"COMPOSIÇÃO ANTIMALÁRICA, MÉTODO PARA TRATAMENTO DE MALÁRIA, E, USO DE UMA COMPOSIÇÃO ANTIMALÁRICA"

Campo da Invenção

[001] A presente invenção trata de uma combinação de curcumina

(Cure), que é um polifenol natural, e dietilditiocarbamato de sódio (DETC), ou seu precursor, dissulfiram (DS) (Ι,Γ,Γ',Γ"- [disulfanedilbis(carbonothioilnitrilo)]tetraetano) onde tal combinação de fármacos apresenta atividade antimalárica aumentada.

Fundamentos da Invenção

[002] A malária é uma doença infecciosa causada por protozoários parasitas do género Plasmodium. Existem diferentes espécies que acometem o homem, são elas: Plasmodium falciparum, o mais comum no planeta e o que causa o maior número de mortes; Plasmodium vivax, responsável por 77% das infecções nas Américas; Plasmodium malariae e Plasmodium ovale (Organização Mundial da Saúde - OMS, 2013). E conhecida, ainda, a infecção natural de seres humanos por P. knowlesi (Jongwutiwes et al., 2004; Antinori et al., 2013), uma espécie inicialmente descrita como parasita de macacos, indicando o caráter de zoonose desta infecção. Recentemente, foi descrita a existência de subespécies de P. ovale (Calderaro et al., 2013).

[003] Plasmodium falciparum e, em menor escala, P. vivax são as principais etiologias de morbi-mortalidade dentre os plasmódios causadores de malária humana. A malária é o produto da interação do parasito com o hospedeiro, fatores geográficos e sociais e a sua evolução está diretamente associada a fatores ligados a ambos.

[004] A quimioterapia constitui não apenas a principal estratégia terapêutica da malária, mas também uma das principais formas de controle da progressão da doença. Os três grupos de drogas mais utilizados e eficazes no tratamento são as drogas quinolínicas derivadas da quinina, obtida da planta Cinchona officinalis e seus análogos. Outro grupo bastante utilizado são os inibidores da dihidrofolato redutase, usados sempre combinados, sendo os mais conhecidos o proguanil, as sulfas, a pirimetamina e o trimetropim. As drogas derivadas da planta Artemísia annua também são bastante efetivas no tratamento da malária, dentre elas o artesunato e o arthemeter (Farooq & Mahajan, 2004).

[005] E importante ressaltar que, entre os maiores obstáculos para a redução da incidência da malária no mundo, está a disseminação de casos refratários à terapêutica (Farooq & Mahajan, 2004; OMS, 2013), particularmente relacionados à resistência à cloroquina (CQ) e à combinação sulfadoxina/pirimetamina (SP).

[006] O regime terapêutico é muito importante para garantir a cura clínica dos pacientes no caso da malária. A rápida melhora do quadro é fundamental para a prevenção da transmissão da doença. A utilização de doses sub-terapêuticas aumenta o risco de falha durante o tratamento e, além disso, constitui uma pressão seletiva para fenótipos resistentes (Barnes et al., 2008a); e, na malária, parasites resistentes estão associados ao aumento de infecções latentes, bem como o aumento da gametocitemia, que leva à maior probabilidade de transmissão da doença, o que explica a rápida propagação da resistência (Barnes et al., 2008b).

[007] A quimioterapia da malária, incluindo a ação da cloroquina, está primordialmente direcionada à eliminação das formas assexuadas do protozoário, as quais degradam ativamente a hemoglobina (Peters, 1970).

[008] Existem relatos indicando que a cloroquina interfere no processo de degradação da hemoglobina e consequente formação da hemozoína (Hz - pigmento malárico). O mecanismo primário de ação da cloroquina (CQ) está associado à sua capacidade de entrar no vacúolo digestivo do parasito, considerado importante alvo celular no mecanismo de ação de compostos anti-maláricos (Wunderlich et al., 2012), sofrer protonação no compartimento acídico, por ser uma base fraca. Uma vez na forma protonada, o composto carregado não mais atravessa a membrana vacúolo digestivo do parasito, onde se acumula, levando à alteração do pH e impedindo assim o processo de formação do cristal de Hz e levando ao aumento do estresse oxidativo pelo efeito pró-oxidante do heme livre (Fitch, 1998; Sullivan, 2002). Entretanto, cabe salientar que a CQ pode exercer efeitos anú-Plasmodium independentes de espécies reativas do oxigénio (ERO), associados à indução de morte celular programada deflagrada pela permeabilização da membrana do vacúolo digestivo (Ch'ng et al., 2011).

[009] Desde a publicação da primeira edição das orientações da

Organização Mundial da Saúde em 2006, a maioria dos países onde o P. falciparum é endémico desenvolveu políticas de tratamento atualizadas, substituindo o tratamento com a CQ e SP para as terapias de combinação baseadas em artemisinina, que é considerado, atualmente, o melhor tratamento para malária falciparum não complicada. Porém, o alto custo do tratamento com derivados de artemisina (OMS, 2013) tem dificultado o combate a essa doença.

[0010] As principais moléculas utilizadas como antimaláricos em uso e em desenvolvimento nos dias atuais são: quinino, pamaquina, cloroquina, mepacrina, proguanil, amodiaquina, primaquina, pirimetamina, sulfadoxina, artemisinina, mefloquina, halofantrina, piromaridina, piperaquina, artemeter, artesunato, diidroartesimina, autovaquona, lumefantrine, tafenoquina e a ablaquina (Kaur et al., 2010).

[0011] A principal estratégia farmacológica contra a malária, proposta pela OMS, envolve a terapia de combinação baseada na artemisinina (ACT, artemisinin-based combination therapy), na qual são utilizados um ou mais fármacos em conjunto com a artemisinina (ou seus derivados), de modo a atingir o máximo de efeito e o mínimo de resistência. Atualmente, a OMS sugere a utilização de artemeter e lumefantrina (AL), artesunato e amodiaquina (AS+AQ), artesunato e mefloquina (AS+MQ) e artesunato e sulfadoxina-pirimetamina (AS+SP). Muitas destas combinações ainda não possuem um mecanismo de ação estabelecido, uma vez que podem atuar de forma sinérgica ou não (OMS, 2013).

[0012] Entretanto, a resistência aos medicamentos utilizados no tratamento da malária é o maior desafio para reduzir a mortalidade causada pelo Plasmodium. Existe uma grande preocupação com relação à emergente resistência dos parasitos às terapias combinadas com a artemisinina, o que gera um enorme interesse em descobrir uma nova geração de medicamentos para estes fins (OMS, 2013).

[0013] Apesar dos diversos antimaláricos conhecidos serem usados com bons resultados no tratamento da malária, estes compostos também apresentam efeitos colaterais indesejados, e há uma necessidade contínua de melhorar a eficácia das drogas.

[0014] Assim, existe uma grande necessidade de proporcionar uma nova combinação estável, devido ao fato dos agentes infecciosos tornarem-se resistentes.

[0015] A patente US 7.858.659 está relacionada a um tratamento para células tumorais e células malignas, por alteração do estado redox ou do ambiente da célula. O referido tratamento visa alterar o balanço de glutationa (GSH) a glutationa oxidada (GSSG). Esta patente menciona uma combinação sinérgica de um agente que oxida a GSH, sendo preferencialmente o DS. A combinação sinérgica inclui a Cure. e antagonistas de enzimas.

[0016] Clark et al. (1983) apresentam evidências de que os parasitos causadores da malária são suscetíveis a ERO. Neste estudo foi usado DETC que demonstrou reverter o efeito antimalárico do alloxan.

[0017] Suckow e Suckow (2006) investigaram a possibilidade de que dietas ricas em anti-oxidantes promovem a extensão do tempo de vida. E mencionado que a cúrcuma (Curcuma longa) é uma especiaria, também conhecida como turmérico, que tem sido consumida como condimento e usada para fins medicinais há muitos séculos na Asia. A cúrcuma contém o poderoso antioxidante, Cure. Foram conduzidos numerosos testes empregando Cure. em diversos modelos experimentais. Foi observado que a Cure. aumenta significativamente a longevidade de Caenorhabditis elegans (Liao et al., 2011), Drosophila melanogaster (Suckow & Suckow, 2006) Tribolium castaneum (Bingsohn et al., 2016) e murinos (Shen et al., 2013), mas em humanos os achados não parecem muito promissores (Sadowska- Bartosz & Bartosz et al., 2014; Soare et al., 2014). Este processo dependente, ao menos em parte, da modulação de autofagia (Petrovski & Das, 2010).

[0018] Pelas razões expostas acima, ainda há uma premente demanda de pesquisa e desenvolvimento (P&D) enfocando um tratamento seguro, eficaz e de baixo custo para a malária. Esta é uma necessidade definitiva não apenas nos mais de 100 países endémicos, mas também para mais da metade da população do mundo sob o risco de contrair malária. Vale salientar que a transmissão desta parasitose ja foi confirmada em aviões na Europa e em residências próximas a aeroportos, comprovando que mosquitos Anopheles sp. são transportados entre nações e continentes. Além disso, com o aquecimento global, a distribuição destes, entre outros vetores, está sendo ampliada, podendo aumentar a incidência da parasitose, bem como sua endemicidade.

[0019] Portanto, a presente invenção tem por objetivo aumentar a eficácia e a segurança de uma preparação farmacêutica para a quimioterapia da malária, empregando a Cure. e o DS ou seu derivado, o DETC.

[0020] Uma vez que os compostos combinados podem promover ações antiparasitárias, mas contrabalancear mutuamente os efeitos redox e/ou toxicidade, podem exercer efeitos citoprotetores e, assim, as preparações farmacêuticas da presente invenção, empregando baixas dosagens, poderão, ainda, ampliar o alcance ou aplicação terapêutica das preparações farmacêuticas e, especialmente, também estendê-lo para o tratamento de grupos que demandem cuidados especiais, tais como crianças, mulheres grávidas e indivíduos imunocomprometidos.

Sumário da Invenção

[0021] A presente invenção trata de uma combinação dos fármacos

Cure, que é um polifenol natural, e DETC, ou seu precursor o DS, que apresenta atividade antimalárica aumentada sinergisticamente.

[0022] A presente invenção apresenta a combinação de dois fármacos, já aprovados para uso em humanos há bastante tempo, sendo ambos muito bem tolerados (i.e. apresentando baixa toxicidade) que apresentaram efeito promissor na quimioterapia da malária tanto in vitro como in vivo. DS é o princípio ativo do Antabuse ^® ou Anti-etanol ^® no Brasil, e é usado com sucesso para o tratamento do etilismo e outras formas de dependência, bem como no tratamento de AIDS, câncer e intoxicações por metais pesados, sendo o DETC considerado menos tóxico do que a aspirina (revisto em Gessner & Gessner, 1992).

[0023] Sendo a Cure. geralmente considerada um antioxidante e o DS e seu derivado, o DETC, caracterizados como fármacos pró-oxidantes, pela capacidade de inibir a atividade superóxido (0 ₂ ^~ ) dismutase (SOD), seria esperável que estes compostos exercessem efeitos reciprocamente antagónicos. De fato o DS reverte o supracitado aumento de longevidade provocado pela Cure. em D. melanogaster (Suckow & Suckow, 2006), fato que pode ser explicado, ao menos em parte, pela ligação da Cure. aos grupos tiol (Aggarwal et al., 2007b). Mesmo sendo muito bem tolerado, DS tem relatos de efeito neurotóxico (Torre et al., 2010; Stone et al., 2014), entretanto alguns destes estudos estão baseados em pacientes com vários anos de etilismo e, eventualmente, narcóticos e relatam eventuais, um único (Stone), dois (Filosto et al., 2008; Tran et al., 2016) ou três (Torre et al., 2010) casos. Entretanto, cabe salientar que a ocorrência de convulsões durante a síndrome de abstinência pode ter etiologia genética (Shirley et al., 2004). Além disso, vale ressaltar a conhecida atividade neuroprotetora da Cure. (e.g. Cole et al., 2007) em lesões produzidas por arsénico (Srivastava et al., 2014), fluoreto (Sharma et al., 2014) isquemia (Tu et al., 2014), hemorragia (Yang et al., 2014). Dados conflitantes podem refletir a complexidade de modos de ação, bem como a demanda de determinação de condições precisas de uso. A Cure. pode ser anticlastogênica (Alaikov et al., 2007), bem como induzir danos cromossomiais (Araújo et al., 1999).

[0024] Não há dúvida de que a Cure. tem numerosas aplicações farmacêuticas promissoras (Aggarwal et al., 2007b; Goel et al., 2008) Entretanto, o uso de Cure. deve ser visto de forma criteriosa. Ao contrário de uma panaceia baseada em inócuo tempero, a Cure. pode representar um risco (Marathe et al., 2009; 2011) reduzindo a atividade microbicida da ciprofloxacina contra Salmonella typhimurium e S. typhi (Marathe et al., 2013), promovendo a proliferação intracelular de Salmonella (Marathe et al., 2012b). O efeito antiflamatório da Cure. pode modular a resposta imune celular (THi) agravando o quadro em modelo de leishmaniose visceral (Adapala & Chan, 2008), bem como aumentando patogenicidade de Salmonella em modelo murino (Marathe et al., 2010). Esta ação bimodal da Cure. pode estar ligada ao seu efeito anti-inflamatório, bem como a sua capacidade de atuar como antioxidante ou pró-oxidante, dependendo de condições como concentração. Esta propriedade remonta a definição de fármaco de Galeno, correlacionando medicamento e veneno. A busca de combinações sinergísticas e/ou aditivas pode constituir uma grande vantagem, por permitir dosagens mais baixas, e pode evitar a produção de efeitos colaterais. Sendo um composto amplamente empregado na indústria nutracêutica, é, indubitavelmente, bem tolerado pelo organismo humano. Entretanto os efeitos colaterais supracitados precisam ser evitados, o que pode ser realizado em função das dosagens.

[0025] Embora o DETC eleve a parasitemia em infecção por Plasmodium berghei (Nair et al., 1982), seu precursor imediato, o DS tem efeito antimalárico sobre Plasmodium falciparum (Scheibel et al., 1979). Esse fármaco apresenta uma propriedade muito relevante para esta infecção, pois é capaz de reverter o fenótipo de resistência, inibindo a atividade de P- glicoproteínas (Sauna et al., 2005), responsáveis pela extrusão de drogas no fenótipo MDR (múltipla resistência a drogas). As células infectadas e o protozoário per se apresentam esta enzima, a qual constitui um fator de virulência e marcador de quadros severos de malária.

[0026] O outro composto empregado é o produto natural Cure. ((E,E)- l,7-bis(4-hidroxi-3-metoxifenil)-l,6-heptadieno-3,5-diona) já testado em diferentes entidades nosológicas (Aggarwal et al., 2007b), em dosagens variando entre 1 e 8 g/ dia {per os), sendo amplamente consumido na forma do condimento turmérico obtido do açafrão-da-India Curcuma longa (sendo a Cure. um componente majoritário) em vários países por milhões/bilhões de pessoas. Este polifenol tem atividade em várias patologias, atuando principalmente como anti-inflamatório (Goel et al., 2008), mas também possuindo ação antiparasitária, inclusive sobre em Plasmodium sp., e tendo demonstrado atividade antimalárica considerável (Haddad et al., 2011).

[0027] A Cure. e o DETC demonstraram ação antimalárica in vitro com IC ₅₀ de 3,4 e 8,0 μg/mL, respectivamente. As combinações destes fármacos mostraram efeito antimalárico altamente sinergístico, como demonstrado pelo valor de Concentração Inibitória Fracionada (FIC) de 0,000175, bem como a plotagem de isobologramas. Vale salientar que a cepa de P. falciparum empregada é resistente à cloroquina.

[0028] Observamos, ainda, que a Cure. inibe a formação de hemozoma (Hz) na mesma faixa de concentração que a cloroquina, e induz a formação de espécies reativas de oxigénio nos parasitos intracelulares, detectáveis por microscopia de fluorescência

[0029] A análise ultraestrutural demonstrou alterações de compartimentos da via endocítica e de formação de Hz, corroborando as dosagens bioquímicas. A presença de cristais de Hz no citoplasma de P. falciparum indica, inequivocamente, a ruptura das membranas de vacúolos digestivos e, portanto, autólise celular. Cabe ressaltar que este efeito não foi associado à hemólise.

[0030] As medidas de citotoxicidade, mensuradas pela incorporação de [ ³ H]Timidina por esplenócitos murinos revelaram a IC ₅₀ do DETC na combinação de 14,22 μg/mL, enquanto que na proliferação de P. falciparum in vitro a combinação com Cure. a IC ₅₀ do DETC obtida foi de 0,0014 μg/mL, demonstrando que a combinação é cerca de 10.000 vezes mais tóxica para os parasitos do que para as células de mamífero, sem apresentar atividade hemolítica. O índice de seletividade (IS) calculado para a combinação foi de 10.157,14, enquanto que para a artemisinina, droga padrão-ouro na terapêutica da malária, o IS obtido foi 27,57. Observamos a baixa toxicidade sistémica pela dosagem de transaminases hepáticas no plasma de camundongos {Mus musculus).

[0031] Os experimentos realizados in vivo, empregando a infecção de camundongos por Plasmodium berghei demonstraram que os dois fármacos tiveram atividade antimalárica inferior ao controle positivo com cloroquina, mas a combinação Curc.-DETC teve atividade aumentada (mais de 40% de promoção da sobrevivência), aproximando-se da atividade exercida pela cloroquina.

Descrição das Figuras

[0032] A Figura 1 mostra a inibição da proliferação/sobrevivência de

Plasmodium falciparum in vitro, mensurada pela incorporação de [ ³ H]hipoxantina por eritrócitos infectados e incubados com Cure.

[0033] A Figura 2 mostra a inibição da proliferação/sobrevivência de

P. falciparum in vitro, mensurada pela incorporação de [ ³ H]hipoxantina, por eritrócitos infectados e incubados com DETC. [0034] A Figura 3 mostra a inibição da proliferação/sobrevivência de

P. falciparum in vitro, mensurada pela incorporação de [ ³ H]hipoxantina por eritrócitos infectados e incubados com DS.

[0035] A Figura 4 mostra os efeitos da combinação da Cure. com o

DETC na proliferação de P. falciparum in vitro, por 24h.

[0036] A Figura 5 mostra os efeitos da combinação do DETC com a

Cure. na proliferação de P. falciparum, mensurada pela incorporação de

[ ³ H]hipoxantina por eritrócitos infectados in vitro, por 24h.

[0037] A Figura 6 mostra um gráfico com a combinação da Cure. com o DS na proliferação de P. falciparum, mensurada pela incorporação de

[ ³ H]hipoxantina por eritrócitos infectados in vitro, por 24h.

[0038] A Figura 7 mostra os efeitos da combinação do DS com a

Cure. na proliferação de P. falciparum, mensurada pela incorporação de

[ ³ H]hipoxantina por eritrócitos infectados in vitro, por 24h.

[0039] A Figura 8 mostra o isobolograma da atividade antiparasitária de diferentes combinações entre a Cure. e o DETC sobre P. falciparum in vitro.

[0040] A Figura 9 mostra o isobolograma da atividade antiparasitária de diferentes combinações entre a Cure. e o DS sobre P. falciparum in vitro.

[0041] A Figura 10 mostra o efeito citotóxico da Cure. sobre a proliferação de esplenócitos murinos in vitro, por 24h.

[0042] A Figura 11 mostra o efeito citotóxico do DETC sobre esplenócitos murinos in vitro, por 24h.

[0043] A Figura 12 mostra o efeito citotóxico do DS sobre a proliferação de esplenócitos murinos in vitro, por 24h.

[0044] A Figura 13 mostra o efeito da combinação de Cure. com diferentes concentrações de DETC sobre a proliferação de esplenócitos murinos, por 24h.

[0045] A Figura 14 mostra o efeito da combinação da Cure. com diferentes concentrações de DS sobre a proliferação de esplenócitos murinos, por 24h.

[0046] A Figura 15 mostra o efeito da combinação do DETC com diferentes concentrações de Cure. sobre a proliferação de esplenócitos murinos, por 24h.

[0047] A Figura 16 mostra o efeito da combinação do DS com diferentes concentrações de Cure. sobre a proliferação de esplenócitos murinos, por 24h.

[0048] A Figura 17 mostra a avaliação da reversibilidade do efeito da

Cure. por 48h sobre hemácias infectadas com P. falciparum na presença e ausência do antioxidante urato.

[0049] A Figura 18 mostra a avaliação da reversibilidade do efeito do

DETC por 48h sobre hemácias infectadas com P. falciparum na presença e ausência de urato.

[0050] A Figura 19 mostra a avaliação da reversibilidade do efeito do

DS por 48h sobre hemácias infectadas com P. falciparum na presença e ausência de urato.

[0051] A Figura 20 mostra a avaliação da capacidade da pré- incubação com urato por 24h em reverter o efeito do DS sobre a proliferação de P. falciparum in vitro.

[0052] A Figura 21 mostra a avaliação da capacidade da pré- incubação com urato por 24h em reverter o efeito do DETC sobre a

proliferação de P. falciparum in vitro.

[0053] A Figura 22 mostra a avaliação da capacidade da pré- incubação com urato por 24h em reverter o efeito do Cure. sobre a proliferação de P. falciparum in vitro.

[0054] A Figura 23 mostra a avaliação da capacidade hemolítica da

Cure por lh.

[0055] A Figura 24 mostra a avaliação da capacidade hemolítica do DETC por lh.

[0056] A Figura 25 mostra a avaliação da capacidade hemolítica do

DS por lh.

[0057] A Figura 26 mostra a avaliação da capacidade hemolítica da

Cure. em combinação com o DETC por lh.

[0058] A Figura 27 mostra a avaliação da capacidade hemolítica da

Cure. em combinação com o DS por lh.

[0059] A Figura 28 mostra o efeito da Cure. por 24h sobre a formação da hemozoína in vitro, em presença de 40 mM SDS e 200 μΜ hemina.

[0060] A Figura 29 mostra o efeito do DETC por 24h sobre a formação in vitro da hemozoína, em presença de 40 mM SDS e 200 μΜ hemina.

[0061] A Figura 30 mostra o efeito do DS por 24h sobre a formação in vitro da hemozoína, em presença de 40 mM SDS e 200 μΜ hemina.

[0062] A Figura 31 mostra a dosagem de hemozoína em presença de extratos de P. falciparum tratados com as IC ₅₀ das drogas.

[0063] A Figura 32 mostra a mensuração da peroxidação lipídica pela dosagem de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) por μg de proteína culturas de P. falciparum incubadas com as IC50 dos compostos por 24h.

[0064] A Figura 33 mostra a citometria de fluxo com utilização da sonda DHE de hemácias infectadas por P. falciparum. A- controle não tratado; B- células tratadas com DETC 10 μg/mL por 2h; C- células tratadas com Cure. 10 μg/mL por 2h; D- células tratadas com DETC 10 μg/mL com Cure. 10 μg/mL por 2h; E- Microscopia de fluorescência de hemácias infectadas por P. falciparum e incubadas com Cure. 10 μg/mL, cuja marcação foi parcialmente revertida por N-acetil-L-cisteína.

[0065] A Figura 34 mostra a citometria de fluxo de hemácias infectadas por P. falciparum tratadas ou não com os compostos isolados e combinados por 2h, com utilização da sonda DHE, mostrando a mediana de todas as populações.

[0066] A Figura 35 mostra a citometria de fluxo de hemácias infectadas por P. falciparum, da população M3 tratadas ou não com os compostos isolados e combinados por 2h, marcadas com a sonda DHE.

[0067] A Figura 36 mostra a citometria de fluxo de hemácias infectadas por P. falciparum, da população M4 tratadas ou não com os compostos isolados e combinados por 2h, marcadas com a sonda DHE.

[0068] A Figura 37 mostra a citometria de fluxo de hemácias infectadas por P. falciparum, da população M5 tratadas ou não com os compostos isolados e combinados por 2h, marcadas com a sonda DHE.

[0069] A Figura 38 mostra a citometria de fluxo de hemácias infectadas por P. falciparum, não tratadas e marcadas com a sonda MitoSox.

[0070] A Figura 39 mostra a citometria de fluxo de hemácias infectadas por P. falciparum, tratadas com DETC 10 μg/mL por 2h e marcadas com a sonda MitoSox.

[0071] A Figura 40 mostra a citometria de fluxo de hemácias infectadas por P. falciparum, tratadas com DETC 10 μg/mL e Cure. 10 μg/mL por 2h e marcadas com a sonda MitoSox.

[0072] A Figura 41 mostra a citometria de fluxo de hemácias infectadas por P. falciparum, tratadas com DETC 10 μg/mL e Tocoferol 10 μg/mL por 2h e marcadas com a sonda MitoSox.

[0073] A Figura 42 mostra a citometria de fluxo de hemácias infectadas por P. falciparum, tratadas com DETC 10 μg/mL, Cure. 10 μg/mL e Tocoferol 10 μg/mL por 2h e marcadas com a sonda MitoSox.

[0074] A Figura 43 mostra a citometria de fluxo de hemácias infectadas com P. falciparum tratadas ou não com os compostos isolados e combinados por 2h, marcadas com a sonda MitoSox.

[0075] A Figura 44 mostra a avaliação do efeito do DS 5 e 25 mg/kg na mortalidade cumulativa de camundongos infectados com P. berghei.

[0076] A Figura 45 mostra a avaliação do efeito do DS 50 e 100 mg/kg na mortalidade cumulativa de camundongos infectados com P. berghei.

[0077] A Figura 46 mostra a avaliação da sobrevivência de camundongos infectados com P. berghei, tratados com diferentes concentrações de Cure.

[0078] A Figura 47 mostra a avaliação da sobrevivência de camundongos infectados com P. berghei, tratados com diferentes concentrações de DETC, DMSO (controle negativo) e CQ (controle positivo).

[0079] A Figura 48 mostra a avaliação da sobrevivência de camundongos infectados com P. berghei e tratados com a combinação entre DETC e Cure.

[0080] A Figura 49 mostra a avaliação das transaminases hepáticas.

A: Alanina aminotransferase (ALT) e B: Aspartato aminotransferase (AST), em plasma de camundongos tratados per os com DETC e Cure, isolados e combinados por 5 dias consecutivos.

[0081] A Figura 50 mostra a avaliação da atividade (A) creatina cinase (CK) e níveis plasmáticos de ureia (B) em plasma de camundongos tratados per os com DETC e Cure, isolados e combinados por 5 dias consecutivos.

Descrição Detalhada da Invenção

[0082] De acordo com a Organização Mundial de Saúde (OMS), em

2015, 95 países registraram ao menos 214 milhões de casos de malária, que resultaram em 438.000 óbitos (OMS, 2015). E alarmante pensar que mais de três bilhões de pessoas estão sob o risco de infecção, particularmente em face às mudanças climáticas, que favorecem a distribuição dos insetos transmissores.

[0083] A infecção se inicia pela hematofagia da fêmea do anofelino durante a qual ocorre a inoculação de esporozoitos presentes na saliva do inseto, na corrente sanguínea do hospedeiro. Em aproximadamente 60 minutos estes esporozoitos chegam aos hepatócitos, dando início à fase exoeritrocítica.

[0084] Em 2002, Mota et al., relataram que o esporozoíto necessita de ativação para conseguir infectar o hepatócito, e esse processo acontece durante a migração através das células do hospedeiro que permite o contato do parasito com moléculas específicas no citoplasma, ativando uma cascata de sinalização dependente de Ca ²⁺ , que é fundamental para induzir a exocitose no esporozoíto, processo necessário para a formação do vacúolo do parasito no hepatócito. Sendo assim, a migração através das células hospedeiras é fundamental para o estabelecimento da infecção.

[0085] O processo de invasão do hepatócito pelo esporozoíta acontece através da ligação da proteína de circunsporozoíta (CSP) a receptores proteoglicanos sulfatados de heparan (HSPGs) do hepatócito (Frevert et al., 1993). O heparan sulfato do fígado apresenta um grau maior de sulfatação, quando comparado a outros tecidos. Isso pode explicar o reconhecimento do sulfato de heparan do fígado pela proteína CSP, e o motivo do sítio de replicação inicial dos parasitos da malária no hospedeiro mamífero ser o fígado (Ying et al, 1997).

[0086] Nas infecções causadas por P. vivax e P. ovale existe a possibilidade de uma segunda esquizogonia, pois alguns parasitos permanecem quiescentes nos hepatócitos. Esse estágio é denominado hipnozoíta (Krotoski et al., 1982), o qual pode estar envolvido nas recidivas da infecção.

[0087] Os esporozoitos começam o processo de multiplicação transformando-se em merozoítos exoeritrocíticos. Em torno de 10 a 12 dias, os hepatócitos se rompem liberando milhares de merozoítos que irão, então, infectar os eritrócitos e começar o ciclo eritrocítico da doença, e é nesta fase que ocorre a maior parte da sintomatologia (Haldar et ah, 2007). O processo de invasão pelo parasito é similar entre as diferentes espécies de Plasmodium spp. É um processo complexo que é mediado por interações moleculares multifatoriais.

[0088] O processo de invasão das hemácias pelos plasmódios ocorre através da interação do parasito com receptores de membrana das hemácias. No caso do P. vivax e do P. knowlesi a interação ocorre com o receptor Duffy; já P. falciparum apresenta a capacidade de interagir com variados receptores, dentre eles as glicoforinas A, B e C, e com a proteína Banda 3 (Gaur et al., 2004).

[0089] O parasito interage com receptores na membrana da hemácia e reorienta a adesão à célula hospedeira de modo que esta seja mediada pela região do complexo apical. O parasito induz a formação de um vacúolo derivado da membrana plasmática da hemácia e com componentes parasitários e, então, penetra no vacúolo através de junções móveis. Três organelas do parasito estão principalmente envolvidas no processo de invasão: roptrias, micronemas e grânulos densos. Os receptores que medeiam o processo de invasão no parasito estão localizados nos micronemas, na superfície celular e nas roptrias, e a localização desses dentro de organelas protege o parasito do processo de neutralização mediada por anticorpos; pois, como a liberação destes a partir das organelas do complexo apical é posterior ao contato com as hemácias, isso acaba por limitar a exposição a anticorpos.

[0090] Já na hemácia, o parasito começa o processo de divisão celular assexuado. O trofozoíto jovem, em forma de "anel", é o estágio mais imaturo do parasito. Cada trofozoíto maduro, nas infecções por P. vivax e P. falciparum, é capaz de dar origem a 20 merozoitos, sendo que cada merozoito pode infectar uma hemácia (Miller, 2002). O crescimento do trofozoíto é acompanhado pelo aumento significativo da taxa metabólica, a qual inclui glicólise, ingestão do citoplasma da célula hospedeira e proteólise da hemoglobina em aminoácidos.

[0091] O plasmódio não degrada os anéis tetrapirrólicos ou heme livres, sendo que estes e o ferro ali presente são tóxicos para o microorganismo por seu efeito oxidante (Har-El et al., 1993). Entretanto, os efeitos do heme em parasitos incubados com CQ podem ser independentes de ERO ou espécies reativas de nitrogénio (Ch'ng JH et al., 2011). Sendo assim, durante o processo de degradação da hemoglobina, a maior parte do heme liberado é polimerizado na forma de hemozoína ou pigmento malárico (Stiebler et al., 2011). Compostos que inibem este processo de biocristalização tem atividade antimalárica (Ziegler et al., 2001 ; Hempelmann, 2007). Além disso, existem evidências bioquímicas da despolimerização de hemozoína por compostos quinolínicos como a cloroquina (Pandey & Tekwani, 1997).

[0092] A biogênese de vacúolos digestivos contendo hemozoína tem um papel central na fisiopatogenia da malária (Dasari & Bhakdi, 2012), ativando as cascatas de complemento e coagulação, processos observados em casos severos de malária (Dasari et al., 2012), modulando a resposta imunológica (Schumann, 2007) e inibindo a função de células efetoras (Perkins et al., 2011) como macrófagos (Arese & Schwarzer, 1997), monócitos (Schwarzer et al., 2008), neutrófilos (Perkins et al., 2011) e células dendríticas (Urban & Todryk, 2006; Millington et al., 2006). Naturalmente para que o conteúdo vacuolar exerça tais efeitos, faz-se necessária a hemólise. O processo de fisiopatogenia da malária é, em grande parte, desencadeado pela lise eritrocitária, processo esse que coloca na circulação sanguínea componentes do parasito, incluindo a hemozoína, e da própria hemácia que irão deflagrar intensa resposta do hospedeiro, associada ao paroxismo (Garcia, 2010). O tratamento da malária com compostos como primaquina, particularmente em pacientes deficientes em glicose-6-fosfato deshidrogenase (G6PD) pode gerar um quadro hemolítico severo (Ramos Júnior et al., 2010), mas muitos pacientes com níveis normais de G6PD apresentam a chamada "Febre da água negra" (loc. cit. White & Ho, 1992). Mesmo combinações envolvendo artesunato (Raffray et al., 2014; Boillat et al., 2015; Chavada et al., 2015; Rolling et al., 2015) e artemeter (De Nardo et al., 2013) podem ocasionar hemólise, tanto in vitro (Anaba et al., 2012) como em humano (De Nardo et al., 2013). Vale ressaltar que, na invenção aqui apresentada, as combinações não acarretaram hemólise detectável in vitro.

[0093] A produção da hemozoína pode estar relacionada à resistência a drogas antimaláricas como a artemisinina (Meunier & Robert , 2010; Witkowski et al., 2012), que atuam no vacúolo digestivo dos parasites intracelulares (dei Pilar Crespo et al., 2008). Assim sendo, a via endocítica deste parasito não apenas constitui um modelo experimental importante para o entendimento da doença, mas ainda um promissor alvo para a quimioterapia antimalárica. Com isso, a formação de cristais de hemozoína a partir de heme constitui uma importante estratégia parasitária de escape do estresse oxidativo (ver abaixo). Vale salientar que o bloqueio da biogênese de hemozoína pode deflagrar a morte celular programada em P. falciparum, através da permeabilização da membrana do vacúolo digestivo (Ch'ng et al., 2011).

[0094] Quando os gametócitos são ingeridos pelo vetor (que é o hospedeiro definitivo), ocorre maturação dos gâmetas dentro do intestino do mosquito. Os microgametas (gâmetas masculinos) sofrem divisão nuclear, seguida de um processo chamado exflagelação, uma vez que os gâmetas têm forma de flagelos. Eles tornam-se móveis, rompem as hemácias e penetram nos macrogametas (gâmetas femininos) formando assim o estágio fertilizado, zigoto. O zigoto alonga-se e torna-se móvel e, então, é chamado oocineto, o qual atravessa a parede do tubo digestivo do inseto, fixando-se à face deste voltada à cavidade geral do corpo. Nesta fase ele transforma-se em oocisto, no interior do qual são formadas centenas de esporozoítos. Os oocistos rompem- se liberando esporozoítos que migram para as glândulas salivares, de onde são introduzidos nos hospedeiros vertebrados juntamente com a saliva, durante repasto sanguíneo, reiniciando o ciclo.

[0095] Essas formas intraeritrocíticas circulam pela corrente sanguínea em todas as espécies de plasmódio que infectam o homem. Porém, na malária falciparum as células infectadas tendem a aderir ao endotélio de diferentes órgãos do corpo, de forma que apenas as formas de anel e gametócito costumam aparecer no sangue periférico.

[0096] A homeostasia requer a manutenção de um meio com equilíbrio redox apropriado, minimizando a geração de ERO como os ânions superóxido, peróxido de hidrogénio e radicais hidroxil que causam danos a ácidos nucléicos, proteínas, lipídeos de membranas (Imlay, 2003). Na tentativa de preservar este ambiente redutor, organismos aeróbicos e anaeróbios utilizam sistemas antioxidantes e reações de óxido-redução (Jakob & Reichmann, 2013). O estado redox da célula é mediado por taxas de nucleotídeos de purina oxidados e reduzidos e tióis como a glutationa/glutationa dissulfeto e tiorredoxina/tiorredoxina dissulfeto (Ghezzi et al., 2005), sistema importante em P. falciparum (Kanzok et al., 2002).

[0097] O estresse oxidativo na malária é relevante tanto ao nível da célula infectada (Muller, 2004), quanto àquele do paciente (Pabón et al., 2003). Uma vez que células efetoras do sistema imune geram espécies oxidantes com atividade microbicida, os mecanismos antioxidantes dos parasitos usualmente constituem importantes estratégias de escape e, portanto, fatores de virulência.

[0098] Tem sido demonstrado na literatura que os parasitos causadores da malária são particularmente vulneráveis ao estresse oxidativo durante seu estágio de vida eritrocítico (Becker et al., 2004). Isto é compreensível tendo em vista que o parasito habita um ambiente pró-oxidante que apresenta oxigénio e ferro, os principais pré-requisitos para a formação de ERO, tais como ânions hidroxila (OH ^" ) e radicais hidroxil (·ΟΗ) via reação de Fenton (Liochev & Fridovich, 1999).

[0099] Para sobreviver a este estresse oxidativo, parasitos e hospedeiros precisaram desenvolver uma pletora de defesas antioxidantes. Algumas destas estão funcionais apenas nos parasitos ou atuam de forma distinta de células humanas, constituindo, portanto, promissores alvos terapêuticos seletivos. Neste sentido, uma das enzimas de primeira linha nas defesas antioxidantes é a superóxido dismutase (SOD), responsável pela detoxificação do superóxido (O ₂ ^*" ). As SOD podem ser caracterizadas segundos cofatores necessários à sua atividade catalítica, que são metais como cobre, zinco, manganês. Em células de mamíferos, incluindo hemácias, citoplasma apresenta Cu-Zn-SOD, enquanto a matriz mitocondrial apresenta Mn-SOD. Algumas bactérias e parasitos apresentam ferro como cofator de atividade SOD. Plasmodium falciparum também apresenta atividade Fe-SOD (Bécuwe et al., 1996), a qual pode constituir alvo altamente seletivo para a quimioterapia antimalárica (Soulère et al., 2003). Vale salientar que a atividade SOD foi reportada reduzida nos pacientes infectados por P. vivax (Bilgin et al., 2012) e em casos graves de malária (Narsaria et al., 2012). Entretanto, a atividade SOD-1 plasmática pode representar um marcador de severidade na malária vivax (Andrade et al., 2010), sendo aumentada nos casos mais graves e reduzida após o tratamento, mas ao contrário já foi relatada a redução nesta atividade tanto após a infecção como sua terapêutica (Farombi et al., 2003). Estes dados aparentemente conflitantes indicam que o estresse oxidativo e a SOD estão envolvidos na patogenia da malária de forma complexa.

[00100] Outro fator importante do estudo da malária está na ocorrência de casos refratários aos tratamentos disponíveis. O extensivo e prolongado uso das drogas antimaláricas vem provocando o surgimento de cepas resistentes (Barnes et al., 2008).

[00101] A P-glicoproteína (Pgp) é uma bomba de efluxo dependente de ATP, localizada na membrana celular. Essa proteína realiza a extrusão de fármacos e, consequentemente, confere resistência de parasitos e de células de mamíferos. A susceptibilidade a drogas é, muitas vezes, inversamente proporcional à expressão e atividade de Pgp (Sauna et al., 2005).

[00102] A atividade Pgp foi descrita em Plasmodium sp. e está relacionada à resistência à cloroquina e à mefloquina (Borst & Ouellette, 1995). A resistência à cloroquina pode ser mediada por mecanismos dependentes de Pgp que realiza o efluxo de cloroquina em parasitos resistentes (Ullman, 1995), nos quais o tratamento com verapamil, um clássico inibidor de PgP, reverte a resistência à cloroquina (Watt et al., 1990). Entretanto, além de inibir essa ATPase, o verapamil age como bloqueador de cálcio, atuando tanto na condução elétrica do feixe sinoatrial como nos endotélios, provocando vasodilatação, constituindo, assim, o bloqueador de cálcio com mais casos letais relatados (revisto em DeWitt & Waksman, 2004).

[00103] Loo et al. em 2004, mostraram que os metabólitos do DS exercem efeitos inibitórios sobre Pgp. Eles demonstraram que estes efeitos não estão relacionados à inibição da síntese da proteína, mas à interação do DS com duas cisternas localizadas no sítio ligante de ATP da proteína. Quando os sítios de ATP estão acessíveis, o DS interage com as cisternas; inibindo, assim, a hidrólise do ATP e inativando a proteína.

[00104] A presente invenção utiliza uma combinação sinérgica contendo Cure. e DETC ou seu precursor o DS e estes fármacos tem a capacidade de inibir PgP, da mesma forma que a Cure, podendo, presumivelmente atuar na reversão de resistência a drogas pelos parasitos. Cure.

[00105] A Cure. [(E, E)-l,7-bis(4-hidroxi-3-metoxifenil)-l,6- heptadieno-3,5 diona] é um polifenol natural encontrado no rizoma da Curcuma longa que possui a seguinte estrutura molecular (fórmula I):

Fórmula I

[00106] A Cure. apresenta uma série de potenciais propriedades terapêuticas como: anti-inflamatória, antioxidante, antineoplásica, dentre outras. Sendo assim, é possível perceber que a Cure. possui uma série de alvos moleculares e celulares. Isso possivelmente explica as atividades pleiotrópicas da substância para diversas doenças, incluindo o câncer.

[00107] De forma análoga ao DETC, a Cure. é capaz de inibir bombas cassete ABC, revertendo o fenótipo MDR em células tumorais (revisto em Aggarwal et al., 2007b) e Cândida albicans, podendo ser empregada em combinações (Sharma et al., 2009; Garcia-Gomes et al., 2012).

[00108] E sabido que os produtos naturais, incluindo a Cure, constituem importantes fontes de agentes antiparasitários. Diferentes formulações e regimes de Cure. já tiveram atividades antiparasitárias (Haddad et al., 2011) contra Trypanosoma cruzi, Leishmania spp., Schistosoma mansoni, Giardia lamblia, Cryptosporidium parvum, Eimeria tenella, Opisthorchis viverrini, e atividade antimalárica demonstradas (Reddy et al., 2005). Entretanto, a Cure. não foi testada em combinação com tiocarbamatos no tratamento de qualquer infecção parasitária, ou outra entidade nosológica. DS e DETC

[00109] O dietilditiocarbamato é o primeiro metabólito do DS, droga utilizada no tratamento do alcoolismo nos últimos 50 anos. Em células de mamíferos, este composto atua como um agente seletivo para carbamilação de proteínas nos grupos sulfidril (Nagendra et al., 1997).

[00110] Os ditiocarbamatos demonstram atividade antioxidante e quelantes de metais (revisto em Hogarth, 2012). Eles são reconhecidos por sua capacidade de inativar a enzima superóxido dismutase (SOD-Cu/Zn) em células eucarióticas, atuando como quelante de metais no sítio ativo da enzima (Halliwell & Gutteridge, 1990).

[00111] As estruturas químicas do DS (Ι,Γ, Γ',Γ"-

[disulfanedilbis(carbonothioilnitrilo)]tetraetano) e DETC são apresentadas a seguir como fórmulas II e III, respectivamente.

Fórmula II Fórmula III

[00112] O DETC pode exercer diversas atividades. Além de quelar íons metálicos como ferro, zinco e cobre e atuar como supressor de radicais livres, este composto inibe a SOD, promovendo danos mediados por superóxido, bem como liga-se a proteínas ricas em tiol e glutationa, formando pontes disulfeto, inibindo, assim, possíveis mecanismos antioxidantes (Halliwell & Gutteridge, 1990).

[00113] A busca de novas terapias nos leva a abordar a possibilidade de sinergismo entre drogas, melhorando a eficácia delas mesmo em menores concentrações, diminuindo, portanto, os efeitos colaterais de ambas. Neste sentido, sistemas reguladores de estresse oxidativo surgem como um possível alvo.

[00114] Além de possíveis efeitos sobre SOD, tanto o DETC (Arnelle et al., 1997; Ningaraj et al., 2001 ; Rahden-Staron et al., 2012) quanto o seu precursor, o DS (Nagendra et al., 1994; van Gorp et al., 1997; Burkitt et al., 1998; Balakirev & Zimmer, 2001 ; Kwolek-Mirek et al., 2012), podem regular negativamente os níveis de glutationa reduzida (GSH), podendo, com isso, promover a ação antimalárica de drogas quinolínicas (Deharo et al., 2003). DETC já foi empregado em humanos como imunomodulador (imuthiol) em pacientes com HIV/AIDS (Reisinger et al., 1990) e em modelos de leishmaniose cutânea (Khouri et al., 2010), mas ainda não havia sido testado em modelos de malária ou em combinações.

[00115] Cientes do estado da arte, os inventores analisaram a ação de combinações de tiocarbamatos com o produto natural Cure. na malária e encontraram a relevante eficácia da combinação de Cure. e DETC no tratamento da malária.

[00116] Para alcançar seus objetivos, os inventores conduziram diversos experimentos para avaliar a combinação sinérgica da presente invenção.

[00117] Foram especificamente avaliados :

(1) o efeito de Cure. isolada e em combinação com o DETC e com o DS sobre a sobrevivência de Plasmodium falciparum in vitro;

(2) o potencial citotóxico das substâncias isoladas e em combinação;

(3) os possíveis efeitos sinergísticos entre as drogas combinadas;

(4) os possíveis mecanismos de ação das drogas isoladas e combinadas com antagonistas de sistemas antioxidantes através da análise ultraestrutural e técnicas bioquímicas/citoquímicas de Plasmodium falciparum e P. berghei;

(5) o efeito in vivo das drogas e combinações supracitadas sobre a sobrevivência de camundongos da linhagem Swiss webster infectados com Plasmodium berghei. Cabe mencionar que tanto DS como Cure. tem atividade radioprotetora de DNA em Saccharomyces cerevisiae (Nemavarkar et al., 2004) e células de roedores (Srinivasan et al., 2007; 2008;) e humanas in vitro (Srinivasan et al., 2006; Sebastià et al., 2014; Shafaghati et al., 2014), bem como em modelos experimentais in vivo (Ozgen et al., 2012; Cho et al., 2013). Nestes modelos a Cure. reverte o estresse oxidativo produzido pela radiação (Srinivasan et al., 2007). Já foram testados os efeitos da Cure. em pacientes sob radioterapia e a capacidade antioxidante do plasma foi aumentada, mas não foi verificada diferença no desfecho clínico, no regime adotado (Hejazi et al., 2016).

[00118] A presente invenção será, agora, definida com referência aos seguintes exemplos que não devem ser interpretados como limitadores do escopo da invenção.

Metodologia

[00119] Coleta de Sangue humano Os procedimentos para coleta nas veias periféricas foram realizados segundo técnica preconizada pelo Ministério da Saúde (Brasil). Os critérios de inclusão foram: indivíduos saudáveis de ambos os sexos que possuíssem sangue tipo O e fator RH positivo (0+), com idade acima de 21 anos e com peso superior a 50 kg. Os indivíduos selecionados doaram 10 mL de sangue, o qual foi utilizado somente para a cultura de Plasmodium in vitro. Vale ressaltar que não foi feita qualquer forma de diagnóstico ou caracterização das amostras coletadas. Ensaios in vivo foram realizados somente em modelo experimental murino. Cultivo do Plasmodium falciparum em fase eritrocítica

[00120] Os experimentos foram realizados utilizando-se P. falciparum clone W2 (CQ-resistente), cultivados em hemácias humanas conforme descrito por Trager e Jensen, 1976. Os parasites foram mantidos em garrafas plásticas para cultura de 50 a 150 mL, a 37 °C, em meio RPMI 1640 (GibcoBRL), suplementado com 25mM de Hepes (Sigma- Aldrich), 1 lmM de glicose (Sigma- Aldrich), ^g/mL de gentamicina (Sigma- Aldrich), 5% de bicarbonato de sódio (Sigma-Aldrich) filtrado, hipoxantina (Sigma-Aldrich) e 10% (v/v) de plasma humano 0 ⁺ (inativado) coletado no Hemocentro da Bahia (HEMOBA). As culturas foram mantidas com hematócrito de 5% em mistura gasogênica de 90% N ₂ ; 5% 02; 5% C0 ₂ . As trocas do meio de cultura e da mistura gasogênica foram realizadas diariamente. A parasitemia foi monitorada através de esfregaços sanguíneos fixados e corados com Panótico. [00121] Separação do P. falciparum da hemácia: O processo de lise das hemácias foi realizado segundo Gallo et al., 2009. Parasites foram isolados das hemácias utilizando-se 20 vezes o volume dos pellets de um tampão contendo 7 mM K ₂ HP0 ₄ , 1 mM NaH ₂ P0 ₄ , 11 mM NaHC0 ₃ , 58 mM KC1, 56 mM NaCl, 1 mM MgCl ₂ , 14 mM glicose e 0,02% saponina. Os pellets foram lavados 2 vezes a 1500 g por 5 minutos neste tampão.

[00122] Sincronização das Culturas: A sincronização para obtenção de culturas com parasitos predominantemente na forma de "anel" ou trofozoíto jovem, utilizados para testes quimioterápicos in vitro, foi realizada segundo Lambros e Vanderberg, 1979. Resumidamente, 15 mL da cultura com 90% dos parasitos na forma evolutiva de "anel" foram centrifugados por 5 minutos a 2039 g. Posteriormente as células foram res suspendidas em 10 mL de sorbitol (VETEC) a 5% e incubadas por 5 minutos a 37 °C. As células foram então centrifugadas a 2039 g por 6 minutos e mantidas em cultura conforme descrito.

[00123] Concentração das células com Percoll: Para aumentar a taxa de parasitemia, fez-se necessário, utilização da concentração das células parasitadas através da utilização do gradiente de percoll segundo Kutner et al., 1985. As culturas sincronizadas e com hematócrito de 5% no estágio de trofozoíto maduro foram centrifugadas a 550 g a 27 °C por 5 minutos. Os pellets foram lavados em salina tamponada com fosfato - PBS (137 mM NaCl - 2,7 mM KC1 - 1,24 mM Na ₂ HP0 ₄ - 0,14 mM de KH ₂ P0 ₄ pH 7,2). As hemácias infectadas foram então res suspendidas em 2 mL de PBS com 6% de sorbitol (VETEC). Suspensões de hemácias em PBS-sorbitol foram adicionadas sobre gradientes de percoll (GE Healthcare) (90% - 80% - 70% - 60%). Após esse procedimento os tubos foram centrifugados a 1500 g, por 20 minutos à temperatura ambiente em centrífuga (Beckman) com rotor de ângulo fixo.

[00124] Testes de proliferação: Os testes de proliferação foram realizados segundo Desjardins et al., 1979. Os parasites foram previamente cultivados em meio livre de hipoxantina por no mínimo 72 horas, posteriormente sincronizados. Parasites foram incubados com 5 (cinco) concentrações variadas dos compostos utilizando a proporção 1/3 (10(^g/mL à 1,23 μg/mL) por 24 horas em placas de 96 poços, após esse período foram adicionados ao meio de cultura 25 μΕ/poço de [ ³ H]-hipoxantina (0,5 μθ/ροςο), e incubados por mais 24 horas a 37 °C. As placas foram então congeladas a - 20 °C por 6-18 horas para lise das hemácias. Após esse período foram descongeladas e colhidas em capilares de vidro, em papéis de filtro (Perkin-Elmer), na qual foram adicionados 4 mL de líquido de cintilação. Então as amostras foram colocadas em bolsas e emergidas em cintilação de fluxo, por emissão radioativa em contador β Matrix 9600 (Perkin-Elmer). A concentração de hipoxantina tritiada incorporada aos parasitos foi avaliada através da leitura da radioatividade incorporada. A medida de incorporação de [ ³ H] -hipoxantina foi realizada em contagem por minuto, sendo proporcional à viabilidade do parasito. Para determinar as IC ₅₀ das drogas foram utilizadas 5 (cinco) concentrações das drogas. Os estágios de anel (200 μΐ. por poço, com hematócrito de 5% e parasitemia de 1-2%) foram expostos às drogas. Todos os testes foram realizados em triplicata. A parasitemia e a morfologia dos parasitos foram analisadas em esfregaços corados com Giemsa e visualizadas em microscopia ótica. Os valores de IC ₅₀ foram calculados pelo programa GRAPHPAD.PRISM5.0.

[00125] Avaliação da citotoxicidade em esplenócitos: Inóculos de 1 x IO ⁶ esplenócitos, retirados de camundongos BALB/c, foram incubados em meio RPMI (GibcoBRL) completo, suplementado com 10% (v/v) de soro fetal bovino e 10 μΐ. de [ ³ H]-timidina/poço, de forma a obter uma concentração de 1 μθ/ροςο, em presença ou ausência dos fármacos. Para estimular a proliferação dos esplenócitos foi utilizada 10 μg/mL de concanavalina A (Sigma- Aldrich). Após 24 horas, as células foram coletadas para contagem de radioatividade incorporada através do contador β Matrix 9600 (Perkin-Elmer). A porcentagem de inibição será calculada em relação ao controle e a CC5 ₀ determinada.

[00126] Avaliação da citotoxicidade em macrófagos: A coleta dos macrófagos foi realizada por lavagem peritoneal utilizando PBS a 4 °C, pH 7,4. As células coletadas do peritônio foram transferidas para tubos estéreis, mantidos em banho de gelo, centrifugadas três vezes a 363 g durante 5 minutos à 4 °C em tampão fosfato para lavagem. As células sedimentadas foram ressuspensas em meio de cultura RPMI - 1640 completo, na concentração de 5xl0 ⁶ células/mL. Dessa suspensão, 100 μΐ, adicionados em cada poço da placa (96 poços). Em seguida, os compostos, diluídos em meio de cultura RPMI completo, foram adicionados, em triplicata, 100 μΐ, de cada. As incubações foram feitas durante 24 horas (37 °C, 7,5% de C0 ₂ ). Após esse período, 100 μΐ, de uma solução de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2-5- difeniltetrazólio (MTT) diluído em meio RPMI na proporção 1 : 1 foram incubados em cada poço, por 3 horas (37 °C, 7,5% de C0 ₂ ). Após o período foram retirados 100 μΐ, do sobrenadante e adicionando DMSO em porção de 1 : 1. As células foram homogeneizadas e centrifugadas por 10 minutos a 1400 g. A citotoxcididade foi mensurada a partir da análise da atividade mitocondrial das células através do método da redução do MTT a formazam. Foi realizada a leitura do sobrenadante em espectrofotômetro VersaMax a 570 nm.

[00127] Taxas de hemólise in vitro: Para avaliar a capacidade dos compostos em causar hemólise, utilizou-se a técnica proposta por Wang e colaboradores 2010. Coletou-se sangue em tubo com heparina, centrifugou-se a 796 g por 10 minutos a 4 °C. O sobrenadante foi retirado e as hemácias foram lavadas 4 vezes com PBS. As hemácias (hematócrito 1 %) foram incubadas com concentrações variadas das substâncias (100 μg/mL - 50 μg/mL - 25 μg/mL - 12,5 μg/mL e a IC ₅₀ da substância) a 37 °C em estufa a 5% de C0 ₂ por 1 hora. Foi utilizada solução de saponina a 1% (m/v) como controle positivo, gerando 100% de hemólise. Após incubação, as placas foram centrifugadas a 286 g por 10 minutos, e 100 μΐ. do sobrenadante foram transferidos para outra microplaca. A leitura foi realizada a 540 nm em espectrofotômetro. A taxa de hemólise das amostras foi calculada segunda a fórmula abaixo:

% Hemólise = absorbância da amostra - absorbância do branco x 100 / absorbância do controle com saponina

[00128] índice de Seletividade: Após a determinação das IC ₅₀ e das CC ₅₀ dos compostos isolados e da combinação, os índices de seletividade (IS) foram determinados com a seguinte fórmula: índice de seletividade = ^{L "}

[00129] Para que um composto seja considerado seguro, o IS deve ser igual ou maior que 10 (Bézivin et al., 2003).

[00130] Determinação de Concentrações Inibitórias Fracionadas (FIC): Para a determinação da FIC e posterior caracterização do tipo de associação entre as drogas, foram realizados ensaios de proliferação celular. Os ensaios foram realizados segundo metodologia citada anteriormente. Entretanto, para a determinação de FIC, fez-se necessário combinar concentrações variadas de um composto, mantendo-se fixa a concentração do outro (e vice-versa). Posteriormente determinou-se a IC ₅₀ do composto que teve sua concentração variada na combinação entre as drogas e posteriormente estes resultados foram plotados na seguinte fórmula objetivando a determinação da FIC:

[00131] A partir daí foi calculada as IC ₅₀ das combinações das drogas e, posteriormente, estes resultados foram aplicados na seguinte fórmula: FIC = (IC ₅₀ da combinação das drogas AB / IC ₅₀ da droga A) + (IC ₅₀ da combinação das drogas BA / IC ₅₀ da droga B)

[00132] Resultados de FIC abaixo de 0,5 caracterizam efeitos sinergísticos (Hallander et al., 1982).

[00133] Isobolograma: Os gráficos de isobolograma foram

construídos através da utilização do programa CompuSyn (ComboSyn, Paragon, NJ, EUA). Para isso foram determinadas FICs em proporções variadas (25%, 50%, 75%, 100%).

[00134] Peroxidação lipídica: Hemácias infectadas foram incubadas na presença e ausência das drogas e, após o tratamento, as células foram centrifugadas e, então, as hemácias foram lisadas segundo protocolo descrito. Após a lise, as células foram res suspendidas em 200 μΐ, de PBS. 200 μΐ, de TBA (ácido tiobarbitúrico) a 1 % em água destilada e ácido acético glacial na proporção de 1 : 1 foram adicionados para posterior incubação a 100 °C por um período de 3 horas. As substâncias reativas ao TBA (TBARS) foram mensuradas em espectrofotômetro a 532 nm e os resultados foram expressos por μg de proteína.

[00135] Microscopia Eletrônica de Transmissão: As células foram concentradas através do gradiente de percoll e as amostras foram fixadas em glutaraldeído a 2,5 % em tampão cacodilato de sódio 0,1 M pH 7,2, pós- fixadas em tetróxido de ósmio 1 % em tampão cacodilato de sódio 0,1M, ferricianeto de potássio 0,8 % e cloreto de cálcio 5 mM ao abrigo da luz por 40 minutos em temperatura ambiente. A seguir as células foram lavadas no mesmo tampão e desidratadas em concentrações crescentes de acetona (30 - 100 %) por 10 minutos em cada. As amostras foram infiltradas e emblocadas em resina epoxi Polybed (Polysciences). Após polimerização, cortes ultrafinos foram obtidos em ultramicrótomo e coletados em grades de cobre de malha 400, foram, então, contrastadas em soluções aquosas de 5 % de acetato e de uranila por 20 min. e 3 % de citrato de chumbo por 5 min. e observadas ao microscópio eletrônico de transmissão Zeiss EM 109 a 80kV.

[00136] Microscopia de fluorescência: Garrafas de cultura contendo hemácias infectadas por Plasmodium falciparum sincronizados e tratados com Cure. e DETC a 10 μg/mL por 2 horas foram lavadas com PBS e centrifugadas a 1.500 rpm (639 g) por 5 minutos. Posteriormente foram incubadas com 10 μΜ de Dihidroetídio (DHE) ou 5 μΜ de MitoSox em HBSS ('Hank's balanced salt solution'), a 37 °C. Após este tempo, as células foram observadas ao microscópio invertido de fluorescência.

[00137] Detecção de superóxido mitocondrial: Para a detecção de radicais superóxido mitocondriais foi utilizada a sonda fluorescente MitoSox ^® (Molecular Probes ^® ). Hemácias infectadas com Plasmodium falciparum foram incubadas na presença de 5 μΜ de MitoSox em HBSS por um período de 10 minutos a 37 °C ao abrigo da luz. As células haviam sido previamente tratadas com as drogas testes na concentração de 10 μg/mL por um período de 3 horas. Após incubação, as células foram lavadas em HBSS e avaliadas por citometria de fluxo a 510/580 nm (excitação/emissão).

[00138] Detecção de espécies reativas de oxigénio :Para detectar as espécies reativas do oxigénio, utilizou-se a sonda fluorescente DHE. Hemácias infectadas com Plasmodium falciparum foram tratadas por 3 horas com as drogas teste, e posteriormente foram incubadas com DHE a 10 μΜ por 30 minutos a 37 °C em PBS. Após a incubação, as células foram lavadas e avaliadas por citometria de fluxo e microscopia de fluorescência.

[00139] Formação de β-Hematina /w Vitro: A síntese de β-hematina in vitro permite investigar a influência dos fármacos na formação de Hz, baseando-se no princípio apresentado por Egan et al. (2001) e modificações nos métodos descritos por Nhien e colaboradores em 2011. Foram incubados em microtubos ΙΟΟμΜ de hemina em NaOH 0, 1M com solução de dodecil sulfato de sódio (SDS) à 40 mM. O volume final de 1 mL foi completado com 0,5 M tampão acetato de sódio (pH 4,8). Após dezesseis horas em estufa à 28 °C, os tubos foram centrifugados a 7.000 g por 10 min., posteriormente os precipitados foram ressuspendidos em 0,1 M de tampão bicarbonato de sódio com 2,5% de SDS (pH 9,1). Este procedimento foi repetido por mais três vezes, e depois o precipitado foi diluído em NaOH 0,1M, quantificando-se a hemina livre ao final do processo por absorbância das amostras a 400 nm no espectrofotômetro de microplaca VERSAmax.

[00140] Dosagem da formação de hemozoína em extratos do parasito: Hemácias infectadas com a forma de anel foram incubadas na presença e ausência das drogas, após um período de 18 horas, já como trofozoítos maduros de Plasmodium falciparum, as hemácias foram lizadas e os parasitos foram ressuspendidos em 1 mL de PBS. Posteriormente, foram centrifugados a 14.000 g por 5 minutos em temperatura ambiente e o sobrenadante foi descartado. Os pellets foram ressuspendidos em 1,0 mL de tampão bicarbonato de sódio 0, 1 M pH 9, 1 com 2,5 % de SDS. As amostras foram agitadas por 15 minutos e novamente centrifugadas a 14000 g em 10 minutos em temperatura ambiente (esse procedimento foi repetido 3 vezes). Após esse processo, as amostras foram novamente res suspendidas em 1 mL de água destilada e passadas no agitador de tubos (vortex) por 1 minuto. Novamente foram centrifugadas a 14000 g por 10 minutos em temperatura ambiente, e o sobrenadante foi descartado (esse procedimento foi repetido 2 vezes). As amostras foram então ressuspendidas em 1,0 mL de NaOH 0,1 M, agitadas por 30 minutos e as concentrações totais de heme foram quantificadas em espectrofotômetro a 400 nm.

[00141] Experimentos in vivo: Foram realizados em camundongos da linhagem Swiss Webster, pesando aproximadamente 20+5 g provenientes do biotério do CPqGM FIOCRUZ/BA. Os camundongos foram inoculados por via intraperitoneal com eritrócitos infectados com P. berghei (1 x 10 ⁵ ) conforme descrito por Peters W., 1965. Os animais foram tratados diariamente por via oral, durante 5 dias com as substâncias testes. Dois grupos controles (n=5) foram usados a cada experimento, um grupo tratado com doses curativas de cloroquina (25 mg/kg) e outro grupo tratado com o diluente das substâncias testes (salina ou dimetilsulfóxido - DMSO). A sobrevivência, dos grupos tratados, foi calculada em relação aos grupos controle não tratados. Todas as substâncias foram testadas em 3 experimentos independentes.

[00142] Avaliação de toxicidade in vivo: Para avaliação de toxicidade in vivo, camundongos da linhagem Swiss webster foram tratados por via oral durante cinco dias consecutivos com Cure. e DETC isolados e combinados. Após 36 horas do último tratamento, amostras de sangue e plasma foram coletadas destes animais para avaliação dos parâmetros indicativos do dano hepático: AST (Aspartato aminotransferase), ALT (Alanina aminotransferase), CK (Creatina cinase) e Uréia. As amostras foram avaliadas com utilização do Reflotron ^® Plus, ROCHE (Una Health Ltd).

Drogas utilizadas

(1) Cloroquina (6-cloro-4-(4-dietil-amino -1-metilbutilamino)- quinolina)

(2) DETC

(3) Cure. ([(E, E)-l,7-bis(4-hidroxi-3-metoxifenil)-l,6- heptadieno-3,5 diona])

(4) DS (Ι, Ι',Γ, Γ'- [disulfanedilbis(carbonothioilnitrilo)]tetraetano)

[00143] A cloroquina e o DS foram obtidos de Farmanguinhos/FIOCRUZ, e a Cure. e o DETC foram adquiridos da Sigma- Aldrich. Estas drogas foram testadas apenas in vitro e em camundongos.

[00144] Análise estatística: Os dados obtidos foram representados como a média ± desvio padrão e analisados estatisticamente pelos testes ANO VA e pós-teste de Tukey com nível de significância de p< 0,05. Todos os experimentos foram realizados com pelo menos três repetições independentes, em triplicata. Os gráficos apresentados no presente pedido de patente são representativos dos resultados, confirmando o efeito sinérgico da combinação proposta na presente invenção.

[00145] Considerações Éticas: Os animais foram mantidos e manipulados dentro das normas preconizadas pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) da FIOCRUZ-BA, segundo a Lei n°. 1.153, Sérgio Arouca de 1995. O projeto foi apreciado e aprovado pela referida comissão (licença n ² 020/2015).

EXEMPLO 1: Inibição do crescimento de P. falciparum in vitro

[00146] Para avaliar a susceptibilidade do protozoário às diferentes drogas testadas, eritrócitos humanos infectados por P. falciparum foram incubados in vitro com Cure, DS e DETCpor 24 horas, e a proliferação celular foi avaliada através da técnica de incorporação de hipoxantina tritiada. As drogas foram analisadas em comparação ao controle com o DMSO, solvente utilizado para diluir a Cure. Os gráficos são representativos dos experimentos e foram repetidos no mínimo três vezes. Os valores aproximados de IC ₅₀ foram obtidos em ao menos quatro experimentos independentes de dose-resposta, empregando cinco concentrações de drogas isoladas ou combinadas.

[00147] As Figuras 1, 2 e 3 mostram a inibição da proliferação/sobrevivência de P. falciparum in vitro, mensurada pela incorporação de [ ³ H] hipoxantina, incubados com Cure. (Fig 1), com DETC (Fig. 2) e com DS (Fig. 3). Os valores de IC ₅₀ obtidas com Cure, DETC e com DS foram de 3,4 μg/mL, 8,0 μg/mL e 5,9 μg/mL, respectivamente.

EXEMPLO 2: Inibição do crescimento in vitro de P. falciparum pela combinação de drogas

[00148] Para avaliar o efeito da combinação das drogas na proliferação dos parasites, os mesmos foram incubados com as combinações por um período de 24 horas, e foram calculados os valores de FIC (concentração inibitória fracionada), para determinar se as combinações de diferentes fármacos possuem efeitos antagonistas, aditivos ou sinergísticos.

[00149] Os resultados estão representados nas Figuras 4, 5, 6 e 7. A

Figura 4, que é a combinação da Cure. com o DETC, mostra o valor de IC ₅₀ do DETC na combinação de 0,0014 μg/mL, o que determinou o valor de FIC de 0,000175, caracterizando assim um efeito bastante sinergístico para a combinação nessas concentrações, tendo em vista que valores de FIC abaixo de 1 determinam sinergismo entre drogas em combinações.

[00150] A Figura 5, que representa a combinação do DETC com a Cure, mostra a IC ₅₀ da Cure. na combinação de 0,36 μg/mL, o que determinou o valor de FIC de 0,1, caracterizando assim um efeito também sinergístico.

[00151] A Figura 6, que representa a combinação da Cure. com o DS, mostra a IC ₅₀ do DS na combinação de 0,0017 μg/mL, o que determinou o valor de FIC de 0,00028, caracterizando assim um efeito altamente sinergístico.

[00152] A Figura 7, que representa a combinação do DS com a Cure, mostra a IC ₅₀ da Cure. na combinação de 0,44 μg/mL, o que determinou o valor de FIC de 0,129, caracterizando assim um efeito bastante sinergístico. EXEMPLO 3: Isobologramas das combinações de drogas

[00153] Para avaliar se a combinação utilizada apresentava um efeito sinergístico para diferentes combinações fracionadas, como foi inicialmente indicado pela FIC, foram plotados os isobologramas.

Exemplo 3A - Cure. + DETC

[00154] O resultado do isobolograma de diferentes combinações entre a Cure. e o DETC é apresentado na Figura 8 e demonstra que, das oito combinações avaliadas, 7 apresentaram um efeito sinergístico, com valores das combinações abaixo de 1. Esse resultado demonstra que a combinação das duas substâncias sobre a proliferação de P. falciparum é eficaz.

Exemplo 3B - Cure. + DS

[00155] O resultado do isobolograma de diferentes combinações entre a Cure. e o DS é apresentado na Figura 9 e demonstra que, das oito combinações avaliadas, 6 apresentaram um efeito sinergístico, com valores das combinações abaixo de 1. Esse resultado demonstra que a combinação das duas substâncias sobre a proliferação de P. falciparum é eficaz, mesmo que com resultados inferiores ao da combinação com o dietilditiocrabamato de sódio (Exemplo 3A).

EXEMPLO 4 - Citotoxicidade sobre células de mamífero

[00156] Para avaliar a possível seletividade in vitro das substâncias testadas, foi realizada a avaliação da citotoxicidade das drogas, através da técnica de incorporação de timidina tritiada evidenciando a proliferação de esplenócitos murinos.

[00157] A relação concentração-resposta mostra o efeito da Cure. (Figura 10), DETC (Figura 11) e DS (Figura 12) sobre a proliferação de esplenócitos in vitro, revelando valores de IC ₅₀ (i.e. CC ₅₀ ) de 11,2, 3,4 e 4,5 μg/mL, respectivamente.

EXEMPLO 5 - Citotoxicidade das combinações sobre esplenócitos

[00158] O Exemplo 5 foi realizado para avaliar os possíveis efeitos citotóxicos das substâncias testadas em combinação sobre a sobrevivência de esplenócitos para avaliar os possíveis efeitos seletivos das substâncias combinadas.

[00159] A Figura 13 mostra o efeito da combinação de Cure. com o DETC sobre a proliferação de esplenócitos. Observa-se que a IC ₅₀ (i.e. CC ₅₀ ) do DETC na combinação foi de 14,22 μg/mL, e quando se compara com a sua CC ₅₀ isolado (3,4 μg/mL), pode-se concluir que a combinação dele com a Cure. é capaz de diminuir a toxicidade do mesmo. [00160] A Figura 14 mostra o efeito da combinação da Cure. com o DS sobre a proliferação de esplenócitos. E possível observar que a IC ₅₀ (i.e. CC ₅₀ ) do DS na combinação foi de 1,75 μg/mL.

[00161] A Figura 15 mostra o efeito da combinação do DETC com a Cure. sobre a proliferação de esplenócitos. Observa-se que a IC ₅₀ (i.e. CC ₅₀ ) da combinação para a Cure. foi de 7,76 μg/mL.

[00162] A Figura 16 mostra o efeito da combinação do DS com a Cure. sobre a proliferação de esplenócitos. Uma vez que a toxicidade dos compostos combinados foi muito baixa, não foi possível calcular a IC ₅₀ (i.e. CC ₅₀ ).

[00163] A Tabela 1, a seguir, mostra os índices de seletividade (IS) dos compostos em combinação.

Tabela 1: Seletividade da atividade das combinações sobre Plasmodium

[00164] Os índices de seletividade foram calculados pela proporção entre IC ₅₀ encontrada para a combinação em esplenócitos (i.e. CC ₅₀ ) e a IC ₅₀ da combinação em culturas de P. falciparum. Os dados foram baseados na média determinada pelos experimentos realizados para cada avaliação.

[00165] A Tabela 1 demonstra uma citotoxicidade em esplenócitos muito menor que a toxicidade das combinações sobre culturas de P. falciparum, o que é extremamente interessante para uma combinação quimioterápica. O IS da combinação DETC + Cure. foi superior a 10.000, i.e. muito acima do fármaco considerado padrão-ouro i.e. a artemisinina, cujo IS obtido foi 27,57 (mais de 368 vezes mais seletividade). Não foi possível calcular o índice de seletividade da Cure. em combinação com o DS, pela impossibilidade de determinar o valor da citotoxicidade em esplenócitos dessa combinação. O IS demonstra uma elevada segurança, tendo em vista uma vez que estes sejam superiores a 3-10 são considerados altamente seletivos

(Bézivin et al., 2003; Prayong et al., 2008).

EXEMPLO 6 - Reversibilidade do Efeito Antiparasitário

[00166] O Exemplo 6 foi realizado para avaliar os efeitos citotóxico ou citostático das drogas sobre a proliferação de Plasmodium falciparum. O pré- tratamento com o antioxidante urato teve por finalidade avaliar se o efeito sobre as células tinha alguma relação com o estresse oxidativo. Os resultados estão apresentados nas Figuras 17, 18 e 19.

[00167] A Figura 17 mostra a avaliação do efeito da Cure. sobre hemácias infectadas com Plasmodium falciparum na presença e ausência do urato. Após 48 horas de incubação, a droga foi retirada e as células novamente cultivadas. É possível observar que, mesmo após a retirada da droga do meio, as células não voltaram a proliferar, o que demonstra um efeito citotóxico ou irreversível da droga, nestas condições. Vale ressaltar que a pré-incubação com o urato não reverteu ou impediu o efeito da droga.

[00168] A Figura 18 mostra a avaliação do efeito do DETC sobre hemácias infectadas com Plasmodium falciparum na presença e ausência do urato. Após 48 horas de incubação, a droga foi retirada e as células novamente cultivadas. É possível observar que, após a retirada da droga do meio, foi reiniciada a proliferação celular, o que demonstra um possível efeito citostático, reversível, da droga, nestas condições. Vale ressaltar que a pré- incubação com o urato inibiu o efeito da droga durante as primeiras 48 horas, demonstrando que o efeito da droga pode ser revertido através do uso de antioxidante.

[00169] A Figura 19 mostra a avaliação do efeito do DS sobre hemácias infectadas com Plasmodium falciparum na presença e ausência do urato. Após 48 horas de incubação, foi retirada a droga e as células cultivadas novamente. Observou-se que, após a retirada da droga do meio, as células voltaram a proliferar, o que demonstra um possível efeito citostático, reversível, da droga, nestas condições. Vale ressaltar que a pré-incubação com o urato reverteu parcialmente o efeito a droga durante as primeiras 48 horas, o que possivelmente relaciona o efeito da droga ao estresse oxidativo, mas presumivelmente não como único mecanismo de ação.

EXEMPLO 7 - Reversão do efeito das drogas pelo antioxidante Urato

[00170] Para a realização deste Exemplo as células foram pré- incubadas na presença do urato, visando avaliar se o antioxidante tinha a capacidade de reverter o efeito das drogas sobre a proliferação dos parasitos in vitro.

[00171] A Figura 20 mostra a capacidade do antioxidante urato em reverter o efeito do DS sobre a proliferação de P. falciparum in vitro. A Figura 21 mostra a capacidade de reversão do efeito do DETC por ação do antioxidante urato. A Figura 22 mostra a capacidade de reversão do efeito da Cure. sobre o crescimento de P. falciparum in vitro por ação do antioxidante urato.

EXEMPLO 8 - Teste de Hemólise

[00172] Tendo em vista que o Plasmodium falciparum é um parasito intracelular que infecta as hemácias e que a sintomatologia (paroxismo) está ligada ao processo hemolítico, foi avaliada a capacidade das drogas em causar hemólise para verificar se a atividade das substâncias era sobre o parasito per se, ou por induzirem a lise das hemácias; impossibilitando, assim, a manutenção da infecção. Os resultados estão representados nas Figuras 23, 24, 25, 26 e 27.

[00173] Conforme mostra a Figura 23, foi observado que, nas concentrações testadas, a Cure. não apresentou capacidade de causar hemólise.

[00174] Observou-se que o DETC não apresentou atividade hemolítica nas concentrações testadas (Figura 24). Foi observado que o DS não foi capaz de produzir hemólise nas concentrações testadas (Figura 25). A Figura 26 mostra que a combinação de Cure. e DETC também não produziu hemólise nas concentrações testadas. A Figura 27 mostra que a Cure. em combinação com o DS também não produziu hemólise nas concentrações testadas. Nestes ensaios, o detergente saponina foi utilizado como controle positivo.

[00175] A análise ultraestrutural de eritrócitos infectados por microscopia eletrônica de transmissão revelou acentuadas dilatações de cisternas retículo endoplasmático que compõem o envoltório nuclear, as quais frequentemente se mostram justapostas às membranas dos vacúolos digestivos (dados não mostrados). Esses achados sugerem que as drogas provoquem desequilíbrio na homeostasia de Ca ²⁺ e de tráfego de vesículas.

[00176] A permeabilização das membranas de vacúolos digestivos foi evidenciada pela presença de cristais de hemozoína no citoplasma de protozoários tratados (não mostrado), indicando a autólise dos parasites. Assim sendo, é presumível que as combinações aqui testadas exerçam tanto o efeito pró-oxidante, evidenciado pelo uso de sondas fluorescentes e lipoperoxidação, quanto a permeabilização do vacúolo digestivo, demostrada pela microscopia. Parasitos intracelulares em culturas tratadas com a combinação Cure. -DETC apresentaram grandes vacúolos contendo hemoglobina não digerida, assim procurou-se mensurar bioquimicamente a formação de hemozoína.

EXEMPLO 9 - Inibição da Formação de Hemozoína in vitro

[00177] A formação da hemozoína é um processo metabólico essencial para a sobrevivência e manutenção do ciclo do Plasmodium falciparum. Tendo em vista os achados da microscopia eletrônica supracitados e alterações na estrutura do cristal, foram avaliados bioquimicamente pela dosagem de hemozoína, os possíveis efeitos das substâncias sobre esse processo, visando verificar se o mecanismo de ação da droga estava relacionado com a formação do cristal. Além das alterações nos cristais, estes pareciam pouco abundantes e foram detectadas, por microscopia eletrônica (não apresentado), amplas áreas de engolf amento de hemoglobina da célula hospedeira, presumivelmente um mecanismo homeostático compensatório para reverter o déficit metabólico.

[00178] A Figura 28 mostra o efeito da Cure. sobre a formação de β- hematina, em presença de 40mM de SDS in vitro. Nas concentrações testadas não foi observado efeito significativo da substância na formação in vitro do cristal.

[00179] A Figura 29 mostra o efeito do DETC sobre a formação in vitro da β-hematina, em presença de 40mM de SDS. Nas concentrações testadas não houve efeito significativo do composto sobre a formação in vitro do cristal.

[00180] A Figura 30 mostra o efeito do DS sobre a formação in vitro da β-hematina, em presença de 40mM de SDS. Nas concentrações testadas, apenas a de 50μΜ apresentou um efeito estatisticamente significativo ( <0,05) em relação ao controle, empregando ANO VA e pós-teste de Tukey. Embora 100 μΜ de DS tenham ocasionado aparente redução na formação de hemozoma, esta não foi estatisticamente significativa.

EXEMPLO 10 - Inibição da formação de hemozoína em extratos do parasito.

[00181] Tendo em vista a discordância de alguns dos dados de dosagem de hemozoma in vitro com as imagens de microscopia eletrônica (não mostradas), principalmente relacionado a Cure, utilizou-se novamente a técnica de dosagem de formação de hemozoma, desta vez fazendo uso de extratos do parasito.

[00182] A partir dos resultados da Figura 31, que mostram a dosagem de hemozoma (HZ) de Plasmo diumfalciparum tratado com a IC ₅₀ das drogas, é possível observar que a Cure. inibiu a formação do cristal in vivo em mais de 50%, ficando a concentração de hemozoma abaixo de 0,01 proteína, i.e. níveis semelhantes ao observado em presença de cloroquina, sendo altamente significativas estatisticamente, em relação ao controle ( <0,0001, Teste de Dunnett). O DETC e o DS não interferiram com a formação do cristal nas concentrações testadas. Estes dados corroboram as observações ultraestruturais referentes à hemoglobina não digerida nos parasites incubados com a combinação de drogas.

EXEMPLO 11 - Peroxidação Lipídica

[00183] Ao observar a presença de membranas concêntricas e de figuras de mielina na microscopia eletrônica de transmissão (não mostrado), principalmente associada ao tratamento com o DETC e com o DS, foi hipotetizada a ocorrência de estresse oxidativo, assim utilizou-se a técnica de detecção de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) para mensurar a peroxidação de lipídios, evento associado à produção de espécies reativas de oxigénio.

[00184] A Figura 32 mostra a mensuração de TBARS em hemácias infectadas por Plasmodium falciparum incubadas com as IC ₅₀ das drogas por 24 horas. É possível observar que o DETC aumenta, de forma estatisticamente significativa ( <0,05, ANOVA, Tukey), a produção de substâncias indutoras de peroxidação lipídica, chegando a cerca de 0,03 a absorbância^g de proteína, o que não foi observado para a Cure. O DS, por sua vez, apresentou uma diminuição significativa nos níveis de peroxidação lipídica quando comparado ao controle.

EXEMPLO 12 - Detecção da Sonda fluorescente DHE

[00185] A verificação microscópica do aumento da geração de espécies reativas por parte das substâncias testadas foi feita utilizando sondas como a DHE, cuja reação foi quantificada, através da citometria de fluxo, a geração de espécies reativas de oxigénio, como superóxido, nas hemácias infectadas por Plasmodium falciparum.

[00186] A Figura 33 mostra a citometria de fluxo de hemácias humanas infectadas por Plasmodium falciparum e marcadas com a sonda DHE. A citometria de fluxo das culturas controle (A) e tratadas por 2 horas com l(^g/mL de DETC (B) e com l(^g/mL de Cure. (C), com a combinação de ambas (D). A detecção da sonda DHE por microscopia fluorescência demonstrou marcação positiva em colocalização com a presença dos parasites intracelulares, mas não nas hemácias não parasitadas, as quais permaneceram negativas. Este efeito foi parcialmente revertido pela incubação com N-acetil- L-cisteína (E). A marcação foi intensa para DETC, DS e Cure, demonstrando, inequivocamente, o efeito pró-oxidante ocasionado pelas drogas, mesmo sendo a Cure. um produto natural comercializado como antioxidante.

[00187] A Figura 34 mostra a comparação entre medianas e porcentagens do 'gate' nas diferentes populações observadas por citometria de fluxo quando utilizada a sonda DHE. Através da mediana da intensidade de fluorescência de M2 determinada pela citometria de fluxo (referente à população total) com as suas respectivas porcentagens de população no 'gate', é possível observar que a Cure. leva ao aumento na intensidade de fluorescência, quando comparada à célula não tratada. Entretanto, é importante ressaltar que o número da população é reduzido. Quando combinada ao DETC, a intensidade de fluorescência permanece bastante semelhante à Cure. isolada, porém, ocorreu o aumento na população expressando intensidade de fluorescência.

[00188] A Figura 35 mostra a mediana da intensidade de fluorescência de da população M3, quando utilizada a sonda DHE, delimitada pela citometria de fluxo, com as suas respectivas porcentagens de população no 'gate'. E possível observar que a Cure. leva ao aumento na intensidade de fluorescência em comparação às células não tratadas. Entretanto, é importante ressaltar que o número da população é reduzido. Quando combinada ao DETC, a intensidade de fluorescência permanece bastante semelhante à da Cure. isolada, porém, ocorre um aumento na população expressando essa intensidade de fluorescência.

[00189] A Figura 36 mostra a mediana da intensidade de fluorescência da população M4 pela citometria de fluxo, quando utilizada a sonda DHE, com as suas respectivas porcentagens de população no 'gate'. E possível observar que a Cure. leva ao aumento na intensidade de fluorescência quando comparada à célula não tratada. Entretanto, é importante ressaltar que o número da população é reduzido. Quando combinada ao DETC, a intensidade de fluorescência permanece elevada, porém, ocorre um aumento na população expressando essa intensidade de fluorescência.

[00190] A Figura 37 mostra a mediana da intensidade de fluorescência da população M5, quando utilizada a sonda DHE, determinada por citometria de fluxo, com as suas respectivas porcentagens de população no 'gate'. E possível observar que a Cure. leva ao aumento na intensidade de fluorescência quando comparada às células não tratadas, o que também é observado quando as células foram tratadas com o DETC. Nesse caso específico, também foi observado o aumento da população com alta expressão de fluorescência em todos os tratamentos quando comparado à população controle.

EXEMPLO 13 - Citometria de fluxo com a sonda MitoSox

[00191] A partir da observação do aumento dos níveis de EROs intracelulares pela utilização da sonda DHE, que detecta ERO como o 0 ₂ ^~ , foi avaliado se esse aumento seria decorrente, ao menos em parte, ao incremento dos níveis de radicais 0 ₂ ^~ mitocondrial, tendo em vista que o DETC é um inibidor de SOD.

[00192] A Figura 38 mostra a citometria de fluxo de hemácias infectadas com Plasmodium falciparum não tratadas, incubadas com a sonda MitoSox para avaliar o perfil de estresse oxidativo pela detecção de radicais 0 ₂ ^~ mitocondrial nas células sem incubação com as drogas. É possível observar que a população M2 corresponde a 7,64% do total, e apresenta uma mediana de 80,58; mostrando assim o comportamento das células em seu estágio basal.

[00193] A Figura 39 mostra a citometria de fluxo de hemácias infectadas com P. falciparum tratadas com 10 μg/mL de DETC durante 2 horas e, posteriormente, incubadas com a sonda MitoSox. E possível observar, se comparado aos dados do controle, que houve um aumento significativo da mediana, da intensidade de fluorescência dessas células, indicando, assim, que o DETC aumenta a produção de 0 ₂ ^~ no compartimento mitocondrial dessas células.

[00194] A Figura 40 mostra a citometria de fluxo de hemácias infectadas com Plasmodium falciparum tratadas com 10 μg/mL de DETC e 10 μg/mL de Cure. durante 2 horas, e posteriormente incubadas com a sonda MitoSox. E possível observar que, em comparação aos dados do controle, houve um aumento da mediana da intensidade de fluorescência dessas células. Entretanto, quando comparado com o tratamento com o DETC, observou-se que ocorreu um declínio na intensidade de fluorescência e que, de certa forma, para o 0 ₂ ^" , a Cure. apresenta um efeito protetor, mas não suficiente para reverter ao nível do controle.

[00195] A Figura 41 mostra a citometria de fluxo de hemácias infectadas com Plasmodium falciparum tratadas com DETC a 10 μg/mL na presença de tocoferol a 10 μg/mL, incubadas com a sonda MitoSox. Pode-se observar que o tocoferol apresenta um efeito protetor para as células, retornando os níveis de 0 ₂ ^~ mitocondrial ao nível do controle.

[00196] A Figura 42 mostra a citometria de fluxo de hemácias infectadas com Plasmodium falciparum tratadas com 10 μg/mL de DETC e 10 μg/mL de Cure, na presença de tocoferol a 10 μg/mL e incubadas com a sonda MitoSox. Pode-se observar que o tocoferol apresenta um efeito protetor para as células, revertendo os níveis de 0 ₂ ^" mitocondrial abaixo do nível do controle, possivelmente uma reação conjunta com a Cure. [00197] A Figura 43 mostra a comparação das intensidades de fluorescência da sonda MitoSox com 10 μg/mL dos diversos tratamentos de eritrócitos infectados por P. falciparum. E possível observar que o tratamento com o DETC aumentou, significativamente, a intensidade de fluorescência das células, em comparação ao controle. Esse efeito foi revertido tanto pelo Tocoferol quanto pela combinação com a Cure.

EXEMPLO 14 Testes in vivo

[00198] Foi avaliada a sobrevivência de camundongos infectados por Plasmodium berghei e tratados com os compostos de interesse, isolados e em combinação.

[00199] A Figura 44 mostra a avaliação do efeito do DS nas concentrações de 5 e 25 mg/kg sobre a sobrevivência de camundongos infectados com P. berghei. Foi observado que a droga na concentração de 5 mg/kg apresentou uma sobrevida de 80% aos 25 dias e 20% no trigésimo dia (final do experimento), enquanto que, no controle negativo (DMSO), os animais pereceram antes do vigésimo dia.

[00200] A Figura 45 mostra a avaliação do efeito do DS nas concentrações de 50 e 100 mg/kg na mortalidade cumulativa de camundongos infectados com P. berghei. Observou-se que o DS, nas concentrações testadas, teve sobrevida superior ao controle negativo entre os dias 10 e 20, mas posteriormente as taxas de sobrevivência foram similares ao controle, isto é, em torno de 15%. O controle positivo com cloroquina manteve a taxa de sobrevivência de 60% ao final do experimento.

[00201] A Figura 46 mostra a avaliação da sobrevivência de camundongos infectados com P. berghei tratados com diferentes concentrações de Cure. E possível observar que, dentre as concentrações testadas, a Cure. a 25 mg/kg apresentou um melhor efeito, tanto no aumento do tempo de sobrevivência dos animais, quase revertendo ao nível do controle positivo, quanto mantendo uma taxa de sobrevida de aproximadamente 28%, enquanto que o controle negativo (DMSO) manteve uma taxa de sobrevida de aproximadamente 15%.

[00202] A Figura 47 mostra a avaliação da sobrevivência de camundongos infectados com P. berghei, tratados com diferentes concentrações de DETC, DMSO (controle negativo) e cloroquina (controle positivo). Foi possível observar que, dentre as concentrações testadas, o DETC a 100 mg/kg demonstrou-se mais eficaz, aumentando o tempo de vida dos animais e apresentando uma taxa de sobrevida de aproximadamente 45%, taxa muito próxima ao controle positivo, que apresentou aproximadamente 57% de sobrevida.

[00203] A Figura 48 mostra a avaliação da sobrevivência de camundongos infectados com P. berghei e tratados com a combinação entre DETC 100 mg/kg e Cure. 25 mg/kg, pois essas concentrações foram as que apresentaram melhores resultados quando avaliadas isoladamente. E possível observar que a combinação das drogas apresentou um incremento na sobrevivência dos animais e uma taxa de sobrevivência de, aproximadamente, 42%.

EXEMPLO 15

[00204] Foi avaliada a toxicidade sistémica pela dosagem de transaminases hepáticas no plasma de camundongos tratados com DETC e Cure, isolados e combinados por 5 dias consecutivos.

[00205] A Figura 49 mostra a avaliação da atividade plasmática de Alanina aminotransferase (ALT) e Aspartato aminotransferase (AST). Foi observado que, nos animais que foram administradas as combinações, as atividades ALT e AST se mantiveram abaixo dos controles.

[00206] A Figura 50 mostra em A dosagem de creatina cinase (CK) e em B níveis plasmáticos de ureia em camundongos tratados como supracitado. Foi observado que, nos animais que foram administradas as combinações, as dosagens não diferiram dos controles negativos. [00207] Conforme aqui já comentado, existe um consenso em promover o uso de drogas já aprovadas pelas agências regulatórias para novos usos na clínica. Entre estes fármacos, vale salientar o DS (Namazi, 2008; Chavali et al., 2012). O DS e, consequentemente o DETC, tem atividade antiparasitária contra Trypanosoma brucei e T. rhodesiense; T. cruzi; Leishmania; Giardia lamblia; Trichuris muris, Plasmodium falciparum e potencializadora da ação antimalárica de cloroquina in vivo. Entretanto, o DETC reverte o efeito antimalárico do alloxan e pode aumentar a parasitemia em animais infectados com P. berghei (Nair et al., 1982).

[00208] De forma análoga, a Cure. tem atividade antimalárica relatada (Haddad et al., 2011) e vem sendo empregada em combinação com drogas antimaláricas (Mimche et al., 2011) e, ministrada com artemeter, pode evitar as recrudescências da infecção murina por Plasmodium berghei (Vathsala et al, 2012).

[00209] Embora a Cure. seja considerada um antioxidante natural, o composto exerce atividade anú-Plasmodium associada à geração de EROs (Cui et al., 2007). Essa aparente discrepância é, presumivelmente, devida ao efeito bimodal dose-dependente da Cure. que, em baixa concentração (i.e. 20 μΜ) inibe a produção de ROS, enquanto que na concentração de 100 μΜ, o fármaco mostra-se pró-oxidante em células Hep3B (Kang et al., 2005). Entretanto a Cure. pode ser pró-oxidante mesmo em concentrações baixas, induz respostas mediadas por glutationa (Leong et al., 2012) e é um potente inibidor da glutationa transferase, enzima implicada em resistência à cloroquina, do P. falciparum (Mangoyi et al., 2010).

[00210] O efeito anti-malárico da Cure. pode ser explicado, ao menos em parte, pela indução da morte celular programada dos eritrócitos ou eritroptose (Fõller et al., 2008), induzida pela Cure. Vale salientar que o estresse oxidativo, inclusive pelo funcionamento deficiente de sistemas antioxidantes pode induzir a eritroptose (Lang et al., 2010). [00211] Além da inibição de SOD (Heikkila et al, 1978) o DETC e, consequentemente, seu precursor o DS têm a capacidade de oxidar a glutationa, promovendo o estresse oxidativo (Rahden-Staron et al, 2012).

[00212] A Cure. também é capaz de modular o metabolismo da glutationa (Heeba et al, 2012) e a depleção desta pela produção de ERO pode deflagrar o processo de apoptose (Kizhakkayil et al., 2012).

[00213] Os resultados aqui relatados indicam que a combinação de

Cure. e DETC tem um efeito pró-oxidante revelado pela produção de ERO. A lipoperoxidação induzida pelo DETC indica que essas combinações podem ocasionar significativo estresse oxidativo nos parasites. A extensa dilatação do retículo endoplasmático que delimita os núcleos dos trofozoítas pode ter sido devida ao estresse oxidativo, já que este processo aumenta os níveis de cálcio citoplasmático, podendo ser esta uma via de sinalização para diferentes vias de morte celular.

[00214] Uma vez que a Cure. inibiu a formação de hemozoína, com a mesma eficiência que a cloroquina, é possível que os anéis heme livre exerçam elevado efeito pró-oxidantes nos parasitos incubados com os fármacos combinados. A geração de heme livre pela Cure. e combinações pode ocasionar a descontinuidade da membrana do vacuolo digestivo, como relatado no tratamento de hemácias infectadas por P. falciparum e tratadas com cloroquina (Ch'ng et al., 2011), evidenciado por microscopia de fluorescência e eletrônica (não mostrado).

[00215] Vale salientar que o aumento do cálcio, sugerido pela acentuada dilatação do retículo endoplasmático que delimita os núcleos dos parasitos, pode estar relacionado à permeabilização do vacúolo digestivo, uma vez que este compartimento acumula Ca ²⁺ no protozoário.

[00216] A presente invenção é baseada na combinação de Cure. e DETC, combinação essa que atua como um medicamento antimalárico.

[00217] Embora ilustrada e descrita aqui com referência a certas representações específicas, a presente invenção não pretende estar limitada aos detalhes apresentados. Em vez disso, várias modificações podem ser feitas nos detalhes dentro do âmbito e escopo de equivalência das reivindicações e sem se afastar do espírito da invenção.

[00218] O entusiasmo referente ao potencial medicinal da Cure. e do tumérico motivaram a publicação de numerosos livros (e.g. Majeed & Badmaev 1999; McBarron, 2013; Stine, 2013; Harris, 2014; Geoffreys 2014) e artigos (e.g. Aggarwal et al., 2007a; Goel et al., 2008) que exaltam propriedades supostamente miraculosas (e.g. Mansour, 2010; Lee, 2016; Ahmed, 2014; Daniels 2014).

[00219] Nos últimos anos, relatos feitos por muitos grupos de pesquisa em diversos modelos experimentais vêm mostrando que a Cure. também pode ter atividades tóxicas ou deletérias tanto in vitro (Goodpasture & Arrighi, 1976; Holy, 2002; Bielak-Zmijewska et al., 2010; Sebastià et al., 2012) como in vivo (Giri et al., 1990; Nair et al., 2005), mas grande parte dos efeitos deletérios parece se dever a problemas metodológicos como concentração de uso e tipo de solvente empregado (Kurien et al., 2011). Tais diferenças sem condições podem explicar porque alguns dados são conflitantes. A Cure. pode ser genotóxica (Sebastià et al., 2012) ou antigenotóxica (Shukla et al., 2003; Ahmad et al., 2004); cancerígena (National Toxicology Program, 1993) e anticancerígena (e.g. Basnet & Skalko-Basnet, 2011 ; Shehzad et al., 2014; Hasima & Aggarwal, 2014; Li & Zhang, 2014; Rahmani et al., 2014). Alguns destes estudos empregaram regimes de dois anos de tratamento (López- Lázaro, 2008).

[00220] As composições farmacêuticas da invenção compreendem a mistura de Cure, DETC ou DS e excipientes farmaceuticamente aceitáveis e descritos em compêndio oficial, perfazendo medicamento de liberação imediata e/ou controlada adequado a administração por via oral e via mucosa (Rowe et al., 2009). Formas farmacêuticas adequadas para as composições da invenção, sem qualquer limitação, são: solução, xarope, suspensão, emulsão, comprimido (como exemplo, simples, revestido ou especial tais como comprimido dispersível, sublingual e multicamada), cápsula, multiparticulados (como exemplo, pó, granulado e/ou pellet) supositório, aerossol e formulações oriundas de dispersões sólidas e/ou micro ou nanoencapsulação (Aulton, 2005).

[00221] As dosagens a serem empregadas na formulação final certamente não serão aquelas empregadas em modelos murinos, em função de diferenças metabólicas que afetam drasticamente a biodisponibilidade. Assim, estamos trabalhando a hipótese de testar combinações de dose-fixa em provas de conceito empregando até 250 mg/dia de DS, que é bem tolerado em humanos (revisto em Gessner & Gessner, 1992) e usualmente empregado (Antabuse ^® ou Antietanol ^® ) em concentrações duas vezes maiores i.e. 500 mg/dia - adultos); associado a 1000 mg de Cure. diariamente, que não causam efeitos colaterais. Já foram relatados ensaios clínicos nos quais indivíduos saudáveis são avaliados recebendo até 8 g de Curc./dia (Aggarwal et al., 2007b).

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