procedimiento de obtención

SECTOR TÉCNICO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a la extracción de compuestos a partir de macroalgas. Más concretamente la invención se refiere a la extracción de antioxidantes a partir de macroalgas pardas.

ESTADO DE LA TÉCNICA

Los antioxidantes son metabolitos secundarios presentes en las macroalgas, plantas, y particularmente en las frutas. Son compuestos que inhiben o previenen la oxidación de un sustrato. En la industria alimentaria, farmacéutica y cosmética se emplean principalmente compuestos sintéticos antioxidantes como hidroxitolueno butilado (BHT), galato de propilo o butirohidroxianisol (BHA). Los antioxidantes naturales como los provenientes de extractos de uva, de romero, de cacao etc., están siendo mejor acogidos debido a su baja toxicidad y alta actividad antioxidante. Una gran familia de compuestos antioxidantes son los florotaninos presentes en macroalgas que muestran buena actividad antioxidante

Varios protocolos de extracción de florotaninos han sido propuestos, entre ellos se pueden citar particiones secuenciales líquido-líquido, utilizando principalmente solventes orgánicos como metanol, hexano, diclorometano, cloroformo, acetato de etilo y butanol, además de purificaciones en columnas cromatográficas, tales como Antioxidant Effects of Phlorotannins Isolated fromlshige okamurae in Free Radical Mediated Oxidative Systems, Yanping, Z., Zhong-Ji Q., Yong L, Moon-Moo K.,Sang-Hoon, L. & Se-Kwon K, J. Agrie. Food Chem., 56, 7001-7009, 2008; Phenolic Compounds in the Brown Seaweed Ascophyllum nodosum: Distribution and Radical-scavenging Activities, Audibert, L, Fauchon.M., Blanc.N., Hauchard, D. & Ar Galla, E, Phytochemical analysi, 21 , 399-405, 2010; Chemical components and its antioxidant properties in vitro: an edible marine brown alga Ecklonia cava, Li, Y., Qian, Z.J., Ryu, B., Lee, S.H., Kim, M.M. and Kim, S.K., Bioorg Med Chem 17, 1963-1973, 2009; Distribution and radical scavenging activity of phenols in Ascophyllum nodosum (Phaeophyceae), Bretón, F., Cérantola, S. & Ar Gall E., Journal of Experimental Marine Biology and Ecology, 399, 167-172, 2011. Sin embargo estos procesos generan residuos no permitidos en alimentación y cosmética, tales como metanol o compuestos organohalogenados. Además, si se requiere una polaridad inferior a la del agua, las mezclas hidroalcohólicas son una opción a los disolventes derivados del petróleo. La utilización de acetona al 70% y acetato de etilo como disolventes fue reportada en Phlorotannins as Radical Scavengers from the Extract of Sargassum ringgoldianum, Nakai, M., Kageyama, N., Nakahara, K. & Miki, W., Marine Biotechnology, 8, 409-414, 2006). Una primera fase de eliminación de material lipídico con hexano y posterior 5 extracción de florotaninos con acetona-agua al 70% fue utilizada en High-performance liquid chromatographic analysis of phlorotannins from the brown alga Fucus vesiculosus, Koivikko, R., Loponen, J., Pihlaja, K. and Jormalainen, V., Phytochem. Anal. 18, pp. 326- 332, 2007. Se ha utilizado etanol puro y al 60% para la extracción de florotaninos en especies como Ascophyllum nodosum y Fucus vesiculosus, seguido de partición liquidól o líquido con éter de petróleo o diclorometano (Evaluation of quantitative methods for the determination of polyphenols in algal extracts, Parys, R.,Rosenbaum, A., Kehraus, S., Reher, G., Glombitza, K-W and Kónig, G.M. . J. Nat. Prod., 1865-1870, 2007.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Los extractos obtenidos a partir del tratamiento de macroalgas pardas, como pueden ser 15 Bifurcaría bifurcata y Ascophyllum nodosum, pueden emplearse para consumo alimentario, cosméstico y/o farmacéutico por su contenido en fucoidanos y florotaninos. El alto contenido en fucoidanos provoca que estos extractos posean una capacidad humectante en la piel, mientras que el poder antioxidante viene dado por la presencia de florotaninos.

20 La obtención de un producto natural que no posea un fuerte aroma característico es deseable para su empleo como ingrediente cosmético para no interferir con otros deseados, lo cual se favorece con extracción acuosa y evitando usar disolventes orgánicos. Es otra característica deseable del proceso de extracción de extractos que los disolventes empleados sean baratos, renovables, de baja o nula toxicidad y que su

25 manejo no sea peligroso. Los extractos crudos o fracciones aisladas presentan frecuentemente mayor actividad antioxidante que antioxidantes sintéticos como BHA (butirohidroxianisol) o BHT (butirohidroxitolueno).

El procedimiento objeto de la presente invención permite emplear agua para obtener un producto estable, fácil de manejar y adicionar a diferentes productos y libre de trazas de 30 disolventes.

El método de extracción del antioxidante a partir de una macroalga parda comprende: a) Si se emplea macroalga fresca, esta se somete a un lavado con agua corriente que elimina arenas y epífitas, y posteriormente se seca con papel absorbente. En el caso de que se emplee alga seca este proceso de limpieza con agua no es necesario. b) A continuación se mezcla el alga seca o fresca con agua a una relación líquido/sólido (L/S) entre 3 y 5 g/g. c) A continuación se somete la mezcla anterior a un proceso de triturado, preferiblemente en un molino de aspas, hasta reducir el tamaño de partícula entre 0.5 y 2 mm para macroalga seca y entre 0.5 y 3 mm para macroalga fresca. d) Mezclar la macroalga triturada con un disolvente líquido que comprende etanol puro o mezclas etanol:agua en relación 1 : 1 v/v, en una relación Líquido/Sólido (L/S) de entre 5 y

15 (g/g) cuando se parte de macroalga fresca y de entre 50 y 150 (g/g) cuando se parte de macroalga secae) Someter la mezcla a un proceso de disrupción celular aplicando ultrasonidos en continuo. f) El residuo sólido algal obtenido en la etapa anterior se separa por sedimentación y posterior centrifugación o filtración. g) Se elimina el etanol o el 50% del agua, en el caso de que sólo se hubiera empleado agua, a vacío sin superar la temperatura de 40 °C. h) El extracto concentrado se liofiliza para obtener un extracto sólido.

El producto se almacena refrigerado a menos de 5 °C y se protege de la luz para evitar su alteración.

En otro aspecto, la invención se refiere a un extracto antioxidante estable obtenido a partir del procesado de macroalgas pardas, más concretamente de macroalgas algas de las especies Bifurcaría bifurcata, Ascophyllum nodosum, Saccorhiza polyschides y Sargassum muticum BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Las modalidades detalladas en las figuras se ilustran a modo de ejemplo y no a modo de limitación:

La Figura 1 muestra el esquema para disrupción celular asistida por ultrasonido en un sistema de alimentación macroalgal en continuo. La Figura 2 muestra la detección de florotaninos mediante HPLC en columna de fase reversa C18.

La Figura 3 muestra el perfil ultravioleta del extracto de Bifurcaría bifurcata, con un perfil característico de florotaninos y semejante al de floroglucinol. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

En una realización particular la invención se dirige a un extracto acuoso antioxidante obtenido a partir de macroalgas pardas caracterizado por a) un contenido de carbohidratos entre 33 y 156 mg de glucosa/g de liofilizado; b) un contenido en fucoidanos, expresados como sulfatos totales tras la digestión de la muestra, entre 44 y 118 mg de sulfatos/g de liofilizado; c) un contenido de florotaninos, expresados como floroglucinol, entre 12 y 62.4 mg equivalentes de floroglucinol/g de liofilizado; y d) un contenido en alginatos, entre 10 y 55 mg equivalentes de ácido glucurónico/g de liofilizado.

En otro aspecto, la invención se dirige a una composición cosmética y/o alimentaria que comprende el extracto antioxidante objeto de la presente invención.

Se cita a modo de ejemplo y sin limitar el alcance de la protección un ejemplo de la aplicación del método de extracción de antioxidantes a partir de Bifucaria Bifurcata. La extracción se realiza en continuo y en condiciones de temperatura inferior a 40 °C para evitar reducción en el poder antioxidante o cantidad de los compuestos extraídos. En la Figura 1 se muestra el esquema para disrupción celular asistida por ultrasonido en un sistema de alimentación macroalgal en continuo compuesto por una unidad de generación de ultrasonidos que incluye un sonotrodo (105) dispuesto en una celda de flujo continuo (104), que es alimentado mediante una bomba peristáltica principal (102) y otra de recirculación (103). En una realización particular de la invención el proceso de extracción del compuesto acuoso antioxidante comprende las siguientes etapas: a) Se lavaron 120 g de macroalga fresca con agua potable y posteriormente con agua destilada. b) Se añadieron 300 mL de agua c) Se pretritura la macroalga, accionando una batidora de aspas durante 10 min obteniendo un tamaño de partícula inferior a 3 mm. d) Se añadió agua a la preparación obtenida en el paso anterior hasta obtener una relación L/S de 10 y se introdujo en un tanque de alimentación (100) que se mezcla mediante un agitador (101). Se seleccionó una de las condiciones de extracción descritas en la Tabla 1 , que resume un diseño experimental factorial 2 ² con 4 puntos centrales. e) Las condiciones extracción ultrasónica en continuo consideraron los parámetros de potencia (como amplitud o porcentaje de la potencia nominal aplicada) y relaciones de recirculación del caudal de entrada del caldo de alga a la celda de flujo continuo (celda de sonicado o ultrasónica) (104) en la que un sonotrodo (105) aplica ultrasonidos en continuo a la mezcla con una densidad de potencia en el rango entre 3 y 13 W/cm ³ . La Tabla 1 resume la combinación de tratamientos ejecutados para el diseño experimental. El montaje de extracción requiere de un sistema de extracción asistido con ultrasonido como el que se muestra en la Figura 1. f) Se dejó sedimentar el residuo sólido sedimentable y se separó del sobrenadante por decantación. g) El siguiente paso consistió en centrifugar y separar nuevamente el sobrenadante. Este tiene un volumen de 1200 mL, el cual se redujo hasta 500 mL por evaporación a vacío a 30°C o a temperatura ambiente, h) Se obtuvo un extracto liofilizado (106), que en esta realización particular comprende un volumen total de 1400 mL en el que y finalmente para obtener un extracto sólido y seco.

Amplitud Ratio de recirculación Potencia Tiempo de

residencia en

W/cm ³

celda (s)

1 1 13 9.2

1 -1 13 6.9

-1 1 7.2 9.2

-1 -1 7.2 6.9

0 0 10.1 8.28

0 0 10.1 8.28

0 0 10.1 8.28

0 0 10.1 8.28

Tabla 1 .- Diseño experimental 2 ² y 4 puntos centrales. Códigos de ajuste de amplitud -1 , 0 y 1 corresponden a amplitudes de 50%, 70% y 90%. Códigos de relación de recirculación -1 , 0 y +1 corresponden a 1 , 1 .5 y 2, siendo el caudal de recirculación constante de 300 mL/min

El rendimiento de extracción en base húmeda a partir de macroalga fresca se encuentra dentro de un intervalo de 2.9 - 6.6 % (p/p); mientras que el rendimiento de extracción para alga seca se encuentra dentro del intervalo 27.7 y 57.3 % (p/p); los rendimientos para cada una de las especies de algas analizadas se recogen en la Tabla 2. El máximo de absorbancia de este extracto liofilizado y posteriormente redisuelto en agua, frente a un blanco de agua se localiza entre 250 nm y 280 nm, tal y como se recoge en la Figura 3.

Contenido de polifenoles totales: Se entiende por polifenoles toda una famila de compuestos presentes en los vegetales, que contiene o se derivan del grupo fenol: derivados del ácido benzoico, derivados de ácido cinámico, flavonoides, etc.

Para determinar el contenido de polifenoles del extracto obtenido se empleó una ligera modificación del método propuesto en Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdic phosphotungstic acid reagents. Singleton & Rossi.Singleton, V. L; Rossi, J. J. Am. J. Enol. Vitic, 16, 144-158, 1965. Así, se usaron 500 μΙ_ de muestra disuelta en agua, a la cual se le añadieron 2,5 ml_ de reativo Folin-Ciocalteu y 2,0 ml_ de Na ₂ C0 ₃ . La absorbancia se leyó a 765 nm, después de incubar las muestras durante 15 min a 45°C.

Tabla 2.- Rendimientos de extractos acuosos en base seca y húmeda, b.s: considerando secado de 24 h

45°C

El ensayo de inhibición del radical DPPH propuesto en "Use of a free radical method to evalúate antioxidant activity", Brand-Williams W, Cuvelier ME, Berset C . LWT Food Sci Technol 28:5-30 18 (1995), se utilizó para determinar la capacidad donante de protones por parte del extracto. El método se aplicó con una leve modificación tal y como se describe, en donde a 980 μΙ_ de una solución metanólica del radical (6,9 * 10 ^"5 mol/L) se añadieron 20 μΙ_ de una solución acuosa del extracto. La disminución de la absorbancia se registró a 515 nm después de 16 minutos. El porcentaje de inhibición del radical DPPH se calculó frente al registro de un blanco. Intervalos de concentración entre 5 y 40 mg/mL de extractos de Ascophyilum nodosum y Bifurcaría bifurcata se evaluaron para determinar la EC50, cuyos resultados fueron 23.73 ± 3.83 mg extracto /mL y 17.68± 2.2 mg extracto/mL, respectivamente. Estos mismos valores expresados como equivalentes de ácido gálico (EAG) corresponden a 1.08± 0.16 y 1.04 ± 0.13 mg EAG/mL, respectivamente. Especie Sulfatas Acido Polifenoles Oligoelementos

uránico

Azúcares totales

totales

Na K Mg P Ca S mg/g extracto

Ascophyllum 1 15 50 47 44 70 46 9 2 6 18 nodosum

Bifurcaría 156 1 18 55 62.4 20 71 3 1 4 36 bifurcata

Saccorhiza 33 44 10 3 48 180 6 4 3 12 polyschides

Sargassum 122 70 40 12 44 87 23 4 5 19 muticum

Tabla 3. Caracterización de extractos liofilizados a partir de cuatro variedades de algas pardas.

Contenido en polisacáridos:

Se entiende por polisacáridos los polímeros formados a partir de azúcares, principalmente hexosas y/o pentosas, que funcionan como componente estructural y de reserva energética en los vegetales.

Se determinó el contenido en polisacáridos mediante el método fenol-sulfúrico, propuesto en Colorimetric method for determination of sugars and related substances, Dubois, M.; Gilíes, K. A.; Hamilton, J. K.; Rebers, P. A.; Smith, F. Anal. Chem. , 28, 350-356, 1956. Se obtuvo un contenido promedio de carbohidratos de 156.7 mg de glucosa/g de liofilizado del extracto obtenido a partir de la macroalga Bifurcaría bifurcata, siendo un 29% superior al obtenido a partir de Ascophyllum nodosum en similares condiciones.

Se entiende por fucoidanos una familia de polisacáridos característicos de las algas, que son formados por polimerización de derivados de la fucosa, un azúcar sulfatado.

El contenido promedio en fucoidanos fue determinado mediante el procedimiento descrito en Determination of inorganic sulphate in studies on the enzimic and non- enzymic hydrolysis of carbohydrate and other sulphate esters, Dodgson, Dodgson, K. S. . Biochem. J., 78, pp. 312-317, 1961 , y es expresado como sulfatos totales tras la digestión de la muestra. El valor promedio en los extractos de Bifurcaría bifurcata es de 1 18 mg de sulfatos/g de liofilizado, un 134% superior a un extracto de Ascophyllum nodosum obtenido en similares condiciones. Los niveles de azufre determinados mediante técnicas de ICP-OES (media de 36.3 mg S/g liofilizado) fueron el doble de los obtenidos para Ascophyilum nodosum (media de 18.14 mg/g).

Los principales polisacáridos en las algas son los denominados alginatos, formado por polimerización principalmente del ácido glucurónico.

El contenido en alginatos fue estimado a partir del contenido en ácidos uránicos según el método propuesto en New method for quantitative determination of uronic acids, Blumenkrantz et al., Blumenkrantz, N. y Asboe-Hansen, G. Anal. Biochem, 54, pp. 484- 489, 1973. El extracto de Bifurcaría bifurcata mostró un contenido medio de alginatos, expresado como ácidos uránicos y empleando ácido glucurónico como estándar, de 55.1 mg/g de liofilizado, siendo un 15% superior a un extracto de Ascophyilum nodosum obtenido en las mismas condiciones.

Determinación espectrofotomérica de polifenoles totales.

Se empleó el método Folin-Ciocalteau de determinación de polifenoles totales, empleando floroglucinol como estándar. El contenido promedio de polifenoles totales, principlamente florotaninos, en el extracto de Bifurcaría bifurcata, fue de 62.4 mg equivalentes de floroglucinol/g de liofilizado, un 7.3 % superior al obtenido de Ascophyilum nodosum.

Detección cromatográfica de florotaninos: Por florotaninos se entienden polímeros generados por polimerización de floroglucinol (1 ,3,5 trihidroxibenceno), en paralelismo con la denominación de taninos, formados por polimerización de catequina/epicatequina y derivados. Los taninos son componentes de la pared celular de las plantas y los florotaninos lo son en las macroalgas.

Se realizó la extracción de florotaninos a partir del extracto liofilizado, de acuerdo con la metodología propuesta en High-performance liquid chromatographic analysis of phlorotannins from the brown alga Fucus vesiculosus Phytochem, Koivikko et al., 2007, Koivikko, R., Loponen, J., Pihlaja, K. and Jormalainen, V. ,Anal. 18, pp. 326-332,2007, en donde se eliminaron las etapas de lavados con hexano.

Se pesaron 95 mg del extracto de Bifurcaría bifurcata. y se solubilizaron en 25 mL de agua, posteriormente, los florotaninos se extrajeron 4 veces con 10 mL de una mezcla de acetona/agua: 7/3. La muestra se centrifugó para separar el sobrenadante. Las porciones de sobrenadante se unieron y se eliminó la acetona con corriente de N ₂ . El residuo se resuspendió en agua y posteriormente se liofilizó. El liofilizado se disolvió en 1 mL de agua destilada y quedó listo para inyectar al equipo de cromatografía líquida de alta eficacia. El método de separación cromatográfica fue el propuesto en Toxicity and antioxidant activity in vitro and in vivo of two Fucus vesiculosus extracts, .Zaragoza, M.C., López, D., Sáiz, M. P., Poquet M., Pérez J., Puig-Parellada, P., Mármol, F., Simonetti, P., Gardana, C, Lerat, Y., Burtin, P., Inisan, C, Rousseau, I., Besnard, M., and Mitjavila, M.T. . J. Agrie. Food Chem, 56, pp. 7773-7780, 2008.

En la Figura 2, se observan los picos mayoritarios (5-6, 11 y 18) cuya señal se detecta a los 25-26, 30 y 37 min, respectivamente. La máxima absorbancia de la mezcla de florotaninos se observa a los 273 nm, como se muestra en la Figura 3. El perfil del espectro UV-Visible coincide con el de un estándar de la molécula de floroglucinol.