

Γ75

5 mg Anti-B7H3 A m in 510 p,L ml PBS (c= 9.8 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.029 mg TCEP in 50μ1 PBS-Puffer versetzt. Der Ansatz wurde mit 1840 μΐ PBS-Puffer, der zuvor auf pH 8 eingestellt wurde, verdünnt und 1 b bei RT gerührt. Anschließend wurden 0.229 mg (0.00023 mmol) von Intermediat F275 gelöst in ΙΟΟμΙ DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der Ansatz über mit PBS-Puffer pH8 equillibrierte PD 10-Säulen (Sephadex* G-25, GE Healthcare) gegeben und mit PBS-Puffer pH.8 eluiert. Das Eluat über Nacht bei RT unter Argon gerührt und anschließend durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2). Ein Teil des ADCs kann unter diesen Bedingungen auch in der Ring- geschlossenen Fonn vorliegen. Der erhaltene ADC Batch wurde folgendermaßen charakterisiert: Protein Konzentration: 1.18 mg/mL

Drug/mAb Ratio: 3.8

Eingesetzt wurden hier zur Kupplung mit intemiediat F281 5 mg Anti-B7H3 AKIB in 51 0 μΕ PBS bei pH 7.2 (c=9.8 mg/mL). Die Rediiktionszeii des Antikörpers in Gegenwart von 0.029 mg TCEP betrug 30 min. Dann wurde der Ansatz nach Zusatz von 0.22 mg (0.23 μιηοΐ) F281 in 50 μΙ> DMSO 20 h bei RT gerührt und anschließend über Sephadex gereinigt,. Schließlich wurde mitteis Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS.

Protein Konzentration: 1.32 mg/ml.

Drug/rnAb Ratio: 2.4

Γ77

Beispiel 284L2

5 mg Anti-B7H3 AKm iti 510 μΕ ml PBS (c=9.8 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.029 mg TCEP in 50μ1 PBS-Puffer versetzt und 30 min bei RT gerührt. Anschließend mirden 0,26 mg (0.23 μιηοΐ) von Intermediat F284 gelöst in 50μί DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der Ansatz mit PBS-Puffer pH 8 auf 2.5 ml aufgefüllt und über eine mit PBS Puffer pH8 equillibrierte PD 10-Säule (Sephadex ^® G-25, GE Healthcare) gegeben, mit PBS- Puffer pH 8 eluiert und anschließend über Nacht bei RT gerührt. Das Eluat wurde anschließend durch Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2). Der erhaltene ADC Batch wurde folgendermaßen charakterisiert:

Protein Konzentration: 1.34 mg/mL

Drug/mAb Ratio: 3.0

5 mg Anti-B7H3 AKm in 510 μί ml PBS (c=9.8 mg/mL) wurden unter Argon mit einer Lösung aus 0.029 mg TCEP in 50μ1 PBS-Puffer versetzt und 30 min bei RT gerührt. Anschließend wurden 0,21 mg (0.23 μτηοΐ) von Intermediat F296 gelöst in 50μΙ DMSO zugegeben. Nach weiteren 90 min Rühren bei RT wurde der Ansatz mit PBS-Puffer pH 8 auf 2.5 ml aufgefüllt und über eine mit PBS Puffer pH8 equillibrierte PD 10-Säule (Sephadex ^® G-25, GE Healthcare) gegeben, mit PBS- Puffer pH 8 eluiert und anschließend über Nacht bei RT unter Argon gerührt. Das Eluat wurde anschließend durch Ultrazentrifugalion aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS-Puffer (pH 7.2). Der erhaltene ADC Batch wurde folgendermaßen charakterisiert:

Protein Konzentration: 1.31 mg/mL

Drug/m Ab Ratio: 3.2

Beispiel 297L1 (Isomer 1)

Eingesetzt wurden hier zur Kupplung mit Intermediat F297 5 mg Anti-B 7H3 AK _]A in 510 μΐ, PBS bei pH 7.2 (c= 9.7 mg/mL). Die Reduktionszeit des Antikörpers in Gegenwart von 0.029 mg TCEP betrug 30 min. Dann wurde der Ansatz nach Zusatz von 0.23 mg (0.26 μτηοΐ) F297 in 50 μΕ DMSO, 2 h bei RT gemhrt und anschließend über Sephadex gereinigt. Schließlich wurde mittels Ultrazentrifugation aufkonzentriert und rückverdünnt mit PBS.

Protein Konzentration: 0.97 mg/mL

Drug/mAb Ratio: 2.4

Beispiel 297L2 (Isomer 1)

Eingesetzt wurden hier zur Kupplung mit Intermediat F297 5 mg Anti-B7H3 AKIB in 515 xL PBS bei pH 7.2 (c= 9.8 mg/mL). Die Reduktionszeit des Antikörpers in Gegenwart von 0.029 mg TCEP betrug 30 min. Dann wurde der Ansatz nach Zusatz von 0.23 mg (0.26 μιηοί) F297 in 50 yL DMSO, 2 h bei RT gerührt und anschließend über Sephadex gereinigt. Schließlich wurde mitteis Ultrazentrifugation aurkonzentriert und mckverdünnt mit PBS.

Protein Konzentration: 1.43 mg/mL

Drug/inAb Ratio: 3.1

C: Bewertung der biologischen Wirksamkeit

Die biologische Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindungen kann durch die nachstehend beschriebenen Assays gezeigt werden:

Die Analyse der cytoto toxi sehen Wirkung der Anti-B7H3-ADCs erfolgt auf verschiedenen Zelllinien:

A498: humane Niereiikarzmomzellen, ATCC-CRL-HTB-44, Standardmedium: RPMT 1640; (Biochrom; # FG 1215, mit stabilem Glutamin) + 10% FCS (Biochrom; # S0415), B7H3 positiv.

MCF-7: humane Brustkrebszellen, Standardmedium: RPMI 1640; (Biochrom; # F 1275, ohne Phenolrot) + E2 (final: 1E-10M; ß-estradioi, Sigma # E2758 oder ZK 5018 im CLL) + 10% CCS, + 2m Units/ml Insulin (bovine, Biochrom; # K 3510) + L-Alanyl-L-Glutamine; (final: 2mM, Bioclirom; # K 0302), B7H3 positiv.

Caki-2: humane Nierenkarzinomzellen, ATCC-HTB-27, Standardmedium: DMEM / Ham's F12 (#FG4815, Biochrom AG) + 10% FCS (#F2442, Sigma), B7H3 positiv.

Raji: humane Burkitfs Lymphomzellen, DMSZ-ACC-319, Standardmedium: RPMI 1640; (Biochrom; ff FG 1215, mit stabilem Glutamin) + 10% FCS (Bioclirom; ff S0415), B7H3 negativ.

NCI-H292: humane mukoepidermoide Lungenkarzinomzellen, ATCC-CRL-1848, Standardmedium: RPMI 1640 (BiochiOm; #FG1215, siab. Glutamin) + 10% FCS (Bioclirom; #S0415).

Kultivierung der Zellen erfolgt nach Standard-Methode, wie bei der American Tissue Cuiture Coilection (ATCC) für die jeweiligen Zeillinien angegeben.

CTG-Assay

Die Kultivierung der Zellen erfolgte nach StandardMethode, mit den unter C-i angegebenen Wachstumsmedien. Zur Diirchffihrung wurden die Zellen mit einer Lösung von Trypsin (0.05%) und EDTA (0.02%) in PBS (Biochrom AG #L2343) abgelöst, pelletiert, in Kulturmedium resuspendiert, gezählt und in eine 96-Loch Kuiturplatte mit weissem Boden (Costar #3610) ausgesät (in 75μ3/1.οώ, folgende Zeilzahlen je Loch: NCI-H292: 2500 Zellen/ Loch, BxPC3 2500 Zeilen / Loch) und im Bratschrank bei 37°C und 5% Kohlendioxid inkubiert. Nach 24h wuixlen die in 25 μΐ Kulturmedium (vierfach konzentriert) auf die Zellen gegeben, so dass finale Konzentrationen der Antikörper-Witkstoffkonjugate von 3 x 10 ^" ' M bis 3 x 10 ^' " M auf den Zellen erreicht wurden (Triplikate). Anschließend wurden die Zeilen im Brutschrank bei 37°C und 5% Kohlendioxid inkubiert. In einer parallelen Platte wurde die Zellvitalität zu Beginn der Wirkstoffbehandlung (Tag 0) mit dem Cell Titer Glow (CTG) Luminescent Cell Viability Assay (Promega #07573 und #G7571) bestimmt. Dazu wurden pro Zeilansatz 1 ΟΟμΙ des Substrats hinzugefügt, die Platten anschließend mit Alufolie abgedeckt, für 2 Minuten mit dem Plattenschüttier bei 180 rpm geschüttelt, für 8 Minuten auf der Laborbank stehen gelassen und dann mit einem Luminometer (Victor X2, Perkin Elmer) gemessen. Das Substrat detektiert den ATP-Gehalt in den lebenden Zellen, wobei ein Lumineszenz-Signal erzeugt wird, dessen Höhe direkt proportional zur Vitalität der Zellen ist. Nach 72h Inkubation mit den Antikö-per-Wirkstoffkonjugaten wurde nun auch in diesen Zellen die Vitalität mit dem Cell Titer Glow Luminescent Cell Viability Assay wie oben beschrieben bestimmt. Aus den gemessenen Daten wurde die ICso der Wachstumshemmung im Vergleich zum Tag 0 unter Verwendung des DRC (Dose Response Curve) Analysis Spreadsheets anhand einer 4-Parameter Anpassung berechnet. Das DRC Analysis Spreadsheet ist ein von Bayer Pharma AG und Bayer Business Services auf der Plattform 1DBS E-WorkBook Suite entwickeltes Biobook Spreadsheet (IDBS: ID Business Solutions Ltd., Guildford, UK).

In der folgenden Tabelle la sind die lCso-Werte repräsentativer .Ausführungsbeispiele mit dem Anti-B7H3-Antikörper aus diesem Assay aufgeführt:

Tabelle la

Ä498 SViCF-7 Raji

!C _5ß [M] !C ₅₀ IM] !C ₅₀ [IV!] !C ₅₀ IM]

CTG CTG CTG CTG

173L1 6.00E-7 4,98E-09 6.00E-7

194L2 3,57E-10 2 _. .08E-10 2,75E-1G l,31E-7 208L2 8,91E-10 2 _. .42E-10 5,99E-9 l,14E-7

240L1 2,35E-Q9 7 _. .25E-10 9,97E-08

257L2 1,16E-10 7,37E-11 1.50E-11 8,75E-08

270L1 6.GQE-7 7 _. .00E-08 6.00E-7

263L2 <3.0E-11 2 _. .49E-10 >3.0E-7 l,13E-07

194L1 6 _. .43E-10 >3,00E-7

257L1 4 _. .49E-10 l,17E-7

259L1 4 _. .57E-9 >3,00E-7

260L2 2 _. .15E-10 >3,00E-7

284L2 7 _. .02E-10 >3,00E-7

274L1 1.86E-9 l,15E-7

297L1 8 _. .93E-9 l,41E-7

297L2 >3,00E-7 7 _. .56E-10 >3,QGE-7 l,20E-7

240L2 · ^■ 7 _. .49E-10 1.58E-10 • >3,GQE-7 5,44E-8

275L2 · ^■ >3,00E-7 9 _. .15E-11 • >3,GQE-7 8,18E-8

257L2 · ^■ 1.37E-10 8 _. .63E-11 • <3,GQE-11 6,65E-8

296L2 · ^■ 6 _. .22E-10 1.63E-10 • >3,GQE-7 1,05E-7

281L2 · ^■ 1.39E-08 3 _. .42E-8 • 5,26E-9 >3,00E-7

M09 1.65E-11 1.50E-11 9.75E-11 1.50E-11 Die angegebenen Wirkdaten beziehen sieh auf die im vorliegenden experimentellen Tei beschriebenen Ausführungsbeispiele mit den angegebenen Drug''mAB-Ratios. Die Werte können bei anderen Drug/mAB-Ratios gegebenenfalls abweichen. Bei den IC50-Werten handelt es sich um Mittelwerte aus mehreren unabhängigen Experimenten oder um Einfachwerte. Die Wirkung der B7H3- Antikörper- Wirkstoffkonjugate war selektiv versus der jeweiligen Isotypkontrolle, die den jeweils entsprechenden Linker und Toxophor enthielt und targetspezifisch versus nicht-B7H3- exprimierenden Tumorzellen. Die unkonjugierten B7H3-Antikörper zeigten ebenfalls keine Wirkung in den oben genannten Zellinien.

MTT-Assay

Die Kultivierung der Zellen erfolgte nach Standardmethode, mit den unter C-1 angegebenen Wachstumsmedien. Zur Durchführung wurden die Zellen mit einer Lösung von Accutase in PBS (Fa. Biochrom AG #L2143) abgelöst, pelletiert, in Kulturmedium resuspendiert, gezählt und in eine 96-Loch Kulturplatte mit weißem Boden (Fa. Costar #3610) ausgesät (NCI H292: 2500 Zellen/well in ΙΟΟμί Gesamtvolumen). Anschließend wurden die Zellen im Brutschrank bei 37°C und 5% Kohlendioxid inkubiert. Nach 48h wurde ein Mediumwechsel durchgeführt. Dann wurden die Metaboliten in Ι Ομϊ- Kulturmedium in Konzentrationen von 10 ^'5 M bis 10 ^"!3 M zu den Zellen (Triplikate) pipettiert, bevor der Ansatz im Brutschrank bei 37°C und 5% Kohlendioxid inkubierte. Nach 96h erfolgte die Detektion der Zellproiiferation mit Hilfe des MTT-Assays (ATCC, Manassas, Virginia, USA, Katalog-Nr. 30-1010K). Hierzu wurde das MTT Reagens für 4h mit den Zellen inkubiert, bevor durch Zugabe des Detergenzes die Lyse der Zellen über Nacht erfolgte. Die Detektion des gebildeten Farbstoffs erfolgte bei 570nm (Infinite Ml 000 pro, Fa. Tecan). Aus den gemessenen Daten wurde der ICso- Wert der Wachstumshemmung unter Verwendung der DRC (Dose Response Curve) berechnet. Die ProHferation ohne Testsubstanz, aber ansonsten identisch behandelten Zellen, wird als 100% Wert definiert.

sestimmung _. der uinibition des inesinspindelproteuis Kar/ ü,gs durcii ausgewanlte

Die Motordomäne des humanen Kinesinspindelproteins KSP Eg5 (Fa. tebu-bio/ Cytoskeieton Ine, No. 027EG01 -XL) wurde in einer Konzentration von ΙΟηΜ mit 50 μ&' ^η ύ Taxol (Fa. Sigma No. T7191-5MG) stabilisierten Microtubuli (bovine oder porcine, Fa. tebu-bio/ Cytoskeleton Inc) für 5 ■nin bei RT in 15mM PT.PES, pH 6,8 (5mM MgCi ₂ und l ömM DTT, Fa. Sigma) inkubiert. Die frisch hergestellte Mischung wurde in eine 384 MTP (Fa. Greiner bio-one REF 781096) aliquotiert. Es folgte die Zugabe der zu untersuchenden Inhibitoren in Konzentration von 1.0 xI 0-6M bis 1.0x 10-13M und ATP (finale Konzentration 500μΜ; Fa. Sigma). Die Inkubation erfolgte über 2h bei RT. Die ATPase-Aktivität wurde durch den Nachweis des entstehenden anorganischen Phosphats mit Malachit -Grün detektiert (Fa. Biomol). Nach der Zugabe des Reagenz erfolgte eine 50min Inkubation bei RT, bevor die Detektion der Absorption bei einer Wellenlänge von 620nm erfolgte. Als Positivkontrolle wurden Monastrol (Fa. Sigma, M8515-lmg) und Ispinesib (Fa. AdooQ Bioscience A10486) verwendet. Die Einzeldaten der Dosis-Wirkungskurve stellen achtfach Bestimmungen dar. Bei den ICso-Werten handelt es sich um Mittelwerte aus zwei unabhängigen Experimenten. Als 100% Kontrolle diente die nicht mit Inhibitoren behandelte Probe.

In der folgenden Tabelle 2 sind die ICso-Werte repräsentativer Ausfuhrungsbeispiele aus dem beschriebenen Assay aufgeführt sowie die korrespondierenden zytotoxischen Daten (MTT-Assay).

Tabelle 2

NCI-H292 KPL4

Beispiele KSP-Assay

ICso [M] ICso [M] ICso |.Mj ^"

MTT Assay MTT Assay

Ml 2.01E-09 5.00E-07 5.00E-07

M2 2.45E-09 2.04E-07 1.63E-07

M3 1.52E-09 3.21E-08 9.00E-08

M4 2.73 E-10 4.43E-08 1.76E-07

M5 4.57E-10 7.94E-08 2.22E-07

M6 1.78E-09 4.63E-08 1.93E-07

M7 6.21 E-10 2.22E-08 9.25E-08

M9 1.07E-09 7.74E-10 2.57E-10

MI O 4.70E-10 3.03E-07 2.26E-07

Ml 1 1.1 1E-09 4.32E-1 1

M12 4.46E-10 3.3E-08

Ml 3 1 .50E-09 1.52E-07 1.69E-07

Ml 4 2.16E-09 1 .74E-07 1.82E-07

M l 5 9.64E-10 1.33E-07 1.69E-07

Ml 6 1.48E-09 1 .43E-07 1.95E-07 Ml 7 4.17E-09 7.35E-09

Ml 8 5.17E-09 3.55E-08

MI 9 2.58E-09 1.21E-07

M20 1.14E-07

M21 2.31E-09

M22 8.27E-10 2.89E-08 1.82E-07

M23 1.26E-09 5.00E-07 5.00E-07

M24 2.90E-09 i .67E-07 5.00E-07

M25 2.91E-09 5.00E-07 5.00E-07

M26 9.441E-10 6.38E-08

M27 2.03E-09 2.76E-07

Die angegebenen Wirkdaten bezieben sich auf die im vorliegenden experimentellen Teil beschriebenen Ausfühnmgsbeispieie.

C-2 Interiialisieruiigsassav

Internalisierung ist der Schüsselprozess, um eine spezifische und effiziente Bereitstellung der zytotoxischen Payload in Antigen-exprimierenden Krebszellen durch Antikörper-Drug-Konjugate (ADC) zu ermöglichen. Dieser Prozess wird über Fluoreszenzmarkierung von spezifischen B7H3- Antikörpern und einen Isotyp-Kontrollantikörper verfolgt. Hierzu wird zunächst die Konjugation des Fluoreszenzfarbstoffes an Lysine des Antikörpers durchgeführt. Die Konjugation erfolgt mit zweifach molarem Überschuss von CypHer 5E mono NHS ester (Batch 357392, GE Healthcare) bei pH 8, 3. Nach erfolgter Kupplung wurde die Reaktionsmischling gelchromatographisch aufgereinigt (Zeba Spin Desaiting Columns, 40K, Fa. Thermo Scientific, No. 87768:

Elutionspuffer: DULBECCO ^' S PBS, Fa. Sima-Aldrich, No. D8537), um überschüssigen Farbstoff zu eliminieren und den pH- Wert zu adjustieren. Die Ankonzentrierung der Proteinlösung erfoigte mittels VIVASPIN 500 Säulen (Fa Sartorius stedim biotec). Die Bestimmung der dye load des Antikörpers erfolgt mittels spektrophotometrischer Analyse (Fa. NanoDrop) und anschließender Berechnung (D: P = Ad _ye 8p _r oidn:(A2so- ,16Ady _e )8d _y e).

Die dye load des hier untersuchten B7H3 -Antikörpers sowie der Isotyp-Kontrolle lagen in vergleichbarer Größenordnung. In Zellbindungs-Assays wurde getestet, dass die Konjugation zu keiner Affinitätsänderung des Antikörpers führte. Die markierten Antikörper werden im Internalisierungs-Assays eingesetzt. Vor de Behandlungs Start wurden Zellen (2xl0 /well) in ΙΟΟμΙ, Medium in einer 96-MTP ausgesät (fat, black, clear bottom No 4308776, Fa. Applied Biosystems). Nach 18h Inkubation bei 37°C/5 /OCO2 wurde das Medium gewechselt und markierte Anti-B7H3 -Antikörper in variierender Konzentration hinzugefugt (10, 5, 2.5, 1, 0.1 ng/mL). Das gleiche Behandlungssehema erfolgte mit der markierten Isotyp-Kontrolle (negative control). Die gewählten Inkubationszeiten warenOh, 0,25h, 0,5h, 1h, 1,5h 2h, 3h, 6h and 24h. Die Fluoreszenz- Messung wurde mit Hilfe des InCellAnalyzer 1000 (Fa. GE Healthcare) durchgeführt. Es erfolgte eine kinetische Evaluierung über die Messung der Parameter granule counts/cell und totale granule intens ity/cell.

B7H3 -Antikörper wurden nach Bindung an B7H3 auf ihre Internalisierungsfahigkeit hin untersucht. Hierzu wurden zwei verschiedene B7H3-exprimierende Zelllinien (A498, 786-0 gewählt. Es konnte Target-vermittelte spezifische Intemalisierung mit den B7H3-Antikörpem beobachtet werden, wohingegen die Isotyp-Kontrolle keine Intemalisierung zeigte (Beispiel A498- Zellen Figur 2).

C-3 Injjtro Tests^ur Besttm

Die Zell-Permeabilität einer Substanz kann mittels in v iro-Testung in einem Flux-Assay unter Verwendung von Caco-2-Zellen untersucht werden [M.D. Troutman und D.R. Thakker, Pharm. Res. 20 (8), 1210-1224 (2003)]. Hierzu wurden die Zellen auf 24-Loch-Filterpiatten für 15-16 Tage kultiviert. Zur Bestimmung der Permeation wurde die jeweilige Testsubstanz in einem HEPES- Puffer entweder apikal (A) oder basal (B) auf die Zellen gegeben und für 2 h inkubiert. Nach 0 h und nach 2 h wurden Proben aus den Cis- und Transkompartimenten entnommen. Die Proben wurden mittels HPLC (Agilent 1200, Böblingen, Deutschland) unter Verwendung von reverse phase- Säulen aufgetrennt. Das HPLC-System war über ein Turbo Ion Spray-Interface an ein Triple Qua- dropol-Massenspektrometer API 4000 (AB SCIEX Deutschland GmbH, Darmstadt, Deutschland) gekoppelt. Die Permeabilität wurde anhand eines Pap - Wertes bewertet, weicher mittels der von Schwab et al. publizierten Formel berechnet wurde [D. Schwab et ed., J. Med. Chem. 46, 1716- 1725 (2003)]. Eine Substanz wurde als aktiv transportiert klassifiziert, wenn das Verhältnis von Papp (B-A) zu Papp (A-B) (efflux ratio) >2 oder <0.5 war.

Von entscheidender Bedeutung für Toxophore, die intrazellulär freigesetzt werden, sind die Permeabilität von B nach A [P _app (B-A)] und das Verhältnis von P _app (B-A) zu P _app (A-B) (efflux ratio): Je niedriger diese Permeabilität ist, desto langsamer sind die aktiven und passiven Transportvorgänge der Substanz durch die Monoschicht von Caco-2-Zellen. Gibt das efflux ratio zudem keine Hinweise auf aktiven Transport, kann die Substanz nach intrazellulärer Freisetzung länger in der Zelle verweilen. Damit steigt auch die Zeit, die für eine Interaktion mit dem biochemischen Target (hier: Kinesin-Spindelprotein, KSP / Eg5) zur Verfugung steht.

In der folgenden Tabelle 5 sind Permeabilitätsdaten repräsentativer Ausfuhrungsbei spiele aus diesem Assay aufgeführt:

Tabelle 3

Ausführungsbeispiel a ( -A Efflux ratio

[nm/s]

Ml 7.8 4

M2 4.8 6.4

M3 1.4 1.3

M4 21.3 18.7

M5 20.3 26.5

M6 1.7 0.7

M7 5.6 2 2

M9 213 16

Ml l 24.3 27.7

Ml 2 3.3 1.8

Ml 3 7.1 3.6

Ml 4 12.7 6.6

Ml 5 6.4 4.4

M l 6 9.0 7.0

Ml 7 93.6 81.5

M18 1.6 2.9

Ml 9 1.9 2.9

M21 0.5 1.5

M22 0.9 0.9

M23 2.8 2.0

M24 3.9 1.0

M25 8.1 3.6

M26 13.0 9.6 Aiisführangsbeispie! Papp (B-A) Efilux ratio

[nm/s]

M27 13.2 9

Viele Tumorzellen exprimieren Transporterproteine für Wirkstoffe, was häufig mit einer Resistenzentwicklung gegenüber Cytostatika einhergeht. Substanzen, die keine Substrate von solchen Transporterproteinen wie beispielsweise P-Glycoprotein (P-gp) oder BCRP sind, könnten somit ein verbessertes Wirkprofil aufzeigen.

Die Substrateigenschaften einer Substanz für P-gp (ABCBl ) wurden mittels eines Flux-Assays unter Verwendung von LLC-PK1 -Zellen, die P-gp überexprimieren (L-MDR1 -Zeilen), bestimmt [A.H. Schinkel et al., J. Clin. luvest. 96, 1698-1705 (1995)]. Hierzu wurden die LLC-PK1- oder L-MDR1 -Zeilen auf 96-Loch-Filterplatten für 3-4 Tage kultiviert. Zur Bestimmung der Permeation wurde die jeweilige Testsubstanz allein oder in Gegenwart eines Inhibitors (wie z.B. Ivermectin oder Verapamil) in einem HEPES-Puffer entweder apikal (A) oder basal (ß) auf die Zellen gegeben und für 2 h inkubiert. Nach 0 h und nach 2 h wurden Proben aus den Cis- und Transkompar- timenten entnommen. Die Proben wurden mittels HPLC unter Verwendung von reverse phase- Säuien aufgetrennt. Das HPLC-System war über ein Turbo Ion Spray-Interface an ein Triple Qua- dropol-Massenspektrometer API 3000 (Applied Biosystems Applera, Darmstadt, Deutschland) gekoppelt. Die Permeabilität wurde anhand eines P _apP - Wertes bewertet, welcher mittels der von Schwab et al. publizierten Formel berechnet wurde [D. Schwab et al., J. Med. Chem. 46, 1716- 1725 (2003)]. Eine Substanz wurde als P-gp-Substrat klassifiziert, wenn das Efflux-Verhältnis P _app (B-A) zu Papp (A-B) >2 war.

Als weitere Kriterien zur Bewertung der P-gp-Substrateige schatten können die Efilux- Verhältnisse in L-MDR1- und LLC-PK1 -Zellen oder das Efflux-Verhältnis in An- oder Abwesenheit eines Inhibitors miteinander verglichen werden. Wenn sich diese Werte um mehr als einen Faktor 2 unterscheiden, so handelt es sich bei der betreffenden Substanz um ein P-gp-Substrat. C-6 Wirksamkeitstest in vivo

Die Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Konjugale wurde in vivo beispielsweise mittels Xenograft-Modellen getestet. Der Fachmann kennt Methoden im Stand der Technik, anhand derer die Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Verbindungen getestet werden kann (siehe z.B. WO 2005/081711; Polson et al, Cancer Res. 2009 Mar 15;69(6):2358-64). Beispielsweise wurde hierzu Nagern (z.B. Mäusen) eine Tumorzelllinie, welche das Zielmolekül des Binders exprimiert, implantiert. Anschließend wurde den Implantat-Tieren entweder ein erfindungsgemäßes Konjugal, ein Ιβοίγ -Αη^δφβτ-ΚοηΙτοΙΗίθ^υ^ίβ oder ein Kontrollantikörper oder isotonische Salzlösung appliziert. Die Applikation erfolgte einmalig oder öfter. Nach einer Inkubationszeit von mehreren Tagen wurde die Tumorgröße im Vergleich von Konjugat-behandelten Tieren und der Kontrollgruppe bestimmt. Die Konjugat-behandelten Tiere zeigten eine geringere Tumorgröße.

C-6a. Wachstumshemmung / Regression von experimentellen Tumoren in der Maus

Humane Tumorzellen, die das Antigen für das exprimieren, werden subkutan in die Flanke von immunsupprimierten Mäusen inokuliert, beispielsweise NMRi Nudeoder SCID-Mäuse. 1 -10 Millionen Zeilen werden aus der Zellkuitur abgelöst, zentrifugiert und mit Medium oder Medium / Matrigel resuspendiert. Die Zellsuspension wird unter die Haut der Maus gespritzt.

Innerhalb von einigen Tagen wächst ein Tumor heran. Die Behandlung beginnt nach Etablierung des Tumors, ungefähr bei einer Tumorgröße von 40 mm ² . Um die Wirkung auf größere Tumoren zu untersuchen, kann die Behandlung auch erst bei einer Tumorgröße von 50-100 mm ² begonnen werden.

Die Behandlung mit ADCs erfolgt über die intravenöse (i.v.) Route in die Schwanzvene der Maus. Das ADC wird mit einem Volumen von 5 inL / kg appliziert.

Das Behandlungsschema richtet sich nach der Pharmakokinetik des Antikörpers. Als Standard wird drei Mal in Folge jeden vierten Tag behandelt. Bei langsam wachsenden Tumoren bietet sich eine wöchentliche Behandlung an. Für eine zeitnahe Beurteilung kann sich auch ein Schema mit einer Einmalbehandlung eignen. Die Behandlung kann aber auch weiter fortgesetzt werden oder es kann sich zu einem späteren Zeitpunkt ein zweiter Zyklus mit drei Behandlungstagen anschließen. Standardmäßig werden 8 Tiere pro Behandhmgsgruppe eingesetzt. Neben den Gruppen, die die Wirksubstanzen bekommen, wird eine Gmppe als Kontroligruppe nur mit dem Puffer nach dem gleichen Schema behandelt. im Verlauf des Experiments wird die Tumorfläche regelmäßig mit einer Schieblehre in zwei Dimensionen (Länge / Breite) gemessen. Die Tumorfläche wird mittels Länge x Breite bestimmt. Der Vergleich der mittleren Tumorfläche der Behandlungsgruppe mit der Kontroligruppe wird als T ^' /C area angegeben.

Werden alle Gruppen des Experimentes nach Behandlungsende gleichzeitig beendet, können die Tumore entnommen und gewogen werden. Der Vergleich der mittleren Tumorgewichte der Behandlungsgruppe mit der Kontroligruppe wird als T/C weight angegeben.

C-6b. Wirksamkeit der Anti-B7H3 Antikörper-Wirkstoffkonjugate in verschiedenen Tumormodellen

Die Tumorzellen werden subkutan in die Flanke von weiblichen NMRI-nude Mäusen (Janvier) inokuliert. Bei einer Tumorgröße von ~40 mm ² wird intravenös mit dem Antikör er- Wirkstoffkon ugat behandelt. Im Anschiuss an die Behandlung wird das Tumorwachstum ggf. weiterverfolgt.

Die Behandlung mit den Anti-B7H3 Antikör er- Wirksto ffkonj ugaten führt zu einer deutlichen und lang anhaltenden Wachstumshemmung der Tumore im Vergleich zur Kontroligruppe und dem iinkonjugierten Anti-B7H3 Antikörper. Die Tabelle 8 gibt die optimalen T ^' /C Werte an, ermittelt über die Tumorfläche am jeweiligen Tag gerechnet nach Behandlungsstart.

Tabelle 8:

Beispiel Tumor Modell Dosis Dosisseheina T/Copi area

104L1 A498 5 mg/kg Q4dx3 0,62 (Dl 5)

208L2 A498 10 mg/kg Q7dx3 0,49 (Dl 4)

257L2 0,60 (Dl 4)

2081,2 MCF-7 10 mg/kg Q7dx4 0,67 (D24)

257L2 0,44 (D24)

2081,2 Caki-2 10 mg/kg Q7dx4 0,65 (D24)

257L2 0,59 (D24) AK-BEISPIEL 1: TPP5706 imd seine humanisierten Derivate

TPP5706 wurde wie oben besehrieben synthetisiert. Die Bindung von TPP5706 an humanes B7H3 sowie an humanes B7H2 und B7H4 wurde mithilfe von ELISAs charakterisiert. Schwarze 384er MaxisorpPlatten (Nunc) wurden mit einem anti-human IgG Fe (Sigma, Ϊ2316; 1 :440 Verdünnung) in einfach coating Puffer (Candor) für eine Stunde bei 37 Grad Celsius gecoatet. Nach einmaligem waschen mit PBS, 0.05% Tween wurde die Platte mit 300% Smart Block (Candor) für eine Stunde bei 37 Grad Celsius geblockt. Anschliessend wurde der zu testende Antikörper (z.B. TPP5706 oder eines seiner Derivate) an die Platte gebunden (2μ^Ίη1 IgG in PBS, 0.05% Tween, 10% Smart Block; 1 Stunde, Raumtemperatur). Nach dreimaligem Waschen wurden die Platte mit de relevanten Antigen oder nur mit Puffer inkubiert (37ng/ml in PBS, 0.05% Tween, 10% Smart block; B7H2: RnDSystems, 8206-B7; B7H3: RnDSystems, 2318-B3-050/CF; B7H4: RnDSystems, 6576-B7; 1 Stunde, Raumtemperatur). Nach dreimaligem Waschen wurde die Platte mit einem anti-His HRP Antikörper inkubiert (Novagen, 71840-3; 1 : 10000 Verdünnung; 1 Stunde, Raumtemperatur). Nach dreimaligem Waschen wurde die Platte 30 Minuten mit Amplex Red inkubiert und anschliessend ausgelesen. Die Daten in Tabelle AK-1 zeigen, dass TPP5706 B7H3, aber nicht B7H2 oder B7H4 bindet.

Tabelle AK-1: Bindung von TPP5706 und TPP3803 an B7H2, B7H3 und B7H4

Aufgrund seiner spezifischen Bindung an B7H3 ist TPP5706 ein geeigneter Kandidat für die Entwicklung von Therapeutika zur Behandlung von Krankheiten und anderen Beeinträchtigungen, in welche B7H3-exprimierende Zellen involviert sind. Da der Antikörper murinen Urspnmgs ist, wurde er unter Anwendung von Standardmethoden humanisiert (siehe z.B. Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13 : 1619-1633 (2008)). Besonders TPP6642 und TPP6850 sind für eine weitere Optimierung geeignet, da ihre Bindung an B7H3 weitgehend unbeeinträchtigt ist (Tab. AK-2). Erfindungsgemäß iässt sich für TPP6642 und TPP6850 mitteis der unten aufgeführten Aminosäuresubstitutionen eine noch weitere Annäherung an die humanen Keimbahnsequenzen erzielen: Diese sind für TPP6642 in der leichten Kette: E27Q, N28S, N30S, N31 S, T34N, F36Y, Q40P, S43A, Q45K, H50A, K52S, T53S, A55Q, E56S, H90Q, H91 S, G93S, P96L. Für TPP6642 in der schweren Kette: B I S, N33Y, V34M, T50I, F52N, G54S, N55G, D57S, N61 A, K65Q, D66G, K67R, T72R, A79V. Für TPP6850 in der leichten Kette: E27Q, N28S, N30S, N3 I S, T34N, F36Y, V48T, H50A, K52S, T53S, A55Q, E56S, Q70D, H90Q, H91S, G93S. Für TPP6850 in der schweren Kette: 131 S, N33G, V34I, H35S, I37V, T50W, F52S, P53A, G54Y, D57N, S59N, N61A, F64L, K65Q, D66G, A68V, L70M, K74T, K77S, A107Q.

Diese Substitutionen führen zu einer weiteren Reduktion der Immunogenität im Menschen, was eine vorteilhafte Eigenschaft im Hinblick: auf die Entwicklung von Therapeutika darstellt, weiche auf den erfindungsgemäßen Antikörpern basieren.