COMPUESTOS CON ACCIóN ANTINEOPLáSICA Y COMPOSICIONES FARMACéUTICAS QUE LOS CONTIENEN.

Campo de Ia técnica La presente invención se encuadra dentro del campo de Ia farmacología molecular y en concreto con Ia oncología, específicamente con compuestos químicos obtenidos por modelación molecular in silico con acción citotóxica y efecto antitumoral al bloquear el sitio de fosforilación descrito para los sustratos de Ia enzima Caseína Kinasa 2 (CK2) mediante interacción directa o indirecta y las composiciones farmacéuticas que los contenga.

Estado de Ia técnica anterior

La CK2 es una enzima serina/treonina que está involucrada en el incremento de Ia proliferación celular y su localización intracelular es fundamentalmente nuclear durante el proceso de transformación maligna (Tawfic S., Yu S., Wang H., Faust R., Davis A., Ahmed K. (2001) Protein kinase CK2 signal in neoplasia. Histol. Histopathol. 16:573-582). Así mismo, algunas proteínas virales claves en Ia patogenia del Virus de Ia Inmnunodeficiencia Humana (VIH) y del Virus de Ia Hepatitis C (VHC) han sido reportadas como sustratos para CK2 (Meggio F., Marín O., Boschetti M., Samo S., Pinna LA. (2001) Mol CeII Biochem 227:145-151 ; Franck N., Le Seyec J., Guguen-Guillouzo C ₁ Erdtmann L. (2005) Hepatitis C virus NS2 protein is phosphorylated by the protein kinase CK2 and targeted for degradation to the proteasome. J Virol. 79:2700-2008) Hallazgos de diferentes grupos en el mundo han confirmado Ia existencia de niveles elevados de CK2 en diversos tumores sólidos de origen epitelial en ordenes entre 3 y 7 veces respecto al tejido normal (Tawfic S., Yu S., Wang H., Faust R., Davis A., Ahmed K. (2001) Protein kinase CK2 sígnal in neoplasia. Histol Histopatol. 16:573- 582; Faust R.A., Gapany M., et al (1996) Elevated protein kinase CK2 activity in chromatin of head and neck tumors: association with malignant transformation. Cáncer Letters 101 :31-35), además de que Ia actividad de fosforilación por esta enzima es un evento celular importante en Ia transformación maligna y constituye un marcador de progresión del tumor (Seldin D.C., Leder P. (1995) Casein Kinase llα transgene-induced murine lymphoma: relation to theileroiosis in cattle. Science

267:894-897). Por otro lado, Ia sobre-expresión de CK2 en animales trangénicos conlleva a Ia tumorigenesis de las glándulas mamarias a través del incremento de Ia cascada de señalización Wnt/beta-catenina en las células epiteliales mamarias (Landesman-Bollag E., Romien-Mourez R., et al (2001) Protein Kinase CK2 in mammary gland tumorigenesis. Oncogene 20:3247-3257). Hallazgos recientes han sugerido también que Ia enzima CK2 juega un papel esencial en procesos como Ia remodelación de Ia cromatina (Barz T., Ackenmann K., Dubois G., EiIs R., Pyerin W. (2003) Genome-wide expression screens indícate a global role for protein kinase CK2 in chromatin remodeling. J Cell Sci. 116:1563-1577) y el mantenimiento de Ia viabilidad celular (Unger G. M., Davis A.T., Slaton J.W., Ahmed K. (2004) Protein kinase CK2 as regulador of cell survival: implications for cáncer therapy. Curr Cáncer Drug Targets, 4:77-84). Así mismo, de connotada implicación para el proceso de desarrollo del cáncer han sido los hallazgos que demuestran que Ia fosforilación mediada por CK2 constituye una señal fuerte para la protección frente al fenómeno de apoptosis, razón por Ia cual se considera esta enzima como un mediador antiapoptótico en Ia fisiología celular (Ahmed K., Gerber D. A., Cochet C. (2002) Joining the cell survival squad: an emerging role for protein kinase CK2. Trends Cell BIoI, 12:226-229; Torres J., Rodríguez J., et al (2003) Phosphorylation- regulated cleavage of the tumor suppressor PTEN by caspase-3: ¡mplicatíons for the control of protein stability and PTEN-protein interactions. J BIoI Chem, 278:30652- 60).

Sobre Ia base de los hallazgos anteriormente descritos se confirma que Ia fosforilación mediada por CK2 es un evento bioquímico que constituye un blanco potencial para Ia intervención terapéutica del cáncer y que inhibidores de tal evento, pueden constituir candidatos con perspectivas para el tratamiento de esta entidad. Hasta el momento diferentes grupos en el mundo han desarrollado estrategias para inhibir Ia fosforilación mediada por CK2 con el uso de dos acercamientos experimentales: a) La inhibición directa de Ia enzima, o b) El bloqueo del sitio de fosforilación dentro del dominio acídico descrito para los sustratos de CK2. En ambos procedimientos, los autores han demostrado el concepto de que Ia inhibición del evento de fosforilación mediado por esta kinasa conlleva a Ia inducción de apoptosis de células tumorales lo cual constituyen resultados de validación experimental de CK2 como blanco de interés en el desarrollo de fármacos para el tratamiento del cáncer.

Por ejemplo, un inhibidor directo de Ia enzima como es el 4, 5, 6, 7- tetrabromobenzotriazole (TBB) ha sido probado como inductor de apoptosis y de degradación dependiente de caspasas en células JurKatt en el rango de concentración micromolar (Ruzzene M., Penzo D., Pinna L. (2002) Protein kinase CK2 inhibitor 4,5,6,7-tetrabromobenzotriazole (TBB) induces apoptosis and caspase-dependent degradation of haematopoietic lineage cell-specific protein 1 (HS1) in Jurkat cells. Biochem J., 364:41-47). Así mismo, mediante Ia inhibición de Ia expresión de Ia enzima empleando oligonucleotidos antisentido se ha demostrado un efecto apoptótico in vitro, así como acción antitumoral en un modelo experimental de cáncer en ratones (Guo C ₁ Yu S., et al. (2001) A potential role of nuclear matrix- associated protein kinase CK2 in protection against drug-induced apoptosis ¡n cáncer cells. J Biol Chem, 276:5992-5999; Slaton J.W., et al. (2004) Induction of apoptosis by antisense CK2 in human prostate cáncer xenograft model. Mol Cáncer Res. 2:712-721). Otros inhibidores del sitio de unión al ATP han sido descritos para Ia CK2 entre los cuales se encuentran derivados de antraquinonas, flavonoides y compuestos derivados del azabenzimidazol halogenado (Sarno S., et al. (2002) Toward the rational design of protein kinase casein kinase-2 inhibitors. Pharmacol Therapeutics 93:159-168). De igual forma se ha reportado Ia identificación de un inhibidor selectivo de Ia CK2 mediante enlazamiento molecular de alto flujo que resulto ser el acido 5-oxo-5,6-dihidroindolo(1,2-a)quinazolin-7-yl=acético (IQA) (Vangrevelinghe E., et al. (2003) Biochemical and three-dimensional-structural study of the specific inhibition of protein kinase CK2 by [5-oxo-5,6-dihydroindolo-(1 ,2- a)quinazolin-7-yl]acetic acid (IQA). J Med Chem. 46:2556-2662). Tales compuestos han mostrado su efecto inhibitorio de Ia actividad enzimática in vitro en valores de Concentración Inhibitoria 50 (CI50) en el rango micromolar sin embargo, no se han reportado evidencias de eficacia antitumoral in vivo de dichos inhibidores de CK2 en modelos experimentales de cáncer.

El otro acercamiento descrito para interferir el proceso de fosforilación mediado por CK2 ha sido mediante el bloqueo del sitio de fosforilación dentro del dominio acídico encontrado en los sustratos de esta enzima. En Ia solicitud de patente WO 03/054002 y el trabajo de Perea S. E., et al. (2004) Antitumor effect of a novel proapoptotic peptide impairing the phosphorylation by the protein kinase CK2. Cáncer Res. 64:7127-7129, se limitan a proponer el uso de una familia de péptidos cíclicos que bloquean Ia fosforilación del sustrato de CK2 in vitro y muestran

citotoxicidad en células tumorales y efecto antitumoral en modelos preclínicos de cáncer. Sin embargo, los péptidos descritos en esos reportes presentan Ia limitante de que no son capaces de penetrar por si solos al interior de Ia célula necesitando así de Ia fusión con otro tipo de péptido con capacidad intrínseca permeable. En general, los péptidos comparados a moléculas pequeñas poseen problemas con Ia estabilidad ¡n-vivo dentro de Ia circulación, así como con su administración oral y/o penetración celular, aspectos en los cuales las moléculas pequeñas los superan (Ludger Wess, Isogenica: Improving peptides, Biocentury Octubre 25, 2004). Otras limitantes de las formas peptidicas como terapéuticos Io constituye su rápido aclaramiento así como su potencial capacidad inmunogénica y el costo económico por dosis terapéutica, generalmente superior a los fármacos.

Explicación de Ia invención.

Teniendo en cuenta las limitaciones potenciales de los péptidos cíclicos descritos como posibles agentes terapéuticos Ia presente invención describe, en efecto, por primera vez moléculas químicas que inhiben Ia fosforilación mediante interacción directa o indirecta con el sitio de fosforilación de los sustratos para CK2, así como Ia inducción de citotoxicidad y efecto antitumoral en modelos experimentales de cáncer. Los compuestos químicos de Ia invención tienen una estructura que les permite cumplir con uno o varios de los siguientes requerimientos:

A: provoca Ia unión de los compuestos al dominio de fosforilación o su entorno en el sustrato de Ia CK2, bloqueando directa o indirectamente Ia unión de Ia enzima al sustrato. B: provoca Ia unión de los compuestos al dominio de fosforilación del sustrato de Ia

CK2, permitiendo Ia unión de Ia enzima pero bloqueando directa o indirectamente Ia transferencia del grupo fosfato a Ia serina fosfoaceptora.

C: provoca Ia unión de los compuestos a Ia proteína sustrato de Ia CK2, provocando un cambio conformacional en el dominio de fosforilación, su entorno o ambos, de forma directa o indirecta que impide Ia unión de Ia CK2 o Ia transferencia del grupo fosfato a Ia serina fosfoaceptora.

De esta forma estos compuestos se caracterizan fundamentalmente por su capacidad de inhibición del evento bioquímico de fosforilación mediado por CK2.

En una realización particular, Ia invención se refiere a moléculas químicas las cuales presentan una estructura química definida por Ia ocurrencia, en cualquier parte de Ia molécula, de manera consecutiva de los siguientes elementos, con las características de hibridación señaladas, enlazados entre sí, agrupados en las siguientes cinco clases estructurales:

I. N-[C(sp2)]i _A3 -N

II. N-[C(sp2)]i _l2 -[C(sp3)] _{1 l2l} 3-N

III. N-[C(SpS)]L ₂₁₃ -N

IV. N-C(SpZ)-[C(SpS)I ₁ , ₂ -C(sp2)-N

V. N-C(sp3)-[C(sp2)]i, ₂ -C(sp3)-N

Compuestos pertenecientes a estas clases estructurales se muestran a continuación:

1.

,5,5-tr¡methylcyclohex-2-en-1-one sem¡carbazone

2.

m¡no-2,6-dihydroxypyrim¡din-5-yl)-W-¡sopropylth¡ourea

3.

-λ/'-(2-furylmethyl)urea

4.

arboxyethyl)amino]carbonyl}am¡no)propano¡c ac¡d

5.

loroethyl)-3-(cyanomethyl)urea

6.

(1/-/-indol-3-yl)acetone th¡osemicarbazone

7.

'-phosphoryltrihydrazinecarboxamide

8.

1-phenylhex-4-en-1-one semicarbazone

9.

¡oxoimidazolidin-4-yl)-3-(hydroxymethyl)urea

10.

11.

utyl-3-(2-chloroethyl)urea

loroethyl)-3-(1 -methyl-1 -phenylethyl)urea

13.

loroethyl)-3-[1,1-d¡methyl-2-(methylsulfonyl)ethyl]urea

14.

no-λ/-benzyl-2-(formylam¡no)-3-¡minopropanam¡de

15.

phenoxyacetone thiosem¡carbazone

16.

inoacetyl)am¡no]acetyl}amino)acetyl]am¡no}acetic ac¡d

17.

nzyloxy)carbonyl]am¡no}acetyl)(methyl)amiπo]acet¡c acid

18.

romopropanoyl)amino]acetyl}am¡no)acetic acid

19.

dithiosem¡carbazone

20.

minopropanoyl)am¡no]acetyl}amino)acetic acid

21.

luoro-3-(trifluoromethyl)phenyl]amino}acetohydrazide

22.

odophenyl)amino]acetohydrazide

23.

ihydroxypropyI)-2-(2-n¡tro-1W-im¡dazol-1-yl)propanamide

24.

minoacetyl)amino]acetyl}amino)pentano¡c acid

25.

1 ,2-dithioxoethane-1 ,2-d¡yl)düm¡no]d¡acet¡c acid

26.

,NH ,NH

H ₂ N' "NH ' NH ₂

^C 33426

λ/-(2-am¡noethyl)-λ/ ¹ -{2-[(2-am¡noethyI)am¡no]ethyl}ethane-1,2-d¡am¡ne

27.

1 ,4-dichlorobutane-2,3-diyl)d¡methanesulfonamide

28.

29.

hydroxypyr¡midin-5-yl)sulfamic acid

30.

¡oxo¡midazolid¡n-4-yl)-λ/-[3-(tr¡fluoromethyI)phenyl ]methanesulfonamide

31.

roxyethyl)¡son¡cot¡nohydraz¡de

32.

ichIorobenzyl)th¡o]-6-hydroxypyr¡m¡dine-4-carboxyl¡c acid

33.

o-λ/-ben2ylpropanamide

34.

ysuccinohydraz¡de

35.

o-4-{[(benzyloxy)carbonyl]amino}-4-oxobutano¡c acid

36.

(phenyl)methyl]am¡no}benzamide

37.

S-(2-im¡no-2-{[2-(1-methyl-1H-benzimidazol-2-yl)ethyI]am ¡no}ethyl) hydrogen thiosulfate

38.

o-6-[(2-hydroxypropyl)amino]-5-nitropyrim¡d¡n-4-ol

39.

40.

(2-hydraz¡no-2-oxoethyl)-1 H-pyrrole-3-carboxylate

Estas moléculas fueron descritas para esta función mediante el modelado molecular exhaustivo del sitio de fosforilación consenso definido para esta enzima. (Meggio F.,

Pinna L.A. (2003) One-thousand-and-one sustrates of protein kinase CK2. The

FASEB J. 17:349-368) su validación por enlazamiento molecular a Ia proteína CK2 y el posterior análisis por acoplamiento molecular masivo de una base de datos de diversidad química generada en nuestro laboratorio conteniendo aproximadamente un millón doscientos mil compuestos.

La invención también incluye cualquier variante homologa de los compuestos anteriores. Se entiende por variante homologa a cualquier molécula de naturaleza química similar o no a los aquí descritos, cuya estructura permita realizar el mismo efecto de los compuestos aquí descritos, y su resultado sea inhibir Ia fosforilación de los sustratos de CK2.

En otra realización preferida de Ia invención, Ia composición farmacéutica contiene uno o más de los compuestos químicos o sus sales farmacéuticamente aceptables, así como excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables. También es parte de Ia presente invención el uso de los compuestos químicos, para Ia manufactura de medicamentos para Ia inhibición de Ia proliferación de células tumorales in vitro, in vivo o en dispositivos asociados al cuerpo y para el tratamiento del cáncer en seres vivos y otras enfermedades donde Ia CK2 posea un papel patológico. Las moléculas químicas descritas se definieron por su capacidad de inhibir Ia fosforilación de Ia secuencia mínima de aminoácidos S/T-X-X-E/D siendo X preferiblemente algún aminoácido diferente del tipo Usina o Arginina, aunque no se descartan otras proteínas, que no poseen esta secuencia consenso pero que también son fosforiladas por CK2, unen este tipo de compuestos y su fosforilación se ve inhibida por ellos. Para Ia definición de los compuestos químicos descritos en Ia invención se realizó el modelado molecular exhaustivo del sitio de fosforilación consenso descrito para esta enzima (Meggio F., Pinna L.A. (2003) One-thousand-and-one sustrates of protein kinase CK2. The FASEB J. 17:349-368) su validación por enlazamiento molecular a Ia proteína CK2 y el posterior análisis por acoplamiento molecular masivo de una base de datos de diversidad química generada en nuestro laboratorio, conteniendo un millón doscientos mil compuestos. Los compuestos con valores calculados de energía de unión por encima de Ia media se seleccionaron como positivos para el primer ciclo, aplicándoles una segunda ronda de acoplamiento con valores más restrictivos de selección, y fueron analizados para extraer las regularidades estructurales, Ia estructura química de los compuestos seleccionados en el segundo ciclo fue optimizada para obtener valores mayores de energía de unión calculada. Tales compuestos fueron sintetizados, purificados utilizando Cromatografía Liquida, luego analizados por Espectrometría de Masas y Resonancia Magnético Nuclear así como Espectrofotometría Infrarroja y finalmente evaluados en cuanto a su efectividad in vitro e in vivo. De acuerdo con esta invención, los compuestos químicos descritos son igualmente eficaces en cuanto a su capacidad de inhibir el evento de fosforilación por CK2. Los compuestos químicos descritos en Ia presente invención producen citotoxicidad de una manera dosis-dependiente en células tumorales de origen humano sin necesidad de acoplamiento a vehículos de penetración ¡ntracelular. Estas

evidencias se corresponden con hallazgos previos que demuestran que las moléculas químicas son capaces por si solas de penetrar al interior de Ia célula e interactuar con sus respectivos blancos (Meggio F, Pagano MA, Moro S, Zagotto G, Ruzzene M, Samo S ₁ Cozza G, Bain J, Elliott M, Deana AD, Brunati AM, Pinna LA (2004) Inhibition of protein kinase CK2 by condensed polyphenolic derivatives. An in vitro and ¡n vivo study. Biochemistry. 43:12931-12936). De igual forma resulta de interés que los valores de CI50 encontrados para los compuestos químicos de Ia invención en los ensayos de citotoxicidad in vitro se encuentran en el rango nanomolar. Estos resultados demuestran una mayor eficacia anticelular de los compuestos químicos descritos en Ia invención respecto a los péptidos cíclicos previamente descritos como inhibidores del dominio de fosforilación de CK2. En concordancia con los resultados in vitro, los compuestos químicos de Ia presente invención ejercen un potente efecto antitumoral cuando estos se administran tanto por vía sistémica como localmente. De igual forma, se demostró que los compuestos químicos de Ia invención ejercen un efecto antitumoral en dosis tan bajas como 0.5 y 2 mg/Kg, Io cual representa una reducción de 10 a 20 veces de Ia dosis a Ia cual los péptidos cíclicos descritos anteriormente logran un efecto similar.

Breve descripción de las Figuras: Figura 1 : Efecto antitumoral de compuestos químicos en modelos de tumores humanos implantados en ratones

Exposición detallada de modos de realización / Ejemplos

La presente invención se explica a través de los siguientes ejemplos de realización:

Ejemplo 1 : Selección de los compuestos mediante modelación molecular in silico.

Mediante el uso del modelo computacional desarrollado a partir del acoplamiento molecular masivo se seleccionaron un grupo de compuestos basados en una alta energía de interacción calculada para el complejo ligando receptor como se muestra en Ia tabla siguiente. Esta energía aproximada se estima teniendo en cuenta un análisis exhaustivo de Ia conformación y de los componentes energéticos utilizando un programa computacional desarrollado en nuestro laboratorio. Tabla 1: Energías de interacción calculadas para el complejo ligando-receptor

Ejemplo 2: Efecto de los compuestos químicos descritos sobre Ia fosforilación de un sustrato típico de CK2.

Este ensayo consiste en una reacción de fosforilación in vitro donde se uso como sustrato Ia oncoproteína E7 del Virus Papiloma Humano tipo 16 (VPH-16) expresada en E. CoIi como proteína de fusión a Glutation S-Transferasa (GST). Posteriormente, Ia E7-GST se purificó por cromatografía de afinidad usando Glutation-Sefarosa (Pharmacia). Antes de Ia reacción enzimática, Ia E7-GST fue preincubada con diferentes concentraciones de los compuestos químicos mencionados en Ia invención durante una hora a 37 ⁰ C. La mezcla de reacción se realiza en 50 μl de buffer Tris:HCL 25 mM pH 7.5, 1 μCi de ³² P- γATP, 100 μM ATP, 40 μl de Ia resina que contiene E7-GST, 0.2 M NaCI , 10 mM MgCI y 1 unidad de Ia

enzima CK2 (Promega). La reacción se incuba a 37 ⁰ C durante 40 minutos. Seguidamente se realizan tres lavados de Ia resina con 0.5 mi del buffer de reacción y finalmente el nivel de fosforilación de Ia E7-GST es analizado en una electroforesis PAGE al 10%. La visualización de Ia proteína fosforilada se realizó mediante el revelado de placas de rayos X previamente expuestas con el gel seco. La cuantificación de Ia fosforilación de E7 se realizó mediante análisis de densitometría de las respectivas placas. Los valores de CI50 se estimaron a partir de las respectivas curvas dosis-efecto. La CI50 representa Ia concentración que inhibe el 50% de Ia actividad enzimática. Paralelamente se incluyó como control de comparación en el ensayo el péptido cíclico P15 reportado como inhibidor del sitio de fosforilación de los sustratos de CK2. Los resultados observados en Ia Tabla 2 indican que los diferentes compuestos químicos descritos en esta invención son inhibidores efectivos de un sitio de fosforilación típico de Ia CK2 según los valores de CI50 observados. Resulta interesante el hecho de que las moléculas químicas descritas en Ia invención muestran mayor capacidad inhibitoria respecto al péptido cíclico reportado previamente como inhibidor del sitio de fosforilación de CK2 que solamente ejerce su efecto inhibitorio en el rango micromolar. Tabla 2: Efecto inhibitorio de Ia fosforilación de un sustrato típico de CK2

Ejemplo 3: Efecto de los compuestos químicos descritos sobre el sitio consenso de fosforilación de Ia CK2.

Este ensayo consiste en una reacción de fosforilación in vito donde se usó como substrato Ia secuencia RRREEETEEE que representa el dominio consenso optimizado para Ia fosforilación por CK2. Previo a Ia reacción de fosforilación, el péptido sustrato se incubo durante una hora a 37 ⁰ C con los diferentes compuestos químicos descritos en Ia invención. Seguidamente, Ia mezcla de reacción se realizó en 50 μl de buffer Tris: HCL 25 mM pH 7.5, 1 μCi de ³² P- γATP, 100 μM ATP, 2 mg/ml del péptido substrato, 0.2 M NaCI, 10 mM MgCI y 1 unidad de Ia enzima CK2 (Promega). La reacción se incubó a 37 ⁰ C durante 10 minutos. Seguidamente se aplicaron 5 μl de Ia reacción en papel de filtro Whatmann PE-81 y se realizaron cuatro lavados con 10 mM de H ₃ PO ₄ Finalmente se midió Ia radiactividad asociada al papel de filtro y Ia cantidad de cpm por muestra refleja directamente Ia actividad enzimática de CK2. Paralelamente se incluyó como control de comparación en el ensayo el péptido cíclico P15 reportado como inhibidor del sitio de fosforilación de los sustratos de CK2. Los valores de CI50 que corresponden al efecto inhibitorio fueron estimados de las respectivas curvas dosis-efecto. La CI50 representa Ia concentración que inhibe el 50% de Ia actividad enzimática. Los resultados de este ejemplo plasmados en Ia Tabla 3, demostraron que los compuestos químicos mencionados en esta invención inhiben eficientemente Ia fosforilación del sustrato de CK2 in vitro según los valores de CI50 observados. Además, estos resultados indicaron una mayor eficacia inhibitoria de las moléculas químicas reportadas en Ia invención respecto al péptido cíclico previamente reportado como inhibidor del sitio de fosforilación de CK2.

Tabla 3: Efecto de los compuestos químicos descritos sobre el sitio consenso de fosforilación de la CK2

Ejemplo 4: Efecto de los compuestos químicos de Ia presente invención sobre células tumorales humanas.

Para este ensayo, las células H-125 procedentes de un Carcinoma de Pulmón humano a Células No Pequeñas (NSCLC) se sembraron en placas de 96 pocilios (Costar) a una densidad de 2x10 ⁴ células/ml en medio Dulbecco (DMEM) (Gibco) suplementado con Suero Fetal Bovino (Gibco). Al cabo de 24 horas, los compuestos químicos descritos en Ia presente invención se adicionaron al medio de cultivo en un rango de dosis comprendido entre 0.5 y 100 nM. La incubación fue realizada por espacio de 72 horas a 37 ⁰ C en presencia de CO ₂ al 5% y al término de Ia misma se adicionaron 20 μl de una solución de MTS 1.90 mg/ml. Las placas se mantuvieron 1

hora adicional en las mismas condiciones de incubación y finalmente se realizó Ia lectura de Ia absorbancia a 492 nm. Los resultados son mostrados como porciento de crecimiento de los controles sin compuestos químicos y los valores de IC50 fueron calculados a partir de las respectivas curvas de dosis-respuesta (Tabla 4). Los resultados obtenidos en este ensayo demuestran que los compuestos químicos de Ia presente invención tienen efecto citotóxico sobre células tumorales en cultivos in vitro. Además, se demuestra Ia superioridad de tales compuestos en cuanto a Ia eficacia citotóxica respecto al péptido cíclico P15 previamente descrito como inhibidor del sitio fosforilable de los sustratos de CK2. Tabla 4: Efecto de los compuestos químicos sobre células tumorales humanas

Ejemplo 5: Efecto antitumoral de los compuestos químicos de Ia invención en modelos de tumores humanos implantados en ratones atímicos.

En estos ensayos se utilizaron ratones desnudos BaIbC de sexo femenino entre 6 y 8 semanas de nacidos. Para Ia implantación del tumor en este modelo se inocularon 5 000 000 de células H-125 resuspendidas en 250 μl de PBS en Ia región dorsal de los animales. Una vez que los tumores fueron palpables con un volumen alrededor de 50 mm ³ , se realizó Ia administración directa de 200 μg de los compuestos C32425, C33426 y C33427 de manera consecutiva durante 5 días. Como se puede observar en Ia Figura 1 , Ia administración de los compuestos químicos es capaz de producir una respuesta antitumoral significativa. Estos resultados evidencian Ia eficacia antitumoral de moléculas químicas inhibidoras del sitio de fosforilación de Ia CK2 en un modelo relevante de Ia oncología experimental.