可用于检测抗人乳头瘤病毒抗体的抗原、 试剂盒及其应用 技术领域

本发明涉及抗体检测技术领域， 特别涉及抗人乳头瘤病毒 (Human Papillomavirus , HPV) 抗体检测技术领域， 具体是指一种用于检测抗人乳头瘤病毒抗体的 抗原、 相关免疫检测试剂 盒及其应用， 尤其用于高危险型人乳头瘤病毒 (HPV)亚型 HPV16和 HPV18。 背景技术

子宫颈癌是第二位常见女性恶性肿瘤， 人乳状瘤病毒 (HPV)是其发生的必要条件。 尽管 人群 HPV感染很普遍， 如： 宫颈癌高发区妇女 35岁以后感染率仍高达 20.8%。 但超过 80% 的 HPV DNA阳性妇女不会进展为癌症或癌前病变。 因此 HPV DNA检测缺陷是无法分辨一 过性感染和可引起宫颈病变的感染， 导致较高假阳性率。 大量研究显示， HPV致癌基因表达 产物 (癌蛋白 oncoprotein)有很高的致癌活性，因此这些生物标 志物有可以作为比 HPV DNA更 为准确有特异性的宫颈癌预测指标。 高危 HPV E2、 E6、 E7癌蛋白（oncoprotein)的表达水平和 宫颈癌前病变不同阶段直接相关。 利用这一特性可以构建全新的宫颈癌分子筛查 指标。

对 HPV致癌机理的研究表明， 高危型 HPV 的早期表达蛋白 E6 , E7蛋白在宫颈癌的发 生中起着重要作用。 在宫颈高度病变和癌症患者的宫颈上皮细胞中 HPV E6 及 E7 蛋白一般 呈过度表达， 持续表达和过量表达的 E6 , E7致癌蛋白可与宿主细胞调控蛋白（如， P53和 Rb 蛋白等)相互作用， 使肿瘤抑制因子失活， 导致细胞永生化和恶性转化。

除了 HPV DNA检测和 HPV致癌蛋白检测， 血液 (体液)中 HPV抗体也证明对 HPV感染 及宫颈癌发病史有很大的相关性。 HPV L1血液抗体可用标准 ELISA方法检测， 提供 HPV 感染信息。 随着 HPV感染时间的延长， HPV诱导产生了抗 HPV抗体， 故可检测到血清中抗 HPV抗体。 Wikstrom等检测了 47例男性现症尖锐湿疣患者和 32例曾有尖锐湿疣病史患者的 男性对 HPV6型和 HPV11型衣壳蛋白的血清 IgG抗体，并与 205例无生殖器尖锐湿疣病史的 男性比较， 结果， 血清中抗 HPV6型的 IgG抗体在曾有尖锐湿疣病史的男性中为 35%, 在现 症尖锐湿疣中为 27% , 而在对照组为 10%。 这表明抗 HPV6 IgG抗体的出现发生在尖锐湿疣 病期的晚些时候， 同时 IgG阳性也反映曾感染过这种病毒。

Stone 等报道了利用此方法对于美国普通人群 7218例 HPV-16的感染率研究， 结果表明 女性阳性率 17.9% , 男性阳性率 7.9%。 HPV L1 抗体 ELISA方法在配合 HPV疫苗 (Merck公 司 Gardasil预防性疫苗）的研发及临床试验过程中� ��被广泛釆用。 Luevano 等用蛋白芯片例 宫颈癌病人的血清样品进行了高通量检测分析 ， 分析 13个 HPV型的总共 54604种蛋白的抗 体 profiling, 结果表明了血液中致癌蛋白的抗体与宫颈癌、 高度病变、 低度病变、 及无症状 普通人有较强的相关性 (Luevano, M.， et al, High-Throughput Profiling of the Humoral Immune Responses Against Thirteen Human Papillomavirus Types by Proteome Microarrays. 2010. Virology. 2010; 405(1): 31-40)。

因此， 为了实现 HPV抗体检测的高灵敏度、 高特异性和高稳定性， 需要提供新的用于检 测抗人乳头瘤病毒抗体的抗原。 发明内容

为了解决上述存在的问题， 本发明的目的是提供一种用于检测抗人乳头瘤 病毒抗体的抗 原肽及相关免疫检测试剂盒， 该用于检测抗人乳头瘤病毒抗体的抗原肽可以 高灵敏度、 高特 异性和高稳定性地检测血液、唾液或其它样品 中的 HPV抗体，从而可以为医生准确诊断病人 宫颈上皮内瘤变和子宫颈癌带来依据， 进而及时釆取治疗， 以防止癌症发生， 或癌症扩散， 及时减轻病人痛苦， 由其制成的免疫检测试剂盒可以快速简单准确 地检测血液、 唾液或其它 样品中的 HPV抗体， 适于大规模推广应用。 本发明的第一方面， 提供了一种人乳头瘤病毒抗原肽， 所述的抗原肽源自人乳头瘤病毒 的 E7蛋白， 并且所述抗原肽的长度为 5-50个氨基酸， 并且所述的抗原肽可结合于抗人乳头瘤 病毒的抗体。 所述抗原肽的长度可以为 5、 10、 15、 20、 25、 30、 35、 40、 45、 50个氨基酸。

在另一优选例中， 所述的抗体包括单克隆抗体、 多克隆抗体或抗血清。 在另一优选例中， 所述抗原肽的第 m+2位、 第 m+3位、 第 m+5位、 第 m+6位为 Asp、 Ser、 Glu、 Glu和 /或第 m+8-m+12位氨基酸依次为 Asp、 Glu、 Ile、 Asp和 Gly, 其中 m≥0且 m为整数。 在另一优选例中， 所述抗原肽的结构如式 I所示

[XaaO]-[Xaal]-[Xaa2]-[Xaa3]-[Xaa4]-[Xaa5]-[Xaa6] (I)

式中，

XaaO为无， 或 1-5个氨基酸构成的肽段；

Xaal为 DS;

Xaa2选自 S或 E;

Xaa3为 EE;

Xaa4选自 E或 N;

Xaa5为 DEIDG;

Xaa6为无、 或长度为 1-30个氨基酸构成的肽段。

在另一优选例中， XaaO和 /或 Xaa6不为无。

在另一优选例中， XaaO和 /或 Xaa6的肽段序列为来源于 HPV的 E7蛋白序列。

在另一优选例中，对于 XaaO和 /或 Xaa6而言， 所述的 "来源于 HPV的 E7蛋白序列"指 XaaO 的肽段序列来自于 HPV的 E7蛋白的、且直接位于 Xaal上游的序列和 /或 Xaa6的肽段序列来自于 HPV的 E7蛋白的、 且直接位于 Xaa5下游的序列。

在另一优选例中， 所述的 E7蛋白包括野生型和突变型的 E7序列。

在另一优选例中，所述的 HPV病毒包括 HPV16、 HPV18、 HPV31、 HPV33、 HPV35、 HPV39、 HPV45、 HPV51、 HPV52、 HPV56、 HPV58、 HPV59、 HPV68。

在另一优选例中， XaaO为 1个、 2个或 3个氨基酸构成肽段， 如 &&0为8、 LN或 IDG。 在另一优选例中， Xaa6为长度大于 10个 (如 10-20个， 较佳地 11-18个)氨基酸构成的肽段。 在另一优选例中， 所述的 Xaa6为 SEQ ID NO.: 3中第 14-24位。

在另一优选例中， 所述的 Xaa6为 SEQ ID NO.: 5中第 13-28位。

在另一优选例中， 所述的抗原肽包括盐和非盐形式。 在另一优选例中， 所述的盐为药学 上可接受的盐 在另一优选例中， 所述抗原肽的结构如式 II所示，

[YaaO]-[Yaal]-[Yaa2]-[Yaa3]-[Yaa4]-[Yaa5] (II)

式中，

YaaO为无， 或 1-30个氨基酸构成的肽段；

Yaal为 DS;

Yaa2选自 S或 E;

Yaa3为 EE;

Yaa4选自 E或 N;

Yaa5为无、 或长度为 1-30个氨基酸构成的肽段。

在另一优选例中， YaaO和 /或 Yaa5不为无。

在另一优选例中， 所述 YaaO为 5-25个氨基酸构成的肽段且 Yaa5为 1-10个氨基酸构成的肽 段。 优选地， YaaO为 10-25个氨基酸构成的肽段且 Yaa5为 1-10个氨基酸构成的肽段。

在另一优选例中， 所述 YaaO为 1-5个氨基酸构成的肽段且 Yaa5为 10-25个氨基酸构成的肽 段。 优选地， YaaO为 1-5个氨基酸构成的肽段且 Yaa5为 15-25个氨基酸构成的肽段。

在另一优选例中， YaaO和 /或 Yaa5的肽段序列为来源于 HPV的 E7蛋白序列。

在另一优选例中， 对于 YaaO和 /或 Yaa5而言， 所述的 "来源于 HPV的 E7蛋白序列" 指 YaaO 的肽段序列来自于 HPV的 E7蛋白的、且直接位于 Yaa 1上游的序列和 /或 Yaa5的肽段序列来自于 HPV的 E7蛋白的、 且直接位于 Yaa4下游的序列。

在另一优选例中， 所述的 E7蛋白包括野生型和突变型的 E7序列。

在另一优选例中，所述的 HPV病毒包括 HPV16、 HPV18、 HPV31、 HPV33、 HPV35、 HPV39、 HPV45、 HPV 51、 HPV 52、 HPV 56、 HPV 58、 HPV 59、 HPV 68。

在另一优选例中， 所述的抗原肽包括盐和非盐形式。 在另一优选例中， 所述的盐为药学 上可接受的盐。 在另一优选例中， 所述的抗原肽选自下组： SEQ ID NO.: 3、 SEQ ID NO.: 5、 或其组合。 在另一优选例中， 所述的抗原肽选自下组：

(a)具有 SEQ ID ΝΟ:1-5任一所示氨基酸序列的多肽；

(b)具有与 SEQ ID ΝΟ:1-5中任一所示氨基酸序列 > 80%同源性的多肽，且所述多肽具有与 抗人乳头瘤病毒的抗体的结合能力；

(c)将 SEQ ID ΝΟ:1-5中任一所示氨基酸序列经过 1-5个氨基酸残基的取代、 缺失或添加而 形成的， 且保留与抗人乳头瘤病毒的抗体结合能力的衍 生多肽。

在另一优选例中， 所述的抗人乳头瘤病毒的抗体是抗 HPV病毒 E7蛋白的抗体。

在另一优选例中， 所述抗原肽釆用化学合成或生物工程方法获得 ， 包括重组蛋白、 融合 蛋白。 本发明的第二方面， 提供了一种融合蛋白， 所述融合蛋白含有本发明第一方面的抗原肽 和任选的标签序列。 本发明的第三方面， 提供了一种分离的核酸分子， 所述核酸分子编码根据本发明第一方 面所述的抗原肽或根据本发明第二方面的融合 蛋白。 本发明的第四方面， 提供了一种组合物， 其特征在于， 它含有：

(a)本发明第一方面的人乳头瘤病毒抗原肽或其 药学上可接受的盐， 或根据本发明第二方 面的融合蛋白； 和

(b) 药学上可接受的载体或赋形剂。

在另一优选例中， 所述的组合物包括药物组合物和疫苗组合物。 本发明的第五方面， 提供了根据本发明第一方面的人乳头瘤病毒抗 原肽的用途， 其特征 在于， 用于制备检测 HPV的试剂或试剂盒； 或

用于制备预防或治疗人乳头瘤病毒感染的药物 ； 或

用于检测抗人乳头瘤病毒抗体。

在另一优选例中， 所述的试剂包括检测片、 检测板、 蛋白芯片、 液基芯片、 磁珠。

在另一优选例中， 所述药物选自疫苗或抗体。

在另一优选例中， 所述抗人乳头瘤病毒抗体为人体液样品中的抗 人乳头瘤病毒抗体。 优 选地， 所述体液是血液或唾液 本发明的第六方面， 提供了一种免疫检测试剂盒， 所述试剂盒包括根据本发明第一方面 的用于检测抗人乳头瘤病毒抗体的抗原肽。 所述试剂盒中可以包括一种或多种根据本发明 第 一方面的用于检测抗人乳头瘤病毒抗体的抗原 肽。

在另一优选例中， 所述试剂盒还包括载体， 所述的用于检测抗人乳头瘤病毒抗体的抗原 肽包被在所述载体上。

在另一优选例中， 所述免疫检测试剂盒还包括标记的抗人乳头瘤 病毒抗体的二抗。 二抗 用来检测人血清中的抗体 IgG, IgM, 或 IgA. 所用标记物可以是辣根过氧化物酶， 碱性磷酸 酶， 荧光分子 FITC (或其它荧光标记)， 化学发光检测。 检测方法可以是显色法， 荧光方法， 化学发光， 电化学发光法进行定性、 定量分析。

在另一优选例中， 所述的标记的抗人乳头瘤病毒抗体的二抗是辣 根过氧化物酶标记的抗 人乳头瘤病毒抗体的二抗。 应理解， 在本发明范围内中， 本发明的上述各技术特征和在下文（如实施例 ）中具体描述 的各技术特征之间都可以互相组合， 从而构成新的或优选的技术方案。 限于篇幅， 在此不再 一一累述。 本发明的有益效果在于病人在被病毒感染后， 可在血清和口腔唾液中高特异性、 高灵敏 度地检测出现的特异性的抗体 IgM, IgA或 IgG分子， 从而可以为医生准确诊断病人宫颈上 皮内瘤变和子宫颈癌带来依据， 进而及时釆取治疗， 以防止癌症发生， 或癌症扩散， 及时减 轻病人痛苦， 以此制成的免疫检测试剂盒， 可以快速简单准确地检测血液或唾液中的 HPV抗 体， 适于大规模推广应用。 具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究， 设计并合成了几十种具有不同序列的人乳头瘤 病毒抗 原肽， 并从中筛选出了具有优异灵敏性和特异性的抗 原肽。 具体而言， 本发明人应用生物信 息学的方法， 基于同源性分析和生物学特性 (包括免疫原性)等分析， 设计了数十个候选序列， 釆用固相法将其合成，分离纯化获得高纯度的 多肽片段。针对这些候选序列用多肽作为 ELISA 包板抗原， 使用病人血清 (多达 546例宫颈癌、 宫颈病变病人)与健康体检人群 (600多例)样品 进行检测； 并对比 HPV分子检测结果、 TCT细胞形态学结果、 病理诊断结果， 对血清检测的 数据进行统计学分析。经过反复筛选，最终获 得了一类新型的、可结合于抗人乳头瘤病毒 HPV 癌蛋白抗体的抗原肽。 能够用于检测、 预防和治疗人乳头瘤病毒感染， 及相关癌症。 在此基 础上完成了本发明。 活性多肽

如本文所用， 术语 "HPV癌蛋白抗原"、 "HPV癌蛋白抗原肽"、 "人乳头瘤病毒癌蛋白抗 原肽"、 "人乳头瘤病毒癌蛋白抗原 "、 "人乳头瘤病毒抗体的抗原 "、 "多肽抗原 " 可互换使用。 指多肽序列来自于人乳头瘤病毒 (如 HPV16、 HPV18)E7 蛋白的多肽。

如本文所用， 术语 "本发明的 HPV抗原"、 "本发明 HPV抗原肽"、 "本发明人乳头瘤病 毒抗原肽"、 "本发明人乳头瘤病毒抗原肽段" 可互换使用， 指可结合于抗人乳头瘤病毒抗体 的抗原肽 (如 SEQ ID ΝΟ:1至 5所示的多肽)。这些抗原肽能够用于检测 HPV癌基因产物诱导 产生的癌蛋白抗体。 HPV癌蛋白是 HPV病毒侵入细胞后才会表达的癌细胞蛋白标志 物。 此 夕卜， 所述术语还包括具有结合抗人乳头瘤病毒的抗 体功能的、 SEQ ID NO: 1-5序列的变异形 式。 这些变异形式包括 (但并不限于)： 1-3个 (通常为 1-2个， 更佳地 1个)氨基酸的缺失、 插 入和 /或取代， 以及在 C末端和 /或 N末端添加或缺失一个或数个 (通常为 3个以内， 较佳地为 2个以内， 更佳地为 1个以内）氨基酸。 例如， 在本领域中， 用性能相近或相似的氨基酸进行 取代时， 通常不会改变蛋白质的功能。 又比如， 在 C末端和 /或 N末端添加或缺失一个或数 个氨基酸通常也不会改变蛋白质的结构和功能 。 此外， 所述术语还包括单体和多聚体形式的 本发明多肽。 该术语还包括线性以及非线性的多肽 (如环肽)。

本发明还包括人乳头瘤病毒抗原肽的活性片段 、衍生物和类似物。如本文所用，术语 "片 段"、 "衍生物" 和 "类似物" 是指基本上保持与抗人乳头瘤病毒的抗体相结 合的功能或活性 的多肽。 本发明的多肽片段、 衍生物或类似物可以是 (i)有一个或几个保守或非保守性氨基酸 残基 (优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽， 或 (ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团 的多肽， 或 (iii)抗原肽与另一个化合物（比如延长多肽半� ��期的化合物， 例如聚乙二醇)融合所 形成的多肽， 或 (iv)附加的氨基酸序列融合于此多肽序列而形� �的多肽 (与前导序列、 分泌序 列或 6His等标签序列融合而形成的融合蛋白）。 根据本文的教导， 这些片段、 衍生物和类似 物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

一类优选的活性衍生物指与式 I或式 II的氨基酸序列相比， 有至多 3个， 较佳地至多 2 个， 更佳地至多 1个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换� �形成多肽。 这些保守性变异 多肽最好根据表 1进行氨基酸替换而产生。 表 1

发明还提供人乳头瘤病毒抗原肽的类似物。 这些类似物与 SEQ ID NO:l至 5所示的多肽 的差别可以是氨基酸序列上的差异， 也可以是不影响序列的修饰形式上的差异， 或者兼而有 之。 类似物还包括具有不同于天然 L-氨基酸的残基 (如 D-氨基酸)的类似物， 以及具有非天然 存在的或合成的氨基酸 (如 β、 Υ -氨基酸)的类似物。 应理解， 本发明的多肽并不限于上述例 举的代表性的多肽。

修饰 (通常不改变一级结构)形式包括： 体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或 羧 基化。 修饰还包括糖基化， 如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步 骤中进行糖基化修 饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴 露于进行糖基化的酶 (如哺乳动物的糖基化酶或 去糖基化酶)而完成。 修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基 (如磷酸酪氨酸， 磷酸丝氨酸， 磷酸苏氨酸)的序列。 还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或 优化了溶解性能的多肽。

本发明多肽还可以以由药学上或生理学可接受 的酸或碱衍生的盐形式使用。 这些盐包括 (但不限于)与如下酸形成的盐： 氢氯酸、 氢溴酸、 硫酸、 柠檬酸、 酒石酸、 磷酸、 乳酸、 丙 酮酸、 乙酸、 琥珀酸、 草酸、 富马酸、 马来酸、 草酰乙酸、 曱磺酸、 乙磺酸、 苯磺酸、 或羟 乙磺酸。 其他盐包括： 与碱金属或碱土金属 (如钠、 钾、 钙或镁)形成的盐， 以及以酯、 氨基 曱酸酯或其他常规的 "前体药物" 的形式。 编码序列

本发明还涉及编码人乳头瘤病毒抗原肽的多核 苷酸。

本发明的多核苷酸可以是 DNA形式或 R A形式。 DNA可以是编码链或非编码链。 编 码成熟多肽的编码区序列可以与编码 SEQ ID NO:l至 5所示的多肽的序列相同或者是简并的 变异体。 如本文所用， "简并的变异体" 在本发明中是指编码具有 SEQ ID ΝΟ:1至 5所示 的多肽， 但相应编码区序列有差别的核酸序列。

本发明的核苷酸全长序列或其片段通常可以用 PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获 得。 目前， 已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明 多肽 (或其片段，或其衍生物)的 DNA 序列。然后可将该 DNA序列引入本领域中已知的各种现有的 DNA分子 (或如载体)和细胞中。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体， 以及用本发明的载体或多肽编码序列经基 因工程产生的宿主细胞。 制备方法

本发明多肽可以是重组多肽或合成多肽。 本发明的多肽可以是化学合成的， 或重组的。 相应地， 本发明多肽可用常规方法人工合成， 也可用重组方法生产。

一种优选的方法是使用液相合成技术或固相合 成技术，如 Boc固相法、 Fmoc固相法或是 两种方法联合使用。 固相合成可快速获得样品， 可根据目的肽的序列特征选用适当的树脂载 体及合成系统。 例如， Fmoc系统中优选的固相载体如连接有肽中 C端氨基酸的 Wang树脂， Wang树脂结构为聚苯乙烯， 与氨基酸间的手臂是 4-烷氧基苄醇； 用 25%六氢吡啶 /二曱基曱 酰胺室温处理 20分钟， 以除去 Fmoc保护基团， 并按照给定的氨基酸序列由 C端逐个向 N 端延伸。 合成完成后， 用含 4%对曱基苯酚的三氟乙酸将合成的胰岛素原相� ��肽从树脂上切 割下来并除去保护基， 可过滤除树脂后乙醚沉淀分离得到粗肽。 将所得产物的溶液冻干后， 用凝胶过滤和反相高压液相层析法纯化所需的 肽。 当使用 Boc系统进行固相合成时， 优选树 脂为连接有肽中 C端氨基酸的 PAM树脂， PAM树脂结构为聚苯乙烯， 与氨基酸间的手臂是 4-羟曱基苯乙酰胺； 在 Boc合成系统中， 在去保护、 中和、 偶联的循环中， 用 TFA/二氯曱烷 (DCM)除去保护基团 Boc并用二异丙基乙胺 (DIEA/二氯曱烷中和。 肽链缩合完成后， 用含对 曱苯酚 (5-10%)的氟化氢 (HF)，在 0°C下处理 1小时，将肽链从树脂上切下，同时除去保护� �团。 以 50-80%乙酸 (含少量疏基乙醇)抽提肽，溶液冻干后进一步� ��分子筛 Sephadex G10或 Tsk-40f 分离纯化， 然后再经高压液相纯化得到所需的肽。 可以使用肽化学领域内已知的各种偶联剂 和偶联方法偶联各氨基酸残基，例如可使用二 环己基碳二亚胺 (DCC),羟基苯骈三氮唑 (HOBt) 或 1，1，3，3-四脲六氟磷酸酯 (HBTU)进行直接偶联。 对于合成得到的短肽， 其纯度与结构可用 反相高效液相和质谱分析进行确证。

在一优选例中， 本发明人乳头瘤病毒抗原肽， 按其序列， 釆用固相合成的方法制备， 行 高效液相色谱纯化， 获得高纯度目的肽冻干粉， -20°C贮存。

另一种方法是用重组技术产生本发明多肽。 通过常规的重组 DNA技术， 可利用本发明 的多核苷酸来表达或生产本发明的人乳头瘤病 毒抗原肽。 一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码人乳头瘤病毒抗原肽的多� �苷酸 (或变异体)， 或用含有该多核苷酸的 重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞； (2) .在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3) .从培养基或细胞中分离、 纯化蛋白质。

重组多肽可在细胞内、 或在细胞膜上表达、 或分泌到细胞外。 如果需要， 可利用其物理 的、 化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯 化重组的蛋白。 这些方法是本领域技术人 员所熟知的。 这些方法的例子包括但并不限于： 常规的复性处理、 用蛋白沉淀剂处理 (盐析方 法)、 离心、 渗透破菌、 超处理、 超离心、 分子筛层析 (凝胶过滤)、 吸附层析、 离子交换层析、 高效液相层析 (HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结 合。

由于本发明多肽较短， 因此可以考虑将多个多肽串联在一起， 重组表达后获得多聚体形 式的表达产物， 然后通过酶切等方法形成所需的小肽。 药物组合物和施用方法

本发明的抗原肽或融合蛋白可作为免疫原在体 内诱导产生抗 HPV或 HPV阳性细胞 (癌细 胞)的抗体及淋巴 T细胞活性， 从而达到抗癌治疗效果。 此外， 本发明抗原肽具有优异的特异 性和免疫活性， 故可用于制备免疫治疗或预防的抗癌症疫苗。

另一方面， 本发明还提供了一种药物组合物（包括疫苗组 合物）， 它含有 (a)安全有效量的 本发明多肽或其药学上可接受的盐 (或其编码序列）； 以及 (b)药学上可接受的载体或赋形剂。 本发明多肽的数量通常为 10微克 -100毫克 /剂， 较佳地为 100-1000微克 /剂。

为了本发明的目的，有效的剂量为给予个体约 0.01毫克 /千克至 50毫克 /千克，较佳地 0.05 毫克 /千克至 10毫克 /千克体重的本发明多肽。 此外， 本发明的多肽可以单用， 也可与其他治 疗剂一起使用（如配制在同一药物组合物中） 。

药物组合物还可含有药学上可接受的载体。 术语 "药学上可接受的载体" 指用于治疗剂 给药的载体。 该术语指这样一些药剂载体： 它们本身不诱导产生对接受该组合物的个体有 害 的抗体，且给药后没有过分的毒性。这些载体 是本领域普通技术人员所熟知的。在 Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Pub. Co. , N.J. 1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充� �� 讨论。 这类载体包括 (但并不限于）： 盐水、 緩冲液、 葡萄糖、 水、 甘油、 乙醇、 佐剂及其组 合。

治疗性组合物中药学上可接受的载体可含有液 体， 如水、 盐水、 甘油和乙醇。 另外， 这 些载体中还可能存在辅助性的物质， 如润湿剂或乳化剂、 pH緩冲物质等。

通常， 可将治疗性组合物制成可注射剂， 例如液体溶液或悬液； 还可制成在注射前适合 配入溶液或悬液中、 液体载体的固体形式。

一旦配成本发明的组合物， 可将其通过常规途径进行给药， 其中包括 (但并不限于)： 肌 内、 静脉内、 皮下、 皮内或局部给药。 待预防或治疗的对象可以是动物； 尤其是人。

当本发明的药物组合物被用于实际治疗时， 可根据使用情况而釆用各种不同剂型的药物 组合物。 较佳地为注射剂。

这些药物组合物可根据常规方法通过混合、 稀释或溶解而进行配制， 并且偶尔添加合适 的药物添加剂， 如赋形剂、 崩解剂、 粘合剂、 润滑剂、 稀释剂、 緩冲剂、 等渗剂 (isotonicities)、 防腐剂、 润湿剂、 乳化剂、 分散剂、 稳定剂和助溶剂， 而且该配制过程可才艮据剂型用惯常方 式进行。

本发明的药物组合物还可以緩释剂形式给药。 例如， 人乳头瘤病毒抗原肽或其盐可被掺 入以緩释聚合物为载体的药丸或微嚢中， 然后将该药丸或微嚢通过手术植入人的组织。 作为 緩释聚合物的例子， 可例举的有乙烯-乙烯基乙酸酯共聚物、 聚羟基曱基丙烯酸酯 (polyhydrometaacrylate) , 聚丙烯酰胺、 聚乙烯吡咯烷酮、 曱基纤维素、 乳酸聚合物、 乳酸-乙 醇酸共聚物等， 较佳地可例举的是可生物降解的聚合物如乳酸 聚合物和乳酸-乙醇酸共聚物。

当本发明的药物组合物被用于预防或治疗时， 作为活性成分的人乳头瘤病毒抗原肽或其 药学上可接受的盐的剂量， 可根据待预防或治疗的每个对象 (病人)的体重、 年龄、 性别、 症 状程度而合理地加以确定。 本发明的主要优点包括：

(a)本发明的人乳头瘤病毒抗原肽具有与抗人乳 头瘤病毒抗体特异性结合的能力， 且灵敏 度高、 特异性强；

(b)本发明人乳头瘤病毒抗原肽长度适中， 易于制备；

(c) 能够简便地对血液、 唾液或其它体液进行检测。 下面结合具体实施例， 进一步阐述本发明。 应理解， 这些实施例仅用于说明本发明而不 用于限制本发明的范围。 下列实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照常规条件如 Sambrook等人， 分子克隆： 实验室手册 (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) 中所述的条件， 或按照制造厂商所建议的条件。 实施例 1

一、 材料与方法

1、 试剂和药品

辣根过氧化物酶标记羊抗人 (Goat Anti-Human IgG，FC), 购自 Priece Product # 31413 。 2、 仪器和耗材

MULTISKAN MK3酶标仪 (Thermo公司）； 酶标板 (COSTAR公司）。

3、 主要溶液系统

• 包被緩冲液 (PBS磷酸盐溶液)： 磷酸二氢钾 0.2g, 12水磷酸氢二钠 2.9g, 氯化 钠 8.0g, 氯化钾 0.2g, 加蒸馏水至 1L, 4度保存。

• 洗涤緩冲液 (PBS-Tween 20, 0.1%): Tween-20 lmL, 加入到 1L稀释緩冲液 (PBS) 中， 搅拌混匀， 调 pH值到 7.0 ~ 7.2之间。

• 封闭液： 5%milk-PBS-Tween

• 血清稀释液： 10%FBS- PBS-Tween

. TMB显示液： Amresc, CAT NO.64285730, 用前 TMB 底色显色 A液和 B液等 体积混合。

o 底物显色 A液： 乙酸钠 13.6g, 柠檬酸 1.6g, 双氧水 (30%) 0.3ml, 蒸馏水加 至 500ml。

o 底物显色 B液： 乙二胺四乙酸二钠 0.2g柠檬酸 0.95g甘油 50ml 四曱基联 苯胺 0.2g 蒸馏水加至 500ml。

• 终止液 (2mol/L H2S04): 双蒸水 178.3mL, 滴加浓4酸(98%)21.7 1^。

4、 间接 ELISA方法的建立

1)用 PBS 稀释 HPV 多肽抗原 HPV16-1/HPV16-2/HPV16-3/HPV18-1/HPV18-2 浓度为

4ug/ml, 包被 costar板条 lOOul/孔， 4°C 过夜。

2) PBS洗涤一次， 拍干。

3)加入 5%奶粉 -PBS封闭， 250ul/孔， 37度 3小时。

4) PBST洗涤一次， 拍干。

5)10%FBS-PBST稀释血清 1 : 50稀释， 振荡器混匀。

6)加入稀释好的血清， 空白对照， 阴性对照以及阳性对照， 50ul/孔， 37度孵育 1小时。

7) 0.1 %tween-PBS洗涤 5次， 拍干。

8)加入辣根过氧化物酶标记羊抗人， 用 10%FBS -PBST稀释 (1 : 40000), lOOul/孔， 37度 孵育 30分钟。

9)0.1%tween-PBS 洗涤 5次， 拍干。

10) TMB显色: TMB A液和 B液等体积混合， lOOul/孔， 37度 20min。

11) 2M H ₂ S0 ₄ , 50ul/孔终止， 用酶标仪 450nm读数。

5、 试剂盒组成：

本试剂盒由以下几个部分组成：

1. 包被本发明的用于检测抗人乳头瘤病毒抗体的 抗原的 costar酶标板一块

2. 辣根过氧化物酶标记羊抗人一管（lOul)

3. 10*PBST—瓶 (10ml)

4. TMB显色液 A液一瓶 (6ml) , Β液一瓶 (6ml)

5. 终止液一瓶 (6ml)

6、 包被抗原

多肽抗原如下

SEQ ID

名称 序列 备注

NO.:

16E7蛋白的第

HPV16-1 KCDSTLRLCVQSTHVDIRTLE 1

60-80位

16E7蛋白的第

HP VI 6 -2 PTLHEYMLDLQPETTDLYCYEQLNDSSEEE 2

6-35位

16E7蛋白的第

HPV16-3 LNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAH 3

28-51位

18E7蛋白的第

HPV18-1 IDGVNHQHLPARRAEPQR 4

41-58位

HPV18-2 SDSEEENDEIDGVNHQHLPARRAEPQRH 5 18E7蛋白的第 32-59位

SEQ ID NO.:2-5的序列比对结果如下：

SEQ ID NO. : 2： PTLHEYMLDLQPETTDLYCYEQLNDSSEEE

SEQ ID NO. : 3 : LNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAH

SEQ ID NO. : 4 : IDGVNHQHLPARRAEPQR

SEQ ID NO. : 5 : SDSEEENDEIDGVNHQHLPARRAEPQRH 二、 检测结果

试剂盒选择 5条多肽 (SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 , SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5)作为包被选择， 通过 ELISA方法检测血清， 记录每个样本的 OD值 (450nm波 长)。

1、 用包被抗原并封闭过的酶标板通过 ELISA方法检测健康人血清， 检测的原始数据结 果如下。

表一： HPV血液 ELISA检测正常人血清结果表

血清编号 SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: 5 正常人 1号 0.237 0.232 0.300 0.367 0.237 正常人 2号 0.320 0.238 0.384 0.503 0.342 正常人 3号 0.427 0.319 0.529 0.484 0.364 正常人 4号 0.373 0.265 0.401 0.991 0.882 正常人 5号 0.338 0.198 0.367 0.606 0.468 正常人 6号 0.276 0.227 0.391 0.251 0.221 正常人 7号 0.232 0.214 0.311 0.278 0.252 正常人 8号 0.284 0.267 0.406 0.506 0.289 正常人 9号 0.286 0.283 0.419 0.382 0.365 正常人 10号 0.226 0.168 0.249 0.229 0.169 正常人 11号 0.266 0.213 0.320 0.378 0.275 正常人 12号 0.303 0.212 0.389 0.422 0.312 正常人 13号 0.250 0.262 0.402 0.575 0.345 正常人 14号 0.343 0.277 0.179 0.278 0.243 正常人 15号 0.422 0.169 0.129 0.357 0.242 正常人 16号 0.372 0.132 0.127 0.307 0.306 正常人 17号 0.729 0.272 0.274 0.664 0.420 正常人 18号 0.502 0.390 0.229 0.437 0.349 正常人 19号 0.526 0.383 0.241 0.461 0.309 正常人 20号 0.482 0.508 0.265 0.417 0.339 正常人 21号 0.584 0.446 0.395 0.519 0.415 正常人 22号 0.539 0.451 0.319 0.474 0.410 正常人 23号 0.500 0.294 0.205 0.435 0.303 正常人 24号 0.472 0.372 0.253 0.407 0.294 正常人 25号 0.616 0.405 0.265 0.551 0.373 正常人 26号 0.704 0.480 0.430 0.639 0.626 正常人 27号 0.519 0.335 0.288 0.454 0.247 正常人 28号 0.750 0.450 0.359 0.685 0.374 正常人 29号 0.549 0.359 0.270 0.484 0.242 正常人 30号 0.333 0.261 0.275 0.277 0.217 正常人 31号 0.277 0.192 0.262 0.329 0.301 正常人 32号 0.375 0.283 0.369 0.474 0.376 正常人 33号 0.264 0.201 0.212 0.281 0.205 正常人 34号 0.293 0.257 0.312 0.275 0.255 正常人 35号 0.323 0.267 0.449 0.291 0.201 正常人 36号 0.280 0.256 0.354 0.310 0.281 正常人 37号 0.171 0.137 0.160 0.398 0.285 正常人 38号 0.267 0.180 0.190 0.475 0.455 正常人 39号 0.201 0.123 0.163 0.370 0.215 正常人 40号 0.202 0.187 0.276 0.473 0.273 正常人 41号 0.206 0.298 0.119 0.181 0.183 正常人 42号 0.288 0.455 0.155 0.263 0.233 正常人 43号 0.224 0.186 0.213 0.296 0.255 正常人 44号 0.219 0.206 0.243 0.184 0.398

2、 选择 2条多肽 (SEQ ID NO: 3 , SEQ ID NO: 5)作为包被选择并封闭过的酶标板通过 ELISA方法检测正常人血清， 检测的原始数据结果如下；

表二： HPV血液 ELISA检测正常人血清结果表

血清编号 SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 5 血清编号 SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 5

N B1号 0.562 0.575 N B101号 0.947 0.989

N B2号 0.232 0.436 N B102号 0.650 0.606

N B4号 0.894 0.766 N B103号 0.464 0.618

N B5号 0.573 0.415 N B104号 0.777 0.327

N B6号 0.768 0.644 N B105号 0.605 0.669

N B7号 0.643 0.538 N B106号 0.347 0.342

N B8号 0.717 0.621 N B107号 0.642 0.626

N B9号 0.649 0.509 N B108号 1.125 0.958

N B10号 0.514 0.477 N B109号 0.517 0.480

N B11号 0.653 0.558 N B110号 0.703 0.638 NB12号 0.983 1.006 NB111号 0.769 0.725

NB13号 0.745 0.635 NB112号 0.543 0.414

NB14号 0.423 0.340 NB113号 0.318 0.410

NB15号 0.490 0.399 NB114号 1.017 1.195

NB16号 0.747 0.617 NB115号 1.106 0.865

NB17号 0.669 0.554 NB116号 0.609 0.600

NB18号 0.770 0.683 NB117号 0.931 0.791

NB19号 0.490 0.401 NB118号 0.660 0.674

NB20号 0.556 0.319 NB119号 0.884 0.667

NB21号 0.879 0.634 NB120号 1.253 1.380

NB22号 0.397 0.363 NB121号 0.575 0.588

NB23号 0.463 0.402 NB122号 0.690 0.630

NB24号 0.657 0.572 NB123号 0.612 0.536

NB25号 0.824 0.526 NB124号 1.018 0.685

NB27号 0.996 0.880 NB125号 0.371 0.276

NB28号 0.463 0.384 NB126号 0.619 0.435

NB29号 1.100 0.651 NB127号 0.473 0.335

NB30号 0.373 0.328 NB128号 0.679 0.540

NB31号 0.725 0.678 NB129号 0.758 0.621

NB32号 0.664 0.422 NB130号 0.518 0.390

NB33号 0.464 0.354 NB131号 0.301 0.306

NB34号 0.689 0.628 NB132号 0.519 0.491

NB35号 0.503 0.437 NB133号 0.595 0.506

NB36号 0.382 0.390 NB134号 0.672 0.618

NB37号 0.784 0.697 NB135号 0.452 0.380

NB38号 0.521 0.442 NB136号 0.582 0.533

NB39号 0.392 0.331 NB137号 1.068 0.910

NB40号 0.473 0.393 NB138号 0.570 0.537

NB41号 0.448 0.443 NB139号 0.631 0.634

NB42号 0.365 0.582 NB140号 0.316 0.294

NB43号 0.679 0.618 NB141号 0.685 0.606

NB44号 0.316 0.301 NB142号 0.499 0.473

NB45号 0.306 0.301 NB143号 0.828 0.737

NB46号 0.367 0.352 NB144号 0.501 0.533

NB47号 0.289 0.237 NB145号 0.478 0.448

NB48号 0.283 0.258 NB146号 0.517 0.537

NB49号 0.354 0.317 NB147号 0.554 0.486 NB50号 0.876 0.903 NB148号 0.416 0.357

NB51号 0.615 0.617 NB149号 0.704 0.515

NB52号 0.606 0.462 NB150号 0.491 0.357

NB53号 0.440 0.365 NB151号 0.479 0.403

NB54号 0.612 0.458 NB152号 0.797 0.619

NB55号 0.837 0.707 NB153号 0.662 0.594

NB56号 0.583 0.487 NB154号 0.744 0.612

NB57号 0.495 0.384 NB155号 0.305 0.237

NB58号 0.666 0.559 NB156号 1.027 0.931

NB59号 0.888 0.799 NB157号 0.628 0.485

NB60号 0.682 0.621 NB158号 0.320 0.230

NB61号 0.433 0.398 NB159号 0.414 0.328

NB62号 0.783 0.626 NB160号 0.538 0.435

NB63号 0.404 0.334 NB161号 0.282 0.348

NB64号 0.515 0.418 NB162号 0.484 0.453

NB65号 0.982 0.793 NB163号 0.341 0.308

NB66号 0.364 0.348 NB164号 0.552 0.425

NB67号 0.518 0.501 NB165号 0.631 0.459

NB68号 0.469 0.438 NB166号 0.480 0.385

NB69号 0.496 0.487 NB167号 0.774 0.615

NB70号 0.536 0.469 NB168号 0.552 0.467

NB71号 0.430 0.507 NB169号 0.493 0.350

NB72号 1.482 1.469 NB170号 0.384 0.329

NB73号 0.611 0.579 NB171号 0.473 0.437

NB74号 0.534 0.517 NB172号 0.299 0.282

NB75号 0.522 0.507 NB173号 0.257 0.254

NB76号 0.448 0.368 NB174号 0.324 0.329

NB77号 0.500 0.515 NB175号 0.176 0.193

NB78号 0.425 0.344 NB176号 0.258 0.243

NB79号 0.739 0.554 NB177号 0.358 0.396

NB80号 0.504 0.437 NB178号 0.646 0.697

NB81号 0.684 0.525 NB179号 0.486 0.442

NB82号 0.787 0.675 NB180号 0.507 0.587

NB83号 0.998 1.021 NB181号 0.207 0.265

NB84号 0.893 0.701 NB182号 0.703 0.629

NB85号 0.698 0.580 NB183号 0.447 0.370

NB86号 0.873 0.958 NB184号 0.364 0.399 N B87号 1.370 1.241 N B185号 0.289 0.261

N B88号 0.591 0.493 N B186号 0.595 0.452

N B89号 0.591 0.488 N B187号 0.620 0.643

N B90号 0.659 0.641 N B188号 0.317 0.329

N B91号 0.512 0.454 N B189号 0.468 0.480

N B92号 0.724 0.634 N B190号 0.365 0.339

N B93号 1.038 0.854 N B191号 0.426 0.397

N B94号 0.448 0.455 N B192号 0.548 0.520

N B95号 0.589 0.542 N B193号 1.121 1.128

N B96号 0.590 0.592 N B194号 0.866 0.804

N B97号 1.218 1.009

N B98号 0.560 0.522

N B99号 0.295 0.385

N B100号 0.459 0.476

3、 选择 5条多肽 (SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 , SEQ ID NO: 4, SEQ

ID NO: 5)作为包被选择包被并封闭过的酶标板通过 ELISA方法检测病人血清， 病人的病理 诊断结果如表三中所示， 其中部分病人经过 HC2病理检验， 结果如下：

表三： HPV血液 ELISA检测病人血清结果表

SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID

血清编号 病理资料 NO: 1 NO: 2 NO: 3 NO: 4 NO: 5 病人 1号 CIN III 0.917 0.533 0.723 0.852 0.643 病人 2号 CIN II 1.290 0.640 0.714 1.225 1.085 病人 3号 CIN II 0.782 0.516 0.295 0.822 0.684 病人 4号 CIN III 1.100 0.708 0.676 1.413 0.886 病人 5号 子宫颈癌 0.489 0.344 0.447 0.708 0.536 病人 6号 卵巢癌 0.472 0.419 0.447 1.035 0.535 病人 7号 子宫肌瘤 0.909 0.326 0.263 0.844 0.395 病人 8号 宫颈病变 0.566 0.507 0.492 0.930 0.693 病人 9号 CIN III 0.292 0.191 0.184 0.578 0.498 病人 10号 CIN III 1.122 0.833 0.768 1.340 1.025 病人 11号 盆块 0.466 0.271 0.154 0.401 0.305 病人 12号 宫颈病变 0.577 0.623 0.499 0.683 0.568 病人 13号 卵巢畸胎瘤 0.323 0.244 0.206 0.408 0.326 病人 14号 CIN II 1.122 0.716 0.789 1.104 0.985 病人 15号 子宫内膜癌 0.366 0.492 0.328 0.341 0.364 病人 16号 宫颈病变 0.820 0.579 0.395 0.795 0.580 病人 17号 子宫肌瘤 0.442 0.465 0.283 0.417 0.453 病人 18号 卵巢囊肿 0.770 0.801 0.660 0.745 1.116 病人 19号 宫颈病变 0.600 0.460 0.299 0.575 0.435 病人 20号 宫颈病变 0.575 0.435 0.334 0.550 0.452 病人 21号 CIN III 0.810 0.469 0.364 0.785 0.722 病人 22号 CIN III 0.644 0.550 0.542 0.619 0.742 病人 23号 盆块 0.725 0.722 0.676 0.700 0.479 病人 24号 CIN II 0.628 0.659 0.391 0.593 0.524 病人 25号 子宫内膜炎 0.770 0.332 0.274 0.735 0.359 病人 26号 宫腔占位 0.637 0.515 0.491 0.602 0.705 病人 27号 卵巢囊肿 0.467 0.334 0.328 0.432 0.336 病人 28号 卵巢囊肿 0.722 0.547 0.624 0.687 0.434 病人 29号 宫颈病变 0.621 0.597 0.376 0.586 0.443 病人 30号 卵巢囊肿 0.664 0.763 0.453 0.629 0.496 病人 31号 子宫颈恶性肿瘤 0.600 0.535 0.598 0.565 0.530 病人 32号 宫颈癌 0.841 0.915 0.660 0.806 0.880 病人 33号 CIN II 0.585 0.500 0.519 0.571 0.425 病人 34号 子宫内膜癌 0.788 0.641 0.514 0.753 0.514 病人 35号 宫颈癌术后 0.772 0.438 0.439 0.737 0.471 病人 36号 CIN III 0.661 0.613 0.604 0.704 0.625 病人 37号 宫颈癌 1.197 0.805 0.780 1.132 0.898 病人 38号 卵巢囊肿 0.736 0.478 0.387 0.671 0.662 病人 39号 CIN III 0.807 0.589 0.842 0.742 0.615 病人 40号 CIN III 1.542 1.412 1.553 1.477 1.418

4、 选择 3条多肽 (SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 3 , SEQ ID NO: 5)作为包被选择包被 并封闭过的酶标板通过 ELISA方法检测病人血清， 病人的病理诊断结果如表四中所示， 结果 ^口下：

表四： HPV血液 ELISA检测病人血清结果表

P240 宫颈扁平湿疣 0.333 0.756 0.753

P255 CIN II 0.378 0.773 0.683

P269 CIN I 0.380 0.567 0.617

P289 输卵管积脓 0.471 1.449 0.747

P302 子宫腺肌病 0.238 0.288 0.344

P322 盆腔炎 0.255 0.389 0.451

P352 子宫肌瘤 0.623 0.741 0.632

P358 子宫肌瘤 0.600 0.728 0.607

P408 左卵巢畸胎瘤 0.303 0.530 0.821

P420 慢性宫颈炎 1.090 1.407 1.575

P421 CIN I - II 0.493 0.708 0.844

P421 CIN1-2级 0.382 0.492 0.455

P427 CIN III 0.281 0.671 0.642

P444 CIN术后 0.300 0.828 0.633

P449 鳞癌 0.200 0.547 0.497

P463 CIN3级 0.545 0.610 0.507

P467 CIN3级 0.204 0.530 0.480

P471 CIN III 0.514 0.335 0.320

P482 CIN III 0.297 0.724 0.594

P482 CIN III 0.319 0.689 0.522

P483 宫颈鳞癌 0.289 0.669 0.539

P487 CIN 0.420 0.698 0.796

P488 CIN II 0.321 0.640 0.553

P489 CIN 0.233 0.790 0.887

P490 宫颈病变 0.135 0.270 0.327

P491 CIN I 0.545 0.358 0.448

P493 宫颈病变 0.256 0.516 0.434 三、 数据分析

1、 根据正常人检测值， 计算出平均值， 标准方差， CUTOFF值。 分别将表一中的 44例 正常人血清在 HPVE7多肽上的反应 OD值取平均数， 并计算标准方差 SD, 本试剂盒在确定 CUTOFF值时选择正常人平均值加上两倍的标准方 差作为 HPV 阴阳性的判断标准， 结果如 下：

Cutoff计算公式为： cutoff = 平均值 OD + 2 * SD 标准方差

1.1 根据表一结果， HPVE7( SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 , SEQ ID NO:

4, SEQ ID NO: 5)5条多肽检测正常人血清结果统计分析得出， 结果如下表：

表五： HPV E7 的 5条多肽血清 ELISA检测数据表 SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: 5 平均值 0.292 0.279 0.382 0.301 0.383 标准方差 0.098 0.100 0.111 0.076 0.111 cutoff 0.487 0.480 0.604 0.452 0.605

1.2根据表二结果， HPVE7( SEQ ID NO: 3和 SEQ ID NO: 5)2条多肽检测正常人血 结果统计分析得出， 结果如下表：

表六： HPV E7的 2条多肽血清 ELISA检测数据表

1.3 根据表五和表六的结果， 对比分析得出 SEQ ID NO: 3和 SEQ ID NO: 5这 2条多肽 在不同实验时得出的 cutoff值一致。

2、 通过 cutoff值， 判断检测的病人血清 HPV的阴性、 阳性， 超过这个 cutoff值的即认 为是阳性， 且只要一个多肽检测为阳性， 即认为有 HPV感染， 同时与 HC2诊断结果对比。

2. 1在检测的病人血清中 291例血清有 HC2诊断结果，有病理诊断阳性的病例 84例. 在 病理阳性病人组 (临床诊断"金标准 ")， 血清抗体检测结果与 HC2 分子检测结果相对比 (见表 7), 将其与本试剂盒检测 HPV 结果进行对比如下表： （本检测结果中统计为阳性的包括： （i) 两个抗原检测结果有任何一个是阳性结果， （ii)两个抗原检测结果都是阳性结果）

表七： 根据表三的结果， 对于病人的血清 ELISA诊断结果与 HC2诊断结果对比表

( "+" 表示检测结果阳性； "-" 表示检测结果阴性）

病人 14号 CIN II + + + + + + 病人 15号 子宫内膜癌 + +

病人 16号 宫颈病变 + + + + + 病人 17号 子宫肌瘤 +

病人 18号 卵巢囊肿 + + + + + 病人 19号 宫颈病变 +

病人 20号 宫颈病变 + +

病人 21号 CIN III + + + + 病人 22号 CIN III + + + + + 病人 23号 盆块 + + + + + + 病人 24号 CIN II + + +

病人 25号 子宫内膜炎 + + 病人 26号 宫腔占位 + + + + +

病人 27号 卵巢囊肿

病人 28号 卵巢囊肿 + + + + + 病人 29号 宫颈病变 + +

病人 30号 卵巢囊肿 + + + + + 病人 31号 子宫颈恶性肿瘤 + + + + +

病人 32号 宫颈癌 + + + + + + 病人 33号 CIN II + + + +

病人 34号 子宫内膜癌 + + + + + + 病人 35号 宫颈癌术后 + + + 病人 36号 CIN III + + + + + + 病人 37号 宫颈癌 + + + + + + 病人 38号 卵巢囊肿 + + + + 病人 39号 CIN III + + + + + + 病人 40号 CIN III + + + + + + 表八： 根据表四的结果， 对于病人的血清 ELISA诊断结果与 HC2诊断结果对比表

P269 CIN I + + +

P289 输卵管积脓 + + + +

P302 子宫腺肌病

P322 盆腔炎

P352 子宫肌瘤 + + +

P358 子宫肌瘤 + + +

P408 左卵巢畸胎瘤 + +

P420 慢性宫颈炎 + + +

P467 CIN3级 + +

P482 CIN III + +

P483 宫颈鳞癌 + +

P487 CIN + + +

P488 CIN II + + +

P489 CIN + + +

P490 宫颈病变

P491 CIN I + +

P493 宫颈病变 + - + + 将表七结果的 HC2结果和血液 ELISA检查结果进行人数统计分析， 结果如下表:

表九： HC2结果与血液 ELISA检测准确率人数及比例对比表

其他妇科疾病主要为盆腔炎， 卵巢嚢肿， 子宫肌瘤等妇科疾病。 将表八结果的 HC2结果和血液 ELISA检查结果进行人数统计分析， 结果如下表:

表十： HC2结果与血液 ELISA检测准确率人数及比例对比表 病理诊断结果 人数 HC2检测 SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 5 阳性 阳性 阳性 阳性

CIN I 4 3 2 3 4

CIN II - III 7 4 0 7 7 宫颈癌 1 1 0 1 1 宫颈病变 2 1 0 1 1 其他妇科疾病

其他妇科疾病主要为盆腔炎， 卵巢嚢肿， 子宫肌瘤等妇科疾病,

2. 2检测病人血清中有 10例血清为没有 HC2检测报告， 但病理报告为 CIN和宫颈癌, 本试剂盒检测 HPV结果， 病人数及血液检测阳性率对比结果如表。

表十一： 对于没有 HC2诊断结果， 但有病理结论的病人与 HPV血液 ELISA检测结果总结

( "+" 表示检测结果阳性； "-" 表示检测结果阴性)

表十二： 无 HC2结果的 CIN , 宫颈癌及宫颈病变的病人血液 ELISA检测的人数表

2. 3 将所有 CIN II以上和宫颈癌的病人血液 ELISA检测结果统计人数及阳性比例结果 如表十三。

表十三： 所有 CIN , 宫颈癌及宫颈病变的病人血液 ELISA检测的人数及准确率比例表

上述结果表明， 抗原肽 SEQ ID NO: 2, 3 , 5对 CIN II检测灵敏度和准确性更优； 而抗 原肽 SEQ ID NO: 3 , 4, 5对 CIN III和宫颈癌检测灵敏度和准确性更优。 本发明的上述多肽是经过发明人的选择并在病 人样品及正常人样品中进行了检测验证， 而直接釆用 GST-HPV16-E7和 GST- HPV118E7全长融合蛋白（分别为 SEQ ID NO: 6、 SEQ ID NO: 7所示序列)检测血清， 效果不佳， 请参见下列实验数据。

四、 实验材料和 ELISA方法同前面第一点， 只是釆用多肽 (SEQ ID NO: 3 , SEQ ID NO: 5)检测的同时， 还釆用 GST-HPV16-E7和 GST- HPV118E7全长融合蛋白作为检测抗原， 在用 PBS稀释 GST-HPV16-E7、 GST-HPV18-E7全长融合蛋白时， 浓度均为 2ug/ml, 检测结果如 下：

1.根据上面实验步骤， 检测部分病人血清和普通人血清， 检测结果和病人病理报告如下 表所示：

表十四 多肽检测和全长融合蛋白检测结果

P319号 盆腔炎 0.452 0.427 1.579 1.015

P320号 盆腔炎 0.498 0.427 0.275 0.525

P321号 盆腔炎 0.515 0.662 0.504 0.497

P322号 盆腔炎 0.393 0.457 0.516 0.506

P323号 子宫肌瘤 0.186 0.663 0.420 0.335

P451号 盆块 0.868 0.595 0.452

P452号 宫腔占位 0.891 0.601 0.485

P453号 CIN 1.194 0.672 0.425

P454号 子宫颈恶性肿瘤 0.625 0.687 0.334

P455号 宫颈癌 1.076 0.848 0.976

P456号 CIN II 0.977 0.820 0.570

P457号 子宫内膜癌 1.326 0.925 0.630

P458号 宫颈癌术后 0.986 0.972 0.547

P459号 宫颈癌术后 0.857 1.205 0.645

P460号 CIN III 0.483 0.754 0.450

P461号 输卵管癌 0.937 0.855 0.543

P462号 子宫颈癌 0.907 0.789 0.525

P463号 子宫颈癌 1.072 0.958 0.532

P464号 宫颈病变 0.893 0.961 0.618 正常人组：

NA1号 0.656 0.483 0.255 0.282

NA2号 0.461 0.998 0.119 0.215

NA3号 0.367 0.580 0.210 0.233

NA5号 0.427 0.776 0.192 0.191

NA11号 0.370 0.758 0.198 0.333

NA12号 0.307 0.665 0.250 0.281

NA16号 0.328 0.641 0.131 0.225

NA18号 0.445 0.622 0.260 0.293

NC24号 0.376 0.791 0.290 0.421

NC31号 0.308 0.319 0.390 0.485

NC36号 0.335 0.492 0.197 0.464

NC38号 0.356 0.452 0.490 0.588

NC40号 0.346 0.432 0.150 0.331

NC41号 0.530 0.882 1.024 1.134

NC79号 0.285 0.380 0.329 0.455

NC101号 0.389 0.577 0.307 0.422

NC102号 0.405 1.057 0.346 0.324 五. 实验分析

1. 将使用全长蛋白的检测结果与之前釆用 HPV多肽 SEQ ID:3和 SEQ ID:5两种多肽联 合检测结果对比， 对比如下表， 表中 HPV16-E7蛋白、 HPV18-E7蛋白、 抗原肽 SEQ ID:3、 抗原肽 SEQ ID:5的 cutoff值分别为： OD值为 0.601和 0.603 , 在多肽联合检测中， 只要抗原 肽 SEQ ID:3和抗原肽 SEQ ID:5检测中， 有一个为阳性， 则结果计为阳性。

表十五 多肽检测和全长融合蛋白检测结果分析

P322号 盆腔炎

P323号 子宫肌瘤 +

P451号 盆块 + +

P452号 宫腔占位 + +

P453号 CIN + + +

P454号 子宫颈恶性肿瘤 + + +

P455号 宫颈癌 + + +

P456号 CIN II + + +

P457号 子宫内膜癌 + + +

P458号 宫颈癌术后 + + +

P459号 宫颈癌术后 + + +

P460号 CIN III + +

P461号 输卵管癌 + + +

P462号 子宫颈癌 + + +

P463号 子宫颈癌 + + +

P464号 宫颈病变 + + +

正常人组：

NA1号 +

NA2号 +

NA3号 +

NA5号 +

NA11号 +

NA12号 +

NA16号 +

NA18号 +

NC24号 +

NC31号

NC36号

NC38号

NC40号

NC79号

NC101号 +

NC102号 + 总结： HPV16-E7, HPV18-E7全长融合蛋白在检测 CIN, 宫颈癌病人时有一定的阳性病 人漏检， 灵敏性比多肽检测差。 在检测普通妇科炎症病人和普通人群时有一定 的假阳性率， 敏感性比多肽检测略差。 所以， HPV 16-E7和 HPV 18-E7全长蛋白对于检测 CIN , 宫颈癌等不 是很适合。 实施例 2 特异性验证

在本实施例中， 为了进一步验证 SEQ ID No.: 1-5抗原肽是否存在 HPV的特异性表位， 通过 ELISA检测方法， 釆用以全长 HPV 16-E7蛋白、 或 HPV 18-E7蛋白作为免疫抗原获得的 单克隆抗体， 与各抗原肽进行特异性结合测试。 其中， 各单抗是均能与全长的 16-E7或 18-E7 抗原特异性结合的单克隆抗体。

结果发现， SEQ ID NO: 1-5的抗原肽均能与多种单克隆抗体结合。 该结果提示， 本发明 的抗原肽具有能够与人乳头瘤病毒抗体特异性 结合的抗原表位 (见下表)。 此外。 SEQ ID No.: 1-5也不与其他无关抗体 (包括抗其他病毒蛋白的抗体)发生结合， 这提示， 本发明抗原肽的交 叉反应性氐。

表十六 抗原肽抗原表位分析

因此，本发明的抗原肽不仅能够用于检测 (尤其是早期检测) HPV感染和 HPV感染所致的 癌症， 而且可以用于制备预防性或治疗性的药物组合 物（包括疫苗组合物）， 从而有效诱导人 体产生针对人乳头瘤病毒 HPV 癌蛋白的特异性免疫反应， 从而起到预防癌症或治疗癌症作 用。 讨论

本发明的血液酶标免疫分析法 (ELISA)以免疫生化原理为基础， 提供高灵敏度， 高特异性 和高稳定性的抗原-抗体检测方法。 病人在被病毒感染后， 可在血清和口腔唾液中出现特异性 的抗体 IgM， IgA或 IgG分子。用酶标免疫分析法 ELISA检测病人血清或唾液中特异性抗 HPV 的抗体分子。 本发明通过对 HPV病毒高危型 HPV16, HPV18基因序列的分析， 用生物信息 学分析对抗原性的理论预测， 并用实验方法筛选、 证明临床应用的意义。 通过制备多个高纯 度的抗原多肽， 并以国内人群健康者血清和感染者血清对制备 抗原进行反复筛选、 验证， 获 得了有高灵敏度， 高特异性和高稳定性的目的抗原 HPV16-1、 HPV 16-2, HPV 16-3, HPV18- HPV18-2。 并证明用这些多肽抗原结合到某种固相载体表 面， 能保持其免疫反应活性。 在测 定时， 使受检标本与固相载体表面的抗原起反应。 用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原、 抗体复合物与其他物质分开， 最后是结合在固定载体上的酶量与标本中受检 物质的量成一定 的比例。 加入酶反应的底物后， 然后通过显色来检测， 故可根据颜色反应的深浅作定性或定 量分析。 本发明的血液 ELISA检测试剂盒与 DNA检测 (HC2， CareHPV)相比，取样均匀， 非 侵略性， 操作更为快速， 简单； 费用便宜， 容易推广， 更适合中国市场； 可避免 PCR方法带 来的假阳性和假阴性， 大大提高了检测结果的精确度和准确度； 与传统的巴氏涂片、 醋酸染 色 VIA, 阴道镜检查相比， 更为准确、 容易、 快速。 ELISA检测方法经各种参数和实验程上 的优化， 可作为大规模筛选的工具用于宫颈癌的早期筛 查。

综上， 本发明的用于检测抗人乳头瘤病毒抗体的抗原 可以高灵敏度、 高特异性和高稳定 性地检测血液或唾液中的 HPV抗体，从而可以为医生准确诊断病人宫颈上 皮内瘤变和子宫颈 癌带来依据， 进而及时釆取治疗， 以防止癌症发生， 或癌症扩散， 及时减轻病人痛苦， 由其 制成的免疫检测试剂盒可以快速简单准确地检 测血液或唾液中的 HPV抗体，适于大规模推广 应用。

在此说明书中， 本发明已参照其特定的实施例作了描述。 但是， 很显然仍可以作出各种 修改和变换而不背离本发明的精神和范围。 因此，说明书应被认为是说明性的而非限制性 的。