Apherese-Vorrichtung Die Erfindung betrifft eine Apherese-Vorrichtung, umfassend einen mit dem Blut-oder Plasmafluss kontaktierbaren festen Trä- ger.

Unter Apherese werden Behandlungsverfahren verstanden, deren Therapieeffekte auf der extrakorporalen Elimination pathogener Proteine, proteingebundener pathogener Substanzen, freier patho- gener Substanzen oder pathogener Zellen des Blutes beruhen. Wenn das pathogene Protein nur aus dem zellfreien Plasma eliminiert werden kann, wird das Plasma vorher von den Blutzellen mit Hilfe eines Membranplasmaseparators (Plasmaseparation) oder mit Hilfe einer Hämozentrifuge getrennt. Beim unselektiven Plasmaaustausch (Plasmapherese) wird das ausgetauschte Patientenplasma als ge- samtes separiert, wobei neben den Pathogenen auch alle anderen lebensnotwendigen Proteine eliminiert werden. Dadurch ist die Substituierung des entnommenen Plasmas mit Elektrolyten, Human- albumin oder Frischplasma erforderlich. Bei selektiven Plas- maphereseverfahren können mit Hilfe von Adsorption, Präzipitation oder Filtration pathogene Proteine ganz spezifisch aus dem separierten Plasma entfernt werden, wobei das Plasma nach der erfolgten Entfernung ohne wesentlichen Volumenverlust reinfundiert werden kann. Diese selektiven Verfahren haben den Vorteil, dass hierbei auf eine Substitutionslösung verzichtet werden kann. Bei selektiven Vollblutaphereseverfahren werden die pathogenen Eiweiße spezifisch und ohne vorherige Plasmaseparati- on direkt aus dem nicht vorbehandelten Blut adsorbiert, womit- im Gegensatz zu den Plasmaseparationsverfahren-sowohl die Plasmaseparation als auch die Zugabe einer Substitutionslösung entfallen können. Eine weitere Unterform der Apherese ist die Zytapherese, bei welcher Zellen aus dem Blut entfernt werden.

Dabei können selektiv Leukozyten, Erythrozyten, Thrombozyten, Granulozyten oder sogar Stammzellen gewonnen werden.

Obgleich die Apherese (z. B. als Plasmapherese oder Zytapherese) gegenwärtig vorwiegend zur Gewinnung von Spenderplasma (als Plasmakonserve, zur Isolierung verschiedener Plasmafraktionen oder zur Gewinnung von Blutprodukten) verwendet wird, gewinnen Aphereseverfahren zunehmend auch auf therapeutischem Gebiet an Bedeutung. So werden gegenwärtig eine ganze Reihe von Stoff- wechselkrankheiten (z. B. (familiäre) Hypercholesterinämie, pro- grediente koronare Herzkrankheit mit isolierter Lp (a)-Erhöhung, Chylomikronämie-Syndrom, Leberversagen,...), Nierenkrankheiten (Goodpasture Syndrom, Systemischer Lupus erythematodes mit Lu- pusnephritis, Wegnersche Granulomatose, Hämolytisch-urämisches Syndrom, Idiopathische fokal-sklerosierende Glomerulonephritis, Paraproteinämie assoziierte Syndrome, Kryoglobulinämische Purpu- ra, HLA-Sensibilisierung bei Nierentransplantation, ...), Er- krankungen des Nervensystems (Myasthenia gravis, Guillain-Barri- Syndrom, Chronische demyelinisierende Polyradikuloneuritis, Pa- raproteinämische Polyneuropathie, Lambert-Eaton-Syndrom, Refsum- Syndrom,...), Erkrankungen des Immunsystems (Rheumatoide Arthri- tis, Hemmkörperhämophilie, Pemphigus, ...), Erkrankungen des Blutkreislaufs und der Mikrozirkulation (Hyperviskositätssyn- drom, Antiphospholipidantikörper-Syndrom, Thrombotische Mikroan- giopathie nach Knochenmarktransplantation, Altersabhängige Makuladegeneration, Hörsturz, Periphere Störungen der Mikro- zirkulation, Idiopathische dilatative Kardiomyopathie, Transplantatvaskulopathie nach Herztranspantation, Homozygote familiäre Hypercholesterinämie, Fokal segmentale Glomeruloskle- <BR> <BR> rose, Hämolytisch-urämisches Syndrom, ...), Vergiftungen, akute Leberinsuffizienz, Neoplasmen, Hyperhydratation, Thyreotoxikose, etc., mit Aphereseverfahren behandelt (siehe Pschyrembel (257.

Auflage) Stichwort"Plasmapherese" ; www. nephrologie. de/172Apha- rese. htm).

Die Alzheimer'sche Erkrankung (AE) ist eine progressive, neuro- logische Störung für die gegenwärtig keine effektive Behandlung möglich ist. Typisch für diese Erkrankung sind zerebrale Plaques, welche das Amyloid-ß-Peptid enthalten, und fadenartige neuronale Strukturen aus dem Mikrotubulus assoziierten TAU- Protein. Obgleich sowohl Amyloid-ß und TAU für die Pathogenese als relevant betrachtet werden, scheinen die aktuellsten For- schungsergebnisse darauf hinzudeuten, dass Amyloid-ß das vor- rangige Agens in der Pathogenese darstellt. Es werden daher zunehmend Therapeutika entwickelt, die die Amyloid-ß-Produktion, die Amyloid-ß Aggregation oder die von diesen Aggregaten ver- ursachten neurotoxischen Vorkommnisse verhindern sollen. Eine zusammenfassende Darstellung der bislang eingeschlagenen thera- peutischen Strategien für AE ist im Übersichtsartikel von Wolfe (Nature Reviews Drug Discovery 1 (2002) 859-866) gegeben.

Die Amyloid-ß-Plaques bilden sich ausgehend vom so genannten Amyloid-ß Precurser Protein (APP), welches ein integrales Trans- membran-Protein ist (für das auch keine physiologische Funktion klar belegt ist ; allerdings lassen neueste Forschungsergebnisse vermuten, dass APP als sog. Membran-Cargo-Rezeptor für Kinesin I fungiert). APP wird durch so genannte Sekretasen proteolytisch gespalten, wobei physiologisch vor allem ein 40-Aminosäuren langes Aß-Peptid (Aß40) gebildet wird. Andere, kürzere und länge- re Formen von Aß entstehen ebenfalls, vor allem eine 42-Amino- säure-Version (Aß42), welche ein hohes Aggregationsvermögen aufweist. Diese Aß42-Form ist daher auch die überwiegende Form in amyloiden Plaques. Die für diese unterschiedlichen Spaltungen verantwortlichen Sekretasen (a-, und vor allem ß-und gamma-Se- kretase) bilden daher auch primäre Angriffsziele einer möglichen AE Behandlungsstrategie. Es wurde daher versucht, Modulatoren bzw. Inhibitoren für diese Enzyme bei der Behandlung von AE einzusetzen (wie z. B. Benzodiazepine, Sulphonamide, Benzocapro- lactame).

Ein weiteres Gen, das mit AE assoziiert ist, ist Apolipoprotein E, wobei hierfür drei allele Varianten existieren (APOE2, APOE3 und APOE4). Es hat sich gezeigt, dass Personen mit ein oder zwei Kopien von APOE4 ein höheres Risiko für AE aufweisen, wohingegen APOE2-Träger ein geringeres Risiko, verglichen mit der Gesamtbe- völkerung aufweisen. Auch zeigt es sich, dass Personen, die Sta- tine, also Arzneimittel, die Cholesterinbiosynthese inhibieren, zu sich nehmen, ein deutlich verringertes Risiko für AE auf- weisen. Eine weitere Strategie zur Behandlung von AE kon- zentriert sich daher auf die Inhibition der Cholesterinbiosynthese, eben mit beispielsweise Statinen.

Ein weiterer Ansatz zur Behandlung von AE betrifft die Inhibiti- on der Amyloid-Aggregation in zerebralen Plaques, welche unter anderem ebenfalls durch Sekretase-Inhibitoren durchgeführt werden könnte. Weiters wurde auch vorgeschlagen, den Zinkgehalt zu senken, da Zink in physiologisch relevanten Konzentrationen die Aggregation von Aß induzieren kann.

Schließlich wurden auch immunologische Strategien beschrieben, beispielsweise eine Immunisierung mit Aß42, welche jedoch im Rahmen einer klinischen Studie wegen schwerer Nebenwirkungen eingestellt werden musste (Willke, Bild der Wissenschaft, 9 (2003), 24-28).

Weitere AE-Behandlungsstrategien, die im Stand der Technik vorgeschlagen worden sind, betreffen die Verhinderung der APP- Expression und die Erhöhung der Aß-Clearance, wobei für erstere Substanzen gesucht wurden, die mit der APP-Promoter-Region wechselwirken. Im Hinblick auf die Aß-Clearance wurde eine Erhöhung der Aktivität von bestimmten Proteasen, wie das Insulin abbauende Enzym und Neprolysin, oder die periphere Applikation von anti-Aß-Antikörpern (De Mattos et al., PNAS 98 (15) (2001), 8850-8855) vorgeschlagen. Schließlich wurde auch versucht, be- reits bestehende Amyloid-Plaques wieder aufzulösen, beispiels- weise durch Erniedrigung des Amyloid ß-Niveaus im Serum von AE- Patienten. In diesem Zusammenhang wurde auch vorgeschlagen, die Plaque-Ablagerungen von ß-Amyloid-Proteinen im Gehirn durch Apherese-Verfahren zu reduzieren (US 6 551 266, worin die Ent- fernung von Makromolekülen mit einem Molekulargewicht von mehr als 500kD durch Apherese vorgeschlagen wird), ohne dass dies allerdings für AE auch tatsächlich gezeigt wurde. Die Auflösung durch bereits bestehende Plaques in Hirnzellen ist aber durch Aphereseverfahren direkt nicht möglich (Blut/Hirn-Schranke ist unüberwindlich für Plaques oder auch Moleküle mit >500kD).

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war daher die Bereitstellung einer neuen Behandlungs-und Präventionsstrategie für die Alz- heimer'sche Erkrankung.

Demgemäß wird mit der vorliegenden Erfindung eine Apherese-Vor- richtung, umfassend einen mit dem Blut oder Plasmafluss kon- taktierbaren festen Träger, der einen Amyloid-ß-Precurser- Protein (APP) bindenden Rezeptor aufweist, zur Verfügung ge- stellt. Mit der vorliegenden Apherese-Vorrichtung kann gezielt bei AE-Patienten bzw. Personen mit AE-Risiko mittels Apherese eine Clearance von APP oder APP-Abbauprodukten, insbesondere Aß40 oder Aß42, vorgenommen werden. Es ist bekannt, dass ein dyna- misches Äquilibrium von Aß42 zwischen dem zentralen Nervensystem (ZNS) und dem Plasma besteht. Es konnte im Mausmodell gezeigt werden (DeMattos PNAS 2001, siehe oben), dass die periphere Ap- plikation von anti-Aß-Antikörpern die ZNS und Plasma Aß42 Clea- rance beeinflusst und die Aß42 Belastung im Gehirn reduziert, ohne dass die anti-Aß-Antikörper die Blut-Hirn-Schranke über- winden. Diese Ergebnisse wurden von Matsuoka et al (Journal of Neuroscience 2003 : 29-33) durch die periphere Applikation anderer Aß42 bindender Moleküle (Gelsolin und GM1) bestätigt. Der Prozess der Entstehung der Plaques im Gehirn kann also durch Abfangen von Aß42 im Blut unterbunden werden. Hierbei ist es nicht kritisch, ob die Rezeptoren in der Apherese-Vorrichtung, die mit dem Blut oder Plasma des Patienten kontaktiert werden, spezifisch für Aß42 oder andere Abbauformen von APP sind, wesent- lich ist nur, dass mit dieser spezifischen Adsorption APP und dessen (proteolytische) Abbauprodukten, insbesondere Aß42, aus dem Blut eliminiert werden, so dass es nicht zu einem"falschen" Proteinabbau (nämlich zu Aß42) kommt. Damit beruht die vor- liegende Erfindung auf einem völlig anderen Anwendungsansatz für die Apherese als die US 6 551 266, nämlich auf der Eliminierung der potenziellen Plaque-Bausteine und nicht erst der Plaques. Im Übrigen scheidet die Eliminierung von Plaques mittels Apherese von vornherein als nicht effektiv zur AE-Behandlung aus, da die Blut-Apherese die Regionen der Plaqueentstehung im Gehirn gar nicht erreichen kann.

Auf der anderen Seite hat die erfindungsgemäße Apherese gegen- über Verfahren, die im Körper selbst zur Abreicherung von Aß führen (wie z. B. in DeMattos et al., PNAS 98 (15) (2001), 8850- 8855 mit peripheren anti-Aß Antikörpern), den entscheidenden Vorteil, dass hierbei keine Autoimmunantworten ausgelöst werden können. Weiters müssen erfindungsgemäß auch keine Substanzen dem Patienten zugeführt werden, die erst im Körper selbst wirken können (eventuell erst, nachdem sie an eine bestimmte Stelle transportiert worden), sondern das pathogene Agens wird gezielt entfernt, also die Ursache der Erkrankung spezifisch extrakorpo- ral abgetrennt, ohne dass die Reaktionsprodukte im Körper eliminiert werden müssen.

Dabei können erfindungsgemäß die bereits bestehenden und bekann- ten Apherese-Vorrichtungen in allen Ausführungsformen leicht an die vorliegende Erfindung angepasst werden. Insbesondere sollte bei der Wahl des festen Trägers (und der Apheresevorrichtung) auf dessen (deren) medizintechnische Eignung Bedacht genommen werden. Derartige Träger, Verfahren oder Vorrichtungen sind un- ter anderem in der WO 97/48483 A, US 5 476 715,6 036 614, 5 817 528 oder 6 551 266 beschrieben. Entsprechende kommerzielle Apherese-Apparate werden auch unter anderem von den Firmen Fresenius, Affina, Plasmaselect, ASAHI, Kaneka, Braun, etc. vertrieben, wie z. B. das LDL-Therasorb@, das Immunosorba@, das Prosorba@, das Globaffin@, das Ig-Therasorb@, das Immusorba@, das Liposorba@, das HELP@, das DALII, das Bilirubin-Gallensäure-Absor- ber BR-350, die Prometheus@ Entgiftung, das MARS@, das ADAsorb- System von Medicap oder das Plasma FLO-System. All diese Systeme - obgleich in der kommerziellen Form nicht primär immer auf die spezifische Eliminierung eines einzelnen Proteins gerichtet- können ohne weiteres von einem Apherese-Fachmann an die vor- liegende Erfindung angepasst werden, z. B. als Immunapherese und/oder unter Einbau des erfindungsgemäßen festen Trägers (z. B. als Säule) in das Apherese-Gerät.

Unter"APP bindenden Rezeptoren"werden daher erfindungsgemäß auch sämtliche Substanzen verstanden, die eine Affinität zum Liganden APP und dessen biologischen Nebenprodukten, insbesonde- re Aß42, haben und in der Lage sind, diese Polypeptide aus dem Blut oder Plasma von AE-Patienten oder Personen mit einem Risiko für AE zu entfernen. Diese APP-bzw. Aß42-Rezeptoren können dabei vorzugsweise (poly oder monoklonale) Antikörper, Proteine, Pep- tide, Ganglioside oder Nukleinsäuren sein.

Besonders bevorzugt sind dabei anti-APP-Antikörper, anti-Aß40- Antikörper oder anti-Aß42-Antikörper, APP bindende Proteine, insbesondere Gelsolin, apoJ oder apoE, APP bindende Peptide, APP bindende Ganglioside, insbesondere GM1 oder APP bindende Nukle- insäuren, insbesondere Aptamere) oder Mischungen dieser Rezepto- ren.

Beispiele für derartige Antikörper sind 3D6 (Als) 2H3 (Aßll2), 2G3 (Aß33-40), 21F12 (Aß33-42), 12H7 (Aß33-42) (Johnson-Wood et al, PNAS 1997 : 1550-1555), 10D5, 16C11 (Bard et al, Nature Medicine 2000 : 916-919) die De Mattos et al. (2001) beschriebenen Anti- körper (m266, m243) sowie Antikörper gleicher Spezifität. Der- artige Antikörper werden beispielsweise bei der Immunisierung von Säugetieren mit Vakzinformulierungen, enthaltend APP, Aß42 oder Fragmente oder Varianten davon, erhalten, gegebenenfalls gefolgt von Zellfusion und Klonselektionsprotokollen (bei monoklonalen Antikörpern).

Gelsolin (Matsuoka et al 2003, siehe oben), apoJ und apoE (DeMattos'et al 2001, siehe oben) sind weitere Beispiele für APP-bindende Protein-Rezeptoren. GM1 ist ein Beispiel für einen APP-bindenden Gangliosid-Rezeptor (Matsuoka et al 2003, siehe oben).

Weitere Beispiele für APP-bindende Proteine sind das CETP (Cho- lesteryl-Ester-Transfer-Protein) und das ERAB-Protein (261 AS groß ; He et al., JBC 273 (17) (1998), 10741-10746 ; Lustbader et al., Science 304 (2004), 448-452 ; insbesondere AS 1-186 bzw. 1- 158). Beispiele für APP-bindende Peptide sind die aus den APP- bindende Proteinen abgeleiteten APP-bindenden Fragmente. Konkre- te Beispiele für APP-bindende Peptide sind KTYNLKKGQT-C ("Peptid 4077"), GIAVASKTYNLKKGQTHTLEDFQRVLDV (ERAB 93-120), SKTYNLKKG- QTHT (ERAB 98-110), C-HQKLVFFAED ("Peptid 1323"), C-EVHHQKLVFFA- EDVGS ("Peptid 1324"), C-HQKIVFFAED ("Peptid 1325"') und FGFPEHLLVDFLQSLS-C ("Peptid 1208") (bzw. auch alle anderen ERAB, CETP oder ß-breaker Fragmente, die die APP-bindenden Bereiche beinhalten) (die terminalen Cysteine sind bei diesen Peptiden nicht Teil der nativen Proteinsequenz sondern wurden zu Kopplung der Peptide angehängt).

Peptide als APP-bindende Rezeptoren können dabei aus D-oder L- Aminosäuren oder Kombinationen von D und L-Aminosäuren zu- sammengesetzt sein, und gegebenenfalls durch weitere Modifi- zierungen, Ringschlüsse oder Derivatisierungen verändert worden sein. Geeignete Peptidrezeptoren für z. B. Aß42 können aus Peptid- bibliotheken zur Verfügung gestellt werden, die kommerziell erhältlich sind. Vorzugsweise sind diese Peptide zumindest 5, vorzugsweise 6, Aminosäuren lang, insbesondere mindestens 8 Ami- nosäuren, wobei bevorzugte Längen sich bis zu 11, vorzugsweise bis zu 14 oder 20 Aminosäuren erstrecken können. Erfindungsgemäß können jedoch auch längere Peptide ohne weiteres als APP bindende Rezeptoren herangezogen werden. Desweiteren eignen sich Oligomere (wie z. B. Polyethylenimin und Polylysin) als Rezepto- ren.

Zur Herstellung derartiger APP-bindender Rezeptoren sind selbst- verständlich auch Phagen-Bibliotheken, Peptid-Bibliotheken, z. B. mittels kombinatorischer Chemie erzeugt oder mittels high throughput screening-Techniken für verschiedenste Strukturen, geeignet (siehe z. B. in Phage Display : A Laboratory Manual by Carlos F. Barbas (Editor), et al ; Willats WG, Phage display : practicalities and prospects. Plant Mol Biol. 2002 Dec ; 50 (6) : 837-54 ; http : //www. microcollections. de/showpublications. php#).

Neben Phagenbibliotheken auf Randomisierungsbasis eigen sich ebensolche Bibliotheken, die sich des ribosomalen Displays oder des bakteriellen Displays bedienen. Entsprechende Bibliotheken und Verfahren zu ihrer Generierung sind dem Fachmann bekannt und unter anderem in US 2004/0110281 A, WO 00/72880 A und WO 02/059148 A beschrieben.

Weiters können auch APP-bindende Rezeptoren auf Basis von Nukle- insäuren ("Aptamere" ; aber auch"Decoy"-Oligodeoxynuleotide (ds Oligonukleotide, die von der Sequenz her Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren darstellen) ) eingesetzt werden, wobei auch diese mit verschiedensten (Oligonukleotid-) Bibliotheken (z. B. mit 2-180 Nukleinsäureresten) aufgefunden werden können (z. B. Burgstaller et al., Curr. Opin. Drug Discov. Dev. 5 (5) (2002), 690-700 ; Famulok et al., Acc. Chem. Res. 33 (2000), 591- <BR> <BR> 599 ; Mayer et al., PNAS 98 (2001), 4961-4965, uvm. ). Das Nukle- insäurerückgrat kann dabei beispielsweise durch die natürlichen Phosphordiester-Verbindungen aber auch durch Phosphorotioate oder Kombinationen oder chemische Variationen (z. B. als PNA) aufgefunden werden, wobei als Basen erfindungsgemäß vor allem U, T, A, C, G, H und mC eingesetzt werden können. Die 2'-Reste der Nukleotide, die gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können, sind vorzugsweise H, OH, F, Cl, NH2, 0-Methyl, 0- Ethtyl, 0-Propyl oder 0-Buthyl, wobei die Nukleinsäuren auch noch anders modifiziert werden können, also beispielsweise mit Schutzgruppen, wie sie üblicherweise in der Oligonukleotidsyn- these angewendet werden, versehen werden. APP-bindende Aptamere sind daher ebenfalls bevorzugte APP-bindende Affinitätsmoleküle im Rahmen der vorliegenden Erfindung.

Die Aptamere für APP findet man bespielsweise mit dem nach- folgend beschriebenen Verfahren. Man kontaktiert immobilisiertes APP (oder eine andere der oben beschriebenen Formen) mit einer Mischung aus Nukleinsäuren, wobei hochaffin bindende Nukleinsäu- ren von den weniger affin oder gar nicht bindenden Nukleinsäuren abgetrennt werden. Bei den Mischungen mit Nukleinsäuren handelt es sich typischerweise um Nukleinsäurenbibliotheken, welche bei- spielsweise im Wege der kombinatorischen Chemie hergestellt wurden. Eine Nukleinsäurebibliothek enthält eine Vielzahl von- einander unterschiedlicher Nukleinsäuren, wobei zumindest in einem Teilsequenzbereich eine Randomisierung (mit natürlichen und/oder nicht-natürlichen Nukleotiden) eingerichtet ist. Es kann, muss aber nicht, ein konservierter Sequenzbereich vorgese- hen sein. Randomisierung in n Positionen mit m verschiedenen Nu- kleotiden führt zu einer Bibliothek mit nm Elementen.

Für das Auffinden der APP-spezifischen Affinitätsnukleinsäuren werden folgende Schritte durchgeführt. a) eine Säule wird (in- nenseitig) mit APP (etc. ) beladen und APP (etc. ) wird in der Säule immobilisiert, b) das Gemisch an Nukleinsäuren wird einem ersten Ende der Säule aufgegeben, wobei durch die Säule ein de- finierter Volumenstrom an Trägersubstanz, laufend vom ersten Ende zum zweiten Ende der Säule, eingerichtet ist, c) die Nukle- insäuren werden mit abnehmender Affinität der Nukleinsäuren zu <BR> APP (etc. ) in zunehmendem Abstand vom ersten Ende der Säule ge- bunden und immobilisiert, d) der Volumenstrom an Trägersubstanz durch die Säule wird nach einer definierten Laufzeit beendet, e) die Säule wird durch eine Mehrzahl von Teilungen in Säulenseg- mente aufgetrennt, wobei jedem Segment eine Laufwegkoordinate zugeordnet wird, f) aus zumindest einem Segment werden die immo- bilisierten Nukleinsäuren unspezifisch desorbiert und unter Zu- ordnung der dem Segment zugeordneten Laufwegkoordinate gewonnen.

Der Ausdruck innenseitig der Säule meint innerhalb eines Lumens in aller Allgemeinheit. Der Ausdruck der Säule sollte alle Arten fester Trägersysteme umfassen können, z. B. auch nicht vollstän- dig umschlossene Trägersysteme sind möglich.

Die Immobilisierung von APP (etc. ) kann nach den üblichen Metho- den der Säulenchromatographie erfolgen. Als Säule ist jedes me- chanisches Konstrukt bezeichnet, welches ein Lumen mit zwei Enden aufweist. Als Strukturmaterial kommen alle für Säulen üb- lichen Materialien, wie Metalle, Glas und/oder Kunststoffe in Frage. Die Säule kann innenseitig mit einer APP- (etc.) bindenden Matrix versehen sein und/oder das Strukturmaterial kann zur di- rekten Bindung der Targetmoleküle geeignet oder vorbereitet sein. Ein Gemisch aus Nukleinsäuren bezeichnet Nukleinsäurebi- bliotheken mit einer Anzahl. von typischerweise 106 bis 1022/Mol, insbesondere 101° bis 1011/Mol, voneinander verschiedener Nukle- insäurenspezies. In der auf die Säule aufgetragenen Bibliothek ist jede Nukleinsäurespezies statistisch beispielsweise mit 10 bis 10", insbesondere 100 bis 1013, Molekülen vertreten. Die Trä- gersubstanz ist üblicherweise eine Flüssigkeit, in welcher die Nukleinsäurebibliothek löslich und stabil ist. Hierfür kommen alle für Nukleinsäurebibliotheken üblichen Puffer und derglei- chen in Frage. Der Volumenstrom an Trägersubstanz kann vor Auf- trag der Nukleinsäurebibliothek eingestellt werden. Dann wird die Nukleinsäurebibliothek säuleneingangsseitig dem Trägersub- stanzstrom zugegeben. Die Nukleinsäurebibliothek kann aber auch unmittelbar aufgegeben werden. Nach einer Laufzeit, welche durch den Aufbau der Säule und den eingestellten Volumenstrom bestimmt ist, tritt der"Pfropfen", welcher durch die Nukleinsäurebiblio- thek aufgegeben wurde, säulenausgangsseitig wieder aus (verbrei- tert durch Faltung mit der Diffusion), wobei gebundene Nukle- insäuren aus dem"Pfropfen"abgetrennt und in der Säule immo- bilisiert wurden. Zweckmäßigerweise wird der Volumenstrom durch die Säule wenig-bzw. nicht-turbulent, vorzugsweise laminar, eingestellt (Summe der Beschleunigungsvektoren der Trägersub- stanz über das Säulenvolumen, insbesondere über den Säulen- querschnitt, minimal, idealerweise 0). Die Gesamtanzahl der APP- Moleküle in der Säule beträgt typischerweise das 102-bis 1016-fla- che, insbesondere das 103-bis 10"-fauche, der Anzahl an Nukle- insäuremolekülen einer einzelnen Spezies in der aufgetragenen Nukleinsäurebibliothek. Die Bindung der Nukleinsäuren an die APP-Moleküle erfolgt vorzugsweise unter Bedingungen, welche einem späteren Einsatz der Nukleinsäuren bei der Apherese ent- sprechen, beispielsweise in einem geeigneten Puffer, welcher entsprechend abgestimmt ist hinsichtlich Temperatur, Ionenstär- ke, pH-Wert und Pufferbedingungen. Die Trägersubstanz sowie das Lösungsmittel der Nukleinsäurenbibliothek sind dann entsprechend hinsichtlich derer Komponenten auszuwählen. Die Teilung der Säu- le in eine Mehrzahl von Säulensegmente kann beispielsweise durch Zerschneiden der Säule erfolgen, wobei die Schnitte vorzugsweise orthogonal zum Volumenstromvektor erfolgen. Die Säule kann aber auch zuvor aus Säulensegmenten zusammengesetzt worden sein, wobei sich ein Säulensegment vorzugsweise in Richtung des Volu- menstromvektors an das nächste Säulensegment dicht aneinander- reiht (Fügequerschnitt orthogonal zum Volumenstromvektor). Dann kann die Teilung durch Auflösung des zuvor gebildeten Verbundes aus Säulensegmenten erfolgen. Die unspezifische Desorption kann durch Eluierung mit einem hinreichend starken Liganden durch Verdrängung, Komplexierung, Modifikation und/oder Zerstörung von APP, physikochemisch oder thermisch erfolgen. Auch mechanische Verfahren, beispielsweise Ultraschall, können zur Desorption oder zur Verstärkung der Desorption eingesetzt werden. Es können auch Kombinationen der vorstehenden Desorptionsverfahren ange- wandt werden. Es versteht sich, dass die Nukleinsäuren von dem verwendeten Desorptionsverfahren nicht zersetzt werden dürfen.

Die oben beschriebenen Schritte beruhen auf der Erkenntnis, dass eine Nukleinsäurebibliothek sich analog einer Proteinmischung mittels der Affinitätschromatographie räumlich nach Massgabe der Affinität zum Targetmolekül, im hier beschriebenen Fal, für APP (etc. ), trennen lässt. Die Erfindung beruht weiterhin auf der Erkenntnis, dass eine mittels unspezifischer Desorption sich einstellende Vermengung desorbierender Nukleinsäuren verschie- dener Affinität dadurch vermeidbar ist, dass vor der unspezi- fischen Desorption die Säule mit den darin gebundenen Nukle- insäuren gleichsam in Affinitätsabschnitte aufgeteilt und die in den so erhaltenen Affinitätsabschnitten bzw. Säulensegmenten ge- bundenen Nukleinsäuren sich leicht und ohne störende Liganden- koppelungen beispielsweise im Rahmen einer PCR oder RT-PCR un- spezifisch desorbieren und ebenso unspezifisch amplifizieren lassen. Subsequente Selektionsartefakte werden vermieden. Ebenso wenig sind Liganden, insbesondere hohe Konzentrationen an Liganden, zur Desorption erforderlich. Schließlich stehen prak- tisch alle gebundenen und dann desorbierten Nukleinsäuremoleküle für eine Amplifikation zur Verfügung. Dies erlaubt es, mit geringen Nukleinsäurekonzentrationen zu arbeiten. Es ist grund- sätzlich bereits ausreichend, wenn in der Nukleinsäurebibliothek jede Spezies im statistischen Mittel mit einem Molekül vertreten ist. Wenn die Anzahl der APP-Moleküle in einem Säulensegment statistisch 1 beträgt, dann können sogar einzelne Nukleinsäure- spezies nach ihrer Affinität zum Targetmolekül getrennt werden.

Ein besonderer Vorzug dieses Verfahrens ist nachfolgend erläu- tert. Die Auftrennung der Nukleinsäuren nach Affinität führt dazu, dass Nukleinsäuren in einem Säulensegment eine ähnliche Affinität bei unterschiedlicher Spezifität (unterschiedliche Re- gionen von APP werden gebunden bzw. sind Bindungsstellen für die APP-Affinitätsnukleinsäuren) aufweisen.

Grundsätzlich reicht es aus, wenn ein Segment, welchem eine ge- wünschte Affinität zugeordnet ist, (isoliert) zur Desorption weiterverarbeitet wird. Dies setzt allerdings-außer bei ma- ximaler Affinität, wobei das, bezogen auf den Volumenstromvek- tor, erste Säulensegment weiter verarbeitet wird-eine Vorstel- lung über die Affinitätsverteilung bei der aufgetragenen Nukle- insäurebibliothek voraus. Bevorzugt ist es daher in der Regel, dass die immobilisierten Nukleinsäuren aus jedem Segment separat desorbiert und gewonnen werden unter jeweiliger Zuordnung der Laufwegkoordinaten jeden Segments zu den daraus gewonnenen Nu- kleinsäuren.

Grundsätzlich ist jede Art der Desorption möglich. Vorzugsweise wird die unspezifische Desorption mittels üblicher physikoche- mischer oder thermischer Verfahren durchgeführt wird. Thermische Desorption erfolgt durch Erwärmung des Säulensegments bzw. der darin enthaltenen Lösung. Die Erwärmung kann beispielsweise durch elektrische Beheizung oder Einstrahlung von Mikrowellen oder IR erfolgen. Insbesondere sind die Erwärmungstechniken aus der PCR Technologie geeignet. Neben der Amplifikation von Nukle- insäuren bzw. Aptameren mittels Polymerase können selbstver- ständlich auch andere Amplifikationsverfahren, wie beispiels- weise mittels Ligase, angewandt werden. Die unspezifische Desorption kann durch chemische Modifikation von APP unterstützt werden, z. B. Oxidation durch Natriumperjodat oder dergleichen, oder durch unspezifische Komplexbildung, z. B. mittels Borat oder dergleichen zur Blockierung von cis-trans-Diolbindungen in Kohlenhydraten.

Daher ist es bevorzugt, wenn die unspezifische Desorption durch thermische Desorption in einer, vorzugsweise verlängerten Hochtemperaturphase einer PCR oder RT-PCR durchgeführt wird.

Hierbei wird ein Synergieeffekt erzielt, da in aller Regel, ins- besondere beim Arbeiten mit Nukleinsäurebibliotheken mit nied- rigen Konzentrationen der Nukleinsäurespezies, eine Amplifi- zierung ohnehin erforderlich ist. Zur Erhöhung der Ausbeute wird beispielsweise mit 5 bis 60, vorzugsweise mit 20 bis 60, höchstvorzugsweise mit 45 bis 55, Zyklen gearbeitet. Im Rahmen der Amplifikation kann mit mindestens einem markierten Primer gearbeitet werden. Der Primer kann mindestens eine Endonuklease- schnittstelle aufweisen. Eine solche Schnittstelle dient bei- spielsweise dazu, das Amplifikat von größeren Bereichen der Primersequenz zu befreien. Nukleotidbausteine, sei es im Primer oder bei den zu selektierenden Nukleinsäuren, können beispiels- weise mittels Fluoreszenzfarbstoffen markiert sein. Als Fluo- reszenzfarbstoffe seien beispielsweise genannt : Alexa TM Fluor 488, Fluor 532, Fluor 546, Fluor 568, Fluor 594, Oregon Green 488, Fluorescein, Rhodamine 6G, Tetramethylrhodamine, Rhodamine B und Texas Red. Das Amplifikat kann auch durch zwei verschie- dene chemische Modifikationen an verschiedenen Enden markiert sein, sofern die bei der Modifikation eingeführten Gruppen ge- eignet sind, als Liganden jeweils an einer unterschiedlichen Af- finitätsmatrix gebunden werden zu können.

Es empfiehlt sich, zur sicheren Abtrennung nicht-affiner oder niedriger-affiner Nukleinsäuren zwischen geeigneten Verfah- renstufen Waschverfahrensschritte einzufügen. Insbesondere ist es bevorzugt, wenn zwischen den Verfahrensschritten d) und e) zumindest ein Waschverfahrensschritt durchgeführt wird. Zum Waschen ist beispielsweise das Lösungsmittel bzw. das Medium der Nukleinsäurebibliothek bzw. die Trägersubstanz geeignet.

Bevorzugt ist es, wenn die innenseitige Belegung der Säule mit APP (etc. ) und dessen Immobilisierung mittels kovalenter Bindung, vorzugsweise nach Aktivierung mit chemisch hochre- aktiven Gruppen (beispielsweise Tresylchlorid, Cyanbromid und/oder Periodat) oder über bifunktionale Spacerverbindungen nach Modifikation mit chemisch wenig reaktiven Gruppen (bei- spielsweise Amin, Hydroxy, Keto und/oder Carboxyl), durchgeführt wird. Beispiele für Spacergerüste geeigneter Spacerverbindungen sind : substituierte und unsubstituierte C2-C10 Alkylgruppen, substituierte und unsubstituierte C2-C10 Alkenylgruppen, sub- stituierte und unsubstituierte C2-C10 Alkynylgruppen, substitu- ierte und unsubstituierte C4-C7 Carbocylo alkylgruppen, sub- stituierte und unsubstituierte C4-C7 Carbocylo alkenylgruppen, substituierte und unsubstituierte C7-C14 Aralkylgruppen, ein he- terocyclisches Molekül mit Heteroatomen ausgewählt aus Stick- stoff, Sauerstoff, Schwefel, wobei besagte Substitutionen be- stehen können aus Alkyl, Alkenyl, Alkynyl, Alkoxy, Thiol, Thio- alkoxy, Hydroxyl, Aryl, Benzyl, Phenyl, Nitro, Halogen, Äthergruppen mit 2 bis 10 Kohlenstoffatomen und 1 bis 4 Sauer- stoff oder Schwefel Atomen, Polyalkyl glycol, Halogen, Hydroxyl, Thiol, Keto, Carboxyl, Amide, Ätherverbindungen, Thioäther, Ar- nidinederivaten, Guanidinederivaten, Glutamylderivaten, Nitrat (ON02), Nitro (NO2), Nitril, Trifluoromethyl (-CF3), Trifluorome- thoxy (-OCF3), 0-Alkyl, S-Alkyl, NH-Alkyl, N-Dialkyl, 0-Aralkyl, S-Aralkyl, NH-Aralkyl, Amino, Azido (N3), Hydrazino (NHNH2), Hy- droxylamino (ONH2), Sulfoxide (SO), Sulfone (SO2), Sulfide (S-), Disulfide (S-S), Silyl bestehen kann. Spacerverbindungen sind typischerweise bifunktional, wobei die Funktionalitäten gleich oder verschieden sein können und beispielsweise ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus"N-Hydroxysuccinimid und Hydrazide".

Zur Verringerung der Varietät innerhalb der aus einem Säulenseg- ment erhältlichen Nukleinsäuren ist es bevorzugt, wenn jedes Säulensegment im statistischen Mittel 0,1 bis 103, vorzugsweise 1 bis 102, höchstvorzugsweise 1 bis 10, APP (etc. )-Moleküle ent- hält. Hierauf abgestimmt kann die Nukleinsäurebibliothek, wie aufgetragen, im statistischen Mittel 0,1 bis 103, vorzugsweise 1 bis 102, höchstvorzugsweise 1 bis 10, Nukleinsäuremoleküle einer Spezies enthalten.

Für das Strukturmaterial der Säule kommen grundsätzlich alle beispielsweise aus der Affinitätschromatographie bekannten Werk- stoffe in Frage. Hierzu gehören Säulen aus Kieselgel oder Poly- mere, wie Polyethylen nach Aktivierung durch chemische De- rivatisierung oder Plasmaaktivierung. Die Länge der Säulenseg- mente liegt zweckmäßigerweise im Bereich von 0, 1 um bis 1 mm, vorzugsweise 0,1 bis 100 um, höchstvorzugsweise 0,5 bis 10 um.

Solche Schnitte lassen sich unschwer beispielsweise mittels eines Mikrotoms herstellen. Der Innendurchmesser der Säule liegt zweckmäßigerweise im Bereich von 0,05 bis 1 mm, vorzugsweise von 0,1 bis 0,5 mm, höchstvorzugsweise von 0,2 bis 0,4 mm.

Zweckmäßig ist es, wenn vor der eigentlichen Trennung (Bindung oder mechanische Auftrennung) der Nukleinsäuren unerwünschte Nu- kleinsäuren eliminiert werden. Unerwünschte Nukleinsäure sind beispielsweise Nukleinsäuren, welche an APP-freie Innenoberflä- chen der Säule binden. Dann kann eine APP-freie Säule vorge- schaltet-und die Nukleinsäurebibliothek zuvor hierdurch geleitet werden.

Bei den vorstehenden Verfahrensweisen kann kontinuierlich, i. e. beispielsweise durch Hintereinanderschalten von Säulen, oder diskontinuierlich, beispielsweise durch zwischenzeitliches Auf- fangen des Eluenten aus der Vorsäule, gearbeitet werden.

Zur Erzielung einer weiteren Verbesserung der Affinitätstrennung kann grundsätzlich auf verschiedene Weisen verfahren werden. So können die aus einem oder mehreren Segmenten desorbierten Nukle- insäuren, ggf. nach Amplifikation wiederholt den erfindungsgemä- ßen Verfahren unterworfen werden, und/oder die Elutropie der Be- dingungen bei der Desorption kann erhöht werden (Temperatur, Ionenstärke, pH-Wert, Pufferbedingungen). Alternativ kann die Raumdichte von APP und folglich der gebundenen Nukleinsäuren, i. e. die Anzahl der APP-Moleküle, in einem Säulensegment ver- ringert werden.

APP-bindende Aptamere (die erfindungsgemäß wie oben definiert auch Aß42 bindende Aptamere miteinschließen) sind daher ebenfalls bevorzugte APP bindende Rezeptoren im Rahmen der vorliegenden Erfindung.

Erfindungsgemäß werden daher die APP-bindenden Rezeptoren, die vorzugsweise aus Peptiden, Antikörpern oder Nukleinsäuren be- stehen, an ein geeignetes Trägermaterial zur extra-korporalen Eliminierung von APP und dessen proteolytischen Abbauprodukten in Alzheimer- (Risiko-) Patienten verwendet.

Bei der Anwendung der vorliegenden Erfindung in medizinischer Routinepraxis ist es erforderlich, dass der Träger steril und pyrogenfrei ist, so dass jede Trägersubstanz bzw. jede Rezeptor-/Träger-Kombination, die diese Merkmale erfüllt, er- findungsgemäß bevorzugt ist (siehe z. B. US 6 030 614 oder US 5 476 715). Zu den geeigneten Beispielen zählen poröse Homopolyme- re, Co-oder Terpolymere von Vinyl enthaltenden Monomeren (z. B.

Acryl-Säure, wie z. B. TSK Toyopearl, Fractogel TSK), Träger mit Modifkationen (Aktivierungen) mit Oxiran enthaltenden Ver- bindungen (z. B. Epichlorohydrin) und gegebenenfalls weiteren Re- aktionen mit NH3, Amino oder Carboxyl enthaltenden Verbindungen, oder CNBr oder CNCl-Adsorbientien, wie in der EP 110 409 A und der DE 36 17 672 A beschrieben. Besonders bevorzugte Ad- sorptionsmaterialien für therapeutische Zwecke sind geeignet, einen Verlust von Blutzellen zu vermeiden, aktivieren das Kom- plementsystem nicht oder nur geringfügig und halten eine Aggre- gatbildung im extra-korporalen Kreislauf möglichst hintan.

Weiters sollten die eingesetzten Trägermaterialien vorzugsweise auch in rezeptorgekoppelter Form ausreichend stabil gegenüber Sterilisierungsmaßnahmen sein, insbesondere gegenüber Ethylen- Oxid-Sättigung, Glutaraldehyd-Sättigung, Gamma-Bestrahlung, Dampfbehandlung, UV-Behandlung, Lösungsmittelbehandlung und/oder Detergensbehandlung, etc.. Beispielsweise können auch Produkte auf Sepharose-, Agarose-, Acryl-, Vinyl-, Dextran-etc.-Basis eingesetzt werden, die vorzugsweise geeignete funktionelle Gruppen zur Anbindung der APP bindenden Rezeptoren bereits kom- merziell erhältlich aufweisen. Weitere geeignete Träger schließen auch Monolithe ein (Träger auf Basis von quervernetz- ten Glycidylmethacrylat-co-ethylenglykoldimethacrylat-Polymer) Subpol (Poschalko et al., J Am Chem Soc. 2003 Nov 5 ; 125 (44) : 13415-26.).

Zur Kopplung der Rezeptoren an die geeigneten Träger ist die dem Fachmann bekannte Chemie einsetzbar (z. B. Bioconjugate Techni- ques, Greg T Hermanson, Ed., Academic Press, Inc, San Diego, CA, 1995,785pp).

Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Bereitstel- lung einer Behandlung oder Behandlungsvorrichtung der Alz- heimer'schen Erkrankung oder zur Vorbeugung einer derartigen Erkrankung, indem die Vorrichtung geeignet zur Behandlung des jeweiligen Patienten hergerichtet wird. Bei der Durchführung der Behandlung wird ein Patient für eine zur effektiven Eliminierung von APP-Polypeptiden ausreichende Zeitdauer an die Apherese-Ap- paratur angeschlossen, wobei der Blut-oder Plasmafluss des Pä- tienten mit dem festen Träger, umfassend den APP bindenden Rezeptor, kontaktiert wird, worauf APP und/oder die proteoly- tischen Abbauprodukte von APP, insbesondere Aß42, gebunden werden. Im Zuge der Apherese-Behandlung sind natürlich periphe- rer oder zentralvenöser Venenzugang bzw. arterievenöse Fistel sicherzustellen, ebenso wie ausreichende Antikoagulation, sowie die erforderlichen Quantifizierungs-und Messdaten aufzuzeich- nen. Weiters wird bei den meisten Apherese-Verfahren eine Primär-Trennung von Plasma und Blutzellen vor der eigentlichen Plasmabehandlung erforderlich sein. Besondere Personen, bei denen eine vorbeugende Maßnahme erforderlich ist, sind familiär belastete Personen, ältere Personen (>50, >60 oder >70 Jahre) oder Personen mit einem anderen Risikofaktor für AE, insbesonde- re genetische Faktoren.

Die Erfindung wird anhand der nachfolgenden Beispiele sowie der Zeichnungsfiguren, auf die sie selbstverständlich nicht einge- schränkt ist, näher erläutert.

Es zeigen : Fig. 1 : die Bindung von Aß42 an das Peptid 1208 (gekoppelt an BSA und an ELISA Platte ge-coated) ; Fig. 2 : die Bindung von Peptid 1208 (und 1208-BSA) an Aß42 (ge- coated an ELISA Platte) ; Fig. 3 : die kompetitive Bindung von Aß42 an 1208-BSA.

1. Herstellung des APP-Rezeptor tragenden Trägers 1.1 Monolithische Säule Eine CIMEpoxy Monolithic Säule (BIA Separations, SI) wird gemäß den Angaben des Herstellers mit 0,5 M Na-Phosphat-Puffer bei pH 8,0 äquilibriert und ein monoklonarer Antikörper gegen Aß Peptid ebenfalls gemäß Herstellerangaben aktiviert und an die CIM-Säule gekoppelt. Die Säule wird mehrfach mit Phosphat-Puffer gewaschen (+ 1 M NaCl) und überschüssige Epoxy-Gruppen gegebenenfalls noch blockiert.

Qualitätssicherung wird mittels Kontrolle im Wasch-und Äquilibrationseluat durchgeführt ; nur Säulen ohne aktive Epoxy- Gruppen und ohne Antikörper-Leakage im Eluat werden weiterver- wendet und in eine Apharese-Apparatur eingebaut.

1.2 Sepharose-Säule Ein Agarose Bulk-Material (Sepharose CL4B) wird aseptisch in einen sterilen und pyrogenfreien Behälter gefüllt und das Mate- rial aseptisch gewaschen, wobei zwischen jedem Waschschritt das Gelmaterial völlig unter Vakuum getrocknet wird. Die Sepharose wird anschließend für 30 Minuten bei 115°C im Autoklaven dampfs- terilisiert.

Nach der Sterilisierung wird die Sepharose in einem sterilen Be- hälter in 60% Aceton/Wasser aufgenommen und mit CNBr und Trie- thylamin aktiviert (14 g CNBr pro 96 ml Acton ; 30 ml Triethylamin in 66,2 ml 87 % igem Aceton). Dann wurde eine Ace- ton/HCl-Lösung zugesetzt (392 ml steriles, pyrogenfreies Wasser ; 16,3 ml 5 N HC1, 408 ml Aceton). Die aktivierte Sepharose wird gewaschen und innerhalb von 2 h der Kopplungsreaktion zuge- führt, um die Hydrolyse von aktivierten Gruppen zu verhindern.

Eine sterilfiltrierte Antikörper-Lösung (m266 bzw. m243) wird in das Reaktionsgefäß eingebracht und für mindestens 90 min ge- rührt. Schließlich wird die Reaktionslösung gründlich gewaschen (mit isotonischem Phosphat-Puffer), bis keine Reaktionsprodukte im Eluat nachweisbar sind, und die Antikörper-gekoppelte Sepha- rose in sterile und depyrogenisierte Glassäulen mit Glassintern gefüllt und einer abschließenden Qualitätskontrolle unterzogen (Eluatanalyse hinischtlich Reaktionsprodukten, Schwermetallen etc. ; Partikelanalyse, Pyrogenizität ; Sterilität).

2. Tiermodell für die Apherese-Behandlung von Alzheimer-Pati- enten Im Institut für Diabetes"Gerhardt Katsch"ist ein miniaturi- siertes extrakorporales System zur Anwendung der Apherese-Thera- pie am Kleintiermodell Ratte entwickelt worden. Ein derar-tiges Apherese-Testsystem ist weltweit nur sehr begrenzt verfüg-bar.

Die wiederholte Apherese-Behandlung beim gleichen Ver-suchstier und sich daran anschließende Untersuchungen in der Nachbeobach- tungsphase zur Beurteilung des Therapieerfolges haben einen ho- hen Neuheitswert und sind im internationalen Schrifttum bisher nicht beschrieben worden.

Die Apherese ist ein alternatives Therapieverfahren, bei dem Blut außerhalb des Körpers krankheitsverursachende Substanzen entzogen werden. In der Humanmedizin ist die Apherese bisher zur Behandlung von mehr als 100 Krankheiten eingesetzt worden. Mit Hilfe der Apherese konnten krankheitsrelevante Substanzen u. a. bei Autoimmunerkrankungen wie rheumatoider Arthritis, Myasthenia gravis, endokriner Ophthalmopathie, Multipler Sklerose, systemi- schem Lupus erythematosus, Stiff-Man-Syndrom und Typ-l-Diabetes vollständig oder zumindest teilweise aus dem Blut entfernt wer- den. Bisher wird die Apherese jedoch nur als alternatives Ver- fahren zur Behandlung von Therapie-resistenten chronischen Er- krankungen, die mit starken Belastungen und einer deutlichen Einschränkung der Lebensqualität der betroffenen Patienten ver- bunden sind, anerkannt. Ein wesentlicher Grund dafür ist, dass bisher keine detaillierten Kenntnisse zu den Wirkmechanismen ei- ner erfolgreichen Apherese-Therapie vorliegen.

Durch Verwendung anerkannter Tiermodelle, wie z. B. für den Typ- 1-Diabetes und die rheumatoide Arthritis, können sowohl die Wirkmechanismen der Apherese-Verfahren weiter aufgeklärt als auch neuartige Indikationsstellungen für die Apherese-Behandlung präklinisch getestet werden. Für die Durchführung von Apherese- Behandlungen werden die Versuchstiere zunächst mit chronischen Gefäßkathetern versehen. Im extrakorporalen Kreislauf werden an- schließend die plasmatischen und zellulären Bestandteile des Blutes über Plasmafilter getrennt. Während die zellulären Be- standteile sofort an das Tier zurückgehen, kann das Plasma vor der Rückführung durch verschiedene Adsorptionsverfahren (Immun- <BR> <BR> adsorption o. a. ) gereinigt werden. Die gute Verträglichkeit sol- cher wiederholter Apherese-Behandlungen ist bereits für ver- schiedene Rattenstämme belegt worden (Körpermasse, Hämatokrit, Allgemeinzustand). Das Apherese-Testsystem ist bei Tieren mit einem Mindestgewicht von 250g erprobt und an Ratten-Modellen für Autoimmunerkrankungen (Typ-1-Diabetes, Kollagen Typ II-indu- zierte Arthritis) eingesetzt worden.

Das extrakorporale System zur Plasmapherese am Kleintiermodell kann für verschiedene Arten der Adsorption herangezogen werden.

Die Anwendung dieses Testsystems an Modellen für chronische Er- krankungen ermöglicht (A) die Erprobung neuer Behandlungs-und Präventionsstrategien, (B) die Entschlüsselung der Wirkmechanis- men verschiedener Apherese-Technologien und (C) die Ermittlung der Indikationsstellung für einzelne Apherese-Therapieverfahren.

Das IDK ist Ihr kompetenter Partner bei der präklinischen Tes- tung neu entwickelter Apherese-Verfahren und kann wesentlich zur Überführung und Markteinführung neuer therapeutischer Verfahren von der Entwicklungsphase über die tierexperimentelle Erprobung bis hin zur klinischen Anwendung beim Patienten beitragen (http ://www. praeklinik. de/).

Vor Beginn der experimentellen Apherese-Therapie werden die Tie- re mit arteriellen und venösen Kathetern versehen, beziehungs- weise es werden chronisch katheterisierte Ratten (Gefäßkatheter, die zur Applikation von Testsubstanzen und zur Blutproben-ent- nahme sowie zur Durchführung der Apherese-Therapie und der Clamp-Untersuchungen im Tiermodell geeignet sind) eingesetzt. In einem ersten Schritt werden bei der Apherese zunächst Blut- zellen und Plasma mittels Plasmafilter getrennt. Während die Blutzellen unmittelbar in das Tier refundiert werden (über den venösen Katheter) wird das getrennte Plasma an dem in Beispiel 1 hergestellten Adsorptions-Mittel vorbeigeführt (wobei die Ligan- den durch Bindung an die immobilisierten Affinitätspeptide aus dem Plasma abgetrennt werden), bevor es dem Tier wieder zuge- führt wird.

3. Aß42-Aptamere 3.1 Aktivierung einer Kieselgelsäule mit Tresylchlorid Die Säule wird mit Aceton durchspült. Zur Aktivierung wird eine wasserfreie Lösung (2 ml Aceton, 1 ml Tresylchlorid, einige Tropfen Pyridin) durch die Säule gegeben (10faches Säulenvolu- men) und diese über Nacht auf Eis inkubiert. Anschließend wird die Säule mit dem 20fachen Säulenvolumen 100% Aceton (wasserfrei) durchspült. Die aktivierte Säule kann in 1 mM HCl aufbewahrt werden.

3.2 Aktivierung einer Polyethylensäule Ein Polyethylenschlauch wird mit dem 20fachen Säulenvolumen bei Raumtemperatur mit einer Lösung (2% Kaliumpermanganat (KMnO4) (w/v) in konzentrierter Schwefelsäure (H2SO)) und anschließend mit destilliertem Wasser durchspült. Zur weiteren Kopplung der Säulenoberfläche können bi-oder polyvalente Moleküle zum Cross- linking verwendet werden, die mindestens eine reaktive Aldehyd- gruppe (z. B. 1% Glutaraldehyd) aufweisen. Diese werden für 1 h bei 4° C durch die Säule gegeben. Anschließend wird die Reaktion durch reduzierende Bedingungen (z. B. durch Natrium Cyanoborhy- drid (0. 00025% w/v in 0.15 M NaCl, pH 3,9) stabilisiert.

3.3 Koppelung von Aß42 an die aktivierte Kieselgelsäule Die Tresylchlorid-aktivierte Säule wird mit 0,1 M Na2C03 (pH 8,5) durchspült. Zur Koppelung wird ein Peptid oder Protein (2 mg/ml 0,1 M Na2CO3, pH 8,5) mehrfach für 2 h bei 37° C und anschließend für 4 h auf Eis durch die Säule gegeben. Zur Blockierung freier Bindungstellen der Säule wird anschliessend ein Überschuss von 0,2 M Glycin, pH 8 für durch die Säule gegeben.

3.4 Koppelung eines Glykoproteins an die aktivierte Polyethylen- säule Die aktivierte Säule wird mit 0,1 M Na2CO3 (pH 8,5) durchspült.

Zur Koppelung wird Aß42 (2 mg/ml 0,1 M Na2C03, pH 8,5) mehrfach für 2 h bei 37° C und anschließend für 4 h auf Eis durch die Säule gegeben. Zur Blockierung freier Bindungstellen der Säule wird anschließend ein Überschuss von 0,2 M Glycin, pH 8 durch die Säule gegeben. Zur Verbesserung der Reaktion kann l-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimid (EDC), 5% w/v zugegeben werden).

3.5 Herstellung einer Säule zur Eliminierung unerwünschter Mole- küle Die Tresylchlorid-aktivierte Säule wird mit 0,1 M Na2CO3 (pH 8,5) durchspült. Soll gegen ein Molekül mit einer oder mehreren primären oder sekundären Aminen die Elimination erfolgen wird dieses Molekül oder das Gemisch (2 mg/ml 0,1 M Na2C03, pH 8,5) mehrfach über Nacht bei RT durch die Säule gegeben. Zur Blo- ckierung freier Bindungstellen der Säule wird anschließend ein Überschuss von 0,2 M Glycin, pH 8 für durch die Säule gegeben.

Wird keine Elimination gegen bestimmte Moleküle mit einer oder mehreren primären oder sekundären Aminen gewünscht, werden alle Bindungstellen der Säule mit Glycin blockiert.

Weitere Derivatisierungsverfahren finden sich beispielsweise in den folgenden Literaturstellen : Patterson, W. J., National Aero- nautics and Space Administration, Technical Memorandum, NASA TMX-73311, U. S. Government Printing Office, Washington, D. C., 1976, Ma, S. M., Gregonis, D. E., von Wagenen, R. A., and Andrade, J. D., in"Hydrogels for Medical and Related Applica- tions" (J. D. Andrade, Ed. ), Amer. Chem. Soc. Symp. Series, Vol.

31, p. 241,1976, Harris, J. M., Struck, E. C., Case, M. G., Pa- ley, M. S., Van Alstine, J. M., and Brooks, D. E., J. Polymer Sci., Polymer Chem. Ed., 22,341 (1984), Regnier and Noel, Reg- nier, F. E., and Noel, R. J., J. Chromatog. Sci., 14, (1976), Yalpani, M. and Brooks, D. E., J. Polymer Sci., Polymer Chem.

Ed., 23,395 (1985).

3.6 Durchführung des Kontaktes der Nukleinsäuren an Aß42 und Trennung der Säule Die beschichteten Säulen werden Leckage frei hintereinander ge- schaltet, erst die Säulen zur Elimination unerwünschter Molekü- le, anschließend die Aß42-Säule. Zur Äquilibrierung wird ein geeigneter Puffer, z. B. eine Pufferlösung (10 mM Tris-HCl, 50 mM KC1, 1,5 mM MgCl2 und Gelatine 0, 001% (w/v), pH 8,3), für 1 h auf Eis über die Säule gegeben. Die Nukleinsäuren der kombinato- rischen Nukleinsäurebibliothek werden in 1 ml des gleichen Puf- fers aufgenommen und zum Aufschmelzen von Doppelsträngen für 10 min auf 95° C erwärmt und anschließend mehrfach (4-30mal) über die Säule gegeben. Anschließend werden die Säulen getrennt und über Nacht auf Eis mit dem gewählten Puffer (s. o.) gewaschen.

Die Auftrennung der Säule in Strömungsrichtung erfolgt mit einem geeigneten Schneidwerkzeug.

4. Bindungsstudien von Aß42 an Peptid 1208 (FGFPEHLLVDFLQSLS-C) Zur Analyse der Amyloid-beta Bindung an das Peptid 1208 wurde zunächst das Peptid an ein Trägerprotein (BSA) gekoppelt, wobei die Peptidkonzentration 500pMol (ca. lmg/ml) betrug. Das 1208- BSA Konjugat wurde an eine ELISA Platte gebunden, wobei 100ng Peptid pro Well gebunden wurde. Die ELISA Patte wurde mit PBS, 1% BSA abgesättigt und anschließend wurde die Bindung von Amylo- id-beta (1-42) in einem Konzentrationsbereich von 8-lOOOng/well analysiert. Gebundenes Amyloid-beta wurde mit einem spezifischen Maus Antikörpers nachgewiesen. Mit Hilfe eines biotinylierten anti-Maus Antikörpers und Streptavidin gekoppelter Peroxidase wurde abschließend die Menge an gebundenem Amyloid-beta quanti- fiziert. Als Substrat wurde ABTS eingesetzt und in einem ELISA- Reader bei einer Wellenlänge von 405nm analysiert. (Fig. 1) Zur Analyse der Bindung des Peptides 1208, wurde Amyloid-beta (1-42) an eine ELISA Platte gebunden (500ng pro Well). Die ELISA Patte wurde anschließend mit PBS, 1% BSA abgesättigt und dann freies Peptide 1208 bzw. 1208-BSA Konjugat dazugegeben (1,6- 50ng). Gebundenes Peptid wurde mit einem spezifischen monoklona- len Antikörper detektiert. Zur abschließenden Quantifizierung wurde ein biotinylierten anti-Maus Antikörper und Streptavidin gekoppelte Peroxidase benutzt. Als Substrat wurde ABTS einge- setzt und in einem ELISA-Reader bei einer Wellenlänge von 405nm analysiert. (Fig. 2) 1208-BSA Konjugat wurde an eine ELISA Platte gebunden (100ng Peptid pro Well) und die Patte wurde mit PBS, 1% BSA abgesät- tigt. Anschließend wurde die Bindung von Amyloid-beta (1-42) (lOOOng/well) in Gegenwart von freiem Peptid 1208 oder Kon- troll-Peptid (Konzentrationsbereich 30-2000ng/) analysiert. Die Detektion des gebundenen Amyloid-beta erfolgte wie beschrieben.

(Fig. 3)