Die effektive Behandlung von Schmerz ist eine große Herausforderung für die molekulare Medizin. Akuter und transitorischer Schmerz ist ein wichtiges Signal des Körpers, um den Menschen vor schwerem Schaden durch die Umgebung oder Überbelastung des Körpers zu bewahren. Im Gegensatz dazu hat der chronische Schmerz, der länger anhält als die Ursache des Schmerzes und der erwartungsgemäße Zeitrahmen der Heilung keine bekannte biologische Funktion und betrifft Hunderte von Millionen Menschen weltweit. Rund 7,5 Mio. Menschen leiden allein in der Bundesrepublik Deutschland an chronischen Schmerzen.

Unglücklicherweise ist die pharmakologische Behandlung des chronischen Schmerzes noch unbefriedigend und bleibt daher eine Herausforderung für die aktuelle medizinische Forschung. Die derzeit existierenden Analgetika sind häufig nicht ausreichend wirksam und haben z. T. schwere Nebenwirkungen.

Daher werden vielfach neue Targets, körpereigene Strukturen, über die eine schmerzmodulierende Einwirkung, beispielsweise niedermolekularer Wirkstoffe oder anderer Verbindungen wie Antisense Oligodesoxynukleotide (ODN), möglich erscheint, für die Behandlung insbesondere chronischer Schmerzen gesucht. Die PlM1-Kinase ist ein vielversprechender Ansatzpunkt für die Entwicklung neuer

Schmerzmedikamente. Die cDNA-Sequenz von PIM1-Kinase, human findet sich in den Datenbanken unter AN : NM_002648. Die Aminosäure-Sequenz von P1M1-Kinase, human findet sich in den Datenbanken unter AN : NP002639. Die cDNA-Sequenz von P1M1-Kinase, Ratte findet sich in den Datenbanken unter AN : NM_017034. Die Aminosäure-Sequenz von PIM1- Kinase, Ratte findet sich in den Datenbanken unter AN : NP058730. Die cDNA-Sequenz von PIM1-Kinase, Maus findet sich in den Datenbanken unter AN : NM_008842. Die Aminosäure-Sequenz von PIM1-Kinase, Maus findet sich in den Datenbanken unter AN : NP032868.

Antisense Oligodesoxynukleotide (ODN), Ribozyme und andere katalytische Nukleinsäuren können zur Behandlung, insbesondere des chronischen Schmerzes durch Abbau oder Veränderung der mRNA ausgewählter Targets-im Falle dieser Erfindung die vorangehend beschriebene PlM1-Kinase-eingesetzt werden, deren Expresssion herunterregulieren und damit die Anzahl der Targetproteine pro Zelle verringern. Die ODN lagern sich an die mRNA an und blockieren so zum einen die Translation und initiieren zum anderen den Abbau der mRNA durch RNase H, die RNA in einer DNA/RNA Duplex spaltet. Porreca et al.

(1999) konnten zeigen, dass intrathekal applizierte ODNs gegen den PN3/SNS-Kanal bei Ratten die Entwicklung von Hyperalgesie und Allodynie durch chronische Nerven-oder Gewebeschädigung verhindern.

Auch wenn die Sequenz des PIM1 Gens bekannt ist, so kommt es doch für eine effektive Blockierung und Spaltung der mRNA insbesondere auf die Auswahl der richtigen Antisense-Oligodesoxynukleotide, Ribozyme und anderen katalytische Nukleinsäuren an. Die mRNA des Targets ist meist gefaltet und nur an wenigen Stellen für eine Anlagerung und nachfolgende Spaltung zugänglich. Über die richtige Auswahl der ODN ist aber im Stand der Technik nichts bekannt.

Aufgabe der vorliegenden Schrift war entsprechend die Entwicklung von Antisense Oligodesoxynukleotiden und katalytischer Nukleinsäuren sowie entsprechender Ribozyme gegen die mRNA des PIM1. Ein Gegenstand der Erfindung ist daher ein Oligonukleotid enthaltend oder entsprechend eine (r) Basensequenz gemäß einem der Unterpunkte (b) bis (j) in einer der Abbildungen 1,2, 4,5, 6,7, 8,9, 10, 11, 12,13, 14, 15 oder 16 oder eine (r) sich in maximal einer abweichenden Base davon unterscheidende (n) Sequenz, wobei sich die Abweichung in der Base nicht im Unterpunkt (a) abgebildeten Sequenzbereich befindet. Dabei bedeutet Oligonukleotid im Sinne dieser Erfindung ein Molekül mit zwischen 2 und 40 Nukleotiden..

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Oligonukleotid enthaltend oder entsprechend eine (r) Basensequenz gemäß einem der Unterpunkte (b) bis (j) in einer der Abbildungen 1,2, 3,4, 5,6, 7,8, 9,10, 11,12, 13, 14, 15 oder 16.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Oligonukleotid enthaltend oder entsprechend eine (r) Basensequenz gemäß Unterpunkt (k) in einer der Abbildungen 1,2, 4,5, 6,7, 8,9, 10,11, 12,13, 14,15 oder 16 oder eine (r) sich in maximal zwei abweichenden Base, vorzugsweise einer, davon unterscheidende (n) Sequenz, wobei sich die Abweichung (en) in der (n) Base (n) nicht im im Unterpunkt (a) abgebildeten Sequenzbereich befindet (n).

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Oligonukleotid enthaltend oder entsprechend eine (r) Basensequenz gemäß Unterpunkt (k) in einer der Abbildungen 1, 2,3, 4,5, 6,7, 8,9, 10,11, 12,13, 14,15 oder 16.

Ein bevorzugter Gegenstand der Erfindung ist auch ein erfindungsgemäßes Oligonukleotid gemäß einer der vorgenannten erfindungsgemäßen Formen der Oligonukleotide, bei dem das

Oligonukleotid ein Länge von 15 bis 30, vorzugsweise 15 bis 25, insbesondere 17 bis 19 oder genau 18, Nukleotiden aufweist.

Ein weiterer bevorzugter Gegenstand ist auch ein erfindungsgemäßes besonders bevorzugtes Oligonukleotid (im folgenden Oligonukleotid A genannt) gemäß einer der vorgenannten erfindungsgemäßen Formen der Oligonukleotide, bei dem-gegebenenfalls in einer Base abweichend-die in den Oligonukleotiden enthaltene oder diesen entsprechende der Basensequenz einer der Abbildungen 1,2, 3,4, 9,10, 11,12, 15 oder 16 zu entnehmen ist. Damit sind insbesondere Oligonukleotide gemeint, die als besonders effektiv erkannt wurden bzw. entsprechende Sequenzen gegebenenfalls leicht abweichend enthalten, mit hoher Bindung an die mRNA des PIM1 zu binden (s. Oligos K2, K3, K6, K17 und K24 bzw. die entsprechenden humanen Sequenzen).

Ein weiterer besonders bevorzugter Gegenstand ist auch ein erfindungsgemäßes besonders bevorzugtes Oligonukleotid (im folgenden Oligonukleotid B genannt) gemäß einer der vorgenannten erfindungsgemäßen Formen der Oligonukleotide, bei dem-gegebenenfalls in einer Base abweichend-die in den Oligonukleotiden enthaltene oder diesen entsprechende Basensequenz einer der Abbildungen 1,2, 3,4, 11 oder 12, vorzugsweise 1,3 oder 11, insbesondere 1 oder 3, zu entnehmen ist.

Ein bevorzugter Gegenstand der Erfindung ist ein erfindungsgemäßes Oligonukleotid das mindestens eine modifizierte oder unmodifizierte Ribose, mindestens eine modifizierte oder unmodifizierte Phosphodiesterbindung und/oder mindestens eine modifizierte oder unmodifizierte Base aufweist.

Ein ganz besonders bevorzugter Gegenstand der Erfindung ist ein erfindungsgemäßes Oligonukleotid, bei dem mindestens eines der

Nukleotide, insbesondere mehrere der Nukleotide,"Locked Nucleic Acids" ("LNA") sind oder mindestens eines der Nukleotide, insbesondere alle Nukleotide, Phosphorothioate sind, vorzugsweise ein solches, bei dem mehrere der Nukleotide"Locked Nucleic Acids" ("LNA") sind."Locked nucleic acids" ("LNA") sind Ribonukleotide, die eine Methylen-Brücke enthalten, die den 2'-Sauerstoff der Ribose mit dem 4'-Kohlenstoff verbindet (s. Abb. 27). Einen Überblick über LNA geben Braasch D. A. und Corey, D. R. (2001), Locked nucleic acids (LNA) ; fine-tuning the recognition of DNA und RNA. Chem. Biol. 8,1-7. Dieser Artikel ist ausdrücklich Mitbestandteil der vorliegenden Beschreibung und Offenbarung. LNA werden beispielsweise von der Firma Proligo, Boulder, CO, USA angeboten. Auch Phosphorothiate sind dem Fachmann bekannt und können beispielsweise bei MWG-Biotech AG, Ebersberg, Germany bestellt werden.

Bevorzugt sind hierbei Oligonukleotide, in denen die"LNA"am 5'-und 3'- Ende des Oligonukleotids liegen, vorzugsweise jeweils die letzten 2-5 Nukleotide, insbesondere jeweils die letzten 4 oder 5 Nukleotide, am 3'- und 5'-Ende des Oligonukleotids"LNA's"sind, und/oder in denen > 6, insbesondere > 8 zusammenhängende Nukleotide im Oligonukleotid keine"LNA"sind, vorzugsweise bei denen von den im Sequenzbereich gemäß jeweiligen Unterpunkt (a) abgebildeten Nukleotiden des Oligonukleotids gemäß einer der Abbildungen 1 bis 16 Unterpunkt (b) bis (k) nur jeweils höchstens eines oder keines der Nukleotide eine"LNA"ist.

Bei den mit LNA oder Phosphorothioaten modifizierten Oligonukleotiden ist es besonders bevorzugt, wenn es sich um ein erfindungsgemäßes

Oligonukleotid A oder erfindungsgemäßes Oligonukleotid B, vorzugsweise ein erfindungsgemäßes Oligonukleotid B (s. o.).

Generell ist ein besonderer separater Gegenstand der Erfindung Nukleinsäuren, insbesondere Oligonukleotide, bei denen mehrere der Nukleotide"Locked Nucleic Acids" ("LNA") sind, in denen die"LNA"am 5'- und 3'-Ende des Oligonukleotids liegen, vorzugsweise jeweils die letzten 2- 5 Nukleotide, insbesondere jeweils die letzten 4 oder 5 Nukleotide, am 3'- und 5'-Ende des Oligonukleotids"LNA"sind, und/oder in denen > 6, insbesondere > 8 zusammenhängende Nukleotide im Oligonukleotid keine "LNA"sind. Die bisher bezüglich der LNA ausgeführten Ausführungsformen gelten auch für diesen Gegenstand.

Ein ganz besonders bevorzugter Gegenstand der Erfindung ist ein erfindungsgemäßes Oligonukleotid, das als si-RNA vorliegt. Beispiele für si-RNAs finden sich in der US 6,506, 559, der EP 1 144 623, der WO 01/75164 oder der W002/44321, die hiermit Teil der vorliegenden Offenbarung sind.

Ein weiterer bevorzugter Gegenstand ist auch ein Polynukleotid-Konstrukt enthaltend mindestens ein erfindungsgemäßes Oligonukleotid. Hier ist Polynukleotidkonstrukt in einem sehr weiten Sinne zu verstehen. Es umfaßt RNA und DNA und Nukleotide ab einer Länge von mindestens 20 Nukleotiden. Dabei versteht man unter (rekombinantes) Polvnukleotid- Konstrukt eine generelle Bezeichnung für jede Art von DNA-bzw. RNA- Molekülen, die durch die in vitro-Verknüpfung von DNA-, RNA-Molekülen entstanden sind. Unter Polynukleotid versteht man folgendes : Das zugrundeliegende Nukleotid ist ein grundsätzlich aus Nukleinbase, Pentose und Phosphorsäure bestehender Grundbaustein der Nukleinsäuren. Diese entspricht einem hochmolekularen Polynukleotid aus mehreren Nukleotiden, die über Phosphorsäure-Pentose-Veresterung miteinander verknüpft sind. Unter die Erfindung fallen aber auch modifizierte

Polynukleotide, die zwar die Basenabfolge beibehalten, aber über ein modifiziertes Rückrat statt der Phosphorsäure-Pentose verfügen.

Ein weiterer bevorzugter Gegenstand ist auch ein Polynukleotid-Konstrukt enthaltend in zwei voneinander getrennten Bereichen die beiden Nukleotidteilsequenzen Abschn. I und Abschn. III gemäß einem der Unterpunkte (I)- (n) oder die beiden Nukleotidteilsequenzen Helix I und <BR> <BR> Helix Ht gemäß einem der Unterpunkte (o) - (q) in einer der Abbildungen 1, 3,4, 5,6, 7, 8, 9,11, 12,13 oder 15 oder von diesen Nukleotidteilsequenzen jeweils maximal in einer Base abweichende Nukleotidteilsequenzen. Genaueres über die Aufteilung der beiden Bereiche kann man der Fig. 24) (Helix I und Helix 111/Ribozym) und bei Santoro et al. (1997) FIG. 2 S. 4264 (Abschnitt I und Abschnitt III/DNA- Enzym) entnehmen, wobei der Inhalt der letzteren Literaturstelle ausdrücklich mit zur Offenbarung der vorliegenden Anmeldung gehört.

Ein weiterer bevorzugter Gegenstand ist auch ein Polynukleotid-Konstrukt kodierend für mindestens ein erfindungsgemäßes Oligonukleotid. Darunter ist insbesondere eine abzulesende DNA oder ein Vektor enthaltend DNA oder RNA ist, dessen Produkt ein erfindungsgemäßes Oligonukleotid ist oder sein kann.

Ein weiterer bevorzugter Gegenstand ist auch ein erfindungsgemäßes Polynukleotid-Konstrukt, bei dem es sich um ein Ribozym, ein DNA-Enzym, einen Vektor, insbesondere einen Expressionsvektor, oder eine PNA handelt.

Dabei heißt generell im Sinne dieser Erfindung : : - (Klonierungs) vektor : Generelle Bezeichnung für Nukleinsäure-Moleküle, die beim Klonieren als Träger von Fremdgenen oder Teilen dieser Gene dienen.

Expressionsvektor : Bezeichnung für speziell konstruierte Klonierungsvektoren, die nach Einbringen in eine geeignete Wirtszelle die Transcription und Translation des in den Vektor einklonierten Fremdgens erlauben.

- PNA : International gebräuchliche Abkürzung für peptidic Nucleic Acids.

Hierbei bilden peptidisch verknüpfte Aminosäuren eine Kette, wobei die Aminosäuren als Seitenkette eine für die Hybridisierung mit DNA oder RNA fähigen Base trägt.

- Sequenz : Abfolge von Nukleotiden oder Aminosäuren. Im spezifischen Sinne dieser Erfindung ist damit die Nukleinsäuresequenz gemeint.

Ribozym : Bezeichnung für eine katalytisch aktive Ribonukleinsäure (z. B. Ligase, Endonuklease, Polymerase, Exonuklease), s. z. B.

Hammerhead-Ribozyme gemäß Abb. 24 oder 25 sowie die Beschreibung der Abbildungen oder s. Vaish, N. K et al. (1998), Nucl.

Acids Res. 26, 5237-5242.

DNA-Enzym : Bezeichnung für ein DNA-Molekül, das katalytische Aktivität beinhaltet (z. B. Ligase, Endonuklease, Polymerase, Exonuklease), s. z. B- DNA-Enzym 10-23 gemäß Abb. 26 sowie die Beschreibung der Abbildung oder s. Santaro und Joyce (1997) Proc.

Natl. Acad. Sci. USA 94,4262-4266.

- katatvtische RNA/DNA : generelle Bezeichnung für Ribozyme bzw. DNA- Enzyme (s. o.).

Ein weiterer bevorzugter Gegenstand ist auch ein erfindungsgemäßes Polynukleotid-Konstrukt enthaltend in zwei voneinander getrennten Bereichen die beiden Nukleotidteilsequenzen-wie oben beschrieben, wobei

es sich um ein Ribozym, vorzugsweise ein"hammerhead"Ribozym, oder ein DNA-Enzym, vorzugsweise ein DNA-Enzym vom Typ 10-23 oder 8-17, handelt. Hier ist es besonders bevorzugt und ausgewählt, wenn es sich um ein DNA-Enzym enthaltend mindestens die Nukleotidteilsequenzen Abschn. I und Abschn. III gemäß einem der Unterpunkte (I) bis (n), vorzugsweise (n), in einer der Abbildungen 1,3, 4,5, 6,7, 8, 9,11, 12 oder 13, - vorzugsweise 1,3, 7 oder 11, insbesondere 1 oder 3, oder - vorzugsweise 4,6, 8 oder 12, insbesondere 4 oder 12 handelt. Ebenso ist es besonders bevorzugt und ausgewählt, wenn es sich bei dem Polynukleotid-Konstrukt um ein Ribozym enthaltend mindestens die Nukleotidteilsequenzen Helix 1'und Helix 111 gemäß einem der Unterpunkte (o) bis (q), vorzugsweise (o), in einer der Abbildungen 1,3, 4, 5,6, 8,11 oder 12 ; - vorzugsweise 1,3 oder 11, insbesondere 11 ; oder - vorzugsweise 4,6, 8 oder 12, insbesondere 4 oder 12 handelt.

Eine bevorzugte Ausführungsform ist insbesondere Fig 24 zu entnehmen.

Fig. 24 zeigt in allgemeiner Darstellung ein"Hammerhead"-Ribozym nach Vaish, N. K. et al. (1998), Nucl. Acid Res. 26,5237-5242 mit den "erkennenden Armen"Helix I und Helix 111, in die jeweils die erfindungsgemäß Helices I und 111 gemäß der Unterpunkte (o)- (q) in einer der Abbildungen 1,3, 4,5, 6,7, 8,9, 11,12, 13 oder 15 eingefügt werden, um zu den erfindungsgemäßen"Hammerhead"-Ribozymen zu kommen.

Dabei ersetzt der Abschnitt Helix I in jeweils einer der Abbildungen 1,3, 4, 5,6, 7,8, 9,11, 12,13 oder 15 die beliebigen Nukleotide in Helix I nach Abbildung 24 so, daß das erste Nukleotid am 3'-Ende von Helix I in jeweils einer der Abbildungen 1,3, 4,5, 6,7, 8,9, 11,12, 13 oder 15 das erste beliebige Nukleotid"N"am 3'-Ende der Helix I der Abbildung 24 ersetzt und die folgenden beliebigen Nukleotide"N"in Helix I Abb. 24 in Richtung 5'-

Ende durch die Nukleotide ersetzt werden, die in einem der Unterpunkte (o) bis (q) Helix I in jeweils einer der Abbildungen 1,3, 4,5, 6,7, 8, 9,11, 12,13 oder 15 gezeigt sind. Die Nukleotide"A"und"C"am 5'-Ende der Helix 111 in einer der Abbildungen 1,3, 4,5, 6,7, 8,9, 11,12, 13 oder 15 ersetzen jeweils die Nukleotide"A"und"C"in Helix lil in Abb. 24 und die folgenden beliebigen Nukleotide"N"in Helix lil Abb. 24 werden in Richtung 5'-Ende durch die Nukleotide ersetzt, die in einem der Unterpunkte (o)- (q) Helix 111 in jeweils einer der Abbildungen 1,3, 4,5, 6,7, 8,9, 11,12, 13 oder 15 gezeigt sind.

Entsprechendes gilt für alle Ribozyme gemäß Unterpunkten (o bis q) in jeweils einer der Abbildungen 1,3, 4,5, 6,7, 8,9, 11,12, 13 oder 15.

Konkret ist eine bevorzugte Ausführungsform insbesondere Fig 26 zu entnehmen. Fig. 26 zeigt in allgemeiner Darstellung ein DNA-Enzym des Typs'10-23'gemäß Santoro et al., 1997, Fig. 2, S. 4264. Der obere, mit einem Pfeil gekennzeichnete Strang ist der zu spaltende RNA-Strang, wobei der Pfeil die Spaltstelle angibt und der untere ist eine Darstellung des DNA-Enzyms. In Bezug auf die vorliegende Anmeldung ist dabei im oberen Strang das"Y"="U"und das"R"="G", wobei 3'-wärts vom"Y"ein "C"liegt. Die Spaltstelle auf dem oberen Strang ist daher eine sogenannte <BR> <BR> GU-Site (s. o. ). Entsprechend ist"R"im unteren Strang ="A"und 5'-wärts vom"R"im unteren Strang befindet sich entsprechend ein"G". Dem schließen sich 5-wärts die weiteren Nukleotide aus Abschnitt I gemäß den Unterpunkten (I bis n) in jeweils einer der Abbildungen 1,3, 4,5, 6,7, 8,9, 11,12, 13 oder 15 an, d. h. 5 weitere Nukleotide bei Unterpunkt I, 6 weitere Nukleotide bei Unterpunkt m und 7 weitere Nukleotide bei Unterpunkt n. In Abschnitt 111 gemäß Abbildung 25-dem zweiten mit der RNA basengepaarten Abschnitt-schließen sich dann direkt an das am Abschnitt 111 anliegende ungepaarte"A"aus 5'-Richtung 3'-wärts die Nukleotide aus Abschnitt 111 gemäß den Unterpunkten (I bis n) in jeweils einer der Abbildungen 1,3, 4,5, 6,7, 8,9, 11,12, 13 oder 15 an, d. h. 7 weitere

Nukleotide bei Unterpunkt I, 8 weitere Nukleotide bei Unterpunkt m und 9 weitere Nukleotide bei Unterpunkt n. Abschnitt i und Abschnitt I sind die sogenannten"erkennenden Arme"des DNA-Enzyms (s. später folgendes Beispiel 3).

Das im Rahmen der Erfindung besonders bevorzugte DNA-Enzym des Typs"10-23"für Unterpunkt (n) nach Abb. 1 hätte damit folgende Sequenz, wobei der unterstrichene Abschnitt mit der RNA basengepaart wäre : GCTGGGTGA (=R)-GGCTAGCTACAACGA-GGTGACAGG Dieses DNA-Enzym würde als DK24 (9/9) bezeichnet werden, wobei die Bezeichnung aussagt, daß das Enzym gegen die GU-Site des Oligos K24 gerichtet ist und in den"erkennenden Armen"jeweils 9 Nukleotide (Abschnitt 1 und 111) enthält, z. B. gemäß Abschnitt I und Abschnitt 111 von Unterpunkt (n) in Fig. 1). Entsprechendes gilt für alle DNA-Enzyme gemäß Unterpunkten (I bis n) in jeweils einer der Abbildungen 1,3, 4,5, 6,7, 8,9, 11,12, 13 oder 15.

Ein weiterer bevorzugter Gegenstand ist auch ein erfindungsgemäßes Polynukleotid-Konstrukt, wobei dieses mindestens eine modifizierte oder unmodifizierte Ribose, mindestens eine modifizierte oder unmodifizierte Phosphodiesterbindung und/oder mindestens eine modifizierte oder unmodifizierte Base aufweist.

Ein weiterer bevorzugter Gegenstand ist auch ein erfindungsgemäßes Oligonukleotid oder erfindungsgemäßes Polynukleotid-Konstrukt, wobei dieses an einen Träger ; insbesondere Protein, vorzugsweise tet-, Transportin oder Ferritin ; gebunden und/oder in einem Liposom verpackt ist.

Ein weiterer bevorzugter Gegenstand ist auch eine Zelle enthaltend mindestens ein erfindungsgemäßes Oligonukleotid und/oder ein erfindungsgemäßes Polynukleotid-Konstrukt.

Ein weiterer bevorzugter Gegenstand ist auch ein Arzneimittel enthaltend mindestens ein erfindungsgemäßes Oligonukleotid, ein erfindungsgemäßes Polynukleotid-Konstrukt und/oder eine erfindungsgemäße Zelle sowie gegebenenfalls geeignete Hilfs-und/oder Zusatzstoffe. Die erfindungsgemäßen Arzneimittel können als flüssige Arzneiformen in Form von Injektionslösungen, Tropfen oder Säfte, als halbfeste Arzneiformen in Form von Granulaten, Tabletten, Pellets, Patches, Kapseln, Pflaster oder Aerosolen verabreicht werden und enthalten neben den mindestens einem erfindungsgemäßen Gegenstand je nach galenischer Form gegebenenfalls Trägermaterialien, Füllstoffe, Lösungsmittel, Verdünnungsmittel, Farbstoffe und/oder Bindemittel. Die Auswahl der Hilfsstoffe sowie die einzusetzenden Mengen derselben hängt davon ab, ob das Arzneimittel oral, peroral, parenteral, intravenös, intraperitoneal, intradermal, intramuskulär, intranasal, buccal, rectal oder örtlich, zum Beispiel auf Infektionen an der Haut, der Schleimhäute und an den Augen, appliziert werden soll. Für die orale Applikation eignen sich Zubereitungen in Form von Tabletten, Dragees, Kapseln, Granulaten, Tropfen, Säften und Sirupen, für die parenterale, topische und inhalative Applikation Lösungen, Suspensionen, leicht rekonstituierbare Trockenzubereitungen sowie Sprays. Erfindungsgemäße Gegenstände in einem Depot in gelöster Form oder in einem Pflaster, gegebenenfalls unter Zusatz von die Hautpenetration fördernden Mitteln, sind geeignete perkutane Applikationszubereitungen. Oral oder perkutan anwendbare Zubereitungsformen können die erfindungsgemäßen Gegenstände verzögert freisetzen. Die an den Patienten zu verabreichende Wirkstoffmenge variiert in Abhängigkeit vom Gewicht des Patienten, von der Applikationsart, der Indikation und dem Schweregrad der Erkrankung.

Üblichweise werden 2 bis 500 mg/kg wenigstens eines erfindungsgemäßen

Gegenstandes appliziert. Wenn das Arzneimittel insbesondere zur Gentherapie verwendet werden soll, empfehlen sich als geeignete Hilfs- oder Zusatzstoffe beispielsweise eine physiologische Kochsalzlösung, Stabilisatoren, Proteinase-, DNAse-Inhibitoren etc.

Ein weiterer bevorzugter Gegenstand ist auch ein Diagnostikum enthaltend mindestens ein erfindungsgemäßes Oligonukleotid, ein erfindungsgemäßes Polynukleotid-Konstrukt und/oder eine erfindungsgemäße Zelle sowie gegebenenfalls geeignete Zusatzstoffe.

Dabei bedeuten - Arzneimittel : ein Stoff entsprechend der Definition im Artikel 1 §2 des deutschen Gesetzes über den Verkehr mit Arzneimitteln (AMG). Das heißt, Stoffe oder Zubereitungen aus Stoffen, die dazu bestimmt sind, durch Anwendung am oder im menschlichen oder tierischen Körper 1. Krankheiten, Leiden, Körperschäden oder krankhaft Beschwerden zu heilen, zu lindern, zu verhüten oder zu erkennen, 2. die Beschaffenheit, den Zustand oder die Funktionen des Körpers oder seelische Zustände erkennen zu lassen, 3. vom menschlichen Körper erzeugte Wirkstoffe oder Körperflüssigkeiten zu ersetzen, 4. Krankheitserreger, Parasiten oder körperfremde Stoffe abzuwehren, zu beseitigen oder unschädlich zu machen oder 5. die Beschaffenheit, den Zustand oder die Funktionen des Körpers oder seelische Zustände zu beeinflussen.

- Diagnostikum : Verbindung oder Verfahren, das verwendet werden kann, um eine Krankheit zu diagnostizieren Ein weiterer bevorzugter Gegenstand ist auch die Verwendung mindestens eines erfindungsgemäßen Oligonukleotid, eines erfindungsgemäßen

Polynukleotid-Konstrukt und/oder einer erfindungsgemäßen Zelle zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Schmerz, insbesondere von chronischem Schmerz, taktiler Allodynie, thermisch ausgelöstem Schmerz, und/oder Entzündungsschmerz.

Ein weiterer bevorzugter Gegenstand ist auch die Verwendung mindestens eines erfindungsgemäßen Oligonukleotids, eines erfindungsgemäßen Polynukleotid-Konstrukts und/oder einer erfindungsgemäßen Zelle zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Harninkontinenz ; auch von neurogenen Blasensymptomen ; Pruritus, Tumoren, Entzündungen ; insbesondere von PlM1-Kinase-assoziierten Entzündungen mit Symptomen wie Asthma ; sowie von allen mit PIM1 zusammenhängenden Krankheitssymptomen.

Ein weiterer bevorzugter Gegenstand ist auch die Verwendung mindestens eines erfindungsgemäßen Oligonukleotids, eines erfindungsgemäßen Polynukleotid-Konstrukts und/oder einer erfindungsgemäßen Zelle für die Gentherapie, vorzugsweise In-vivo oder In-vitro Gentherapie. Unter Gentherapie versteht man eine Therapieform, bei der durch die Einführung von Nukleinsäuren in Zellen ein Effektorgen, meist ein Protein, aber auch eine Antisense RNA, exprimiert wird oder ein vorsynthetisiertes Antisense Oligodesoxynukleotid eingebracht wird. Man unterscheidet prinzipiell In- vivo-und In-vitro-Verfahren. In In-vitro-Verfahren werden Zellen aus dem Organismus entfernt und ex-vivo mit Vektoren transfiziert, um anschließend wieder in denselben oder in einen anderen Organismus eingebracht zu werden. Bei der In-vivo-Gentherapie werden Vektoren, beispielsweise zur Bekämpfung von Tumoren, systemisch (z. B. über die Blutbahn) oder direkt in den Tumor appliziert.

Ein weiterer bevorzugter Gegenstand ist auch ein Verfahren zur Identifizierung schmerzmodulierender Substanzen, dadurch gekennzeichnet, daß die Identifizierung über eine Quantifizierung der

Bindung mindestens eines, vorzugsweise markierten, erfindungsgemäßen Oligonukleotids oder mindestens eines erfindungsgemäßen Polynukleotid- Konstrukts an eine RNA erfolgt.

Ein weiterer bevorzugter Gegenstand ist auch ein Verfahren zur Identifizierung schmerzmodulierender Substanzen mit folgenden Verfahrensschritten : (a) gentechnische Manipulation mindestens einer Zelle (Testzelle) mit mindestens einem erfindungsgemäßen Oligonukleotid und/oder einem erfindungsgemäßen Polynukleotid-Konstrukt, (a') parallele gentechnische Manipulation mindestens einer identischen Zelle (Kontrollzelle) entweder . unterbleibend, 'unter Durchführung der Manipulation parallel ohne Oligonukleotid oder Polynukleotid-Konstrukt oder 'mit einem veränderten, nicht mehr erfindungsgemäßen Oligonukleotids oder Polynukleotidkonstrukts, (b) parallele Inkubation einer zu testenden Substanz unter geeigneten Bedingungen mit mindestens einer Test-Zelle und mindestens einer Konrolizelle und/oder einer Präparation aus solchen Zelle, die mindestens ein Protein, ausgewählt aus der PIM-Familie, vorzugsweise der PIM1- Kinase, synthetisiert hat (c) Messung der Bindung der Testsubstanz an dem von den Zellen synthetisierten Protein oder Messung mindestens eines der durch die Bindung der Testsubstanz an das Protein veränderten funktionellen Parameter,

(d) Identifizierung der Substanzen über das Ausmaß der Differenz zwischen dem Meßwert bei der Testzelle und dem bei der Kontrollzelle.

Dabei bezieht sich der Begriff schmerzmodulierend auf einen potentiellen regulierenden Einfluß auf das physiologische Schmerzgeschehen, insbesondere auf eine analgetische Wirkung. Der Begriff Substanz umfaßt jede als Arzneimittel-Wirkstoff geeignete Verbindung, insbesondere also niedermolekulare Wirkstoffe, aber auch andere wie Nukleinsäuren, Fette, Zucker, Peptide oder Proteine wie Antikörper. Die Inkubation unter geeigneten Bedingungen ist hier so zu verstehen, daß die zu untersuchende Substanz mit der Zelle oder der entsprechenden Präparation in einem wässrigen Medium eine definierte Zeit vor der Messung reagieren kann. Dabei kann das wässrige Medium temperiert werden, beispielsweise zwischen 4°C und 40°C, vorzugsweise bei Raumtemperatur oder bei 37°C. Die Inkubationszeit kann zwischen wenigen Sekunden und mehreren Stunden variiert werden, je nach der Wechselwirkung der Substanz mit dem Protein. Bevorzugt sind aber Zeiten zwischen 1 min und 60 min. Das wäßrige Medium kann geeignete Salze und/oder Puffersysteme enthalten, so daß bei der Inkubation beispielsweise ein pH zwischen 6 und 8, vorzugsweise pH 7,0-7, 5 im Medium herrscht. Dem Medium können weiter geeignete Substanzen, wie Coenzyme, Nährstoffe etc. beigefügt werden. Die geeigneten Bedingungen können vom Fachmann in Abhängigkeit von der zu untersuchenden Wechselwirkung der Substanz mit dem Protein aufgrund seiner Erfahrung, der Literatur oder weniger, einfacher Vorversuche leicht festgelegt werden, um im Verfahren einen möglichst deutlichen Meßwert zu erhalten. Eine Zelle, die ein Protein synthetisiert hat, ist ein Zelle, die dieses Protein bereits endogen exprimiert hat oder eine solche, die gentechnisch verändert wurden, so daß sie dieses Protein exprimiert und entsprechend vor Beginn des erfindungsgemäßen Verfahrens das Potein enthält. Die Zellen können Zellen aus evt. immortalisierten Zellinie sein oder native

aus Geweben stammende und aus diesen isolierte Zellen sein, wobei der Zellverband meist aufgelöst ist. Die Präparation aus diesen Zellen umfaßt insbesondere Homogenate aus den Zellen, das Cytosol, eine Membranfraktion der Zellen mit Membranfragmenten, eine Suspension isolierter Zellorganellen etc.

Der Maßstab über den das Verfahren die Auffindung interessanter Substanzen erlaubt, ist entweder die Bindung an das Protein, die z. B. durch Verdrängung eines bekannten Liganden oder das Ausmaß gebundener Substanz nachgewiesen werden kann, oder die Veränderung eines funktionellen Parameters durch die Wechselwirkung der Substanz mit dem Protein. Diese Wechselwirkung kann insbesondere in einer Regulation, Hemmung und/oder Aktivierung von Rezeptoren, lonenkanälen und/oder Enzymen liegen und veränderte funktionelle Parameter können beispielsweise die Genexpression, das lonenmilieus, der pH oder das Membranpotentials, bzw. die Veränderung der Enzymaktivität oder der Konzentration der 2nd messenger sein. Dabei heißt : - aentechnisch manipuliert : Manipulation von Zellen, Geweben oder Organismen derart, daß hier genetisches Material eingebracht wird - endogen exprimiert : Expression eines Proteins, die eine Zellinie unter geeigneten Kulturbedingungen aufweist, ohne daß dieses entsprechende Protein durch gentechnische Manipulation zur Expression veranlasst wurde Eine weitere bevorzugter Ausführungsform dieses Verfahrens sieht vor, daß die Zelle bereits vor den Verfahrensschritten (a) und (a') gentechnisch manipuliert wird.

Eine weitere bevorzugter Ausführungsform dieses Verfahrens sieht vor, daß die gentechnische Manipulation die Messung mindestens eines der durch die Testsubstanz veränderten funktionellen Parameter erlaubt : Eine weitere bevorzugter Ausführungsform dieses Verfahrens sieht vor, daß durch die gentechnische Manipulion eine in der Zelle nicht endogen exprimierte Form eines Mitglieds der Pim-Kinase-Familie, vorzugsweise die PIM-1-Kinase, exprimiert oder ein Reportergen eingeführt wird.

Eine weitere bevorzugter Ausführungsform dieses Verfahrens sieht vor, daß die Messung der Bindung über die Verdrängung eines bekannten markierten Liganden eines Mitglieds Pim-Kinase-Familie, vorzugsweise der PIM-1-Kinase, erfolgt.

Eine weitere bevorzugter Ausführungsform dieses Verfahrens sieht vor, daß zwischen den parallelen Verfahrensschritten (a) und (a') und dem Verfahrensschritt (b) > 8 h, vorzugsweise > 12 h, insbesondere > 24 h, vergehen.

Ein weiterer bevorzugter Gegenstand ist auch ein Verfahren zur Diagnose von Krankheitsbildern, die mit veränderter Expression von Genen der Pim- Kinase-Familie verbunden sind, dadurch gekennzeichnet, daß die Diagnose über eine Quantifizierung der Bindung eines erfindungsgemäßen Oligonukleotids und/oder mindestens eines erfindungsgemäßen Polynukleotid-Konstrukts an eine RNA erfolgt.

Die Oligonukleotide und auch Polynukleotidkonstrukte werden nach dem Fachmann bekannten Verfahren hergestellt. Dabei werden Nukleotide, insbesondere auch Oligonukleotide, beispielsweise nach Art der Merryfield- Synthese, an einem unlöslichen Träger (H. G. Gassen et al., Chemical and Enzymatic Synthesis of Genefragments (Verlag Chemie, Weinheim 1982))

oder auf andere Art synthetisiert (Beyer/Walter ; Lehrbuch der Organischen Chemie, 20. Auflage, (S. Hirzel Verlag, Stuttgart 1984), S. 816 ff.).

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Behandlung, insbesondere Schmerzbehandlung, eines nichthumanen Säugetieres oder Menschen, das oder der eine Behandlung von Schmerzen, insbesondere chronischer Schmerzen, benötigt, durch Verabreichung eines erfindungsgemäßen Arzneimittels, insbesondere solche enthaltend eine erfindungsgemäßes Oligonukleotid und/oder ein erfindungsgemäßes Polynukleotid-Konstrukt. Ein weiterer Gegenstand sind auch entsprechende Verfahren zur Behandlung von Pruritus und/oder Harninkontinenz.

Die folgenden Beispiele und Abbildungen sollen die Erfindung erläutern, ohne daß der Gegenstand der Erfindung darauf beschränkt wäre.

Abbildungen und Beispiele Abbildungen Abbildungen, Abb., Figur und Fig. sind als synonym zu betrachten. Ebenso synonym sind im Zusammenhang mit den Abbildungen Subtyp und Unterpunkt. Ein"X"in den abgebildeten Sequenzen steht für ein beliebiges zur entsprechenden Base auf der mRNA von PIM1 komplementäres Nukleotid. Die Abbildungen zeigen : Figur 1) Generell Nukleotidsequenzen ausgehend von einer Antisense Oligodesoxynukleotidsequenz gegen die mRNA des PIM1 aus der Ratte, hier häufig als Oligo K3, Oligonukleotid Nr. 3 oder K3 bezeichnet.

Unterpunkte (a)- (z) zeigen verkürzte Ausschnitte aus dieser Antisense- Oligodesoxynukleotidsequenz K3, Unterpunkt (aa) zeigt die volle Antisense-Oligodesoxynukleotidsequenz, mit der das"messenger walk screening"durchgeführt wurde.

Figur 2) Die dem Oligo K6 entsprechende Sequenz eines Antisense- Desoxyoligonukleotids gegen humanes PIM1. Die Untertypen (a) - (aa) entsprechen bezüglich Art und generellem Inhalt den bereits zu Figur 1 beschriebenen.

Figur 3) Generelle Nukleotidsequenzen ausgehend von einer Antisense Oligodesoxynukleotidsequenz gegen die mRNA des PIM1 aus der Ratte, Figur 24) : Allgemeine Darstellung eines"Hammerhead"-Ribozyms mit den "erkennenden Armen"Helix I und Helix III.

Figur 26) : Darstellung des DNA-Enzyms des Typs'10-23'gemäß Santoro et al., 1997, Fig. 2, S. 4264 : Der obere, mit einem Pfel gekennzeichnete Strang ist der zu spaltende RNA-Strang, wobei der Pfeil die Spaltstelle angibt und der untere ist eine Darstellung des DNA-Enzyms. In Bezug auf die vorliegende Anmeldung ist dabei im oberen Strang das"Y"="U"und das"R"="G", wobei 3'-wärts vom"Y"ein"C"liegt. Die Spaltstelle auf dem oberen Strang ist daher eine sogenannte GUC-Site (s. o. ). Entsprechend ist"R"im unteren Strang ="A" und 5'-wärts vom"R"im unteren Strang befindet sich entsprechend ein"G".

Fig. 27) Schematische Darstellung einer"Locked Nucleic Acid"LNA : Beispiele : Beispiel 4 : In vivo Experimente In 20 mänlichen Sprague-Dawley-Ratten wurden an den linken L5/L6 Spinal-Nerven Spinal-Nerven-Ligaturen gemäß Kim und Chung (1992) angelegt. Zur selben Zeit wurden Spinal-Katheter gemäß Pogatzki et al. 6 (2000) implantiert. 4 bis 6 Tage nach der Operation wurde die taktile Schwellen-Basislinie (Rückzugs-Schwellen/withdrawal threshholds) an der ipsi-und contralateralen Hinterpfote durch ein elektronisches vonFrey- Anesthesiometer (IITC Life Science, USA) gemessen. Der korrekte Sitz der Spinal-Katheter wurde durch Lidocain-Gabe (10p1, 2%) bestätigt, die in einer kurzfristigen Lähmung beider Hinterglieder resultierte. Nach dem Test und Messung der Basislinie wurden je 45, ug PIM-1 Antisense- (AS, n=10) oder Mismatch (MS, n=10)-Oligonukleotide in 0.9% NaCI einmal am ersten Tag und b. i. d. an den folgende 4 Tagen gegeben. Die taktilen Rückzugs- Schwellen (withdrawal threshholds) wurden 30 Minuten nach der ersten täglichen Oligo-Gabe gemessen. Die Ergebnisse sind als % maximal possible effect (% MPE ; % des maximal möglichen Effekts) auf der ipsilateralen Seite angegeben, in dem man die Basisline als 0% und die Rückzugs-Schwelle einer Kontroll-Gruppe als 100% MPE annimmt.

Beispiel 5 : "Locked Nucleotides"/Gegen Abbau geschützte Oligonukleotide bzw.

Oligonukleotid-Konstrukte Es wurden verschiedene erfindungsgemäße Oligonukleotide insbesondere gemäß Untergruppe (aa) x, y oder z der Abbildungen 1 oder 2 oder gemäß Abbildung 3 hergestellt. Die meisten von diesen waren LNA-Konstrukte, die bei PROLIGO in Boulder, Co, USA bestellt wurden und bei denen LNA an verschiedenen Stellen saßen. Weiter wurde ein unverändertes Oligonukleotid gemäß Untergruppe (aa) der Abbildungen 1 synthetisiert und ein von der Basensequenz entsprechendes Phosphorothioat bei MWG Biotech AG in Ebersberg Deutschland bestellt.

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