FRUTO DE CAMU CAMU

D E S C R I P C I Ó N

La presente invención se refiere un producto antioxidante obtenido a partir de frutos de camu camu (Myrciaria dubia). Por tanto, la invención se podría encuadrar en el campo de la industria alimentaria y de la industria farmacéutica y cosmética.

ESTADO DE LA TÉCNICA

El camu camu (Myrciaria dubia (H.B.K.) Me Vaugh es una fruta nativa de la Amazonia en Colombia, Venezuela, Perú y Brasil, caracterizada por su alto contenido en ácido ascórbico, que supera significativamente a cítricos como el limón o la naranja (hasta 50 veces más), con valores en torno a los 9-50 g/kg. Por otro lado, el camu camu también contiene una alta concentración de polifenoles que recientemente han recibido mucha atención debido a su actividad antioxidante y habilidad inhibidora de radicales libres con implicaciones beneficiosas para la salud humana. Los radicales libres son responsables de muchas enfermedades degenerativas, muerte celular y cáncer.

Los antioxidantes naturales son muy valorados porque se pueden emplear en el diseño de alimentos benéficos para la salud. Estudios epidemiológicos sugieren que una dieta rica en frutas y vegetales está relacionada con una reducción de la incidencia de enfermedades cardiovasculares, cáncer y algunos desórdenes degenerativos producidos por un exceso de radicales libres.

En los últimos años se ha despertado un gran interés por los antioxidantes naturales. La industria alimentaria los emplea porque retrasan la oxidación de lípidos y, por lo tanto, mejoran la calidad nutricional de los alimentos. Asimismo, los antioxidantes poseen propiedades beneficiosas para la salud, entre las que cabe destacar la prevención de las enfermedades coronarias y el cáncer. Por último, se emplean en la industria cosmética como ingredientes naturales activos. (Káhkónen et al. Antioxidant activity of plant extracts containing phenolic compounds. J Agrie. Food Chem. 1999. 47, 10:3954-62 y Crispo et al., Protective effeets of polyphenolic compounds on oxidative stress-induced cytotoxicity in PC12 cells, Can.J.Physiol.Pharmacol., 2010, 88:429-438).

Asimismo, la obtención de nuevos metabolitos de origen vegetal con propiedades antioxidantes resulta también de máximo interés, en la industria química, de los polímeros o de la energía.

Sin embargo, la estabilidad tanto del ácido ascórbico como de los polifenoles se puede ver afectada por el proceso de manufacturación. Además, el procesamiento de los frutos tiene obviamente también consecuencias en las propiedades organolépticas de los productos obtenidos. Por ejemplo el estudio de Ramos Alvarado (Revista Amazónica de Investigación Alimentaria, 2002, v. 2, n° 2, p89-99) describe diversos procedimientos de conservación y concentración y sus efectos en la concentración de vitamina C de los productos obtenidos así como sus propiedades organolépticas.

Dada la complejidad de la matriz del fruto camu camu y la vida útil del fruto fresco, sigue habiendo necesidad de procedimientos para la obtención de productos que conserven el máximo de compuestos bioactivos.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención trata de un proceso para la obtención de un producto antioxidante de frutos camu camu, preferiblemente en forma de polvo, que conserva altas concentraciones de ácido ascórbico, polifenoles y proantocianidinas. La invención también se refiere a la composición que comprende el producto antioxidante obtenido.

La presente invención presenta las siguientes ventajas:

- El fruto camu camu se recoge en el estado de maduración verde-pintón, minimizando los tiempos de cosecha y recolectando un fruto más firme que es más resistente en la recogida. Este estado de maduración facilita que el fruto no se dañe y pierda sus características fisicoquímicas durante el tiempo que tarde desde su recolección hasta su procesado,

- se aprovecha tanto la pulpa como la piel de los frutos, facilitando su tratamiento y extrayendo de forma eficaz los componentes bioactivos presentes en dichas partes de los frutos,

- el producto obtenido mediante el procedimiento descrito en la presente invención, así como la composición que lo comprende, presenta una concentración muy elevada de ácido ascórbico y polifenoles,

- asimismo, en dicha composición se conservan grandes cantidades de proantocianidinas,

- la composición obtenida tiene un grado de humedad muy bajo, por lo que es muy estable.

La diferencia entre el producto obtenido mediante el procedimiento de la presente invención y los frutos camu camu o los productos obtenidos de dicho fruto descritos en el estado de la técnica es el alto contenido en compuestos con capacidad antioxidante. Más concretamente el producto de la presente invención contiene cantidades de vitamina C y polifenoles (entre los que se encuentran las proantocianidinas) no descritas previamente, contribuyendo de esta manera al estado de la técnica con aspectos de alto interés en la industria alimentaria, farmacéutica y cosmética.

Por tanto, un primer aspecto de la presente invención se refiere a un procedimiento de obtención de un producto de frutos de Myrciaria dubia que comprende las siguientes etapas: a) Seleccionar frutos de Myrciaria dubia con un ratio de sólidos solubles/acidez de entre 1 ,40 y 2,30, es decir, en estado verde-pintón, b) eliminar las semillas de los frutos seleccionados en la etapa (a), c) secar los frutos sin semillas obtenidos en la etapa (b) a una temperatura menor de 60°C.

Un segundo aspecto de la presente invención se refiere a un producto obtenido por el procedimiento tal y como se ha descrito anteriormente.

Un tercer aspecto de la presente invención se refiere a una composición que comprende el producto tal y como se ha descrito anteriormente. Dicha composición puede ser una composición alimentaria, farmacéutica o cosmética.

Un cuarto aspecto de la presente invención se refiere al uso del producto o de la composición tal y como se han descrito anteriormente como antioxidante.

Un quinto aspecto de la presente invención se refiere al uso del producto o de la composición tal y como se han descrito anteriormente para la fabricación de una composición alimentaria.

Un sexto aspecto de la presente invención se refiere al uso del producto o de la composición tal y como se han descrito anteriormente para la fabricación de un medicamento. Por último, otro aspecto de la invención se refiere a al uso del producto o de la composición tal y como se han descrito anteriormente para la fabricación de un cosmético.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención.

Un primer aspecto de la presente invención se refiere a un procedimiento de obtención de un producto de frutos de Myrciaria dubia que comprende las siguientes etapas: a) Seleccionar frutos de Myrciaria dubia con un ratio de sólidos solubles/acidez de entre 1 ,40 y 2,30, es decir, en estado verde-pintón, b) eliminar las semillas de los frutos seleccionados en la etapa (a), c) secar los frutos sin semillas obtenidos en la etapa (b) a una temperatura menor de 60°C.

El fruto Myrciaria dubia es también conocido comúnmente como camu camu, camu-camu, camo camo, cagari o aragá de agua. El término "secado" puede emplearse indistintamente al término "deshidratación".

En una primera realización del primer aspecto de la presente invención, el ratio de sólidos solubles/acidez es de entre 1 ,60 y 2,20, preferiblemente 1 ,80 y 2. El ratio de sólidos solubles/acidez se determina mediante la medida de la cantidad de sólidos solubles totales y del pH de la solución o de los frutos:

- El pH se mide por ejemplo con un pHmetro (preferiblemente digital pero no necesariamente). En los frutos camu camu, a mayor madurez menor contenido en ácidos.

- Los sólidos solubles totales (porcentaje o grados Brix) se pueden medir por refractometría. A mayor concentración de sólidos solubles totales mayor índice de refracción de la luz, de forma proporcional. La medida con el refractómetro muestra el porcentaje de concentración de los sólidos solubles (porcentaje Brix) contenidos en una muestra (por ejemplo en una solución de agua). El contenido de los sólidos solubles es el total de todos los sólidos disueltos en el agua, incluso el azúcar, las sales, las proteínas, los ácidos, etc., y la medida leída es el total de la suma de éstos. En la presente invención, el porcentaje Brix (%) se calibra a la cantidad de gramos de azúcar contenidos en 100g de solución de azúcar. Con soluciones que contienen otros componentes además de azúcar, es necesario recurrir a una tabla de conversión que proporcione la concentración exacta de azúcar o de otro compuesto que desee medirse por medio del porcentaje Brix. Se puede usar por ejemplo un refractómetro Abbe, se mide la actividad acuosa (relación que existe entre la presión de vapor de un alimento dado en relación con la presión de vapor del agua pura a la misma temperatura) y la acidez (% ácido cítrico) con una solución de NaOH (0, 1 M).

Sin embargo hay otros métodos para determinar el estado de maduración de interés del camu camu, por ejemplo pero sin que sirva de limitación:

- Color de la piel: El cambio de color de verde a rojo indica que se acumular compuestos que hacen más apetecible el fruto para su consumo (estrategia ecológica para la dispersión de las semillas por medio de su consumo por animales; zoocoria). Para detectar este cambio se pueden utilizar aparatos como el colorímetro Hunter. El estado conocido como verde-pintón en la piel también se puede describir como el estado en el que la maduración, basada en la coloración rojiza de la cara externa de los frutos, es de un 20%-30% de media de la superficie total media de los frutos. Se puede realizar comparando el color de fondo del fruto con el de la tabla colorimétrica estándar de colores típicos de la variedad de camu camu o emplear colorímetro.

- Color y aspecto de las semillas: La medida del color y del aspecto de las semillas de camu camu puede servir para determinar el estado de madurez óptimo para obtener el producto de la invención. Es conocido que las semillas van a ir protegiéndose de capas de tejido que generalmente se oscurecen con el avance de la maduración, con el objeto de que el embrión desecado contenido en las semillas quede protegido frente a los ácidos del estómago de los animales que lo ingieren.

- Medida de la capacidad de desprendimiento del fruto: si el fruto se desprende fácilmente es que está maduro. A mayor resistencia menor madurez. Mediante técnicas conocidas por el experto en la materia podría determinarse fácilmente la capacidad de desprendimiento del fruto del estado óptimo verde-pintón de la presente invención.

- Dureza de los frutos: puesto que a medida que el fruto madura las sustancias pépticas se degradan, esto ocasiona que el producto se ablande, así a mayor dureza menor maduración. Para valorar la dureza se utiliza un penetrómetro o texturómetro, con el penetrómetro se introduce una aguja gruesa con cierta presión en el fruto. - Otros índices químicos de madurez: mediante la medida de los gases internos por ejemplo por cromatografía de gases midiendo el CO2 o el etileno del fruto.

Los métodos para determinar la madurez son preferiblemente el ratio de sólidos solubles/acidez y el color de la piel.

En otra realización preferida del primer aspecto de la presente invención, la etapa (b) comprende un aplastado de los frutos seleccionados en la etapa (a). El aplastado permite abrir el fruto y las semillas o pepitas se pueden extraer automática o manualmente.

En otra realización preferida del primer aspecto de la presente invención, en la etapa (c) los frutos se secan hasta tener un contenido de humedad de un 3% a 9% (es decir, el contenido de agua en el fruto seco está entre un 3% y un 9%), preferiblemente hasta tener un contenido de humedad de un 5% a un 7%. La etapa de secado se puede llevar a cabo por medio de técnicas conocidas por el experto en la materia que permitan deshidratar los frutos a temperaturas inferiores a 60°C. Por ejemplo por medio de deshidratación osmótica, mediante el que se emplean temperaturas de operación de entre 20-50°C; o por secado en lecho fluidizado. El secado se lleva a cabo preferiblemente a una temperatura entre 20 y 55°C y más preferiblemente entre 40 y 50°C. Este secado se lleva a cabo preferiblemente en lecho fluidizado. Esta etapa puede llevarse a cabo durante de 2 a 20 horas, preferiblemente de 5 a 15 horas. La humedad inicial del fruto antes secar es de 90% (es decir, que un 90% del fruto fresco es agua).

En otra realización preferida del primer aspecto de la presente invención, además hay una etapa (d) posterior a (c) de molienda. Posteriormente, puede haber una etapa (e) posterior a (d) de tamizado. El tamizado tiene por objeto separar las distintas fracciones de una mezcla obtenida en la molienda en función de su tamaño. El tamiz o malla consiste de una superficie con perforaciones uniformes por donde pasará parte del material y el resto será retenido. Dicho tamizado se lleva a cabo con una luz de malla de 0, 1 mm a 1 mm, preferiblemente de 0,2 mm a 0,8 mm. Estas etapas de molienda y tamizado permiten obtener un polvo fino que permite su uso en una gran variedad de aplicaciones.

El término molienda se refiere a la pulverización y/o a la desintegración del material sólido obtenido tras la etapa de secado. Mediante la molienda se reduce el volumen promedio de las partículas de una muestra sólida dividiendo o fraccionando la muestra por medios mecánicos hasta el tamaño deseado. Algunos de los métodos de molienda se llevan a cabo por impacto, frotamiento de cizalla o cortado.

En la presente invención se puede emplear el término "harina" para designar el producto obtenido de la molienda del producto secado, tamizado o no tamizado. En la presente invención se puede emplear el término "polvo" para designar el producto obtenido de la molienda del producto secado, tamizado. Preferiblemente se emplea el término harina para designar el producto obtenido de la molienda del producto secado, tamizado tal como se describe en un párrafo anterior.

En otra realización del primer aspecto de la presente invención, además hay una etapa de extracción de los componentes hidrosolubles en disolución con pH ácido, preferiblemente la disolución con pH ácido comprende un ácido tricarboxílico, y más preferiblemente el ácido tricarboxílico es ácido cítrico.

En esta etapa, de manera general, se mezcla la harina obtenida tras la molienda (tamizada o no tamizada) y se mezcla con una disolución con pH ácido, preferiblemente el pH ácido viene dado porque la disolución comprende ácido cítrico. Se agita la mezcla y posteriormente se deja decantar o se centrifuga para separar la fase líquida de la fase sólida. En otra realización del primer aspecto de la presente invención, la disolución que se ha obtenido en la etapa de extracción se liofiliza.

Un segundo aspecto de la presente invención se refiere a un producto obtenido por el procedimiento tal y como se ha descrito anteriormente, a partir de ahora el producto de la invención.

En una realización del segundo aspecto de la presente invención, el producto que se obtiene por el procedimiento tal y como se ha descrito anteriormente (menos con la etapa de extracción) comprende vitamina C en una concentración de entre 5 y 20 g/100g de producto, más prefenblemente entre 7 y 15 g/100g de producto. La vitamina C total es la suma del ácido ascórbico y del ácido dehidroascórbico.

En otra realización del segundo aspecto de la presente invención, el producto que se obtiene por el procedimiento tal y como se ha descrito anteriormente (menos con la etapa de extracción) comprende además vitamina C glucosilada en una concentración de entre 0,5 y 5 g/100 g de producto, preferiblemente entre 1 y 3 g/100 g de producto.

Por "vitamina C glucosilada" se entiende ácido ascórbico o ácido dehidroascórbico glucosilado, es decir, unido a un glúcido. Prefenblemente, la vitamina C glucosilada comprende un monosacáhdo, y más preferiblemente dicho monosacárido se selecciona de galactosa, glucosa y cualquiera de sus mezclas.

En otra realización del segundo aspecto de la presente invención, la vitamina C glucosilada se selecciona de AA-2G, AA-3G, AA-5G, AA-6G y cualquiera de sus mezclas. Por AA-2G, AA-3G, AA-5G y AA-6G se entienden tanto los isómeros α como los β. Por AA se entiende ácido ascórbico, el número indica el carbono del ácido ascórbico que comprende el átomo de oxígeno por el cual se forma en el enlace con el glucido, y la G representa el glucido, preferiblemente monosacárido y más preferiblemente galactosa o glucosa.

Es decir, por AA-2G se entiende un compuesto de fórmula I:

donde X representa un α-glúcido o un β-glúcido, preferiblemente un monosacárido y más preferiblemente galactosa o glucosa y aún más preferiblemente glucosa.

De la misma manera, AA-3G, AA-5g y AA-6G están representados por los compuestos de fórmula II, III y IV, respectivamente:

Estos derivados glucosídicos son un derivado de la vitamina C que forma más estable que la vitamina C, mejorando su actividad biológica. En otra realización del segundo aspecto de la presente invención, la vitamina C glucosilada comprende AA-2G.

Además el producto de la invención comprende preferiblemente polifenoles mayoritarios identificados en una concentración de entre 3500 y 5000 mg/100 g de producto, preferiblemente entre 3700 y 4250 mg/100g de producto. Los diferentes polifenoles que se encuentran en el producto de la invención comprenden flavonoles, derivados del ácido elágico (es decir, ácido elágino y glicósidos), elagitaninos, galotaninos y proantocianidinas.

Por "flavonoles" se entiende una clase de flavonoides que tienen como esqueleto a 3-hidroxiflavona (IUPAC: 3-hidroxi-2-fenilcroma-4-ona). Su diversidad se genera principalmente por las diferentes posiciones de los grupos OH fenólicos. Un ejemplo de flavonol sería la miricetina. El producto de la invención comprende preferiblemente flavonoles en una concentración de entre 0,5 y 3 mg/100 g de producto, más preferiblemente entre 1 y 2 mg/100 g de producto.

Por "derivados del ácido elágico" se entiende tanto el ácido elágico como sus derivados, principalmente sus derivados glucosilados. El ácido elágico está presente en las plantas también como elagitaninos, que es una clase de taninos hidrolizables formados mayoritariamente por pentagaloilglucosa, un éster de ácido gálico y glucosa. La diferencia entre elagitaninos y galotaninos radica en que en los elagitaninos los grupos galoil están unidos mediante enlaces C-C, mientras que en los galotaninos están unidos por enlace dépsido. El producto de la invención comprende preferiblemente derivados del ácido elágico en una concentración de entre 100 y 200 mg/100 g de producto, más preferiblemente entre 120 y 160 mg/100 g de producto. Además, el producto de la invención preferiblemente comprende elagitaninos en una concentración de entre 300 y 500 mg/100 g de producto, más preferiblemente entre 350 y 450 mg/100 g de producto y preferiblemente comprende galotaninos en una concentración de entre 10 y 70 mg/100 g de procuro, más preferiblemente entre 25 y 50 mg/100 g de producto.

Por proantocianidinas se entiende una clase de polifenoles, también llamados flavanoles. Los flavanoles incluyen compuestos como las catequinas y las catequinas galato. El producto de la invención preferiblemente comprende proantocianidinas seleccionadas de la lista que comprende catequina, catequina galato, galocatequina, epigalocatequina, epigalocatequina aducto y galocatequina galato, más preferiblemente las proantocianidinas son catequina, catequina galato, galocatequina, epigalocatequina, epigalocatequina aducto y galocatequina galato. En una realización preferida del segundo aspecto de la presente invención, el producto comprende proantocianidinas en una concentración de entre 3000 y 4000 mg/100g de producto, preferiblemente entre 3200 y 3800 mg/100g de producto.

Todos estos polifenoles, así como la vitamina C total forman un grupo de compuesto bioactivos denominados en el contexto de la invención como camunina. Es la alta concentración de camunina en el producto de la invención lo que le aporta las características antioxidantes, tan importante en farmacología y en la producción de productos nutracéuticos o composiciones cosméticas.

Por otro lado, no es únicamente la alta presencia de camunina la que le confiere las propiedades antioxidantes al producto y composiciones de la invención. El producto de la invención tiene preferiblemente un grado medio de polimerización entre 2 y 4, más preferiblemente entre 2,5 y 3,5. El grado de polimerización es una variable determinante en la biodisponibilidad de los compuestos bioactivos, es decir, la fracción de nutriente contenida en el alimento que es capaz de atravesar la pared intestinal y es útil para el metabolismo. Es de destacar que este grado de polimerización se encuentra entre los más bajos de entre los productos naturales conocidos, como se puede observar en la comparación realizada en el apartado de ejemplos de la presente invención.

Otra realización del segundo aspecto se refiere al producto obtenido por el procedimiento tal y como se ha descrito anteriormente comprendiendo la etapa de extracción y liofilización. Preferiblemente este producto comprende entre un 40% y un 80% en peso de vitamina C, más preferiblemente entre un 50% y un 70% en peso de vitamina C. Por otro lado, este producto comprende entre un 10% y un 30% en peso de vitamina C glucosilada, preferiblemente entre un 15% y un 25% en peso de vitamina C glucosilada.

Tal y como se ha descrito anteriormente la vitamina C glucosilada se selecciona de AA-2G, AA-3G, AA-5G , AA-6G y cualquiera de sus mezclas, más preferiblemente la vitamina C glucosilada comprende AA-2G.

Un tercer aspecto de la presente invención se refiere a una composición que comprende el producto tal y como se ha descrito anteriormente. La composición, definida de forma general, es un conjunto de componentes que está formado al menos por el producto tal y como se describe en la invención.

Esta composición puede ser una composición alimentaria. Obviamente, la composición se puede ver acompañada de otros componentes como por ejemplo pero no limitantemente leche, yogur, agua, harinas, chocolate, cereales y zumos de frutas.

La "composición alimentaria" comprende el producto obtenido por el procedimiento tal y como se ha descrito anteriormente y que proporciona nutrientes. El término "composición alimentaria" y "composición nutritiva" pueden emplearse como sinónimos. La composición alimentaria o nutritiva es o forma parte de un alimento, un nutracéutico, un suplemento, un probiótico o un simbiótico. El término "composición alimentaria" o "composición nutritiva" de la presente invención se refiere a aquel alimento que, con independencia de aportar nutrientes al sujeto que lo toma, afecta beneficiosamente a una o varias funciones del organismo, de manera que proporciona un mejor estado de salud y bienestar. Como consecuencia, dicha composición puede ser destinada a la prevención y/o tratamiento de una enfermedad o del factor causante de una enfermedad. Por tanto, el término "composición alimentaria" de la presente invención se puede emplear como sinónimo de alimento funcional o alimento para fines nutricionales específicos o alimento medicinal.

El término "nutracéutico" tal como se emplea en la presente invención se refiere a sustancias aisladas de un alimento y utilizadas de forma dosificada que tienen un efecto beneficioso sobre la salud.

El término "probiótico" tal como se emplea en la presente invención se refiere a microorganismos vivos que cuando son suministrados en cantidades adecuadas promueven beneficios en la salud del organismo hospedador.

El término "simbiótico" tal como se emplea en la presente invención se refiere a aquellos alimentos que contienen una mezcla de prebióticos y probióticos. Habitualmente contienen un componente prebiótico que favorece el crecimiento y/o actividad metabólica y en definitiva el efecto del probiótico con el que se combina.

El término "suplemento", sinónimo de cualquiera de los términos "suplemento dietético", "suplemento nutricional" o "suplemento alimenticio" es un "ingrediente alimenticio" destinado a complementar la alimentación. Algunos ejemplos de suplementos dietéticos son, pero sin limitarse, las vitaminas, los minerales, aminoácidos y componentes de los alimentos como las enzimas y los extractos de plantas o glandulares. No se presentan como sustitutos de un alimento convencional ni como componente único de una comida o de la dieta alimenticia sino como complemento de la dieta. Preferiblemente la composición alimentaria es un alimento que se selecciona de la lista que comprende: producto lácteo, producto vegetal, producto cárnico, aperitivo, chocolate, bebida o alimento infantil. El producto lácteo se selecciona de la lista que comprende, pero sin limitarse, producto derivado de leche fermentada (por ejemplo, pero sin limitar yogur o queso) o no fermentada (por ejemplo, pero sin limitar, helado, mantequilla, margarina, suero lácteo). El producto vegetal es, por ejemplo, pero sin limitarse, un cereal en cualquier forma de presentación, fermentado o no fermentado. La bebida puede ser, pero sin limitarse, cualquier zumo de frutas o leche no fermentada.

Por otro lado, la composición también puede ser una composición farmacéutica. Esta composición farmacéutica preferiblemente comprende excipientes farmacéuticamente aceptables.

Para su aplicación en terapia, el producto de la invención se encontrará, preferentemente, en una forma farmacéuticamente aceptable o sustancialmente pura, es decir, que tiene un nivel de pureza farmacéuticamente aceptable excluyendo los aditivos farmacéuticos normales tales como diluyentes y portadores, y no incluyendo material considerado tóxico a niveles de dosificación normales. Los niveles de pureza para el principio activo son preferiblemente superiores al 50%, más preferiblemente superiores al 70%, y todavía más preferiblemente superiores al 90%. En una realización preferida, son superiores al 95% del compuesto anteriormente descrito, o de sus sales, solvatos o profármacos.

En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a aquella cantidad del componente de la composición farmacéutica que cuando se administra a un mamífero, con preferencia un humano, es suficiente para producir la prevención y/o el tratamiento, tal como se define más adelante, de una enfermedad o condición patológica de interés en el mamífero, con preferencia un humano. La cantidad terapéuticamente efectiva variará, por ejemplo, según la edad, el peso corporal, el estado general de salud, el sexo y la dieta del paciente; el modo y el tiempo de administración; la velocidad de excreción, la combinación de fármacos; la gravedad del trastorno o la condición patológica particulares; y el sujeto sometido a terapia, pero puede ser determinada por un especialista en la técnica según su propio conocimiento.

La composición farmacéutica es un conjunto de componentes que está formado al menos por el producto de la invención en cualquier concentración, que tiene al menos una aplicación en la mejora del bienestar físico o fisiológico o psicológico de un sujeto, que implique una mejora del estado general de su salud.

El término medicamento tiene un significado más limitado que el significado de "composición farmacéutica", tal como se define en la presente invención, ya que el medicamento implica necesariamente un efecto preventivo o terapéutico es decir, un efecto fisiológico en el sujeto. Más adelante se definirá debidamente el término "medicamento".

El término "excipiente" hace referencia a una sustancia que ayuda a la absorción de cualquiera de los componentes del producto de la invención, estabiliza dichos componentes o ayuda a la preparación de la composición farmacéutica en el sentido de darle consistencia o aportar sabores que lo hagan más agradable. Así pues, los excipientes podrían tener la función de mantener los componentes unidos como por ejemplo almidones, azúcares o celulosas, función de endulzar, función de colorante, función de protección del medicamento como por ejemplo para aislarlo del aire y/o la humedad, función de relleno de una pastilla, cápsula o cualquier otra forma de presentación como por ejemplo el fosfato de calcio dibásico, función desintegradora para facilitar la disolución de los componentes y su absorción en el intestino, sin excluir otro tipo de excipientes no mencionados en este párrafo. Por tanto, el término "excipiente" se define como aquella materia que, incluida en las formas galénicas, se añade a los principios activos o a sus asociaciones para posibilitar su preparación y estabilidad, modificar sus propiedades organolépticas o determinar las propiedades físico-químicas de la composición farmacéutica y su biodisponibilidad. El excipiente "farmacéuticamente aceptable" debe permitir la actividad de los compuestos de la composición farmacéutica, es decir, que sea compatible con dichos componentes. Ejemplos de excipientes son aglutinantes, rellenos, desintegradores, lubricantes, recubridores, endulzantes, saborizantes y colorizantes. Ejemplos más concretos no limitantes de excipientes aceptables son almidones, azúcares, xilitol, sorbitol, fosfato de calcio, grasas esferoides, talco, sílice o glicerina entre otros.

La "forma galénica o forma farmacéutica" es la disposición a que se adaptan los principios activos y excipientes para constituir un medicamento. Se define por la combinación de la forma en la que la composición farmacéutica es presentada por el fabricante y la forma en la que es administrada.

La composición farmacéutica puede comprender un "vehículo" o portador, que es preferiblemente una sustancia inerte. La función del vehículo es facilitar la incorporación de otros compuestos, permitir una mejor dosificación y administración o dar consistencia y forma a la composición farmacéutica. Por tanto, el vehículo es una sustancia que se emplea para diluir cualquiera de los componentes de la composición farmacéutica de la presente invención hasta un volumen o peso determinado; o bien que aún sin diluir dichos componentes es capaz de permitir una mejor dosificación y administración o dar consistencia y forma al medicamento. Es vehículo es farmacéuticamente aceptable. Cuando la forma de presentación es líquida, el vehículo farmacéuticamente aceptable es el diluyente.

Además, el excipiente y el vehículo deben ser farmacológicamente aceptables, es decir, que el excipiente y el vehículo esté permitido y evaluado de modo que no cause daño a los organismos a los que se administra. La composición farmacéutica de la invención puede comprender otra sustancia activa. Además del requerimiento de la eficacia terapéutica, donde dicha composición farmacéutica puede necesitar el uso de otros agentes terapéuticos, pueden existir razones fundamentales adicionales que obligan o recomiendan en gran medida el uso de una combinación de un compuesto de la invención y otro agente terapéutico. El término "principio activo" es toda materia, cualquiera que sea su origen, humano, animal, vegetal, químico o de otro tipo, a la que se atribuye una actividad apropiada para constituir un medicamento.

En cada caso la forma de presentación del medicamento se adaptará al tipo de administración utilizada, por ello, la composición de la presente invención se puede presentar bajo la forma de soluciones o cualquier otra forma de administración clínicamente permitida y en una cantidad terapéuticamente efectiva. La composición farmacéutica de la invención se puede formular en formas sólidas, semisólidas, líquidas o gaseosas, tales como comprimido, cápsula, polvo, gránulo, ungüento, solución, supositorio, inyectable, inhalante, gel, jarabe, nebulizador, microesfera o aerosol, preferiblemente en forma de comprimido, cápsula, polvo, gránulo, solución, supositorio o jarabe. Según una realización aún más preferida de la presente invención, la composición farmacéutica se presenta en una forma adaptada a la administración oral.

La forma adaptada a la administración oral se refiere a un estado físico que pueda permitir su administración oral. Dicha forma adaptada a la administración oral se selecciona de la lista que comprende, pero sin limitarse, gotas, jarabe, tisana, elixir, suspensión, suspensión extemporánea, vial bebible, comprimido, cápsula, granulado, sello, pildora, tableta, pastilla, trocisco o liofilizado.

Otra posibilidad es que la composición farmacéutica se presente en una forma adaptada a la administración sublingual, nasal, intracatecal, bronquial, linfática, rectal, transdérmica o inhalada. El producto de la invención puede ir asociado, por ejemplo, pero sin limitarse, a liposomas o micelas. Las composiciones anteriormente mencionadas pueden ser preparadas usando métodos convencionales, como los descritos en las Farmacopeas de diferentes países y en otros textos de referencia.

Los compuestos y composiciones de la presente invención pueden ser empleados junto con otros medicamentos en terapias combinadas. Los otros fármacos pueden formar parte de la misma composición o de otra composición diferente, para su administración al mismo tiempo o en tiempos diferentes.

La composición de la invención también puede ser una composición cosmética.

En la presente invención se entiende como "cosmético" a aquellas preparaciones constituidas por sustancias naturales o sintéticas o sus mezclas, de uso externo en las diversas partes del cuerpo humano: piel, sistema capilar, uñas, labios, órganos genitales externos, dientes y membranas mucosas de la cavidad oral, con el objeto exclusivo o principal de higienizarlas, perfumarlas, cambiarles su apariencia, protegerlos o mantenerlos en buen estado y/o corregir olores corporales pero no para producir un efecto terapéutico. La composición cosmética puede contener excipientes y/o vehículos farmacéuticamente y farmacológicamente aceptables tal como se ha descrito en párrafos anteriores. Por otra parte la composición cosmética puede presentarse en cualquier forma adaptada a la administración tópica.

Un cuarto aspecto de la presente invención se refiere al uso del producto o de la composición tal y como se han descrito anteriormente como antioxidante. Los resultados mostrados en el apartado de ejemplos de la invención muestran que la capacidad antioxidante del producto de la invención presenta valores superiores (por cualquier método de análisis) a la capacidad antioxidante de los frutos con los que se comparan (fresa, uva, manzana, cacao en polvo) (ver tabla 7). Por el término "antioxidante" se entiende una composición capaz de retardar o prevenir la oxidación de otras moléculas. Las reacciones de oxidación pueden producir radicales libres que comienzan reacciones en cadena que dañan células. El estrés oxidativo ha sido asociado a la patogénesis de muchas enfermedades humanas, es por ello que el uso del producto de la presente invención como antioxidante tiene un gran interés en farmacología.

Otros aspectos de la presente invención se refieren al uso del producto o de la composición tal y como se han descrito anteriormente para la fabricación de una composición alimentaria, de un medicamento o de una composición cosmética.

El medicamento al que se refiere la presente invención puede ser de uso humano o veterinario. El "medicamento de uso humano" es toda sustancia o combinación de sustancias que se presente como poseedora de propiedades para el tratamiento o prevención de enfermedades en seres humanos o que pueda usarse en seres humanos o administrarse a seres humanos con el fin de restaurar, corregir o modificar las funciones fisiológicas ejerciendo una acción farmacológica, inmunológica o metabólica, o de establecer un diagnóstico médico. El "medicamento de uso veterinario" es toda sustancia o combinación de sustancias que se presente como poseedora de propiedades curativas o preventivas con respecto a las enfermedades animales o que pueda administrarse al animal con el fin de restablecer, corregir o modificar sus funciones fisiológicas ejerciendo una acción farmacológica, inmunológica o metabólica, o de establecer un diagnóstico veterinario. También se considerarán "medicamentos veterinarios" las "premezclas para piensos medicamentosos" elaboradas para ser incorporadas a un pienso.

Otra realización preferida de la presente invención se refiere al uso del producto de la invención o de la composición que lo comprende para la fabricación de un medicamento o para la fabricación de una composición alimentaria, para la prevención y/o tratamiento de enfermedades provocadas en parte o totalmente por el estrés oxidativo, conocidas por el experto en la materia. Algunas de las enfermedades en cuya aparición está involucrado el estrés oxidativo son: a) enfermedades neurodegenerativas como por ejemplo pero sin limitarse la enfermedad de Lou Gehrig, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Huntington, encefalopatía miálgica; o b) enfermedades cardiovasculares.

El término "tratamiento" tal como se entiende en la presente invención se refiere a combatir los efectos causados como consecuencia de una enfermedad o condición patológica de interés en un sujeto (preferiblemente mamífero, y más preferiblemente un humano) que incluye:

(i) inhibir la enfermedad o condición patológica, es decir, detener su desarrollo;

(¡i) aliviar la enfermedad o la condición patológica, es decir, causar la regresión de la enfermedad o la condición patológica o su sintomatología;

(iii) estabilizar la enfermedad o la condición patológica.

El término "prevención" tal como se entiende en la presente invención consiste en evitar la aparición de la enfermedad, es decir, evitar que se produzca la enfermedad o la condición patológica en un sujeto (preferiblemente mamífero, y más preferiblemente un humano), en particular, cuando dicho sujeto tiene predisposición por la condición patológica.,

A continuación se ¡lustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de manifiesto las cantidades de compuestos bioactivos en el producto y composiciones de la invención y su capacidad antioxidante. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención. BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

FIG. 1. Cromatograma a 360 nm de una composición de la invención. mAU: miniunidades de absorción, min: minutos; 1 : dilactona del ácido valonéico, 2: glucosil elágico, 3: pentosil elágico, 4: Miricetina glucósido, 5: rhamnosil elágico, 6: ácido elágico, 7: Ácido elágico, 8-12 derivados del elágico no identificados,

FIG. 2. Cromatograma a 280 nm de una composición de la invención. mAU: miniunidades de absorción, min: minutos; 14: ácido gálico, 15: castalagina, 16: vescalagina, 17: elagitanino, 18: pedunculagina, 19: HHDP- galoil-glucosa, 20: di-HHDP-galoil-glucosa, 21 , HHDP-galoil-glucosa, 23: d¡- HHDP-galoil-glucosa, 24: tri-galoil-HHDP-glucosa, 22 y 25: derivados del ácido gálico no identificado.

FIG. 3. Cromatograma a 280 nm de una composición de la invención. mAU: miniunidades de absorción, min: minutos; 30: catequina, 31 : epicatequina.

FIG. 4. Cromatograma a 280 nm de una composición de la invención. mAU: miniunidades de absorción, min: minutos; 32: catequina aducto, 33: epicatequina aducto.

FIG. 5. Cromatograma a 280 nm de una composición de la invención. mAU: miniunidades de absorción, min: minutos; 34: catequina galato, 35: epicatequina galato.

FIG. 6. Cromatograma a 280 nm de una composición de la invención. mAU: miniunidades de absorción, min: minutos; 36: galocatequina aducto, 37: epigalocatequina aducto. FIG. 7. Cromatograma a 280 nm de una composición de la invención. mAU: miniunidades de absorción, min: minutos; 38: galocatequina, 39: epigalocatequina.

FIG. 8. Cromatograma a 280 nm de una composición de la invención. mAU: miniunidades de absorción, min: minutos; 40: galocatequina aducto, 41 : epigalocatequina aducto.

FIG. 9. Cromatograma a 280 nm de una composición de la invención. mAU: miniunidades de absorción, min: minutos; 42: galocatequina galato, 43: epigalocatequina galato.

FIG. 10. Cromatograma a 280 nm de una composición de la invención. mAU: miniunidades de absorción, min: minutos; 44: galocatequina galato aducto, 45: epigalocatequina galato aducto.

FIG. 11. Variación de 8-OHdG con el producto de la invención (negro) con respecto a vitamina C sintética (blanco). %: tanto por ciento de variación respecto a la concentración basal a 0 h (tomando el valor basal como 100%).

FIG. 12. Variación de ORAC del producto de la invención (negro) y de la vitamina C sintética (blanco) con respecto a la basal en pmolesTrolox. pmT: equivalentes de pmolesTrolox.

FIG. 13. Variación de GSH con el producto de la invención (negro) con respecto a la vitamina C sintética (blanco). %: tanto por ciento de variación respecto a la concentración basal a OH (tomando el valor basal como 100%).

FIG. 14. Absorción de vitamina C con el producto de la invención (negro) con respecto a la vitamina C sintética (blanco). A: Absorción en pmol/l; H: horas. FIG. 15. Diferencia de absorción de vitamina C del producto de la invención respecto a la vitamina C sintética. %: Diferencia de absorción en %; H: horas.

FIG. 16. Cromatograma del producto del ejemplo 1 a 240 nm. AA: vitamina C; D: derivados glucosilados de la vitamina C.

EJEMPLOS

Ejemplo 1. Procedimiento de obtención del producto de la invención.

En primer lugar, se seleccionaron frutos camu camu con estado de maduración verde-pintón, que corresponde a un 20-30% de maduración o un ratio de sólidos en suspensión/acidez de entre 1 ,80 y 2.

El estado de madurez deseado se determina por medio de métodos conocidos por el experto en la materia descritos en un apartado anterior de la memoria descriptiva.

El estado de madurez se puede determinar por la medida de la superficie de coloración roja en la cara exterior de los frutos. Un 20-30% indica que dicho porcentaje medio de la superficie de los frutos tiene coloración roja.

Un método preferido para determinar la maduración de los frutos es el cálculo del ratio de sólidos en suspensión frente a la acidez. En la presente invención se ha establecido, de acuerdo con diversos autores del estado de la técnica, que el color exterior de los frutos camu camu tiene la siguiente equivalencia con el ratio sólidos solubles/acidez: 1 ,31 para los frutos verdes (estado inicial); 1 ,90 para los frutos verde rojizos (verde pintón) (estado de madurez medio); y 2,41 para los frutos rojos (estado maduro). Por tanto, en la presente invención se estableció que el ratio óptimo de sólidos en suspensión/acidez tenía que ser de entre 1 ,80 y 2 para tener las características antioxidantes del producto de la presente invención.

Los frutos proceden de la especie Myrciaria dubia HBK Me Vaugh que es una especie de camu camu arbustivo que crece en zonas inundables en Pucallpa (los ríos Ucayali) que especialmente tienen un alto contenido de materia orgánica. Como especie semiacuática, en períodos de grandes inundaciones puede permanecer hasta 7 meses debajo del agua, con temperaturas de entre 20 y 30 grados y con precipitaciones anuales de entre 1700 a 3000 mm.

La fruta seleccionada se lavó con agua clorada y posteriormente se desinfectó, añadiendo al agua 5 ppm más de cloro. Tras la desinfección la fruta se aclaró y se pasó al despepado. Para el despepado, se aplastó la fruta con una prensa y se separó la pepita manualmente. La piel de la fruta no se eliminó.

A continuación se procedió al secado de la fruta. El secado se llevó a cabo en una secadora de lecho fluidizado a una temperatura entre 45 y 55 °C durante unas 10 horas. El producto final tenía una humedad de un 6%.

Tras el secado, se procedió a la molienda y al tamizado con una malla de 0,5 mm. Partiendo de una cantidad inicial de 1000 kg de frutos camu camu se obtuvo una cantidad final de producto tamizado de 50 kg.

Ejemplo 2. Análisis de polifenoles, vitamina C y actividad antioxidante del producto del ejemplo 1.

Ejemplo 2.1. Identificación de los principales constituyentes fenólicos del producto.

Se efectuó un análisis cualitativo del producto de la invención con identificación de los principales constituyentes fenólicos empleando la metodología de cromatografía líquida de alta eficacia con detección por red de diodos (del inglés, HPLC-DAD), cromatografía líquida de alta eficacia con detección por espectrometría de masas (del inglés, HPLC-MS) y por cromatografía líquida de ultra-alta eficacia con detección de espectrometría de masas cuadrupolar (del inglés, UPLC-QTOF).

Posteriormente se realizó un análisis cuantitativo en los extractos obtenidos mediante HPLC con detección ultra violeta (UV) a longitudes de onda específicas para cada tipo de metabolito, y cuantificando frente a patrones externos. Los flavonoles fueron cuantificados como rutina (quercetina 3- rutinósido), los antocianos como cianidina 3-rutinósido, los derivados del elágico como ácido elágico, los elagitaninos como vescalagina, y los galotánicos como ácido gálico.

Metabolitos polifenólicos identificados:

Flavonoles: Miricetina glucósido (4), miricetina pentósido (6), derivado de miricetina glucósido (1 1 ),

Derivados del elágico: dilactona del ácido valonéico (1 ), glucosil elágico (2), pentosil elágico (3), rhamnosil elágico (5), ácido elágico (6), 8 -12 Derivados del elágico no identificado.

Derivados del gálico: ácido gálico (14), y dos derivados del ácido gálico no identificados todavía (22 y 25).

Elagitaninos: Castalagin (15), Vescalagin (16), ellagitanino no identificado (17), Di-HHDP-glucosa (Pedunculagina) (18), HHDP- galoil-glucosa (19), Di-HHDP- galoil-glucosa (20), HHDP-d¡ galoil-glucosa (21 ), Di-HHDP- galoil-glucosa (23), Tri- galoil-HHDP-glucosa (24).

Tabla 1 . Tiempo de retención, espectro de UV/Visible, ión molecular y fragmentación de los compuestos fenólicos identificados en la composición del ejemplo 1 . Los cromatogramas de algunos de los compuestos se pueden apreciar en la fig. 1 y 2.

Tiempo de mg/100 mg

Amáx fragmentos

N° Compuesto retención [M-H] ^" composición

(nm) MS

(min) (mediaisd)

Flavanoles

316, 221 ,

4 Miricetina glicósido 27,5 479 264, 358 1 ,401 ±0,053

179

6 Miricetina pentósido 30,4 449 272, 356 316 trazas

Taninos hidrolizados

1 Acido valoneico dilactona 15,4 469 255, 374 425 5,457±0,099

Derivados del ácido elágico

2 Acido elágico hexósido 24,7 463 255, 362 301 7,519±0,081

3 Acido elágico pentósido 28,9 433 254, 360 301 20,42±0, 16

Acido elágico

5 29,7 447 254, 364 300 12,94±0,28 dehoxihexósido

7 Acido elágico 30,9 301 256, 368 229 76,49±0,49

8 Derivado del ácido elágico 35,9 489 254, 362 301 3,904±0,058

9 Derivado del ácido elágico 36,5 489 254, 362 429, 301 3, 128±0,064

10 Derivado del ácido elágico 37,2 586 254, 360 415, 301 2,27±0, 14

12 Derivado del ácido elágico 40,8 720 254, 362 301 1 ,508±0,027

13 Derivado del ácido elágico 41 ,5 720 254, 362 301 1 ,618±0,008

Total 129, 80±0, 15

Elagitaninos

915, 889,

15 Castalagina 1 1 ,5 933 246 64,51 ±1 , 11

631

915, 889,

16 Vescalagina 13,9 933 246 228,88±1 ,89

631

17 Elagitanino 15,8 1221 240 915 19,38±0,78

18 Pedunculagina 16,2 784 240 481 , 301 17,93±0, 17

19 HHDP- galoil-glucosa 19,8 633 240, 270 463, 301 17,80±1 , 13

917, 633,

20 Di-HHDP- galoil-glucosa 20,5 935 240, 270 38,37±2,78

301

21 HHDP- galoil-glucosa 21 ,8 875 240, 272 484, 301 7,89±0,41

917, 633,

23 Di-HHDP- galoil-glucosa 25,9 935 240, 270 5,71 ±0,35

301

767, 741 ,

24 Tri- galoil-HHDP-glucosa 27,9 937 240, 276 4,89±0, 17

465, 301

Total 405,35±0,98

Derivados del ácido gálico 14 Acido gálico 9,0 169 274 125 29,56±0,71

22 Derivado del ácido gálico 24, 1 915 240, 274 457, 169 6,43±0,41

Derivado del ácido gálico 551 , 523,

25 37,8 569 238, 274 6,40±0,50

169

Total 42,40±0, 54

Total 578,01±0,55

Las proantocianidinas fueron cuantificadas tras degradación por el método de la floroglucinólisis, y por análisis de los productos de hidrólisis mediante HPLC- DAD-fluorescencia, empleando como patrón los productos de degradación de la procianidina B2.

Proantocianidinas: catequina, catequina galato, galocatequina, epigalocatequina, epigalocatequina aducto, galocatequina galato

Tabla 2. Tiempo de retención, espectrometría UV/Visible, ión molecular y fragmentación de las proantocianidinas identificados en la composición del ejemplo 1 .

Tiempo de mg/100 mg

Amáx fragmentos

N° Compuesto retención [M-H] ^" composición

(nm) MS

(min) (mediaisd)

30 Catequina 15,3 289 275 245, 205, 179 213,53±3,27

31 Epicatequina 19, 1 289 trazas

32 Catequina aducto 1 1 ,5 413 trazas

33 Epicatequina aducto 12,0 413 277 287, 261 , 175 845,48±1 ,89

34 Catequina galato 24,9 441 277 331 , 289, 169 52,02±0,40

35 Epicatequina galato 27,4 441 trazas

36 Galocatequina aducto 17,4 565 277 439, 413, 395 677, 73±1 1 ,99

37 Epigalocatequina aducto 23,6 565 trazas

38 Galocatequina 10,7 305 277 287, 219, 178 45,28±4,72

39 Epigalocatequina 14,4 305 277 287, 219, 178 60, 10±0,67

40 Galocatequina aducto 6, 1 429 trazas

41 Epigalocatequina aducto 8,6 429 275 303, 261 , 177 409,20±6,47

42 Galocatequina galato 19,3 457 275 331 , 305, 287 352,75±0,13

43 Epigalocatequina galato 22,2 457 trazas

Galocatequina galato

44 10,2 581 trazas

aducto Epigalocatequina galato

45 12,4 581 275 455, 429, 319 767,46±0,13 aducto

Total 3525,54±3,30

Ejemplo 2.2. Determinación de polifenoles, vitamina C y actividad antioxidante del producto del ejemplo 1.

En la siguiente tabla se muestra la concentración de los polifenoles del producto obtenido mediante el procedimiento descrito.

Tabla 3. Composición de los polifenoles mayoritarios identificados totales en mg por 100 g de producto.

El producto de la invención tiene un contenido de proantocianidinas derivadas de la epicatequina, la epigalocatequina y sus correspondientes galatos con una concentración por encima de 3 gramos por 100q.

El grado medio de polimerización de alrededor de 3 indica que el grado de potencial absorción de estas proantocianidinas es elevado y esto supone uno de los principales valores añadidos de este producto.

La vitamina C (ascórbico + dehidroascórbico) fueron cuantificados por HPLC con detección UV tras derivatización. Los resultados se muestran en la tabla 4. Tabla 4. Contenido de ácido ascórbico, dehidroascorbido y Vitamina C total en la composición del ejemplo 1 .

En la siguiente tabla se puede observar el contenido en vitamina C del producto de la invención respecto de otros productos procedentes de otros frutos.

Tabla 5. Contenido en vitamina C de diferentes frutos liofilizados (valores son g/100 g peso seco).

La capacidad antioxidante de los diferentes extractos se llevó a cabo mediante los métodos del ABTS, DPPH y ORAC frente at Trolox, métodos bien conocidos en el estado de la técnica. Los resultados se muestran en la tabla 6.

Tabla 6. Capacidad antioxidante de la composición del ejemplo 1 por los métodos ABTS, DPPH y ORAC. ( ^* mol trolox/g composición)

ABTS ^* DPPH ^* ORAC ^* 752,3 1036,4 755

Como puede observarse en la tabla 7, la capacidad antioxidante del producto de la invención es superior a la capacidad antioxidante mostrada en otros frutos con capacidad antioxidante reconocida.

Tabla 7. Capacidad antioxidante, ABTS, DPPH Y ORAC de diferentes frutos en equivalentes de pmoles de trolox/g peso seco de muestra.

Ejemplo 3. Estudio farmacocinético de la vitamina C del producto del ejemplo 1 frente a la vitamina C sintética

Se realizó un estudio farmacocinético que consistió en un estudio cruzado durante 3 semanas con intervención dietética controlada en una población de 12 individuos, divididos en dos grupos de 6 individuos para estudiar los efectos de la ingesta del producto del ejemplo 1 (producto de la invención) y de la vitamina C sintética. A un grupo se le suministró el producto de la invención durante una semana, luego estuvieron una semana de lavado y posteriormente se les suministró la vitamina C sintética. Al otro grupo se le suministraron la vitamina C sintética en primer lugar, luego una semana de lavado y por último se les suministró el producto de la invención. La vitamina C sintética elegida es de la marca comercial Redoxon 500 mg. Se comparó la biodisponibilidad de la vitamina C del producto de la invención frente a la sintética y estudiar su farmacocinética, así mismo se estudiaron los principales parámetros de oxidación de ADN así como los marcadores de nivel antioxidante en plasma ORAC, GSH, y 8-OHdG.

Población de estudio

Los individuos participantes en el estudio (n=12) fueron individuos sanos, no fumadores, no vegetarianos, sin historia de enfermedad gastroinstestinal, enfermedad cardiovascular, alteraciones hemostáticas, o enfermedad crónica, y no estaban realizando un régimen alimentario para perder peso y aparentemente no tenían ninguna enfermedad. La edad de los participantes osciló entre los 20 y los 30 años.

Diseño experimental

Los individuos obligatoriamente evitaron cualquier derivado cítrico la semana previa a la primera intervención y durante las siguientes semanas. Asimismo, restringieron al máximo durante el período de estudio la ingesta de frutas y algunos derivados, así como cacao, té, cerveza, vino y zumos en general. Quedó prohibida la ingesta de estos derivados el día antes de cada uno de los ensayos.

Se dará una cantidad equivalente a 250 mg de vitamina C del producto de la invención, o 250 mg de vitamina C sintética, disueltos en agua, cada componente de las comidas facilitadas se pesó. En los ensayos cruzados, los participantes comieron exactamente lo mismo cuali- y cuantitativamente.

8-OHdG (8-hidroxideoxiguanosina)

Este análisis se realizó con un kit de ELISA (Japan Institute for the Control of Aging) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El anticuerpo monoclonal de 8-OHdG en la base de la placa reacciona completamente con el enlace del 8-OHdG en la solución de la muestra. La adición de la muestra produce un color proporcional a la cantidad de 8-OHdG. La reacción se detiene con la adición del ácido fosfórico, y se mide la absorbancia a 450 nm. El coeficiente de variación intra-dia dio resultados < 4%.

Los niveles de 8-OHdG han sido extensamente estudiados como un claro marcador de oxidación de ADN. En el 70% de los participantes, se observó una disminución de los valores de 8-OHdG, de 30,8 ± 5,8 a 24,2 ±3,6 ng/ml a las 1 1 h. Tras 24 h estos valores no muestras diferencias significativas, siendo los valores medios 25, 1 ± 4,5 ng/ml. El resto de los participantes no muestran variaciones significativas de estos valores.

Tabla 8. Variación en tanto por ciento de 8-OHdG a las 1 1 h y a las 24 h con el producto de la invención y con vitamina C sintética, tomando como 100% los valores básales.

Estos datos también están representados en la figura 1 1 .

Tal y como se muestra en la tabla 8 y en la figura 1 1 , el efecto del producto de la invención se mantiene a las 24 horas.

ORAC-FL

La capacidad de absorción de radicales de oxígeno (ORAC) se llevó a cabo con un lector de microplacas (Synergy HT- multi-detection microplate reader), de Bio-Tek Instruments, mediante microplatos de 96 pocilios con paredes negras y fondo limpio, de la marca Nalge Nunc International. La fluorescencia se midió a través del fondo limpio, con una energía de excitación 485/20 nm y un filtro de emisión de 528/20 nm. El lector fue controlado por el software KC4, versión 3.4. La reacción se llevó a cabo en un tampón de fosfato de sodio (pH 7,4) y la reacción final fue 200 μΙ. FL(fluorescencia) (100 μΙ, 3nM, concentración final) y la muestra en ausencia o en presencia de ΗΡ-β-CDs (70 μΙ) en los pocilios. La mezcla fue incubada durante 30 min. a 37°C, antes de adicionar una solución de AAPH (2,2'-azobis(2-am¡d¡no-propan) dihidrocloruro) (30 μΙ, 19 mM). El microplato fue inmediatamente posicionado en el lector de fluorescencia y se tomaron medidas cada 1 , 14 min., durante 120 min. El microplato automáticamente es agitado justo antes de cada lectura. Se introduce un blando con FL y AAPH utilizando el tampón fosfato sódico en vez de la solución antioxidante, y ocho puntos de calibración utilizando una solución Trolox C (desde 6,25 hasta 31 ,25 μΜ) como antioxidante. Todas las reacciones se hicieron por triplicado para cada muestra. Para evitar el efecto de la temperatura solo se utilizaron 60 de todos los pocilios disponibles en cada microplaca, el resto se llenó con agua destilada. Los valores se expresan en equivalentes de μηιοΐβε Trolox.

La capacidad antioxidante del plasma viene determinada por muchos factores y sustancias, aun así es posible correlacionar su valor con la ingesta de alimentos ricos en antioxidantes. Tanto en la tabla 9 como en la figura 12 se puede apreciar claramente que el producto de la invención no solo consigue tener una diferencia significativa, sino que además la mantiene a las 24h, frente a la vitamina C sintética cuya diferencia es menor, y al as 24h vuelve a sus valores iniciales.

Tabla 9. Variación en tanto por ciento de ORAC a las 1 1 h y a las 24 h con el producto de la invención y con vitamina C sintética, tomando como 0% los valores básales.

Horas Producto invención (%) Vitamina C Sintética (%)

1 1 h 6,24 3,93

24h 5,72 0,57 GSH

Por GSH se entiende glutatión reducido, un antioxidante, ayuda a proteger las células de especies reactivas de oxígeno como los radicales libres y los peróxidos. Por GSSG se entiende glutatión oxidado.

Se determinó mediante el kit Glutathione Assay Kit (GSH, GSSG and Total, Biovision). El GSH reacciona con OPA para generar un compuesto fluorescente, que se mide espectrofotometricamente. El nivel de GSSG puede medirse reduciéndolo con un agente reductor para pasarlo a GSH.

Se tomaron 40 μΙ del preparado con ácido perclórico (6N) y se añaden 20 μΙ_ de KOH frío para precipitar el ácido perclórico y neutralizar las muestras (el pH en ese momento ha de estar entre 5-10). Se mantuvo en hielo durante 5 min y se centrifuga 2 mina 13000 g a 4°C. Se tomaron 10 μΙ, se enrasaron hasta 90 μΙ con buffer. Y se añadieron 100 μΙ de OPA (O-ftalaldehído) en la muestra. Después de incubar durante 40 min se realiza la medición a 340 nm (excitación) y 420 nm(emisión) frente a una curva estándar.

El tripéptido GSH es sintetizado por el organismo y juega un papel muy importante para eliminar radicales peróxido y grupos electrófilos, sus niveles en plasma han sido muy estudiados y relacionados con diferentes enfermedades degenerativas, cáncer, envejecimiento, etc. jugando un papel muy importante en otras rutas de señalización celular en procesos inflamatorios.

Los valores medios iniciales de los niveles GSH en los participantes que consumieron el producto de la invención es de 380,8 ±64,0 μ9/μΙ. Tras su consumo estos valores aumentaron a las 1 1 horas hasta alcanzar valores medios de 644,4 ± 82,0 μ9/μΙ. A las 24 horas los valores son aún superiores (893,6 ± 62,0 μ9/μΙ, observándose diferencias significativas respecto a los valores observados a las 1 1 h. Cuando los participantes consumieron vitamina C sintética, los valores medios de GSH aumentan de 596,3 ±82.0 μς/μΙ a 81 1 ,8 ±43.0 μς/μΙ a las 1 1 h de su ingesta. A las 24 h esta concentración disminuye hasta 628, 1 ±45.0 μς/μΙ), no observándose diferencias significativas respecto a los valores iniciales.

Como podemos apreciar la ingesta del producto de la invención tiene un papel muy positivo en los niveles de GSH a las 1 1 horas, pero además estos valores son incluso mayores a las 24 horas, indicando que su efecto es prolongado en el tiempo.

En la tabla 10 y en la figura 13 se puede apreciar la variación de GSH respecto a sus valores básales.

Tabla 10. Variación de GSH en tanto por ciento, tomando como 100% los valores básales.

Vitamina C

Las muestras se descongelaron e inmediatamente se tomaron alícuotas de 100 μΙ a los que se adicionaron 200 μΙ de acetonitrilo para precipitar proteínas y 100 μΙ de sal de EDTA 0,15% para estabilizar la vitamina C, las muestras fueron centrifugadas, filtradas e inmediatamente pinchadas para evitar la pérdida de vitamina C.

Las muestras fueron analizadas en un UPLC-QqQ-MS (Agilent Technologies), su identificación y cuantificación se realizó por comparación en tiempo de retención y espectro de masas con patrones analíticos de acido ascórbico y acido dehidroascórbico. El método fue previamente validado mediante la adicción de ácido ascórbico y dehidroascórbico a muestras de plasma sin vitamina c al haberlas dejado a temperatura ambiente durante una semana, la recuperación, linealidad, repetitividad y reproducibilidad fueron acordes a los estándares establecidos. Los resultados se expresan como la suma de acido ascórbico más ácido dehidroascórbico.

Los valores medios de vitamina C en todos los individuos nos da una media de 56,93 ±6,91 μΜ/Ι. El valor máximo para el producto de la invención, nos da una media de 92,72±26,84 frente a 83,84±24,95, aunque aquí podemos ver que la desviación estándar es grande debido a las diferencias de absorción entre los individuos.

En la figura 14 se puede apreciar que la vitamina C del producto de la invención, siempre se absorbe mejor que la vitamina C sintética desde las primeras horas de la ingesta.

Para evitar la variabilidad de absorción entre individuos se hace un estudio de biodisponibilidad comparando cada individuo por separado, viendo la diferencia de absorción entre el producto de la invención y la vitamina C sintética en cada individuo, que está ¡lustrado en la figura 15.

De la figura 15 se pueden sacar dos conclusiones:

La diferencia de asimilación entre de la vitamina C del producto de la invención y la vitamina C sintética aumenta conforme pasa el tiempo, siendo mayor a las 24 horas.

La segunda mayor diferencia se produce en la hora 5 que coincide con el nivel postprandial, entre 1 -1 .5 horas después de la comida, aquí debido a la digestión se produce una gran asimilación de grasas y de agentes oxidantes en el organismo, atacando a la vitamina C. Podemos ver como la vitamina C del producto de la invención está más protegida frente a la sintética que sufre una mayor disminución con respecto a lo que podríamos esperar en una farmacocinetica normal.

En la tabla 1 1 se muestra la concentración máxima en plasma alcanzado para la vitamina C tanto para el producto de la invención como para la vitamina C sintética, y el área bajo la curva de su farmacocinética a las 24 horas (AUC). Se puede apreciar como en 1 1 de los 12 individuos se absorbe mejor la vitamina C procedente del producto de la invención que de la vitamina C sintética.

Ejemplo 4. Análisis de la vitamina C giucosiiada del producto del ejemplo 1. Los resultados mostrados en el ejemplo 3 muestran que la vitamina C del producto de la invención está protegida de alguna manera, lo que hace que sus efectos se mantienen más en el tiempo, comparado con una vitamina C sintética.

Por tanto se llevaron a cabo los siguientes análisis para identificar los derivados de vitamina C que pudieran estar presentes en el producto de la invención.

En la figura 16 se muestra el cromatograma del producto del ejemplo 1 a 240 nm.

Ejemplo 5. Procedimiento de obtención del producto concentrado de la invención.

Se preparó un concentrado de vitamina C y sus derivados glucósidos a partir del producto del ejemplo 1 mediante las siguientes etapas:

- se mezcló un gramo del producto del ejemplo 1 en 10 mi de agua;

- se añadió ácido cítrico 2M;

- se agitó la mezcla para su homogeneización;

- se centrifugó y se separaron las dos fases, líquida y sólida;

- la fase líquida, que comprende los componentes hidrosolubles en pH ácido, se liofilizó.

Se determinó el contenido en vitamina C y de los derivados glucósidos de la vitamina C en el liofilizado, siendo de un 40% de vitamina C y un 20% de vitamina C glucosilada.