La invención se refiere a un aparato para explorar una muestra, en particular una propiedad óptica de una capa de material total o parcialmente transparente.

En biodetección, objetos de interés tales como células y capas de proteína son muy transparentes. Por lo tanto, normalmente se detectan indirectamente utilizando etiquetas externas fluorescentes que emiten luz, o directamente utilizando un esquema interferométrico para medir los cambios de fase que experimenta la luz cuando pasa a través los mismos.

Uno de dichos aparatos es conocido por el documento US 8.472.031 B2, que utiliza dos haces de iluminación desplazados y cuasi superpuestos que experimentan cambios de fase relativos cuando se propagan a través del objeto, y un conjunto de sensores de imagen para registrar el modelo de interferencia resultante.

Un inconveniente de este aparato conocido es su limitada sensibilidad lo que, en particular, va unido al hecho que los cambios de tese experimentados por la luz que pasa a través de la muestra generalmente son pequeños. Además, los distintos elementos del aparato lo hacen comparativamente grande.

Por lo tanto, un objetivo de la presente invención es disponer un aparato mejorado para explora· una propiedad óptica de una muestra que, en funcionamiento, sea particularmente más compacto y/o más sensible.

Este objetivo se consigue con un aparato de acuerdo con la reivindicación 1 y con un aparato de acuerdo con la reivindicación 10. En las reivindicaciones dependientes se especifican realizaciones preferidas.

De acuerdo con el primer aspecto de la invención, tal como se especifica en la reivindicación 1, se dispone un elemento reflectante que refleja los dos haces desplazados ("sheared beams”) de modo que los haces reflejados pueden propagarse de nuevo a través del elemento birrefri rigente utilizado para dividir el haz de luz de iluminación en los dos haces desplazados. De este modo, los dos haces desplazados son recombinados después de la reflexión utilizando el mismo elemento birrefringente. Después de ser recombinados por el elemento birrefringente, el haz recombinado es detectado por un detector. En funcionamiento, la muestra se dispone en la trayectoria óptica de los haces desplazados o en la cara posterior de una superficie reflectante en la trayectoria óptica de los haces desplazados, presentando la superficie reflectante una resonancia de piasmón superficial o una resonancia de piasmón superficial localizada.

En vista de esto, en comparación con aparatos de esquema de transmisión conotidos, el número de elementos puede reducirse. Por ejemplo, en la técnica anterior, eran necesarios por lo menos dos elementos binrefringentes, uno para dividir el haz de luz de iluminación y uno para recombinar los dos haces

desplazados. De acuerdo con el primer aspecto de la invención, solamente es suficiente uno de dichos dementes. Además, dado que se utiliza el mismo elemento birrefringente para dividir el haz de luz de iluminación y para recombinar los dos haces desplazados tras la reflexión, el desplazamiento fuera de la zona de detección se cancela perfectamente, de modo que pueden utilizarse componentes ópticos de calidad inferior, y se facilita la alineación.

El aparato puede configurarse de mano» que el elemento binrefringente quede dispuesto en la trayectoria óptica de los haces reflejados. Los haces reflejados pueden reflejase directamente hada el elemento birrefringente. En otras palabras, los haces reflejados pueden propagarse a lo largo de su dirección de propagación hada el demento birrefringente. Alternativamente, el aparato puede comprender uno o más elementos ópticos adicionales que varíen la dirección de propagación de los haces reflejados de modo que sean dirigidos hacia el elemento birrefringente.

La muestra puede ser posidonable de manera que, en funtionamiento, los haces desplazados y los haces reflectantes se propaguen a través de la muestra. En otras palabras, la muestra puede ser posidonable en la trayectoria óptica de los haces desplazados, en particular entre el elemento birrefringente y el elemento reflectante. En este caso, la muestra es explorada dos veces, lo que aumenta la sensibilidad del aparato en comparación con la utilización de un esquema de transmisión tal como es conotido de la técnica anterior.

Alternativamente, la muestra puede ser posidonable en la cara posterior de una superfide reflectante que presente una resonancia de piasmón superficial o una resonancia de piasmón superficial localizada. La superficie reflectante se dispone en la trayectoria óptica de los haces desplazados. De este modo, la superficie reflectante puede reflejar los haces desplazados desde una primera dirección de propagación hada una segunda dirección de propagación en funcionamiento del aparato. La expresión“cara posterior" debe entenderse con referencia a la directión de llegada de los haces desplazados sobre la superficie reflectante. En otras palabras, la cara posterior de la superficie reflectante es el lado que queda orientado alejado de los haces desplazados incidentes reflejados por la superficie reflectante. En fundonamiento, la muestra puede influir en las propiedades de resonanda de la superfide reflectante influyendo, de este modo, en las propiedades de los haces desplazados reflejados. En particular, un campo electromagnético evanescente es excitado en el lado de la superficie reflectante. La amplitud y la fase del campo evanescente se ven afectadas por cualquier cambio del medio cercano a la capa reflectante o su cara posterior, es dedr, en particular por la muestra (la

espedfícadón“cercano” significa, en este caso, distancias del orden de la longitud de onda de iluminadón). Este campo evanescente modificado afecta, a su vez, a los haces desplazados reflejados cuyos cambios son medidos posteriormente.

La superficie reflectante puede formar parte del elemento refledante. En otras palabras, el demento reflectante puede comprender la superficie reflectante que presenta una resonanda de plasmón superficial o una resonanda de plasmón superfidal localizada. El elemento reflectante, en este caso, puede comprender, en particular, uno o varios canales o cavidades, de manera que la muestra sea posicionable en estos canales o cavidades en la parte posterior de la superficie reflectante o detrás de la miaña. Esta disposidón de la muestra tiene la ventaja de que los haces desplazados no atraviesan un postole líquido que contenga la sonda evitando, por lo tanto, posibles artefactos. La superfide reflectante, en este caso en particular, puede presentar una resonancia de plasmón superficial localizada.

Alternativamente, la superfide reflectante puede formar parte de un segundo demento reflectante o adicional dispuesto en la trayectoria óptica de los haces desplazados, en particular en la trayectoria óptica que va desde el elemento birrefringente hacia el primer demento reflectante mena onado anteriormente. Por ejemplo, la superficie reflectante puede formar parte de un prisma de resonancia de plasmón superficial, tal como se detalla más adelante.

Las resonancias plasmónicas, en general, son el resultado de oscilaciones de carga en una superficie metálica debido a un campo óptico (que es un campo eléctrico oscilante). En la resonanda de plasmón superfidal, SPR, se utiliza una superfide metálica plana sobre un sustrato dieléctrico (desde donde se refleja el haz). Para inducir la correcta frecuencia de oscilación sobre las cargas en el metal, el haz tiene que ser reflejado con un ángulo específico. En la resonancia de piasmón superficial localizada, LSPR, la superficie es na reestructurada y estas estructuras actúan como antenas, induciendo la oscilación de carga con menos dependencia del ángulo de incidencia. De este modo, el“efecto de detección" plasmónico de la LSPR es más intenso, pero con una distancia de detección menor que la de la SPR.

También puede colocarse en la trayectoria óptica de los haces desplazados una LSPR que presente un sustrato dieléctrico, en particular entre el elemento birrefringente y el elemento reflectante, donde la muestra se dispone sobre la LSPR que presenta un sustrato dieléctrico o cerca de la misma (la especificación“cerca" significa, en este caso, distancias del orden de la longitud de onda de iluminación).

La LSPR que presenta un sustrato dieléctrico (también denominado substrato LSPR) puede disponerse, en particular, de manera que el ángulo incidente de los haces desplazados sobre el substrato dieléctrico presente un ángulo específico, por egempio, 90°. Dependiendo del ángulo y la geometría de la nanoestructura, el substrato de LSPR puede trabajar en transmisión o bien en reflexión. En caso de transmisión, los haces desplazados pasan dos veces a través de la muestra en el substrato de LSPR o cerca del mismo. En caso de reflexión, el substrato de LSPR refleja la luz y la muestra a detectar se coloca en la cara posterior de la superficie donde está situada la nanoestructura. De esta manera, el campo evanescente desde las nanoestructuras ¡nteractúa con la capa de la muestra cerca o en contacto con la nanoestructura, produciendo, de este modo, cambios de fase sobre los haces desplazados. El sustrato de LSPR puede presentar una estructura de na no-orificios y/o nano-partículas.

El efecto de la LSPR en transmisión o reflexión puede obtenerse o aumentarse alternativamente o adicionalmente añadiendo nano partículas de metal a la muestra.

Las nanopartículas metálicas, nano-antenas, nano-orificios y/o películas de las estructuras piasmón icas pueden ser sustituidas por homólogos dieléctricos o semiconductores, que puedan proporcionar unos comportamientos de transmisión reflexión mejorados. Estos homólogos dieléctricos o semiconductores,

preferiblemente con un elevado índice de refracción (por ejemplo, dióxido de titanio, TÍO2, o silicio, Si), pueden combinarse con los haces desplazados y la configuración reflectante de la invención. La muestra puede ser una muestra total o parcialmente transparente, en particular una capa de materia! total o parcialmente transparente. Por ejemplo, la muestra puede ser una muestra biológica, tal como una o varias células y/o una o varias capas de protelna. La muestra puede ser sólida, líquida o gaseosa. Un medio que rodee o integre la muestra también puede ser sólido, liquido o gaseoso. Por ejemplo, la muestra puede ser un material sólido dispersado en un líquido o gas.

El aparato puede utilizarse para explorar una propiedad óptica de la muestra, tal como el índice de refracción de la muestra o el patrón de interferencia causado por los cambios de fase inducidos por la muestra. A partir de esta propiedad óptica puede obtenerse más información, tal como parámetros estructurales o parámetros del material.

La fuente de luz puede ser un LED, un láser, o cualquier otra fuente de luz apropiada para explora’ la propiedad óptica de la muestra. En general, la fuente de luz puede ser una fuente de haces ópticos plana. La longitud de coherencia debe ser mayor que la diferencia de la trayectoria óptica más grande (cambio de fase) a detectar y debe seleccionarse de manera que se eviten artefactos (que resultan de reflexiones de elementos no deseadas u otras señales falsas, por ejemplo) tanto como sea postole. En particular, la longitud de coherencia puede ser del orden de la distancia de desplazamiento o mayor.

El aparato puede configurarse de manera que, en funcionamiento, los dos haces desplazados se propaguen a través de la muestra de Interés y sean reflejados por el elemento reflectante. Después de la reflexión, los dos haces reflejados se propagan de nuevo a través de la muestra, antes de recombinarse por el elemento

birrefringente en un haz recombinado, que eventualmente es detectado por el detector. En la práctica, los haces desplazados pueden formar los dos brazos de un ¡nterferómetro de Mach-Zehnder, que puede utilizarse para detectar con precisión la diferencia de fase entre cualesquiera dos puntos de la muestra separada por la distancia de desplazamiento.

Los haces desplazados pueden ser cuasi superpuestos en el sentido de que los haces se superponen parcialmente y comprenden, además, zonas que se no superponen. La distancia de desplazamiento, que corresponde al desplazamiento entre los dos haces desplazados, puede adaptarse al tamaño esperado de las estructuras de la muestra. Para aplicaciones de biodetección, la distancia de desplazamiento puede ser, por ejemplo, entre 10 y 50 pm. La distancia de desplazamiento puede seleccionarse, en particular, en base a las siguientes consideraciones:

- debe ser mayor que las características más pequeñas de la imagen que puede o debe resolver;

- debe ser mayor que el tamaño del pixel del detector; y/o

- para fuentes con baja coherencia, debe ser lo suficientemente pequeña de manera que dos puntos separados por la distancia de desplazamiento den una buena señal interferométrica.

El detector puede comprender un conjunto de sensores de imagen para detectar el haz recombinado de una manera resuelta espacialmente. En otras palabras, el detectar puede sor un sensor de imagen. Por ejemplo, puede utilizarse como detectar un detectar de un dispositivo de acoplamiento de carga (CCD) o un semiconductor complementario de óxido metálico (CMOS). El tamaño de pixel del detector puede ser del orden de 2 x 2 pm. El haz recombinado puede incidir directamente en el detector. En otos palabras, puede no preverse ninguna óptica de imagen, tal como lentes.

La muestra puede ser posicionable sobre un portamuestras, que puede

corresponder, por ejemplo, a una cámara de la muestra de mícrofluido, un laboratorio en un chip, una placa con micro-cavidades o un portaobjetos de microscopio simple. Este portamuestras puede disponerse en el aparato en la trayectoria óptica de los haces desplazados entre el elemento birrefringente y el elemento reflectante o en la cara posterior de una superficie reflectante en la trayectoria óptica de los haces desplazados, presentando la superficie reflectante una resonancia de plasmón superficial o una resonancia de plasmón superficial localizada.

El portamuestras puede colocarse muy próximo al elemento reflectante, o en contacto con éste, o muy próximo a la cara posterior de la superficie reflectante que presenta una resonancia de plasmón superficial o una resonancia de piasmón superficial localizada, o en contacto con la misma.

La especificación "muy próximo" o“cerca de" significa aquí distancias más grandes que 0 y menos de diez veces, en particular, menos de cinco veces la longitud de onda de iluminación. El aparato puede comprender, además, un elemento polarizante para polarizar el haz de luz de iluminación antes de entrar en el elemento birrefringente y para polarizar el haz recombinado antes de ser detectado por el detector.

El elemento polarizante puede ser, en particular, un divisor de haz polarizante y/o el demento birrefringente puede una placa de Savart. Una placa de Savart está formada por dos cristales birrefringentes la cual divide d haz de luz de iluminación en los dos haces desplazados parcialmente superpuestos. El uso de la placa de Savart es ventajoso ya que los dos haces desplazados presentan entonces unas propiedades ópticas uniformes. Esto último es importante para realizar mediciones precisas de la propiedad óptica. El elemento birrefringente puede ser

alternativamente una placa única de un cristal birrefringente. Un divisor de haz polarizante actúa parcialmente como espejo semitransparente. En otras palabras, parte de la luz incidente es reflejada y polarizada mientras que d resto es transmitida. El uso de un divisor de haz polarizante permite ahorrar espacio.

Alternativamente, puede utilizarse respectivamente un espejo semitransparente o un espejo, que esté desalineado e inclinado, en combinación con dos polarizadores, uno entre la fuente de luz y el espejo y el otro entre d espejo y el detector.

El aparato puede comprender, además, un elemento semi-reflectante en la trayectoria óptica de los haces desplazados, en particular entre el elemento birrefringente y el elemento reflectante. El elemento semi-reflectante puede disponerse, en particular, de manera que los haces desplazados reflejados por el demento reflectante sean parcialmente reflejados hada el elemento reflectante por el elemento semi- reflectante cuando se encuentra en funcionamiento. La parte transmitida puede propagarse hacia el elemento birrefringente. Por ejemplo, el demento semi-reflectante puede ser un espejo sem itra nspa rente .

En esta realización, los haces desplazados se propagan múltiples veces entre el elemento reflectante y el elemento semi-reflectante, y los efectos causados por la muestra, dispuesta particularmente entre el elemento reflectante y el elemento semi- reflectante, pueden aumentarse en un factor proporcional a la finura de la cavidad. En otras palabras, mediante el elemento reflectante y el elemento semi-reflectante puede formarse una cavidad de Fabry-Pérot.

El elemento birrefringente puede ir montado de manera que puede indinarse respecto a la dirección de propagación del haz de luz de iluminación. El elemento birrefríngente, de este modo, puede ser posdonable con un ángulo respecto a un plano perpendicular a la dirección de propagación dei haz de luz de iluminación. De esta manera, es postole introducir un cambio de fase variable entre los dos haces desplazados. Este cambio de fase variable puede utilizarse para realizar un análisis ¡nterferométrico de cambio de fase de la muestra y para aumentar la sensibilidad del aparato.

El elemento reflectante puede ser, en particular, un espejo. En particular, el espejo puede corresponder a un espejo metálico total o parcialmente reflectante, un espejo dieléctrico o un espejo piasmónico. En caso de un espejo piasmónico, en la superficie reflectante se dispone una estructura con patrones, por ejemplo, una estructura metálica con patrones, que presente una resonancia de plasmón superficial localizada (LSPR). En tales casos, si la muestra se dispone muy próxima a la superficie reflectante del espejo piasmónico, la muestra puede influir en sus propiedades de resonancia. A su vez, las propiedades plasmónicas pueden influir en las propiedades de los haces reflejados.

En particular, en el caso de un espejo piasmónico, la muestra puede ser posicionable en un portamuestras situado muy próximo a la superficie reflectante o en contacto con la misma o, tal como se ha indicado anteriormente, en un canal o cavidad del espejo piasmónico en la cara posterior o detrás de la superficie reflectante.

El aparato puede comprender, además, un prisma con una superficie reflectante para reflejar los haces desplazados desde una primera dirección de propagación hacia una segunda dirección de propagación en un ángulo respecto a la primera dirección de propagación, en el que la superficie reflectante presenta una resonancia de plasmón superficial, y en el que la muestra es posicionable en la cara posterior de la superficie reflectante. De este modo, en este caso, el prisma corresponde al segundo elemento reflectante mencionado anteriormente. En funcionamiento, los dos haces desplazados pueden entrar en el prisma a través de una cara de entrada, ser reflejados por la superficie reflectante, y salir a través de una cara de salida.

Mediante la reflexión sobre la superficie reflectante, la dirección de propagación de los dos haces desplazados cambia a una dirección de propagación en un ángulo respecto a la dirección de propagación de los haces desplazados que entran en el prisma. En este caso, el elemento reflectante puede colocarse en la trayectoria óptica de los haces desplazados de manera que los haces desplazados reflejados por la superficie reflectante y que se propagan en la segunda dirección de propagación son reflejados por el elemento reflectante hacia el prisma. De esta manera, en funcionamiento, los haces desplazados reflejados entran de nuevo en el prisma a través de la cara de salida, son reflejados por la superficie reflectante, y salen a través de la cara de entrada del prisma. Entonces, de nuevo, los haces desplazados reflejados pueden ser recombinados por el elemento birrefringente y ser detectados por un detector, tal como se ha indicado anteriormente.

De este modo, en este caso, el elemento reflectante puede reflejar los haces desplazados que se propagan a lo largo de la segunda dirección de propagación hada la superficie reflectante del prisma.

Dado que la superficie reflectante del prisma forma un interfaz de resonancia de plasmón superficial (SPR), los haces desplazados se conectan a la muestra a través del campo evanescente. De este modo, la muestra influye en las propiedades de los haces desplazados, aunque los haces desplazados realmente no se propagan a través de la muestra.

El prisma puede ir montado o dispuesto de manera que puede inclinarse respecto a la dirección incidente de los haces desplazados. De esta manera, el ángulo de incidencia y, así, el ángulo de reflexión puede adaptarse, particularmente para optimizar el efecto de resonancia de plasmón superficial.

El ángulo entre la primera dirección de propagación y la superficie reflectante del prisma puede ser entre 30° y 50°, en partícula· entre 35° y 45°. Asi, el ángulo entre la primera y la segunda dirección de propagación puede ser entre 80° y 120°, en particular entre 90° y 110°.

En el caso de que el aparato comprenda, además, un prisma, el portamuestras para colocar la muestra puede disponerse, en partícula·, muy próximo a la cara posterior de la superficie reflectante del prisma o en contacto con la misma.

La superficie reflectante del prisma puede estar formada por una capa de interfaz entre el prisma y sus alrededores. La cara posterior de la superficie reflectante puede referirse, en particular, al lado de la capa de Interfaz que queda orientada alejada del interior del prisma, mientras que la superficie puede referirse al lado de la capa de interfaz que queda orientada hada el interior del prisma a través del cual los haces desplazados son incidentes sobre la capa de interfaz en funcionamiento.

De acuerdo con un segundo aspecto de la invención, especificado en la

reivindicación 10, se dispone un aparato para explorar una propiedad óptica de una muestra que también permite aumentar la sensibilidad y, de este modo, solucionar el problema técnico identificado al principio. El segundo aspecto se caracteriza por disponer un prisma con una superficie reflectante para reflejar el haz de luz de iluminación desde una primera dirección de propagación hacia una segunda dirección de propagación en un ángulo respecto a la primera dirección de propagación, en el que la superficie reflectante presenta una resonancia de plasmón superficial, y en el que la muestra es posicionable en la cara posterior de la superficie reflectante. A diferencia del aparato que incluye un prisma descrito anteriormente, no se dispone ningún elemento reflectante para reflejar los haces desplazados que se propagan a lo largo de la segunda dirección hada el prisma. En cambio, se dispone un elemento birrefringente y un detector para crear y analizar dos haces desplazados en la trayectoria óptica del haz de luz de iluminadón reflejado por la superficie reflectante del prisma.

En este caso, en particular, el elemento birrefringente puede utilizarse o configurarse para dividir el haz de luz de iluminación reflejado en dos haces desplazados. Puede disponerse un polarizador lineal entre el demento birrefringente y el detector. Este po lanzador puede utilizase o configurarse para crear interferencia entre los dos haces desplazados. El patrón de interferencia puede ser detectado por el detector en el funcionamiento del aparato. El aparato puede comprender, además, un elemento polarizante dispuesto entre la fuente de luz y el prisma para polarizar el haz de luz de iluminación. En particular, tos dos pdarizadores pueden estar alineados paralelos o cruzados.

El elemento birrefringente puede ser una placa de un cristal birrefringente o una placa de Savart. Los otros elementos pueden comprender una o varias de las características identificadas anteriormente para el primo· aspecto de la invención, aparte del elemento reflectante.

El aparato de acuerdo con la reivindicación 10 también puede funcionar de la misma manera que se ha indicado anteriormente en la realización del aparato de acuerdo con el primer aspecto con un prisma, aparte del elemento reflectante. En este caso, el elemento birrefringente puede ser un segundo elemento

birrefringente y el aparato puede comprender, además, un primer elemento blrrefringentB para dividir el haz de luz de auminación en dos haces desplazados. El primer elemento birrefringente puede disponerse, en particular, en la trayectoria óptica del haz de luz de iluminación entine la füente de luz y el prisma. La superficie reflectante se dispone entonces para reflejar los haces desplazados en el funcionamiento del aparato desde la primera dirección de propagación hada la segunda dirección de propagación. El segundo elemento birrefringente está configurado entonces para recombinar los haces desplazados reflejados y el detector está configurado para detectar el haz recombinado.

El aparato puede comprender una o varias de las características identificadas anteriormente para el primer aspecto de la invención, aparte del elemento reflectante.

El primer y el segundo elemento birrefringente pueden ser, en particular, cada uno, una placa de Savart.

El aparato puede comprender, además, un primer elemento polarizante dispuesto entre la fuente de luz y el primer elemento birrefringente y un segundo elemento polarizante dispuesto entre el segundo elemento birrefringente y el detector.

Los inventores averiguaron que, el uso del prisma con una superficie con resonancia de plasmón superficial permite reducir el ruido de medición para la medición de la fase, lo que significa que puede conseguirse una detección más precisa. Además, este aparato puede explorar propiedades tanto dependientes de la fase como dependientes de la amplitud de la reflexión de resonancia de plasmón superficial de la muestra.

Se describirán ahora unas realizaciones ventajosas en combinación con las figuras

Figura 1 ilustra la configuración de un aparato de ejemplo de acuerdo con el primer aspecto de la Invención;

Figuras 2a a 2d ilustran un principio de funcionamiento en el cual se basa el aparato de acuerdo con la figura 1 ; Figuras 3a y 3b ilustran resultados que pueden obtenerse mediante el aparato de la figura 1 en comparación con un aparato de la técnica anterior;

Figura 4 ilustra otro aparato de ejemplo de acuerdo con el primer

aspecto de la invención;

Figura 5 ilustra otro aparato de ejemplo de acuerdo con el primer

aspecto de la invención;

Figura 6 ilustra un aparato de ejemplo de acuerdo con el segundo

aspecto de la invención;

Figura 7 ilustra otro aparato de ejemplo de acuerdo con el primer

aspecto de la invención;

Figuras 8a y 8b ilustran un principio de funcionamiento en el cual se basan los aparatos de ejemplo mostrados en las figuras 6 y 7; y

Figura 9 ilustra un resultado que puede obtenerse con un aparato

según la figura 6.

La figura 1 muestra de manera esquemática una posible configuración de un aparato de ejemplo de acuerdo con el primer aspecto de la invención. A continuación, se explicará el aparato con referencia a su uso. Una fuente de luz 1, por ejemplo, un diodo emisor de luz, LED, o un láser, emite un haz de luz de iluminación. Posibles longitudes de onda para LEDs son 490 nm, 530 nm, 625 nm o 810 nm, todas con potencias de salida del exden de unos mW. En general, son postoles longitudes de onda desde ultravioleta hasta el rango de infrarrojo - en particular en el rango de infrarrojo cercano y medio - y potencias de hasta varios vatios.

El haz de luz de iluminación entonces es polarizado y desviado desde una primera dirección de propagación hacia una segunda dirección de propagación ortogonal mediante un divisor de haz polarizante 2. Posteriormente, una placa de Savart 3, que actúa como elemento birrefringente, divide el haz de luz de iluminación en dos haces desplazados parcialmente superpuestos. Para ilustración, en la figura 1 se muestran dos rayos de luz del haz de luz de iluminación. Los dos rayos de luz pueden corresponder, por ejemplo, a los rayos de luz contiguos en fronteras opuestas del haz de luz de iluminación.

Los dos haces desplazados se propagan entonces a través de una muestra 4 dispuesta en un portamuestras (no mostrado por separado). La muestra puede ser una muestra biológica, química y/o médica que comprenda, por ejemplo, células y/o capas de proteína. La muestra es total o parcialmente transparente. Asi, los haces desplazados se propagan a través de la muestra y son reflejados entonces por una superficie reflectante 5 de un elemento reflectante 6. El elemento reflectante 6 puede ser un espejo, en particular un espejo metálico o un espejo dieléctrico. Pueden utilizarse también otras superficies con reflectividad alta o parcial para formar una superficie reflectante que refleje los dos haces desplazados en una dirección opuesta a la segunda dirección de propagación o, en otras palabras, en una dirección opuesta a la dirección incidente de los haces desplazados.

Los haces desplazados reflejados se propagan una segunda vez a través de la muestra 4 y después son re combinados en un único haz recombinado por la placa de Savart 3. El haz recombinado es polarizado entonces por el diviso· de haz polarizante 2 y es detectado por un detector 7, por ejemplo, un dispositivo de acoplamiento de carga (CCD).

En la práctica, los haces desplazados forman los dos brazos de un interferómetro de Mach-Zehnder, que puede utilizarse para detectar de manera muy precisa la diferencia de fose entre cualesquiera dos puntos de la muestra separados por la distancia de desplazamiento. En otras palabras, los cambios de fase experimentados local mente por los haces desplazados en vista de la muestra dan lugar a diferencias de fase locales entre los haces reflejados que, de nuevo, producen un patrón de Interferencia que puede ser detectado por el detector.

La figura 2 ilustra un principio de funcionamiento en el cual se basa el aparato de la figura 1. La figura 2 muestra una estructura ilustrativa 8 de una muestra de ejemplo y dos rayos de luz 9, 10 de los dos haces desplazados. Los dos rayos de luz ilustrados 9, 10 están separados por la distanda de desplazamiento que puede ser, por ejemplo, del orden de 10 a 50 pm. Esta distancia es ligeramente menor que la anchura de la estructura de ejemplo 8 en una dirección perpendicular a la dirección de propagación de los rayos de luz 9, 10.

En la figura 2(a) se ilustra la situación en la que los dos rayos 9, 10 no atraviesan la estructura 8. En este caso, no hay ningún cambio de fase entre los dos rayos. De este modo, cuando son recombinados por la placa de Savart 3 de la figura 1 , no se produce ninguna Interferencia inducida por cambio de fase.

En el caso ilustrado en la figura 2(b), el rayo de luz 10 atraviesa la estructura 8 y, de este modo, experimenta un cambio de fase. El rayo de luz 9 no atraviesa la estructura 8. Este cambio de fase relativo da lugar a una interferencia

correspondiente entre los dos rayos 9, 10.

En la situación ¡lustrada en la figura 2(c) ambos rayos 9, 10 se propagan a través de la estructura 8 y, así, experimentan esencialmente el mismo cambio de fase.

En la situación ilustrada en la figura 2(d), el rayo 9 se propaga a través de la estructura 8 mientras que el rayo de luz 10 no lo hace. Esta situación es comparable con la situación ilustrada en la figura 2(b) pero con los papeles de los haces 9 y 10 invertidos. De este modo, el rayo de luz 9 experimenta un cambio de fase mientras que el rayo de luz 10 no lo hace.

La figura 3 ¡lustra las capacidades del aparato de acuerdo con la figura 1

comparando los resultados con un esquema de transmisión de la técnica anterior. Para la prueba, se utilizó un patrón de SK½ sobre un sustrato de S1O2. Los resultados Nustrados a la izquierda en la figura 3a se han obtenido con un aparato tal como el que se describe en el documento US 8.472.031. Los resultados a la derecha en la figura 3a se han obtenido con un aparato de acuerdo con la figura 1.

En las figuras 3a se muestran imágenes de la estructura de la muestra observada, donde la escala gris representa la diferencia de fase óptica en los respectivos puntos respecto a posiciones separadas por la distancia de desplazamiento. La diferencia de fase a lo largo de la parte vertical de la cruz 11 (perfil x) se muestra a la izquierda de la figura 3b, mientras que la diferencia de fase a lo largo de la parte horizontal de la cruz 11 (perfil y) se muestra a la derecha de la figura 3b. El perfil obtenido por el esquema de transmisión de la técnica anterior se muestra como una línea discontinua mientras que el perfil obtenido utilizando la configuración de acuerdo con la figura 1 se muestra como una línea continua. En efecto, los valores de fase detectados utilizando el aparato de la figura 1 son aproximadamente dos veces más grandes en comparación con los resultados obtenidos por el aparato de la técnica anterior. Esto se debe a que los haces desplazados se propagan dos veces a través de la muestra 4.

La placa de Savart 3 ilustrada en la figura 1 va montada en un plano perpendicular a la segunda dirección de propagación. La placa de Savart puede ir montada de manera que puede inclinarse respecto a este plano para introducir un cambio de fase variable entre los dos haces desplazados. Este cambio de fase variable puede utilizarse para realizar un análisis de cambio de fase ¡nterferométrico de la muestra y, de este modo, aumentar adicional mente la sensibilidad.

La figura 4 ilustra otro ejemplo de un aparato de acuerdo con el primer aspecto de la invención. El sistema básicamente corresponde al sistema de la figura 1. Sin embargo, se dispone un espejo semitransparente adicional 12 en la trayectoria óptica de los haces desplazados, entre la placa de Savart 3 y el elemento reflectante 6, en particular, entre la placa de Savart 3 y la muestra 4. De esta manera, alrededor de la muestra 4 se forma una cavidad de Fabry-Pérot. En particular, los haces desplazados se propagan múltiples veces a través de la muestra 4, y los cambios de fase locales producidos por la muestra 4 aumentan en un factor proporcional a la finura de la cavidad.

En la figura 5 se ilustra un aparato de ejemplo adicional de acuario con el primer aspecto de la invención. En este caso, la superficie reflectante 5 contiene una estructura con patrón, por ejemplo, una estructura metálica, que presenta una resonancia de plasmón superficial localizada, LSPR. La superficie reflectante, así, forma parte de un espejo plasmónico 6. La muestra 4 se encuentra muy próxima al espejo plasmónico 6. En particular, el portamuestras en el cual se dispone la muestra 4 puede montarse en el espejo plasmónico 6, es decir, en contacto con la superficie reflectante. La muestra 4 influye en las propiedades de resonancia de la superficie reflectante que presenta una resonancia LSPR. A su vez, estas propiedades plasmón icas aumentan los cambios de fase que habría creado la muestra 4 sin la resonancia LSPR. De esta manera, la sensibilidad del aparato puede aumentarse adicionalmente.

En otra variante, que no se ¡lustra por separado, la muestra 4 puede disponerse en una cavidad o canal del espejo plasmónico detrás o en la cara posterior de la superficie reflectante 5. La expresión‘detrás" debe entenderse con referencia a la dirección de llegada de los haces desplazados en la superficie reflectante. De acuerdo con esta variante, los haces desplazados no se propagan a través de la muestra 4 sino que la muestra 4 influye en las propiedades de resonancia del espejo plasmónico y, así, en los cambios de fase locales de los haces reflejados. Esta variante es ventajosa, en particular, si la muestra debe disponerse en un líquido ya que entonces no es necesario que los haces desplazados pasen a través del líquido lo que, por otra parte, puede producir artefactos. La muestra 4 puede disponerse de manera que la distancia entre la muestra 4 y la superficie reflectante 5, es decir, la superficie en la que los haces desplazados son reflejados en funcionamiento del aparato, puede ser menos de diez, en particular menos de 5 veces la longitud de onda de la luz de iluminación. En otras palabras, la cavidad o el canal del espejo plasmónlco detrás o en la cara posterior de la superficie reflectante 5 se dispone esencialmente inmediatamente detrás de la superficie reflectante 5.

La figura 6 ilustra un aparato de ejemplo de acuerdo con un segundo aspecto de la invención. El aparato comprende una fuente de luz 1, tal como un láser o un LED, tal como de acuerdo con el primar aspecto de te invención descrito anteriormente. En el funcionamiento del aparato, el haz de luz de iluminación se propaga a través de un primer elemento de polarización 13 y un primer elemento birrefringente 14 en forma de primera placa de Savart. Los haces desplazados entran entonces en un prisma de resonancia de plasmón superficial 15 a través de una cara de entrada 16, son reflejados por una superficie reflectante interior 17, y luego salen del prisma 15 a través de una cara de salida 18. La muestra 4 se dispone muy próxima a una superficie extema 19 del prisma o en contacto con la misma, en te cara posterior de la superficie reflectante 17. En vista de la resonancia de plasmón superficial, SPR, el campo evanescente se conecta a la parte de la muestra en contacto con la superficie del prisma o próxima a la misma influyendo de este modo en los cambios de fase. Así, aunque los haces desplazados no se propaguen completamente a través de la muestra 4 sino que sólo interactúen con una parte de la misma, a través del campo evanescente, de nuevo pueden impartirse cambios de fase por la muestra 4 y observarse como un patrón de interferencia.

Al ser reflejados por la superficie reflectante 17, los haces desplazados cambian de una primera dirección de propagación a una segunda dirección de propagación en un ángulo respecto a la primera dirección de propagación. En otras palabras, el ángulo entre la primera y te segunda dirección de propagación es mayor de 0 ^o y puede ser, en particular, mayor de 30°. Después de salir del prisma de resonancia de plasmón superficial 15, los haces desplazados son recombinados por un segundo elemento birrefiingente en forma de segunda placa de Savart 20. El haz

recombinado es polarizado entonces por un segundo elemento de polarización 21 y detectado por un detector 7. El detector 7 puede ser un dispositivo de acoplamiento de carga, CCD, y puede realizarse de la misma manera que en el primer aspecto de la invención que se ha descrito anteriormente. El (Misma de resonancia de plasmón superficial 15 puede inclinarse o girar para variar el ángulo de reflexión de los haces desplazados reflejados.

El aparato de acuerdo con la figura 6 tiene la ventaja de que puede explorar las propiedades tanto dependientes de la tese como dependientes de la amplitud de la reflexión de resonancia de plasmón superficial de la muestra 4. La figura 9 representa las mediciones de la sensibilidad de fase e intensidad de un conjunto de patrones de S1O2 nanométricos delgados depositados en un prisma de SPR tal como se lustra en la figura 6. Cada valor representa la diferencia de señal entre una región con capa de Si<¼ y una región sin ella. Las barras de error asociadas se calculan a partir de la desviación estándar de la señal en las regiones exploradas. Este procedimiento se repite para diferentes ángulos de incidencia, cada uno con una respuesta plasmónica diferente y, por lo tanto, una mejora de la señal. Con el fin de comparar las señales físicamente diferentes de fase e intensidad, sus curvas han sido escaladas de modo que su modulación absoluta es la misma. Tal como puede apreciarse a partir de las barras de error, las mediciones de intensidad tienen un error asociado mayor que las mediciones de fase, (para este caso, es de 3 a 4 veces mayor). Esta gráfica muestra las ventajas de mediciones de fase sobre intensidad. Dependiendo de la configuración, la geometría y la longitud de onda, la señal detectada también puede ser una combinación de efectos de fase e intensidad. Nótese que solamente se detecta la Intensidad y el aparato convierte efectos de fase en modulación de intensidad.

En algunas configuraciones, el primer demento birrefringente 14 puede omitirse. En este caso, el segundo demento birrefringente 20, que puede ser una placa de cristal birrefringente en lugar de una placa de Savart, divide el haz de luz de iluminación reflejado en dos haces desplazados. El segundo elemento polarizante puede ser entonces un analizador y puede utilizarse para crear interferencia entre estos dos haces desplazados, que es detectada posteriormente por el detector 7.

Los elementos polarizantes mostrados en la figura 6 seleccionan una polarización lineal para el haz óptico mientras el divisor de haz polarizante utilizado en las otras realizaciones separa espacialmente el haz en dos haces según su polarización. El divisor de haz polarizante puede utilizarse como elemento polarizante si solamente se selecciona una de las dos polarizaciones.

La figura 7 ilustra otro aparato de ejemplo de acuerdo con el primer aspecto de la invención. El aparato de acuerdo con la figura 7 básicamente corresponde a una combinación del aparato mostrado en la figura 1 y el aparato mostrado en la figura 6. Se prevé así una fuente de luz 1 , un divisor de haz polarizante 2, una placa de Savart 3 y un detector 7. A diferencia del aparato de la figura 1 , sin embargo, se dispone, de acuerdo con esta realización, un prisma de resonancia de plasmón superficial 15 tal como se ha descrito con referencia a la figura 6.

De acuerdo con la realización mostrada en la figura 1, y a diferencia de la realización mostrada en la figura 6, sin embargo, se dispone una superficie reflectante 5 como parte de un elemento reflectante 6 para reflejar los haces desplazados que salen de la cara de salida 18 del prisma de SPR 15 de manera que los haces reflejados entran de nuevo en ti prisma de SPR 15 a través de la cara de salida 18, son reflejados por la superficie reflectante 17, y salen del prisma 15 a través de la cara de entrada 16. La placa de Savart 3 se utiliza de nuevo entonces para recombinar los haces desplazados reflejados y el haz recombinado es detectado por el detector 7 después de ser polarizado por el divisor de haz polarizante 2. Las funcionalidades del primer y el segundo elemento polarizante 13, 21 en la figura 6 se realizan mediante el divisor de haz polarizante 2 de la figura 7.

En el aparato ilustrado en las figuras 6 y 7, el modo de resonancia de plasmón superficial puede ser excitado por uno o por ambos de los haces desplazados. Para dio, la polarización debe establecerse de manera correspondiente. En particular, un modo de resonancia de plasmón superficial no puede ser excitado por una polarización que se encuentre dentro del plano de la superficie reflectante. Esto se ilustra en la figura 8. La figura 8(a) muestra una primera configuración de

polarización, en la que la luz de iluminación de entrada es polarizada

horizontalmente (o verticalmente). De este modo, los haces desplazados se trasladan verticalmente, y ambos pueden excitar el modo de resonancia de plasmón superficial, desplazar

En la figura 8(b) la luz de iluminación de entrada es polarizada en diagonal, de modo que los haces desplazados se trasladan en diagonal, y sólo uno de ellos puede excitar el modo de SPR, ya que el otro tiene una polarización en el plano de la superficie reflectante del prisma de SPR 15.

Las realizaciones descritas no pretenden ser limitaciones, sino servir de ejemplos que ilustran características y ventajas de la invención.