El objeto de la presente invención corresponde a una composición natural en base a extracto de polen apícola chileno recolectado por Apis mellifera desde diferentes especies nativas chilenas en flor, tales como Cryptocarya alba, Azara sp., Schinus sp., Echinopsis chiloensis

Kageneckia oblonga, entre otras. El extracto posee una alta utilidad como aditivo en alimentos (preservante, colorante, antioxidante, nutriente) o como coadyuvante antimicrobiano o antioxidante en formulaciones de aditivos alimentarios.

El extracto se obtiene mediante un procedimiento de extracción y producción que comprende, a) secar la corbícula, b) agregar agua destilada, c) mezclar con agitador magnético a 60 ^a C, d) moler y filtrar con papel filtro Whatman N ^a para obtener el extracto final. El procedimiento puede incluir un liofilizado y un encapsulado según se requiere en su aplicación industrial .

i ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La Zona Central de Chile, que se extiende aproximadamente entre el paralelo 30° y 39° LS, se caracteriza por poseer un clima de tipo mediterráneo, con veranos secos y calurosos, e inviernos fríos y húmedos (Di Castri & Hajek, 1976; Montenegro, 2000) . Las zonas de clima mediterráneo en el mundo son escasas, representando sólo el 5% del total de tierras emergidas del planeta, sin embargo, albergan el 25% de la biodiversidad vegetal mundial. Esto implica que dichas regiones poseen altos niveles de endemismo, es decir, que son habitadas por especies que viven exclusivamente en ellas. En el caso de Chile Central, su grado de endemismo corresponde al 48% de su flora (Arroyo & Cavieres, 1997). Debido a esto, la zona Central de Chile ha sido recientemente declarada como sitio prioritario para la conservación de la Biodiversidad o "Biodiversity Hotspot" (Mittermier et al. 1999; Myers et al. 2000). Las características anteriormente expuestas hacen que las zonas de clima mediterráneo se constituyan en sitios especialmente adecuados para la producción y obtención de productos con características únicas e irrepetibles, entre los que se encuentran alimentos de tipo funcional y productos con aditivos alimenticios altamente deseables en términos de nutrición y salud (Basim et al, 2006) . Alimentos Funcionales

Los "alimentos funcionales" son alimentos o componentes en la dieta que pueden aportar un beneficio para la salud más allá de la nutrición básica eligiendo aquellos que pueden aportar beneficios específicos para la salud, como por ejemplo, las frutas y los vegetales, los granos enteros, los alimentos y las bebidas fortificadas o mejoradas y algunos suplementos en la dieta. Los componentes biológicamente activos en los alimentos funcionales pueden aportar beneficios para la salud o efectos fisiológicos deseables (Lee et al 2004). Se están descubriendo atributos funcionales en muchos alimentos tradicionales y a su vez, desarrollando nuevos productos alimenticios con componentes beneficiosos. El interés del consumidor por la relación entre la dieta y la salud ha aumentado la demanda de información acerca de los alimentos funcionales. Los rápidos avances en ciencia y tecnología, el aumento de los costos de los servicios de atención médica, los cambios en las leyes de alimentos afectando las etiquetas con la información nutricional acerca de los productos, una población cada vez más informada y el crecido interés en lograr un bienestar saludable a través de la dieta, se cuentan entre los factores que incrementan el interés por los alimentos funcionales. Antioxidantes en vegetales

Los antioxidantes, las sustancias más requeridas en los alimentos funcionales, son moléculas que actúan como donantes de electrones, estabilizando e inactivando otras moléculas conocidas como radicales libres, que se caracterizan por carecer de un electrón en su estructura, siendo por ello sumamente reactivas con cualquier molécula que pueda donarles ese electrón. En el organismo humano, producto del metabolismo, se generan constantemente radicales libres, por lo que se necesitan antioxidantes que los estabilicen e inactiven, evitando asi el daño que éstos causan al reaccionar con moléculas biológicamente importantes, tales como ácidos nucleicos, ácidos grasos constituyentes de las membranas, y proteínas (Montero 1999) .

Muchos estudios epidemiológicos han demostrado que una alta ingesta de frutas y verduras se asocia con una menor incidencia de cáncer (Poppel, 1996; Weisburger, 1991), especialmente los cánceres al tracto gastrointestinal (Johnson, 2004) . Esto se debe, en parte, a dieta elevada en contenido de antioxidantes de frutas y hortalizas, eficaces en la prevención de enfermedades relacionadas con el estrés oxidativo (Kaur & Kapoor, 2001) . Los antioxidantes se han convertido recientemente en un tema de creciente interés. Sin embargo, los resultados de ensayos aleatorios en busca del posible efecto preventivo de la dieta con suplementos de uno o más antioxidantes han sido contradictorios (Vivekananthan et al, 2003; Lee & Park, 2003; Omenn et al, 1996; Paolini et al, 2003) .

Los alimentos de origen vegetal proporcionan una amplia variedad de antioxidantes dietéticos tales como vitaminas C y E, los carotenoides , flavonoides y otros compuestos fenólicos. La adición y efectos sinérgicos de estos antioxidantes dietéticos con otros compuestos (por ejemplo, minerales) puede aportar beneficios para la salud. Debido a la complejidad de la composición de antioxidantes en los alimentos, su estudio es costoso y además puede tener un valor limitado debido a la misma interacción sinérgica entre los compuestos antioxidantes en una mezcla de alimentos, no considerada al momento de la extracción o en la selección de los métodos utilizados.

Las propiedades biológicas de los antioxidantes dependen de su liberación desde el alimento durante el proceso de la digestión (bioaccesibilidad) y pueden diferir cuantitativa y cualitativamente dependiendo de los procesos de extracción empleados en el estudio, sin embargo, algunos antioxidantes pueden permanecer en los residuos de la extracción de (Pérez- Jiménez & Saura-Calixto, 2005) por lo que su disponibilidad estará limitada por la técnica de extracción empleada (Serrano et al, 2005a, b) .

Antioxidantes y efecto sobre la salud

En países de mayor poder adquisitivo y por ende, dietas con mayor cantidad de antioxidantes (verduras, frutas, vino, miel, polen) , los trastornos asociados a procesos oxidativos son atenuados y de menor incidencia (Howson et al, 1986) . Otras significativas evidencias vinculan a los radicales libres con enfermedades de alta incidencia en la población, como las cataratas oculares (Leske et al, 1991; Taylor, 1992; Knekt, 1992) , las enfermedades cardiovasculares (Gey et al, 1991; Steinberg et al, 1992; Steinberg, 1993; Brighenti et al, 2005), la enfermedad de Alzheimer (Flynn & Ranno, 1999; Markesbery & Carney, 1999) , problemas inmunológicos (Makinodan & Key, 1980) , etc. Las evidencias e investigaciones que indican el aumento de cáncer y nacimientos defectuosos por consumo insuficiente de antioxidantes (McGregor et al, 1990; Bendich & Butterwoth, 1991) junto a la numerosa información científica acerca de la necesidad de incorporar éstos a la alimentación diaria, justifican un mayor consumo de alimentos que contengan micronutrientes . Tipos de antioxidantes

A pesar de su denominación común, existen diferencias entre los diversos antioxidantes dietarios, tanto en términos de su comportamiento químico como en sus propiedades biológicas . Algunos de estos antioxidantes, como las vitaminas C y E, los carotenoides y el Selenio (Se), son bien conocidos; en tanto, otros son novedosos y sus propiedades han comenzado a estudiarse sólo en las últimas 2 décadas, como es el caso de los compuestos fenólicos o polifenoles. Sin embargo, aún no se sabe a ciencia cierta cuál o cuáles de los constituyentes antioxidantes de los alimentos de origen vegetal de la dieta es o son responsables del efecto protectivo contra el daño oxidativo, aunque se supone que esta tarea no radica en una o unas pocas sustancias, sino que en la acción conjunta de varias de ellas.

Los compuestos fenólicos o polifenoles son una gran familia de compuestos elaborados por las plantas como defensa al estrés oxidativo causado por factores abióticos, como la radiación UV, y que por ende se encuentran en muchos alimentos de origen vegetal, como los berries, el té, el vino y los productos apícolas (Hertog et al, 1993b; Tomás-Barberán et al, 1993, 2001; Andrade et al, 1997; Simonetti et al, 1997; Burda & Oleszek 2001; Kahkonen et al, 2001; Miranda-Rottmann et al, i 2002; Wada & Ou, 2002; Kumazawa et al, 2004; Beretta et al, 2005). Los principales polifenoles presentes en nuestra dieta son los ácidos fenólicos, flavonoides y pigmentos como antocianinas y taninos . Un grupo especialmente interesante lo constituyen los flavonoides, de los que ya hay más de 4000 descritos, teniendo muchos de ellos una capacidad antioxidante incluso más alta que las vitaminas A, C y E (Kinsella et al, 1993) además de una interesante actividad antibiótica (Cushnie & Lamb, 2005) .

Numerosos efectos beneficiosos para la salud son atribuidos a los polifenoles y a una dieta rica en antioxidantes. Además de las conocidas capacidades antioxidantes, se ha reportado que los polifenoles dietarios retardan el envejecimiento y muerte celular, evitan el daño sobre el material genético contribuyendo asi a su estabilidad, aumentan la actividad de enzimas desintoxicadoras de toxinas o drogas del hígado y reducen el riesgo de desarrollar enfermedades cardíacas y cáncer (Diplock, 1991; Reddy y Lokesh, 1992; Sánchez-Moreno et al, 1999; Dugas et al, 2000; Middleton et al. 2000; Ferguson 2001; Lu et al, 2001; Fahey & Stephenson 2002; Ha et al, 2003; Schwarz y Roots 2003; Ueda et al, 2003; Pfeffer et al, 2003), de la misma forma en que actúa una dieta rica en compuestos antioxidantes (Clarkson & Thompson 2000; Gemma et al, 2002). Capacidad antioxidante del polen apícola

Innumerables propiedades han sido descritas para los componentes de la colmena, sin embargo, en nuestro pais aún no se han establecido científicamente las propiedades nutricionales del polen apícola. Análisis de composición química y pruebas de actividad antioxidante del polen apícola se han realizado recientemente en algunos centros de investigación alrededor del mundo.

En México, se demostró la buena capacidad antioxidante del polen colectado por A. mellifera (Figura 1) desde flores de Amaranthus hybridus y Prosopis juliflora , medidos por un método de inhibición de peroxidación de lipidos (TBARS) , y del polen de Tapetes sp. y de la mezcla de éste con polen de A. hybridus por el método espectrofotométrico del DPPH (Almaraz- Abarca et al, 2007) . Usando el método del DPPH en Brasil, se probaron 3 diferentes tipos de extractos obtenidos de cargas de polen de Mimosa gemmulata colectadas por la abeja sin aguijón Melipona subnitida (Sarmentó Silva et al, 2006) . Dos de esos extractos exhibieron buenos niveles de actividad antioxidante, aunque menores a antioxidantes comúnmente usados en la industria (ácido ascórbico y BHT) . En Japón, el extracto etanólico de polen de Cistus ladaniferus mostró un alto nivel de actividad antioxidante en comparación con soluciones concentradas de α-tocopherol y ácido ascórbico (Nagai et al, 2002) . Esta buena capacidad es mayor cuando el polen está fresco, disminuyendo con el almacenamiento por más de un año según determinaron Campos et al (2003) con cargas polínicas monoflorales de 12 especies vegetales colectadas en Portugal y Nueva Zelanda. En este estudio se mostró una actividad antioxidante particularmente alta en el polen de Eucalyptus globulus, el cual exhibió también el mayor contenido total de polifenoles.

Una alta concentración de polifenoles ha sido encontrada también en muestras de polen apícola europeo (Kroyer & Hegedus, 2001) , donde se destaca la necesidad y se hace la recomendación de realizar mayor investigación sobre los polifenoles del polen apícola y establecer su relación con la capacidad antioxidante exhibida con este producto. Estudios más recientes también han mostrado una amplia variabilidad en la actividad antioxidante del polen obtenido de flores de una docena de especies en Polonia, la cual parece no tener una relación directa con el contenido total de compuestos fenólicos (Leja et al, 2007) . Además, los compuestos fenólicos del polen corbicular, al contrario de los encontrados en otros productos de origen vegetal o apícola, se encuentran como agliconas, esto es, no están glicosilados o unidos a carbohidratos, pues el enlace que los une se rompe cuando la abeja mezcla el polen colectado con su saliva y secreciones de sus glándulas hipofaringeas, lo que incrementa las posibles bioactividades de los compuestos fenólicos del polen apícola (Serra-Bonvehí et al, 2001) .

Existe evidencia de la eficiencia del tratamiento con antioxidantes del polen en pacientes con Síndrome de Fatiga Crónica (CFS) , enfermedad relativamente común en personas de edad avanzada, la que es causada por daño oxidativo y fallas en los mecanismos de protección antioxidante del cuerpo, entre otras razones. En un estudio de 3 meses realizado en Suecia en 22 pacientes con CFS, se les dio un extracto de polen sueco con alto contenido de polifenoles, mientras a otro grupo se le aplicó un placebo. Se observó una mejora estadísticamente significativa en el grupo tratado con el extracto de polen, disminuyendo principalmente la fatiga, los problemas de insomnio y la hipersensibilidad . Además, hubo disminución muy significativa en la fragilidad de los eritrocitos, que constituye una forma de detección del daño oxidativo (Ockerman, 2000) . El investigador a cargo reconoció el efecto sinérgico de los antioxidantes y sugiere el uso de extractos de polen en futuras combinaciones para tratamientos de esta enfermedad . Por otro lado, las propiedades biológicas del polen producido en las más diversas regiones del mundo han sido ampliamente estudiadas, destacando su capacidad antioxidante relacionada a su alto contenido de compuestos fenólicos y pigmentos ( irzoeva et al, 1997; Burdok, 1998; Bankova & Marcucci, 2000; Drago et al, 2000) . Algunos nuevos compuestos bioactivos también han sido detectados en muestras de propóleos nacionales (Valcic et al, 1998 y 1999; Muñoz et al, 2001a y b) . Estas propiedades convierten al polen en una excelente alternativa para su uso en la industria de los alimentos, usadas como aditivos alimenticios.

Actualmente, por el cada vez mayor rechazo del público al uso de preservantes sintéticos, existe un creciente interés por el uso de aditivos naturales que cumplan con el objetivo de preservar los alimentos, y el polen se transforma asi en una interesante alternativa para ser utilizada con ese objetivo en la industria de los alimentos.

Por su parte, los pigmentos vegetales, tales como los carotenoides presentes en el polen apícola, juegan roles fundamentales en la protección contra la foto-oxidación y el daño causado por especies reactivas de oxígeno en tejidos fotosintéticos , siendo ésta su principal función en este tipo de tejidos. Son pigmentos liposolubles encontrados en frutas y vegetales verdes, amarillos, anaranjados y rojos. Hay pigmentos bien conocidos, tales como a- y β-caroteno, licopeno, luteina, astaxantina y zeaxantina. Aproximadamente 700 carotenoides son encontrados en la naturaleza pero sólo 50 de ellos pueden ser absorbidos y metabolizados por el cuerpo humano, algunos de éstos, como el β-caroteno, sirven como precursores de la vitamina A (Bartley & Scolnik, 1995). Los carotenos han probado su eficacia en estabilizar especies reactivas de oxigeno y en atrapar oxigeno libre convirtiéndose en una importante pieza dentro de la barrera antioxidante (Bartley & Scolnik, 1995; Granato, 2003) . Además, ellos también tienen muchas otras actividades fisiológicas establecidas: pueden estimular el sistema inmunológico mejorando la función inmune (Jyonouchi et al, 1991 y 1993, 1994; Okai & Higashi-Okai, 1996; Bennedsen et al, 1999), reduce la mutagénesis e inhibe las transformaciones celulares. Estudios epidemiológicos han establecido una correlación inversa entre ingesta de carotenoides e incidencia de algunos tipos de cáncer (Granato, 2003) .

En relación a esto, se han efectuado estudios epidemiológicos donde se ha correlacionado una dieta rica en carotenoides con una disminución en el riesgo de desarrollar ciertos tipos de cáncer, enfermedades coronarias y algunas enfermedades degenerativas (Bendich, 1994) . Su capacidad de prevenir el cáncer es generalmente atribuida a la actividad antioxidante de los carotenoides (Seis et al. 1992), Sin embargo, aún en los países desarrollados, la ingesta diaria de β-caroteno en la población es 4-5 mg inferior a la ingesta recomendada

(Lachance, 1988) . Esta deficiencia puede compensarse con suplementos o bien con la ingesta de alimentos ricos en carotenoides. Los carotenoides usados actualmente son extraídos desde las plantas o producidos por síntesis orgánica

(Pfander, 1992). Sin embargo, existe un público cada vez mayor que está prefiriendo el uso de alimentos ricos en pigmentos por sobre los suplementos obtenidos por procesos artificiales.

El polen chileno ha sido identificado como una buena fuente de carotenoides (Montenegro et al, 1997), no obstante, las propiedades biológicas y químicas de estos pigmentos en el polen apícola aún permanecen inciertas. Por otro lado, el polen también representa una excelente fuente de proteínas de origen vegetal, siendo uno de los pocos alimentos de dicho origen que contiene todos los aminoácidos, además de fibra dietética, vitaminas y minerales (Serra-Bonvehí & Escolá- Jordá, 1997) lo que posiciona al polen apícola como una buena alternativa para dietas y tratamientos médicos donde el consumo de carne y grasas de origen animal debe reducirse. La constatación de que los productos apícolas heredan propiedades de las plantas melíferas, permite suponer que se encontrarán nuevos productos con propiedades diferenciables en otros productos de la colmena, que permitirán generar nuevas oportunidades de negocios con nuevas aplicaciones en la industria alimentaria humana, específicamente en lo relativo al polen, del cual se sabe que tiene propiedades nutritivas y como pigmentos, sin embargo, este conocimiento no cuenta a la fecha con una base científica que permita establecer y constatar las propiedades de los diferentes pólenes según su origen botánico, y más aún, profundizar en la búsqueda de principios activos que sirvan de modelo para nuevas formulaciones de productos comerciales en el ámbito de los aditivos funcionales para la industria agro-alimentaria.

Antecedentes preliminares

El grupo del Laboratorio de Botánica de la Facultad de Agronomía e Ingeniería Forestal de la Pontificia Universidad Católica dirigido por la Profesora Gloria Montenegro, que presenta esta propuesta y gracias al financiamiento de CONICYT (Proyecto Fondef D03I-1054), ha abordado la investigación pionera en este campo comenzando con la miel, a través de la presentación de dos patentes comerciales para productos elaborados a partir de extractos fenólicos de mieles monoflorales de dos plantas nativas de Chile, los cuales han exhibido excelentes propiedades antibacterianas y antioxidantes (Montenegro et al, 2005a y b; Montenegro & Pizarro, 2007). Luego de ello, los esfuerzos fueron dirigidos a estudiar las propiedades del polen, cuyas características bioquímicas, especialmente su contenido de compuestos fenólicos y sus propiedades antioxidantes sólo en los últimos años han comenzado a ser estudiadas sistemáticamente en importantes centros de investigación de alimentos a nivel mundial. Es así como, los inventores de la presente solicitud se abocaron a evaluar principios bioactivos derivados de extractos de polen colectado de especies nativas, versus, extractos de polen de especies cultivadas. Lo primero se fundamenta en el conocimiento y resultados de investigación del proyecto FONDEF D03I1054 en que algunas mieles de origen de vegetación nativa tienen propiedades de importancia tecnológica y comercial, por lo tanto, se espera que en los pólenes de origen nativo puedan encontrarse resultados de similar magnitud, aunque supone nuevos desafíos de investigación en la adaptación de protocolos y validación de los resultados al trabajar con polen corbicular. En tanto que la evaluación del polen de especies cultivadas (especialmente de frutales para exportación) se debe a la masa crítica de colmenas destinadas a la polinización de estas especies, a las que se destina según ODEPA (Diagnóstico y Agenda Estratégica de la Cadena Apícola en Chile, 2006) cerca de 250.000 colmenas, generando al año entre US$ 9 y 15 millones de ingresos a los apicultores sólo por polinización, actualmente no dándole valor a este polen como sub-producto de esta actividad. Si a lo anterior le sumamos el efecto de la polinización apícola sobre las exportaciones frutícolas, se tiene que, según FEDEFRUTA, los envíos totalizaron US$2.756 millones (FOB) en 2007 y alcanzan US$2.984 millones en la temporada 2008, provenientes de especies en que la actividad polinizadora de la abeja es fundamental en la productividad y calidad de la fruta de exportación, tales como paltos, cerezo, manzano, kiwi, entre otros.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCIÓN

El planteamiento global de la presente solicitud se basa en la bioprospección de productos apícolas de compuestos naturales biológicamente activos a partir del supuesto que si las abejas melíferas utilizan la vegetación nativa/endémica de nuestro país y las plantaciones de frutales considerados altamente melíferos para sustentar la colmena, tanto la miel como el polen corbicular heredarán las propiedades y los compuestos químicos de las plantas que visitan como fuente de elaboración de sus productos que les permite alimentarse (larvas, obreras, zánganos y reinas) y protegerse de patógenos extraños .

El polen apícola ha mostrado ser buena fuente de pigmentos y poseer excelentes propiedades biológicas (antibióticas y antioxidantes) en estudios científicos realizados con estos productos apícolas en diversos países (Mirzoeva et al, 1997; Serra-Bonvehí & Escola-Jordá, 1997; Burdok, 1998; Bankova & Marcucci, 2000; Drago et al, 2000; Kroyer & Hegedus, 2001; Serra-Bonvehí et al, 2001; Nagai et al, 2002; Campos et al, 2003; Almaraz-Abarca et al, 2004 y 2007; Sarmentó Silva et al, 2006; Leja et al, 2007) .

De acuerdo a lo anterior, el objeto de la presente invención corresponde a proveer un extracto de pólenes, provenientes de flora nativa (Figura 2), rico en compuestos fenólicos, capaz de inhibir el crecimiento in vitro de bacterias patógenas humanas. Este extracto además de posee actividad antioxidante, Colorante natural, suplemento alimentario proteico y alimento funcional.

Entre los fundamentos que sustentan la característica nutritiva funcional del polen, están los siguientes: Su alto contenido de compuestos fenólicos, principalmente los flavonoides, los cuales tienen la capacidad de reducir los riesgos de contraer enfermedades degenerativas mediante la reducción del estrés oxidativo y la inhibición de la oxidación molecular (Moráis et al, 2011) . El papel de los compuestos se refleja en la prevención de enfermedades crónico-degenerativas como la ateroesclerosis, diversos tipos de cáncer, osteoporosis y diabetes (Cotelle et al, 1996; Parr y Bowell, 2000) . En este sentido, es conocido el hecho que el efecto de los fitoquimicos sobre la salud no siempre es una función directa del componente en si, sino que es el resultado de la mezcla de todos los componentes presentes en el alimento. En este sentido, el polen, como resultado del proceso de pecoreo por parte de las abejas, las cuales aglutinan el polen de las flores junto con néctar y sustancias salivares (Baldi et al, 2004); representa una alternativa potencial como alimento funcional ya que estos antioxidantes se encuentran en presencia de un alto contenido en hidratos de carbono, proteínas, lípidos, vitaminas, minerales y otros compuestos, que permiten garantizar esta función antioxidante (Vit & Santiago, 2009) . Diversos estudios efectuados sobre muestras de polen apícola europeo permitieron, a partir de la producción de extractos de estos pólenes, determinar la capacidad antioxidante y anti-radicalaria de ellos. Aquí se pudo demostrar la dependencia existente entre la presencia de compuestos fenólicos hidrosolubles y la actividad antioxidante que evidenciaron las muestras analizadas. Sin embargo, se encontraron importantes diferencias entre el contenido de fenoles entre las muestras estudiadas lo que permitió concluir que el origen botánico era el responsable de tales diferencias (Kroyer, y otros, 2001) .

Su alto contenido de carotenoides . La presencia de pigmentos que le otorgan la coloración característica al grano de polen, le contribuye además las propiedades que estos compuestos poseen. Los pigmentos debido a su estructura química, corresponden a la familia de antioxidantes naturales cuya función primordial estaría asociada a la neutralización de radicales libres (Marguitas et al, 2009; Saric, 2009) .

Su alto contenido de proteínas de origen vegetal, siendo uno de los pocos alimentos de dicho origen que contiene todos los aminoácidos, además de fibra dietética, vitaminas y minerales (Serra-Bonvehí & Escola-Jorda, 1997) lo que posiciona al polen apícola como una buena alternativa para dietas y tratamientos médicos donde el consumo de carne y grasas de origen animal debe reducirse . 4. Su potencial actividad antimicrobiana. Existen varios estudios que indican que el polen apícola tiene actividad antimicrobiana (Carpes et al, 2007 y 2009; Moráis et al, 2011; Basim et al, 2006) .

La presente solicitud provee además el procedimiento mediante el cual se extrae el polen apícola y los compuestos activos contenidos en él, para ser utilizados en la industria alimentaria. El procedimiento se realiza en un sistema industrial prototipo especialmente diseñado para aumentar la eficiencia de producción de polen (Figura 3) .

La invención esencialmente corresponde a una composición obtenida de extracto de flavonoides y/o fenoles de polen apícola, preferentemente de origen botánico de especies nativas de Chile.

El origen botánico de cada polen se determinó a través de un proceso de separación de los granos de polen por centrifugación y su posterior tinción y observación en microscopio de luz. Los datos fueron cuantificados estadísticamente. De esta forma una muestra de polen se considera monofloral cuando más del 50% del total de granos de polen presentes en la miel corresponden a una sola especie vegetal . El procedimiento de extracción de polen apícola, y solo a modo ilustrativo dado que un técnico de nivel medio versado en la materia podrá claramente extrapolar las cantidades a continuación señaladas, se lleva a cabo un proceso que contempla las siguientes etapas:

1. Se pesan 100 gramos de polen y se agrega 500 mi de agua destilada ó en etanol, dependiendo del uso final de extracto de polen.

2. Se mezcla en un agitador magnético durante 30 minutos a una temperatura de 60 °C.

3. Se somete a proceso de licuado a máxima velocidad, durante 10 min.

4. Se filtra en matraz Kitasato, con papel filtro Whatman N°

5. El residuo de polen que queda en el papel filtro es eliminado.

6. El líquido obtenido se vuelve a filtrar mediante el mismo procedimiento del paso n° 5.

8. El extracto final obtenido se colecta y se almacena a - 20°C.

El volumen final obtenido por lOOgr de polen corresponde a 550 mi. La concentración final del extracto es de 0,034 gr/ml de extracto, o 34,4gr/L. De esta forma se obtiene un producto inocuo de fácil elaboración y compatible con una alimentación saludable, aspecto ratificado por el Informe de "Registrar Corp" de Estados Unidos, organismo competente para evaluar la registrabilidad del producto en la FDA de USA. Al ser un producto inocuo puede ser utilizado en la alimentación convencional y/o en la orgánica. El extracto posteriormente puede ser formulado de diferentes formas, como por ejemplo y no limitándose a, disolución en agua destilada o liofilizado en polvo.

El extracto asi obtenido presenta una consistencia lechosa homogénea. En su composición es posible encontrar todos los compuestos presentes en el grano de polen los que constituyen una importante reserva de nutrientes, además de cumplir funciones orientadas a la protección de diversos tipos de stress a los que se encuentran expuestas las estructuras vegetales del polen. De esta manera, los extractos obtenidos de polen apícola se presentan como un producto natural rico en moléculas cuyas propiedades biológicas originales permanecen inalteradas en el producto final.

El extracto de polen presenta rangos de pH que pueden fluctuar entre 3 y 6 siendo estable a temperaturas inferiores a 4 °C. La consistencia es levemente viscosa y adquiere el color de la muestra sin disolver. El extracto puede ser almacenado tanto en frascos de vidrio como en recipientes plásticos. En ambos casos, los componentes no se degradan.

El extracto no es fotosensible, por lo tanto los frascos o recipientes que lo almacenan pueden ser transparentes. La calidad del extracto se garantiza cumpliendo las especificaciones de temperatura por al menos 3 meses.

Mediante el análisis proximal de diversas muestras de extracto de polen se han determinado los porcentajes de humedad, cenizas, fibra y extracto no nitrogenado (ENN) que este posee.

El extracto de polen presenta valores de porcentaje de humedad de hasta un 87%, mientras que el porcentaje de cenizas y fibra no superan el 1%, para cada uno de estos parámetros. El porcentaje de ENN fluctúa entre 7 y 8 %.

Otro aspecto importante es la energía o calorías que 100 mL de extracto de polen son capaces de aportar. Los valores energéticos se encuentran entre las 54 y 60 Kcal por cada 100 mL o gramos de extracto. El extracto de polen es un producto de origen vegetal que presenta en su composición diversas familias de compuestos que le otorgan un interesante y atractivo potencial como alimento funcional rico en proteínas, compuestos fenólicos hidrosolubles, hidratos de carbono, pigmentos y minerales. Estas moléculas son las responsables de entregarle a los extractos las diversas propiedades biológicas que presentan. Está constituido por diversas moléculas que se encuentran disponibles en solución.

El estado del arte respecto del área temática de la presente invención muestra la publicación de varias patentes que persiguen objetivos homólogos con procedimientos diferentes. De este modo la solicitud de patente CN 101965940. BEE POLLEN AND LUCID GANODERMA FREEZE-DRIED POWDER CAPSULE AND PRODUCTION PROCESS THEREOF (ANHUI WANSHAN BIOLOG TECHNOLOGY CO LTD.) tiene relación con una cápsula para contener polvo liofilizado de Ganoderma Lucidum y polen de abeja, y su proceso para su producción, donde la estructura de las cápsulas está formada por el polvo liofilizado de Ganoderma Lucidum y el polen de abeja es depositado dentro de la mencionada cápsula. La relación en peso del polen de abeja con respecto del Ganoderma Lucidum en las formulaciones de polvo liofilizado es de 01:05 de Ganoderma Lucidum y 95/99 de polen de abeja. El proceso de producción del polen de abeja/Ganoderma Lucidum, comprende tamizar el polvo a través de una malla 60, en la proposición indicada su preparación el polen de abeja, y la pasta de Ganoderma Lucidum, a continuación se somete la composición de respaldo a una etapa de congelación al vacio en seco, o liofilizado, luego se muele el producto liofilizado y se tamiza el polvo, obteniéndose un producto semi-procesado que se encapsula. El proceso de producción de las capsulas es simple, evitando el daño de las sustancias biológicamente activas y la preservación del producto no constituye un requisito especial, siendo fácil de llevar, conservar y servir, tratándose de un producto tónico que contiene un compuesto o una combinación polen de abeja y Ganoderma Lucidum. Este invento está orientado a destacar la viabilidad de colocar en una cápsula polen de abeja y Ganoderma Lucidum. No se describe la extracción del polen de abeja o la extracción/preparación del Ganoderma Lucidum. No se destaca las propiedades nutricionales o alimentarias del contenido de la cápsula, tampoco los atributos alimentarios del hongo, Ganoderma Lucidum, en su contenido de polisacáridos con propiedades medicinales. Por lo tanto, el invento de la presente solicitud resulta más especifico en cuanto al proceso de extracción de polen apícola y en cuanto a la caracterización y propiedades de los elementos que constituyen este extracto, y que se obtienen por este proceso de extracción innovador. La solicitud de patente CN 101971939. PROCESS FOR AKING BEE POLLEN FREEZE-DRIED POWDER THROUGH LOW-TEMPERATURE HIGH- PRESSURE WALL-BREAKING (ANHUI WANSHAN BIO-TECH CO., LTD) se refiere a la producción de cápsulas de polen de abeja partido liofilizado a baja temperatura y alta presión, en el que se hace pasar el polen de abeja a través de un tamiz de malla 30, para eliminar las impurezas, luego se deja secar de tal manera que el contenido de humedad sea menor que el 2%, luego se deposita en agua pura, se remoja durante 24 horas a temperatura ambiente, se forma una pasta de polen de abeja, luego esta pasta se coloca en un proceso de liofilización a baja temperatura, posteriormente se muele el polvo liofilizado, utilizando una máquina de molienda de alta velocidad, a continuación se hace pasar a través de un tamiz con una malla de acero inoxidable, con lo cual se obtiene un producto semi-procesado o semi-terminado de polen de abejas partido liofilizado a baja temperatura y alta presión, siendo un producto semi procesado, luego de examinar la preparación en el mencionado producto, se realiza el envasado en cápsula y pulido, envasado de acuerdo a ciertas especificaciones en forma de tableta o en frascos. Este invento está orientado a describir el procedimiento para la producción de cápsulas de polen de abeja partido liofilizado a baja temperatura y alta presión, pero no destaca las propiedades nutricionales o alimentarias ni identifica las propiedades del polen de abeja que este producto representa.

La solicitud de patente JP 2010259346, POLLEN OR BEE POLLEN CRUSHED COMPOSITION AND EXTRACT THEREOF, AND METHODS FOR PRODUCING THESE (YA ADA BEE FARM CORP) prove un medio para, de manera eficiente y efectivamente utilizar los ingredientes nutritivos del polen y polen de abeja para alimentos y cosméticos. Se obtiene una composición molida y un extracto rico en ingredientes nutricionales incluyendo polifenoles, los que se obtienen por molienda fina del polen o polen de abeja y posterior extracción con agua o un solvente que contenga agua, la principal diferencia con la presente invencione es el uso de polen apícola de vegetación nativa de Chile, que aporta propiedades únicas debido a su alto endemismo .

La solicitud CN 101658255. BEE POLLEN POWDER AND PREPARATION METHOD THEREOF (SA JIU MEDICAL & PHARMACEUTICAL CO., LTD) se refiere a un tipo de polvo de propóleos y un método de preparación, donde dicho polvo de propóleos está compuesto por el extracto de propóleos, celulosa y un aglomerante. El método de preparación consiste en las siguientes etapas. Agregar etanol al extracto de propóleos previamente purificado para disolverlo, siendo la proporción del extracto de propóleos con respecto del etanol de 1 a 10 : 10 a 1, agregar HP C (hidropropinolmetilcelulosa) , mezclando los componentes y dejar secar al vacio a una temperatura de 40 a 80 °C durante 0,5 a 1,5 horas, moler el producto seco a una malla de 100 o superior, o agregarlo nuevamente con sílice, mezclándolo bien con lo cual se obtiene el producto final. En la presente invención se aplica un proceso de secado convencional al vacío y la técnica del proceso de molienda a temperatura ambiente, con el objeto de evitar el secado por congelamiento (liofilizado) , y la técnica del procedimiento de molienda a baja temperatura. Cuando el producto está seco y al evitar la temperatura elevada, el tiempo requerido es corto y no se producen perdidas de elementos activos de propóleos, obteniendo un bajo costo de producción, permitiendo una fabricación en serie y a escala industrial. Los propóleos fabricados se dejan durante 3 horas a la temperatura de 60 °C, sin que se presente un apelmazamiento siendo un producto de fácil almacenamiento, transporte y utilización. La presente invención tiene una amplia gama de usos, siendo posible utilizar el producto en la fabricación de alimentos que contengan propóleos, medicamentos, productos para la salud y cosméticos .

Este invento está orientado a describir la preparación de un polvo de propóleos compuesto por el extracto de propóleos, celulosa y un aglomerante. Sin embargo, a diferencia de la presente solicitud no se destaca ni se identifica las propiedades nutricionales o alimentarias del contenido de propóleos y no está orientada a "extraer" las propiedades nutricionales de los componentes de esta mezcla de propóleos

El documento RU 2294631. POLLEN COLLECTOR ( FEDERAL ' OE GOSUDARSTVENNOE OBRAZOVATEL ¹ NOE UCHREZHDENIE VYSSHEGO

PROFESSIONAL'NOGO OBRAZOVANIJA DAL) se refiere a un equipo para apicultura, con objeto de colectar polen de flores transportados por las abejas como un sistema de recolección eficiente y sin daño a las abejas.

Adicionalmente, se observan en la literatura del tema otras solicitudes de patente menos relevantes a la presente invención y que no afectan su inventividad, tales como CN 101332219. BROKEN POLLEN EXTRACT AND EXTRACTING ETHOD AND USE THEREOF (ZHEJIANG HISUN PHAR ACEUTICAL CO, LTD) , CN 101869592. FORMULA AND PREPARATION METHOD OF POLLEN PRODUCT (BEIJING BAIHUAFENG PRODUCT TECHNOLOGY DEVELOPMENTCO . , LTD]) y el manuscrito científico de Vit et al "Composición química de polen apícola fresco recolectado en el páramo de Misintá de los andes venezolanos", 2008. En resumen, la literatura científica estudiada y de patentes muestra que los esfuerzos recientes en el área temática se han centrado en la obtención de extractos de polen apícola y métodos para ello, más que a los procedimientos de extracción del polen para obtener un producto enriquecido como el de los inventores de la presente solicitud.

EJEMPLOS Los ejemplos que a continuación se señalan se incorporan a título exclusivamente ilustrativo para favorecer la comprensión del pliego y no significan que limiten en modo alguno los alcances de las reivindicaciones que se solicitan. EJEMPLO 1 . COLECTA Y ANÁLISIS DEL ORIGEN BOTÁNICO DE LOS PÓLENES COLECTADOS DESDE LAS COLMENAS EN ESTUDIO

Los pólenes son colectados directamente por los apicultores desde sus colmenas, los que luego son trasladados al Laboratorio de Botánica de la Universidad Católica de Chile donde se almacenan a 5 °C en la oscuridad hasta el momento de su análisis. Se aplica el protocolo sistematizado para detectar e identificar los granos de polen (denominado polen corbicular) que quedan retenidos en el néctar que la abeja colecta para fabricar la miel. Mediante la identificación de las especies a las que pertenecen estos granos de polen, se conoce las plantas que fueron usadas por la abeja para su elaboración .

EJEMPLO 2. DETERMINACIÓN DE PROTEÍNA EN POLEN APÍCOLA

La determinación del nitrógeno en polen apícola, como evidencia del contenido proteico, se realiza mediante el método Kjeldahl: Se coloca 1 g de muestra en un matraz Kjeldahl junto con 25 mi de ácido sulfúrico concentrado libre de nitrógeno. Se agrega 1 g de sulfato de cobre y 10 g de sulfato de potasio. Luego se calienta para producir la digestión de la materia orgánica. Se conecta el matraz con un extractor para eliminar los gases que se producen. La mezcla se mantiene en un calentador fuerte hasta que adquiera un color claro (de incoloro a levemente verdoso) , y se conserva con calentamiento lento por 30 min más. El amoníaco que se desprende se combina con el H2SO4, formando (NH ₄ )S0 ₄ . El carbono y el azufre se desprenden en forma de gases que, al combinarse con el oxígeno, forman moléculas de CO ₂ y SO ₄ o SO3. Este residuo se deja enfriar durante 40 min, se diluye con H ₂ 0 hasta completar aproximadamente 300 a 350 mL, y se deja enfriar completamente. Una vez frío se agregan 100 mL de NaOH al 40% para alcalinizar la mezcla. Este paso se realiza directamente en el aparato de destilación. En otro matraz se mide entre 20 y 100 mL de H ₂ S0 ₄ 0, 2 N. La cantidad de H ₂ S0 ₄ 0, 2 N que se mida dependerá de la cantidad de nitrógeno que se estima contiene la muestra en análisis. El matraz se conecta inmediatamente con el aparato de destilación, para que el NH ₃ libre que se forma pase a la solución de ¾30 ₄ 0,2 N donde se recibe el destilado. El H2SO ₄ que se encuentra en el recipiente se neutraliza en parte por el amoniaco liberado. La cantidad de NH3 formado se determina por titulación de la parte del ácido no neutralizado. La titulación se lleva a cabo con NaOH 0,1 N. La destilación puede considerarse como finalizada cuando se hayan destilado 150 mL de la solución. El tubo que conduce el destilado hacia el matraz con H2SO4 0,2 N se saca y se lava con H2O destilada. Después de dejar hervir por 3 minutos más, se apaga el calentador y el contenido de los recipientes se enfria. Como indicador en la titulación se usa rojo de metilo. En los cálculos, el contenido de nitrógeno debe corregirse por el factor 8, 755, el que proviene de multiplicar 6,25 (% de nitrógeno en la proteína) por 1,4008 (peso atómico del nitrógeno en g) . De acuerdo a Rabie et al (1983) el factor específico para polen corresponde a 5,6 para obtener el valor de proteína cruda, siendo más exacto que el de 6,25 utilizado para cualquier muestra vegetal (Rougier et al, 1994)

EJEMPLO 3. PREPARACIÓN DE LOS EXTRACTOS DE POLEN APICOLA Y OBTENCION DE PIGMENTOS CAROTENOIDES Para llevar a cabo el extracto de polen apícola, y solo a modo ilustrativo dado que un técnico de nivel medio versado en la materia podrá claramente extrapolar las cantidades a continuación señaladas, se lleva a cabo un proceso que contempla las siguientes etapas:

1. Se pesan 100 gramos de polen y se agrega 500 mi de agua destilada ó en etanol, dependiendo del uso final de extracto de polen.

2. Se mezcla en un agitador magnético durante 30 minutos a una temperatura de 60 °C.

3. Se somete a proceso de licuado a máxima velocidad, durante 10 min.

4. Se filtra en matraz Kitasato, con papel filtro hatman N° 5. El residuo de polen que queda en el papel filtro es eliminado .

5. El líquido obtenido se vuelve a filtrar mediante el mismo procedimiento del paso n° 5.

6. El extracto final obtenido se colecta y se almacena a - 20°C.

El volumen final obtenido por lOOgr de polen corresponde a 550 mi. La concentración final del extracto es de 0,034 gr/ml de extracto, o 34,4 gr/L. En caso de extraer carotenoides, el sobrenadante se pone en un embudo de decantación y se le agregan 5 mL de éter de petróleo. A continuación se agregan 10 mL cada una, suavemente y dejándola resbalar por las paredes del embudo. Se agita suavemente, y una vez que se han formado dos fases se elimina la fase inferior (acetona-agua) . Este proceso se repite dos veces más, dejando salir una pequeña parte de la fase superior en la tercera repetición, para asegurar la salida de toda la fase inferior. Se añade 5 mL de metanol acuoso al 92%, se mezcla enérgicamente y se dejan formar las dos fases. La fase superior (éter de petróleo) es colectada en un tubo limpio, quedando listo para su análisis posterior. El almacenaje se realiza en frió a 4 °C aproximadamente.

EJEMPLO 4: EJEMPLO DE FORMULACION

A continuación se detallan los compuestos y el rango en que estos se encuentran. Las determinaciones de estos compuestos se realizan mediante análisis directo de una muestra del extracto con metodologías analíticas específicas para cada compuesto . COMPUESTO RANGO

Fenoles hidrosolubles : Hasta 20g de fenoles equivalentes a ácido gálico por Litro

Proteínas : Hasta un 30% en relación a la masa inicial de polen utilizada para producir el extracto.

Pigmento Licopeno: Hasta 30 μg de licopeno por litro de extracto.

Pigmento β-Caroteno: Hasta 25 ug de β-Caroteno por litro de extracto.

Hidratos de Carbono Totales: Entre un 30 a 70% en relación a la masa inicial de polen utilizada para producir el extracto.

Los rangos varían debido al origen botánico de la muestra de polen a partir de la cual se prepare el extracto. Eso explica la amplia variabilidad de los valores encontrados para cada uno de los componentes antes descritos. Compuestos presentes en el extracto de polen:

DESDE HASTA

FENOLES HIDROSOLUBLES 7,1 g/kg 14, 95 g/kg

PROTEINAS 18% 30%

LICOPENO 8 mg/kg 60, 35 mg/kg

BETACAROTENO 13,57 mg/kg 25,31 mg/kg

HIDRATOS DE CARBONO TOTALES 30% 70%

FRAP (eq m Fe ⁺² /kg) 14,39 28,28

DPPH (gr eq Ac . Ascórbico/Kg) 2,90 2, 99

DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

Figura 1. Fotografía de una abeja doméstica (Apis mellifera) .

Figura 2. Pólenes obtenidos desde Apis Mellifera provenientes de: A: Hypochaeris radicata 200x, B: Gevuina avellana 200x, C: Luma apiculata 4500x, D: Mentha pulegium 4500x, E: omatia hirsata 3000x, F: Azara integrafolia 4500x.

Figura 3. Diagrama esquemático de planta piloto para extracción de polen apícola. El polen corbicular es colocado en un contenedor (A) para luego pasar a la fase de secado (B) que es realizado con un ventilador (C) . El producto seco se muele en un molino (D) y luego se tamiza en un filtro con poros de 100 μπι (E) . En otra parte del sistema, se mezcla un oxidante (F) y un solvente (G) en un mezclador de reactivos (H) ; mediante una bomba de recircularización (I) se vierten éstos reactivos en el producto filtrado manteniéndose en constante movimiento en un mezclador de polen y reactivos (J) . El producto de esta fase se deja decantar en un estanque (K) para luego ser filtrada con una bomba de vacío (L) y una membrana con poros de 2 \im (M) , obteniendo el producto final en un estanque (N) .

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