技术领域

本发明涉及化学药物领域， 涉及氢氧化铝 [Α1(ΟΗ) ₃ ]化合物在制药中的新的 用途， 具体涉及氢氧化铝 [Α1(ΟΗ) ₃ ]化合物在制备治疗肝癌药物中的应用。

背景材料

据报道， 原发性肝癌 (简称肝癌)是世界范围内第六位的最常见恶性� ��瘤， 每 年新增病例约 70余万， 其中肝细胞癌约占 80%。 调查显示肝癌是中国最常见的 恶性肿瘤， 我国每年新发肝癌病例约占全球发病总数的 55%,肝癌已成为我国第 二大肿瘤致死原因。 至今， 临床治疗中手术切除仍是治疗肝癌的最佳治疗 方法， 也是早期肝癌的首选治疗措施。 但由于原发性肝癌发病隐匿， 发展快速， 导致确 诊时能手术切除者仅为 10 %左右， 而且， 即使施行手术， 仍有许多病例无法完 全切除或肿瘤难以避免术后复发。 此外， 由于手术对人体的创伤较大， 常会使患 者的免疫力降低，并且导致一系列并发症， 因此，临床实践中对于晚期肝癌患者， 多因其肝功能不全而无法手术。这一部分病人 ， 需通过各种非手术切除的方法进 行治疗， 或者先行非手术治疗， 使肿块缩小局限， 再行手术切除治疗， 即二期切 除， 以使患者获得较好的益处。 因此， 寻找有效的肝癌非手术治疗方式对于提高 肝癌患者， 尤其是中晚期肝癌患者的生存率是至关重要的 。

目前， 肝癌的非手术治疗措施包括针对肿瘤的化学治 疗、 放射治疗、 免疫治 疗和基因治疗等。 肿瘤的免疫治疗是近年来兴起的最有前景的新 疗法， 该疗法能 增强免疫系统的自我调节能力， 激发特异性免疫反应， 从而达到治疗肿瘤并延缓 和降低肿瘤复发转移的目的。 通常， 肝癌的免疫治疗分为以下几类： （1)非特异 性免疫治疗， 指应用一些免疫调节剂通过非特异性地增强机 体的免疫功能， 激活 机体的抗肿瘤免疫应答， 以达到治疗肿瘤的目的； 目前应用于肿瘤治疗的有： 细 胞因子 (lL-2、 IFN、 TNF 等)、 微生物及其产物、 维生素 K、 热休克蛋白 (HSP) 等。 （2)主动免疫治疗， 指利用肿瘤细胞或肿瘤抗原物质诱导机体产生 特异性免 疫， 进而主动杀伤肿瘤细胞， 阻止肿瘤的生长扩散和复发以治疗肿瘤的方法 ； 目 前常用的括扩 DC疫苗、肿瘤细胞疫苗及异种重组甲胎蛋白疫� ��等。（3)过继免疫 治疗， 指向肝癌患者输入具有抗瘤活性的免疫细胞， 直接杀伤肿瘤或激发机体抗 瘤免疫效应， 从而达到治疗肝癌的目的。

氢氧化铝 [Α1(ΟΗ)3]作为美国 FDA和中国食品药品监督局批准的唯一人用疫 苗佐剂， 在疫苗中使用不仅可以提高机体的免疫应答而 且具有较好的安全性。 氢 氧化铝佐剂经 80余年的使用， 其有效性和安全性已得到了实践的验证和人们 的 公认， 并已获得批准应用于商业性的疫苗， 如白百破三联疫苗 (DTP)、 型流感嗜 血杆菌疫苗、乙肝疫苗 (HBV)等。有关商品化的氢氧化铝佐剂，其实质� �� Α1(ΟΗ)3 的不完全脱水产物， 即纤维状结晶形态的粒子， 大小 4.5 nm χ 2.2 nm x 10 nm, 等电点 11.4。 这种粒子聚集后以松散的 1 ~ 10 μ ηι大小的形式存在。 在化学上， 氢氧化铝佐剂是以铝羟基形式存在的，其羟基 可以提供或接受质子， 从而表现为 两性化合物。 商业产品的佐剂氢氧化铝为近乎透明的溶胶， 黏附疫苗抗原后， 抗 原被限定在胶体形成的特定网格结构中， 可通过 "储存库效应" 和 "免疫刺激 效应"两种机制增强机体对抗原的免疫应答。� �存库效应是指抗原提呈细胞 (APC) 在对抗原摄取、 加工、 处理过程中， 抗原与免疫细胞作用时间越长， 就越有利于 后续的免疫应答。 氢氧化铝黏附疫苗抗原后， 在其表面和内部高度浓聚着许多抗 原，物理性的呈递给免疫细胞，而不改变其化 学结构， 以便于免疫细胞能充分地、 高水平地、 长时间地与疫苗抗原接触作用， 从而使有意义的免疫应答被诱导。 免 疫刺激效应主要是指氢氧化铝后可激活 Β 细胞母细胞化， 进而促进抗体产生。 近来随着研究的深入， 人们发现氢氧化铝还可通过多种方式刺激机体 的免疫效 应， 包括 1)促进炎性细胞的聚集， 如中性粒细胞、 炎性单核细胞和树突状细胞 (DC); 2)作用于人的外周血单核细胞，诱导单核细胞� ��化为成熟的 CD40 ⁺ 、 CD83+ DC; 3)诱导动物模型的 Th2型免疫应答； 4)介导炎性因子的分泌， 如通过 Nlrp3 炎症小体介导 IL-Ιβ分泌； 5)通过细胞表面脂类的活化促使 DC摄入抗原； 6)体 外诱导 T细胞显著增殖， 增强记忆性 CD8+ T细胞， 诱导杀伤性 T细胞的分化。

目前， 有关氢氧化铝作为疫苗佐剂的作用机制已在体 内外进行了大量的实验 研究， 但迄今尚未见氢氧化铝单独用于抗肿瘤及其相 关机制研究的报道。

发明内容

本发明的目的是提供氢氧化铝 [Α1(ΟΗ) ₃ ]化合物的新的药用用途。

本发明提供了氢氧化铝 [Α1(ΟΗ) ₃ ]在制备抗肿瘤药物中的用途， 尤其涉及氢 氧化铝作为单独成分在制备治疗肝癌的药物中 的应用。

本发明的氢氧化铝 [Α1(ΟΗ) ₃ ]是指广泛用于多种疫苗的氢氧化铝佐剂� �

本发明提供了氢氧化铝作为单独成分在制备治 疗肝癌药物中的应用。本发明 中， 进行了荷瘤实验小鼠体内肿瘤接种实验、 免疫学分析、 增殖、 凋亡和免疫组 化检测等多种实验手段， 结果显示： 给予氢氧化铝干预可明显抑制肝癌细胞的体 内增殖， 诱导中性粒细胞浸润肿瘤、 肿瘤细胞凋亡， 进而抑制皮下肿瘤的体内生 长并提高荷瘤小鼠的生存率，表明本发明釆用 氢氧化铝作为单独唯一成分能够有 效抑制肝癌细胞的生长， 具有抗肝癌作用。

本发明利用氢氧化铝 [Α1(ΟΗ) ₃ ]化合物（通过巿购渠道获得， 本发明的实施例 中由复旦大学上海医学院医学分子病毒学实验 室提供，）作为单独成分在小鼠肝 癌荷瘤模型中进行了实验。通过皮下注射小鼠 来源的肝癌细胞系（Hepal-6细胞， 本发明的实施例中由第二军医大学王红阳教授 实验室提供）， 建立小鼠肝癌荷瘤 模型， 观察小鼠皮下肿瘤的生长情况和小鼠的生存情 况， 结果显示， 空白组和给 予生理盐水组皮下肿瘤体积明显增大并有多只 实验小鼠死亡，而实验组给药氢氧 化铝 [Α1(ΟΗ) ₃ ]后仅有一只小鼠死亡， 小鼠皮下肿瘤生长速率明显减慢， 并有数 只小鼠的皮下肿瘤明显缩小， 几不可见。 通过对小鼠器官的 H&E染色， 显示给 药 Α1(ΟΗ) ₃ 后， 与空白组和给予生理盐水组相同， 小鼠主要脏器未见明显损伤。 通过对小鼠皮下肿瘤的免疫组化染色， 显示给药 Α1(ΟΗ) ₃ 后， 肿瘤细胞的增殖明 显减慢、 细胞凋亡明显增多。

本发明经实验表明， 给予 Α1(ΟΗ) ₃ 干预后， 可明显抑制肝癌细胞的增殖， 诱 导细胞凋亡，进而抑制皮下肿瘤的体内生长并 提高荷瘤小鼠的生存率， 表明本发 明的 Α1(ΟΗ) ₃ 作为单独唯一成分能够安全、 有效地抑制肝癌细胞的生长， 具有抗 肝癌作用。

进一步的， 本发明所述的 Α1(ΟΗ) ₃ 可作为单独活性成分制备治疗肝癌的药 物，还可作为单独成分与其他有效的肝癌干预 方法或抗肝癌药物用于肝癌的综合 干预措施。 如， 将 Α1(ΟΗ) ₃ 作为单独活性成分与手术或放射干预方法 或其他抗肝 癌药物联合用于肝癌的综合干预。

本发明为肝癌干预措施的选择和 Α1(ΟΗ) ₃ 的临床应用提供了新的思路。 为了便于理解， 以下将通过具体的附图和实施例对本发明进行 详细地描述。 需要特别指出的是， 具体实例和附图仅是为了说明， 显然本领域的普通技术人员 可以根据本文说明， 在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修 正和改变， 这 些修正和改变也纳入本发明的范围内。

附图说明

图 1是建立的小鼠肝癌荷瘤模型。

图 2是空白组、 生理盐水组和 Α1(ΟΗ) ₃ 组小鼠肿瘤生长关系图，

其中， 图 2-1是各组小鼠肿瘤的生长曲线； 图 2-2是给予处理 6周后， 各组 小鼠皮下肿瘤的代表性图片。

图 3是空白组、 生理盐水组和 Α1(ΟΗ) ₃ 组小鼠的生存曲线。

图 4是空白组、 生理盐水组和 Α1(ΟΗ) ₃ 组小鼠脏器情况图，

其中， 图 4-1是给予处理 6周后， 各组小鼠脏器的代表性图片； 图 4-2是各 组小鼠脏器的 H&E染色图。

图 5是空白组、生理盐水组和 Α1(ΟΗ) ₃ 组小鼠皮下肿瘤的 Ki67免疫组化染色图。 图 6是空白组、 生理盐水组和 Α1(ΟΗ) ₃ 组小鼠皮下肿瘤的 TUNEL细胞凋亡检测 图。

图 7是生理盐水组、 Al(OH) ₃ 7天和 11天开始治疗组的小鼠皮下肿瘤生长曲线图， 体内免疫细胞检测及统计图和皮下肿瘤切片的 H&E染色图，

其中图 7-1是生理盐水组、 Α1(ΟΗ) ₃ 7天和 11天开始治疗组的小鼠皮下肿瘤 生长曲线图；

图 7-2是生理盐水组、 Α1(ΟΗ) ₃ 7天和 11天开始治疗组的小鼠脾脏和肿瘤中 中性粒细胞的流式检测图及数据统计图；

图 7-3是生理盐水组、 Α1(ΟΗ) ₃ 7天和 11天开始治疗组的小鼠皮下肿瘤切片 的 H&E染色图。

具体实施方式

实施例 1: 小鼠肝癌荷瘤模型的建立

选取 4-6周龄、雄性 C57BL/6J小鼠 40只，釆用皮下注射方式每只接种 1 x 10 ⁷ 个 Hepal-6细胞， 两周后观察成瘤情况。 共有 29只小鼠成瘤， 随即分为空白 组 （ 9只；)、 对照组给予生理盐水（ 10只）和实验组给予 Α1(ΟΗ)3 ( 10只 )。 实施例 2: 空白组、 生理盐水组和 Α1(ΟΗ)3组小鼠肿瘤生长情况

空白组小鼠不予处理、 实验组小鼠给予 Α1(ΟΗ)3 溶液 （溶于生理盐水）， 0.25mg/只， 每隔 3 天一次， 腹腔注射。 对照组给予等量的生理盐水 (0.9%NaCl 液体)， 每隔 3天一次， 腹腔注射。 给药后每周测量各组小鼠皮下肿瘤大小， 计 算肿瘤体积 （肿瘤体积 =肿瘤长径 X 肿瘤短径 ² / 2 )。 给予处理 6周后， 处死各 组小鼠， 取出皮下肿瘤并绘制肿瘤生长曲线。

如图 2-1和 2-2所示， 空白组与生理盐水组小鼠的皮下肿瘤生长较迅 速， 体 积明显增大， 两组间肿瘤体积和生长曲线无明显差异。 给予 Α1(ΟΗ)3 后， 小鼠 皮下肿瘤生长速度明显减慢， 体积明显缩小， 实验证实注射 Α1(ΟΗ)3 可明显抑 制小鼠体内肝癌细胞的生长。

实施例 3: 空白组、 生理盐水组和 Α1(ΟΗ)3组小鼠的生存曲线

空白组、 生理盐水组和 Α1(ΟΗ)3组小鼠按实施例 2所述方法给予处理， 每日 观察小鼠的生存情况并绘制生存曲线。 如图 3结果所示， 截止至实验结束时， 空 白组共有 4只小鼠死亡， 生理盐水组有 5只小鼠死亡， 而 Α1(ΟΗ)3组仅有一只 小鼠死亡。 结果表明注射 Α1(ΟΗ)3能明显提高荷瘤小鼠的生存率。

实施例 4: 空白组、 生理盐水组和 Α1(ΟΗ)3组小鼠脏器情况

空白组、 生理盐水组和 Α1(ΟΗ)3组小鼠按实施例 2所述方法给予处理， 6周 后处死小鼠， 收取各组小鼠脏器（心、 肝、 脾、 肺和肾）， 以福尔马林液固定， 石蜡包埋， 制作切片并进行 H&E染色。 H&E染色方法： 1)脏器组织石蜡切片脱 蜡至水； 2)苏木精液染色 5 min, 水洗； 3)1%盐酸乙醇 1-3 s, 水洗； 4)0.5%伊 红液染色 lmin, 水洗； 5)脱水封片。

如图 4-1和 4-2所示， 各组小鼠脏器的形态、 体积和组成细胞均未见明显异 常， 表明注射 Α1(ΟΗ) ₃ 对小鼠主要脏器没有明显的损伤作用。

实施例 5: 空白组、 生理盐水组和 Α1(ΟΗ)3组小鼠皮下肿瘤的 Ki67免疫组化染 色

空白组、 生理盐水组和 Α1(ΟΗ)3组小鼠按实施例 2所述方法给予处理， 6周 后处死小鼠， 取出皮下肿瘤组织， 以福尔马林液固定， 石蜡包埋， 制作切片并进 行 Ki67免疫组化染色。 Ki67是一种增殖细胞相关的核抗原， 其功能与有丝分裂 密切相关， 在细胞增殖中是不可缺少。 Ki67 作为标记细胞增殖状态的抗原， 其 阳性染色说明细胞增殖活跃。 Ki67 染色方法： 1)肿瘤组织石蜡切片脱蜡至水； 2)3%H202 室温 lOmin,水洗； 3)抗原修复； 4)山羊血清封闭 30min; 5)滴加 Ki67 抗体 ( 1 :100, 购自 Cell Signaling Technology公司 )， 4°C过夜; 6)滴加辣根过氧 化物酶标记的二抗 （购自上海长岛生物公司） 37°C 30min; 7)DAB 显色 （购自 DAKO公司）； 8)苏木素复染， 盐酸酒精分化； 9)脱水封片。

如图 5所示， 与空白组和生理盐水组相比， Α1(ΟΗ)3组小鼠皮下肿瘤中 Ki67 染色阳性细胞明显减少， 证明注射 Α1(ΟΗ) ₃ 明显抑制小鼠体内肝癌细胞的增殖。 实施例 6: 空白组、 生理盐水组和 Α1(ΟΗ)3组小鼠皮下肿瘤的 TUNEL细胞凋 亡检测

空白组、 生理盐水组和 Α1(ΟΗ)3组小鼠按实施例 2所述方法给予处理， 6周 后处死小鼠， 取出皮下肿瘤组织， 以福尔马林液固定， 石蜡包埋， 制作切片并进 行 TUNEL细胞凋亡检测 （ TUNEL FITC染色试剂盒购自上海睿安生物， 实验步 骤参见试剂盒说明书）。 TUNEL法是应用末端脱氧核糖核苷酸转移酶的作� ��在凋 亡细胞断裂 DNA的末端催化掺入荧光素 FITC标记的脱氧三磷酸尿苷， 进而在 荧光显微镜下直接观察 FITC标记细胞， 即为凋亡细胞。

如图 6 所示， 与空白组和生理盐水组相比， Α1(ΟΗ)3 组小鼠皮下肿瘤中 TUNEL FITC染色阳性细胞明显增多， 证明注射 Α1(ΟΗ) ₃ 明显诱导小鼠体内肝癌 细胞的凋亡。

实施例 7： 铝佐剂治疗方案的确立及机制研究

选取 5-6周龄、 雄性 C57BL/6J小鼠 21只， 随机分为 3组， 每组 7只， 釆 用皮下注射方式每只小鼠分别接种 1 X 10 ⁷ 个 Hepal-6细胞， 两组实验组小鼠分 别于接种后 7, 11天开始给予 Α1(ΟΗ)3溶液 （溶于生理盐水）， 0.25mg/0.25mL/ 只，每隔 3天一次，腹腔注射。对照组于接种后 7天给予等量的生理盐水 (0.9%NaCl 液体)， 每隔 3天一次， 腹腔注射。 给药后每周测量各组小鼠皮下肿瘤大小两次， 并计算肿瘤体积（肿瘤体积 =肿瘤长径 X 肿瘤短径 2/ 2 )。最后一次免疫后 3天， 处死所有小鼠， 取其脾脏经研磨， 裂红等处理， 获得单细胞悬疑， 进行中性粒细 胞， 巨噬细胞， N K , C D 4 , C D 8 T , T r e g等细胞流式检测。 肿瘤组织 经剪切， 胶原酶和 DNA酶消化处理后获单细胞悬液， 进行中性粒细胞和巨噬细 胞的流式检测。 并取部分肿瘤组织进行病理切片， 参照实例 2进行 HE染色。

如图 7-1所示， 当接种后 7天开始给予 Α1(ΟΗ)3后， 小鼠皮下肿瘤生长速度 明显减慢， 体积明显缩小。 而生理盐水组和 Α1(ΟΗ) ₃ 11天治疗组小鼠的皮下肿瘤 生长较迅速， 体积明显增大。 实验证实接种后 7天开始给予 Α1(ΟΗ)3 治疗可明 显抑制小鼠体内肝癌细胞的生长。

经过对小鼠脾脏和肿瘤中细胞进行流式分析， 结果显示， 小鼠脾脏中中性粒 细胞（ C D 1 1 b + G r 1 + )随肿瘤的增大而增多， 而肿瘤中的中性粒细胞则 随肿瘤的增大而减少， （如图 7-2 )对切片进行 HE染色可见 Α1(ΟΗ)3 7天治疗组 肿瘤内有大量的中性粒细胞， 其形态为具典型的分叶核的细胞（如图 7-4 )。 在显 微镜下观察肿瘤的切片结果可见： 1 ) 100倍下发现注射铝佐剂会引起肿瘤内细 胞的坏死， Α1(ΟΗ)3 7天治疗组的坏死比 11天治疗组的程度严重， 生理盐水组未 见任何坏死； 2) 400倍下可见 Α1(ΟΗ)3 7天治疗组的肿瘤内有大量的中性粒细胞 的侵润， 而在生理盐水组和 Α1(ΟΗ)3 11天治疗组的小鼠肿瘤内少有中性粒细胞 的侵润， 几乎全是肿瘤细胞； 3 ) Α1(ΟΗ)3 7 天治疗组的肿瘤内除了坏死， 还见 有坏死后的纤维化修复， 而在其他两组则见到大量的肿瘤细胞处于核分 裂相， 表 明肿瘤细胞生长旺盛（如图 7-4 )。 鉴于中性细胞具有抗肿瘤的作用， 据文献报道 肿瘤微环境内的 TGF- β可诱导中性粒细胞的功能发生变化， 发挥促肿瘤生长的 功能， 当阻断 TGF- β后， 中性粒细胞则具有抑制肿瘤生长的功能； 从本实验 7 天和 11天治疗组的效果差异可能也是因为肿瘤微环� ��的变化所致。