Die effektive Behandlung von Schmerz ist eine große Herausforderung für die molekulare Medizin. Akuter und transitorischer Schmerz ist ein wichtiges Signal des Körpers, um den Menschen vor schwerem Schaden durch die Umgebung oder Überbelastung des Körpers zu bewahren. Im Gegensatz dazu hat der chronische Schmerz, der länger anhält als die Ursache des Schmerzes und der erwartungsgemäße Zeitrahmen der Heilung keine bekannte biologische Funktion und betrifft Hunderte von Millionen Menschen weltweit. Rund 7,5 Mio. Menschen leiden allein in der Bundesrepublik Deutschland an chronischen Schmerzen.

Unglücklicherweise ist die pharmakologische Behandlung des chronischen Schmerzes noch unbefriedigend und bleibt daher eine Herausforderung für die aktuelle medizinische Forschung. Die derzeit existierenden Analgetika sind häufig nicht ausreichend wirksam und haben z. T. schwere Nebenwirkungen.

Daher werden vielfach neue Targets, körpereigene Strukturen, über die eine schmerzmodulierende Einwirkung, beispielsweise niedermolekularer Wirkstoffe oder anderer Verbindungen wie Antisense Oligodesoxynukleotide (ODN), möglich erscheint, für die Behandlung insbesondere chronischer Schmerzen gesucht. Der von Caterina et al.

(1997) klonierte Vanilloid Rezeptor Subtyp 1 (VR1, auch als Capsaicin

Rezeptor bezeichnet) ist ein vielversprechender Ansatzpunkt für die Entwicklung neuer Schmerzmedikamente. Es handelt sich dabei um einen Kationenkanal, der vorwiegend durch primäre sensorische Neuronen exprimiert wird (Catarina et al. 1997). VR1 wird durch Capsaicin, eine Komponente der Chilischoten, Hitze (>43°C) und einen niedrigen pH-Wert (Protonen) infolge von Gewebeverletzungen aktiviert und bewirkt einen Calcium-Einstrom in primäre Afferenzen. VR1-Knockout Mäuse entwickelten keine thermische Hyperalgesie nach Gewebeschäden bzw.

Entzündungen (Caterina et al., 2000 ; Davis et al., 2000).

Antisense Oligodesoxynukleotide (ODN), Ribozyme und andere katalytische Nukleinsäuren können zur Behandlung, insbesondere des chronischen Schmerzes durch Abbau oder Veränderung der mRNA ausgewählter Targets-im Falle dieser Erfindung der vorangehend beschriebenen Vanilloid-Rezeptors Subtypes 1 (VR1) (Catarina et al. 1997) - eingesetzt werden, deren Expresssion herunterregulieren und damit die Anzahl der Rezeptoren pro Zelle verringern. Die ODN lagern sich an die mRNA an und blockieren so zum einen die Translation und initiieren zum anderen den Abbau der mRNA durch RNase H, die RNA in einer DNA/RNA Duplex spaltet. Porreca et al. (1999) konnten zeigen, dass intrathekal applizierte. ODNs gegen den PN3/SNS-Kanal bei Ratten die Entwicklung von Hyperalgesie und Allodynie durch chronische Nerven- oder Gewebeschädigung verhindern.

Auch wenn die Sequenz des VR1 bekannt ist, so kommt es doch für eine effektive Blockierung und Spaltung der mRNA insbesondere auf die Auswahl der richtigen Antisense-Oligodesoxynukleotide, Ribozyme und anderen katalytische Nukleinsäuren an. Die mRNA des Targets ist meist gefaltet und nur an wenigen Stellen für eine Anlagerung und nachfolgende Spaltung zugänglich. Über die richtige Auswahl der ODN ist aber im Stand der Technik nichts bekannt.

Aufgabe der vorliegenden Schrift war entsprechend die Entwicklung von Antisense Oligodesoxynukleotiden und katalytischer Nukleinsäuren sowie entsprechender Ribozyme gegen die mRNA des Vanilloid Rezeptors. Ein Gegenstand der Erfindung ist daher ein Oligonukleotid enthaltend oder entsprechend eine (r) Basensequenz gemäß einem der Unterpunkte (b) bis (j) in einer der Abbildungen 1,2, 4,5, 6,7, 8,9, 10,11, 12,13, 14,15 oder 16 oder eine (r) sich in maximal einer abweichenden Base davon unterscheidende (n) Sequenz, wobei sich die Abweichung in der Base nicht im im Unterpunkt (a) abgebildeten Sequenzbereich befindet. Dabei bedeutet Oligonukleotid im Sinne dieser Erfindung ein Molekül mit zwischen 2 und 40 Nukleotiden..

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Oligonukleotid enthaltend oder entsprechend eine (r) Basensequenz gemäß einem der Unterpunkte (b) bis (j) in einer der Abbildungen 1,2, 3,4, 5,6, 7,8, 9,10, 11,12, 13, 14, 15 oder 16.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Oligonukleotid enthaltend oder entsprechend eine (r) Basensequenz gemäß Unterpunkt (k) in einer der Abbildungen 1,2, 4,5, 6,7, 8,9, 10,11, 12,13, 14,15 oder 16 oder eine (r) sich in maximal zwei abweichenden Base, vorzugsweise einer, davon unterscheidende (n) Sequenz, wobei sich die Abweichung (en) in der (n) Base (n) nicht im im Unterpunkt (a) abgebildeten Sequenzbereich befindet (n).

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Oligonukleotid enthaltend oder entsprechend eine (r) Basensequenz gemäß Unterpunkt (k) in einer der Abbildungen 1,2, 3,4, 5,6, 7,8, 9,10, 11,12, 13,14, 15 oder 16.

Ein bevorzugter Gegenstand der Erfindung ist auch ein erfindungsgemäßes Oligonukleotid gemäß einer der vorgenannten erfindungsgemäßen Formen der Oligonukleotide, bei dem das

Oligonukleotid ein Länge von 15 bis 30, vorzugsweise 15 bis 25, insbesondere 17 bis 19 oder genau 18, Nukleotiden aufweist.

Ein weiterer bevorzugter Gegenstand ist auch ein erfindungsgemäßes besonders bevorzugtes Oligonukleotid (im folgenden Oligonukleotid A genannt) gemäß einer der vorgenannten erfindungsgemäßen Formen der Oligonukleotide, bei dem-gegebenenfalls in einer Base abweichend-die in den Oligonukleotiden enthaltene oder diesen entsprechende der Basensequenz einer der Abbildungen 1,2, 3,4, 9,10, 11, 12,15 oder 16 zu entnehmen ist. Damit sind insbesondere Oligonukleotide gemeint, die als besonders effektiv erkannt wurden bzw. entsprechende Sequenzen gegebenenfalls leicht abweichend enthalten, mit hoher Bindung an die mRNA des VR1 zu binden (s. Oligos V15, V30 V2, V16 und V4 bzw. die entsprechenden humanen Sequenzen).

Ein weiterer besonders bevorzugter Gegenstand ist auch ein erfindungsgemäßes besonders bevorzugtes Oligonukleotid (im folgenden Oligonukleotid B genannt) gemäß einer der vorgenannten erfindungsgemäßen Formen der Oligonukleotide, bei dem-gegebenenfalls in einer Base abweichend-die in den Oligonukleotiden enthaltene oder diesen entsprechende Basensequenz einer der Abbildungen 1,2, 3,4, 11 oder 12, vorzugsweise 1,3 oder 11, insbesondere 1 oder 3, zu entnehmen ist.

Ein bevorzugter Gegenstand der Erfindung ist ein erfindungsgemäßes Oligonukleotid das mindestens eine modifizierte oder unmodifizierte Ribose, mindestens eine modifizierte oder unmodifizierte Phosphodiesterbindung und/oder mindestens eine modifizierte oder unmodifizierte Base aufweist.

Ein ganz besonders bevorzugter Gegenstand der Erfindung ist ein erfindungsgemäßes Oligonukleotid, bei dem mindestens eines der

Nukleotide, insbesondere mehrere der Nukleotide,"Locked Nucleic Acids" ("LNA's") sind oder mindestens eines der Nukleotide, insbesondere alle Nukleotide, Phosphorothioate sind, vorzugsweise ein solches, bei dem mehrere der Nukleotide"Locked Nucleic Acids" ("LNA's") sind."Locked nucleic acids" ("LNA's") sind Ribonukleotide, die eine Methylen-Brücke enthalten, die den 2'-Sauerstoff der Ribose mit dem 4'-Kohlenstoff verbindet (s. Abb. 27). Einen Überblick über die LNA's geben Braasch D. A. und Corey, D. R. (2001), Locked nucleic acids (LNA) ; fine-tuning the recognition of DNA und RNA. Chem. Biol. 8,1-7. Dieser Artikel ist ausdrücklich Mitbestandteil der vorliegenden Beschreibung und Offenbarung. LNA's werden beispielsweise von der Firma Proligo, Boulder, CO, USA angeboten. Auch Phosphorothiate sind dem Fachmann bekannt und können beispielsweise bei MWG-Biotech AG, Ebersberg, Germany bestellt werden.

Bevorzugt sind hierbei Oligonukleotide, in denen die"LNA's"am 5'-und 3'- Ende des Oligonukleotids liegen, vorzugsweise jeweils die letzten 2-5 Nukleotide, insbesondere jeweils die letzten 3 oder 4 Nukleotide, am 3'- und 5'-Ende des Oligonukleotids"LNA's"sind, und/oder in denen > 6, insbesondere > 8 zusammenhängende Nukleotide im Oligonukleotid keine"LNA's"sind, vorzugsweise bei denen von den im Sequenzbereich gemäß jeweiligen Unterpunkt (a) abgebildeten Nukleotiden des Oligonukleotids gemäß einer der Abbildungen 1 bis 16 Unterpunkt (b) bis (k) nur jeweils höchstens eines oder keines der Nukleotide eine"LNA"ist.

Bei den mit LNA's oder Phosphorothioaten modifizierten Oligonukleotiden ist es besonders bevorzugt, wenn es sich um ein erfindungsgemäßes

Oligonukleotid A oder erfindungsgemäßes Oligonukleotid B, vorzugsweise ein erfindungsgemäßes Oligonukleotid B (s. o.).

Generell ist ein besonderer separater Gegenstand der Erfindung Nukleinsäuren, insbesondere Oligopeptide, bei denen mehrere der Nukleotide"Locked Nucleic Acids" ("LNA's") sind, in denen die"LNA's"am 5'-und 3'-Ende des Oligonukleotids liegen, vorzugsweise jeweils die letzten 2-5 Nukleotide, insbesondere jeweils die letzten 3 oder 4 Nukleotide, am 3'- und 5'-Ende des Oligonukleotids"LNA's"sind, und/oder in denen > 6, insbesondere > 8 zusammenhängende Nukleotide im Oligonukleotid keine "LNA's"sind. Die bisher bezüglich der LNA's ausgeführten Ausführungsformen gelten auch für diesen Gegenstand.

Ein weiterer bevorzugter Gegenstand ist auch ein Polynukleotid-Konstrukt enthaltend mindestens ein erfindungsgemäßes Oligonukleotid. Hier ist Polynukleotidkonstrukt in einem sehr weiten Sinne zu verstehen. Es umfaßt RNA und DNA und Nukleotide ab einer Länge von mindestens 20 Nukleotiden. Dabei versteht man unter (rekombinantes) Polvnukleotid- Konstrukt eine generelle Bezeichnung für jede Art von DNA-bzw. RNA- Molekülen, die durch die in vitro-Verknüpfung von DNA-, RNA-Molekülen entstanden sind. Unter Polynukleotid versteht man folgendes : Das zugrundeliegende Nukleotid ist ein grundsätzlich aus Nucleinbase, Pentose und Phosphorsäure bestehender Grundbaustein der Nucleinsäuren. Diese entspricht einem hochmolekularen Polynukleotid aus mehreren Nukleotiden, die über Phosphorsäure-Pentose-Veresterung miteinander verknüpft sind. Unter die Erfindung fallen aber auch modifizierte Polynukleotide, die zwar die Basenabfolge beibehalten, aber über ein modifiziertes Rückrat statt der Phosphorsäure-Pentose verfügen.

Ein weiterer bevorzugter Gegenstand ist auch ein Polynukleotid-Konstrukt enthaltend in zwei voneinander getrennten Bereichen die beiden Nukleotidteilsequenzen Abschn. I und Abschn. III gemäß einem der

Unterpunkte (I)- (n) oder die beiden Nukleotidteilsequenzen Helix I und Helix 111 gemäß einem der Unterpunkte (o) - (q) in einer der Abbildungen 1, 3,4, 5,6, 7,8, 9, 11, 12,13 oder 15 oder von diesen Nukleotidteilsequenzen jeweils maximal in einer Base abweichende Nukleotidteilsequenzen. Genaueres über die Aufteilung der beiden Bereiche kann man der Fig. 24) (Helix I und Helix 111/Ribozym) und bei Santoro et al. (1997) FIG. 2 S. 4264 (Abschnitt I und Abschnitt III/DNA- Enzym) entnehmen, wobei der Inhalt der letzteren Literaturstelle ausdrücklich mit zur Offenbarung der vorliegenden Anmeldung gehört.

Ein weiterer bevorzugter Gegenstand ist auch ein Polynukleotid-Konstrukt kodierend für mindestens ein erfindungsgemäßes Oligonukleotid. Darunter ist insbesondere eine abzulesende DNA oder ein Vektor enthaltend DNA oder RNA ist, dessen Produkt ein erfindungsgemäßes Oligonukleotid ist oder sein kann.

Ein weiterer bevorzugter Gegenstand ist auch ein erfindungsgemäßes Polynukleotid-Konstrukt, bei dem es sich um ein Ribozym, ein DNA-Enzym, einen Vektor, insbesondere einen Expressionsvektor, oder eine PNA handelt.

Dabei heißt generell im Sinne dieser Erfindung : : - (Klonierungs ! vektor : Generelle Bezeichnung für Nukleinsäure-Moleküle, die beim Klonieren als Träger von Fremdgenen oder Teilen dieser Gene dienen.

- Expressionsvektor : Bezeichnung für speziell konstruierte Klonierungsvektoren, die nach Einbringen in eine geeignete Wirtszelle die Transcription und Translation des in den Vektor einklonierten Fremdgens erlauben.

- PNA : International gebräuchliche Abkürzung für peptidic Nucleic Acids.

Hierbei bilden peptidisch verknüpfte Aminosäuren eine Kette, wobei die Aminosäuren als Seitenkette eine für die Hybridisierung mit DNA oder RNA fähigen Base trägt.

- Sequenz : Abfolge von Nukleotiden oder Aminosäuren. Im spezifischen Sinne dieser Erfindung ist damit die Nukleinsäuresequenz gemeint.

-Ribozym : Bezeichnung für eine katalytisch aktive Ribonukleinsäure (z. B. Ligase, Endonuklease, Polymerase, Exonuklease), s. z. B.

Hammerhead-Ribozyme gemäß Abb. 24 oder 25 sowie die Beschreibung der Abbildungen oder s. Vaish, N. K. et al. (1998), Nucl.

Acid Res. 26,5237-5242.

- DNA-Enzym : Bezeichnung für ein DNA-Molekül, das katalytische Aktivität beinhaltet (z. B. Ligase, Endonuklease, Polymerase, Exonuklease), s. z. B- DNA-Enzym 10-23 gemäß Abb. 26 sowie die Beschreibung der Abbildung oder s. Santaro und Joyce (1997) Proc.

Natl. Acad. Sci. USA 94,4262-4266.

- katalvtische RNA/DNA : generelle Bezeichnung für Ribozyme bzw. DNA- Enzyme (s. o.).

Ein weiterer bevorzugter Gegenstand ist auch ein erfindungsgemäßes Polynukleotid-Konstrukt enthaltend in zwei voneinander getrennten Bereichen die beiden Nukleotidteilsequenzen-wie oben beschrieben, wobei es sich um ein Ribozym, vorzugsweise ein"hammerhead"Ribozym, oder ein DNA-Enzym, vorzugsweise ein DNA-Enzym vom Typ 10-23 oder 12-32, handelt. Hier ist es besonders bevorzugt und ausgewählt, wenn es sich um ein DNA-Enzym enthaltend mindestens die Nukleotidteilsequenzen Abschn. I und Abschn. III gemäß einem der Unterpunkte (I) bis (n),

vorzugsweise (n), in einer der Abbildungen 1,3, 4,5, 6,7, 8, 9,11, 12 oder 13, - vorzugsweise 1,3, 7 oder 11, insbesondere 1 oder 3, oder - vorzugsweise 4,6, 8 oder 12, insbesondere 4 oder 12 handelt. Ebenso ist es besonders bevorzugt und ausgewählt, wenn es sich bei dem Polynukleotid-Konstrukt um ein Ribozym enthaltend mindestens die Nukleotidteilsequenzen Helix I und Helix 111 gemäß einem der Unterpunkte (o) bis (q), vorzugsweise (o), in einer der Abbildungen 1,3, 4, 5,6, 8, 11 oder 12 ; vorzugsweise 1,3 oder 11, insbesondere 11 ; oder - vorzugsweise 4,6, 8 oder 12, insbesondere 4 oder 12 handelt.

Konkret ist eine bevorzugte Ausführungsform insbesondere Fig 24 und 25 zu entnehmen. Fig. 24 zeigt in allgemeiner Darstellung ein"Hammerhead"- Ribozym nach Vaish, N. K. et al. (1998), Nucl. Acid Res. 26,5237-5242 mit den"erkennenden Armen"Helix I und Helix ii, in die jeweils die erfindungsgemäß Helices I und 111 gemäß der Unterpunkte (o)- (q) in einer der Abbildungen 1,3, 4,5, 6,7, 8,9, 11,12, 13 oder 15 eingefügt werden, um zu den erfindungsgemäßen"Hammerhead"-Ribozymen zu kommen.

Dabei ersetzt der Abschnitt Helix I in jeweils einer der Abbildungen 1,3, 4, 5,6, 7,8, 9,11, 12,13 oder 15 die beliebigen Nukleotide in Helix I nach Abbildung 24 so, daß das erste Nukleotid am 3'-Ende von Helix I in jeweils einer der Abbildungen 1,3, 4,5, 6,7, 8,9, 11,12, 13 oder 15 das erste beliebige Nukleotid"N"am 3'-Ende der Helix I der Abbildung 24 ersetzt und die folgenden beliebigen Nukleotide"N"in Helix I Abb. 24 in Richtung 5'- Ende durch die Nukleotide ersetzt werden, die in einem der Unterpunkte (o) bis (q) Helix I in jeweils einer der Abbildungen 1,3, 4,5, 6,7, 8,9, 11, 12,13 oder 15 gezeigt sind. Die Nukleotide"A"und"C"am 5'-Ende der Helix 111 in einer der Abbildungen 1,3, 4,5, 6,7, 8,9, 11,12, 13 oder 15 ersetzen jeweils die Nukleotide #A" und #C" in Helix III in Abb. 24 und die

folgenden beliebigen Nukleotide"N"in Helix lil Abb. 24 werden in Richtung 5'-Ende durch die Nukleotide ersetzt, die in einem der Unterpunkte (o)- (q) Helix 111 in jeweils einer der Abbildungen 1,3, 4,5, 6,7, 8, 9,11, 12,13 oder 15 gezeigt sind. Ein konkretes Beispiel zeigt Abbildung 25. Das "Hammerhead"-Ribozyms V16 (7/7) geht auf Abbildung 24) und Abbildung 11) zurück. Dabei heißt Ribozym V16 (7/7), daß das Enzym gegen die GUC-Site des Oligos V16 gerichtet ist und in den"erkennenden Armen" jeweils 7 Nukleotide (Helix I und Helix 111) enthält, hier gemäß Helix I und Helix 111 von Unterpunkt (o) in Fig. 11). Entsprechendes gilt für alle Ribozyme gemäß Unterpunkten (o bis q) in jeweils einer der Abbildungen 1,3, 4,5, 6,7, 8,9, 11,12, 13 oder 15.

Konkret ist eine bevorzugte Ausführungsform insbesondere Fig 26 zu entnehmen. Fig. 26 zeigt in allgemeiner Darstellung ein DNA-Enzym des Typs'10-23'gemäß Santoro et al., 1997, Fig. 2, S. 4264. Der obere, mit einem Pfel gekennzeichnete Strang ist der zu spaltende RNA-Strang, wobei der Pfeil die Spaltstelle angibt und der untere ist eine Darstellung des DNA-Enzyms. In Bezug auf die vorliegende Anmeldung ist dabei im oberen Strang das"Y"="U"und das"R"="G", wobei 3'-wärts vom"Y"ein "C"liegt. Die Spaltstelle auf dem oberen Strang ist daher eine sogenannte GUC-Site (s. o. ). Entsprechend ist"R"im unteren Strang ="A"und 5'-wärts vom"R"im unteren Strang befindet sich entsprechend ein"G". Dem schließen sich 5-wärts die weiteren Nukleotide aus Abschnitt I gemäß den Unterpunkten (I bis n) in jeweils einer der Abbildungen 1,3, 4,5, 6,7, 8, 9, 11,12, 13 oder 15 an, d. h. 5 weitere Nukleotide bei Unterpunkt I, 6 weitere Nukleotide bei Unterpunkt m und 7 weitere Nukleotide bei Unterpunkt n. In Abschnitt III gemäß Abbildung 25-dem zweiten mit der RNA basengepaarten Abschnitt-schließen sich dann direkt an das am Abschnitt III anliegende ungepaarte"A"aus 5'-Richtung 3'-wärts die Nukleotide aus Abschnitt 111 gemäß den Unterpunkten (I bis n) in jeweils einer der Abbildungen 1,3, 4,5, 6,7, 8,9, 11,12, 13 oder 15 an, d. h. 7 weitere Nukleotide bei Unterpunkt I, 8 weitere Nukleotide bei Unterpunkt m und 9

weitere Nukleotide bei Unterpunkt n. Abschnitt 111 und Abschnitt I sind die sogenannten"erkennenden Arme"des DNA-Enzyms (s. später folgendes Beispiel 3).

Das im Rahmen der Erfindung besonders bevorzugte DNA-Enzym des Typs"10-23"für Unterpunkt (n) nach Abb. 1 hätte damit folgende Sequenz, wobei der unterstrichene Abschnitt mit der RNA basengepaart wäre : ATGTCATGA (=R)-GGCTAGCTACAACGA-GGTTAGGGG Dieses DNA-Enzym würde als V15 (9/9) bezeichnet werden, wobei die Bezeichnung aussagt, daß das Enzym gegen die GUC-Site des Oligos V15 gerichtet ist und in den"erkennenden Armen"jeweils 9 Nukleotide (Abschnitt 1 und 111) enthält, z. B. gemäß Abschnitt I und Abschnitt 111 von Unterpunkt (n) in Fig. 1). Entsprechendes gilt für alle DNA-Enzyme gemäß Unterpunkten (I bis n) in jeweils einer der Abbildungen 1,3, 4,5, 6,7, 8,9, 11,12, 13 oder 15.

Ein weiterer bevorzugter Gegenstand ist auch ein erfindungsgemäßes Polynukleotid-Konstrukt, wobei dieses mindestens eine modifizierte oder unmodifizierte Ribose, mindestens eine modifizierte oder unmodifizierte Phosphodiesterbindung und/oder mindestens eine modifizierte oder unmodifizierte Base aufweist.

Ein weiterer bevorzugter Gegenstand ist auch ein erfindungsgemäßes Oligonukleotid oder erfindungsgemäßes Polynukleotid-Konstrukt, wobei dieses an einen Träger ; insbesondere Protein, vorzugsweise tet-, Transportin oder Ferritin ; gebunden und/oder in einem Liposom verpackt ist.

Ein weiterer bevorzugter Gegenstand ist auch eine Zelle enthaltend mindestens ein erfindungsgemäßes Oligonukleotid und/oder ein erfindungsgemäßes Polynukleotid-Konstrukt.

Ein weiterer bevorzugter Gegenstand ist auch ein Arzneimittel enthaltend mindestens ein erfindungsgemäßes Oligonukleotid, ein erfindungsgemäßes Polynukleotid-Konstrukt und/oder eine erfindungsgemäße Zelle sowie gegebenenfalls geeignete Hilfs-und/oder Zusatzstoffe. Die erfindungsgemäßen Arzneimittel können als flüssige Arzneiformen in Form von Injektionslösungen, Tropfen oder Säfte, als halbfeste Arzneiformen in Form von Granulaten, Tabletten, Pellets, Patches, Kapseln, Pflaster oder Aerosolen verabreicht werden und enthalten neben den mindestens einem erfindungsgemäßen Gegenstand je nach galenischer Form gegebenenfalls Trägermaterialien, Füllstoffe, Lösungsmittel, Verdünnungsmittel, Farbstoffe und/oder Bindemittel. Die Auswahl der Hilfsstoffe sowie die einzusetzenden Mengen derselben hängt davon ab, ob das Arzneimittel oral, peroral, parenteral, intravenös, intraperitoneal, intradermal, intramuskulär, intranasal, buccal, rectal oder örtlich, zum Beispiel auf Infektionen an der Haut, der Schleimhäute und an den Augen, appliziert werden soll. Für die orale Applikation eignen sich Zubereitungen in Form von Tabletten, Dragees, Kapseln, Granulaten, Tropfen, Säften und Sirupen, für die parenterale, topische und inhalative Applikation Lösungen, Suspensionen, leicht rekonstituierbare Trockenzubereitungen sowie Sprays. Erfindungsgemäße Gegenstände in einem Depot in gelöster Form oder in einem Pflaster, gegebenenfalls unter Zusatz von die Hautpenetration fördernden Mitteln, sind geeignete perkutane Applikationszubereitungen. Oral oder perkutan anwendbare Zubereitungsformen können die erfindungsgemäßen Gegenstände verzögert freisetzen. Die an den Patienten zu verabreichende Wirkstoffmenge variiert in Abhängigkeit vom Gewicht des Patienten, von der Applikationsart, der Indikation und dem Schweregrad der Erkrankung.

Üblichweise werden 2 bis 500 mg/kg wenigstens eines erfindungsgemäßen Gegenstandes appliziert. Wenn das Arzneimittel insbesondere zur Gentherapie verwendet werden soll, empfehlen sich als geeignete Hilfs-

oder Zusatzstoffe beispielsweise eine physiologische Kochsalzlösung, Stabilisatoren, Proteinase-, DNAse-Inhibitoren etc.

Ein weiterer bevorzugter Gegenstand ist auch ein Diagnostikum enthaltend mindestens ein erfindungsgemäßes Oligonukleotid, ein erfindungsgemäßes Polynukleotid-Konstrukt und/oder eine erfindungsgemäße Zelle sowie gegebenenfalls geeignete Zusatzstoffe.

Dabei bedeuten - Arzneimittel : ein Stoff entsprechend der Definition im Artikel 1 §2 des deutschen Gesetzes über den Verkehr mit Arzneimitteln (AMG). Das heißt, Stoffe oder Zubereitungen aus Stoffen, die dazu bestimmt sind, durch Anwendung am oder im menschlichen oder tierischen Körper 1. Krankheiten, Leiden, Körperschäden oder krankhafte Beschwerden zu heilen, zu lindern, zu verhüten oder zu erkennen, 2. die Beschaffenheit, den Zustand oder die Funktionen des Körpers oder seelische Zustände erkennen zu lassen, 3. vom menschlichen Körper erzeugte Wirkstoffe oder Körperflüssigkeiten zu ersetzen, 4. Krankheitserreger, Parasiten oder körperfremde Stoffe abzuwehren, zu beseitigen oder unschädlich zu machen oder 5. die Beschaffenheit, den Zustand oder die Funktionen des Körpers oder seelische Zustände zu beeinflussen.

-Diagnostikum : Verbindung oder Verfahren, das verwendet werden kann, um eine Krankheit zu diagnostizieren Ein weiterer bevorzugter Gegenstand ist auch die Verwendung mindestens eines erfindungsgemäßen Oligonukleotid, eines erfindungsgemäßen Polynukleotid-Konstrukt und/oder einer erfindungsgemäßen Zelle zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Schmerz,

insbesondere von chronischem Schmerz, taktiler Allodynie, thermisch ausgelöstem Schmerz, und/oder Entzündungsschmerz.

Ein weiterer bevorzugter Gegenstand ist auch die Verwendung mindestens eines erfindungsgemäßen Oligonukleotids, eines erfindungsgemäßen Polynukleotid-Konstrukts und/oder einer erfindungsgemäßen Zelle zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Harninkontinenz ; auch von neurogenen Blasensymptomen ; Pruritus, Tumoren, Entzündungen ; insbesondere von VR1-Rezeptor-assoziierten Entzündungen mit Symptomen wie Asthma ; sowie von allen mit VR1 zusammenhängenden Krankheitssymptomen.

Ein weiterer bevorzugter Gegenstand ist auch die Verwendung mindestens eines erfindungsgemäßen Oligonukleotids, eines erfindungsgemäßen Polynukleotid-Konstrukts und/oder einer erfindungsgemäßen Zelle für die Gentherapie, vorzugsweise In-vivo oder In-vitro Gentherapie. Unter Gentherapie versteht man eine Therapieform, bei der durch die Einführung von Nukleinsäuren in Zellen ein Effektorgen, meist ein Protein, aber auch ein Antisense Oligodesoxynukleotid, exprimiert wird. Man unterscheidet prinzipiell In-vivo-und In-vitro-Verfahren. In In-vitro-Verfahren werden Zellen aus dem Organismus entfernt und ex-vivo mit Vektoren transfiziert, um anschließend wieder in denselben oder in einen anderen Organismus eingebracht zu werden. Bei der In-vivo-Gentherapie werden Vektoren, beispielsweise zur Bekämpfung von Tumoren, systemisch (z. B. über die Blutbahn) oder direkt in den Tumor appliziert.

Ein weiterer bevorzugter Gegenstand ist auch ein Verfahren zur Identifizierung schmerzmodulierender Substanzen, dadurch gekennzeichnet, daß die Identifizierung über eine Quantifizierung der Bindung mindestens eines, vorzugsweise markierten, erfindungsgemäßen

Oligonukleotids oder mindestens eines erfindungsgemäßen Polynukleotid- Konstrukts an eine RNA erfolgt.

Ein weiterer bevorzugter Gegenstand ist auch ein Verfahren zur Identifizierung schmerzmodulierender Substanzen mit folgenden Verfahrensschritten : (a) gentechnische Manipulation mindestens einer Zelle (Testzelle) mit mindestens einem erfindungsgemäßen Oligonukleotid und/oder einem erfindungsgemäßen Polynukleotid-Konstrukt, (a') parallele gentechnische Manipulation mindestens einer identischen Zelle (Kontrollzelle) entweder * unterbleibend, 'unter Durchführung der Manipulation parallel ohne Oligonukleotid oder Polynukleotid-Konstrukt oder mit einem veränderten, nicht mehr erfindungsgemäßen Oligonukleotids oder Polynukleotidkonstrukts, (b) parallele Inkubation einer zu testenden Substanz unter geeigneten Bedingungen mit mindestens einer Test-Zelle und mindestens einer Konrollzelle und/oder einer Präparation aus solchen Zelle, die mindestens ein Rezeptorprotein, ausgewählt aus der Vanilloid-Rezeptor- Familie, vorzugsweise den VR-1-Rezeptor, synthetisiert hat (c) Messung der Bindung der Testsubstanz an dem von den Zellen synthetisierten Protein oder Messung mindestens eines der durch die Bindung der Testsubstanz an das Rezeptorprotein veränderten funktionellen Parameter, (d) Identifizierung der Substanzen über das Ausmaß der Differenz zwischen dem Meßwert bei der Testzelle und dem bei der Kontrollzelle.

Dabei bezieht sich der Begriff schmerzmodulierend auf einen potentiellen regulierenden Einfluß auf das physiologische Schmerzgeschehen, insbesondere auf eine analgetische Wirkung. Der Begriff Substanz umfaßt jede als Arzneimittel-Wirkstoff geeignete Verbindung, insbesondere also niedermolekulare Wirkstoffe, aber auch andere wie Nukleinsäuren, Fette, Zucker, Peptide oder Proteine wie Antikörper. Die Inkubation unter geeigneten Bedingungen ist hier so zu verstehen, daß die zu untersuchende Substanz mit der Zelle oder der entsprechenden Präparation in einem wässrigen Medium eine definierte Zeit vor der Messung reagieren kann. Dabei kann das wässrige Medium temperiert werden, beispielsweise zwischen 4°C und 40°C, vorzugsweise bei Raumtemperatur oder bei 37°C. Die Inkubationszeit kann zwischen wenigen Sekunden und mehreren Stunden variiert werden, je nach der Wechselwirkung der Substanz mit dem Rezeptor. Bevorzugt sind aber Zeiten zwischen 1 min und 60 min. Das wäßrige Medium kann geeignete Salze und/oder Puffersysteme enthalten, so daß bei der Inkubation beispielsweise ein pH zwischen 6 und 8, vorzugsweise pH 7,0-7, 5 im Medium herrscht. Dem Medium können weiter geeignete Substanzen, wie Coenzyme, Nährstoffe etc. beigefügt werden. Die geeigneten Bedingungen können vom Fachmann in Abhängigkeit von der zu untersuchenden Wechselwirkung der Substanz mit dem Rezeptor aufgrund seiner Erfahrung, der Literatur oder weniger, einfacher Vorversuche leicht festgelegt werden, um im Verfahren einen möglichst deutlichen Meßwert zu erhalten. Eine Zelle, die einen Reuzeptor synthetisiert hat, ist ein Zelle, die diesen Rezeptor bereits endogen exprimiert hat oder eine solche, die gentechnisch verändert wurden, so daß sie diesen Rezeptor exprimiert und entsprechend vor Beginn des erfindungsgemäßen Verfahrens den Rezepror enthält. Die Zellen können Zellen aus evt. immortalisierten Zellinie sein oder native aus Geweben stammende und aus diesen isolierte Zellen sein, wobei der Zellverband meist aufgelöst ist. Die Präparation aus diesen Zellen umfaßt insbesondere Homogenate aus den

Zellen, das Cytosol, eine Membranfraktion der Zellen mit Membranfragmenten, eine Suspension isolierter Zellorganellen etc.

Der Maßstab über den das Verfahren die Auffindung interessanter Substanzen erlaubt, ist entweder die Bindung an den Rezeptor, die z. B. durch Verdrängung eines bekannten Liganden oder das Ausmaß gebundener Substanz nachgewiesen werden kann, oder die Veränderung eines funktionellen Parameters durch die Wechselwirkung der Substanz mit dem Rezeptor. Diese Wechselwirkung kann insbesondere in einer Regulation, Hemmung und/oder Aktivierung von Rezeptoren, lonenkanälen und/oder Enzymen liegen und veränderte funktionelle Parameter können beispielsweise die Genexpression, das lonenmilieus, der pH oder das Membranpotentials, bzw. die Veränderung der Enzymaktivität oder der Konzentration der 2nd messenger sein. Dabei heißt : - gentechnisch manipuliert : Manipulation von Zellen, Geweben oder Organismen derart, daß hier genetisches Material eingebracht wird - endogen exprimiert : Expression eines Proteins, die eine Zellinie unter geeigneten Kulturbedingungen aufweist, ohne das dieses entsprechende Protein durch gentechnische Manipulation zur Expression veranlasst wurde Eine weitere bevorzugter Ausführungsform dieses Verfahrens sieht vor, daß die Zelle bereits vor den Verfahrensschritten (a) und (a') gentechnisch manipuliert wird.

Eine weitere bevorzugter Ausführungsform dieses Verfahrens sieht vor, daß die gentechnische Manipulation die Messung mindestens eines der durch die Testsubstanz veränderten funktionellen Parameter erlaubt.

Eine weitere bevorzugter Ausführungsform dieses Verfahrens sieht vor, daß durch die gentechnische Manipulion eine in der Zelle nicht endogen exprimierte Form eines Mitglied der Vanilloid-Rezeptor-Familie, vorzugsweise der VR-1-Rezeptor, exprimiert oder ein Reportergen eingeführt wird.

Eine weitere bevorzugter Ausführungsform dieses Verfahrens sieht vor, daß die Messung der Bindung über die Verdrängung eines bekannten markierten Liganden eines Mitglied der Vanilloid-Rezeptor-Familie, vorzugsweise des VR-1-Rezeptors, erfolgt.

Eine weitere bevorzugter Ausführungsform dieses Verfahrens sieht vor, daß zwischen den parallelen Verfahrensschritten (a) und (a') und dem Verfahrensschritt (b) > 8 h, vorzugsweise > 12 h, insbesondere > 24 h, vergehen.

Ein weiterer bevorzugter Gegenstand ist auch ein Verfahren zur Diagnose von Krankheitsbildern, die mit veränderter Expression von Genen der Vanilloid-Rezeptor-Familie verbunden sind, dadurch gekennzeichnet, daß die Diagnose über eine Quantifizierung der Bindung eines erfindungsgemäßen Oligonukleotids und/oder mindestens eines erfindungsgemäßen Polynukleotid-Konstrukts an eine RNA erfolgt.

Die Oligonukleotide und auch Polynukleotidkonstrukte werden nach dem Fachmann bekannten Verfahren hergestellt. Dabei werden Nukleotide, insbesondere auch Oligonukleotide, beispielsweise nach Art der Merryfield- Synthese, an einem unlöslichen Träger (H. G. Gassen et al., Chemical and Enzymatic Synthesis of Genefragments (Verlag Chemie, Weinheim 1982)) oder auf andere Art synthetisiert (Beyer/Walter ; Lehrbuch der Organischen Chemie, 20. Auflage, (S. Hirzel Verlag, Stuttgart 1984), S. 816 ff.).

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Behandlung, insbesondere Schmerzbehandlung, eines nichthumanen Säugetieres oder Menschen, das oder der eine Behandlung von Schmerzen, insbesondere chronischer Schmerzen, benötigt, durch Verabreichung eines erfindungsgemäßen Arzneimittels, insbesondere solche enthaltend eine erfindungsgemäßes Oligonukleotid und/oder ein erfindungsgemäßes Polynukleotid-Konstrukt. Ein weiterer Gegenstand sind auch entsprechende Verfahren zur Behandlung von Pruritus und/oder Harninkontinenz.

Die folgenden Beispiele und Abbildungen sollen die Erfindung erläutern, ohne daß der Gegenstand der Erfindung darauf beschränkt wäre.

Abbildungen und Beispiele Abbildungen Abbildungen, Abb., Figur und Fig. sind als synonym zu betrachten. Ebenso synonym sind im Zusammenhang mit den Abbildungen Subtyp und Unterpunkt. Ein"X"in den abgebildeten Sequenzen steht für ein beliebiges zur entsprechenden Base auf der mRNA von VR1 komplementäres Nukleotid. Die Abbildungen zeigen : Figur 1) Generell Nukleotidsequenzen ausgehend von einer Antisense Oligodesoxynukleotidsequenz gegen die mRNA des VR1 aus der Ratte, hier häufig als Oligo V15, Oligonukleotid Nr. 15 oder V15 bezeichnet.

Unterpunkte (a)- (j) zeigen verkürzte Ausschnitte aus dieser Antisense- Oligodesoxynukleotidsequenz, Unterpunkt (k) zeigt die volle Antisense- Oligodesoxynukleotidsequenz, mit der das"messenger walk screening"

durchgeführt wurde, Unterpunkte (I)- (n) zeigen jeweils zwei (Abschn. I und Abschn. III) von der vollen Antisense-Oligodesoxynukleotidsequenz ausgehende Nukleotidteilsequenzen, die jeweils nicht überlappende Teilbereiche dieser Seqenz umfassen oder diesen entsprechen, meist an oder in der GAC-Region getrennt sind und in bestimmten Polynukleotidkonstrukten, insbesondere DNA-Enzymen, in zwei voneinander getrennten Bereichen, den"erkennenden Armen"auftreten, Unterpunkte (o) - (q) zeigen jeweils zwei (Helix I und Helix lil) von der vollen Antisense-Oligodesoxynukleotidsequenz ausgehende Nukleotidteilsequenzen (hier allerdings als RNA), die jeweils nicht überlappende Teilbereiche dieser Seqenz umfassen oder diesen entsprechen, meist an oder in der GAC-Region getrennt sind und in bestimmten Polynukleotidkonstrukten, insbesondere Ribozymen, in zwei voneinander getrennten Bereichen, den"erkennenden Armen"auftreten.

Figur 2) Die dem Oligo V15 in Figur 1 in der Position auf der mRNA entsprechende Sequenz eines Antisense-Desoxyoligonukleotids gegen humanes VR1. Die Untertypen (a) - (k) entsprechen bezüglich Art und generellem Inhalt den bereits zu Figur 1 beschriebenen.

Figur 3) Generell Nukleotidsequenzen ausgehend von einer Antisense Oligodesoxynukleotidsequenz gegen die mRNA des VR1 aus der Ratte, hier häufig als Oligo V30, Oligonukleotid Nr. 30 oder V30 bezeichnet. Art und Inhalt der Untertypen entspricht den bereits zu Figur 1 beschriebenen.

Figur 4) Die dem Oligo V30 in Figur 3 in der Position auf der mRNA entsprechende Sequenz eines Antisense-Desoxyoligonukleotids gegen humanes VR1. Die Untertypen (a) - (q) entsprechen bezüglich Art und generellem Inhalt den bereits zu Figur 1 beschriebenen.

Figur 5) Generell Nukleotidsequenzen ausgehend von einer Antisense Oligodesoxynukleotidsequenz gegen die mRNA des VR1 aus der Ratte, hier häufig als Oligo V32, Oligonukleotid Nr. 32 oder V32 bezeichnet. Art und Inhalt der Untertypen entspricht den bereits zu Figur 1 beschriebenen.

Figur 6) Die dem Oligo V32 in Figur 5 in der Position auf der mRNA entsprechende Sequenz eines Antisense-Desoxyoligonukleotids gegen humanes VR1. Die Untertypen (a) - (q) entsprechen bezüglich Art und generellem Inhalt den bereits zu Figur 1 beschriebenen.

Figur 7) Generell Nukleotidsequenzen ausgehend von einer Antisense Oligodesoxynukleotidsequenz gegen die mRNA des VR1 aus der Ratte, hier häufig als Oligo V26, Oligonukleotid Nr. 26 oder V26 bezeichnet. Art und Inhalt der Untertypen entspricht den bereits zu Figur 1 beschriebenen.

Figur 8) Die dem Oligo V26 in Figur 7 in der Position auf der mRNA entsprechende Sequenz eines Antisense-Desoxyoligonukleotids gegen humanes VR1. Die Untertypen (a) - (q) entsprechen bezüglich Art und generellem Inhalt den bereits zu Figur 1 beschriebenen.

Figur 9) Generell Nukleotidsequenzen ausgehend von einer Antisense Oligodesoxynukleotidsequenz gegen die mRNA des VR1 aus der Ratte, hier häufig als Oligo V2, Oligonukleotid Nr. 2 oder V2 bezeichnet. Art und Inhalt der Untertypen entspricht den bereits zu Figur 1 beschriebenen.

Figur 10)

Die dem Oligo V2 in Figur 9 in der Position auf der mRNA entsprechende Sequenz eines Antisense-Desoxyoligonukleotids gegen humanes VR1. Die Untertypen (a) - (k) entsprechen bezüglich Art und generellem Inhalt den bereits zu Figur 1 beschriebenen.

Figur 11) Generell Nukleotidsequenzen ausgehend von einer Antisense Oligodesoxynukleotidsequenz gegen die mRNA des VR1 aus der Ratte, hier häufig als Oligo V16, Oligonukleotid Nr. 16 oder V16 bezeichnet. Art und Inhalt der Untertypen entspricht den bereits zu Figur 1 beschriebenen.

Figur 12) Die dem Oligo V16 in Figur 11 in der Position auf der mRNA entsprechende Sequenz eines Antisense-Desoxyoligonukleotids gegen humanes VR1. Die Untertypen (a) - (q) entsprechen bezüglich Art und generellem Inhalt den bereits zu Figur 1 beschriebenen.

Figur 13) Generell Nukleotidsequenzen ausgehend von einer Antisense Oligodesoxynukleotidsequenz gegen die mRNA des VR1 aus der Ratte, hier häufig als Oligo V28, Oligonukleotid Nr. 28 oder V28 bezeichnet. Art und Inhalt der Untertypen entspricht den bereits zu Figur 1 beschriebenen.

Figur 14) Die dem Oligo V28 in Figur 13 in der Position auf der mRNA entsprechende Sequenz eines Antisense-Desoxyoligonukleotids gegen humanes VR1. Die Untertypen (a) - (k) entsprechen bezüglich Art und generellem Inhalt den bereits zu Figur 1 beschriebenen.

Figur 15) Generell Nukleotidsequenzen ausgehend von einer Antisense Oligodesoxynukleotidsequenz gegen die mRNA des VR1 aus der Ratte,

hier häufig als Oligo V4, Oligonukleotid Nr. 4 oder V4 bezeichnet. Art und Inhalt der Untertypen entspricht den bereits zu Figur 1 beschriebenen.

Figur 16) Die dem Oligo V4 in Figur 15 in der Position auf der mRNA entsprechende Sequenz eines Antisense-Desoxyoligonukleotids gegen humanes VR1. Die Untertypen (a) - (k) entsprechen bezüglich Art und generellem Inhalt den bereits zu Figur 1 beschriebenen.

Figur 17 : Fig. 17) zeigt das Ergebnis des Messenger Walk Screenings. Zu sehen sind in jeder Spur neben der oberen Bande des ungeschnittenen Substrates die zwei Produktbanden der geschnittenen mRNA sowie einige unspezifische Banden. Zu sehen ist die VR1 mRNA nach dem Abbau durch RNase H in der Gegenwart von jeweils einem von 33 Antisense- Oligonukleotiden (Oligo V1 bis Oligo V33). Zu sehen sind in jeder Spur neben der oberen Bande des ungeschnittenen Substrates die zwei Produktbanden der geschnittenen mRNA sowie einige unspezifische Banden.

Spur 1 : VR1 mRNA, Spur 2-34 : RNase H Assay mit Antisense Oligodesoxynukleotiden gegen die 33 GUC-Sites der VR1 mRNA (Oligo V1 bis Oligo V33).

Figur 18) : Quantitative Auswertung des Messenger Walk Screenings. In Figur 18 ist der prozentuale Anteil der ungeschnittenen mRNA nach dem RNase H Assay mit den einzelnen ODNs aufgetragen. Jeder Wert repräsentiert den Mittelwert aus mindestens drei Experimenten, so daß die Standardabweichung in keinem Fall 10% übersteigt. Die Antisense Oligodesoxynukleotide gegen die 15. und 30. GUC-Site binden am

effizientesten an die VR1 mRNA, sodass diese zu 88 4 bzw. 97 1% durch die RNase H abgebaut wird (Oligo V15 und Oligo V30).

Figur 19) : Bild von einem Gel nach dem RNase H Assay mit den Oligonukleotiden V15, V15Ktr. (Mismatch), V30 und V30 Ktr. (Mismatch).

Gezeigt sind VR1 mRNA (Spur 1) sowie RNase H Assay mit den Oligodesoxynukleotiden V15, V15Ktr., V30 und V30Ktr (Spur 2-5).

Figur 20) : Quantitative Beurteilung des Schneidens der mRNA durch Ribozyme und DNA-Enzyme unter Bedingungen unter"Single turnover"-Bedingungen.

Figur 21) : Kinetik des VR1 mRNA-Schneidens durch Ribozyme und DNA-Enzyme unter"Single turnover"-Bedingungen.

Figur 22) : Kinetik der VR1 mRNA-Schneidens durch Ribozyme und DNA-Enzyme unter"Multiple turnover"-Bedingungen.

Figur 23) : Abschätzung der taktilen Allodynie während der Behandlung durch VR1- Antisense (AS)- und Mismatch (MS)-Oligodesoxynukleotide (V15 und V15Ktr.).

Figur 24) :

Allgemeine Darstellung eines"Hammerhead"-Ribozyms mit den "erkennenden Armen"Helix I und Helix III, in die jeweils die Helices I und 111 gemäß der Unterpunkte (o)- (q) in einer der Abbildungen 1,3, 4,5, 6,7, 8, 9,11, 12,13 oder 15 eingefügt werden, um zu den erfindungsgemäßen "Hammerhead"-Ribozymen zu kommen (s. Beschreibung zu Figur 1).

Dabei ersetzt der Abschnitt Helix I in jeweils einer der Abbildungen 1,3, 4, 5,6, 7,8, 9,11, 12,13 oder 15 die beliebigen Nukleotide in Helix I nach Abbildung 24 so, daß das erste Nukleotid am 3'-Ende von Helix I in jeweils einer der Abbildungen 1,3, 4,5, 6,7, 8,9, 11,12, 13 oder 15 das erste beliebige Nukleotid"N"am 3'-Ende der Helix I der Abbildung 24 ersetzt und die folgenden beliebigen Nukleotide"N"in Helix I Abb. 24 in Richtung 5'- Ende durch die Nukleotide ersetzt werden, die in einem der Unterpunkte (o) bis (q) Helix I in jeweils einer der Abbildungen 1,3, 4,5, 6,7, 8,9, 11, 12,13 oder 15 gezeigt sind. Die Nukleotide"A"und"C"am 5'-Ende der Helix 111 in einer der Abbildungen 1,3, 4,5, 6,7, 8,9, 11,12, 13 oder 15 ersetzen jeweils die Nukleotide #A" und #C" in Helix III in Abb. 24 und die folgenden beliebigen Nukleotide #N" in Helix III Abb. 24 werden in Richtung 5'-Ende durch die Nukleotide ersetzt, die in einem der Unterpunkte (o)- (q) Helix 111 in jeweils einer der Abbildungen 1,3, 4,5, 6,7, 8,9, 11,12, 13 oder 15 gezeigt sind. Ein konkretes Beispiel zeigt Abbildung 25.

Figure 25) Darstellung des (besonders bevorzugten)"Hammerhead"-Ribozyms V16 (7/7), nach Abbildung 24) und Abbildung 11). Dabei heißt Ribozym V16 (7/7), daß das Enzym gegen die GUC-Site des Oligos V16 gerichtet ist und in den"erkennenden Armen"jeweils 7 Nukleotide (Helix I und Helix III) enthält, hier gemäß Helix I und Helix 111 von Unterpunkt (o) in Fig. 11).

Entsprechendes gilt für alle Ribozyme gemäß Unterpunkten (o bis q) in jeweils einer der Abbildungen 1,3, 4,5, 6,7, 8,9, 11,12, 13 oder 15.

Figur 26) :

Darstellung des DNA-Enzyms des Typs'10-23'gemäß Santoro et al., 1997, Fig. 2, S. 4264 : Der obere, mit einem Pfel gekennzeichnete Strang ist der zu spaltende RNA-Strang, wobei der Pfeil die Spaltstelle angibt und der untere ist eine Darstellung des DNA-Enzyms. In Bezug auf die vorliegende Anmeldung ist dabei im oberen Strang das"Y"="U"und das"R"="G", wobei 3'-wärts vom"Y"ein"C"liegt. Die Spaltstelle auf dem oberen Strang ist daher eine sogenannte GUC-Site (s. o. ). Entsprechend ist"R"im unteren Strang ="A" und 5'-wärts vom"R"im unteren Strang befindet sich entsprechend ein"G".

Dem schließen sich 5-wärts die weiteren Nukleotide aus Abschnitt) gemäß. den Unterpunkten (I bis n) in jeweils einer der Abbildungen 1,3, 4,5, 6,7, 8,9, 11,12, 13 oder 15 an, d. h. 5 weitere Nukleotide bei Unterpunkt I, 6 weitere Nukleotide bei Unterpunkt m und 7 weitere Nukleotide bei Unterpunkt n. In Abschnitt 111 gemäß Abbildung 25-dem zweiten mit der RNA basengepaarten Abschnitt-schließen sich dann direkt an das am Abschnitt i anliegende ungepaarte"A"aus 5'-Richtung 3'-wärts die Nukleotide aus Abschnitt III gemäß den Unterpunkten (I bis n) in jeweils einer der Abbildungen 1,3, 4,5, 6,7, 8,9, 11,12, 13 oder 15 an, d. h. 7 weitere Nukleotide bei Unterpunkt I, 8 weitere Nukleotide bei Unterpunkt m und 9 weitere Nukleotide bei Unterpunkt n. Abschnitt III und Abschnitt I sind die sogenannten erkennenden Arme"des DNA-Enzyms (s. Beispiel 3).

Das DNA-Enzym des Typs"10-23"für Unterpunkt (n) nach Abb. 1 hätte damit folgende Sequenz, wobei der unterstrichene Abschnitt mit der RNA basengepaart wäre : ATGTCATGA (=R)-GGCTAGCTACAACGA-GGTTAGGGG Dieses (besonders bevorzugte) DNA-Enzym würde als V15 (9/9) bezeichnet werden, wobei die Bezeichnung aussagt, daß das Enzym gegen die GUC-Site des Oligos V15 gerichtet ist und in den"erkennenden Armen"jeweils 9 Nukleotide (Abschnitt und)))) enthält, z. B. gemäß

Abschnitt I und Abschnitt III von Unterpunkt (n) in Fig. 1). Entsprechendes gilt für alle DNA-Enzyme gemäß Unterpunkten (I bis n) in jeweils einer der Abbildungen 1,3, 4,5, 6,7, 8,9, 11,12, 13 oder 15.

Fig. 27) Schematische Darstellung einer"Locked Nucleic Acid"LNA : Beispiele : Identifizierung der generell geeigneten Schnittstellen : Der erste Schritt in der Antisense-und Ribozym-Strategie ist die Identifizierung zugänglicher Stellen der mRNA für die Bindung von Oligonukleotiden, insbesondere aber auch von Ribozymen. Dazu mußte die mRNA des VR1 auf diese Schnittstellen hin untersucht werden. Eine Analyse der VR1-mRNA ergab im kodierenden Bereich folgende potentielle Erkennungsstellen für Ribozyme : 33 X GT (U) C-Sequenzen 28 X GT (U) T-Sequenzen 12 X GT (U) A-Sequenzen Um die zugänglichen Stellen der VR1 mRNA zu ermitteln, wurden in einem ersten Schritt drei unabhängige Nukleotidgemische folgender Sequenz synthetisiert : Gemisch 1 : NNNAACNNN sog. GUU-Library Gemisch 2 : NNNCACNNN sog. GUA-Library Gemisch 3 : NNNGACNNN sog. GUC-Library Diese wurden konsekutiv in einem Rnase H-Experiment verwendet und es zeigte sich, daß nur mit der GUC-Library ein nennenswerter Abbau der VR1-mRNA zu beobachten war. Somit sind von den potentiellen

Zielsequenzen für Ribozyme die 33 GUC-Sites in der VR1 mRNA am besten zugänglich und wurden zur weiteren Analyse eingesetzt.

Beispiel 2 : Identifizierung der effektivsten Antisense Oligodesoxynukleotide Messenger Walk Screening Zur Identifikation von Bereichen der mRNA, die für Antisense Oligodesoxynukleotide zugänglich sind, wurde diese systematisch mit ODNs im RNase H Assay gescreent (Messenger Walk Screening). Die ODNs waren 18 Nukleotide lang und enthielten in der Mitte eine GAC- Sequenz, die revers-komplementär zu GUC-Sequenzen in der mRNA ist.

Dieses Triplet wurde als Target gewählt, da es gute Ergebnisse zeigte und in einem zweiten Schritt zur Entwicklung von Hammerhead Ribozymen und DNA Enzymen verwendet werden kann. Insgesamt wurden 33 ODNs, die als V1 bis V33 bezeichnet wurden, gegen sämtliche GUC-Sites der VR1 mRNA getestet. Die ODNs wurden systematisch durch die Zugabe von jeweils einem ODN und RNase H zur mRNA auf ihre Eignung hin gescreent. Die RNase H schneidet gebildete DNA/RNA-Duplexe wo immer ein Oligonukleotide an die mRNA binden kann (Fig. 17).

In vitro Transkription der VR1 mRNA Zunächst wurde die cDNA des Vanilloid Rezeptors in den Vektor pcDNA3.1 (+) der Firma Invitrogen kloniert. Anschließend erfolgte die in vitro Transkription der mRNA mit dem RiboMAX Large Scale RNA Production System-T7 der Firma Promega nach Angaben des Herstellers.

RNase H Assav Zum Test, ob ein Antisense Oligodesoxynukleotid an die mRNA gebunden hat, wurde ein RNase H Assay durchgeführt. Dazu wurde die VR1 mRNA (100 mM) mit einem fünffachen Überschuss des ODNs in einem

Gesamtvolumen von 10 ul in 40 mM Tris/HCI pH 7,2 ; 4 mM M9C12 ; 1 mM DTT und 150 mM NaCI für 7,5 min bei 37°C in Gegenwart von 0,4 u RNase H (von Promega) inkubiert. Die Reaktionen wurden durch Zugabe von EDTA (65 mM Endkonzentration) gestoppt. Die Proben wurden über ein 1,5% iges Agarose-Gel aufgetrennt und mit Ethidiumbromid (1 ug/ml) 20 min angefärbt. Die Gele wurden mit dem Gel Doc 2000 Gel Documentation System der Firma Biorad photographiert und mit dem Programm Quantity One ausgewertet.

Fig. 17 zeigt das Ergebnis des Messenger Walk Screenings. Zu sehen sind in jeder Spur neben der oberen Bande des ungeschnittenen Substrates die zwei Produktbanden der geschnittenen mRNA sowie einige unspezifische Banden.

Eine Quantifizierung des RNA-Abbaus zeigte, daß durch das effektiveste Antisense Oligonukleotid (Oligo Nr. 30 (V30)) mehr als 90% der VR1 mRNA spezifisch geschnitten/gespalten werden konnte, wenn es im 5- fachem Überschuß gegenüber der Ziel-mRNA eingesetzt wird (Fig. 18).

Die Intensitäten der einzelnen Banden wurden ausgewertet. In Figur 18 ist für die einzelnen ODNs der Anteil der ungeschnittenen mRNA für den RNase H Assay aufgetragen. Die Antisense Oligodesoxynukleotide gegen die 15. und 30. GUC-Site (Oligo V15 und Oligo V30) binden am effizientesten an die VR1 mRNA, so daß diese zu 88 4 bzw. 97 1% durch die RNase H abgebaut wird.

Die Sequenzen der in diesem Test effektivsten Antisense- Oligodesoxynukleotide finden sich in Abbildungen 1,3, 5,7, 9,11, 13 und 15, wobei u. a. die als Oligo V15 (Abb. 1) und Oligo V30 (Abb. 3) bezeichneten bevorzugt erscheinen in Betracht gezogen wurden.

Als Mismatch-Kontrollen für diese Antisense Oligodesoxynukleotide wurden für die folgenden Experimente Oligodesoxynukleotide synthetisiert und verwendet, bei denen jede fünfte und sechste Base (bzw.-falls diese identisch sind-zwei benachbarte Basen) vertauscht sind. Die Sequenzen der Kontroll Oligodesoxynukleotide (Mismatch) lauten : Oligo V15Ktr. : CAT GCT ATG AGC GTT GAG Oligo V30Ktr. : ATC TGT TTG AGC GTC TAC Zur Kontrolle wurde der RNase H Assay mit den Oligonukleotiden V15, V15Ktr., V30 und V30 Ktr. durchgeführt (s. Abb. 19). Erwartungsgemäß wird die RNA nur mit den Antisense ODNs, nicht aber mit den Mismatch- Kontrollen abgebaut, da diese nicht an die mRNA binden.

Zusammenfassung : Im RNase H Assay mit Antisense Oligodesoxynukleotiden gegen sämtliche GUC-Triplets der VR1 mRNA konnten Oligodesoxynukleotide gegen die GUC-Triplets (2,4, 15,16, 26,28, 30 und 32), insbesondere das 15. und 30. als die am besten bindenden ODNs identifiziert werden. Diese Oligodesoxynukleotide sowie zwei Mismatch-Kontrollen stehen somit für Versuche im Tiermodell und andere Verwendungen zur Verfügung.

Entsprechend interessant sind auch die humanen Sequenzen gem. Abb. 2, 4,6, 8,10, 12,14, 16"die von der Position den in der Ratte gefundenen entsprechen. Die mRNA der Ratte und des Menschen sind stark homolog (wahrscheinlich auch in der Faltung) und es ist daher klar, daß günstig erreichbare identifizierte Schnittstellen auf der Ratten mRNA auch human interessant sind. Dabei sind die Sequenzen besonders bevorzugt, die auch das GUC-Triplett zeigen, die Abbildungen 4,6, 8 und 12, und aufgrund der der Ratte ähnlichen Lokalisation auch die V15 und V30 entsprechenden gemäß Abbildungen 2 und 4.

Beispiel 3 : Ribozyme und DNA-Enzyme Weiter wurden aufgrund der gefundenen effektivsten Bindungsstellen entsprechende Ribozyme und DNA-Enzyme untersucht.

"Hammerhead"-Ribozyme und DNA-Enzyme des Typs'10-23' (Santoro et al., 1997) wurden gegen die Stellen die mRNA konstruiert, welche für ODNs zugänglich waren. Die Länge der"erkennenden Arme"war 7 oder 9 Nukleotide auf jeder Seite. Quantitative Auswertung der mRNA- Spaltung/Schneidung unter"Single turnover"-Bedingungen (10-facher Überschuß an Ribozymen und DNA-Enzymen) zeigte nach 20 min bei 37°C, daß Ribozyme mit kürzeren"erkennenden Armen" (Helix I und Helix III) aktiver sind, während widerum bei DNA-Enzyme solche mit längeren "Armen" (Abschn. l und Abschn. III) aktiver sind (Fig. 20). Eine schematische Abbildung eines Ribozyms mit den Helices I und 111 zeigt Fig.

24) und ein Beispiel Fig 25). Für ein DNA-Enzym 10-23 kann man dies (5'- wärts (Abschnitt I) und 3'-wärts (Abschnitt i) vom katalytischen Motiv) bei Santoro et al. (1997 ; S. 4264, Fig. 2) entnehmen (s. auch Fig 26) mit der Figurenbeschreibung).

Experimente mit Ribozymen und DNA-Enzymen wurden in 50 mM Tris/HCI pH 7.5 und 10 mM MgCI2 bei 37 °C durchgeführt. Für"Single turnover"- Experimente wurden Ribozyme und DNA-Enzyme im 10-fachen Überschuß verwendet. Bei"Multiple turnover"-Experimente wurde das Substrat mRNA im 1 0-fachen Überschuß verwendet.

"Single turnover"-Kinetik Es wurde eine kinetische Analyse unter"Single turnover"-Bedingungen für die zwei effektivsten Ribozyme und DNA-Enzyme durchgeführt (Fig. 21).

Die Daten sind in Tabelle 1 zusammengefaßt. DNA-Enzym V15 (9/9) (s.

Beschreibung Fig. 26), das die mRNA mit einer biphasischen Kinetik

schneidet, hat die höchste Rate (Geschwindigkeitskonstante), gefolgt von Ribozym V16 (7/7) (s. Fig 25), DNA-Enzym V30 (9/9) und dem langsamsten Ribozym V15 (7/7). Dabei heißt z. B. DNA-Enzym V15 (7/7), daß das Enzym gegen die GUC-Site des Oligos V15 gerichtet ist und in den"erkennenden Armen"jeweils 7 Nukleotide (Abschnitt I und 111) enthält, z. B. gemäß Abschnitt I und Abschnitt 111 von Subtyp (I) in Fig. 1).

Tabelle 1 : A1 k1 A2 k2 A# [min-1] [min-1] DNAzym 0,43 ~ 0,05 2,3 ~ 0,5 0,34 ~ 0,04 0,07 ~ 0,01 0,21 ~ 0,0 V15 (9/9) DNAzym 0,90 ~ 0, 02 0,042 ~ 0,002 - - 0,08 ~ 0,0 V30 (9/9) Ribo 0,51 ~ 0,09 0,023 ~ 0,007 - - 0,049 ~ 0,0 V15 (7/7) Ribo 0,58 ~ 0, 02 0,077 ~ 0,008 - - 0, 34 0, 0 V16(7/7)

Tab. 1 : Kinetische Daten der Ribozyme und DNA-Enzyme gegen VR1 mRNA unter"Single turnover"-Bedingungen "Multiple turnover"-Kinetik Die Spaltung der mRNA unter"Multiple turnover"-Bedingungen (10-facher Substrat Überschuß) wird in Fig. 22 gezeigt. Wieder hat das DNA-Enzym V15 (9/9) eine höhere anscheinende (apparente) Rate

((Geschwindigkeitskonstante) (Faktor 3.4) als das Ribozyme V16 (7/7) (Tab. 2).

Tabelle 2 : k [min-1] DNAzyme V15 (9/9) (6,5 ~ 0,6)*10-3 Ribo V16(7/7) (1,9 ~ 0,2)*10-3 Tab. 2 : Kinetische Daten der Ribozyme und DNA-Enzyme gegen VR1 mRNA unter"Multiple turnover"-Bedingungen.

Beispiel 4 : In vivo Experimente In 20 mänlichen Sprague-Dawley-Ratten wurden an den linken L5/L6 Spinal-Nerven Spinal-Nerven-Ligaturen gemäß Kim und Chung (1992) angelegt. Zur selben Zeit wurden Spinal-Katheter gemäß Pogatzki et al.6 (2000) implantiert. 4 bis 6 Tage nach der Operation wurde die taktile Schwellen-Basislinie (Rückzugs-Schwellen/withdrawal threshholds) an der ipsi-und contralateralen Hinterpfote durch ein elektronisches vonFrey- Anesthesiometer (IITC Life Science, USA) gemessen. Der korrekte Sitz der Spinal-Katheter wurde durch Lidocain-Gabe (10u1, 2%) bestätigt, die in einer kurzfristigen Lähmung beider Hinterglieder resultierte. Nach dem Test und Messung der Basislinie wurden je 45pg VR-1 Antisense- (AS, n=10) oder Mismatch (MS, n=10)-Oligonukleotide in 0.9% NaCI einmal am ersten

Tag und b. i. d. an den folgende 4 Tagen gegeben. Die taktilen Rückzugs- Schwellen (withdrawal threshholds) wurden 30 Minuten nach der ersten täglichen Oligo-Gabe gemessen. Die Ergebnisse sind als % maximal possible effect (% MPE ; % des maximal möglichen Effekts) auf der ipsilateralen Seite angegeben, in dem man die Basisline als 0% und die Rückzugs-Schwelle einer Kontroll-Gruppe als 100% MPE annimmt.

Verwendet wurden als Antisense Oligo V15 (Fig. 1, Subtyp k) und als Mismatch Oligo V15Ktr. wie oben bereits beschrieben.

Die Behandlung von mononeuropathischen Ratten mit Antisense-aber nicht mit Mismatch-Oligodesoxynukleotiden induzierte eine Verringerung der taktilen Allodynie beginnend am dritten Tag der Behandlung und ein Plateau an den Tagen 4 und 5 der Behandlung erreichend. Es gab keinen Effekt auf die Rückzugs-Schwellen der contralateralen Hinterpfoten.

Beispiel 5 : "Locked Nucleotides"/Gegen Abbau geschützte Oligonukleotide bzw.

Oligonukleotid-Konstrukte Es wurden verschiedene erfindungsgemäße Oligonukleotide insbesondere gemäß Untergruppe (k) der Abbildungen 1 und z. T. auch Abbildung 3 hergestellt. Die meisten von diesen waren LNA-Konstrukte, die bei PROLIGO in Boulder, Co, USA bestellt wurden und bei denen LNA's an verschiedenen Stellen saßen (s. Tabelle 3). Weiter wurde ein unverändertes Oligonukleotid gemäß Untergruppe (k) der Abbildungen 1 synthetisiert und ein von der Basensequenz entsprechendes Phosphorothioat bei MWG Biotech AG in Ebersberg Deutschland bestellt.

Tabelle 3. Liste der verwendeten Oligonukleotide.

Kleinbuchstaben= DNA-Monomere, kursiv und unterstrichen = Phosphorothioate, fette Großbuchstaben= LNA monomere.

Mit diesen Oligonukleotiden wurden verschiedene Versuche unternommen : a) Zunächst wurde der prozentuale Umfang der durch das Oligonukleotid ausgelösten RNA-Spaltung von VR1 durch RNAse H untersucht, wobei die Versuchsbedingungen im wesentlichen mit den in Beispiel 2 genannten Bedingungen übereinstimmten.

Die Ergebnisse sind Tabelle 3 zu entnehmen. Es stellte sich heraus, daß Oligonukleotide mit LNA erst mit dem nativen Oligonukleotid vergleichbare Spaltung zeigten, wenn mindestens 6 oder besser 8 zusammenhängende Nukleotide keine LNA's sind. b) Dann wurde die Schmelztemperatur der LNA/RNA : DNA Hybride nach Standardmethoden gemessen (Tabelle 4). Überraschenderweise zeigten die LNA's eine erhöhte Schmelztemperatur im Vergleich zu den nativen Oligonukleotiden und den Phosphorothioaten. Das ist sehr günstig für die Stabilität. Oligonukleot Anzahl der Tm ide LNA's ° c DNA 1 0 58 PS 0 49 LNA 20 2 61 LNA 19 4 66 LNA 18 6 73 LNA 17 8 79 LNA 16 10 ~85 Tabelle 4. Schmelztemperatur Tm von LNA/DNA : RNA Hybriden c) Dann wurde die Kinetik der RNASe H-Spaltung unter gleichen Bedingungen wie oben untersucht, nur daß äquimolare Mengen RNA und

Antisense Oligonukleotid (Je 100 nM) verwendet wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 gezeigt. Überraschenderweise zeigte das Oligonukleotid mit LNA eine deutliche Steigerung der Aktivität im Vergleich zu den nativen Oligonukleotiden und den Phosphorothioaten. Oligonukleotide k [min-'] DNA 1 0.17 ~ 0. 01 LNA 17 1. 1 0. 6 PS 0. 07 0. 01 Tabelle 5. Spaltungsraten-Konstanten für die RNase H-Spaltung von"full- length"VR1 mRNA induziert durch verschiedene Antisense Oligonukleotide. d) Abschließend wurde die Halbwertszeit der Oligonukleotide mit LNA sowie des nativen Oligonukleotids und des Phosphorothioats radioaktiv markiert bei 37°C in humanem Serum über bis zu 2 Tage bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 gezeigt. Während die native DNA eine Halbwertszeit von 1,5 h und das Phosphorothioat eine von 10h zeigt, sind die Nukleotide mit LNA, die an den Enden 3 oder 4 LNA's hatten, mit tri/2 von ca. 17h deutlich besser. Oligonukle nt t1/2 otide end [h] block DNA 1 1 5 + 0.3 PS 0 LNA 20 4 _ 2 LNA 19 2 6 ~ # ? # LNA 18 3 17 2 LNA 17 4 15 1 LNA 16 5 15 ~ 2 Tabelle 6. Halbwertszeit von nativem, Phosphorothioat-und End-block LNA/DNA-Oligonukleotiden in humanem Serum.

An besten schnitten daher die Nukleotide mit LNA's ab, die ca. 8 zusammenhängende Nukleotide ohne LNA's hatten und am 3'-und 5'- Ende 3 oder 4 LNA's hatten.

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