ET UTILISATIONS

La présente invention relève du domaine de la détection de bactéries Staphylococcus aureus , et notamment des souches de Staphylococcus aureus qui sont résistantes à la méticilline.

Par "détection", on entend collectivement toutes les techniques permettant d'identifier, qualitativement et/ou quantitativement, ou d'enrichir, purifier ou séparer un analyte biologique, en l'occurrence des bactéries

Staphylococcus aureus .

Conformément au document EP-A-0 323 331, on connaît un réactif pour détecter des bactéries Staphylococcus aureus , y compris les souches résistantes à la méticilline, ce réactif comprenant :

- du fibrinogène,

- un anticorps reconnu par la protéine A de Staphylococcus aureus, - un anticorps reconnaissant spécifiquement le sérotype capsulaire de type 5 de Staphylococcus aureus ou un anticorps reconnaissant spécifiquement le sérotype de type 8 de Staphylococcus aureus , et de préférence un mélange de ces deux anticorps. Selon la présente invention, on apporte un anticorps, monoclonal ou polyclonal, qui reconnaît, de manière spécifique, un épitope commun aux souches de Staphylococcus aureus de différents serotypes capsulaires, notamment les souches résistantes à la méticilline. Cet anticorps est choisi parmi les immunoglobulines de type G, les immunoglobulines de type M et les immunoglobulines de type A.

Une application particulièrement avantageuse de l'anticorps selon l'invention consiste à l'incorporer dans un réactif spécifique pour la détection de Staphylococcus aureus , y compris les souches résistantes à la

méticilline. Par rapport au document EP-A-0 323 331, la sensibilité du réactif de l'invention est supérieure, car la capacité de reconnaissance des serotypes capsulaires est plus importante. Ainsi selon l'invention, on propose et décrit : un anticorps monoclonal ou polyclonal, spécifique d'un épitope commun aux souches de Staphylococcus aureus de différents serotypes capsulaires, notamment des souches résistantes à la méticilline, ledit anticorps étant choisi parmi les immunoglobulines de type G, les immunoglobulines de type M et les immunoglobulines de type A ; cet anticorps reconnait à la fois spécifiquement au moins deux serotypes capsulaires différents desdites souches de Staphylococcus aureus ; de préférence, il est choisi parmi les immunoglobulines de type G et les immunoglobulines de type M ;

- un anticorps monoclonal ou polyclonal tel que défini ci-dessus qui en particulier reconnait au moins le sérotype capsulaire de type 5 et le sérotype capsulaire de type 8 desdites souches de Staphylococcus aureus, un anticorps monoclonal susceptible d'être obtenu selon une technique adaptée de Galfe et al. (Nature, 266, 522-550, (1977)), en utilisant comme lignée cellulaire initiale pour la fusion, la lignée des myélomes SP2/0-Agl4 (ATCC CRL 1581) ; la fusion est effectuée avec des cellules de rate de souris de l'espèce BALB/C et de la souche BALB/CBYJICO (commercialisée par la Société IFFA Credo) , immunisées par une souche de Staphylococcus aureus de type 5, selon les techniques classiques ; les clones obtenus ont été criblés par techniques immunoenzymatiques (ELISA) ; les clones sélectionnés ont été réinjectés par voie intrapéritonéale à des souris préparées au préalable pour la production de liquide d'ascite ; chaque anticorps monoclonal a été utilisé pour sensibiliser des particules de latex et a été testé pour sa spécificité à reconnaître les polyosides capsulaires de Staphylococcus aureus ; les

anticorps monoclonaux dénommés respectivement P2G7A1E5 et P6D8D12E1 ont été choisis en raison de leur spécificité à reconnaître un épitope commun avec différents serotypes capsulaires en particulier de type 5 et 8 ; un anticorps monoclonal susceptible d'être obtenu, ou tel qu'obtenu à partir de la lignée cellulaire hybridome déposée sous le N°96021514, le 15/02/1996 auprès de l'ECACC ; un anticorps monoclonal susceptible d'être obtenu, ou tel qu'obtenu à partir de la lignée cellulaire hybridome déposée sous le N°96021513, le 15/02/1996 auprès de l'ECACC ;

- une lignée cellulaire hybridome, telle que celle déposée sous le N°96021514, le 15/02/1996 auprès de l'ECACC, ou telle que celle déposée sous le N°96021513, le 15/02/1996 auprès de l'ECACC, ou toute autre lignée cellulaire hybridome dérivée, par exemple toute progéniture de cette lignée ; les lignées cellulaires sont revendiquées en tant que telles, ainsi que toute lignée cellulaire dérivée, c'est-à-dire susceptible de produire des anticorps présentant les mêmes caractéristiques immunologiques que celles décrites dans la présente invention ;

- un réactif spécifique de détection des bactéries Staphylococcus aureus et notamment des souches résistantes à la méticilline, comprenant au moins un anticorps reconnaissant spécifiquement au moins un épitope commun des différents serotypes capsulaires des souches de Staphylococcus aureus résistantes à la méticilline, ledit réactif comprenant au moins un anticorps monoclonal ou polyclonal tel que défini précédemment ; ledit anticorps peut être fixé ou couplé, ou non, sur un support ou un marqueur ; par anticorps monoclonal ou polyclonal, on entend les anticorps tels que définis précédemment ainsi que tout anticorps présentant une spécificité croisée avec ceux-ci ;

- un réactif spécifique, notamment de détection des bactéries Staphylococcus aureus et notamment des souches résistantes à la méticilline, comprenant en outre du fibrinogène ou un composé à base de fibrinogène susceptible d'être reconnu par le facteur d'affinité pour le fibrinogène de Staphylococcus aureus ; le fibrinogène ou composé de fibrinogène peut être fixé ou couplé, ou non, sur un support ou sur un marqueur ;

- un réactif spécifique, notamment de détection des bactéries Staphylococcus aureus et notamment des souches résistantes à la méticilline, comprenant en outre des immunoglobulines ou leur fragment Fc reconnues par la protéine A de Staphylococcus aureus , fixées ou couplées, ou non, sur un support ou sur un marqueur, Toutes sortes de support ou marqueur peuvent être envisagées selon l'invention.

On peut ainsi utiliser des particules en suspension. Ces particules sont notamment des particules de latex, telles que des billes de polystyrène ou des particules similaires, ayant de préférence une taille inférieure à 2 μm. A titre d'exemple, on peut citer les particules Estapor, commercialisées par la Société RHONE- POULENC, telles que :

- des particules de polystyrène K080, ayant un diamètre de 0,8 μm,

- des particules de polystyrène K109, ayant un diamètre de 0,8 μm,

- des particules de polystyrène ayant des groupes carboxyliques, PSI 480, ayant un diamètre de 0,8 μm. On peut également utiliser des gels magnétiques, tels que les gels de polyacrylamide et/ou d'agarose contenant des particules magnétiques. On peut en outre utiliser des gels tels que Ultrogel et Magnogel (marques de commerce) de la Société IBF.

Le support utilisé dans un réactif selon la présente invention, peut être également des hématies par exemple de mouton.

Le support peut être sous la forme d'une plaque, d'un cône, d'une barrette, par exemple de polystyrène, ou d'un copolymère à base de styrène, d'un tube de verre ou analogue.

La fixation d'anticorps et de fibrinogène sur des particules en suspension, notamment de latex, peut être réalisée selon l'une des techniques suivantes :

- par adsorption passive, la fixation pouvant être spontanée, au cours d'une incubation des particules de latex dans une solution contenant les anticorps et le fibrinogène ; une incubation par exemple d'environ 2 heures à 20°C est souvent suffisante ;

- par covalence, la fixation pouvant être réalisée en créant une liaison covalente entre les anticorps et les groupements réactifs présents sur certaines particules du latex ; il est possible par exemple d'utiliser un carbodiimide pour créer la liaison covalente.

Lorsque le support est constitué d'hématies, celles-ci peuvent au préalable être sensibilisées par du fibrinogène ou toute autre molécule appropriée, selon les techniques classiques. La concentration des anticorps à fixer sur les particules de latex, qui doit être déterminée pour chaque anticorps selon les méthodes connues, est habituellement comprise entre 0,1 μg et 100 μg de protéines anticorps par millilitre de latex en solution. Dans un réactif selon l'invention, les anticorps et le fibrinogène peuvent être fixés sur une suspension unique de particules, par exemple de latex, ou bien être fixés sur des suspensions de particules respectivement différentes, telles que des hématies et des particules de latex, ou différents latex qui sont ensuite mélangés pour constituer le réactif.

Le marqueur peut être toute molécule biologique ou chimique, par exemple une enzyme, un haptène, un oligonucléotide, un élément radioactif...

D'autres objets de l'invention sont les suivants ; - un réactif tel que défini précédemment comprenant un anticorps de type immunoglobuline comprenant un fragment Fc susceptible de se fixer sur la protéine A de Staphylococcus aureus et/ou un autre composé à base de fibrinogène ou dérivé, susceptible de réagir avec le facteur d'affinité pour le fibrinogène desdites bactéries, ledit réactif comprenant de plus, au moins un anticorps polyclonal ou monoclonal susceptible de reconnaître spécifiquement différents serotypes capsulaires de Staphylococcus aureus , notamment les serotypes de type 5 et 8 ;

- un procédé pour détecter dans un échantillon biologique des bactéries Staphylococcus aureus , et notamment des souches résistantes à la méticilline, caractérisé en ce que : * on dispose d'un réactif, tel que précédemment défini,

* on met en contact ledit échantillon avec ledit réactif,

* on observe l'obtention d'une agglutination. Les caractéristiques et avantages des objets de l'invention sont ci-après exposés et illustrés dans les Exemples 1-3.

EXEMPLE 1 : Composition d'un réactif selon l'invention, appelé SLIDEX 5 \PH PLUS

Le réactif comprend un anticorps de type immunoglobuline comprenant un fragment Fc susceptible de se fixer sur la protéine A de Staphylococcus aureus et/ou un autre composé à base de fibrinogène ou dérivé, susceptible de réagir avec le facteur d'affinité pour le fibrinogène desdites bactéries, ledit réactif comprenant

de plus, au moins un anticorps polyclonal ou monoclonal susceptible de reconnaître spécifiquement différents serotypes capsulaires de Staphylococcus aureus , notamment les serotypes de type 5 et 8. EXEMPLE 2 : Procédé d'obtention de l'anticorps contenu dans le réactif de l'Exemple 1

a) Préparation de cellules de rate de souris immunisées par une souche de Staphylococcus aureus * Matériel :

Souches de Staphylococcus aureus CIP103313 de sérotype capsulaire 5 et CIP108314 de sérotype capsulaire 8.

Milieu de culture : gélose Columbia + 5 % de sang de mouton.

* Méthode :

Les souches conservées à - 80°C sont cultivées 2 fois sur gélose au sang de mouton.

Les colonies sont mises en suspensions en sérum physiologique à la concentration de 3 x 10 ⁹ germes/mL.

Une méthode d'inactivation a été utilisée : inactivation à 70°C pendant 1 heure.

Les vaccins sont préparés extemporanément.

* Origine de la culture cellulaire : - Souche de Staphylococcus aureus de sérotype capsulaire 5

Animal d'immunisation : souris femelles de l'espèce BALB/C et de la souche BALB/CBYJICO (fournies par

IFFA Credo) - Lignée myélomateuse SP2/0-AG14.

* Protocole d'immunisation :

J =0 3 x IO ⁸ germes + ACF (1:1) IP

J = 7,14 3 x IO ⁸ germes IP

J = 28,76 3 x IO ⁸ germes IP J = 204 Booster 3 x IO ⁸ germes en NaCl 9 % IV

J = 207 fusion du 29/01/93, souris n°l série 010

* Culture en suspension

* Ploidie : hétéroploïde

* Conditions de culture :

- Milieu de base : Iscove's Modified Dulbecco Médium additionné de bicarbonate de sodium (3024 mg/1) , de

10 % de sérum de veau foetal (SVF) , pH 6,7 à 7,3, température 25°C.

Réactifs additionnels : insuline (5 μg/l) , 2-mercaptoéthanol (10 μM) , éthanolamine (20 μM) , pénicilline (100 U/ml), streptomycine (50 μg/ml) .

- Technique de sub-culture : les cellules sont sub-cultivées tous les 2 ou 3 jours.

* Congélation des cellules :

- Composition du milieu : IMDM additionné de 10 % de SVF et 10 % de DMSO (diméthyl sulfoxyde - Sigma)

- Concentration cellulaire : 3,6 x IO ⁶ cellules par ampoule (2 x 10 ⁶ cellules/ml)

- Méthode : congélation lente des cellules à -80°C dans du milieu IMDM - SVF 10 % - DMSO 10 %, 24h à 72h, puis conservation dans l'azote liquide -180°C.

b) Identification de 1 'hybridome stable

* Nombre de clonage effectués : 2

* Nom du clone : 6D8D12E1 * Isotypage : IgG2b,K

* Capacité de synthèse : taux d'Ig sécrétées dans le surnageant : ND.

* Spécificité antigénique : ELISA indirect m - plaques NUNC-maxisorb coatées avec 50 μL de germes (IO ⁹ g/ml) STAPH 5, séchés une nuit à 37°C,

- saturer avec 100 μL de PBS-lait 1 % pendant 1 h à 37°C,

- saturer avec 100 μL de PBS-sérum de cheval 1 %, incuber pendant 1 h à37°C,

ajouter 100 μl de surnageant ou de liquide d'ascite dilués en PBS-Tween 20 0,05%, puis incubés 1 h à 37°C, ajouter 100 μL d'Ig anti-Ig(H+L) de souris conjuguées à la PAL (Jackson Laboratories lot 24724) dilué au 1/2000 en PBS-BSA 1 % + sérum de cheval 1 %, 1 h à 37°C, ajouter 100 μL de PNPP (BioMérieux réf. 60002990) à la concentration de 2 mg/ml dans de la DEA-HCL (Biomérieux réf. 60002989), pH9,8, incuber 30 min à 37°C, - bloquer la réaction avec 100 μL de NaOH 1 N. NB: 3 lavages sont effectués entre chaque étape avec 300 μL de Pbs-tween 20 0,05% et un lavage supplémentaire en eau distillée avant d'ajouter le PNPP. RESULTATS de (1) : cet anticorps est spécifique de

S . aureus et ne reconnaît ni S . Warneri , ni S. Hominls , ni S . Epidermidis , ni S . Cohnii , ni S . Haemolyticus.

Il reconnaît les souches S . aureus type 5, type 8, type B, type A, type MC31, et les souches non 5, non 8 (Ex: souches 1033, K8, 16N15) .

Technique d'agglutination directe ( 2 )

Dans des plaques à fond rond (Biomérieux M220 24A réf. 96350) mettre 50 μL de surnageants dilués en

PBS + 50 μL de germes à 5 x IO ⁸ g/ml ; agiter les plaques puis incuber à 22°C. La lecture est effectuée à l'oeil, 15 heures plus tard environ.

RESULTATS de ( 2 ) : agglutination visible à l'oeil (4+).

c) Production d'anticorps in vivo

* Animal utilisé : souris femelles ayant de 4 - 6 semaines, de l'espèce BALB/C, de la souche BALB/CBYJICO (IFFA Credo) .

* Préparation de l' inoculum : la suspension cellulaire est centrifugée à 200 g, 10 minutes, 25°C. Les

cellules sont resuspendues dans du NaCl 9 % à raison de IO ⁶ cellules/ml,

* injection de 10 ⁶ cellules/souris par voie intrapéritonéale, pour 20 souris, * Temps de récolte du liquide d'ascite : 10 jours + 2 jours,

* Volume d'ascites : 245,5 ml,

* Volume du pool : 230,5 ml,

* Rendement : 93.9 %,

EXEMPLE 3 : Comparaison de la sensibilité et de la spécificité du réactif SLIDEX STAPH PLUS et de celles de divers réactifs commercialisés, dans la détection de différentes souches de Staphylococcus aureus Le réactif SLIDEX STAPH PLUS a été comparé aux réactifs suivants :

- SLIDEX STAPH KIT: réf. 7 311 2 lot 674145 B (exp. 4/96) , commercialisé par la Demanderesse,

- STAPHYSLIDE: réf. 5 508 1 lot 674775 A (exp. 9/96) , commercialisé par la Demanderesse,

PASTOREX STAPH PLUS commercialisé par

Diagnostic Pasteur : réf. 56356 lot 4L042R (exp 2/96) et lot SE 047 R (exp. 7/96) ,

STAPHAUREX PLUS commercialisé par Murex : Réf ZL 33 lot K61691 0 (exp. 1 1/95) et lot K9251 1 0 (exp.

8/96) .

Pour déterminer la sensibilité de chacun de ces réactifs, les 346 souches de Staphylococcus aureus suivantes ont été testées : - 118 souches S . aureus résistantes à la méticilline et n'ayant pas le facteur d'affinité pour le fibrinogène (dumping Factor négatif) (origine : France,

Allemagne, Angleterre, Bénélux, Italie, Espagne, USA, USA

Kansas) - 131 souches S. aureus résistantes à la méticilline et ayant le facteur d'affinité pour le

fibrinogène (dumping Factor positif) (origine : France, Allemagne, Angleterre, Bénélux, Italie, Espagne, USA, Australie, Hong-Kong)

97 souches S . aureus sensibles à la méticilline (origine : France, Angleterre, Bénélux, Italie, Espagne, Pologne, Australie, Hong Kong)

En outre, pour déterminer la spécificité de chacun de ces réactifs, 155 souches Staphylococcus non aureus ont été testées (origine : France, Allemagne, Angleterre, Bénélux, Italie, Espagne, Pologne, USA, Australie, Hong- Kong) .

Les souches ont été cultivées sur gélose Columbia + 5 % de sang de mouton.

a) Résultats de sensibilité obtenus avec les 118 souches S . aureus résistantes à la méticilline et n'ayant pas le facteur d'affinité pour le fibrinogène

Les résultats sont rassemblés dans le Tableau 1 ci-dessous : Tableau 1

inint signifie "ininterprétable"

Conformément au Tableau 1, SLIDEX STAPH PLUS a montré une sensibilité significativement supérieure (98,30 %) à celle de SLIDEX STAPH KIT (79.67 %) , de PASTOREX STAPH PLUS (90,6 %) et STAPHAUREX PLUS (82,9 %) .

b) Résultats obtenus avec les 131 souches S . aureus résistantes à la méticilline et ayant le facteur d'affinité pour le fibrinogène

Les résultats sont rassemblés dans le Tableau 2 ci-dessous :

Tableau 2

* agglutination lente inint signifie "ininterprétable".

c) Résultats obtenus avec les 97 souches S . aureus sensibles à la méticilline

Les résultats sont rassemblés dans le Tableau 3 ci-dessous :

Tableau 3

inint signifie "ininterprétable"

Conformément à ce tableau, l'ensemble des souches a été détecté, ce qui donne une sensibilité de 100 % pour chacun des réactifs.

d) Résultats obtenus avec les 155 souches S . non aureus

Les résultats sont rassemblés dans le Tableau 4 ci-dessous :

Tableau 4

Les espèces S . epidermidis , S . simulans , S . hyicus peuvent posséder une capsule.

Les espèces S . lugdunenεis , S . schleiferi , S . hyicus , S . intermedius peuvent comporter le facteur d'affinité pour le fibrinogène.

Les spécificités de PASTOREX STAPH PLUS et STAPHAUREX sont identiques (88,44 %) mais inférieures à celles de STAPHYSLIDE (91,37 %) et de SLIDEX STAPH PLUS (92,57 %) .

e) Performances des réactifs

Le tableau 5 ci-dessous indique les résultats de sensibilité et de spécificité de chacun des réactifs.

Tableau 5

Dans ce tableau, ainsi que dans les tableaux suivants où elles apparaissent, les mentions meti R, meti S, signifient respectivement "résistantes à la méticilline" et "sensibles à la méticilline".

Il ressort de ce tableau que la sensibilité de SLIDEX STAPH PLUS (99,2 %) est significativement supérieure aux autres réactifs ; cette supériorité est

essentiellement due à une meilleure performance sur les souches S . aureus résistantes à la méticilline et n'ayant pas le facteur d'affinité pour le fibrinogène.