CO01] A presente invenção refere-se a uma micropart icuia com propriedades funcionais e antioxidante que compreende material de parede, surfactante não iônico, óleo essencial de Ocimum gratis-sdmum (alfavaeáo) e óleo essencial de Thymus vulgaris (tomilho) .

[002] Adicionalmente ¹ , a invenção refere-se ao uso da microparticuia para indústria alimentícia, farmacêutica e cosmética corno meio para aumentar a vida de prateleira de produtos cárneos por meio da proteção antioxidante, seja na estocagem do produto evitando sua oxidação ou como aditivo na alimentação animal.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO E ESTADO ΏΑ TÉCNICA

[003] Os antioxidantes sintéticos têm sido largamente utilizados na indústria de alimentes co o conservantes alimentares, devido à sua eficácia e baixo custo, sendo o BHT (butilhidroxitolueno) , BHA (butiihidroxianisol ) , BHQ (butilhidroxiquinona terciária) e PG (propil gaiato) os mais utili ados. No entanto, tais compostos apresentam, restrição em alguns países, pois existe a suspeita de apresentarem riscos potenciais à saúde humana, como efeitos carcinogênicos . Portanto, há um crescente interesse em produtos que sejam naturais e mais seguros para aplicações alimentares, sendo uma tendência progressiva na preferência dos consumidores os antioxidantes naturais .

[004] Ά busca por alternativas a estes produtos tem impulsionado as pesquisas, como os óleos voláteis presentes em plantas aromáticas, que apresentam atividade antioxidante comprovada. Estes óleos, apresentados na forma microencapsulada, demonstraro-se uma estratégia promissora na incorporação das dietas das aves e também na produção de produtos cárneos, a fim de controlar a oxidação iipídica, ser oferecer prejuízos ao consumidor .

[005] O estado da técnica apresenta que existe urna correlação linear entre a alta po centagem de compos os fenólicos da planta e uma alta capacidade antioxidante, comprovada por várias metodologias analíticas (ZHENG; WANG, 2001; KATSUBE et ai., 2004; WOJDYLO et al . , 2007; DUDONNÉ et ai-, 2009). Wei; Shibalttot (2010) avaliaram o efeito antioxidante de 25 tipos de óleos voláteis por quatro diferentes metodologias e classificaram os óleos de tomilho cravo com altos níveis de tirool. (231) e eugenol (77$), respectivamente, como os principais em atividade antioxidante. Corroboram com estes resultados os trabalhos conduzidos por Kahkonen et al. (1999), Lee et aí. (2005) e Woidylo et al. (2007) que identificaram que o óleo essencial do tomilho apresentou—se como potente antioxidante comparável ao BHT e ao alfa-tocoferol .

[006] 0 composto eugenol é tr dicionalmente conhecido como sendo o constituinte de maior proporção no óleo essencial do cravo [Eugenia caryophyllata] . Entretanto, a espécie Oci um çratíssimum . , popularmente conhecida como alfavacão, tem também o eugenol como principal composto identificado em sua composição (SILVA et al., 1999,· VIEIRA et al . , 2001). Revisão apresentada por Prabhu et. al, (2009) destaca várias propriedades reconhecidas e estudadas do 0. gratissímum, ressaltando o eugenol como o componente .majoritário em diferentes partes da planta, dando ênfase à sua atividade antí icrobiana e alta capacidade antioxidante, quando avaliado in vitro. Dor an et al., (2000) avaliaram a capacidade antioxidante in vitro de diferentes compostos de óleos essenciais e concluíram com o maior valor para eugenol, sendo superior ao antioxidante sintético BHA.

[007] Os compostos tiraol e eugenol são reconhecidos coroo ORAS (sigla em inglês para aditivos reconhecidos geralmente corno seguros) pela FDA {Food and Drug àdniinistration) podendo assim, serem utilizados na elaboração de produtos cárneos.

[0 8] No entanto, os óleos essenciais são ingredientes voláteis e sua incorporação requer maiores cuidados, desta forma, o processo de mlcroencapsulação por spxay~drying preserva cie forma roais eficiente estes compostos das condições adversas do meio ambiente como oxigénio, luz e umidade, pois este estará envolto em um material de parede; além da facilidade para a inclusão e dispersão nas misturas cárneas,

[009] Isto posto, o desenvolvimento de um produto natural à base de óleos essenciais microencapsulados , para ser adicionado em carnes, produtos cárneos, e nas dietas dos animais a fim de controlar a oxidação lipidica, sem oferecer prejuízos ao consumidor, ser a de especial valo para a indústria de carne de âves .

[010] Abd El-Alim, S.S.L.. ,et ai . , em 02/99 "Culinary herbs ínhibit lipid oxidation in ra and cooked minced meat patties during storage" descrevem o uso de diversas plantas na inibição da peroxidaçâo lipidica em carne de frango e suíno. As plantas empregadas foram: manjerona, manjerona selvagem, cominho, cravo, menta, noz-moscada, curry, _, canela, manjericão, sáivia, tomilho e gengibre, A invenção proposta difere do trabalho de Abd El- Alim, S. S.L. , et al, principalmente pelo fato da. presente invenção utilizar uma mistura pré-estabelecida de óleos essenciais na forma microencapsulada e que, além da aplicação na formulação de produtos cárneos também pode sêx utilizada na ração das aves para se obter benefícios no controle dos processos oxidati os na carne. Ade ais a presente invenção se trata de um produto com a tecnologia da microeneapsulaçêo, tornando-o mais homogéneo e de fácil manipulação e incorporação, além da determinação de. um nivel ótimo de adição para elaboração de produtos cárneos, e de ração de aves.

[OU] O documento KR1Q133&65S de 08/08/11 se refere a um método de produção de produtos cárneos cuja estabilidade é proporcionada pela supressão da oxidação de gordura devido a um extrato etanóiico de origem natural que atua como antioxidante. A invenção proposta difere do documento KR101335658 principalme te pelo enquanto este documento trata do uso de um extrato etanóiico de "ch i", um extrato adquirido da folha, do tronco e da raiz das plantas Aster scaber, goldenrod, lígulazia fischerí, Âinsliaea acerif lia, Saussurea seoulensis e Saussurea grandífolia, de aplicação por pulverização na carne, enquanto a presente invenção é uma combinação de dois óleos essenciais microencapsulados, que utilizada tanto como aditivo nas dietas das aves como na formulação de produtos cárneos e ambos com a finalidade de conter os processos oxidativos com valores de aplicação bem definidos.

[012] Dawidowicz, A-, et al em 21/05/15 "Does antioxidant properties of t e raain component of essential oil reflect its antioxidante properties? The comparison of antioxidante properties of essential oils and their main components" descrevem um estudo que discute as semelhanças e diferenças entre as atividades antioxidantes de óleos essenciais e seus componentes principais, entre as quais Thymus vulgaris e seu componente: trmol, Caryophyllus aromáticos e seu componente eugenol. A invenção proposta difere do trabalho de Dawidowicz, A., et al principalmente pelo fato da presente invenção ser uma associação compreendendo os óleos essenciais de Thymus vulgaris e Ocimum gratissímum microencapsulados, com at ídade antioxidante comprovada tanto em in vitro como in vivo. Além disso, as análises antioxidantes realizadas in vitro foram confirmadas in vivo, como também utilizando a matriz do produto cárneo através dd emprego de metodologias de análises apropriadas. Ainda destacando, a presente invenção vai além da avaliação in vitro da atividade antioxidante, pois valida duas formas de aplicação do produto: tanto como aditivo nas dietas para frango de corte e o efeito posterior na conservação da carne, tanto como na mistura para a elaboração de produtos cá eos .

[013] O documento W02: ^: Q 143.666.7 de 07/09/12 refere-se a uma composição contendo óleos essenciais de plantas aromáticas da família Lamiaceae, com ação fungicida. Os óleos essenciais são produzidos por extração contínua a partir de Tkymus vulgaris (tomilho) e Origanu vulgate (orégano) . Os óleos produzidos contêm uma elevada quantidade de carvacrol e timol. O produto relatado é uma mistura das duas plantas na sua forma oleosa, sem estipular a proporção e apenas assegurando os limites de cada composto maioritário. A invenção proposta difere do WO201436667 principalmente pela forma de produção e aplicação, como também pelo tipo de plantas utilizadas e pela proporção da associação. Além da forma de aplicação ser para u a finalidade diferente, uma vez que a presente invenção valida duas formas de ação antioxidante (aditivo ¹ para a ração e elaboração de. produtos cárneos), também refere-se a plantas distintas, com a diferenciação tecnológica da mieroencapsulação, que transforma o produto líquido era mícroparticulas na forma de pó, facilitando a manipulação e homogeneização nas matrizes dos produtos,

[014] O documento US20110Õ76376 de 07/04/08 refere-se a uma composição de antioxidante natural para produtos cárneos, caracterizado por ser preparado a. partir de extratos fenólieos de mel. A forma de aplicação é por pulverização, no liquido do marinado, por aspersão ou banho, cujo ob etivo é entrar em conta o cora a carne formando uma película protetora. Desta forma, não há um limite de segurança ou recomendação de níveis para o uso do produto. A invenção proposta difere do documento 05201100.76376 principalmente pelo fato da invenção proposta ser uma associação estabelecida dos óleos essências de Thymus vulgaris e Ocimum grati&simum na forma microencapsulada para ser utilizada tanto como aditivo nas dietas das aves como na formulação de produtos cárneos, ambos com a finalidade de conter os processos oxidativos com valores de aplicação bem definidos.

[015] Kim, Il-Suk, et ai-, em 21/06/11 relatam em "Ant.ioxida.nt Actívities of Hot Water Extracts from Various Spices ^x o uso de extratos com atividade antioxidante. Entre as espécies avaliadas, e que são comumente utilizadas em carnes estão: o tomilho e o orégano. Kim, I.l-Suk, et al . , fazem menção apenas às análises antioxidantes realizadas in vitro, sendo que para se afirmar a efetividade e aplicabilidade da (s) substância (s) em produtos cárneos se faz necessário ensaio in vivo ou utilizando a matriz do produto através de metodologias de análises apropriadas. A invenção proposta difere do trabalho de Kim, Il-Suk, et aí., principalmente pelo fato de que não só analisa a atividade antioxidante in vítro, mas valida duas formas de aplicação do produto: tanto como aditivo nas dietas para frango de corte e o efeito posterio na conservação da carne, tanto como na mistura para a elaboração de produtos cárneos, tendo como referência um dos antioxidantes sintéticos mais utilizados para esta finalidade.

[016] O documento CN1317971C de 26/12/15 re f e re a aplicação dos óleos essenciais de Thymus vugaris e basil como aditivos na ^■ alimentação de frango. 0 percentual de óleo de Thymus vugaris foi empregado na faixa de 1,5-2,5% e o percentual de basil na faixa de 1, 5-2,5% . A invenção proposta difere do documento CN1317971C principalmente pelo fato deste ser uma mistura de vários ingredientes, incluindo óleos essenciais para serem utilizados nas dietas das aves e animais de criação, porém sem especificação ou finalidade de USO, apenas a forma de fabricação do produto, enquanto aquela demonstra desde a forma de fabricação do produto, tecnologia da microencaps lação dos óleos essenciais de Thymus v lgarís e Ocímvm gxatissimxxm, bem como também a finalidade a que servirá esta invenção,

[017] Dashtí, N . D., et ai., em 12/15 em "Antioxidant Effect of Thyme Essential Oi.1 on Oxida ive Stability of Chicken Nuggets" se refere ao uso de óleos essenciais de espécies de tomilho, porém maior ativídade foi observada para Eataria ui tiflora referida neste trabalho "como tomilho", com. a função antioxidante em "nuggets" de frango. O trabalho de Dashti, . D., et al . , é um produto liquido assim há indícios de maior dificuldade de dispersão e homogeneidade na matriz de carne. A invenção proposta difere do trabalho de Dashti, N, D-, et al., principalmente pelo fato de ser avaliado apenas um dos óleos essenciais (mesmo género de planta mas não a mesma espécie do Thymus vulgarís) em relação à presente invenção que compõe a associação de dois óleos essenciais, O produto desenvolvido na presente invenção é uma mistura exata na proporção de 1 para 3 dos óleos (essenciais de Thymus vulgaris e Ocimum gratissímum na forma microencapsulada e com eficácia comprovada em um menor nível de utilização do que o proposto, pois os níveis {1000 e 2000 ppm) que apresentaram resultado positivo no controle da oxidação lipidíca da carne são bem superiores àqueles utilizados na presente invenção f'0 e 140 ppm da associação dos óleos essenciais ) ^: - [018] Diante do exposto, seria útil se a técnica dispusesse de microparticulas compreendendo óleos essenciais, para serem adicionadas em carnes, produtos cárneos, e nas dietas dos animais a fim de controlar a oxidação lipidíca, alternativa como antioxidantes naturais em substituição aos sintéticos.

BREVE DESCRIÇÃO DA INVEN ÃO

[0153] A presente invenção refere-se a uma microparticula antioxidante que compreende:

- Material de parede: Maltodextrina

- Agente emulsíficante : Polysorbate 80, era proporção variável de 8 a 12%, preferencialmente de 10% em massa referente aos sólidos totais;

- Óleo essencial de tomilho e óleo essencial de alfavacâo, na proporção de 1:3;

- 4 a 61, preferencialmente 5% de Óleo essencial de tomilho era massa referente aos sólidos totais;

- 14 a 16%, preferencialmente 15% de óleo essencial de alfavacão, em massa referente aos sólidos totais.

[0203 A micropar icula obtida apresenta tamanho de 1 a 100 Um, sendo o tamanho médio de 50 pm em forma esférica, e è ura sistema de liberação dos óleos de tomilho e alfavacão que estão na concentração entre 15 a 25 g de óleo/100 g de sólidos totais, preferencialmente 20 g de óleo/100 g de sólidos totais. Os referidos óleos apresentam uma porcentage de eugenol variável entre 40% e 60%, preferencialmente um mínimo de 45%; uma porcentage de carvacroi variável entre 2% e 10%, preferencialmente mínimo de 5%, uma porcentagem de p~cimeno variável entre 3% e 10%, preferencialmente mínimo de 8,0%, e uma porcentagem de tiraol variável entre 5% e 15%, preferencialmente mínimo de 7,0%. A microparticula compreende o mínimo de 15% de timoi mais carvacroi e 45% de eugenol (ou a proporção de 1:3 destes constituintes) . O aprisionamento máximo é de 20% de. óleo.

[021] Adicionalmente a micropartícuia, possui aplicação na indústria alimentícia, farmacêutica e cosmética, com ação antioxidante para prolongar a vida de prateleira de produtos, particularmente em. carnes e produtos cárneos, como aditivo na alimentação de animais de criação, como na ração animal, com ação na qualidade cia carne. Entende-se como produtos cárneos na presente invenção: produtos cárneos frescais maturados, produtos cárneos curados, produtos cárneos frescais reestruturados, produtos cárneos salgados, produtos cárneos curados e/ou defumados, produtos curados de salsicharia embutidos e. produtos cárneos enlatados e/ou envasados. Mais especificamente entende- se como almôndegas, hambúrgueres, empanados do tipo nuggets, steak, salsichas.

BKBVB DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figura 1. Aspecto das raícropartícuias de óleos essenciais de . vulgaris e O, gratissimum visualizadas em microscópio óptico. Aumento 400x.

Figura 2. Formação de malonaldeído (MDA) em almôndegas cozidas de peito de frangos alimentados com níveis crescentes de OEM e armazenados a 4°C durante 7 dias.

Figura 3. Formação de malonaldeído (MDA) em almôndegas cozidas de sobrecoxa de frangos alimentados com níveis crescentes de OEM e armazenados a 4°C durante 7 dias.

Figura 4. Níveis de malonaldeído (MDA) nas almôndegas de peito cozidas, de frangos alimentados com níveis crescentes de OEM. Valores médios obtidos durante o período de 7 dias. Letras diferentes (A, B ) significam diferença estatística peio teste de Tukey (P 0, 05) .

Figur 5. Mve s de malonaldeído (MDA) nas almôndegas de sobrecoxa cozidas, de frangos alimentados com níveis crescentes. de OEM. Valores médios- obtidos durante o período de 7 dias. Letras diferentes (A _f B) significam diferença estatística pelo teste de Tukey (P<0,Q5).

Figura β. Formação de malonaldeído (MDA) antes e após o processamento térmico de almôndegas de peito de frangos incorporadas com ΒΉΤ ou dois diferentes níveis de OEM. * diferença estatística em comparação com a carne crua (teste de Durrnet E<0, 05). Letras diferentes (Ά,Β) significam diferença estatística entre os tratamentos após processamento térmico (teste de Tukey P<0,G5).

Figura 7. Formação de malonaldeído (MDA) antes e após o processamento térmico de almôndegas de sobrecoxa de frangos incorporadas com 3ΉΤ ou OEM. * diferença estatística em comparação com a carne crua (test de Dunnet P<0,05). Letras diferentes (A, Bi significam diferença estatística entre os tratamentos após processamento térmico (teste de Tukey P<0, 05).

DESCRIÇÃO DET&LE&DA BA INVENÇÃO

£022] Mícroparticula antioxidante que compreende óleo essencial de Thymus vulgaris; óleo essencial de Ocimum ■gratiss-ímum? Material de parede; e agente emulsificante, sendo que. os óleos essenciais d Thymus vulgaris e de Qcimum gratissimum estão na proporção de 1:3.

[023] O material de parede da mícroparticula antioxidante poder ser selecíonado dentre algínato de cálcio; goma arábica maltodextrína; goma de cajueiro; inuiina; amido; derivados de amido; celulose; derivados de celulose; goma tragacanta; goma Karaia; goma mesquita; goma gelana; pectina; poíissacarideos de soja; poíissacarideos de leite; derivados de poíissacarideos de leite; caseína; gelatina glúten; quítosana ceras; ácidos graxos, preferencialmente maltodext ína . [024] O agente emuisificante da microparticula antioxidante pode ser selecionado dentre surf.actantes não Iónicos , como 2- [.4- (2 , , 4--trimethylpentan-2-yl ) phenoxy] etanol e Polysorbate 80, preferencialmente Polysorbate 80.

[025] Em uma modalidade preferencial a microparticula antioxidante compreend :

- 4 a 6 %,· preferencialraente 5% de Óleo essencial de Thymus vulgaris em massa;

- 14 a 16 , preferencialmente 15% de óleo essencial de Ocimum gratissímum em massa.:

- Maltodextrina como material de parede proporção variável cie 75% a 85%, preferencialmente de 80% em massa referente aos sólidos totais;

- 8 a 12%, preferencialmente 10% de Polysorbate 80 em massa em relação aos sólidos totais,

[026] A microparticula compreende 10 a 30% _r preferencialmente 20% de óleos essenciais. A associação dos óleos de Thymus vnJ.gar.is e Ocimum gratissímum compreende, pelo menos, timol; carvacrol; eugenoi, sendo que a razão dos dois primeiros em relação ao último é de 1:3

[027] O óleo de Thymus vulgarís apresenta porcentagem de timol variável entre 5 e 15%, preferencialmente 7%:. Já o óleo de Ocimum gratissímum apresenta porcentagem de eugenoi variável entre 40 e 60%, preferencialmente 45%.

[028] A associação dos óleos essenciais de Thymus v 1 gari s e de Ocim m gra issi apresenta porce tage de eugenoi variável entre 40 e 60%, preferencialraente 45%, porcentagem de carvacrol variável entre 2 e 10%., preferencialmente 5%, porcentagem de _: p-cimeno variável entre 3 e 10%, preferencialmente 8,0% porcentagem de timol variável entre 5 e 15%, preferencialmente 7,0%. [029] A associação dos óleos essenciais de hymus vulgaris & de Ocimum gratissi um apresenta pelo menos 15% de timol mais carvacrol e pelo raenos 45% de eugenol.

[030] As icroparticulas, apresentam tamanho entre 1 a 100 p.m e tamanho médio de 50 μιυ em forma esférica.

[031] A composição oleosa compreende alfa-tujeno; alfa- pineno canfeno; beta-pineno; beta-irdrceno alfa~felandreno; delta-3-careno; alfa-terpineno; p-cimeno; d-liraoneno; eucalipto! beta-z-ocimeno; gama-terpineno; hidrato de eis sabineno; terpinoleno; linalol; alio-oci eno; cânfora; gama- terpineno; borneoi; terpin-4-ol; alfa~terpineol ; isobornil acetato; timol; carvacrol; alfa-cubeneno; eugenol; alfa- copaeno; beta-bourbonenc; longifoleno; z-cariofileno; beta- gurjune.no; alfa-humuleno; gama-muuro1eno; germacreno~D; aifa- muuroieno; gama-cadineno ; delta-cadineno .

[032] A composição oleosa compreender pelo menos, timol; carvacrol e eugenol, sendo que a razão dos dois primeiros em relação ao último é de 1:3.

[033] Adicionalmente, é objeto cia presente invenção o uso da micropa rtícula para indústria alimentícia, farmacêutica, cosmética e por ser um sistema de proteção dos óleos essenciais de tomilho e alfavacão, uma vez que são compostos altamente voláteis, permitir a formulação de um produto com melhor proteção antioxidante, seja durante a estocagem deste produto, seja co o aditivo na alimentação de animais de criação, para obter ação antioxidante na carne do animai alimentado cora uraa concentração mínima de 350pprn.

[034] A aplicação das micropartícuias em carnes e produtos cárneos para prevenir a oxidação da carne, concentração de 350ppra a OOppm, preferencialmente 700ppm. E a adição na alimentação animal, como na ração, para prevenir a oxidação da carne do animal alimentado é na concentração de 350 a 3500ppm _r pre erencialmente 35G0ppm.

Exemplo de concretização

[035] A Composição química da associação de óleos essenciais, foi determinada através das análises por CG-EM foi, antes do processo de microencapsulação (Tabela 1), e verificou- se que o composto majoritário identificado foi o eugenol (46,45%), seguido pelo carvacrol (8, 40%) , p-cimeno (8, 18%) e. timol (7,05%). A literatura relata que as plantas da familia Lamiaceae e principalmente os óleos esse.nciais comuraente encontrados nos géneros T ymus e Ocimum são ricos nestes compostos e com comprovada atividade antioxidante, pois possuem um ou mais grupos de hidroxila (OH) ligada ao anel aromático,- insaturações e elétrons disponíveis para serem doados.

Tabela 1. Composição quimica (% da associação is óleo essencial de T. vnlgaris e O, grâtíssi nm na proporção 1:3.

Compostos

IR % relativa

(min) identificados

5, 79 926 alfa-tu eno 0, 5

5, 98 933 alfa-pineno 1, 32 o, 38 947 canfe o 0, 83

7, 1 976 beta~pirie.no 0,17

7,54 990 beta-mirceno 0, 65

alf.a-

8, 00 1005 elandreno 0, 48

delta-3-

8,18 1010 carenc 0,13

alfa-

8, 0 1016 terpine.no 0, 25

8,72 1025 p-cimeno 8,18

8, 82 1028 d-iimone o X r 01

8, 7 ^: 1032 eucalipto! 0,58

eta-z~

9, 1G 1036 ocimeno 1,59

ga a-

9,86 1057 te píneno 0,33

hidrato de

10, 26 1068 eis sahineno 0, 14

10, 96 108 terpinoleno 0, 34

11,49 1102 linalol 1 , 6 12 , 55 1127 allo-ocimeno 0, 73

13, 29 1145 cânfora 0, 19

gama-

13,76 1157 terpíne o 0, 8

1 ,15 1166 bor eol 0, 93

14 , 63 1178 terpin-4-ol 1,20

alfa-

15,20 1191 terpineol 0, 30

iso o.rnil

19,24 1287 acetato 0, 57

19,64 1297 timol 7,05

20,07 1307 carvacrol 8,40

21,78 134S a.1fa-cubeneno 0, 22 té,S 53 1366 eugenol 46,45

22 , 7 1376 aifa-copaeno 1,66 beta-

23 , 33; 1385 bourboné o 0, 67

23, 63 1392 m=204 0,43

24, 12 1 04 long.ifoleno 0,23

24,76 1419 z-c riofi ieno 4,29 beta-

25, 09 1 27 gurjuneno 0 , 31

26, 06 1452 a1 fa-humu1eno 0,37 gama-

27, 02 1475 uuroleno 0,89

27, 22 1480 germacreno-D 2, 42 alfa-

27, 94 1498 muuroleno 0,31

28, 48 1512 gama-cadineno 0 , 50 delta-

28,87 1522 cadineno 1,83

TOTAL 37 compostos

Tr - tempo ^: de retenção; IR - índice, de retenção

M croencaps lação da associação de óleos essenciais

[-036} Os óleos de 7. vulgaris e 0. gxâtissimum fo am combinados na proporção 1:3 e submetidos a raicroencapsulação, para uso nos ensaios in vitro e de aplicação in vivo. Como material de parede foi utilizada altodextrina (marca MorRex 1910® com DE 10), da Corn Products ( ogi Guaçu, SP, Brasil). Como agente eraulsificante foi utilizado Poiysorbate 80. As condições operacionais para a raicroencapsulação foram otimizadas utí li'zando-se um mini spray çíryer, variando-se a temperatura de entrada de 180 °C ± 5 ^a C. O gás de arraste utilizado foi o N2 (RODRIGUES, 2004) . [0371 Nesta etapa, 24 g de maltodextrina foi dissolvida em 70 g de água destilada cora a ajuda de um Ultra Tur ax (Ι Ά TlQ ^' } . A. associação de óleos essenciais , compreendendo um total de 6 g, no qual 1,5 g corresponde ao óleo de T, vulgar.!s e 4,5 g de óleo de O. gratíssímum, mais 3 g do agente emulsivo (Polysorbate 80) foi adicionada à prepararão e homogen izada, totalizando 30 % de sólidos totais. Apôs a homogeneização,, a formulação foi passada no mini spray dryer e o resultado final foram raicropartícul as de cor branca contendo, era média, 20 % da associação de óleos essenciais, sendo designado como OEM (óleos essenciais microencapsulados }; .

Caracterização do Processo de lcroencapsulação

[038] As micropartícuias são .brancas, de formato esférico, semelhantes a farinha branca e com õ tamanho variado, sendo em média de 50 μιη, conforme ilustrado na Figura 1. O aspecto a olho nu é uniforme e homogéneo, sendo as diferenças de tamanho percebidas apenas com o uso de microscópio eletronico ou óptico.

[039] A quantificação dos compostos fenólicos totais presentes na associação dos óleos essenciais de ΙΓ. vulgaris e O. gratíssímum na forma pura e microencapsuiada (OEM.) foi determinada pelo método colorimétrico (SINGLETON et al., 1999) utilizando^ o ácido gálico como padrão. A associação de óleos na forma pura (liquida) foi diluída em acetona (0,05 g de OE em Imf de acetona 99 % }; , enquanto: a amostra de OEM foi diluída diretamente: em água Milli-Q. As análises foram feitas em triplicata. A cor azul produzida na redução do reagente Folin- Ciocaiteu pelos fenólicos foi medida em espectrofotôraetro a 740 nm (marca Shimadzu, modelo UV mini 1240} . Os resultados foram expressos em conteúdo de ácido gálico equivalente (mg GAE/100 g) .

[040} A atividade antioxidante pela capacidade de absorção do radical oxigénio (ORAC) , foi determinada através da quantificação do efeito de proteção de um antioxidante e/ou óleo essencial por meio da avaliação da área sob a curva de decaimento de fluorescência da amostr quando comparada corri o branco (maltodextrina) , ou seja, um controle sem a associação dos óleos essenciais ou outro agente antioxidante- Trolox, ura _. análogo solúvel era água de vitamina £, foi usado como um padrão de controle antioxidante. A fluorescência foi monitorada e registada a cada 56 segundos durante aproximadamente 75 min, era Fluorímetro Plousta Óptima ( BMG LABTECfí, Alemanha) a 37°C e com filtro de excitação de 4:85 nm e de emissão de 520 nm. As análises foram feitas em triplicara . Os resultados obtidos para a associação de óleos essenciais na forma pura e microencapsuiada (OEM) foram expressos como concentração de trolox equivalente /mg cie amostra.

[041] Estas análises para determinar a quantidade de fenólicos totais e a capacidade antioxidante da associação cie óleos essenciais foram realizadas antes (OE liquido) e após a mieroencapsulaçâo (OE microencapsuladò) (Tabela 2) , para verificar perdas durante o processo de microencapsulação, uma vez que a amostra liquida composta de óleos voláteis é submetida a um processo de alta temperatura, mas durante ura curto período. Considerando a base de 100% para os valores determinados na forma liquida que foram respectivamente de 107,77 e de 986,76 para fenólicos totais e ORAC,. observa-se que a proporção dos resultados na forma microencapsuiada foi de 28 e 21% na matéria natural. Este valor está de acordo com a quantidade de óleo que foi incorporado à micropartieula (20%) durante o processo no spray-drying, concluindo que a técnica de microencapsulação não afetou a quantidade de fenólicos e a atividade antioxidante da associação . Tabela 2. Determinação da atividade antioxidante capacidade de absorção do radical oxigénio (OR&C)

Natureza da Fenólicos QR&C amostra totais ( trolox/mg de

(mg AG/mg amostra) amostra)

OE 30±1, 36

210+29 (21%) microencapstiiado (2SI) *

* ^■ Porcentagem relativa considerando a amostra na forma liquida cama 100%.

[042] Com a associação na forma mícroencapsulada e com comprovada atividade antioxidante, iniciou-se o ensaio com os frangos de corte avaliando níveis crescentes de inclusão do OEM nas dietas. Foi avaliado o desempenho durante o período de 1 a 21 dias de idade (Tabela 3) e, aos 35 dias, o peso (%->do fígado em relação ao peso vivo das aves (Tabela 4) .

Manejo experimental

[043] Foram utilizados 125 pintos de corte de 1 dia de idade da linhagem CobbSOQ, sendo todos machos. No primeiro dia do experimento, aves com pesos homogéneos foram alojadas em gaiolas em uma sala previamente limpa e desinfetada ., As gaiolas fora alceadas em ura galpão de alvenaria, sendo a temperatura ambiente ideal para as aves obtida através do manejo de cortinas, ventiladores e exaustores, de acordo com as recomendações descritas no manual para a linhagem CobbSOO. O aquecimento nos primeiros dias de vida foi realizado por lâmpadas dispostas em cada gaiola.

[044] O período experimental foi de 35 dias, com fornecimento de água e ração à vontade para as aves. As dietas dos ^• tratamentos-, todas na forma farelada, foram compostas por milho, farelo de soja, óleo de soja e um premix vitamínico mineral para frangos de corte (F30110NB, Cargill) . Todos os macro e micro ingredientes estavam presentes na mesma quantidade, entre os tratamentos, sendo a única diferença a inclusão do OEM e/ou maltodextrina, utilizada como ingrediente "inerte". A formulação das dietas buscou atender ou exceder as exigências do National Research Council - RC (1999; . As dietas experimentais foram formuladas sem a inclusão d antibióticos, coccidiostáticos, enzimas e antioxidantes,, além daquele contido no preraix (F30110NB, Cargill) para preservar as vitaminas da dieta.

[045] Os tratamentos, com níveis crescentes de inclusão da associação de óleo essencial microencapsuiado (OEM) foram designados como: Tl- Dieta controle negativo (sem inclusão de OEM; T2- Dieta com inclusão de 350 ppm de OEM í correspondente a 70 ppm da associação pura) ; T3- Dieta com inclusão de 700 ppm de OEM ( (correspondente a 140 ppm da associação oura) ; T4- Dieta com inclusão de 3500 ppm de OEM (correspondente a 700 ppm da associação pura) , conforme pode ser verificado nas tabela 3 e 4.

Tabela 3. Peso corporal das aves (PM) aos 21 dias, consumo de ração (CR) , ganho de peso (GP) e conversão alimentar (CA) no período de 1 a 21 dias de idade .

Tratamentos PM21 C5¾. GP CA

1-21 1-21 1-21

Tl- Controle 9 9 1301 948 1 , 3:7

T2-350 OEM 1024 1293 974 1, 33

T3- 700 OEM 1004 1300 953 1,36

T4- 3500 OEM 1010 1310 959 1,37

P obabilidade 0, 862 0, 933 0, 861 0 , 287 cv, % 4,4 4, 6 4,7 2,5 i.0 6 j No período entre 1 e 21 dias de idade, os tratamen os foram distribuídos em um delineamento em biocos casualizados ⁽ cada bateria de gaiolas será um bloco), sendo as gaiolas consideradas as unidades experimentais. Cada tratamento foi composto por quatro repetições de seis aves cada, totalizando 24 aves /tratamento. De 21 a 35 dias, cada ave foi considerada uma unidade experimentai (repetição), sendo oito aves/ tratamento.

[047] Ao finai do experimento (35 dias de idade) todas as aves de cada tratamento foram abatidas por deslocamento cervical, para determinação do tamanho de fígado. Após pesagem, cada ave foi desossada e retiradas a pele e cartilagem. Antes de serem embalados foram colocados em um balde com gelo ( chi.I ler; , identificados e armazenados em câmara fria à -20°C por 24 h. Após este período, foi realizada análise de pH com o objetivo primário de verificar se houve alguma alteração do tipo DFD (do inglês dark, firm and dried) ou ?SE (palid, soft, exuda ive) nas carnes. As peças que apresentaram alguma destas alterações não foram utilizadas no ensaio de vida de prateleira. As medições de pH foram determinadas pela leitura direta em pHmetro digital previamente calibrado com soluções tampão de pH 4,0 e 7,0, através da introdução do eletrodo ao músculo (IAL, 2008). Foram tomados seis pontos diferentes de leitura por amostra e considerada a média. A seguir, as partes de peito e sobrecoxa foram congeladas à -20 °C e armazenadas a vácuo em sacos plásticos com baixa permeabilidade ao oxigénio e devidamente identificados até realização das análises posteriores,

Tabela 4 _* Peso relativo ao peso corporal (%) de fígado das aves aos 35 dias de idade.

Tratamentos %Fígado

T2- 350 ppm OEM 1,98 ^b

T3- 700 ppm OEM 1,88 *

T - 3500 ppm OEM 2,40 ^a Probabilidade 0,002

CV, % π,ι

a.b diferentes- letras significam, diferenças estatísticas pelo teste cie Tukey (P¾),G5

[048] O desempenho não foi afetado significativamente (P>0,05) pelos diferentes níveis de inclusão de OEM na dieta dos frangos de corte (Tabela 3) . Neste experimento, era que o objetivo central foi o de avaliar a vida de prateleira da carne destas aves, a análise do desempenho visou justamente verificar se não haveria prejuízos, principalmente com relação ao consumo de ração. Um. dos motivos para irdcroencapsular a associação de óleos essenciais foi o de amenizar alguns efeitos organolépticos que são exacerbados nestas substâncias e podem, de alguma forma, interferir no consumo dos produtos a que são misturados, no caso a ração. O consumo de ração foi muito semelhante entre os diferentes tratamentos, indicando que não houve qualquer tipo de interferência na adição dos OEM na dieta das aves e sendo um ponto positivo na avaliação desta categoria de aditivo.

[049] A porcentagem de fígado das aves foi afetada significativamente {P<8, 05) pela inclusão de níveis de OEM era suas dietas (Tabela 4) . As aves do tratamento que receberam o maior nível de inclusão de OEM (3500 pprr foram as que apresentaram o maior fígado em relação ao peso vivo (P< ^Q , ^Q 5). Esta análise de fígado teve como objetivo verificar algum estimulo relacionado à produção de enzimas hepáticas quando da ingestão dos óleos essenciais. Apesar da maior I de fígado das aves do tratamento T4, quando se compara com aquelas do tratamento Tl (Controle) a diferença não foi significativa, inferindo que a diferença não foi devido à. presença da associação de óleos essenciais no organismo das aves.

Efeito da inclusão de OEM na ração dos frangos sobre a oxidação lipidica da carne de frango (almôndegas de peito © sobrecoxa) após processamento térmico e armazenamento sob refrigeração

[050] As amostras de carne (peito e sobrecoxa) sem osso e sem pele foram descongeladas diarante uma noite sob refrigera ão à 4 ^<3 C. Em seguida, toda gordura aparente foi retirada e as partes moídas con untamente em moedor de carne (Myralux, 12.00 W) , sendo formado por tratamento um pool de peito e outro de sobrecoxa. Em média foi obtido um total de 5,0 kg de peito e 3,5 kg de sobrecoxa pára cada tratamento..

[051] Para todos os tratamentos foram adicionados 0,5% de cloreto de sódio à massa cárnea que foi homogeneizada e pesada em porções de 301:1 g de carne, e em seguida moldadas no formato de almôndegas. As almôndegas foram embaladas em saco de polietileno com baixa permeabilidade ao oxigénio e cozidas era água fervente a 1Q0°C durante 8 min, de acordo com Racaniccí et al. (2004). Em seguida foram resfriadas em água com gelo, reensacadas em sacos de polietileno com alta permeabilidade ao 02, e esboçadas no escuro em câmara fria a 411°C. Cada saco foi identificado e composto por almôndegas referentes aos tratamentos experimentais .

[052] Para o ensaio de inclusão dos QEM na dieta das aves, as almôndegas foram avaliadas quanto a oxidação lipídica peio teste de TBARS, após os períodos de Q, 2, 4 e 7 dias. Foram ana1 isadas 6 almôndegas /dia/tratamento.

[053] Do pool proveniente das aves do tratamento Tl (controle - sem. adição de qualquer aditivo antioxidante), foi retirado um total de 2 kg de massa de peito e 1 kg de sobrecoxa para o ensaio de incorporação do OEM diretamente na carne de frango, conforme descrito a seguir:

Ensaio com o peito : Para a carne de peito foram aplicados os seguintes tratamentos: Tl- tratamento controle (sem adição de qualquer aditivo antioxidante); T2- tratamento com adição de 150 ppm de BHT (99,9 ); T3- tratamento com a adição de 70Q ppm de OEM (correspondente a 1 0 ppm da associação pura); T4- tratamento com a adição de 350 ppm de OEM (correspondente a 70 ppm de associação pura) . As análises referentes à oxidação lipidica foram realizadas com a carne crua e logo apôs o cozimento, sendo analisadas 4 aImôndegas/t atamento .

Ensaio com a sobrecoxa: Para a carne de sobrecoxa foram aplicados os seguintes tratamentos: Tl- tratamento controle (sem adição de qualquer aditivo antioxidante); T2- tratamento com adição de 150 ppm de BHT (99,9 %) ^' ; T3- tratamento com a adição de 700 ppm de OEM (correspondente a 140 ppm da associação pura)■ As análises referentes a oxidação Lipidica foram realizadas com a carne crua e logo após o cozimento, sendo analisadas almôndegas/tratamento.

Oxidação lipidica - Análise de TBARS

[054] As amostras de carne de peito e sobrecoxa foram submetidas â avaliação de estabilidade oxidatíva através da reação com o ácido 2- tiobarbitúrico (TB RS) . A metodologia foi realizada de acordo com. Vyncke (1970), com algumas modificações ( S0RENSEN; J0RGENSE , 1996. As amostras d 5 g de carne foram pesadas, acrescidas de 15 raL de solução contendo 7,5 % de ácido tricloroacético ("TCA) , 0,1 % de pro il gaiato (GP) e 0,1 de ácido etilenodiamino tetra-cétice (EDTA) . Após homogeneização em Ultra-Turrax por 45 ^: segundos a 13.500 rpm, os aldeídos foram extraídos com TCA, diluídos com EDTA (agente quelante) e GP (antioxidante), a fim de evitar a oxidação das gorduras durante a ex ação. Apôs este procedimento, foram, adicionados 5 raL do reagente TBA (0,02 M) , sendo o valor de TBARS determinado por espectrofotometria nos comprimentos de onda de 532 e 600 nm, e os valores expresso-s como malonaldeído (umol/kg de amostra de carne) .

[055] O: armazenamento sob ref igeração durou 7 dias e foi utilizado ura filme plástico permeável ao oxigénio para embalar a almôndegas e simular condições mais: extremas. A oxidação lipídica foi desenvolvida durante os dias em todos os tratamentos como pode ser observado nos altos níveis de TBARS tanto na carne de peito (Figura 2) como na carne de sobrecoxa (Figura 3). Portanto, este aumento se aplica principalmente à carne escura

(coxa e sobrecoxa) , por apresentarem maiores concentrações de ácidos graxos polí-insaturados em relação à carne branca (peito)

( JENSEN, et al. , 1997) .

[056] As almôndegas de peito (Figura 2} de frangos alimentados co níveis de OEM não controlaram a oxidação lipídica em. comparação ao grupo controle (0) , pelo contrário, o nível de inclusão de 350 ppm nas dietas piorou de forma significativa a produção de malonaldeído (IMDA) (P<0,05), Este resultado não condiz com aqueles observador nas almôndegas de sobrecoxa

(Figura 3) . A carne ci sobrecoxa possuí três vezes mais gordura do que a carne de peito ÇBragagnolo, 2001) e este é um indicio de uma ação mais evidente da ingestão dos óleos essenciais no músculo dos animais. Nas almôndegas de sobrecoxa (Figura 3), a partir de .2 dias de refrigeração o tratamento em que as aves ^• consumiram o maior nível de OEM (3500 ppm) diferiu estatisticamente do grupo controle, que apresentou o pior resultado entre os grupos (P 0,05).

[057] Os valores médios de malonaldeído (MOA) obtidos durante todo o período de refrigeração (7 dias) estão: indicados nas Figura 4 (almôndegas de peito) e Figura 5 (almôndegas de sobrecoxa) . Estes resultados demonstrara claramente a não efetivídade dos óleos essenciais em carne com menor teor de gordura (peito) ,· havendo diferenças significativas no período acumulado apenas entre o grupo controle (0) e aqueles suplementados com 350 ppm de OEM n ração, que apresentou o pior resultado (P<0,05) . Em contrapartida, ficou evidente quando se avaliou as almôndegas de sobrecoxa (Figura 5), que a carne das aves alimentadas com o maior nível de OEM em suas dietas (3500 ppm) apresentou um melhor controle na formação de produtos de oxidação quando comparado ao grupo controle (P<0, 05) . Os tratamentos com níveis intermediários de OEM demonstraram valores intermediários de TBARS, podendo também serem considerados como medida preventiva de controle de oxidação lipídic .

Incorporação direta na carne de n veis de OEM sobre a oxidação Ixpxdica antes e após processamento térmico

[058 As carnes provenientes de. aves do grupo controle (sem inclusão de aditivo antioxidante) foram separadas e homogeneizadas em partes iguais para a incorporação dos tratamentos experimentais. Antes de serem submetidas ao tratamento térmico foi retirada uma amostra que representou o tratamento da carne crua .

[0.59] Corno observado para as almôndegas de carne de peito (Figura 6) e de sobrecoxa ( Figura 7) o processamento térmico de forma gerai aumentou os níveis de malonaldeido na carne, comparação de cada tratamento pós-processamento térmico em relação ao tratamento da carne não processada termicamente - esta diferença é sinalizada pelo entre os tratamentos. Isto indica que as etapas de processamento de carnes, tais como moagem e cozimento favorecem as condições para o desenvolvimento de produtos de oxidação (MITSUMOTO et ai-, 2005). Sheehy et al. (1993) relataram que o cozimento aumentou a oxidação lipídica em tecidos musculares de f ango de 4-10 vezes, comparados com tecidos crus. Entretanto _. , na carne de peito (Figura 6) os grupos com a inclusão de BHT e 350 ppm de OEM foram eficientes em conter os processos oxidativos permanecendo com os níveis de TBARS sem diferença significativa quando comparado ao grupo da carne crua, ou seja, antes de passar por processamento térmico (P>0,05), Para a carne de sobrecoxa (Figura 7) que apresenta um maior teor de gorduras, apenas o tratamento com OEM (700 ppm) e não o tratamento com BHT, foi capaz de inibir o processo de oxidação causado pelo aquecimento, não diferindo dos valores da carne crua (PM], 05 ) ..Desta forma, como conclusão para o impacto do aquecimento térmico nos níveis de TBARS, a adição de. 350 ppm. de OEM na carne foi eficiente em conter o processo oxidativo acentuado por este fenómeno na carne de peito e, para carne de sobrecoxa, foi. o nível de 700 ppm de OEM.

[060] Na comparação entre todos os tratamentos logo após o processamento térmico, tanto na carne de peito (Figura 6) como na carne de sobrecoxa (Figura 7) , aqueles com a inclusão de algum aditivo (BHT ou OEM) foram eficientes em conter os processos oxidativos quando comparado ao grupo Controle (sem inclusão de aditivo) (P<0,05), comparação entre os tratamentos pós- processamento térmico, sinalizado pelas diferentes letras "A, B, C"- significam diferença entre os tratamentos. Um destaque se faz para a inclusão de 700 pp de OEM na fabricação das almôndegas de sobrecoxa, já que os níveis de m lonaIdeido ficaram abaixo daqueles produzidos pelo tratamento com BHT. Importante lembrar, que o total de óleos essenciais presentes na micropartícuia gira ao redor de 20%, ou seja, na quantidade de 140 ppm neste nível de 700 ppra de inclusão-.

[061] A associação de óleos essenciais de T. vulgaris e O. grãtissi na forma microencapsulada se mostrou efetíva em conter os processos oxidativos da carne de frango, quando misturadas à ração das aves. Neste caso, tais efeitos foram observados para & carne das aves alimentadas com o maior nível de inclusão (3500 ppm) , eia almôndegas de sobrecoxa submetida a tratamento térmico.

[062] A associação de óleos essenciais microencapsulados quando incorporada nos níveis de 350 ppm e 700 ppm diretamente na carne de frango, foram efetivos em conter os processos oxidativos em relação ao controle, nas almôndegas de peito e sobrecoxa, além do nível de 700 ppm de OE ser mais eficiente que o antioxidante sintético (BHT) nas almôndegas de sobrecoxa.