ALPHAHERPESVIRINAE

MEMORIA DESCRIPTIVA

Campo de la Invención

La presente invención se refiere a una composición con propiedades antivirales, útil para el tratamiento de lesiones producidas por virus herpes de la subfamilia Alphaherpesvirinae, que se obtiene de extractos de alga Macrocystis pyrifera.

De manera preferida, la composición de la invención es útil para la producción de composiciones farmacéuticas o medicamentos de aplicación tópica destinadas al tratamiento o prevención de las infecciones causadas por virus Alphaherpesvirinae.

Antecedentes de la Invención

Los herpesvirus o virus de la familia Herpesviridae son prevalentes en la población humana, infectan al hospedero de por vida y pueden recurrir en el tiempo. Esta familia de virus se divide en tres subfamilias. La subfamilia Alfaherpesvirinae contiene los virus herpes humanos 1 , 2 y 3, los cuales corresponden al virus del herpes simple 1 (VHS-1 o HHV-1 ), virus herpes simple 2 (VHS-2 o HHV-2) y virus varicela zóster (VVZ o HHV-3). La subfamilia Betaherpesvirinae contiene a los virus herpes humanos 5, 6 y 7, que corresponden a citomegalovirus (CMV,VHH-5), virus del exantema súbito (VHH-6) y VHH-7. La subfamilia Gammaherpesvirinae contiene los virus herpes humanos 4 y 8, que corresponden a virus Epstein-Barr (EBVVHH-4) y virus del sarcoma de Kaposi (KSVVHH-8), respectivamente.

Los virus de la subfamilia Alphahe rpesvirinae comparten importantes similitudes, tales como genomas de ADN doble hebra de gran tamaño, genes homólogos, la presencia de un tegumento en el virion, procesos de replicación, la capacidad de producir infección persistente y establecer latencia en el hospedero. Algunos de esos virus son el virus herpes simple de tipo 1 (VHS-1 ), virus herpes simple de tipo 2 (VHS-2) y virus varicela zóster (VVZ) los cuales afectan a la población general con alta prevalencia.

Virus herpes simple de tipo 1 y 2 producen un amplio espectro de enfermedades que pueden ser de carácter grave, como encefalitis, comprometiendo la vida del individuo, o bien de carácter no-peligroso, pero de alta morbilidad. Manifestaciones frecuentes de las infecciones por virus VHS-1 , VHS-2 son el desarrollo de lesiones cutáneas evidentes en la piel y a veces dolorosas, tanto en la zona oro-facial ( herpes labialis, habitualmente VHS- 1 ), la zona genital ( herpes genitalis, habitualmente VHS-2), torso ( eczema herpeticum, herpes gladiatorium por VHS-1 , VHS-2 o VVZ) o dedos (panadizo herpético, habitualmente VHS-1) que, si bien no ponen en peligro la vida del individuo, sí generan síntomas que son molestos (poco estéticos y a veces dolorosos) y que pueden afectar la calidad de vida de las personas y el desempeño laboral de los individuos. Estas lesiones pueden durar hasta 3 y 6 semanas en el contexto de infecciones primarias para VHS-1 y VHS-2, respectivamente y hasta 7-10 días en el caso de recurrencias subsiguientes, las cuales se dan a lo largo de la vida del individuo por tratarse de virus persistentes que establecen infección latente de por vida en las personas. Los virus herpes simple pueden producir también gingivoestomatitis herpética, la cual consiste en la infección e inflamación de las encías, y es generalmente producido por la infección por VHS-1 en niños pequeños. Dado que esta manifestación herpética se da frecuentemente en niños menores de 12 años, esta no puede ser tratada con los antivirales más comunes comercialmente disponibles en la actualidad para estos virus, pues estos están indicados para individuos mayores de 12 años. Además, los virus herpes simple pueden producir complicaciones oculares, principalmente VHS-1 , tales como conjuntivitis y queratitis herpética epitelial o estromal, la cual puede conducir a ceguera permanente. Por otro lado, VVZ también produce de manera frecuente manifestaciones cutáneas produciendo durante la infección primaria un sarpullido similar a ampollas en la piel en todo el cuerpo que da comezón y luego en infecciones recurrentes herpes zóster que afecta principalmente el torso y cara produciendo lesiones extensas y dolorosas en la piel.

Un aspecto importante de los virus herpes simple y varicela zóster, al igual que otros virus herpes, es su capacidad de infectar de por vida a las personas, pudiendo establecer infección persistente en tejidos nerviosos del individuo. Desde estos sitios, estos virus pueden reactivarse producto de diversos estímulos, tales como radiación UV, hipertermia e hipotermia, entre otros, además de causas desconocidas para producir patología recurrente a lo largo de la vida del individuo. Actualmente, se estima que entre 10-25% y 0,4% de los individuos infectados con virus herpes simple y virus varicella zóster, respectivamente manifiestan síntomas de la enfermedad, particularmente lesiones cutáneas o bien en las mucosas en diversas formas ( herpes labialis, herpes genitalis, eczema herpeticum, herpes gladiatorium, herpes zóster, panadizo herpético, queratitis herpética y gingivoestomatitis herpética). Con ello, hasta un 16% de la población humana mundial manifestará lesiones herpéticas producto de estos virus de la subfamilia Aiphaherpesvirinae. Este alto porcentaje de la población afectada por los síntomas de estos virus plantea un número significativo de individuos que potencialmente puede hacer uso de nuevas soluciones efectivas para enfrentar los problemas de salud producidos por estos patógenos. Si bien existen antivirales comercialmente disponibles para tratar lesiones cutáneas por virus de la subfamilia Alphahehrpesvirinae, siendo los más comúnmente utilizados los nucleosidos Aciclovir y Valaciclovir, estos son en general poco efectivos. En el caso de virus herpes simple estos antivirales habitualmente sólo reducen en aproximadamente 1 -2 día, de un total de 7-10 días, el tiempo de recuperación de las lesiones y en algunos casos sus efectos son imperceptibles para algunos individuos. En el caso de herpes zóster producido por VVZ, este mismo tipo de drogas reducen en menos de 50% el dolor residual luego de 6 meses de la manifestación clínica viral.

Por otro lado, aproximadamente un 3,5-10% de individuos inmunosuprimidos (trasplantados, con tratamiento para enfermedades autoinmunes o VIH+) desarrollan infecciones con variantes de VHS que son resistentes a los antivirales “de primera línea” más comúnmente utilizados (por ejemplo, Aciclovir y moléculas derivadas). Lamentablemente, las alternativas farmacéuticas más comúnmente disponibles en la actualidad para estos casos producen de forma frecuente numerosos efectos adversos en el paciente que pueden requerir de supervisión y atención médica. Si bien, en el caso de los individuos inmunocompetentes estas variantes de VHS resistentes se dan sólo en aproximadamente el 1% de los casos, dada la alta prevalencia de estos virus en la población, el número de individuos afectados con este tipo de virus resistente a drogas es significativo.

Por otro lado, existen drogas de segunda generación utilizadas para tratar infecciones por virus herpes simple que son resistentes a Aciclovir. Estas drogas son principalmente: Cidofovir y Foscarnet, drogas que inhiben la ADN polimerasa dependiente de ADN viral y que no requieren de proteínas virales (i.e. TK viral) para su activación en la célula. Si bien estas drogas presentan efectividad contra variantes de VHS resistentes a Aciclovir, los efectos adversos secundarios que producen son numerosos y en un gran porcentaje de los individuos. Algunos de estos efectos secundarios pueden ser nefrotoxicidad, neutropenia, mielosupresión, confusión, estado mental alterado, alucinaciones, pesadillas, ansiedad, ataxia, temblores, convulsiones, fiebre, niveles anormales de enzimas hepáticas en el suero, diarrea y nauseas, entre otros.

Otra alternativa disponible para tratar virus herpes simple es una combinación de Aciclovir e hidrocortisona de uso tópico. Esta combinación, reduce en 1 ,6 días la duración de las lesiones herpéticas (comparado a 1 ,0 días por Aciclovir aplicado de manera tópica de manera sola) y reduce en 50% el tamaño del área de las lesiones. Si bien esta estrategia constituye una mejora estadísticamente significativa para el tratamiento de lesiones herpéticas, aun evidencia la necesidad de identificar drogas o combinaciones de drogas que posean mejor efectividad.

En el estado del arte previo a esta invención existen algunas publicaciones que son cercanas a la invención, las que se resumen brevemente a continuación.

En la publicación de Souza Barros, Caroline, et al. "Therapeutic efficacy in BALB/C mice of extract from marine alga Canistrocarpus cervicornis (Phaeophyceae) against herpes simplex virus type 1" Journal of Applied Phycology 29.2 (2017): 769-773, se obtiene un extracto con propiedades antivirales de un alga parda, como Canistrocarpus cervicornis, y el extracto obtenido se emplea para el tratamiento de lesiones cutáneas de VHS-1. La invención se diferencia de este documento, en que el alga es distinta y emplea una fracción proteica, mientras que en la publicación se indica que la acción está dada por diterpenos, los que pueden presentar toxicidad, y el documento sólo sugiere que tiene una baja toxicidad porque no se observan cambios de peso corporal, o en la función hepática o renal en los 16 días del estudio. Se dice además, que se observan resultados al día 10, con 3 aplicaciones diarias del extracto.

Queda así en evidencia, que el estado actual de la técnica para el tratamiento o prevención de las infecciones cutáneas causadas por virus de la subfamilia Alphahehrpesvirinae (por ejemplo, VHS-1 , VHS-2 y VVZ) requiere el desarrollo de nuevas formulaciones antivirales que den mejores resultados de tiempo de resolución y reducción del dolor que las alternativas actuales y que a la vez tengan bajos efectos secundarios.

La invención resuelve esta necesidad aportando al estado de la técnica, una nueva composición obtenida desde extractos hidrosolubles de alga Macrocystis pyrifera con propiedades antivirales en su fracción proteica, especialmente útil para el tratamiento y prevención de lesiones causadas por virus de la subfamilia Alphahehrpesvirinae.

Donde Macrocystis pyrifera es un alga comestible, por lo que su uso es seguro, y por tanto los extractos de la invención presentan la ventaja adicional de ser de origen natural, de una fuente renovable como son las algas, donde su producción no requiere procesos de síntesis química, por lo que no tienen el peligro de arrastrar subproductos de reacción potencialmente tóxicos para el cuerpo humano o animal. Descripción de las Figuras

Figura 1 : Ensayo de viabilidad celular. Células HeLa se trataron de forma continua con con extracto hidrosoluble de Macrocystis pyrifera libre de alginatos a las concentraciones 0,49- 125 mg/mL por 24 horas y luego incubadas por una hora a 37°C con AlamarBIue® (resazurin) y cuantificadas por colorimetría en placas de pared negra y fondo transparente. La figura muestra el porcentaje de células viables para cada concentración de extracto. Como controles, se incorporan células tratadas con vehículo (solución salina fosfato, PBS) y células tratadas con etanol 75% (letal). Se obtuvieron valores significativos de muerte celular para toda concentración superior a 31 ,2 mg/ml mediante ANOVA de una vía ( ^*** p <0,001). La CC50 calculada por regresión lineal es de 19 mg/ml.

Figura 2: Expresión del gen de la proteína fluorescente verde (reportero GFP) en células HeLa infectadas con A. y B. VHS-1 en presencia 1 mg/ml de extracto hidrosoluble de Macrocystis pyrifera libre de alginatos, o C. VHS-2 en presencia de distintas concentraciones (0,01 ; 0,05; 0,1 ; 0,25 y 5 mg/mL) de extracto hidrosoluble de Macrocystis pyrifera libre de alginatos. En A. se muestra el porcentaje de células GFP positivas (VHS- 1 positivas) y en B. la intensidad de fluorescencia asociada a GFP (VHS-1) 24 horas post infección determinado por citometría de flujo. En C. se muestra la intensidad de fluorescencia de GFP (VHS-2) por pocilio determinado con un lector multi-modo. Controles: células con infección, pero sin tratamiento (ST), células sin infección y sin tratamiento (SI), células tratadas con 50 ug/ml de Aciclovir). Análisis estadístico realizado mediante ANOVA de una vía ( ^*** p <0,001).

Figura 3: Producción de unidades formadoras de placas ( plaque forming units, PFU) en células HeLa incubadas con distintas concentraciones de extracto hidrosoluble de Macrocystis pyrifera libre de alginatos de la invención tratadas de manera continua a la inoculación viral con una cantidad conocida de PFU de A. VHS-1 o B. VHS-2. Se cuantificó el número de PFUs 24 horas después de la infección Se incluyen como controles grupo sin tratamiento pero con infección (ST), grupo sin tratamiento sin infección (SI) y tratamiento con Aciclovir (50 ug/ml). Se obtuvieron valores significativos de efectividad antiviral para toda concentración superior a 0,05 mg/ml para VHS-1 y VHS-2 mediante ANOVA de una vía ( ^* p <0,05; ^*** p<0,001 ). La EC50 calculada por regresión lineal es de 0,05 mg/ml para VHS-1 y 0,08 mg/ml para VHS-2.

Figura 4: Producción de unidades formadoras de placas ( plaque forming units, PFU) en fibroblastos gingivales bucales incubados con distintas concentraciones (mg/ml) de extracto hidrosoluble de Macrocystis pyrifera libre de alginatos de la invención tratados de manera continua a la inoculación viral con una cantidad conocida de PFU de A. VHS-1 o B. VHS-2. Se cuantificó el número de PFUs 24 horas después de la infección. Se incluyen como controles grupo sin tratamiento pero con infección (ST), grupo sin tratamiento sin infección (SI) y tratamiento con Aciclovir (50 ug/ml). Se obtuvieron valores significativos de efectividad antiviral para toda concentración superior a 0,025 mg/ml para VHS-1 y 0,05 mg/ml para VHS-2 mediante ANOVA de una vía ( ^* p <0,05; ^** p <0,01 ; ^*** p <0,001).

Figura 5: Producción de unidades formadoras de placas ( plaque forming units, PFU) en células HeLa incubadas con distintas concentraciones (mg/ml) de extracto hidrosoluble de Macrocystis pyrifera libre de alginatos de la invención tratadas de manera continua a la inoculación viral con una cantidad conocida de PFU de VHS-1 o VHS-2 resistentes a Aciclovir (ACV ^R ). Se cuantificó el número de PFUs 24 horas después de la infección. Se incluyen como controles grupo sin tratamiento pero con infección (ST), grupo sin tratamiento sin infección (SI) y tratamiento con Aciclovir (50 ug/ml). Se obtuvieron valores significativos de efectividad antiviral para toda concentración superior a 0,05 mg/ml para VHS-1 y 0,025 mg/ml para VHS-2 mediante ANOVA de una vía ( ^** p <0,01 ; ^*** p <0,001).

Figura 6: Producción de unidades formadoras de placas ( plaque forming units, PFU) en células HeLa incubadas con distintas concentraciones (mg/ml) de proteínas precipitadas desde extracto hidrosoluble de Macrocystis pyrifera libre de alginatos las cuales fueron tratadas de manera continua con la fracción proteica relativo a la inoculación viral, la cual fue realizada con una cantidad conocida de PFU de A. VHS-1 o B. VHS-2. Se cuantificó el número de PFUs 24 horas después de la infección. Se incluyen como controles grupo sin tratamiento pero con infección (ST), grupo sin tratamiento sin infección (SI) y tratamiento con Aciclovir (50 ug/ml). Se obtuvieron valores significativos de efectividad antiviral para toda concentración superior a 0,1 mg/ml para VHS-1 y para VHS-2 mediante ANOVA de una vía ( ^*** p <0,001).

Figura 7: A. Evaluación de progresión patológica asociada a la infección cutánea por VHS- 1 por 11 días. Se evaluó las manifestaciones clínicas producidas en la piel de animales (ratones, mus musculus ) infectados con VHS-1 y tratatados 2 veces al día con extracto de Macrocystis pyrifera libre de alginatos de la invención formulado farmacéuticamente con hidroximetilcelulosa en una concentración 5 mg/ml o vehículo solo de forma tópica. Se incluye como control un grupo tratado con Aciclovir (ACV) en formato crema 5% (comercial, bioequivalente) luego de la infección con VHS-1 y un grupo de animales que fue preparado para infección (depilación y erosión cutánea), pero sin infección (Mock). B. Cuantificación del área bajo la curva (AUC) de los datos mostratos en A. (salvo Mock que presenta valores despreciables), la cual integra la severidad y duración de la infección (puntaje y tiempo). Figura 8: A. Evaluación de progresión patológica de infección cutánea por HSV-1 durante 11 días. Se evaluó las manifestaciones clínicas producidas en la piel de animales (ratones, mus musculus) infectados con VHS-1 y tratatados 2 veces al día con extracto de Macrocystis pyrifera libre de alginatos de la invención formulado farmacéuticamente con novobase I en una concentración 5 mg/ml o vehículo solo de forma tópica. Se incluye como control un grupo tratado con Aciclovir (ACV) en formato crema 5% (comercial) luego de la infección con VHS-1 y un grupo de animales que fue preparado para infección (depilación y erosión cutánea), pero sin infección (Mock). B. Cuantificación del área bajo la curva (AUC) de los datos mostratos en A. (salvo Mock que presenta valores despreciables), la cual integra la severidad y duración de la infección (puntaje y tiempo).

Descripción Detallada de la invención

La presente invención provee una composición que comprende un extracto preparado a partir de Macrocystis pyrifera, donde el extracto corresponde a la fracción hidrosoluble y se encuentra sustancialmente libre del agente gelificante alginatos. Esta composición tiene propiedades antivirales, y es especialmente útil para el tratamiento y prevención de lesiones causadas por virus de la subfamilia Alphahehrpesvirinae (por ejemplo, VHS-1 , VHS-2 y VVZ), tanto sensibles como resistentes a Aciclovir.

Los inventores han desarrollado una composición en base a extractos hidrosolubles de Macrocystis pyrifera, donde el extracto obtenido está sustancialmente libre de alginatos, compuestos con propiedades gelificantes. Este extracto puede emplearse completo, o sólo su fracción proteica, ya que esta fracción mantiene la mayor actividad. Las proteínas con actividad antiviral aún no han sido completamente identificadas por los inventores.

Es importante resaltar que la invención apunta principalmente a la fracción hidrosoluble o proteica, la que difiere de las fracciones orgánicas, donde se obtienen altas concentraciones de polímeros orgánicos tales como alginatos, fucoidanos y compuestos fenólicos, entre otros.

De este modo la invención apunta a una composición con actividad antiviral que comprende extractos hidrosolubles de Macrocystis pyrifera sustancialmente libres de alginatos y opcionalmente un portador o vehículo. Donde el portador o vehículo puede ser simplemente agua, tampón, suero fisiológico, solución etanólica, o excipientes para formulación de hidrogeles, cremas o ungüentos farmacéuticamente aceptables, tales como carboximetilcelulosa, hidroximetilcelulosa, glicerol, propilenglicol u otros disponibles en la técnica, opcionalmente junto con preservantes o estabilizantes.

Donde el extracto hidrosoluble de Macrocystis pyrifera sustancialmente libre de alginatos o su fracción proteica está presente en una concentración entre 0,05 a 50 mg/mL. Especialmente entre 0,1 a 25 mg/mL, y más especialmente preferida entre 1 y 10 mg/mL.

En un segundo aspecto, la invención se refiere al proceso de preparación de la composición, el que comprende las siguientes etapas: a) mezclar biomasa molida de Macrocystis pyrifera con agua en una proporción de entre 1 a 5 % p/v, a una temperatura entre 15 y 45°C y mantener con agitación durante 2 a 24 horas; b) separar la biomasa residual del sobrenadante hidrosoluble; c) remover los alginatos presentes en solución, obteniendo la fase hidrosoluble, que constituye el extracto el que opcionalmente se mezcla con un portador o vehículo.

Donde en la etapa (b) la biomasa se separa por centrifugación o filtración, o cualquier otra técnica disponible. Y en la etapa (c) los alginatos se eliminan por ejemplo por precipitación con etanol absoluto en una proporción 1 :1 etanol a extracto, y luego se centrifuga o filtra para separar los alginatos precipitados, o por cualquier otra técnica disponible para este fin.

En una realización el etanol agregado puede eliminarse por evaporación, especialmente por evaporación a presión reducida, por ejemplo, a 175 mBar. Una vez eliminado el etanol, se tiene el extracto de la invención el que puede emplearse directamente u opcionalmente puede ser congelado y liofilizado, para luego ser resuspendido en agua o tampón pH 7.

Opcionalmente, se realiza una precipitación de las proteínas en el extracto, para obtener la fracción proteica, por ejemplo, por precipitación con sulfato de amonio en una proporción 1 :1 sulfato de amonio a extracto. Donde esta fracción proteica mantiene la mayor efectividad del extracto de la invención. De este modo el extracto de la invención puede emplearse en diferentes grados de purificación o fraccionamiento, manteniendo su actividad, donde todas estas variantes forman parte de la presente invención.

Finalmente, la invención apunta al uso de la composición que contiene extractos hidrosolubles de Macrocystis pyrifera sustancialmente libres de alginatos o su fracción proteica, para preparar un medicamento antiviral. Donde en una realización preferida el medicamento es para aplicación tópica para piel y mucosas. Este medicamento permite prevenir o tratar lesiones cutáneas causadas por virus de la subfamilia Alphaherpesvirinae (por ejemplo, VHS-1 , VHS-2 y VVZ), sensibles o resistentes a Aciclovir.

La composición de la invención también puede emplearse como aditivo con propiedades antivirales para prevenir la transmisión de los virus de la subfamilia Alphahehrpesvirinae en composiciones que están en contacto con la piel o mucosas, como por ejemplo en labiales, cosméticos en general, dentífricos, enjuagues bucales, chicles o caramelos de sanidad bucal (como los caramelos de propóleo). Así como también en otros productos de higiene y cuidado corporal tal como jabón, talcos, cremas antiarrugas, cremas humectantes, bronceadores, champú, acondicionador, tanto para el cuidado humano o animal. O en cualquier otro artículo o composición que puede entrar en contacto con una región corporal infectada con virus de la subfamilia Alphahehrpesvirinae. La composición antiviral de la invención puede emplearse para aliviar los síntomas de infección por virus herpes y/o para mejorar la estética de las lesiones cutáneas o bucales producidas por virus herpes simple o virus varicela zóster.

Sorprendentemente, los inventores han encontrado que los extractos de Macrocystis pyrifera, como se han descrito en esta invención, disminuyen en experimentos in vitro aproximadamente en más de 99% y más de 98% la infección de virus VHS-1 y VHS-2, respectivamente sobre células humanas (células HeLa a 2,5 mg/ml).

Los inventores han realizado ensayos para determinar el índice de selectividad IS (selectivity índex, SI) de la composición de la invención in vitro, en base a ensayos de reducción en el número de unidades formadoras de placas (PFU) luego de la infección viral y tratamiento. Este índice corresponde al valor obtenido a partir de la razón CC50/EC50. A mayor valor de la razón CC50/EC50 (>1 ), mayor potencial terapéutico presentan los compuestos antivirales, pues significa que presentan elevada actividad antiviral, por sobre efectos adversos en la viabilidad de las células del hospedero (células sustrato).

Por un lado, se calcula el valor CC50 (concentración citotóxica 50%) en cultivo, la cual corresponde a la concentración de extracto de alga que causa la muerte del 50% de células del hospedero en el cultivo. Por otro lado, se calcula el valor EC50 (concentración efectiva 50%) para determinar la concentración de extracto que inhibe el 50% de la actividad viral. Estos ensayos se muestran en el ejemplo 6, incluido más adelante, y dio para el extracto de Macrocystis pyrifera libre de alginatos de la invención un resultado aproximado de 380 para VHS-1 y 237,5 para VHS-2 (basado en resultados de viabilidad y efectividad en células HeLa). Como referencia, el índice de selectividad de Aciclovir, la droga más utilizada para tratar lesiones cutáneas por virus herpes, es de 300-340.

Los inventores también desarrollaron pruebas in vivo, donde la composición de la invención disminuyó significativamente la severidad de la lesión causada por VHS-1 , y disminuyó el tiempo y severidad de la infección respecto al control sin tratar, lo cual se expone como la integración de estos dos parámetros (área bajo la curva, AUC). Es significativo indicar que Aciclovir, si bien redujo el tiempo de lesión fue menos efectivo en disminuir su severidad comparado con el extracto de Macrocystis pyrifera libre de alginatos de la invención. El AUC de Aciclovir es mayor al AUC del extracto de Macrocystis pyrifera libre de alginatos de la invención

Para el experto en la técnica será evidente que las propiedades antivirales de la composición de la invención, si bien han sido demostradas en los ejemplos para los virus VHS-1 y VHS-2, son extrapolares a otros virus de la subfamilia Alphahehrpesvirinae, por ejemplo VVZ y virus herpes que afecten la piel o mucosas del cuerpo humano o animal. Como se demuestra en los ejemplos incluidos a continuación, la invención muestra una efectividad equivalente in vitro para inhibir la producción de placas infecciosas de virus herpes simple sensibles o resistentes a Aciclovir, por lo que es especialmente útil para el control de estos últimos virus.

A continuación, se describen ejemplos que permiten entender de mejor forma el alcance de la invención protegida.

Ejemplos.

Ejemplo 1 : Obtención del extracto de Macrocystis pyrifera.

Ejemplares de las macroalgas Macrocystis pyrifera recolectados en Caleta Chome (Región del Biobío, Chile) fueron lavadas con agua potable para la eliminación de sales minerales, arena y organismos epífitos. Posteriormente las macroalgas fueron liofilizadas durante 5 días a una temperatura de -70°C±1°C, molidas y tamizadas en un tamiz de 0,5 mm. El polvo tamizado de biomasa seca se almacenó en bolsas plásticas selladas al vacío.

Posteriormente Se masaron 3,00 g de biomasa liofilizada y se llevó a un matraz Erlenmeyer. Se añadió 120 ml_ de agua desionizada y se mantuvo en agitación, en un agitador orbital, a 200 RPM a una temperatura de 30°C durante 4 h.

Luego, se centrifugó a 4.000 RPM durante 10 min y se eliminó la biomasa residual decantada. Obteniéndose el extracto hidrosoluble del alga, el que debe se somete a purificaciones adicionales para eliminar los alginatos y polisacáridos de pared de las algas, que pudieran estar presentes.

La precipitación de alginatos se realizó mediante la adición de etanol absoluto al extracto hidrosoluble crudo de Macrocystis pyrifera en proporción 1 :1. Debido al cambio de polaridad de la disolución de extractos, los alginatos precipitaron.

Posteriormente, para lograr una buena separación de los alginatos, la disolución de extractos algales con etanol fue centrifugada a 4.000 RPM por 10 min obteniendo el extracto hidrosoluble sustancialmente libre de alginatos.

Finalmente se procedió a la remoción de etanol desde la fase hidrosoluble del extracto por evaporación del etanol a presión reducida (175 mBar). Ejemplo 2: Ensayo de citotoxicidad.

Para evaluar si el extracto de Macrocystis pyrifera tiene efectos tóxicos sobre las células humanas se realizó una evaluación de viabilidad celular después de ser incubadas en presencia de distintas concentraciones del extracto libre de alginatos de Macrocystis pyrifera obtenido en el ejemplo 1 .

Se realizaron tratamientos continuos en células HeLa con extracto libre de alginatos de Macrocystis pyrifera a concentraciones de 0,1 -125 mg/mL por 24 horas. Posteriormente, las células fueron incubadas por una hora a 37°C con AlamarBIue® (reactivo basado en resazurin), para luego evaluar mediante un ensayo de cuantificación colorimétrica el porcentaje de células viables para cada condición comparado con el control sin tratar con el extracto. Los resultados se ven en la Figura 1 , y muestran que hubo toxicidad incremental del extracto libre de alginatos de la invención sobre las células humanas a concentraciones mayores a 7,81 mg/mL.

Ejemplo 3: Evaluación de actividad antiviral de extractos hidrosolubles in vitro evaluando la expresión de un gen reportero codificado en genomas de VHS.

Para evaluar la actividad antiviral de los extractos hidrosolubles libres de alginatos de la invención, obtenidos en el ejemplo 1 , se utilizaron células HeLa (ATCC® CCL-2™, células epiteliales humanas de cervix) como células blanco para analizar la infección por VHS-1 y VHS-2. Estas células presentan la ventaja de ser humanas y por tanto es esperable que los resultados obtenidos en este modelo se asemejen a lo que sucedería en un contexto fisiológico de infección natural.

Células HeLa fueron tratadas con extracto hidrosoluble de Macrocystis pyrifera libre de alginatos obtenido en el ejemplo 1 , previo a la infección con concentraciones variables de extracto (mg/ml) e inoculadas con cantidades conocidas de unidades formadoras de placas (PFU) de VHS-1 K26GFP o VHS-2 ZAG(333), cepas virales que contienen en su genoma el gen que codifica para la proteína verde fluorescente (GFP).

Después de 24 horas post-infección, el número de células positivas para fluorescencia verde derivada de la expresión de GFP (VHS-1) o la intensidad de fluorescencia verde derivada de la expresión de GFP (VHS-2) fue cuantificada por citometría de flujo o en un lector de placa multimodo, respectivamente. En la Figura 2 se muestran los resultados, donde los datos se muestran expresados como el número de células positivas para fluorescencia verde derivada de la expresión de GFP (VHS-1) o la intensidad de fluorescencia verde derivada de la expresión de GFP (VHS-2) fue cuantificada por citometría de flujo o en un lector de placa multimodo, respectivamente. El extracto de la invención resultó en una disminución de más de 95% de la fluorescencia de GFP de VHS- 1 y más de 91 % de la fluorescencia de GFP de VHS-2 para la condición de tratamiento con 1 mg/ml de extracto hidrosoluble de Macrocystis pyrifera libre de alginatos.

Ejemplo 4: Inhibición de producción de placas infecciosas.

Células HeLa fueron tratadas con distintas concentraciones (mg/mL) de extracto hidrosoluble de Macrocystis pyrifera libre de alginatos, obtenido en el ejemplo 1 ,de manera continua respecto al desafío con VHS con una cantidad conocida de VHS-1 K26GFP o VHS-2 ZAG(333). A las 24 horas posterior a la infección se determinó el número de unidades formadoras de placas (plaque forming units, PFU) presentes en cada pocilio. Los resultados se muestran en la Figura 3, donde se aprecia que el tratamiento con extracto hidrosoluble de Macrocystis pyrifera libre de alginatos de la invención disminuye la producción de PFUs en el cultivo.

Se realizó un ensayo similar al anterior, pero sobre otro tipo celular, fibroblastos gingivales bucales humanos sanos, para evaluar la respuesta en la cavidad bucal, donde frecuentemente hay infecciones de virus herpes. Los resultados se muestran en la Figura 4, donde se observa un resultado similar del extracto hidrosoluble de Macrocystis pyrifera libre de alginatos obtenido en el ejemplo 1 sobre estas células primarias humanas infectadas con VHS-1 o VHS-2.

Por otro lado, se realizó un ensayo de manera similar a lo ya descrito, sobre células HeLa, las que fueron incubadas con distintas concentraciones (mg/ml) de extracto hidrosoluble de Macrocystis pyrifera libre de alginatos obtenido en el ejemplo 1 , de manera continua respecto a la inoculación viral, con una cantidad conocida de PFU de VHS-1 o VHS-2 resistentes a Aciclovir (ACV ^R ).

Los resultados muestran que el extracto de la invención es capaz de disminuir la producción de PFUs en el cultivo, ver Figura 5, y por tanto, el extracto hidrosoluble de Macrocystis pyrifera libre de alginatos de la invención sí es efectivo contra VHS-1 o VHS-2 (ACV ^R ). Al igual que en los ensayos anteriores (Figuras 3 y 4), se cuantificó el número de PFUs 24 horas después de la infección.

Se incluyeron como controles en todos estos experimentos tratamientos con Aciclovir (50 ug/ml), grupo sin tratamiento pero con infección (ST) y grupo sin tratamiento sin infección (SI). Ejemplo 5: índice de selectividad (IS).

5.1 Concentración citotóxica 50% (CC50)

Para determinar la viabilidad celular luego de la adición de concentraciones crecientes de extractos de algas libre de alginatos se determinó la concentración citotóxica 50% (CC50) del extracto hidrosoluble de Macrocystis pyrifera libre de alginatos, obtenido de acuerdo al ejemplo 1. Se evaluó la viabilidad de células HeLa 24 horas después de ser tratadas con concentraciones crecientes del extracto de la invención entre 3,9 a 31 ,2 mg/ml, como se describió en el ejemplo 2. Los resultados de la Figura 1 permiten calcular la concentración de extracto que induce viabilidad celular 50%, siendo este aproximadamente 19 mg/mL.

5.2 Concentración efectiva 50% (EC50)

La concentración efectiva 50% (EC50) antiviral del extracto hidrosoluble de Macrocystis pyrifera libre de alginatos de la invención corresponde a la formación de unidades formadoras de placa (PFU) luego de la adición de manera continua del extracto respecto al desafío con VHS y luego una cantidad conocida de VHS-1 K26GFP o VHS-2 ZAG(333) 24 horas posterior a la infección, evaluado en el ejemplo 4. Los resultados mostrados en la Figura 3, permiten calcular que el tratamiento con 0,05 mg/ml y 0,08 mg/ml de extractos hidrosolubles de Macrocystis pyrifera libre de alginatos disminuyen en un 50% la producción de PFUs de VHS-1 y VHS-2 en el cultivo, respectivamente, siendo estos los valores EC50 para el extracto con cada tipo de virus.

5.3 índice de selectividad (IS)

En base a los datos obtenidos de CC50 y EC50 en células HeLa descritos más arriba para VHS-1 y VHS-2, es posible determinar valores de índice de selectividad (CC50/EC50) aproximado de 380 y 237,5 para VHS-1 y VHS-2, respectivamente con el extracto hidrosoluble de Macrocystis pyrifera de la invención.

Ejemplo 6: Actividad antiviral contra virus herpes simple en fracciones del extracto hidrosoluble de Macrocystis pyrifera libre de alginatos.

Para determinar la naturaleza de la actividad antiviral en los extractos hidrosolubles de Macrocystis pyrifera libre de alginatos de la invención se realizó una precipitación de proteínas desde el extracto hidrosoluble de Macrocystis pyrifera libre de alginatos obtenido en el ejemplo 1 con sulfato de amonio en una propoción 1 :1 peso/volúmen y luego estas se resuspendieron en solución tampón salina (PBS) y se evaluó su actividad antiviral. Como se observa en la Figura 6, las proteínas precipitadas desde el extracto hidrosoluble de Macrocystis pyrifera libre de alginatos presentan actividad antiviral significativa contra VHS-1 y VHS-2, a menor concentración que el extracto parental libre de alginatos, indicando que la capacidad de inhibir la replicación de virus herpes simple en el extracto se debe principalmente a su componente proteico.

Ejemplo 7: Formulación para la aplicación tópica.

Se incorporó el extracto de la invención obtenido en el ejemplo 1 a una concentración final de 5 mg/ml_, en dos bases farmacéuticas, una de tipo hidrogel compuesta por hidroximetilcelulosa y otra de tipo novobase I. La formulación resultante puede ser usada directamente sobre una lesión en la piel para reducir los efectos adversos producidos por la infección cutánea con VHS-1 .

Ejemplo 8: Actividad antiviral in vivo.

Para la capacidad del extracto hidrosoluble de Macrocystis pyrifera libre de alginatos de la invención de inhibir la progresión de daño patológico luego de la infección de piel por VHS- 1 , animales (ratones) fueron infectados con VHS-1 y seguidos por 11 días, siendo tratados 2 veces al día, 24 h luego de la infección, sea con la composición de la invención (formulación para aplicación tópica obtenida en el ejemplo 7, o Aciclovir crema 5% de uso clínico (comercialmente disponible, bioequivalente). En la Figura 7, se muestra que el tratamiento con la formulación que contiene la invención en base hidrogel reduce la la patología de manera significativa comparado al grupo tratado con vehículo cuando se considera, tanto severidad como duración de la patología (integrado con el valor del área bajo la curva de los gráficos, AUC) (Figuras 7A y 7B). El tratamiento con el extracto hidrosoluble de Macrocystis pyrifera libre de alginatos de la invención dio un mejor resultado in vivo que el tratamiento con Aciclovir en crema 5% bioequivalente.

Por otro lado, en la Figura 8, se muestra que el tratamiento con la formulación que contiene la invención en novobase I reduce la patología de manera comparado al grupo tratado con vehículo cuando se considera, tanto severidad como duración de la patología (integrado con el valor del área bajo la curva de los gráficos, AUC) (Figuras 8A y 8B). El tratamiento con el extracto hidrosoluble de Macrocystis pyrifera libre de alginatos de la invención dio un mejor resultado in vivo que el tratamiento con Aciclovir en crema 5% bioequivalente.