MONTESINOS SEGUÍ, Emili (Plaça Sant Domènec, 3Edifici Les Aligues, Girona, E-17071, ES)
BADOSA ROMACHO, Esther (Plaça Sant Domènec, 3Edifici Les Aligues, Girona, E-17071, ES)
FELIU SOLEY, Lidia (Plaça Sant Domènec, 3Edifici Les Aligues, Girona, E-17071, ES)
PLANAS GRABULEDA, Marta (Plaça Sant Domènec, 3Edifici Les Aligues, Girona, E-17071, ES)
FERRE MALAGÓN, Rafael (Plaça Sant Domènec, 3Edifici Les Aligues, Girona, E-17071, ES)
BARDAJÍ RODRÍGUEZ, Eduard (Plaça Sant Domènec, 3Edifici Les Aligues, Girona, E-17071, ES)
MONTESINOS SEGUÍ, Emili (Plaça Sant Domènec, 3Edifici Les Aligues, Girona, E-17071, ES)
BADOSA ROMACHO, Esther (Plaça Sant Domènec, 3Edifici Les Aligues, Girona, E-17071, ES)
FELIU SOLEY, Lidia (Plaça Sant Domènec, 3Edifici Les Aligues, Girona, E-17071, ES)
PLANAS GRABULEDA, Marta (Plaça Sant Domènec, 3Edifici Les Aligues, Girona, E-17071, ES)
FERRE MALAGÓN, Rafael (Plaça Sant Domènec, 3Edifici Les Aligues, Girona, E-17071, ES)
REIVINDICACIONES
1.- Péptidos lineales caracterizados porque responden a Ia fórmula general (I):
X^Xz-Lys-Leu-Phe-Lys-Lys-lle-Leu-Lys-Xs-Leu-NHa (I) en donde
Xi es hidrógeno, acetilo, p-toluensulfonilo, bencilo, o benzoílo, X 2 es Lys, Tyr, Leu, Phe, o Trp, y X 3 es Lys, Tyr, Val, Phe, o Trp, con Ia condición de que el péptido en donde X 1 es hidrógeno, X 2 es Trp, y X 3 es Val, se excluye expresamente.
2.- Péptidos según Ia reivindicación 1 caracterizados porque están definidos por las secuencias SEQ-ID-NO: 1 a SEQJD-NO: 14, y SEQ_ID_NO: 16 a SEQ_!D_NO: 25, y porque tienen el aminoácido del extremo C-terminal en forma de grupo carboxamida.
3.- Péptidos según Ia reivindicación 2 caracterizados porque están definidos por las secuencias SEQ_ID_NO: 6 a SEQ_ID_NO: 11 , SEQ_ID_NO: 13, SEQ_ID_NO: 16, SEQ_ID_NO: 18 a SEQ_ID_NO: 22, y SEQJD_NO: 25, y porque tienen el aminoácido del extremo C-terminal en forma de grupo carboxamida.
4.- Péptidos según Ia reivindicación 3 caracterizados porque están definidos por las secuencias SEQ_ID_NO: 6 y SEQ_ID_NO: 16, y porque tienen el ami- noácido del extremo C-terminal en forma de grupo carboxamida.
5. -Péptidos según Ia reivindicación 1 caracterizados porque están definidos por las secuencias SEQ_ID_NO: 1 a SEQ_ID_NO: 25, y porque tienen el aminoácido del extremo N-terminal funcionalizado con el grupo acetilo, y el ami- noácido del extremo C-terminal en forma de grupo carboxamida.
6.- Péptido según Ia reivindicación 5 caracterizado porque está definido por Ia secuencia SEQ_ID_NO: 16, y porque tiene el aminoácido del extremo N- terminal funcionalizado con el grupo acetilo, y el aminoácido del extremo C- terminal en forma de grupo carboxamida.
7.- Péptidos según Ia reivindicación 1 caracterizados porque están definidos por las secuencias SEQ_ID_NO: 1 a SEQ_ID_NO: 25, y porque tienen el aminoácido del extremo N-terminal funcionalizado con el grupo p-toluensulfonilo, y el aminoácido del extremo C-terminal en forma de grupo carboxamida.
8.- Péptidos según Ia reivindicación 7 caracterizados porque están definidos por las secuencias SEQ_ID_NO: 1 , 6, 11 y 16, y porque tienen el aminoácido del extremo N-terminal funcionalizado con el grupo p-toluensulfonilo, y el aminoácido del extremo C-terminal en forma de grupo carboxamida.
9.- Péptido según Ia reivindicación 8 caracterizado porque está definido por Ia secuencia SEQ_ID_NO: 1 , y porque tiene el aminoácido del extremo N- terminal funcionalizado con el grupo p-toluensulfonilo, y el aminoácido del extremo C-terminal en forma de grupo carboxamida.
10.- Péptidos según Ia reivindicación 1 caracterizados porque están definidos por las secuencias SEQ_ID_NO: 1 a SEQ_ID_NO: 25, y porque tienen el aminoácido del extremo N-terminal funcionalizado con el grupo bencilo, y el aminoácido del extremo C-terminal en forma de grupo carboxamida.
11.- Péptido según Ia reivindicación 10 caracterizado porque está definido por Ia secuencia SEQ_ID_NO: 15, y porque tiene el aminoácido del extremo N- terminal funcionalizado con el grupo bencilo, y el aminoácido del extremo C- terminal en forma de grupo carboxamida.
12.- Péptidos según Ia reivindicación 1 caracterizados porque están definidos por las secuencias SEQ_ID_NO: 1 a SEQ_ID_NO: 25, y porque tienen el aminoácido del extremo N-terminal funcionalizado con el grupo benzoílo, y el aminoácido del extremo C-terminal en forma de grupo carboxamida.
13.- Péptidos según Ia reivindicación 12 caracterizados porque están definidos por las secuencias SEQ_ID_NO: 1 , y SEQ_ID_NO: 11 , y porque tienen el aminoácido del extremo N-terminal funcionalizado con el grupo benzoílo, y el aminoácido del extremo C-terminal en forma de grupo carboxamida.
14.- Péptido según Ia reivindicación 13 caracterizado porque está definido por Ia secuencia SEQ_ID_NO: 1 , y porque tiene el aminoácido del extremo N- terminal funcionalizado con el grupo benzoílo, y el aminoácido del extremo C- terminal en forma de grupo carboxamida.
15.- Utilización de los péptidos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 para Ia preparación de una composición antimicrobiana.
16.- Utilización según Ia reivindicación 15 como agentes antimicrobianos frente a bacterias patógenas de las plantas.
17.- Utilización según Ia reivindicación 16 caracterizada porque las bacterias patógenas de las plantas se seleccionan entre el grupo formado por Erwinia amylovora, Xanthomonas vesicatoria, y Pseudomonas syríngae.
18.- Utilización según las reivindicaciones 16 o 17 caracterizada porque las plantas se seleccionan entre el grupo formado por árboles frutales, plantas hortícolas, y plantas ornamentales.
19.- Composición fitosanitaria que comprende un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, y un agente auxiliar.
20.- Composición según Ia reivindicación 19 caracterizada porque el péptido se encuentra a una concentración comprendida entre 0,01 y 0,5 g/l.
21.- Composición según las reivindicaciones 19 o 20 caracterizada porque el agente auxiliar se selecciona entre el grupo formado por disolventes, tensioac- tivos, agentes tamponantes, filtros de Ia radiación ultravioleta y/o sus mezclas.
22.- Composición según Ia reivindicación 21 caracterizada porque el disolvente es agua.
23.- Método para prevenir y tratar infecciones y enfermedades de plantas causadas por bacterias que comprende poner en contacto Ia planta con una com- posición fitosanitaria según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 22.
24.- Método según Ia reivindicación 23 caracterizado porque las bacterias se seleccionan entre el grupo formado por Erwinia amylovora, Xanthomonas vesicatoria, y Pseudomonas syríngae.
25.- Método según las reivindicaciones 23 o 24 caracterizado porque las plantas se seleccionan entre el grupo formado por árboles frutales, plantas hortícolas, y plantas ornamentales.
26.- Método según cualquiera de las reivindicaciones 23 a 25 caracterizado porque Ia composición se pone en contacto con las partes de las plantas seleccionadas entre el grupo formado por semillas, raíces, tallos, hojas, o frutos, o con el suelo o cualquier medio de crecimiento que rodee las raíces de las plantas.
27.- Método según cualquiera de las reivindicaciones 23 a 26 caracterizado porque la composición fitosanitaria se pone en contacto con Ia planta por pulverización, inmersión o riego. |
PEPTIDOS LINEALES ANTIMICROBIANOS
Campo de Ia técnica
La presente invención se refiere a péptidos lineales que presentan propiedades antimicrobianas, que son particularmente eficaces frente a bacterias patógenas de las. plantas, y se pueden emplear en composiciones fitosanitarias.
Estado de Ia técnica anterior
Las bacterias fitopatógenas son responsables de pérdidas de gran importancia económica en producción vegetal. Entre ellas se destacan, por ejemplo, las bacteriosis causadas por las bacterias Erwinia amylovora, Pseudomonas syringae, y Xanthomonas vesicatoria.
Actualmente en Europa solamente están autorizados algunos productos para Ia protección de las plantas contra enfermedades bacterianas basados principalmente en derivados cúpricos con una eficacia de control in- suficiente.
Antibióticos, como kasugamicina o estreptomicina, que hasta hace pocos años estaban autorizados en algunos países, en Ia actualidad no están autorizados en Europa. Los antibióticos estreptomicina y tetraciclina sí que están autorizados en países como los EE.UU., pero en numerosos casos se ha puesto de manifiesto Ia aparición de cepas resistentes del patógeno que hacen su uso inefectivo, o que pueden suponer un riesgo de transferencia de dicha resistencia a otras bacterias patógenas. En el caso de las micosis causadas por hongos fitopatógenos, si bien existen materias activas disponibles, se requieren continuamente nuevos fungicidas, en parte por Ia aparición de resistencias con una cierta frecuencia.
Además, muchos de los compuestos antibacterianos conocidos más efectivos presentan una persistencia en el medio ambiente que no es deseable.
En los últimos años se ha intensificado Ia preparación de nuevos tipos de antibióticos que puedan evitar Ia resistencia de las bacterias. Entre ellos destacan compuestos aislados de Ia propia naturaleza, por ejemplo los
péptidos, que están presentes en plantas y animales, y algunos de los cuales presentan propiedades antimicrobianas.
Las cecropinas son péptidos antimicrobianos presentes en Ia hemolinfa de Ia mariposa Hyaiophora cecropia como respuesta a una infección bacteriana. En particular Ia cecropina A es un péptido lineal formado por 37 aminoácidos, que presenta una potente actividad lítica contra bacterias Gram- positivas y Gram-negativas. Sin embargo, existen reticencias para su empleo en aplicaciones fitosanitarias dado su elevado coste de producción, al tener una longitud considerable, y su baja estabilidad frente a Ia degradación por proteasas.
En AIi eí al, Mol.Plant-Microbe Interact., 2000, 13, 847-859 se describe un péptido activo frente a algunas bacterias patógenas de las plantas como son Erwinia carotovora subsp. carotovora, y Erwinia carotovora subsp. atroseptica. Se trata de un undecapéptido preparado por primera vez por Ca- vallarin eí al, Mol.Plant-Microbe Interact. , 1998, 11 , 218-227, que está formado por Ia secuencia de aminoácidos Trp-Lys-Leu-Phe-Lys-Lys-lle-Leu-Lys-Val- Leu, y que el aminoácido del extremo C-terminal presenta un grupo carboxa- mida. Dicho péptido es un péptido híbrido formado por fragmentos de los péptidos de origen natural cecropina A y melitina. Concretamente está constituido por los aminoácidos 2-8 de cecropina A y 6-9 de melitina.
No se ha descrito Ia aplicación de dicho undecapéptido frente a otras bacterias fitopatógenas como Erwinia amylovora, Xanthomonas vesicatoria, y Pseudomonas syríngae, que son particularmente relevantes porque afectan plantas que son de gran importancia económica, y contra las que hasta el momento los métodos utilizados para combatirlas son poco efectivos.
Por ello, subsiste Ia necesidad de disponer de nuevos compuestos antimicrobianos que presenten una buena eficacia frente a bacterias patógenas de las plantas, en particular, frente a las bacterias Erwinia amylovora, Xanthomonas vesicatoria, o Pseudomonas syríngae.
Objeto de Ia invención
Los autores de Ia presente invención han desarrollado nuevos péptidos que resultan de fácil preparación y que presentan una elevada efica- cia para inhibir el crecimiento de bacterias patógenas de las plantas, además
presentan baja citotoxicidad en células eucariotas, y una buena estabilidad a Ia degradación por proteasas.
El objeto de Ia presente invención es proporcionar péptidos lineales que presentan propiedades antimicrobianas. Forma también parte del objeto de Ia invención Ia utilización de dichos péptidos como agentes antimicrobianos.
También es objeto de Ia invención una composición fitosanitaria que comprende los péptidos de Ia invención y un agente auxiliar.
Otro objeto de Ia invención es un método para prevenir y tratar infecciones y enfermedades de las plantas causadas por bacterias.
Descripción de Ia invención
Péptidos
El objeto de Ia presente invención es proporcionar péptidos lineales que responden a Ia fórmula general (i):
X 1 -X 2 -LyS-LeU-PlIe-LyS-LyS-IIe-LeU-LyS-X 3 -LeU-NH 2 (I) en donde X 1 es hidrógeno, acetilo, p-toluensulfonílo, bencilo, o benzoílo,
X 2 es Lys, Tyr, Leu, Phe, o Trp, y X 3 es Lys, Tyr, Val, Phe, o Trp, con Ia condición de que el péptido en donde X 1 es hidrógeno, X 2 es Trp, y X 3 es Val se excluye expresamente. En Ia fórmula general, cuando X 1 es hidrógeno se representa como H, el grupo acetilo se representa como Ac, el grupo p-toluensulfonilo como Ts, el grupo bencilo como Bn, y el grupo benzoílo como Bz.
Las abreviaturas empleadas para los aminoácidos en esta descripción siguen Ia normativa de Ia Comisión para Ia Nomenclatura Bioquímica de Ia IUPAC-IUB, según se describe en el libro Biochemical Nomenclature and Related Documents, 2nd edition, Portland Press, 1992, Londres [ISBN 1- 85578-005-4]. De esta forma Leu es L-leucina, Lys significa L-lisina, Me es L- isoleucina, Phe es L-fenilalanina, Tyr es L-tirosina, Trp es L-triptófano, y Val es L-valina. De acuerdo con dicha normativa los péptidos se representan con las abreviaturas de los aminoácidos que los componen unidos por guiones,
que representan los enlaces peptídicos. Así por ejemplo el péptido denominado glicilglicilglicina se simboliza como GIy-GIy-GIy. Esto requiere Ia modificación del símbolo GIy para Ia glicina, H 2 N-CH 2 -COOH, de tres formas distintas: (i) "GIy-" significa H 2 N-CH 2 -CO- (ii) "-GIy-" significa HN-CH 2 -CO-, y (iii) "-GIy" significa HN-CH 2 -COOH
Así, cuando el guión se coloca a Ia derecha del símbolo, caso (i), indica que se ha eliminado el grupo OH del grupo carboxílico del aminoácido, y cuando se coloca a Ia izquierda del símbolo, caso (iii), indica que se ha elimi- nado un átomo de hidrógeno del grupo amino del aminoácido; en el caso (ii) ambas modificaciones se aplican a un mismo símbolo.
El aminoácido GIy- constituye el extremo N-terminal del péptido, y el aminoácido -GIy constituye el extremo C-terminal del péptido.
Como se puede apreciar a partir de Ia fórmula general (I), todos los péptidos de Ia invención tienen el aminoácido Leu del extremo C-terminal en forma de carboxamida, representado como -LeU-NH 2 .
El aminoácido que constituye el extremo N-terminal de los péptidos de Ia invención puede mantener su grupo amino sin derivatizar, o bien el mismo puede estar funcionalizado con un grupo acetilo, p-toluensulfonilo, ben- zoilo o bencilo, tal como se expresa en Ia fórmula general (I).
En el caso de que dicho grupo amino no esté derivatizado, es decir, cuando X 1 es hidrógeno, en esta descripción se considera que el símbolo H-X- es equivalente al símbolo X-, que es Ia forma adoptada por Ia IUPAC en el caso (i) ya mencionado. Las estructuras de los péptidos de Ia invención se definen de acuerdo con Ia fórmula general (I).
Otra forma de definir Ia estructura de los péptidos de Ia invención consiste en emplear las secuencias de aminoácidos SEQ_ID_NO: 1 a SEQ_ID_NO: 25, y especificando además Ia funcionalización que presentan en el extremo N-terminal y en el extremo C-terminal del péptido. Como ya se ha indicado, todos los péptidos de Ia invención tienen el aminoácido que forma el extremo C-terminal en forma de carboxamida.
Las mencionadas secuencias presentan los aminoácidos que se muestran en Ia Tabla I:
TABLA I
La secuencia denominada SEQ_ID_N0:15 corresponde a Ia secuencia del péptido descrito por Cavallarin et al, Mol.Plant-Microbe Interact., 1998, 11 , 218-227, cuyo derivado carboxamida en el extremo C-terminal de Ia secuencia se encuentra expresamente excluido de esta invención.
Entre los péptidos de Ia invención que resultan ser preferidos, se encuentran los péptidos definidos por las secuencias SEQ-ID_NO: 1 a SEQ_ID_NO: 14, y SEQ_ID_NO: 16 a SEQ_ID_NO: 25, y que tienen el aminoácido del extremo C-terminal en forma de grupo carboxamida. Dentro de este grupo son especialmente preferidos los péptidos definidos por las secuencias SEQ_ID_NO: 6 a SEQ_ID_NO: 11 , SEQ_ID_NO: 13, SEQ_ID_NO: 16, SEQ_ID_NO: 18 a SEQ_ID_NO: 22, y SEQ_ID_NO: 25, y que tienen el aminoácido del extremo C-terminal en forma de grupo carboxamida. Particularmente preferidos son los péptidos definidos por las secuencias SEQ_ID_NO: 6 y SEQ_ID_NO: 16, y que tienen el aminoácido del extremo C-terminai en forma de grupo carboxamida. El último de estos dos péptidos preferidos tiene Ia estructura: H-Lys-Lys-Leu-Phe-Lys-Lys-lle-Leu- Lys-Phe-Leu-NH 2 , correspondiente a Ia fórmula general (I) donde X 1 es H, X 2 es Lys, y X 3 es Phe.
También resultan ser preferidos los péptidos definidos por las secuencias SEQ_ID_NO: 1 a SEQ_ID_NO: 25, y que tienen el aminoácido del extremo N-terminal funcionalizado con el grupo acetilo, y el aminoácido del extremo C-terminal en forma de grupo carboxamida. Dentro de este grupo, resulta especialmente preferido el péptido definido por Ia secuencia SEQ_ID_NO: 16, que tiene el aminoácido del extremo N-terminal funcionalizado con el grupo acetilo, y el aminoácido del extremo C-terminal en forma de grupo carboxamida. Dicho péptido tiene Ia estructura Ac-Lys-Lys-Leu-Phe-Lys-Lys-lle-Leu-Lys-Phe-Leu-NH 2 , correspondiente a Ia fórmula general (I) donde Xi es acetilo (Ac), X 2 es Lys, y X 3 es Phe.
También son preferidos los péptidos definidos por las secuencias SEQ_ID_NO: 1 a SEQ_ID_NO: 25, y que tienen el aminoácido del extremo N-
terminal funcionalizado con el grupo p-toluensulfonilo, y el aminoácido del extremo C-terminal en forma de grupo carboxamída.
Dentro de este grupo son particularmente preferidos los péptidos definidos por las secuencias SEQ_ID_NO: 1 , 6, 11 y 16, y que tienen el ami- noácido del extremo N-terminal funcionalizado con el grupo p-toluensulfonilo, y el aminoácido del extremo C-terminal en forma de grupo carboxamida.
Resulta más preferido el péptido definido por Ia secuencia SEQ_ID_NO: 1 , y que tiene el aminoácido del extremo N-terminal funcionalizado con el grupo p-toluensulfonilo, y el aminoácido del extremo C-terminal en forma de grupo carboxamida. Dicho péptido tiene Ia estructura Ts-Lys-Lys- Leu-Phe-Lys-Lys~lle~Leu-l_ys-Lys-Leu-NH 2 , correspondiente a Ia fórmula general (I) donde X 1 es p-toluensulfonilo (Ts), X 2 es Lys, y X 3 es Lys.
También son preferidos los péptidos definidos por las secuencias de aminoácidos SEQ_ID_NO: 1 a SEQ_ID_NO: 25, y que tienen el aminoácido del extremo N-terminal funcionalizado con el grupo bencilo, y el aminoácido del extremo C-terminal en forma de grupo carboxamida.
Dentro de este grupo es especialmente preferido el péptido definido por Ia secuencia SEQ_ID_NO: 15, y que tiene el aminoácido del extremo N-terminal funcionalizado con el grupo bencilo, y el aminoácido del extremo C- terminal en forma de grupo carboxamida. Dicho péptido tiene Ia estructura Bn- Trp-Lys-Leu-Phe-Lys-Lys-lle-Leu-Lys-Val-Leu-NH 2 , correspondiente a Ia fórmula general (I) donde X 1 es bencilo (Bn), X 2 es Trp, y X 3 es Val.
También son preferidos los péptidos definidos por las secuencias de aminoácidos SEQ_ID_NO: 1 a SEQ_ID_NO: 25, y que tienen el aminoácido del extremo N-terminal funcionalizado con el grupo benzoílo, y el aminoácido del extremo C-terminal en forma de grupo carboxamida.
Dentro de este grupo, son especialmente preferidos los péptidos definidos por las secuencias SEQ_ID_NO: 1 , y SEQJDJMO: 1 1 , y que tienen el aminoácido del extremo N-terminal funcionalizado con el grupo benzoílo, y el aminoácido del extremo C-terminal en forma de grupo carboxamida. Resulta más preferido el primero de dichos péptidos que tiene Ia estructura Bz-Lys- Lys-Leu-Phe-Lys-Lys-lle-Leu-Lys-Lys-Leu-NH 2 , correspondiente a Ia fórmula general (I) donde X 1 es benzoílo (Bz), X 2 es Lys, y X 3 es Lys.
Los péptidos descritos en Ia invención están formados por 11 aminoácidos que los hace apropiados para ser preparados empleando los pro-
cedimientos habituales de síntesis de péptidos en fase sólida, descritos por R. B. Merrifield, J.Am.Chem.Soc, 1963, 85, 2149-2154.
Entre ellos se puede mencionar el que emplea como soporte sólido Ia resina 4-metilbencidrilamina (MBHA) funcionalizada con grupos amino. Sobre dicho soporte sólido se llevan a cabo las reacciones sucesivas de acoplamiento entre los diferentes aminoácidos que integran el péptido.
Dicho procedimiento es bien conocido por el experto en Ia materia y se encuentra descrito, por ejemplo, en S.A.Kates, F.AIbericio Eds., SoMd- Phase Synthesis. A practical guide, Marcel Dekker, New York, 2000 [ISBN: 0- 8247-0359-6], o en K. Burguess Eds., Solid-Phase Organic Synthesis, Wiley, John & Sons, New York, 1999 [ISBN: 0471318256].
Cuando se emplea Ia resina MBHA como soporte sólido, habi- tualmente se incorpora a dicha resina un espaciador bifuncional sensible al medio ácido, que permite el desanclaje en condiciones suaves del péptido una vez sintetizado.
Por ejemplo un espaciador bifuncional apropiado es el Fmoc- Rink-Linker (número CAS: 145469-56-3) comercializado por Ia empresa Senn Chemicals (Suiza).
Dicho espaciador, una vez se ha unido a través de su grupo car- boxílico al grupo amino de Ia resina MBHA, y se ha eliminado el grupo protector Fmoc, presenta un grupo amino libre que permite el anclaje de un aminoácido que tenga un grupo carboxílico libre.
En el mercado se puede adquirir Ia resina Fmoc-Rink-MBHA en Ia empresa Senn Chemicals, que ya tiene incorporado el espaciador mencionado. Un procedimiento para Ia preparación de los péptidos de Ia invención puede ser por ejemplo el que se describe a continuación.
En dicho procedimiento se utiliza Ia química del grupo Fmoc (9- fluorenilmetoxicarbonilo) como protector del grupo α-amino de los aminoácidos que se emplean para preparar los péptidos de Ia invención. Para Ia protección de Ia cadena lateral de Ia lisina (Lys) y del trip- tófano (Trp) se ha empleado el grupo ferc-butiloxicarbonilo (Boc). Para Ia protección de Ia cadena lateral de Ia tirosina (Tyr) se ha empleado el grupo tere- butilo (t-Bu).
En Ia primera etapa se procede a Ia eliminación del grupo protec- tor Fmoc, presente en el grupo amino del espaciador bifuncional. A continua-
ción se procede al anclaje del aminoácido leucina, que también tiene el grupo α-amino protegido por el grupo Fmoc.
Antes de proceder al nuevo acoplamiento se elimina el grupo protector Fmoc de Ia leucina anclada en Ia resina. El ciclo de acoplamiento-desprotección se repite hasta completar
Ia estructura del péptido.
La incorporación de los dos últimos aminoácidos del péptido se realiza habitualmente mediante 2 o 3 acoplamientos sucesivos con el fin de completar Ia reacción de acoplamiento del aminoácido con el péptido anclado en Ia resina.
La escisión del péptido del soporte sólido se realiza en condiciones acidas, al mismo tiempo que se eliminan los grupos protectores de las cadenas laterales de los aminoácidos que forman el péptido.
Tras un proceso convencional de aislamiento, los péptidos de Ia invención se obtienen con una buena pureza, habitualmente superior al 90%, determinada por HPLC, en forma de sólidos pulverulentos, y se caracterizan por espectrometría de masas (ESI-MS).
Sorprendentemente se ha comprobado que los péptidos de Ia invención presentan una actividad antimicrobiana, que es particularmente efecti- va frente a microorganismos patógenos de las plantas como son las bacterias Erwinia amylovora, Xanthomonas vesicatoria, y Pseudomonas syringae.
Forma parte del objeto de Ia invención Ia utilización de los péptidos de Ia invención para Ia preparación de una composición antimicrobiana.
Preferiblemente los péptidos de Ia invención se utilizan como agentes antimicrobianos frente a bacterias patógenas de las plantas.
Preferiblemente las bacterias fitopatógenas se seleccionan entre el grupo formado por Erwinia amylovora, Xanthomonas vesicatoria, y Pseudomonas syringae.
Entre los péptidos de Ia invención que resultan ser preferidos pa- ra ser utilizados como agentes antimicrobianos frente a bacterias patógenas de las plantas, se encuentran los péptidos preferidos mencionados anteriormente en este mismo apartado.
Las bacterias mencionadas resultan ser indicadores apropiados para determinar Ia actividad antimicrobiana de compuestos que son suscepti- bles de ser empleados para combatir infecciones y enfermedades causadas por bacterias en plantas.
Erwinia amylovora es una bacteria Gram negativa que causa Ia enfermedad conocida como fuego bacteriano que afecta a las plantas de Ia familia de las rosáceas, entre las que se encuentran árboles frutales de gran importancia económica como son el manzano y el peral, y plantas ornamenta- les como el serbal, el espino, y el mostajo. En Europa está catalogada como una bacteria de cuarentena en agricultura. E! fuego bacteriano puede afectar a prácticamente todos los órganos de Ia planta y con frecuencia implica Ia muerte de los árboles o arbustos enfermos. Actualmente no hay métodos efectivos para el control del fuego bacteriano y es necesario combinar distintas medidas encaminadas a eliminar o reducir el inoculo.
Xanthomonas vesicatoria es una bacteria Gram negativa que provoca Ia enfermedad denominada mancha bacteriana en plantas de Ia familia de las solanáceas que tienen una gran importancia económica como son el tomate y el pimiento. Esta enfermedad afecta a hojas, tallos y frutos provocando su marchitez o muerte.
Pseudomonas syringae es una bacteria Gram negativa que causa un gran número de enfermedades denominadas necrosis bacterianas en plantas de cultivos hortícolas y leñosos como frutales. La patogenicidad de P. syringae reside en muchos casos en su actividad nucleadora del hielo (INA+) que potencia los daños por helada, y Ia producción de diversas fitotoxinas como las siringomicinas.
Preferiblemente las plantas que se pueden tratar con los péptidos de Ia invención se seleccionan entre el grupo formado por árboles frutales, plantas hortícolas, y plantas ornamentales. Entre los árboles frutales se pueden mencionar los de pepita
(manzano, peral), y hueso (melocotonero, albaricoquero, ciruelo, cerezo) y el platanero.
Entre las plantas hortícolas se encuentran las solanáceas (tomate, pimiento, patata) y cucurbitáceas (melón, sandía). Ejemplos de plantas ornamentales son serbal, clavel, espino al- bar y mostajo.
Composiciones fitosanitarias
También forma parte del objeto de Ia invención una composición fitosanitaria que comprende
- un péptido lineal que responde a Ia fórmula general (I):
Xi-X 2 -Lys-Leu-Phe-Lys-Lys-lle-Leu-Lys-X3-Leu-NH 2 (I) en donde
Xi es hidrógeno, acetilo, p-toluensulfonilo, bencilo, o ben- zoilo,
X 2 es Lys, Tyr, Leu, Phe, o Trp, y X 3 es Lys, Tyr, Val, Phe, o Trp, con Ia condición de que el péptido en donde Xi es hidrógeno, X 2 es Trp, y X 3 es Val se excluye expresamente, y - un agente auxiliar.
Entre los péptidos de Ia invención que resultan ser preferidos para formar parte de dichas composiciones fitosanitarias, se encuentran los péptidos mencionados como preferidos en el apartado anterior denominado Péptidos. Las composiciones fitosanitarias de Ia invención presentan buenas propiedades antimicrobianas frente a bacterias patógenas de las plantas.
Habituaimente, en las composiciones antimicrobianas se combinan varios principios activos para obtener una mayor eficacia o un espectro más amplio de actuación. En este caso, las composiciones fitosanitarias de Ia invención también pueden comprender otros agentes antibacterianos para conseguir mayor eficacia antimicrobiana, como por ejemplo Ia combinación de varios péptidos de Ia invención, o su combinación con otras materias activas distintas.
Los péptidos de Ia invención también se pueden combinar con agentes antifúngicos, y así desplegar una acción antimicrobiana más amplia.
La cantidad de péptido que forma parte de Ia composición fitosa- nitaria puede ser variable en función de factores tales como el tipo de planta, Ia concentración de las bacterias patógenas en Ia planta, Ia extensión de Ia enfermedad, etc. La concentración efectiva del péptido se puede determinar y ajustar fácilmente mediante métodos de rutina bien conocidos por el experto en Ia materia. Habituaimente Ia concentración efectiva del péptido se encuentra comprendida entre 0,01 y 0,5 g/l.
El agente auxiliar que acompaña los péptidos de Ia invención en dichas composiciones fitosanitarias puede tener varias funciones, como por ejemplo, facilitar Ia dosificación del péptido, proporcionar un producto fácil-
mente manipulable, mejorar el mojado de las plantas con Ia composición fito- sanitaria.
Dicho agente auxiliar puede ser seleccionado entre el grupo formado por: disolventes, diluyentes, cargas inertes, agentes tensioactivos humectantes, agentes tamponantes, agentes dispersantes, agentes antiapel- mazantes, lubricantes, filtros de Ia radiación ultravioleta, y/o mezclas de los mismos.
Preferiblemente el agente auxiliar se selecciona entre el grupo formado por disolventes, tensioactivos, agentes tamponantes, filtros de Ia ra- diación ultravioleta y/o sus mezclas.
Más preferiblemente el disolvente es agua.
Las composiciones pueden presentarse en forma líquida o en forma sólida. Por ejemplo, en el caso de formulaciones líquidas, Ia composición de Ia invención puede presentarse en forma de una composición diluida lista para ser empleada, o bien en forma de una composición concentrada, que requiere su dilución antes de ser usada, habitualmente con agua.
En el caso de composiciones líquidas acuosas, Ia presencia de agentes tensioactivos humectantes facilita el mojado de las plantas cuando se pulverizan con dicha composición. Una ventaja de los péptidos de Ia invención es que se pueden disolver en agua con facilidad, y se pueden formular generalmente como disoluciones acuosas sin necesidad de emplear disolventes orgánicos adicionales.
Las composiciones en forma sólida pueden ser en forma de granulos, o polvos, en las que los péptidos de Ia invención se mezclan con cargas inertes finamente divididas como, por ejemplo, caolín, tierra de diatomeas, dolomita, carbonato calcico, o talco. También pueden presentarse en forma de polvos o granulos dispersables, que comprenden un agente humectante para facilitar Ia dispersión de los mismos en el líquido.
También forma parte del objeto de Ia invención un método para prevenir y tratar infecciones y enfermedades de plantas causadas por bacterias que comprende poner en contacto Ia planta con una composición fitosani- taria que incluye los péptidos de Ia invención.
En el método de Ia invención Ia composición fitosanitaria se puede aplicar de forma preventiva a las plantas para evitar Ia aparición de las in- fecciones y enfermedades causadas por bacterias. El tratamiento preventivo
tiene su base en que los péptidos de Ia invención inhiben el crecimiento de bacterias patógenas de las plantas.
En el método de Ia invención, Ia composición fitosanitaria también se puede emplear para tratar dichas infecciones y enfermedades una vez se ha detectado su presencia en las plantas, ya que los péptidos de Ia invención inhiben el crecimiento de las bacterias causantes de dichas infecciones y enfermedades.
En esta descripción el término infección se refiere a Ia invasión y destrucción de un órgano, por ejemplo, hojas, flores, o frutos, por parte de los microorganismos patógenos. Por tanto, se trata de un proceso localizado. En cambio, el término enfermedad se refiere a un proceso que afecta a Ia planta, dando lugar a síntomas.
Preferiblemente el método de Ia invención se emplea para prevenir y tratar infecciones y enfermedades provocadas por bacterias patógenas de las plantas seleccionadas entre el grupo formado por Erwinia amylovora, Xanthomonas vesicatoria, y Pseudomonas syringae.
Preferiblemente las plantas que se pueden tratar con los péptidos de Ia invención se seleccionan entre el grupo formado por árboles frutales, plantas hortícolas, y plantas ornamentales. En el método de Ia invención, Ia composición se puede poner en contacto con las partes de las plantas seleccionadas entre el grupo formado por semillas, raíces, tallos, hojas, o frutos, o con el suelo o cualquier medio de crecimiento que rodee las raíces de las plantas.
En el método de Ia invención, la composición fitosanitaria se puede poner en contacto con Ia planta por cualquier técnica convencional, entre las que destacan, Ia pulverización, Ia inmersión o el riego.
Por ejemplo se puede preparar una disolución acuosa de los péptidos de Ia invención y proceder a Ia pulverización de las partes de Ia planta afectadas o susceptibles de ser afectadas. Si se trata de los frutos de un árbol frutal, por ejemplo, también se puede realizar el tratamiento de los mismos por pulverización o por inmersión antes de su cosecha o en post-cosecha.
El tratamiento de las raíces puede llevarse a cabo por ejemplo empleando una composición sólida en Ia que los péptidos se encuentran dispersos en una carga inerte, o por pulverización con Ia mencionada disolución acuosa, o mediante su aplicación por riego.
Ensayos biológicos
La actividad antimicrobiana de los péptidos de Ia invención frente a bacterias patógenas para plantas se ha evaluado mediante Ia determinación de Ia concentración de péptido mínima necesaria para inhibir el crecimiento de los microorganismos. Habitualmente dicha concentración se denomina concentración inhibitoria mínima (CIM).
Este tipo de ensayos es habitual en microbiología y es bien conocido por el experto en Ia materia. Una descripción de Ia metodología empleada se encuentra por ejemplo en M.J.Pelczar Jr, E.C.S.Chan, N.R.Krieg, Microbio- logy: Concepts and Applications. New York: McGraw-Hill, 1997.
Para evaluar dicho efecto antimicrobiano de los péptidos de Ia invención se emplearon las siguientes cepas de bacterias patógenas: Erwinia amylovora PMV6076 (INRA, Angers, Francia), Xanthomonas vesicatoria 2133- 2 (IVIA, Valencia, España), y Pseudomonas syringae pv. syringae EPS94 (IN- TEA, Universitat de Girona, España).
Se ha comprobado que las composiciones que comprenden los péptidos de Ia invención disueltos en agua a concentraciones comprendidas entre 2,5 y 7,5 μM son efectivas para inhibir el crecimiento de bacterias como Erwinia amylovora, Xanthomonas vesicatoria, y/o Pseudomonas syringae.
Estos resultados demuestran Ia eficacia de Ia actividad antimicrobiana de los péptidos de Ia invención, ya que en Avrahami et al, Biochemis- try, 2001 , 40, 12591-12603, se describe que una concentración inhibitoria mínima inferior a 50 μM es considerada como significativa. Los péptidos de Ia invención son más efectivos frente a dichas bacterias que el péptido descrito por Cavallarin et al, definido por Ia secuencia SEQ_ID_NO: 15 y que tiene el extremo C-terminal en forma de grupo carboxa- mida, ya que este péptido presenta unas concentraciones inhibitorias mínimas superiores a 7,5 μM, cuando se ensaya frente a las bacterias Erwinia amylovo- ra, Xanthomonas vesicatoria, y Pseudomonas syringae.
La actividad hemolítica de los péptidos es un indicador de Ia toxicidad en células eucariotas, y una característica que generalmente se determina para aquellos compuestos que pueden llegar a entrar en contacto con el cuerpo humano. Este sería el caso si frutas u hortalizas tratadas con los pépti- dos de Ia invención contuvieran restos de los mismos y fuesen consumidos por
las personas, o al ser manipulados por operarios durante su aplicación o preparación.
La mencionada actividad hemolítica se ha evaluado mediante Ia determinación de Ia liberación de hemoglobina que se produce al poner en contacto una solución de dichos péptidos en tampón de TRIS con suspensiones de eritrocitos al 5% en volumen/volumen procedentes de sangre humana fresca. El resultado de dicha determinación se expresa como el porcentaje de hemolisis que se produce para una concentración conocida de péptido. Una descripción de Ia metodología empleada para Ia determinación de Ia actividad hemolítica se encuentra en Oren eí al, Biochemistry, 2000, 39, 6103-6114, y en Raguse eí al, J. Am. Chem. Soc, 2002, 124, 12774-12785.
Se ha comprobado que Ia gran mayoría de los péptidos de Ia invención presentan una actividad hemolítica significativa a una concentración que resulta ser entre diez y cien veces superior a Ia concentración a Ia que son activos para inhibir el crecimiento de bacterias patógenas de las plantas.
La estabilidad de los péptidos a Ia degradación por proteasas es una característica que permite evaluar que los péptidos se encuentren inalterados en el entorno de Ia planta durante un tiempo de vida medio razonable. Los péptidos pueden ser degradados tanto por proteasas presentes en el teji- do de las plantas como en microorganismos epífitos.
La estabilidad de los péptidos a Ia degradación por proteasas se ha evaluado mediante el tratamiento de soluciones de los péptidos en tampón TRIS con Proteinasa K (Sigma-Aldrich), y Ia monitorización de su degradación por HPLC a diferentes intervalos de tiempo. La degradación se expresa como el porcentaje de péptido degradado después de un intervalo de tiempo determinado calculado a partir de Ia disminución del área del pico del péptido nativo por HPLC. Una descripción de Ia metodología empleada para Ia determinación de Ia estabilidad a proteasas se encuentra en Rozek eí al, Biochemistry, 2003, 42, 14130-14138. Se ha comprobado que algunos péptidos de Ia invención son más estables a Ia degradación por proteasas que el péptido descrito por Cavallarin eí al.
A continuación, a los efectos de completar de forma suficiente Ia anterior descripción, se exponen los siguientes ejemplos.
Ejemplos
En los ejemplos que siguen se emplean las siguientes abreviaciones: Ac: acetilo; Ac 2 O: anhídrido acético; Bn: benzilo; Boc: terc- butiloxicarbonilo; t-Bu: ferc-butilo; Bz: benzoílo; CIM: concentración inhibitoria mínima; DIEA: N,N-diisopropiletilamina; DMF: N,N-dimetilformam¡da; EDTA, ácido etilendiaminotetracético; ESI-MS: espectrometría de masas con ionización por electrospray; Fmoc: 9-fluorenilmetoxicarbonilo; HBTU: hexafluorofos- fato de N-óxido de N-[(1 H-benzotriazol-1-il)(dimetilamino)metilen]-N- metilmetanaminio; HPLC: cromatografía líquida de alta resolución; LB: Luria Bertani; MBHA: 4-metilbencidrilamina; NMP: N-metilpirrolidona; TFA: ácido trifluoroacético; TIS: triisopropilsilano; TRIS: tπs(hidroximetil)aminometano; Ts: p-toluensulfonilo; TSB: Trypticase Soy Broth; UV: ultravioleta.
Los productos Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-lle-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Val-OH, Ia resina Fmoc-Rink-MBHA funcionalizada con grupos amino, y HBTU, se obtuvieron de Senn Chemicals. Los productos cloruro de bencilo, cloruro de benzoílo, ácido trifluoroacético, N-metüpirrolidona, y TIS se obtuvieron de Aldrich. Los productos cloruro de tosilo, piperidina y DIEA se obtuvieron de Fluka. Las siguientes indicaciones sobre el procedimiento para Ia preparación de los péptidos son de carácter general:
Se emplearon aminoácidos que tienen el grupo α-amino protegido con el grupo Fmoc.
Para Ia protección de Ia cadena lateral de Ia lisina y del triptófano se empleó el grupo ferc-butiloxicarbonilo (Boc). Para Ia protección de Ia cadena lateral de Ia tirosina se empleó el grupo ferc-butilo (t-Bu).
- Las reacciones se llevaron a cabo en jeringas de 2 o 5 mi que tenían incorporado un filtro microporoso de polipropileno.
- Todas las transformaciones y lavados se llevaron a cabo a 25° C, a no ser que se indique Io contrario.
El análisis por HPLC se llevó a cabo con un flujo de 1 ,0 ml/min empleando una columna de fase reversa Kromasil (4,6 x 40 mm; tamaño de partículas de 3,5 μm). Se emplearon gradientes lineales con TFA acuoso al 0, 1 % y TFA en acetonitrilo al 0,1%, con una relación com- prendida entre 0,98:0,02 y 0,98:0, 1 durante un período de tiempo de 7 minutos con detección UV a una longitud de onda de 220 nm.
Los espectros ESI-MS fueron adquiridos empleando un instrumento quadrupolo Navigator; operando en el modo positivo de iones (ES+) con un voltaje en Ia muestra de 30 kV.
Todas las relaciones entre los disolventes son volumen/volumen, a no ser que se especifique otro tipo de proporción.
Ejemplo 1.- Preparación de H-Lys-Lys-Leu-Phe-Lys-Lys-lle-Leu-Lys-
Vai-Leu-NH? (Fórmula general (I) donde X 1 es hidrógeno (H), X? es Lvs, y Xa es Val)
En una jeringa de 2 mi de capacidad, equipada con un filtro mi- croporoso en Ia parte inferior, se colocaron 30 mg de resina Fmoc-Rink-MBHA con una funcionalización de 0,66 mmol/g, equivalentes a 19,8 μmoles de grupos amino, y se llenó Ia jeringa con disolvente para hinchar-lavar Ia resina de acuerdo con Ia siguiente secuencia: CH 2 CI 2 (1 * 20 min) y DMF (1 * 20 min). La expresión CH 2 CI 2 (1 x 20 min) se refiere a que se realizó 1 lavado de 20 minutos con cloruro de metileno. Después de cada etapa de lavado se eliminó el disolvente mediante un filtrador de vacío múltiple (Vac Man Laboratory Va- cuum Manifold de Promega Distribuidora). Después de hinchar-lavar Ia resina, ésta se trató con una mezcla de píperidina y DMF (3:7, 1 x 2 min y 1 * 10 min) para eliminar el grupo Fmoc presente en el grupo amino del espaciador bifuncional, y, a continuación, se lavó con DMF (6 x 1 min).
Seguidamente Ia resina se trató con 21 mg de Fmoc-Leu-OH (59 μmoles), 22 mg de HBTU (59 μmoles) y 11 μl de DIEA (63 μmoles) en 0, 1 mi de DMF. Después de 4 h se lavó Ia resina con DMF (6 * 1 min) y se comprobó que el test de ninhidrina era negativo (Kaiser et al, Anal. Biochem., 1970, 34, 595-598).
La eliminación del grupo Fmoc y los lavados subsiguientes se realizaron como ya se ha descrito anteriormente.
El ciclo de acoplamiento-desprotección se repitió para los siguientes cuatro aminoácidos protegidos con el grupo N α -Fmoc: Fmoc-Val-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Leu-OH y Fmoc-lle-OH. En cada etapa se procedió al lavado con DMF (6 x 1 min). A partir del quinto aminoácido incorporado, tanto Ia eliminación del grupo Fmoc, los ciclos acoplamiento-desprotección como los correspon-
dientes lavados se realizaron de Ia misma manera substituyendo en estos casos Ia DMF por NMP. Los seis últimos aminoácidos se incorporaron protegidos con el grupo N α -Fmoc: Fmoc-l_ys(Boc)-OH, Fmoc-Phe-OH y Fmoc-Leu-OH. Para Ia incorporación de los dos últimos aminoácidos se realizaron 2-3 aco- plamientos sucesivos para obtener un test de ninhidrina negativo.
Después de eliminar el grupo Fmoc del último aminoácido acoplado, como ya se ha descrito anteriormente, se lavó Ia resina con NMP (6 x 1 min) y CH 2 CI 2 (6 x 1 min), y se obtuvo el péptido lineal unido a Ia resina, H- Lys-Lys-Leu-Phe-Lys-Lys-lle-Leu-Lys-Val-Leu-Rink-MBHA. A continuación se escindió el péptido de Ia resina mediante un tratamiento con 1 mi de una mezcla de TFA, agua y TIS (95:2,5:2,5) durante 2 horas. Se recogieron los filtrados en un vial mediante una presión positiva de nitrógeno. La resina se lavó con una mezcla de TFA, agua y TIS (95:2,5:2,5, 2 x 0,5 mi). Los filtrados se combinaron y se evaporaron casi a sequedad bajo una corriente de nitrógeno hasta obtener un aceite. Dicho aceite se precipitó con éter dietílico, se centrifugó, y el éter se decantó. Este proceso se repitió 3 o 4 veces. Finalmente, el producto sólido obtenido se disolvió en agua, y se liofilizó.
Se obtuvo un sólido pulverulento que tenía una pureza superior al 90% analizada por HPLC (tiempo de retención 4,39 minutos), y su estructura se confirmó por ESI-MS.
La síntesis de este péptido también se llevó a cabo a mayor escala utilizando 200 mg de resina Fmoc-Rink-MBHA con una funcionalización de 0,66 mmol/g, equivalentes a 132 μmoles de grupos amino, utilizando el procedimiento descrito en este mismo Ejemplo 1.
Ejemplo 2.- Preparación de Ac-Lys-Lys-Leu-Phe-Lys-Lys-lle-Leu-Lys-
Val-Leu-NH? (Fórmula general (I) donde X 1 es acetilo (Ac), X? es Lys, y Xa es Val)
La peptidilresina H-Lys-Lys-Leu-Phe-Lys-Lys-lle-Leu-Lys-Val-
Leu-Rink-MBHA obtenida en el Ejemplo 1 , se trató con 0,2 mi de una mezcla de anhídrido acético (Ac 2 O), piridina y CH 2 CI 2 (1 :1 :1) durante 1 h a temperatura ambiente. Posteriormente, Ia resina se lavó con CH 2 CI 2 (6 x 1 min).
A continuación, se escindió el péptido de Ia resina y se aisló si- guiendo el procedimiento descrito en el Ejemplo 1. La pureza del péptido obte-
nido fue superior al 90% determinada por HPLC (tiempo de retención 4,59 minutos), y su estructura se confirmó por ESI-MS.
Ejemplo 3.- Preparación de Ts-Lys-Lys-Leu-Phe-Lys-Lys-lle-Leu-Lys- Val-Leu-NH? (Fórmula general (I) donde X 1 es p- toluensulfonilo (Ts), X? es Lys, y X a es Val)
La peptidilresina H-Lys-Lys-Leu-Phe-Lys-Lys-lle-Leu-Lys-Val- Leu-Rink-MBHA obtenida en el Ejemplo 1 , se trató con cloruro de p- toluensulfonilo (TsCI) (792 μmoles) y DIEA (1 ,58 mmoles) en 0,2 mi de una mezcla de CH 2 CI 2 y NMP (9:1 ) durante 1 h a temperatura ambiente. Posteriormente, Ia resina se lavó con NMP (6 x 1 min).
A continuación, se escindió el péptido de Ia resina y se aisló siguiendo el procedimiento descrito en el Ejemplo 1. La pureza del péptido obte- nido fue superior al 90% determinada por HPLC (tiempo de retención 4,89 minutos), y su estructura se confirmó por ESI-MS.
Ejemplo 4.- Preparación de Bz-Lys-Lys-Leu-Phe-Lys-Lys-lle-Leu-Lys-
Val-Leu-NH? (Fórmula general (I) donde X 1 es benzoílo (Bz), X z es Lys, y X, es Val)
La peptidilresina H-Lys-Lys-Leu-Phe-Lys-Lys-lle-Leu-Lys-Val-
Leu-Rink-MBHA obtenida en el Ejemplo 1 , se trató con cloruro de benzoílo
(BzCI) (792 μmoles) y DIEA (1 ,58 mmoles) en 0,2 mi de una mezcla de CH 2 CI 2 y NMP (9: 1 ) durante 1 h a temperatura ambiente. Posteriormente, Ia resina se lavó con NMP (6 x 1 min).
A continuación, se escindió el péptido de Ia resina y se aisló siguiendo el procedimiento descrito en el Ejemplo 1. La pureza del péptido obtenido fue superior al 90% determinada por HPLC (tiempo de retención 5,00 mi- ñutos), y su estructura se confirmó por ESI-MS.
Ejemplo 5.- Preparación de Bn-Lys-Lys-Leu-Phe-Lys-Lys-lle-Leu-Lys-
Val-Leu-NH? (Fórmula general (I) donde X 1 es bencilo (Bn), X z es Lys, y X ? es Val)
La peptidilresina H-Lys-Lys-Leu-Phe-Lys-Lys-lle-Leu-Lys-Val-
Leu-Rink-MBHA obtenida en el Ejemplo 1 , se trató con bromuro de bencilo
(BnBr) (792 μmoles) y DIEA (1 ,58 mmoles) en 0,2 mi de una mezcla de CH 2 CI 2 y NMP (9: 1 ) durante 48 h a temperatura ambiente. Posteriormente, Ia resina se lavó con NMP (6 * 1 min).
A continuación, se escindió el péptido de Ia resina y se aisló siguiendo el procedimiento descrito en el Ejemplo 1. La pureza del péptido obtenido fue superior al 90% determinada por HPLC (tiempo de retención 4,73 minutos), y su estructura se confirmó por ESI-MS.
Ejemplo 6.- Preparación de una quimioteca de péptidos lineales en fase sólida
Se diseñó una quimioteca para Ia obtención de 125 péptidos, que responden a Ia fórmula general (I):
X 1 -X 2 -LyS-LeU-PlIe-LyS-LyS-IIe-LeU-LyS-X 3 -LeU-NH 2 (I) en donde
X-i es hidrógeno, acetilo, p-toluensulfonilo, bencilo, o benzoílo, X 2 es Lys, Tyr, Leu, Phe, o Trp, y X 3 es Lys, Tyr, Val, Phe, o Trp, con Ia condición de que el péptido en donde X 1 es hidrógeno, X 2 es Trp, y X 3 es Val, se excluye expresamente de los péptidos de Ia invención.
En cinco jeringas de 5 mi de capacidad, etiquetadas adecuadamente y equipadas con un filtro microporoso en Ia parte inferior, se colocaron 350 mg de resina Fmoc-Rink-MBHA con una funcionalización de 0,66 mmol/g, equivalentes a 231 μmoles de grupos amino. Las jeringas se llenaron con disolvente para hinchar-lavar Ia resina de acuerdo con Ia siguiente secuencia: CH 2 CI 2 (1 x 20 min) y DMF (1 * 20 min). Después de cada etapa de lavado se eliminó el disolvente mediante un filtrador de vacío múltiple (Vac Man Labora- tory Vacuum Manifold de Promega Distribuidora).
Después de hinchar-lavar las resinas, éstas se trataron con una mezcla de piperidina y DMF (3:7, 1 * 2 min y 1 χ 10 min) para eliminar el grupo Fmoc presente en el grupo amino del espaciador bifuncional, y, a continuación, se lavaron con DMF (6 x 1 min). Seguidamente las cinco resinas se trataron con 245 mg de Fmoc-
Leu-OH (693 μmoles), 263 mg de HBTU (693 μmoles) y 121 μl de DIEA (693
μmoles) en 0,8 mi de DMF. Después de 4 h se lavaron las resinas con DMF (6 x 1 min) y se comprobó que el test de ninhidrina era negativo (Kaiser et al, Anal. Biochem., 1970, 34, 595-598).
A continuación se eliminó el grupo Fmoc y se realizaron los lava- dos correspondientes tal y como se ha descrito anteriormente. Seguidamente se acopló a cada resina el aminoácido X 3 correspondiente: Fmoc-Val-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Tyr(Boc)-OH, Fmoc-Phe-OH o Fmoc-Lys(Boc)-OH, siguiendo el procedimiento empleado para acoplar el aminoácido protegido Fmoc-Leu-OH. La eliminación del grupo Fmoc y los lavados subsiguientes se realizaron como ya se ha descrito anteriormente.
El ciclo de acoplamiento-desprotección se repitió para los siguientes tres aminoácidos. De esta manera se acoplaron secuencialmente: Fmoc-l_ys(Boc)-OH, Fmoc-Leu-OH y Fmoc-lle-OH. Estos acoplamientos se realizaron para cada una de las cinco resinas. En cada etapa se procedió al lavado con DMF (6 * 1 min).
A partir del quinto aminoácido incorporado Ia eliminación del grupo Fmoc, los ciclos acoplamiento-desprotección y los lavados correspondientes se realizaron de Ia misma manera substituyendo en estos casos el uso de DMF por el de NMP. Siguiendo este procedimiento se acoplaron a cada una de las cinco resinas de manera secuencial dos residuos de Fmoc-Lys(Boc)-OH, uno de Fmoc-Phe-OH y uno de Fmoc-Leu-OH. En cada etapa se procedió al lavado con NMP (6 x 1 min). Para Ia incorporación del décimo residuo fue necesario un doble acoplamiento para obtener un test de ninhidrina negativo. Una vez acoplado el décimo residuo, cada una de las peptidilre- sinas confinadas en las cinco jeringas, se dividió en cinco fracciones. Las 25 fracciones obtenidas, correspondientes a aproximadamente 46 μmoles de pep- tidilresina cada una, se colocaron en 25 jeringas de 2 mi de capacidad, etiquetadas adecuadamente y equipadas con un filtro microporoso en Ia parte infe- rior. A continuación se eliminó el grupo Fmoc y se realizaron los lavados correspondientes tal y como se ha descrito anteriormente. A cada una de las cinco fracciones de resina que llevan incorporado el mismo aminoácido X 3 se acopló el residuo X 2 correspondiente: Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Tyr(íBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc) o Fmoc-Leu-OH. Los acoplamientos se rea- lizaron utilizando 138 μmoles del aminoácido N α -Fmoc protegido correspondiente, 138 μmoles de HBTU y 138 μmoles de DIEA en 0,3 mi de NMP. Para Ia
incorporación de estos aminoácidos fue necesario realizar un doble acoplamiento para obtener un test de ninhidrina negativo.
A continuación cada una de las 25 fracciones anteriores se dividió en cinco fracciones iguales. Las 125 fracciones de resina obtenidas, co- rrespondientes a aproximadamente 9,2 μmoles de peptidilresina, se colocaron en 125 jeringas de 2 mi de capacidad, etiquetadas adecuadamente y equipadas con un filtro microporoso en Ia parte inferior. A continuación se eliminó el grupo Fmoc y se realizaron los lavados correspondientes tal y como ya se ha descrito anteriormente. Cuatro de las cinco fracciones de resina obtenidas a partir de cada una de las 25 fracciones anteriores se derivatizaron en el extremo N- terminal por acetilación, tosilación, benzoilación o bencilación, respectivamente.
La acetilación se realizó por tratamiento con 0,2 mi de una mez- cía de Ac 2 O, piridina y CH 2 CI 2 (1 : 1 : 1 ) durante 1 h a temperatura ambiente.
La tosilación se llevó a cabo por tratamiento con TsCI (368 μmoles) y DIEA (736 μmoles) en 0,2 mi de una mezcla de CH 2 CI 2 y NMP (9: 1 ) durante 1 h a temperatura ambiente.
La benzoilación se realizó por tratamiento con BzCI (368 μmoles) y DIEA (736 μmoles) en 0,2 mi de una mezcla de CH 2 CI 2 y NMP (9: 1 ) durante 1 h a temperatura ambiente.
La bencilación se llevó a cabo por tratamiento con BnBr (368 μmoles) y DIEA (736 μmoles) en 0,2 mi de una mezcla de CH 2 CI 2 y NMP (9: 1 ) durante 48 h a temperatura ambiente. Posteriormente a estos tratamientos las resinas se lavaron con
NMP (6 x 1 min).
Finalmente, se procedió a Ia escisión de los 125 péptidos de Ia resina en Ia correspondiente jeringa y al aislamiento de cada uno de ellos siguiendo el procedimiento descrito en el Ejemplo 1 . Los péptidos obtenidos se analizaron por HPLC y se confirmó su estructura por ESI-MS. En todos los casos se obtuvo una pureza superior al 90%.
Ejemplo 7.- Ensayos de actividad antimicrobiana
El efecto antimicrobiano de los péptidos de Ia invención se determinó frente a las siguientes cepas de bacterias patógenas: Erwinia amylo-
vora PMV6076 (INRA, Angers, Francia), Xanthomonas vesicatoria 2133-2 (IVIA, Valencia, España), y Pseudomonas syringae pv. syringae EPS94 (IN- TEA, Universitat de Girona, España).
Todas las bacterias se conservaron a una temperatura de -80° C en medio Luria-Bertani (LB) complementado con glicerina al 20% en volumen/volumen.
Las suspensiones de E.amylovora PMV6076 y P. syringae pv. syringae EPS94 se obtuvieron después de un crecimiento de 24 horas a 25° C, y Ia muestra de X. vesicatoria 2133-2 se obtuvo después de Ia incubación duran- te 48 horas a 25° C en agar LB. En todos los casos se resuspendieron en agua estéril para obtener una suspensión ajustada a una absorbancia de 0,2 a 600 nm, que correspondía aproximadamente a 10 8 unidades formadoras de colo- nias/ml.
Para determinar Ia concentración inhibitoria mínima (CIM), los péptidos se solubilizaron en agua estéril milli-Q hasta una concentración final de 1000 μM y se filtraron a través de un filtro de 0,22 μm de poro.
Se realizaron diluciones de los péptidos de Ia invención para obtener soluciones a las concentraciones 750, 500, 250, 200, 150, 125, 100, 75, 50 y 25 μM. Se mezclaron 20 μl de cada dilución con 20 μl de Ia suspensión del indicador bacteriano correspondiente, y 160 μl de medio líquido TSB (Trip- ticase Soy Broth), hasta un volumen total de 200 μl en cada pocilio de una mi- croplaca. Así las concentraciones efectivas a las que se sometían las suspensiones de bacterias fueron 75, 50, 25, 20, 15, 12,5, 10, 7,5, 5 y 2,5 μM. Se llevaron a cabo dos réplicas para cada cepa, concentración y péptido en ensayo.
Los controles positivos contenían agua en lugar de péptido, y los controles negativos contenían los péptidos sin Ia suspensión bacteriana.
El crecimiento microbiano se determinó automáticamente median- te Ia medida de Ia densidad óptica a 600 nm empleando el Microbiology Analy- ser Bioscreen C (Labsystems).
Las microplacas se incubaron a 25° C durante 48 horas con una agitación de 20 segundos antes de Ia medida de Ia absorbancia cada hora. Cada experimento se realizó dos veces. Como CIM se tomó Ia concentración de péptido más baja a Ia que no se producía crecimiento bacteriano al final del experimento.
En Ia Tabla II se presenta el rango de concentraciones entre las que se encuentra Ia CIM, expresada en μM, después de 48 h de incubación a 25° C, para diferentes péptidos de Ia invención frente a las bacterias Erwinia amylovora, Xanthomonas vesicatoria, y Pseudomonas syringae. Los péptidos de Ia Tabla Il se identifican con los parámetros X 1 , X 2 y X 3 que figuran en Ia fórmula general (I). Además, Ia Tabla Il incluye el número de referencia con relación a Ia quimioteca preparada en el Ejemplo 6. En Ia Tabla Il se incluyen como Ejemplo comparativo los resultados correspondientes al péptido descrito por Cavallarin et a/, que no forma parte de Ia invención:
TABLA Il
Se puede comprobar que los péptidos de Ia invención presentan una buena eficacia para inhibir el crecimiento de las bacterias Pseudomonas syringae, Xanthomonas vesicatoria, y/o Erwinia amylovora.
Además la eficacia de los péptidos de Ia invención es superior a Ia del péptido ya conocido, cuyos resultados se presentan en Ia primera fila de Ia tabla anterior bajo Ia denominación de Ejemplo comparativo.
Ejemplo 8.- Ensayos de actividad hemolítica
La actividad hemolítica de los péptidos de Ia invención se evaluó mediante Ia determinación de Ia liberación de hemoglobina que se produce al poner en contacto una solución de los péptidos con una suspensión de eritroci- tos al 5% en volumen procedentes de sangre humana fresca.
La sangre se recogió asépticamente empleando un sistema Vacu- tainer ® K2E (Belliver, Gran Bretaña) con EDTA, y se almacenó a 4 o C durante un período inferior a 2 horas.
La sangre se centrifugó a 6.00Og durante 5 minutos para separar los eritrocitos. éstos se lavaron tres veces con tampón TRIS (10 mM TRIS, 150 mM NaCI, pH 7,2), y se suspendieron en tampón TRIS hasta obtener una suspensión que contenía un 10% en volumen de eritrocitos.
Los péptidos se solubilizaron en tampón TRIS hasta una concentración final 100, 300, y 500 μM. Se emplearon tres réplicas para cada péptido y concentración.
Se mezclaron 65 μl de Ia suspensión de eritrocitos al 10% en volumen con 65 μl de la solución de péptido en cada pocilio de una placa de 96 pocilios Micro-Amp ® (Applied Biosystems, EE.UU.) (5% en volumen de eritrocitos), y se incubó Ia mezcla durante 1 h a 37° C bajo agitación. De este modo las suspensiones de eritrocitos se sometieron a concentraciones de péptidos de 50, 150, y 250 μM.
A continuación se centrifugaron las placas a 3.50Og durante 10 minutos, y se transfirieron alícuotas de 80 μl del sobrenadante a microplacas de 100 pocilios (Bioscreen), que se diluyeron con 80 μl de agua milli-Q. El grado de hemolisis se determinó a partir de Ia absorbancia a
540 nm con un lector de placas Bioscreen.
El control positivo de hemolisis completa se determinó en una solución de tampón TRIS que contenía melitina 200 μM (Sigma-Aldrich, España). El porcentaje de hemolisis (H) se determinó empleando Ia ecua- ción:
H = 100x[(Op-Ob)/(Om-Ob)]
donde Op era Ia densidad óptica medida para una concentración de péptido determinada, Ob era Ia densidad óptica de Ia solución tampón, y Om era Ia densidad óptica para el control positivo con melitina.
La Tabla III presenta los resultados de actividad hemolítica, expresada como el porcentaje de hemolisis calculado según Ia ecuación anterior, para concentraciones de péptidos de Ia invención correspondientes a 50, 150 y 250 μM. Los péptidos de Ia Tabla IiI se identifican con los parámetros X 1 , X 2 , y X 3 que figuran en Ia fórmula general (I). Además Ia Tabla III incluye el número de referencia con relación a Ia quimioteca preparada en el Ejemplo 6:
TABLA
En todos los casos se observa que Ia concentración en Ia que se llegaría a producir una hemolisis significativa es entre 10 y 100 veces superior a Ia concentración en Ia que los péptidos de Ia invención presentan actividad antimicrobiana.
Ejemplo 9.- Ensayos de estabilidad a Ia degradación por proteasas
La estabilidad de los péptidos de Ia invención a Ia degradación por proteasas se determinó mediante un ensayo de digestión del péptido por Proteinasa K (Sigma-Aldrich Corporation, Madrid, España).
Se empleó una disolución de 50 μg/ml de péptido y de 1 μg/ml de Proteinasa K en tampón TRIS 100 mM a pH 7,6, a temperatura ambiente.
El progreso de Ia escisión del péptido se determinó cromatográfi- camente a tiempos comprendidos entre 5 y 45 minutos. Para ello se empleó una columna C 18 de fase reversa (Kromasil, 4,6 x 40 mm; 3,5 μm de tamaño de partícula), y gradientes lineales de TFA acuoso al 0,1 % y TFA en acetonitrilo al 0, 1 % desde 0,98:0,02 a 0:1 durante 7 min realizando Ia detección mediante absorbancia en el ultravioleta a 220 nm.
La Tabla IV presenta los resultados de estabilidad a Ia degradación por proteasas, expresada como el porcentaje de degradación de cada péptido a los 45 minutos. Los péptidos de Ia Tabla IV se identifican con los parámetros X 1 , X 2 , y X 3 que figuran en Ia fórmula general (I). Además Ia Tabla IV incluye el número de referencia con relación a Ia quimioteca preparada en el Ejemplo 6. En Ia Tabla IV se incluyen como Ejemplo comparativo los resultados correspondientes al péptido descrito por Cavallarin et al, que no forma parte de Ia invención:
Se puede observar que algunos péptidos de Ia invención son más estables frente a Ia degradación por proteasas que el péptido descrito por Ca- vallarin et al (Ejemplo comparativo). En particular, los péptidos correspondientes a Ia fórmula general (I) donde X 1 es hidrógeno, X 2 es Lys, y X 3 es Phe, o X 1 es benzoílo, X 2 es Lys y X 3 es Lys, resultan ser dos veces más estables que el péptido del Ejemplo comparativo.