SOSSA FERNANDEZ KATHERINE ELIZABETH (CL)
BECERRA ALLENDE JOSÉ VIOLIDIO (CL)
PEREZ MANRIQUEZ CLAUDIA ISABEL (CL)
RUIZ-TAGLE MOENA NATHALY MARIAN (CL)
VIDAL ARAYA JOSÉ MIGUEL (CL)
NOCKER-EINSIEDLER ANDREAS (CL)
WO2006040174A1 | 2006-04-20 |
CN101564050A | 2009-10-28 | |||
CN102807797B | 2014-10-15 |
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REIVINDICACIONES 1. Una biopintura antifouling CARACTERIZADA porque comprende un sistema de protección de dos barreras que incluye extractos de macroalgas atractantes de bacterias epibiontes con actividad antimicrofouling y extractos activos de bacterias con característica antifouling. 2. Una biopintura antifouling, según reivindicación 1, CARACTERIZADA porque el extracto de macroalga atractante corresponde a un extracto de Ulva sp. 3. Una biopintura antifouling, según reivindicación 1, CARACTERIZADA porque el extracto de bacterias corresponden a extractos de la cepa RGM 2223 y a la cepa de bacteria antártica RGM 2225. 4. Una biopintura antifouling, según reivindicación 1, CARACTERIZADA porque comprende entre 0,625-25 p/v de extracto de Ulva sp. y entre 1,25-10 p/v de extracto de bacterias RGM 2223/RGM 2225. 5. Una biopintura antifouling, según reivindicación 1, CARACTERIZADA porque comprende una matriz base polimérica, que permite la inmovilización de los extractos. 6. Uso de una biopintura antifouling, según reivindicación 1, CARACTERIZADO porque se utiliza sobre superficies inertes expuestas a agua de mar, principalmente redes de uso en acuicultura, tuberías, cascos de barcos. 7. Uso de una biopintura antifouling, según reivindicación 6, CARACTERIZADO porque permite una inhibición del fouling sin el efecto dañino que significa incorporar elementos químicos al medio ambiente. 8. Uso de una biopintura antifouling, según reivindicación 6, CARACTERIZADO porque permite la acción sinergica de los extractos utilizados. |
SECTOR TECNICO
La tecnología que a continuación se presenta esta destina a ser utilizada en el sector industrial, favoreciendo principalmente al sector acuícola y naviero. La tecnología corresponde a una pintura antifouling que contiene agente activos provenientes de fuentes naturales lo que la hace medioambientalmente amigable.
TECNICA ANTERIOR
El fouling, se produce por acumulación indeseable de materiales inorgánicos y orgánicos en superficies sumergidas que incluyen: a) depósito de compuestos de naturaleza mineral, b) descomposición de material orgánico (aceites proteínas, sustancias húmicas), c) adhesión de microorganismos (micro-biofouling), seguido por la adhesión de organismos marinos como larvas de moluscos, artrópodos, macroalgas, etc. (macro-biofouling). Este proceso aumenta los costos de mantención y reparación de superficies sumergidas (naves, redes, balsas jaulas) del orden de US$ 4 billones anuales a nivel mundial, afectando principalmente la Industria naviera, debido a que la formación de este biofouling ocasiona gastos sustancialmente elevados por el consumo de gasolina, corrosión y limpieza de barcos; y en el sector acuícola colapsa redes y jaulas usadas para el cultivo intensivo de salmones. Además de los daños materiales que puede causar, la formación de biofouling puede acantonar patógenos y especies exóticas que pueden ser transportadas en forma involuntaria poniendo en riesgo la salud de ecosistemas completos.
A través de la historia distintas soluciones han sido propuestas para deshacerse del constante problema del biofouling, desde ceras, alquitrán, asfalto, láminas de cobre, revestimientos de plomo, arsénico con sulfuro y aceites, malas hierbas y barro, hasta la común limpieza mecánica (Yebra et al., 2004). A mediados el siglo XIX se comenzaron a desarrollar distintos tipos de pinturas que tenían como objetivo dispersar un agente químico para combatir este problema. Cobre, arsénico, óxido de mercurio en ese entonces eran populares compuestos anti-biofouling, y los solventes utilizados eran en general, aceite de trementina, naftalina, benceno, finalmente se utilizaba aceite de linaza, alquitrán, goma y varios tipos de resina para unir o ligar los componentes de estas novedosas pinturas (Yebra et al., 2004). Luego, con el pasar de las décadas, se irían "puliendo" los métodos y compuestos utilizados para ir cada vez mejorando el rendimiento de estos productos.
El combate del biofouling, actualmente se basa en el uso de pesticidas y metales pesados, alcanzando en Chile un monto de comercialización del orden de US$ 10 millones/año. En los últimos años la presión de sustituir esos productos químicos se ha incrementado sostenidamente. El grave daño al medio ambiente y la salud (por acumulación de los metales pesados en animales marinos) provocó la prohibición de la sustancia más utilizada en este ámbito, el tributiltin (TBT). La prohibición de otras sustancias sintéticas que tienen efectos perjudiciales similares es objeto de discusión pero no ha sido ejecutado por la carencia de alternativas.
Otros compuestos 'booster' de uso común incluyen el herbicida Irgarol (2- methylthio-4-tert-butyl-amino-6-cyclopropylamino-s-triazine) (Thomas, 2001; Burgess et al., 2003), diurón, Sea Nine, zinc pyrithion, zineb y dichlofluanido (Yebra et al., 2004). Aunque son eficientes, existe gran preocupación sobre el uso de estos compuestos altamente tóxicos (Gibbon, 1995; Burgess et al., 2003). Es sabido que la lixiviación de las pinturas marinas al ambiente acuático de muchos de los compuestos mencionados causa daños irreversibles a la fauna y flora acuática y finalmente a la salud humana. Se ha documentado en diversos estudios sobre animales marinos, que pequeñas cantidades de TBT pueden afectar el crecimiento, desarrollo genital (Evans et al., 1995; Swain, 1998), generar malformaciones, producir una acumulación de sustancias tóxicas dentro del organismo y debilitar el sistema inmunológico (Yebra et al., 2006). Es por esto que entraría en vigor, finalmente, luego de 10 años de restricción, el tratado de la IMO (International Maritime Organization) en el año 2008 para prohibir, completamente, el uso de los productos basados en TBT (Ralston & Swain, 2009), este hecho ha obligado a muchos países a regular y restringir el uso de estos compuestos químicos (Champ, 2001). Gracias a esto, se ha forzado a las industrias a desarrollar pinturas antifouling que reemplacen los productos con TBT (Yebra et al., 2004). Con este propósito han nacido variados tipos de pinturas antifouling. Las pinturas Tin Free, han llegado al mercado en dos tipos generales, los "sistemas de agotamiento controlado" (CDPs) y "Copolímeros autopulimentantes libres de estaño (Tin-free SPCs) (Anderson & Hunter, 2000).
Sistemas de agotamiento controlado (controlled depletion systems (CDPs)): Estas son una "actualización" de las matrices solubles tradicionales, esto por medio de un reforzamiento moderno de las resinas. Los mecanismos de funcionamiento son equivalentes a las pinturas solubles convencionales. Se caracterizan por tener resinas del tipo soluble e insoluble junto con el compuesto activo disperso dentro de ellas. Su funcionamiento se basa en la hidratación y erosión de la pintura. Las toxinas migran de forma gradual y se puede regular el "leaching" con la adición de una proporción adecuada entre las resinas (Yebra et al., 2004; Almeida et al., 2007; Cárdenas, 2010; Hochkoeppler et al., 2012).
Copolímeros autopulimentantes libres de estaño (tin-free self-polishing copolymers (tin-free SPCs)): El mecanismo de acción de estas pinturas es similar al de las pinturas TBT-SPC, sin embargo, no contienen estaño, el que es reemplazado por metales como cobre, zinc y silicio (Yebra et al., 2004). Se caracterizan por ser un producto homogéneo sintetizado, que está compuesto por una matriz de un co-polímero (generalmente, acrílico o resina) en donde diferentes grupos "colgantes" están unidos a la cadena polimérica principal. El funcionamiento de este tipo de productos es a través de la degradación hidrolítica de la matriz. Al contacto con el agua los grupos enlazados periféricamente se liberarían al agua causando la eliminación del fouling. Además, en estas pinturas, teóricamente, se podrían regular el accionar del compuesto antifouling y también la solubilidad de la pintura en el agua. (Almeida et al., 2007; Cárdenas, 2010; Hochkoeppler et al., 2012). Las pinturas con copolímeros autopulimentantes libres de estaño ( Tin-free self-polishing copolymers, tin-free SPCs), poseen un mecanismo de acción similar al de las pinturas TBT-SPC, sin embargo, no contienen Tin (estaño), el que es reemplazado por metales como cobre, zinc y silicio (Yebra et al., 2004). Se caracterizan por ser un producto homogéneo sintetizado, que está compuesto por una matriz de un co-polímero (generalmente, acrílico o resina) en donde diferentes grupos "colgantes" están unidos a la cadena polimérica principal. El funcionamiento de este tipo de productos es a través de la degradación hidrolítica de la matriz. Al contacto con el agua los grupos enlazados periféricamente se liberarían al agua causando la eliminación del fouling. Además, en estas pinturas, teóricamente, se podrían regular el accionar del compuesto antifouling y también la solubilidad de la pintura en el agua (Almeida et al., 2007; Cárdenas, 2010; Hochkoeppler et al., 2012).
Hoy en día, la mayoría de las pinturas comerciales antifouling contienen cobre (Cao et al., 2011) siendo sus principales formas el cobre metálico, tiocianato de cobre y óxido de cobre (Omae, 2003). Tomando en cuenta los daños económicos que produce el fouling y los daños ambientales que produce su "solución" es que la problemática actual se centra en la búsqueda de evitar el microbiofouling con pinturas amigables con el medio ambiente, es decir, que no sean dañinas ni para los ecosistemas ni para el ser humano (Chambers et al. 2006); muchos autores sugieren que un sistema natural podrían generar nuevos y poderosos productos antifouling, ya que muchas plantas y animales han desarrollado mecanismos de defensa contra el fouling pudiendo mantenerse relativamente libres de esta estructura incrustante, aun cuando se encuentran sumergidos (Egan et al. 2000, Santos et al. 2013), bajo esta premisa es que desde 1982 se habla de biomimicry, término popularizado por la científica Janine Benyus; el cual ella y su grupo definen como "una aproximación a la innovación que busca soluciones sostenibles a los problemas humanos mediante la emulación de modelos y estrategias probadas por la naturaleza" (The Biomimicry Institute, 2014). Los ejemplos de soluciones o innovaciones utilizando esta interacción entre tecnología y biología son diversos y aplicables a distintas problemáticas humanas; referente a estrategias que combatan el fouling, la búsqueda de compuestos activos naturales se centra en organismos marinos como lo son algas, bacterias, esponjas, corales, por nombrar algunos ( ittschof 2001, Armstrong et al. 2000).
Macroalgas han sido una fuente de búsqueda de compuestos que logren inhibir el fouling, debido a la ausencia de este en su superficie. Ejemplo es el alga roja Delisea pulchra (Greville) Montagne que produce furanones, los cuales protegen a la planta de la colonización bacteriana y posterior formación de biopelículas microbianas y del fouling (de Nys et al. 1995, Maximilien et al. 1998); así como también inhiben la expresión de acil homoserin lactona (AHL) (Manefield et al. 1999) lo que conlleva a una inhibición del quorum sensing ya documentado como mecanismo de señalización en la formación de biopeliculas microbianas (microfouling) en Serratia liquefaclens (Grimes & Hennerty) Bascomb, un patógeno humano (Rasmussen et al. 2000; Hentzer y Givskov 2003). El alga parda Sargassum wightii Greville también ha presentado evidencia de que genera dioctilftalato, el cual posee actividad antibacterial (Sastry y Rao 1995) y posiblemente sea el mismo compuesto el que le otorga las propiedades antifouling (Iyapparaj et al. 2012).
En adicional a lo anterior, las algas no solo generan una fuente de compuestos de inhibición directa, su interacción con los microorganismos es mucho más compleja. Goecke et al. (2012) probó extractos algales de las familias Chlorophyta, Heterokontophyta y Rhodophyta sobre 5 bacterias epibiontes de algas y 5 bacterias estándar para análisis, obteniendo que 3 de estos últimos fueron susceptibles al extracto y las 5 bacterias epibiontes no fueron inhibidas, por el contrario promovieron su crecimiento; un claro ejemplo del efecto dual de las algas sobre bacterias. Lemos et al. (1985) estudió bacterias epíficas de cinco algas verdes y pardas encontrando 38 aislados de 224, con propiedades antibacteriales, todas asignadas al género Pseudoalteromona; por otro lado estudios de las bacterias asociadas al alga Ulva lactuca demuestran que los aislados de esta son capaces de prevenir el asentamiento de larvas de invertebrados y esporas (Egan et al. 2000).
Gracias a este efecto promotor de las algas sobre algunas aislados, es que bacterias provenientes de ambientes marinos, a pesar de ser en su mayoría móviles, flageladas, y capaces de realizar quimiotaxis; se encuentran asociadas a la superficie de peces, algas, invertebrados, moluscos, sin necesariamente iniciar la cascada de reacciones que conllevan al microbiofouling.; convirtiéndose así, las algas, en fuente atractante de bacterias epibiontes, otro blanco potencial de compuestos antifouling. La mayoría de los ejemplos se encuentran dentro de los géneros Pseudoalteromonas y Alteromonas, por ejemplo Yee et al. (2007) probaron la actividad antifouling de Pseudoalteromonas tunicata Holmstróm inmovilizada en k-carrageenan, aumentando el periodo de vida de las bacterias y manteniendo sus propiedades una vez evaluadas en campo. Abarzua et al. (1999) contrastó compuestos extracelulares de la cianobacteria Scytonema hofmanríi, en comparación con el alga Calothríx brevisslma West, obteniéndose que la cianobacteria produce uno de los compuestos antialgales más potentes.
El efecto antagónico entre bacterias es una característica muy difundida en el medio marino y presente en varios grupos bacterianos. También, se han encontrado entre bacterias asociadas a superficies de macroalgas, estrellas de mar, superficies duras naturales o artificiales (fouling) y agregados orgánicos, a través de la producción de antibióticos, en algunas de ellas. En las superficies de organismos vivos la colonización bacteriana puede estar afectada, entre otros, por las propiedades físicas de la superficie y por el acondicionamiento bioquímico inicial, que condicionan características como: tensión superficial, polaridad y grado de humectación (Taylor et al, 1997). Las interacciones de algas y bacterias pueden ir desde simbiótica a parasitaria beneficiando o inhibiendo el crecimiento de ambas según sea el caso. Las algas favorecen el crecimiento de las bacterias a través del intercambio directo de nutrientes, proporcionando compuesto orgánicos liberados durante el crecimiento de las algas o a partir de la descomposición de esta (Unnithan et al, 2013).
En este sentido, se ha propuesto que la competencia por espacio y nutrientes puede ser una poderosa fuerza selectiva que ha generado la evolución de una variedad de adaptaciones efectivas en el asentamiento bacteriano (Grossart et al, 2004). De hecho, la competencia por recursos limitados dentro de una comunidad se considera una importante fuerza selectiva que promueve la biosíntesis de compuestos antimicrobianos (Slattery et al, 2001). La identificación, aislamiento y caracterización de compuestos con propiedades antifouling independiente de su origen no basta como la solución a este problema; para llevar a cabo soluciones concretas es necesario formular una biopintura que logre conservar las características del aislado y de adhiera a la superficie de los barcos. A la fecha se han formulado las siguientes biopinturas: Santos et al. (2013) elaboró una biopinturas cuyo componente activo corresponde a extractos de cinco esponjas y un pepino de mar, los extractos fueron inmovilizados en geles y adheridos a matrices solubles de pinturas antifouling; dichas pinturas fueron evaluadas a los 45 y 90 días en las costas de Colombia y Argentina, obteniéndose como resultado que la pintura cuyo componente activo era Agelas tubulata Lehnert & Van Soest obtuvo la mejor actividad. Pérez et al. (2014) formuló una biopintura cuyo componente activo correspondía a ácido secochiliolide aislado desde un arbusto patagónico altamente distribuido en Argentina y Chile, Nardophyllum bryoides (Lam) Cabrera, dicho aislado fue agregado a una matriz soluble que contenía ácido oleico y xileno, las pinturas fueron evaluadas en campo a los 45 días.
A pesar de lo anteriormente descrito, aún existe la necesidad de contar con tecnologías que permitan una protección antifouling de superficies que están en contacto con agua de mar. Estas tecnologías deben ser amigables con el ambiente, no afectando el ambiente que rodea a las superficies.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1: Esquema que representa la tecnología de la biopintura con dos barreras naturales contra el fouling.
Figura 2: Ensayo de inhibición de extractos de sobrenadantes de cepas antifouling en ensayo de microplaca.
Figura 3: Ensayo de inhibición de extractos de bacterias de cepas antifouling en ensayo de microplaca.
Figura 4: Ensayo de quimiotaxis de bacterias epibiontes AL1M7 hacia extractos algales. Figura 5: Ensayo de exposición de láminas pintadas en microcosmo en agua de mar por 5, 15, y 30 días.
Figura 6: Ensayo de exposición de soportes de acero pintados, montados en terreno en el submareal costero en Dichato.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La tecnología que se presenta corresponde a una biopintura antifouling basada en estrategias naturales usadas por invertebrados y algas marinas para proteger sus superficies de este proceso, ofreciendo una alternativa para el control de biofouling, de menor costo y amigable con el medio ambiente. Se presenta una biopintura basada en la imitación de estrategias naturales como la interacción macroalgas-bacterias epibiontes, esta tecnología comprende un sistema de protección de dos barreras que incluye extractos de macroalgas atractantes de bacterias epibiontes con actividad antimicrofouling, además comprende extractos activos de bacterias benéficas con característica antifouling. La biopintura también comprende una matriz base que permite la inmovilización de los extractos.
En la figura 1A se presenta un esquema de los componentes y efectos de la biopintura con dos barreras naturales contra el biofouling; donde la superficie sumergida (1) está protegida con la biopintura (2) la que comprende componentes atractantes (+) de algas (3, barrera 1) y componentes repelentes de bacterias epibiontes/antárticas con actividad antimicrofouling (-), (barrera 2) de bacterias del microfouling (4). En la figura IB se muestra un esquema de lo que ocurre sin la biopintura protectora. El componente atractante corresponde a extracto de macroalgas, principalmente de Ulva sp., el que atrae bacterias epibionticas benéficas que colonizan la superficie y ejercen allí sus propiedades antifouling.
Además la biopintura posee extractos de bacterias con características antifouling comprobadas, las que poseen una potente actividad inhibitoria de asentamiento en etapas de colonización de biofouling. Estas bacterias corresponden a la cepa epibionte AL1M7 y a la bacterias antártica M9C, ambas cepas están depositadas en la Colección Chilena de Recursos Genéticos Microbianos, con los números de depósitos RGM 2223 y RGM 2225 respectivamente.
La composición déla biopintura esta descrita en la tabla 1. TABLA 1: Pintura antifouling
Compuesto Rango (p/v) Acción
Extracto de Macroalga 0,625-25 Efecto atractante
Extracto AL1M7/M9C 1,25-10 Efecto antifouling
Pintura base c.s.p. Matriz polimérica Esta pintura puede ser utilizada sobre superficies inertes expuestas a agua de mar, principalmente redes de uso en acuicultura, tuberías, cascos de barcos, etc.
El uso de esta biopintura permite una inhibición/retraso en el crecimiento del fouling, impidiendo el asentamiento de microorganismos en las superficies tratadas.
La acción de las dos barreras presentes en la biopintura permite que su resultado sea similar a pinturas que hoy en día se comercializan, pero sin el efecto dañino que significa incorporar elementos químicos al medio ambiente. La biopintura permite la acción sinérgica de los extractos utilizados, siendo menos nociva al incorporar solo extractos naturales, esta biopintura permite imitar las estrategias naturales antifouling como la interacción macroalgas-bacterias.
EJEMPLOS DE APLICACIÓN
Ejemplo 1: Recolección de material biológico.
Se recolectó ejemplares de 7 diferentes algas (Durvillaea antárctica, Porphyra sp, Ulva sp, Chondrachantus chamissoi, Mastocarpus latissimus, Mazzaella sp., Desmarestia ligulata, mediante buzo y selección manual en la zona intermareal baja, sector Taucú (VIII Región) intermareal medio y alto, Dichato (VIII Región). Las muestras de algas fueron inmediatamente subdivididas para la obtención de extractos y para la obtención de bacterias epibiónticas. Fragmentos de las algas fueron depositados en bolsas (obtención de extractos) o traspasadas a tubos Falcon con PBS estéril (aislamiento de bacterias epibiontes) y mantenidas a 4°C hasta su manipulación en laboratorio.
Soportes de diferente material (soportes de celulosa, polietileno, acero inoxidable, polisulfone) fueron dispuestos a media agua (aprox. a 7 m del fondo) en la localidad de Laraquete y Bajos Mela y mantenidos por 18 días. Cada soporte fue removido de su posición, trasladado a laboratorio a 4°C. Además se colectaron redes de acuicultura. En laboratorio los soportes, membranas y redes fueron lavados con PBS y luego cepillados para desprender las bacterias. Cada cepillo fue dispuesto en tubos Falcon conteniendo 15 mi PBS. Se expuso a baño ultrasónico (40 khz) por 5 min para recuperar las bacterias. Ejemplo 2: Aislamiento de bacterias epibiontes, antarticas y del microfouling.
Aislamiento de bacterias desde algas: Fragmentos de algas fueron lavados con PBSm (PBS marino; buffer fosfato salino al 2% NaCI) y depositados en tubos Falcon conteniendo 20 mi de PBSm, luego fueron sonicados a 40 kHz durante 5 min para el desprendimiento de las bacterias asociadas a la superficie del alga. Desde estas muestras se realizaron diluciones seriadas (dil. 10 _1 -10 "5 ) en tubos 1,5 mi estériles, usando PBSm, de cada dilución se sembraron 100 μΙ por rastrillo en placas Petri con medio TSAm 50% (TSA 50% al 2% NaCI), R2Am (R2A al 2% NaCI) y Medio Marino (2216, Difco) e incubaron a 15°C por 24-48 h. Las colonias se seleccionaron de acuerdo a su forma, tamaño o color usando asa curva y se sembraron en medio de acuerdo a las condiciones de la placa desde las que fueron aisladas (TSBm 50%, R2Bm, Medio Marino) y se dejaron crecer a 15°C por 24 h. Una colonia por placa fue traspasada a medio líquido (5 mi de TSBm 50%). Los tubos fueron incubados por 24 h a 15°C, con agitación constante, desde estas muestras se generó cepario en duplicado en glicerol (20% v/v), finalmente se guardó a -80°C.
Bacterias aisladas desde superficies colectadas en suelos (rocas, suelos) en península Fildes, isla Rey Jorge, Territorio Antártico Chileno (verano 2010) fueron sembrados en agar TYES (Tryptone Yeast Extract Salts) por 72 h a 15°C y las colonias aisladas fueron transferidas a tubos de ensayo que contenían medio TYES. Los tubos fueron incubados a 15°C durante 48 h a 120 rpm de agitación. Su conservación en ceparios se indicó previamente. En adelante las bacterias epibiontes serán crecidas en TSAm o TSBm y las de suelos en NB.
Aislamiento de bacterias (microfouling) desde soportes: Desde los diferentes soportes (en 50 mi solución PBS) se obtuvieron muestras de bacterias como se indicó anteriormente (sección aislamiento de bacterias desde algas). Como se señala antes, se generó cepario en duplicado en glicerol (20% v/v), finalmente se guardó a -80°C.
Ejemplo 3: Selección de bacterias con actividad antimicrobiana contra bacterias del microfouling.
Discos de papel filtro: Se cultivaron bacterias del microfouling en forma de tapiz sobre TSAm 25%. Las placas de agar fueron incubadas (temperatura 10-15°C) hasta que las bacterias desarrollaron en un tapiz. Sobre ellas se dispusieron discos de papel filtro estériles de 7 mm diámetro, impregnados con cultivos de las bacterias epibiontes y de la Antártica aisladas en el ejemplo 2, como control positivo de inhibición de crecimiento se utilizó discos con antibióticos conocidos. Se midió el radio de la zona de inhibición entre el disco y la capa bacteriana. Las imágenes fueron capturadas mediante un sistema fotodocumentador de imágenes.
Discos de agar: Las cepas epibiontes y de suelos aisladas desde macroalgas/Antártica fueron recuperadas en medio TSAm 25% o NB 25% se incubaron de 24 a 48 h a 15°C. Las colonias crecidas se emplearon para inocular 5 mi de PBSm estéril, el contenido se homogeneizo, ajustado al patrón de turbidez a un MacFarland 0,5, equivalente a lxlO 8 células/ml. Luego con un cotón empapado de la solución se realizaron los tapices microbianos (TSAm 25%, NB 25%) desde estos se extrajeron discos de agar (8 mm), que fueron dispuestos sobre otra placa conteniendo un tapiz con las bacterias pertenecientes al microfouling marino, se dejaron incubar durante 24 a 48 h a 15°C. Se utilizaron como controles discos de agar con CuS04 a 1000 ppm (control positivo), y con PBS (control negativo). Se midió el halo de inhibición en torno al disco a las 24 h y se repitió el procedimiento a las 48 h, cada cepa epibionte posee una réplica biológica en los distintos tapices. Las imágenes fueron capturadas mediante sistema fotodocumentador de imágenes y analizadas mediante software Advanced UVI-Band (Uvitec, Cambridge).
De un total de 276 (epibiontes y Antártica), 64 presentaron un efecto antagónico sobre al menos una de las cepas del microfouling. De este último, grupo 27 fueron preseleccionadas por forma de colonia, hospedero; las cepas con actividad antifouling comprobada fueron: AL1M7 (epífitas en el intermareal costero VIII Región, obtenida desde algas) y M9C (obtenida desde muestras de suelos Antártica).
Ejemplo 4: Obtención de extractos de algas y bacterias epibiontes.
Extractos de algas: Las muestras de algas recolectadas fueron lavadas con agua de mar estéril para eliminar otros organismos asociados. El volumen de algas frescas fue obtenido por desplazamiento de agua en un cilindro graduado. Se pesó aproximadamente medio kilo de alga fresca y se dejó secar en estufa a 40 °C por 24 h. El producto seco se dejó macerando en metanol p.a por un periodo de 24 h y se filtró el líquido en un embudo simple y se llevó a rotavapor hasta sequedad, obteniendo así un extracto metanólico total. El extracto metanólico polar fue fraccionado mediante extracción líquido-líquido obteniendo fracciones orgánicas de hexano, diclorometano y acetato de etilo que luego se concentraron en rotavapor a 40°C y almacenadas en refrigerador hasta su posterior análisis en CG-EM.
Extractos de bacterias y sobrenadantes: Los medios de cultivo de las bacterias seleccionadas (AL1M7, M9C) fueron filtrados mediante un sistema de filtración al vacío, usando filtros de membrana Durapore (pvdf) de 0,22 pm poro, 47mm diámetro., para separar el medio de cultivo del material biológico (bacterias), posteriormente se realizó una extracción líquido-líquido en un embudo de decantación por triplicado con solventes orgánicos en polaridad creciente con hexano, diclorometano y acetato de etilo, luego la fase orgánica resultante de cada extracción se secó con sulfato de sodio anhidro (Na2S04) para eliminar los residuos de fase acuosa, el siguiente paso consistió en concentrar la fase orgánica con los compuestos de interés en un equipo de destilación al vacío (rotavapor) obteniendo así un extracto total seco de sobrenadante. En el caso de los extractos de bacterias se realiza como extractos de algas.
Ejemplo 5: Actividad antagónica de extractos de bacterias AL1M7 Y M9C hacia bacterias del microfouling.
Los epibiontes AI1M7 y M9C fueron crecidas en 1 litro de TSBm 25% (dos volúmenes de 500 mi) a 15°C en agitación continua a 120 rpm, pasado 48 horas los cultivos fueron centrifugados a 8000 rpm por 10 minutos para separar el pellet celular del sobrenadante; tanto el sobrenadante como el pellet fueron enviados a la Facultad de Ciencias Naturales y Oceanógraficas (Universidad de Concepción) para la obtención de extractos como se indica en ejemplo 4. Los extractos de sobrenadante (inhibidor extracelular) y pellet (inhibidor intracelular) de las cepas AI1M7 y M9C fueron resuspendidos en distintos volúmenes de DMSO para normalizar la concentración; se utilizaron como tratamiento las concentraciones 10% p/v; 5% p/v; 2,5% p/v; 1,125% p/v; 0,625% p/v.
Los ensayos de inhibición de bacterias del microfouling se ajustaron a 200 pL utilizando 20 pL de cultivo del microfouling, 80 pL de TSBm 10% y 100 pL de extractos de sobrenadantes (Rg. 2) o extractos de bacterias (Fig. 3) AL1M7 y M9C en 5 diluciones (10; 5; 2,5; 1,25 y 0,625 % p/v), el ensayo se dejó a 15°C en agitación continua a 120 rpm, pasadas 24 horas se midió la densidad óptica a 540 nm en un TECAN infinite M200P O. Para evaluar la actividad antagónica de los extractos, se compararon contra el biocida sulfato de cobre (CuS0 ), que actuó como control. Barras indican desviación estándar y letras indican agrupaciones estadísticas obtenidas mediante un ANOVA de dos dimensiones y posterior un test de tukey con un nivel de significancia del 0,05.
Las bacterias del microfouling (S51 y DM52) usadas en este estudio, fueron obtenidas desde cultivos en TSBm 25% de 48 horas de crecimiento, a una concentración de 10 5 UFC/ml. Para obtener la concentración se les midió la densidad óptica a 540 nm, usando como blanco TSBm 25%; se tomó como referente que una densidad óptica de 0,2 equivale a una concentración de 10 8 UFC/mL. Ejemplo 6: Selección de extractos de algas atractantes mediante ensayos de quimiotaxis
Desde cultivos en placa TSAm 25% de AL1M7 se traspasó una colonia de cada aislado a 5 mL de TSBm 25% y se dejó crecer por 48 horas a 15°C, se concentró el crecimiento en una centrifuga por 5 minutos a 5000 rpm; el mismo procedimiento se repitió con las bacterias del microfouling. El ensayo se dispuso en una placa petri con PBSm soft al 0,4% y se distribuyeron discos de agar con los extractos algales previamente inmovilizados, el concentrado de bacterias epibiontes y bacterias del microfouling se distribuyó en línea recta por el centro de la placa (Fig. 4). Se utilizó CuS04 a 1000 ppm como control negativo, PBS al 1,5% como control neutro, y TSAm al 25%, como control positivo.
Los mejores extractos atractantes fueron obtenidos desde la macroalga verde Ulva sp. los cuales mostraron atracción hacia diversas bacterias epibiontes antimicrofouling incluida la AL1M7 (Tabla 2) TABLA 2: Movilidad de epibiontes algales con actividad antagónica hacia extractos de algas. Se representa la atracción o quimiotaxis positiva (+) y la ausencia de esta (-).
Ejemplo 7: Formulación de la biopintura.
Una vez obtenidos los extractos de U/va sp, bacterias antimicrofouling (AL1M7 y M9C), estos fueron inmovilizados en una matriz polimérica a base de agua (c.s.p), donde se observó que esta mezcla de matriz polimérica junto a extractos bacterianos ha mostrado en ensayos de laboratorio frente a "bacterias del microfouling" halos de inhibición similares a pinturas antimicrobianas controles utilizadas en el mercado.
En la tabla 3 se presentan las formulaciones de pinturas antifouling utilizadas en los ensayos. TABLA 3. Bases de pinturas y extractos de bacterias usadas para pintar láminas de acero
para ensayos de ex situ (microcosmos) e in situ (borde costero Bahía Dichato).
Pintura Extracto Concentración (p/v).
AL1M7 1,25
Biopintura M9C 1,25
Ulva sp. 25
Control Negativo Pintura base + DMSO
(25%)
Control Positivo SeaVoyage, Sherwin Williams
Ejemplo 8: Análisis de la actividad antibacteriana de la pintura formulada.
Mediante ensayos ex situ (microcosmos) con inmersión estática e in situ (terreno , ) en el borde costero de la bahía de Dichato, se evaluaron las biopinturas preparadas. Para esto, placas de acero inoxidable espejo de 5x2 cm2 {ex situ) y 5xl0cm2 {in situ) fueron pintadas con la mezcla de biopinturas señalados en la Tabla 3, se utilizó como control positivo una pintura antifouling natural (SeaVoyage, Sherwin Williams) y como control negativo la matriz en la que se formularon las biopinturas más DMSO.
Las láminas fueron evaluadas a 0, 15 y 30 días. El fouling formado sobre la lámina fue recuperado y usando este, se midió la turbidez mediante densidad óptica (620 nm), y se capturó imágenes en microplacas (Fig. 5A, C); además se realizó recuento de bacterias viables en TSAm 25% mediante microgotas de 5 μΙ del agua circundante (Fig. 5B). En la figura 5 podemos ver la sinergia que existe entre los extractos utilizados, apreciándose una disminución de la presencia de fouling en las superficies tratadas e inocuidad en el agua circundante mediante la presencia de bacterias.
Para el ensayo in situ los soportes de acero recubiertos con la biopintura fueron montados en terreno en el submareal costero en Dichato, aprox. 1,5 m desde el fondo (Fig. 6 B). Las láminas fueron recuperadas a los 5 días, el fouling adherido a su superficie fue recuperado y utilizado para medir la turbidez mediante densidad óptica (620 nm) y se capturó imágenes en microplacas (Fig. 6A, C).