ROTH THOMAS (DE)
ROTH THOMAS (DE)
P. WORKMAN: "Keynote address: bioreductive mechanisms.", INT. J. RADIAT. ONCOL. BIOL. PHYS., vol. 22, no. 4, 1992, pages 631 - 637
| 1. | Antineoplastische Mittel mit verstärkter Wirksamkeit, dadurch gekennzeichnet, daß sie die folgende acetalische Struktur I als Wirksubstanz aufweisen: ,CH, R1 0 i R^ C O R* I R2 Dabei ist; = H, CH3 oder CH2CH3; R2 = H oder CH3; R3 = 1. eine cytotoxische Funktion Fl, in diesem Falle ist R4 ein über die Positionen 1 2, 6, 7, 11 , 16 oder 17 gebundenes Steroid mit Affinität zum Steroidhormonrezeptor oder ein Trägermolekül mit DNAAffinität; R3 =. |
| 2. | ein Alkylrest (CrClg, gesättigt oder ungesättigt) oder ein Trägermolekül mit DNAAffinität; in diesem Falle ist R4 die cytotoxische Funktion F2; R4 = 1. eine cytotoxische Funktion F2; in diesem Falle ist R3 ein Alkylrest (CrC,8, gesättigt oder ungesättigt) oder ein Trägermolekül mit DNAAffinität; R4 = 2. ein über die Positionen 1, 2, 6, 7, 11 , 16 oder 17 gebundenes Steroid mit Affinität zum Steroidhormonrezeptor oder ein Trägermolekül mit DNAAffinität; in diesem Falle ist R3 die cytotoxische Komponente Fl. |
| 3. | 2Mi ttel nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet , daß R3 die cytotoxische Funktion Fl ist worin bedeuten: R5, R6 = H, CH2CH2C1, CH2CH2Br, CH2CH2OSO2CH3, CH2CH2OSO2NH2, (CH^OH mit n = 15, (CHOC(O)CH3)nCH2OC(O)CH3 mit n = 15 oder Bestandteil eines gesättigten heterocyclischen Ringsystems mit 57 CRingatomeπ, wobei eines zusätzlich durch ein N oder O ersetzt sein kann (Bsp.: Morpholin, Piperazin) R7 wie R5 und R6; R7 ist jedoch nicht Bestandteil eines hetero¬ cyclischen Ringsystems R$ = CH2CH2C1, CH2CH2Br, CH2CH2OSO2CH3 oder CH2CH2OSO2NH2 Mittel nach Anspruch 1 oder 2 , dadurch gekennzeichnet , daß R die cytotoxische Funktion F2 ist worin bedeuten : R5, Rä = H, CH2CH2C1, CH2CH2Br, CH2CH2OSO2CH3, CHJCHJOSOJNHJ, mit n = 15, (CHOC(O)CH3)nCH2OC(O)CH, it n = 15 oder Bestandteil eines gesättigten heterocyclischen Ringsystems mit 57 CRingatomen, wobei eines zusätzlich durch ein N oder O ersetzt sein kann (Bsp.: M orpholin, Piperazin) R7 wie R5 und R6; R7 ist jedoch nicht Bestandteil eines hetero¬ cyclischen Ringsystems RR = CH2CH2C1, CH2CH2Br, CH2CH2OSO2CH3 oder CH2CH,OS02NH2 R9, R10 = H, CH3, F, Cl, Br oder OCH3 Ru, Rπ = H oder CH,. |
Es hat sich überraschend gezeigt, daß die oxϊdative Metabolisierung über enzymatische - Hydroxylierung von lipohpilen Acetalen durch Cytochrom P450 abhängige Monooxygenasen zur Aktivierung antineoplasti scher Gruppen genutzt werden kann.
Diese Monooxygenasen- Aktivierung ist auch im Falle des bekannten Antitumormittel s Cyclo- phosphamid (Endoxan R ) wesentlich. Cyclophosphamid generiert erst nach Cytochrom P450- vermittelter Hydroxylierung an der 4-Position und nachfolgender Himinierung von Acrolein die eigentliche cytotoxische Komponente Phosphoramid-Mustard (Abb. 1).
Acrolein
Cyclophosphamid 4-OH-CP Aldophosphαmld Phosphorαml - ustαrd
Abb. 1
Es hat sich herausgestellt, daß diese Aktivierung durch die Verwendung bestimmter acetalischer Gruppen erheblich gesteigert werden kann. Dies läßt sich für die Herstellung stärker wirksamer antineoplasti scher Agenden ausnutzen. Gleichzeitig bietet diese acetalische Prodrug-Gruppierung die Möglichkeit, die cytotoxische Wirkkomponente mit einem Spektrum an Trägermolekülen zu koppeln, die einen gezielteren Transport zum Tumor ermöglichen bzw. die gezielte Anreicherung an DNA erlauben. Hierdurch sind besser wirksame Antitumormedikarnente zugänglich.
Die Verbindungen besitzen die allgemeine Formel: .ChU- R 1
0 i
R*- C-0 - R*
Dabei ist: i
R 2
R 1 = -H, -CH 3 oder -CH 2 CH 3 ;
R 2 = -H oder -CH 3 ;
R 3 = 1. eine cytotoxische Funktion Fl, in diesem Falle ist R 4 ein über die Positionen
1 , 2, 6, 7, 11, 16 oder 17 gebundenes Steroid mit Affinität zum Steroidhormonrezeptor oder ein Trägermolekül mit DNA-Affinität;
Beispi
-CH 2 CHj>Br, -CH 2 CH 2 OSO 2 CH 3 , -CH 2 CH 2 OSO 2 NH 2 , -(CH^OH mit n
= 1-5, -(CHOC(O)CH 3 ) il CH 2 OC(O)CH 3 mit n = 1-5 oder Bestandteil eines gesättigten heterocyclischen Ringsystems mit 5-7 C-Ringatomen, wobei eines zusätzlich durch ein N oder O ersetzt sein kann (Bsp.: Morpholin, Pipeτazin)
R 7 wie R 5 und R 6 ; R 7 ist jedoch nicht Bestandteil eines hetero¬ cyclischen Ringsystems R- = -CH 2 CH 2 C1, -CH 2 CH 2 Br, -CH 2 CH 2 OSO 2 CH 3 oder
R 3 = 2. ein Alkylrest ( -C«, gesättigt oder ungesättigt) oder ein Trägermolekül mit
DNA-Affinität; in diesem Falle ist R 4 die cytotoxische Funktion F2; R 4 = 1. eine cytotoxische Funktion F2; in diesem Falle ist R 3 ein Alkylrest (C C , gesättigt oder ungesättigt) oder ein Tiägermolekül mit DNA-Affinität; Beispiele für R 4 = cytotoxische Funktion F2: R -
-CH 2 CH 2 Br,
-CH 2 CH 2 OSO 2 CH 3 , -CH 2 CH 2 OSθ 2 NH 2 , -(CH 2 ) n OH mit n
= 1-5, -(CHOC(O)CH 3 ) a CH 2 OC(O)CH 3 mit n = 1-5 oder
Bestandteil eines gesättigten heterocyclischen Ringsystems mit 5-7 C-Ringatomen, wobei eines zusätzlich durch ein N oder O ersetzt sein kann (Bsp.: Morpholin, Piperazin)
R 7 wie R 5 und R 6 ; R 7 ist jedoch nicht Bestandteil eines hetero¬ cyclischen Ringsystems R* = -CH 2 CH 2 C1, -CH 2 CH 2 Br, -CH 2 CH 2 OSO 2 CH 3 oder -CH 2 CH 2 OSO 2 NH 2
R 9 , R 10 = -H, -CH 3 , -F, -Cl, -Er oder -OCH 3 R n , R π = -H oder -CH 3
ERSATZBLÄIT (REGEL 26)
R 4 = 2. ein über die Positionen 1, 2, 6, 7, 11 , 16 oder 17 gebundenes Steroid mit Affinität zum Steroidhormonrezeptor oder ein Trägermolekül mit DNA-Affinität; in diesem Falle ist R 3 die cytotoxische Komponente Fl.
Die Cytochrom P450 vermittelte Aktivierung der Substanzen ist in Abb. 2 allgemein dargestellt und in Abb. 3 anhand der Beispielverbindung 1 näher verdeutlicht. Die Cytochrom P450 vermittelte Freisetzung des bif unktionellen Alkylans Phosphoramid Mustard aus Beispielverbindung 1 übersteigt jene aus Cyclophosphamid um 180%.
Abb. 2
Cyt P450 (α-Hydroxyllβrung)
Propiσnride y Acetodehyd
Abb. 3
Folgende Beispiele erläutern die Erfindung:
1 . N,N-Bis-(2-chlorethyl)phosphorsäurediamid-[4-{ 1 -ethoxypropoxy)benzyI]- ester (Beispielverbindung 1 )
A) 4-( 1 -Ethoxypropoxy)benzyl-(tert.-butyldiphenylsilyl)ether
Zu 23,5 g (54 mmol) 4-Trimethylsilyloxybenzyl-(tert.-butyldiphenylsi- lyDether (5) in 1 20 ml abs. Dichlormethan gibt man bei -70°C 1 3,8 ml (81 ,4 mmol) 1 , 1 -Diethoxypropan, 4,64 ml (64,8 mmol) Propional- dehyd und 30 μ\ (0, 1 7 mmol) Trimethylsilyltrifluorsulfonsäure als
Katalysator.
Nach 29 h Rühren bei -70°C wird die Reaktion durch Zugabe von 2, 1 ml ( 1 5, 1 mmol) Triethylamin abgebrochen. Nachdem sich der Ansatz
auf Raumtemperatur erwärmt hat, überführt man mit insgesamt 100 ml Dichlormethan in einen Scheidetrichter. Es wird 2x mit je 100 ml ges. Natriumhydrogencarbonatlösung und 3x mit je 100 ml dest. Wasser ausgeschüttelt. Die über Natriumsulfat getrocknete organi¬ sche Phase wird zur Trockne eingeengt.
Der TBDPSi-Rest wird anschließend nach der Methode von Hanessian und Lavallee (1 975) mit tetra-Butylammoniumfluorid abgespalten. Verbindung 5 ist aus 4-Hydroxybenzylalkohol nach bekannten Metho¬ den zugänglich: 1 . Einführung der TBDP-Si-Gruppe: Hanessian und Lavallee (1 975); 2. Einführung des TMSi-Rest: Visser et al. ( 1 980).
N,N-Bis-(2-chlorethyl)phosphorsäurediamid-4-(1 -ethoxypropoxy)ben- zylester 0,5 g (20,75 mmol) Natriumhydrid werden in 5 ml abs.
Toluol unter Schutzgasatmosphäre suspendiert und auf 0°C gekühlt. Dazu tropft man eine Lösung von 3,4 g (1 6, 17 mmol) 4-( 1 -Ethoxy- propoxy)benzylalkohol in 30 ml abs. Toluol. Man rührt 1 5 h, wobei sich der Ansatz auf Raumtemperatur erwärmt. Die Alkoholatsuspen- sion wird unter Schutzgas quantitativ in einen Tropftrichter überführt und langsam zu einer Lösung von 4,27 g (1 6,5 mmol) N,N-Bis-(2- chlorethyDphosphorsäureamiddichlorid in 25 ml Toluol (abs.) bei 30°C getropft. Man rührt 6 h. Die Temperatur des Ansatzes wird zwischen -40°C und -1 5°C gehalten. Anschließend leitet man 45 min lang trockenes Ammoniakgas durch den Reaktionsansatz. Nach Erwärmen auf Raumtemperatur wird mit 100 ml Ethylacetat verdünnt und vom Unlöslichen abfiltriert. Die eingeengte Rohlösung wird an Kieselgel mit Hexan/Ethanol = 5 + 1 ,5 säulenchromatographisch gereinigt. Man erhält 3, 1 g (46,3%) gelb¬ lichen Feststoff.
CHN-Analyse: C 18 H 27 CI 2 N 2 O 4 P MG: 413,3 ber.: C: 46,5% H: 6,6% N: 6,8% gef.: C: 46,8% H: 6,5% N: 6,6%
CH,- CH,- 0 CH. ,- CH 2 - CI
CH 3 - CH 2 - CH - 0 ~Λ ~J — CH 2 — 0 — P - N'
NH 2 CH 2 - CH 2 - CI
Beispielverbindung 1
Η-NMR (CDC1 3 , TMS, 400 MHz)
Daten zur in vitro Aktivität: Im Colony forming assay am humanen Lungen- tumorxenograft LXFL 529 wurde die Zellkolonie-Bildung bereits bei 1μg/ml (2,4 ymol/l) zu 98% gehemmt. Cyclophosphamid bewirkte erst bei 10μg/ml eine 40%ige Hemmung.
N,N-Bis-(2-chlorethyl)phosphorsäurediamid-[3-(androst-4- en-3-on-1 7 ?- yloxy)-3-ethoxy-propyl]ester (Beispielverbindung 2)
A) 3-(Androst-4-en-3-on-1 7yS-yloxy)-3-ethoxy-propyl-4-nitrobenzoat
Zu 8 g (22, 1 8 mmol) Androst-4-en-3-on-1 7/5-yl-(trimethylsilyl)ether (Einführung des TMSi-Rests an die 17 ?-OH-Funktion des Steroids: Visser et al. ( 1 980) und 8,58 g (28,84 mmol) 3,3-Diethoxypropyl-4- nitrobenzoat (6) gibt man unter Schutzgasatmosphäre 65 ml abs. Dichlormethan. Der Ansatz wird auf -40°C gekühlt. Man gibt 1 ,6 ml
abs. Aceton und 0,7 ml Trimethylsilyltrifluormethansulfonat als Kata¬ lysator hinzu, kühlt auf -70°C und rührt bei dieser Temperatur 24 h. Die Reaktion wird durch Zugabe von 10 ml Triethylamin abgebro¬ chen. Nachdem sich der Ansatz auf Raumtemperatur erwärmt hat, wird mit 270 ml Dichlormethan verdünnt, 2x mit je 1 50 ml ges.
Natriumhydrogencarbonat-Lösung und 1 x mit 1 50 ml ges. Natriumhy¬ drogensulfat-Lösung ausgeschüttelt und die org. Phase über Natrium¬ sulfat getrocknet. Die eingeengte Lösung wird an einer Kieselgelsäule mit Hexan/Tetrahydrofuran = 3 + 1 als Elutionsmittel gereinigt. Das
Produkt wird aus Hexan/Tetrahydrofuran umkristallisiert. Verbindung 6 ist aus Ethyl-3,3-diethoxypropionat nach bekannten Methoden zugänglich: 1 . Reduktion mit LiAIH 4 : Vik ( 1 973); 2. Ein- führung des 4-Nitrobenzoylrests: Gateau-Olesker et al. ( 1 981 ).
B) N,N-Bis-(2-chlorethyl)phosphorsäurediamid-[3-(androst-4-en- 3-on- 1 7 ?-yloxy)-3-ethoxy-propyl]ester
Nach Abspaltung des 4-Nitrobenzoylrests in 3-(Androst-4-en-3-on- 1 7ß-yloxy)-3-ethoxy-propyl-4-nitrobenzoatmit 1 M isopropanolischer NaOH, werden 1 ,54 g (3,94 mmol) 3-(Androst-4-en-3-on-1 7/?-yloxy)- 3-ethoxy-propanol in 1 5 ml abs. Dichlormethan und abs. Toluol (1 + 1 ) gelöst. Man gibt 2 ml Triethylamin und 2,59 g (1 0 mmol) N,N- Bis-(2-chlorethyl)phosphorsäureamiddichlorid hinzu. Man rührt noch
4 Tage und leitet danach 40 min trockenes Ammoniakgas durch die Reaktionslösung. Nach 30 min Nachrühren wird mit 50 ml Dichlorme¬ than verdünnt und vom Unlöslichen abfiltriert. Die org. Lösung wird eingeengt und der verbleibende Rückstand säulenchromatographisch an Kieselgel mit Dichlormethan/Ethanol/Triethylamin = 10 + 1 + 0, 1 als Elutionsmittel gereinigt. Man erhält 0,64 g (27,9%, 1 , 1 mmol) hochviskoses gelbes Öl. CHN-Analyse: C 28 H 47 CI 2 N 2 O 5 P MG: 593,6 ber.: C: 56,7% H: 8,0% N: 4,7% gef.: C: 56,4% H: 7,9% N: 4,3%
Beispielverbindung 2
'H-NMR (CDC1 3 , TMS, 400 MHz)
Daten zur in vitro Aktivität: Im Sulforhodamin-B-Assay an der Mammacarci- nomzellinie MCF-7 war die Substanz um den Faktor 6 wirksamer als 4- Hydroperoxycyclophosphamid (HOOCP). IC 50 (2) = 3, 1 μM, IC 50 (HOOCP) = 18,0 yM (jeweils 29h Inkubation).
analog zu 2. wurde hergestellt: 3. N,N-Bis-(2-chlorethyl)phosphorsäurediamid-[3-(estr-4-en-3-o n-17/?-yloxy)-3- ethoxypropyljester (Beispielverbindung 3)
Ausbeute: 36% gelbe Kristalle
CHN-Analyse: C 27 H 45 CI 2 N 2 O 5 P MG: 593,6 ber.: C: 56,0% H: 7,8% N: 4,8% gef.: C: 56,3% H: 7,9% N: 4,3%
1 H-NMR (CDCI 3 , TMS, 400 MHz): steht mit der angegebenen Struktur im
Einklang
Beispielverbindung 3
Daten zur in vitro Aktivität: Im Sulforhodamin-B-Assay an der Mammacarci- nomzellinie MCF-7 war die Substanz um den Faktor 3 wirksamer als 4- Hydroperoxycyclophosphamid (HOOCP) . IC 50 (3) = 6,0 M, IC 50 (HOOCP) = 1 8,0 yM (jeweils 29h Inkubation).
N,N-Bis-{2-chlorethyl)phosphorsäurediamid-[4-(4-(2-(9-ac ridyl)amino- ethyl)amino-1-ethoxy-butoxy)benzyl]ester (Beispielverbindung 4)
A) N,N-Bis-(2-chlorethyl)phosphorsäurediamid-[4-((1 -ethoxy-4-benzcar- boxy)-butoxy)benzyl]ester (7)
Zu einer Suspension von 0,22 g (9, 1 7 mmol) Natriumhydrid in 1 2 ml abs. Toluol bei -25 °C tropft man eine Lösung von 3, 1 g (8,99 mmol) 4-Ethoxy-4-(4-hydroxymethylphenoxy)butylbenzoat(8) in 10 ml abs. Toluol. Nach vollständiger Zugabe rührt man noch 2,5 h bei -20°C bis -25 °C und kühlt anschließend auf -40°C ab.
Die -40°C kalte Alkoholatsuspension wird unter Schutzgasatmosphä¬ re zu einer auf -35 °C gekühlten Lösung von 2,37 g (9, 1 7 mmol) N,N- Bis-(2-chlorethyl)phosphorsäureamiddichlorid in 20 ml abs. Toluol gegeben. Man rührt 4 h bei Temperaturen zwischen -35 °C und -1 5°C.
Nach Erwärmen auf -10°C leitet man 45 min lang trockenes Ammo¬ niakgas durch den Ansatz und erwärmt danach auf Raumtemperatur. Nach Verdünnen mit 1 50 ml Ethylacetat wird vom Unlöslichen abge- nutscht und das Filtrat eingeengt. Der Rückstand wird in wenig
Dichlormethan/Aceton = 1 + 1 aufgenommen und an einer Kiesel¬ gelsäule mit Dichlormethan/Aceton = 1 + 1 gereinigt. Verbindung 8 wird aus Verbindung 5 und Benzoesäure-(4,4-diethoxy- butyDester (9) analog der bei Beispielverbindung 1 beschriebenen Umsetzungen hergestellt. Verbindung 9 ist aus 1 ,4-Butandiol über übliche Methoden zugänglich: 1 . Umsetzung einer OH-Gruppe im 1 ,4- Butandiol mit Benzoylchlorid; 2. Oxidation der zweiten OH-Gruppe mit Pyridiniumchlorochromatzum Aldehyd; 3. Herstellung des Diethylace- tals 9 aus dem Aldehyd (analog Roelofsen und van Bekkum (1 972)).
B) N,N-Bis-(2-chlorethyl)phosphorsäurediamid-[4-( 1 -ethoxy-4-((2-amino- ethyl)amino)butoxy)benzyl]ester (10) Zunächst wird der Benzoylrest in Verbindung 7 mit gesättigter metha¬ nolischer Ammoniak-Lösung abgespalten. Dann wird die nun freie OH-Funktion mit Methansulfonsäurechlorid als Methansulfonsäure- ester aktiviert und mit 1 ,2 Diaminoethan zu Verbindung 10 umge¬ setzt (analog Palmer et al. (1 990)).
C) N,N-Bis-(2-chlorethyl)phosphorsäurediamid-[4-(4-(2-(9-acrid yl)amino- ethyl)amino-1 -ethoxy-butoxy)benzyl]ester
1 20 mg (0,25 mmol) Verbindung 10 werden in 2, 1 ml abs. Methanol gelöst. Dazu gibt man 63 mg (0,3 mmol) 9-Methoxyacridin (Herstel¬ lung nach Lehmstedt ( 1 935)) und rührt 26 h bei Raumtemperatur. Der Ansatz wird vom Lösemittel befreit, 6 mal mit je 0,75 ml Diethyl- ether gewaschen und anschließend im Hochvakuum getrocknet. Man erhält 93 mg (56%, 0, 14 mmol) hygroskopische orangenfarbene
Kristalle.
CHN-Analyse: C 32 H 42 CI 2 N 5 O 4 P MG: 662,61 ber.: C: 58,0% H: 6,4% N: 10,6% gef.: C: 57,6% H: 6, 1 % N: 1 1 ' 0%
Beispielverbindung 4
Daten zur in vitro Aktivität: Im Sulforhodamin-B-Assay an der Mammacarci- nomzellinie MCF-7 war die Substanz um den Faktor 5 wirksamer als 4- Hydroperoxycyclophosphamid (HOOCP). IC 50 (4) = 3,7 μU, IC 50 (HOOCP) = 1 8,0 vM (jeweils 29h Inkubation).