Filtre antiviral et son utilisation dans un purificateur d'air, climatiseur ou humidificateur

La présente invention concerne le domaine du risque sanitaire et de la santé publique, notamment lie a la présence de virus aériens. L'invention concerne plus particulièrement un filtre antiviral et optionnellement antibacterien qui est capable de séquestrer les virus et optionnellement les bactéries présents dans l'air ambiant. L'invention concerne aussi tous les produits comprenant ledit filtre tels que des climatiseurs, purificateurs d'air, humidificateurs, ou dispositifs médicaux comme les masques chirurgicaux.

L' élimination des virus aériens est aujourd'hui un important sujet de santé publique. Par exemple, les récentes épidémies virales en Asie (grippes aviaires, SRAS) ont montre qu' il existe un réel besoin de protection face aux attaques virales. La vaccination est pour l'instant une solution peu efficace, du fait des mutations rapides des virus ainsi que de leur multiplication et propagation fulgurantes. Les filtres bactériens existants a l'heure actuelle, tels que les filtres HEPA que l'on peut trouver par exemple dans les masques chirurgicaux traditionnels, ne sont pas efficaces comme barrière αe protection contre les virus. En effet, ces filtres sont constitues de couches de polypropylene non tisse dont les pores présentent une taille de 0,2 μm. Cette taille de pores est peu efficace contre les virus puisque ces derniers sont d'une taille inférieure (de 80 a 110 nm) . La fabrication de filtres antiviraux représente ainsi une solution intéressante face a ce besoin de protection. Plusieurs approches de fabrication de filtres antiviraux ont ete décrites.

Par exemple, la demande de brevet japonais JP2004432430 décrit ainsi un filtre contenant un compose extrait de la

grammée Sasa veitchii, qui aurait des vertus antibactérienne et antivirale.

Le brevet US 5, 888, 527 divulgue un masque antiviral imprégné de polyphénol de thé contenant des catéchmes et des théaflavmes qui permettrait d' inactiver les virus en inhibant la réplication virale et en altérant les propriétés physiques des membranes virales .

La demande de brevet international WO03/051460 concerne un masque comprenant un filtre passif et un filtre actif desinfectant. Le filtre passif permettrait de retenir les particules de poussière, les bactéries et les spores, tandis que le filtre actif tuerait les bactéries, les spores et les virus dont la taille est trop petite pour qu'ils soient bloqués par le filtre passif. Le filtre actif comprend des agents antibactériens, antibiotiques ou antiviraux comme la chlorohexidme ou d' autres composés antiseptiques contenant de la chlorine ou un halogène antiseptique.

Enfin, l'équipe de Kawabata et al. s'est particulièrement intéressée aux polymères de 4-vinylpyridine, et a démontré que ces polymères ont une activité antibactérienne (Kawabata et al., antibacteπal activity of soluble pyndinium-type polymer, Applied and Environmental Microbiology, 1988, pp. 2532-2535), et également une activité antivirale quand ils sont polymérisés sous forme de billes de diamètre 1.7 microns dans un non-tisse (N. Kawabata et al. 1998, Reactive & functional polymers, n°37 p 213-218) . Dans cette publication, le polymère 4-vinylpyndine est polymérise sur une membrane non tissée ayant une taille de pores de 14 μm, en présence de divmylbenzène, de manière à obtenir des billes de diamètre 1,7 microns. Selon les auteurs, la présence de divmylbenzène est essentielle, car en son absence, la polymérisation conduit a l'obtention d'un film d' homopolymères de 4-vinylpyridme qui rend difficile l'obtention d'une

membrane microporeuse. Il est ainsi essentiel que le 4- vinylpyridine soit polymérisé sous forme de billes pour obtenir une membrane microporeuse.

Selon Kawabata et al., l'efficacité de la rétention virale serait due à l'affinité particulière de ce polymère particulier de type pyridine (polychlorure de N-benzyl-4- vinylpyridinium) avec les virus. Sans pouvoir expliquer les causes de cette affinité, Kawabata émet l'hypothèse que (1) les interactions électrostatiques entre les charges positives du polymère et les charges négatives des virus et (2) les interactions hydrophobes entre ce polymère et les virus, pourraient jouer des rôles importants dans cette affinité particulière. Il est à souligner que, en l'absence de test témoin, le test de cette publication ne permet pas d'identifier si la rétention virale observée est réellement due au polymère 4-vinylpyridine ou à la perte virale due aux conditions expérimentales.

Récemment, la demande de brevet WO2006/071191 a décrit un produit antimicrobien et/ou antiviral, recouvert d'un polymère modifié à partir d'un polymère précurseur, ledit polymère précurseur étant sélectionné dans le groupe des polymères ayant la formule générale I, II ou III ou des copolymères de ceux-ci :

Formula II

Ar ⁷

wp _* v

Formula III dans lesquelles

R ¹ et R ² indépendamment sont sélectionnés parmi des chaînes hydrocarbonées (Ci-Ce) linéaire ou branchées, X est dans la gamme de 0 à 1,

R ⁴ est sélectionné parmi une liaison directe et une chaîne hydrocarbonée (Ci-Ce) linéaire ou branchée,

R ⁵ est sélectionné parmi un hydrogène ou des chaînes hydrocarbonées (Ci-C ₆ ) linéaire ou branchées, R ⁶ est sélectionné parmi une liaison directe ou des chaînes hydrocarbonées (Ci-Ce) linéaire ou branchées,

Ar est un groupe hétéro-aromatique contenant un azote, et dans lesquelles ledit polymère précurseur est modifié de telle façon que : - au moins une partie desdits atomes d'azotes sont substitués avec un substituant sélectionné dans le groupe consistant en des groupes alkyls C1-C2 ₀ linéaires ou branchés, et

- au moins une partie des atomes d' azote dans ledit polymère précurseur sont quaternisés.

Au sens de l'invention décrite dans WO2006/071191, l'expression « polymère avec des atomes d'azotes quaternisés » se réfère à des composés de formule générale suivante :

dans laquelle au moins un des résidus « A », « B », « C » et « D » fait partie de l'unité de répétition du polymère, et dans laquelle le ou les résidus « A »-« D » non b compris dans l'unité de répétition du polymère sont n'importe quels résidus formant avec l'azote un composé quaternaire cationique stable formé de façon covalente.

Le terme non-covalent au sens de WO2006/071191 réfère à une liaison non covalente telle qu'une liaison hydrogène.

IC

La Demanderesse a cherché à mettre au point un filtre présentant une activité antivirale, ledit filtre ayant une faible taille de pores, de préférence inférieure à 5 μm, très préférentiellement inférieure à 1 μm et encore plus

15 préférentiellement inférieure ou égale à 0,2 μm. Le filtre selon l'invention peut être préparé selon un procédé simple qui n'exige pas une polymérisation m situ, ledit filtre présentant une surface non occlusive, impliquant que la membrane ou lit de fibres reste microporeux (se) . 0 La Demanderesse établit ainsi que l'affinité entre un polymère et un virus est due à la densité des charges positives reparties dans le réseau polyméπque situé sur l'ensemble de la surface du lit de fibres, lesdites charges étant de préférence portées par des fonctions aminés situées 5 dans la chaîne principale et/ou dans les chaînes latérales du polymère .

Ainsi, la présente invention a pour but de proposer une solution alternative aux filtres antiviraux déjà existants

pour repondre au besoin de protection contre les virus aériens, et concerne l'utilisation d'un polymère cationique ayant de préférence plus d'une fonction aminé par motif, susceptible d'être dépose sur un lit de fibres, de préférence non tissé, en tant que piège a virus.

La présente invention a plus particulièrement pour ob]et un lit de fibres, de préférence charge négativement, recouvert d' au moins un polymère cationique ayant de préférence plus d'une fonction aminé par motif, dont les atomes d'azotes ne sont pas substitués par des groupes alkyls et dont les atomes d'azotes ne sont pas quatermsés, et ayant un taux de protonation d'au moins 20%.

On entend par lit de fibres toute couche tissée ou non tissée composée de fibres en polymères naturels, artificiels ou synthétiques, par exemple des fibres cellulosiques ou non cellulosiques telles que des fibres polyesters, polyéthylène, polypropylène ou polyamides. Suivant un mode de réalisation préféré de l'invention, le lit de fibre est microporeux, c'est-à-dire qu'il a une faible taille de pores, de préférence inférieure à 5 μm, très préférentiellement inférieure à 1 μm et encore plus préférentiellement inférieure ou égale à 0,2 μm.

On entend par polymère cationique, tout polymère protonable, de préférence du type comportant des fonctions aminés sur sa chaîne principale et/ou sur sa ou ses chaîne (s) latérale (s), et ayant un taux de protonation tel qu'il est capable de se fixer sur un lit de fibres d'une part et de fixer des virus d'autre part. De préférence, le taux de protonation d'un polymère cationique est d'au moins 20%.

Le polymère cationique de la présente invention se différencie donc de celui décrit dans WO2006/071191 par le fait qu'il ne comprend pas d'atomes d'azotes substitués par

des groupes alkyls ni d'atomes d'azotes quaternises au sens de WO2006/071191. Le polymère cationique de la présente invention comprend des fonctions aminés sur sa chaîne principale et/ou sur sa ou ses chaîne (s) latérale (s), et a un taux de D protonation d'au moins 20%.

Au sens de la présente invention, le terme « amme protonee » ou « azote protone » se réfère a des composes de formule générale suivante :

0 dans laquelle au moins un des résidus « A », « B », « C » et « D » fait partie de l ^f unité de répétition du polymère, et dans laquelle le ou les résidus « A »-« D » non compris dans l' unité de répétition du polymère sont des atomes d'hydrogènes formant avec l'azote un compose quaternaire 5 cationique stable forme de façon non covalente.

On entend par « taux de protonation » le pourcentage d'atomes d'azotes qui sont protones.

Dans un mode de réalisation de l'invention, ledit lit de fibres ainsi recouvert a une densité de charge de IxICT ⁶ a 0 IxItT ⁸ mole de charge par cm ^z de lit de fibres ou IxIO ^"5 a IxI(T ³ meq par cm ^z de lit de fibres, de préférence ledit lit de fibre a une densité de charge de IxICT ⁷ mol de charge par cm ² de lit eu 1x1 CT ⁴ meq par cm ² de lit de fibres.

Le dosage de la densité de charge par cm ² de lit de z fibres est réalise par les méthodes connues par l'homme du métier comme celles permettant de déterminer la capacité d'échange d'une membrane ou α' une résine echangeuse d'ions

décrites par F. Helffeπch, Ion Exchange. McGraw-Hill Book Company Inc. Ed. (1962), Chapitre 4 ; pages 72-94.

Selon un mode de réalisation, ledit polymère comprend des groupes cationiques sur sa chaîne principale, et/ou sur sa ou ses chaînes latérales.

Dans un premier mode de réalisation, ledit polymère cationique comprend un polymère porteur de groupes aminé (primaires, secondaires, tertiaires) sur sa chaîne principale, une partie au moins des groupes aminés, avantageusement au moins 20%, préférentiellement au moins 30%, très preférentiellement au moins 50%, des groupes aminés étant protonés . De préférence, ces polymères cationiques sont le polydimethylamine-co-épichlorhydπne ou le polydiméthylamine- co-épichlorhydrine-co-éthylenediamine . Le dosage du pourcentage de protonation est réalisé par des techniques bien connues de l'homme du métier telle que celle décrite par Eyler et al. (Eyler RW, Krug TS, Siephius S, Analytical Chemistry 1947 ; 19(1) 24-7). D'autres techniques permettant de doser le pourcentage de protonation sont décrites par Muller et al. (G Muller, C Ripoll et E Selegny, European Polymer Journal, volume 7 (10), 1971, pages 1373-1392).

Dans un second mode de réalisation, ledit polymère cationique comprend un polymère porteur de groupes aminés (primaires, secondaires, tertiaires) sur sa ou ses chaîne (s) latérale (s), une partie au moins des groupes aminés, avantageusement au moins 20%, préférentiellement au moins 30%, très préférentiellement au moins 50%, des groupes aminés étant protonés. De préférence, ces polymères cationiques sont la polyvinylamine, le polyacrylamide modifie, le polyvmylimidazole, les diéthylammoéthyl polysacchaπdes, le chitosan, les polymethacrylate, de préférence le poly 2-

dirtiethylaminoéthyl-méthacrylate, et ne comprennent pas le 4- vinylpyπdine .

Dans un troisième mode de réalisation très préfère, ledit polymère cationique comprend un polymère porteur de groupes amme (primaires, secondaires, tertiaires) sur sa chaîne principale et sur sa ou ses chaîne (s) latérale (s), une partie au moins des groupes aminés, et avantageusement au moins 20%, préferentiellement au moins 30%, très preferentiellement au moins 50%, des groupes aminés étant protonés . De préférence, ces polymères cationiques sont le polyéthylène-imine .

Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, ledit polymère est le polyéthlène-imme .

La présente invention a également pour ob]et un filtre antiviral et optionnellement antibactérien comprenant au moins un lit de fibres recouvert d'au moins un polymère cationique tel que décrit précédemment.

Dans un mode de réalisation préféré, le filtre de l'invention est un filtre antiviral et antibactérien, et comprend au moins un lit de fibres recouvert d'un polymère cationique tel que décrit précédemment, ledit lit de fibre ayant une taille de pores égale ou inférieure à 0,2 μm. La taille de pores égale ou inférieure a 0,2 μm confère une propriété antibacterienne au lit de fibres ; la surface de ce lit de fibres est ensuite recouverte par au moins un polymère cationique, le lit de fibres acquiert ainsi une propriété antivirale en plus de la propriété antibacterienne. On entend par propriétés antivirales du lit de fibres, la capacité dudit lit de fibres à séquestrer les virus.

On entend par virus aérien notamment les virus de la grippe (Influenza virus A, B et C), les coronavirus (par

exemple SARS-CoV) . D'autres virus concernes également par l'invention sont notamment le virus de la variole, les bacteriophages (E. coli) , les virus des hépatites, les poliovirus, rotavirus, le virus mosaïque du tabac, le virus ébola et autres virus infectieux.

Dans un autre mode de réalisation préféré, le filtre de l'invention est un filtre antiviral et antibacteπen, et comprend au moins un lit de fibres recouvert d'un polymère cationique tel que décrit précédemment, et au moins un lit de fibre ayant une taille de pores égale ou inférieure a 0,2 μm.

Avantageusement, le lit de fibres selon l'invention est efficace pendant une durée d'au moins 5 heures, de préférence d'au moins 12 heures et très préférentiellement d'au moins 18 heures .

La présente invention a aussi pour objet un purificateur d'air, un climatiseur ou un humidificateur comprenant au moins un filtre antiviral et optionnellement antibactérien tel que décrit précédemment. La présente invention a aussi pour objet un dispositif médical comprenant au moins un filtre antiviral et optionnellement antibactérien tel que décrit précédemment, notamment un masque chirurgical, des pansements, des vêtements de protection tels qu'un survêtement... La présente invention a pour objet un procédé de préparation d'un lit de fibres à propriété antivirale, comprenant la mise en contact dudit lit de fibres avec une solution de polymère cationique tel que décrit précédemment, puis une étape de séchage. Lors de la mise en contact du polymère cationique avec le lit de fibres, les fonctions cationiques, en particulier

aminé quaternaire, vont interagir avec le lit de fibres, ce qui conduit à la fixation du polymère sur le lit de fibres.

Selon un mode de réalisation, le polymère cationique est solubilise dans un solvant ou un mélange de solvant. Dans un mode de réalisation préféré, le solvant est un solvant polaire, de préférence l'eau. Très préférentiellement, le polymère cationique est solubilisé dans un sel lonisable, notamment du NaCl.

Selon un mode de réalisation, la concentration du polymère dans ladite solution de polymère cationique est de

0,1 à 200 g.l ^"1 , de préférence de 1 à 100 g.l ^"1 , plus préférentiellement de 20 à 80 g.l ^"1 et très préférentiellement de 40 a 50 g.1 ^""1 .

Selon un mode de réalisation, le pH de la solution de polymère est de préférence acide, préférentiellement de 3 à 6,5, et très préférentiellement le pH de la solution de polymère est 6.

Selon un mode de réalisation, le lit de fibres est trempé dans la solution de polymère à température ambiante ou la solution de polymère est pulvérisée à température ambiante sur le lit de fibres.

Selon un mode de réalisation, le lit de fibres est trempé dans la solution de polymère pendant 1 minute à 3 heures, préférentiellement pendant 5 minutes à 1 heure, très préférentiellement pendant 10 à 30 minutes.

Selon un mode de réalisation, le lit de fibres est lave a l'eau avant séchage de manière a éliminer l'excès de solution de polymère.

Selon un mode de réalisation, le lit de fibres est mis a sécher a température ambiante par evaporation ou a l'air ventile. L'étape de séchage peut être accélérée par un passage dans une etuve ventilée ou sous vide.

Selon un mode de réalisation, l'épaisseur du film de polymère obtenu a la surface du lit de fibres est de 0,5 ItT ^{^} μm a 5 μm, de préférence de 0,001 a 1 μm, très preferentiellement de 0,001 a 0,01 μm. La présente invention comprend un procède de préparation d'un lit de fibres a propriété antivirale tel que décrit précédemment comprenant en outre une étape de reticulation du polymère après séchage. Cette opération, facultative, permet parfois d'optimiser la fixation du polymère sur les fibres.

La présente invention comprend également un procède de préparation d'un lit de fibres a propriétés antivirale et antibacterienne dans lequel le procède de préparation d'un lit de fibres a propriété antivirale tel que décrit précédemment est applique sur un lit de fibres comprenant une taille de pores égale ou inférieure a 0,2 μm.

La présente invention sera mieux comprise a l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère a des exemples d'obtention du lit de fibres a propriété antivirale. Dans les exemples qui suivent, donnes a titre illustratif, il sera fait référence a la figure 1 en annexe, dans laquelle est illustre le montage permettant les expériences de filtration.

1- Matériels et méthodes

Réactifs et supports

Un polyethylene-imne (PEI) branche de haut poids moléculaire provenant de la société Aldrich Chemicals

(référence 40,872-7, lot 05906DU-202) a ete choisi pour ces

expériences d'obtention d'un lit de fibres a propriété antivirale .

Le lit de fibres utilisé dans ces expériences provient de la troisième couche de masques de chirurgiens

5 rectangulaires FFPl. Une analyse Infra-Rouge en mode ATR a révèle que les deux premières couches d'un masque (face a l'extérieur) sont constituées de polypropylène non tissé et servent de filtres bactériens, tandis que la troisième couche également non tissée (face visage) est constituée d'un mélange 0 de polyester-cellulose ou de cellulose estérifiée. Ces couches sont chargées négativement.

Dosage des groupes aminés protonés

Cette mesure est effectuée par dosage pHmétrique. 5 25 ml d'une solution de PEI à 0,44 % (4,4 g.l ^"1 ou 0,102 mol.l ^"1 ) dans du NaCl 0,2 mol. I ^-1 sont doses par une solution de HCl 0, 1 mol l ^"1

Le pH de la solution initiale (PEI non protoné) est de 11. 0 14 ml de HCl 0,1 mol.l ^{^1} ont été a3outés pour un volume total de 18 ml pour atteindre un pH = 6.

A pH = 6, le taux de protonation du PEI est de 75 % ± 5 % (14 ml/18 ml) .

5

Dosage de la densité de charge par cm ² de lit de fibres .

Une surface précise du lit de fibres (232 cm ² ) est trempée pendant 12h dans 50 ml d'une solution a 4,4% de PEI C dans du NaCl 0,2 mol.l ^" . Le lit cte fibre est ensuite place dans une solution de HCl 0,1 mol.l ^"1 afin de protoner la totalité du PEI fixe.

Le lit de fibre est ensuite lave a l'eau jusqu'à pH constant pour soutirer l'excès de HCl.

Le lit de fibre est enfin place dans 8 ml d'eau. La quantité de charge positive présente sur le lit de fibre est αosee par la soude 0,01 mol.l ^"1 .

Le pH initial est de 8,56. On trouve un volume équivalent de 2,5 cm ^J de soude 0,01 mol.l ^"1 .

Ceci correspond a une concentration de 3,125 x 1û ^"3 mol/1 d'acide, ou 2,5 x 10 ^"5 mole d'acide dans les 8 ml d'eau. En considérant qu'une mole d'acide avait réagi avec une mole αe motif de répétition de PEI (M _PE i = 43 g. mol ^"1 ) , 1,075 x 10 ^" g de PEI sont donc fixes sur les 232 cm ² de lit de fibre, ce qui est équivalent a 4,63 x 10 ^"6 g de PEI par cm ² de lit de fibre . La valeur de densité de charge du lit de fibres est donc de 1,1 x 10 ^"7 mole de charge par cm ² de lit de fibres ou mieux 1,1 x 10 ^~4 meq par cm ² de lit de fibres.

Modification de la couche 3 La fonctionnalisation s'est portée sur la couche 3 du masque, ci-apres dénommée lit de fibres.

La couche non tissée est trempée pendant une journée dans une solution de PEI a 4,4% en masse dans du NaCl a 0,2 M a pH=8 ou a pH=6. Le sel permet d'augmenter la quantité de polymère fixée. La valeur pH de 8 correspond a un pH optimum de fixation préalablement détermine. La valeur pH de 6 permet d' augmenter la protonation, de préférence la quaternisation du PEI (7<pKa<9) et donc d'améliorer sa fixation. La couche est ensuite egouttee, lavée a l'eau sous agitation lente pendant

10 h, puis sechee a l'air. Enfin, la couche est stérilisée sous UV avant son montage dans la cellule de filtration.

Virus et souche bactérienne Le bacteriophage T4 parasite de la souche E. coli a ete choisi comme virus test. Le bacteriophage T4 et la souche E. coli sont tous deux non pathogènes pour l'homme et pour l' environnement .

Milieux de culture

Le milieu 1 sert pour infecter E. coli par le phage et pour réaliser l'expérience de filtration. Il a pour composition pour un litre d'eau deionisee (Milliro®) : extrait de peptone et de viande : 13g, extrait de levure : 5g ; NaCl: 5g ; KH ₂ PO ₄ : 8g ; NaOH pour obtenir un pH de 7,6.

Le milieu 2, plus riche que le premier, sert au dosage du phage. Il a pour composition pour un litre d'eau deionisee

(Milliro®) : extrait de peptone et de viande : 10g ; glucose :

10 g ; NaCl : 3g, KH ₂ PO ₄ : 0,044 g ; CaCl ₂ : 0,011 g ; MgCl ₂ : 0,203g ; NaOH pour obtenir un pH de 7,6.

Les extraits de peptone, de viande et de levure sont des substrats riches en protéines, en glucides et en vitamines hydrosolubles qui servent a la croissance bactérienne. Le glucose est un glucide qui a le même rôle. NaCl, CaCl ₂ , MgCl ₂ sont des sels nécessaires a la survie des organismes vivants. KH ₂ PO ₄ est un tampon qui permet de maintenir un pH constant.

Les milieux 1 et 2, une fois prépares, sont repartis dans des Erlenmeyer de 250 cm ^J . Ils sont utilises sous forme liquide ou sous forme gélifiée (pour le milieu 2) en y incorporant de l'agar a 3% en masse (polysaccharide

gélifiant) . Ce dernier est coule dans des boites de Pétri et sert a réaliser les numérations lors du dosage. Les milieux sont stérilises par autoclave (12O ⁰ C pendant 20 minutes) puis conserves en chambre froide. Le glucose est autoclave 5 séparément pour éviter sa caramélisation avec le milieu.

Montage

Le montage est illustre figure 1. Il est constitue d'un compresseur d'air générateur d'aérosols (Diffusion 0 Technique Française - Saint-Etienne - France) , relie a un nebuliseur (Atomisor NL 11) . Un filtre a gaz de taille de pores 0,22 μm (Gelman) est place entre le générateur et le nebuliseur afin d'éviter les contaminations bactériennes parasites . 5 La cellule est un support de filtre en deux parties, en verre, comportant une arrivée et une sortie d'air. La membrane est insérée stérilement entre deux joints en caoutchouc recouvrant les rodages de la cellule. L'ensemble est maintenu par des pinces . 0 La sortie de la cellule est reliée a un piège liquide

(50 cm ^J de sérum physiologique) pour dissoudre par barbotage les virus qui ont traverse la membrane. Le flux d'air résiduel passe par un second piège liquide contenant de l'eau de javel afin de neutraliser les éventuelles traces de virus qui ne se s seraient pas dissous.

L'ensemble du montage est autoclave, démonte puis assemble stérilement sous hotte a flux laminaire préalablement stérilise sous UV.

C Mode opératoire des expériences de filtration

Les expériences suivent le même mode opératoire :

Préparation d' une solution virale :

Dans un premier temps, E. coli est inoculé a l'anse de platine dans 150 cm ³ de milieu 1 à 37 ⁰ C. L'évolution de la croissance de la bactérie est suivie par un spectrophotomètre UV/visible. Quand la DO à 580 nm atteint 0,5 (c'est a dire une population cellulaire de 2,1 x 10 ⁸ cellules / ml), 18 μl d'une solution référence de phages (contenant 10 ¹² phages / ml) sont dilués dans 182 μl de sérum physiologique. 20 μl de cette solution sont alors inocules dans le milieu 1 contenant E. coll. La quantité de phages injectée doit toujours être proportionnelle a la population cellulaire. Après une nuit de mise en culture, 130 ml de milieu sont centrifugés a 3000 tours/mm pendant 10 minutes afin d'éliminer les bactéries. Le surnageant est filtré sur Millex type HA (Millipore) de taille de pores 0,45 μm. Le filtrat est récupéré pour servir de solution mère à nébuliser.

Expérience de filtration :

5 cm ³ de la solution mère de phage sont nébulisées pendant environ 1 heure (débit d'air: 8 L/h) . Le montage préalablement décrit a permis de réaliser les expériences suivantes:

Sans membrane, afin de déterminer les pertes en virus dues au montage. - Avec les 3 couches du masque de chirurgien, afin de déterminer sa rétention virale. Avec un lit de fibres non fonctionnalisé. Avec un lit de fibres fonctionnalisé par du PEI a 4,4 % (g/g) à pH=8 dans NaCl 0,2M. - Avec un lit de fibres fonctionnalise par du PEI a 4,4 % (g/g) à pH=6 dans NaCl 0,2M.

Avec un lit de fibres fonctionnalise par du PEI a 0,44 % (g/g) a pH=6 dans NaCl 0,2M.

Titrage des virus En fin d'expérience, 0,4 ml de la solution placée en sortie de cellule sont prélevés et dilues dans 3,6 cm de sérum physiologique. Cette solution est diluée de manière successive jusqu'à une dilution de 10 ^*8 . 0,25 ml de chaque dilution sont ensuite transfères dans des tubes stériles vides auxquels on ajoute 0,4 ml d'une suspension de E. coli en phase exponentielle de croissance préalablement cultive dans 150 ml de milieu 2 (D0 ₅ ao référence = 0,8). Ces tubes sont ensuite places a 37 ⁰ C pendant 30 mm pour permettre aux phages de contaminer E. Coll. 3 ml de gélose molle (milieu 2 contenant de l'agar a 0,6%) a 40 ⁰ C sont ensuite ajoutes a chacun des tubes . Le contenu de chaque tube est étale sur des boîtes de Pétri contenant une gélose solide (agar 3%) de milieu 2. Les boîtes sont placées a 37°C pendant 24 h avant de dénombrer les plages de lyse. La solution mère est également titrée de la même manière (avec une gamme de dilution jusqu'à 10 ^"u ) et sert de référence pour chaque expérience.

Le facteur de perte est égal au nombre de virus par cm ³ de solution mère divise par le nombre de phages par cm ³ de solution réceptrice après filtration.

2- Résultats et discussions

Filtration dans la cellule sans membrane L' expérience de filtration sans membrane sert a évaluer ±a perte en phage due a la nebulisation, au passage du phage

dans la cellule et a sa récupération par bullage dans la solution de sérum physiologique. 0,72 x IQ ¹⁰ virus par cm ³ ont ete retrouves pour une solution mère nebulisee contenant 1,18 x 10 ¹ virus par cm ³ . Le facteur de perte du montage est donc de 1,6.

Filtration à travers le masque commercial

L' efficacité de la rétention virale du masque chirurgical constitue des 3 couches a ete testée. 0,56 x lu ¹⁰ virus par CITT ont ete retrouves pour une solution mère nebulisee contenant 2,88 x lu ¹⁰ virus par cm ³ . Le facteur de perte du masque est donc de 5,2. Compte tenu du facteur de perte propre au seul montage, le masque chirurgical commercial est donc totalement inefficace vis-a-vis des virus.

Filtration à travers le lit de fibres non fonctionnalisé

L'efficacité de la rétention virale du lit de fibres sans traitement a ete mesurée. 0,43 x 10 ¹⁰ virus par cm ³ ont diffuse a travers ce lit de fibres non traite pour une solution mère nebulisee contenant 1,22 x 10 ¹⁰ virus par cm ³ . Le facteur de perte dû au lit de fibres non traite (i.e. la couche 3 non traitée) est donc de 2,9. Ce facteur est inférieur a celui du masque chirurgical a 3 couches ce qui est logique, car les deux couches polypropylene destinées a la filtration bactérienne filtrent aussi très légèrement les virus .

Filtration à travers le lit de fibres fonctionnalisé par du PEI à 4,4 % (g/g) dans NaCl 0,2M à pH =8

La mesure de la rétention virale du lit de fibres traite avec du PEI montre que 1,44 x 10 ^J virus par cm ^J ont diffuse pour une solution mère nebulxsee contenant 0,5 x 10 ¹⁰

virus par cm ^J . Le facteur de perte dû a la couche 3 non traitée est donc de 3,5 x IQ ⁶ . Le traitement PEI a 4,4 % (g/g) en milieu NaCl 0,2M a pH =8 est donc très efficace pour ralentir la diffusion des virus. Cependant, le traitement ne permet pas de rendre la couche totalement barrière vis-à-vis des virus.

Filtration à travers le lit de fibres fonctionnalisé par du PEI à 4,4 % (g/g) dans NaCl 0,2M à pH =6

Une solution mère nébulisée contenant 0,7 x 10 ¹⁰ virus par cm ³ est filtrée à travers un lit de fibres fonctionnalisé par du PEI à 4,4 % (g/g) dans NaCl 0,2M à pH =6. La mesure de la rétention virale par cette couche montre qu'aucun virus n'est détecté après filtration. La rétention des virus par la couche 3 traitée est donc totale. Cette couche est devenue totalement barrière vis-a-vis des virus par notre traitement.

Le PEI est donc un polymère très efficace pour rendre le système de filtration barrière vis-à-vis des virus.

Nous avons vérifié, par dosage COT (carbone organique total) , que le PEI ne se décrochait pas du support lors de la respiration après 5 heures d'utilisation. La respiration a été simulée par diffusion d'air à 8 L /min.

Filtration à travers le lit de fibres fonctionnalisé par du PEI à 0,44 % (g/g) dans NaCl 0,2M à pH =6 Nous avons dilué 10 fois la concentration en PEI fixée sur le lit de fibres afin de vérifier son efficacité en solution plus diluée. La mesure de la rétention virale montre que 5,5 x lu ⁵ virus par cm ^J ont traverse le filtre pour une solution mère nebulisee contenant 5,5 x 10 ⁷ viras par cm ³ . Le facteur de perte est donc de 100. Le traitement PEI a 0,44 % (g/g) est donc nettement moins efficace que le traitement a 4,4 % (g/g) .