本发明涉及药物， 具体涉及 DKK4基因及其编码蛋白在制备药物中的应用， 尤其涉及 DKK4基因及其编码蛋白在制备检测或治疗胃肠� �间质瘤药物中的应 用。 背景技术

胃肠道间质瘤 (gastrointestinal stromal tumor, GIST) 是胃肠道最常见 的间叶来源肿瘤， 主要发生于胃 （约占 70%)。 近年来 GIST的发病率有逐年较快 增加的趋势， 近年来国内外流行病学统计显示 GIST发病率超过 20/百万人 /年。 2009年中国流行病学调査显示其发病率达到约 30/百万人 /年， 据推算， 中国每 年的新发病例数可达 4-5万例左右。 GIST 然已成为消化道内仅次于胃癌、 肠 癌的最常见的恶性肿瘤。 GIST大多起源于胃肠道粘膜下， 向腔内外突出生长， 因而早期并无特殊症状，大多数患者是在肿瘤 生长到一定阶段， 出现消化道出血 或发现腹部肿块才来就诊，甚至有不少患者直 到肿瘤破溃穿孔甚至腹腔内广泛破 散才能得到诊断， 导致错失最佳治疗时机。 由于 GIST起病部位隐匿， 给早期诊 断带来困难， 向腔外突出为主的胃 GIST在内镜检査中较易漏诊， 即使内镜下发 现病灶， 由于病灶深度的原因，大多不能像上皮源性肿 瘤一样取得明确的病理诊 断； 小肠或胃肠道外 GIST的诊断更至今仍是困扰临床医师的一大难� �， 几乎没 有可靠的影像学诊断手段， 甚至往往需要行剖腹探查才能实现诊断。 癌胚抗原 (CEA)应用于大肠癌的早期诊断或甲胎蛋白应用� ��肝癌的筛选已经取得了成功， 而相较于其他肿瘤， 起病隐匿诊断困难的 GIST更需要一种简单可行的生物学标 志物来应用于临床诊断。 GIST的生物学行为多样， 跨度覆盖良性、 低度恶性、 中度恶性、 高度恶性。 绝大多数体积很小的 GIST可以终生随访而无任何进展。 高度恶性病例预后极差， 生长极快， 在靶向治疗药物伊马替尼问世之前， 其中生 存期仅有 10-20个月， 5年生存率 <10%。 同时 GIST的生物学行为较难预测， 虽 然目前有普遍被接受的 NIH危险度分级（主要依据肿瘤大小、核分裂相 以及肿瘤 原发部位）， 但是临床上也有不少病例的病程发展较难用上 述分级标准来解释。 甚至有文献报道一些看似"良性的 GIST",即肿瘤直径 <2cm，核分裂相<5/50 ？ 的肿瘤患者，术后短期内发生复发和转移；也 不乏肿瘤巨大的患者在接受手术治 疗后即使不接受药物治疗也能获得长期生存。 因此，临床上亟待一种能够有效判 断 GIST预后的生物学指标。

小分子酪氨酸激酶受体抑制剂甲磺酸伊马替尼 的问世极大地改变了 GIST的 治疗策略， 该药物以 GIST发病的最根本分子异常 （c-kit基因突变） 为治疗靶 点， 发挥有效的抗肿瘤的作用。 然而，在靶向药物治疗应用的临床实践中也出 现 了一些问题： 1. 约有 5- 10%的患者对伊马替尼原发耐药， 而大多数对伊马替尼 初始治疗有效的患者最终会不可避免地发展为 激发耐药，耐药多发生于初始治疗 开始后 6个月至 2年内； 2. 目前高复发风险 GIST患者手术后接受一定时间的伊 马替尼辅助治疗已经取得共识， 然而辅助治疗合适的人群选择始终存在争议， 放 宽治疗适应症必然会带来医疗资源的浪费，增 加耐药的发生；过度严苛的适应症 也会导致一部分患者错过理应接受的合理治疗 ， 如果能够有更客观合理判断 GIST患者复发风险的指标， 将能极大地有利于 GIST的防治。

DKK基因家族由 Glinka于 1998年首次在两栖动物非洲蟾蜍胚胎细胞中发 现。 在脊椎动物中 DKK家族有四个成员， 分别编码 DKK1、 DKK2、 DKK3、 DKK4蛋 白，它们有较高的同源性。 DKK4(Dickkopf同源物 4)染色体定位于 8pl l. 2- pl l. 1 , 为一种分泌型糖蛋白， 参与机体发育及 Wnt信号转导途径的调控， 其通过与 Wnt 信号转导途径相应的受体结合来调控细胞的分 化、 增殖、 迁移或癌变等特性，在 肿瘤发生方面发挥重要作用。 之前对于 DKK4基因与胃肠道间质瘤发生的关系没 有相应的研究。 发明内容

本发明所要解决的技术问题在于克服上述不足 之处，研究设计 DKK4基因在制 药中的应用。

本发明提供了 DKK4基因及其编码蛋白在制备药物中的应用。

具体地， 本发明公开了 DKK4基因及其编码蛋白在制备检测或治疗胃肠� �间质瘤 药物中的应用。

本发明所述 DKK4基因名称：

中文名： DKK4 (Dickkopf 同源物 4) 英文名： DKK4 ( dickkopf homolog 4)

DKK4基因序列见序列表 1 (SEQ ID NO. 1 )。

本文所用术语 "DKK4"指在两栖动物非洲蟾蜍胚胎细胞中发现的 一个基因。 本发明所指的 DKK4基因包括其完整的 DNA编码序列， 其 RNA序列， 其突变体， 以及其功能上活性的片段。 DKK4编码蛋白为根据 DKK4基因信使 RNA中 CDS区域 序列在人体内翻译合成的蛋白质。需理解的是 ， 当编码相同的氨基酸时， 密码子 中的核苷酸的取代是可接受的。另外需理解的 是， 由核苷酸取代而产生的保守的 氨基酸取代时， 核苷酸的变换也是可被接受的。

本发明所述检测胃肠道间质瘤药物包括用 RT- PCR、 PCR、 免疫检测、 原位杂 交、 基因芯片诊断胃肠道间质瘤的药物或试剂盒。

所述用 RT-PCR检测胃肠道间质瘤的药物至少包括一对特 异性扩增 DKK4基因 的引物。

所述用 qPCR检测胃肠道间质瘤的药物至少包括一对特� �性扩增 DKK4基因的 引物。

所述用免疫检测胃肠道间质瘤的药物包括与 DKK4蛋白特异性结合的抗体、 多克隆抗体和单克隆抗体。

所述用原位杂交检测胃肠道间质瘤的药物包括 与 DKK4核酸序列杂交的探 针。

所述用基因芯片检测胃肠道间质瘤的药物包括 与 DKK4核酸序列杂交的探 针。

所述用于检测胃肠道间质瘤的试剂盒包含用于 RNA分离、 RNA扩增、免疫组 织化学染色、酶联免疫反应、蛋白定量分析的 纯化的试剂、标记等。所述试剂盒 由 DKK4作为活性成分与药用载体组成。

所述试剂盒对 DKK4的描述为： ΦΚΚ4 Dickkopf 同源物 4， dickkopf homolog 4)，一种首先两栖动物非洲蟾蜍胚胎细胞中发� ��的基因，其蛋白编码产物为一种 分泌性糖蛋白。

试剂盒的组分可以以水介质的形式或以冻干的 形式来包装。试剂盒中适当的 容器通常至少包括一种小瓶、试管、 长颈瓶、 宝特瓶、 针筒或其它容器， 其中可 放置一种组分， 并且优选地， 可进行适当地等分。在试剂盒中存在多于一种 的组 分时， 试剂盒中通常也将包含第二、第三或其它附加 的容器， 其中分离地放置附 加的组分。然而， 不同组合的组分可被包含在一个小瓶中。本发 明的试剂盒通常 也将包括一种用于容纳反应物的容器，密封以 用于商业销售。这种容器可包括注 模或吹模的塑料容器， 其中可保留所需的小瓶。

本发明的又一目的是提供了 DKK4基因及其编码蛋白在制备治疗胃肠道间质 瘤药物中的应用。

本发明所述治疗胃肠道间质瘤药物包括： 通过 RNA干扰抑制 DKK4基因表达 的双链核糖核酸、基于 DKK4抗原蛋白的肿瘤疫苗或抑制 DKK4蛋白活性的蛋白质。

本发明所述治疗胃肠道间质瘤药物可以通过口 服、 皮肤或肠胃外方式给药。 本发明所述治疗胃肠道间质瘤药物可以通过本 领域常规技术制成口服、 吸 入、 注射或栓剂等剂型。

本发明人通过下列试验：

a. 发明人首先选取 12例胃 GIST的新鲜手术切除标本， 按照目前使用的危险度 分级标准 （综合考虑肿瘤大小及核分裂相）， 按照肿瘤复发风险递增为标本顺序 编号 （低危 4例、 中危 4例、 高危 4例）。 利用 Roche公司的 NimbleGen芯片对 该 12例标本进行基因表达谱微阵列研究， 筛选出在不同危险度分组间随肿瘤危 险度升高呈显著上调或下调的基因 （p<0. 05， fold change>2) c 之后对筛选出的 基因在另外 24例 GIST新鲜肿瘤标本 （14例高危、 10例低危） 中进行实时定量 PCR验证。 筛选出 DKK4基因无论是在表达谱芯片结果中 （p=0. 00024， fold change=12. 63 ) 还是定量 PCR验证结果中 (p=0. 0029, fold change=42. 16) 均 呈现出在高危组 GIST中显著高表达。

b. 发明人利用组织微阵列技术构建了包含 139例 GIST组织标本（分别包含肿瘤 和瘤旁正常组织） 的组织芯片， 并利用免疫组织化学技术检测 DKK4在这些标本 中的表达情况，发现 DKK-4在瘤旁正常组织中阳性表达率远低于在肿� ��中阳性表 达率 （7. 2% vs 86. 5% )， 且 DKK-4表达强度与肿瘤直径 （p=0. 043 ) 肿瘤分级

(p=0. 018) 呈正相关。

c.发明人扩大样本， 构建了包含另外 187例 GIST肿瘤组织标本的组织芯片， 进 一步分析 DKK-4表达与 GIST临床病理资料及预后的关系，不仅发现 DKK4的表达 与肿瘤直径（p<0. 001 )、 核分裂相 （p=0. 02 )、 和肿瘤分级 (p<0001 )呈正相关， 还与 GIST患者术后生存状态 （p=0. 031 ) 及复发或转移 （p=0. 041 ) 密切相关。 通过 Kaplan-Meier方法绘制生存 /复发曲线， 根据 DKK4表达强弱进行分组患者 的生存 /复发曲线也可得以明显区分。

d. 本发明人运用 ELISA方法检测 20例 GIST患者血浆标本及 25例非 GIST人群 (包括 16例健康人群、 3例胃癌、 3例肠癌及 3例腹腔间叶源性肿瘤患者）血清 标本中 DKK-4蛋白的含量， 根据 DKK4标准品梯度浓度绘制标准曲线计算 DKK4 含量。 结果显示 GIST患者平均血清 DKK- 4蛋白含量（359. 5 ± 156. 4pg/ml )明显 高于非 GIST人群 (54. 92±4. 705pg/ml )， 差异有统计学意义 (P=0. 0347 ) ₀ e. 根据上述实验结果尤其是大样本量的临床资料 分析， 发明人已经发现 DKK4 在胃肠道间质瘤尤其是高度危险的胃肠道间质 瘤中有特别高的特异性表达，证实 了 DKK4基因与 GIST的生物学特性及 GIST患者预后存在一定联系。 该基因的蛋 白编码产物 DKK4蛋白作为一种分泌型糖蛋白， 可以在血清中得到检测， 且其水 平在 GIST患者中特异性升高，为 GIST疾病的早期诊断和预后判断提供一种新的 手段。

在得到了 DKK4的核酸片段的情况下，可根据核苷酸序列� �设计 DKK4特异性 引物 （探针）。 核苷酸全长序列或其片段通常可以用 PCR扩增法、 重组法或人工 合成的方法获得。 对于 PCR扩增法， 可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤 其是开放阅读框序列来设计引物， 并用市售的 cDNA库或按本领域技术人员已知 的常规方法所制备的 cDNA库作为模板， 扩增而得有关序列。 当序列较长时， 常 常需要进行两次或多次 PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次 序拼接在 一起。一旦获得了有关的序列， 就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这 通 常是将其克隆入载体， 再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿 主细胞中分 离得到有关序列。

此外， 还可用人工合成的方法来合成有关序列， 尤其是片段长度较短时。通 常， 通过先合成多个小片段， 然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前， 已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明 蛋白（或其片段， 衍生 物）的 DNA序列。 然后可将该 DNA序列引入本领域中已知的各种现有的 DNA分子 (或如载体)和细胞中。

本发明中， DKK4多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。 总之， 只要能在 宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以 用。表达载体的一个重要特征是通 常含有复制起点、 启动子、 标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含 DKK4的 DNA序列和合适的转录 / 翻译控制信号的表达载体。 这些方法包括体外重组 DNA技术、 DNA合成技术、体 内重组技术等。所述的 DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子 上， 以指 导 mRNA合成。 转化载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点 和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性 标记基因， 以提供用于选择转 化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用 的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以 及绿色荧光蛋白 (GFP)， 或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当 DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体， 可以用于转 化适当的宿主细胞， 以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞， 如细菌细胞； 或是低等真核细胞， 如酵母细胞； 或是高等真核细胞， 如哺乳动物细胞。代表性例子有： 大肠杆菌， 链霉菌属的细 菌细胞； 真菌细胞如酵母； 植物细胞； 昆虫细胞； 动物细胞等。

用重组 DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常 规技术进行。当宿主 为原核生物如大肠杆菌时， 能吸收 DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用 CaC 处理， 所用的步骤在本领域众所周知。 另一种方法是使用 MgCl ₂ 。 如果需 要， 转化也可用电穿孔的方法进行。 当宿主是真核生物， 可选用如下的 DNA转染 方法： 磷酸钙共沉淀法， 常规机械方法如显微注射、 电穿孔、 脂质体包装等。 获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发 明的基因所编码的多肽。根据所用 的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种 常规培养基。在适于宿主细胞生长 的条件下进行培养。 当宿主细胞生长到适当的细胞密度后， 用合适的方法 (如温 度转换或化学诱导)诱导选择的启动子， 将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在 细胞膜上表达、或分泌到细胞 外。如果需要， 可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种 分离方法分离和纯 化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所 熟知的。这些方法的例子包括但并 不限于： 常规的复性处理、 用蛋白沉淀剂处理 (盐析方法)、 离心、 渗透破菌、超 处理、 超离心、 分子筛层析 (凝胶过滤）、 吸附层析、 离子交换层析、 高效液相层 析 (HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结 合。 在获得了核酸序列后， 可根据核酸序列设计特异性核酸探针。设计探 针的方 法是本领域常规的， 可见 Sambrook等人， 分子克隆实验室手册 (New York : Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述。检测生物样品中是否存在 DKK4 蛋白或核酸的示范性方法包括获得测试受试者 的生物样品，使该生物样品接触能 与 DKK4 mRNA或基因组 DNA杂交的标记的核酸探针。 该核酸探针可以是， 例如人 的核酸或及一部分， 如长至少 15、 30、 50、 100个核苷酸并能在严谨条件下与 DKK4 mRNA或基因组 DNA充分杂交的核酸探针。 用于本发明诊断试验的其它探针 如本文所述。

核酸探针与扩增的标记序列接触。该探针优选 连接到一种发色团，但可被放 射标记。 在另一个实施例中， 探针连接到一种结合伴侣上， 如抗体或生物素，或 另一种携带可检测结构域的结合伴侣上。

在传统的方法中，检测可通过 Southern印迹以及与标记的探针杂交来进行。 Southern印迹所涉及的技术是本领域技术人员所� ��知的（参见 Sambrook等， 1989) 常规的检测还有生物芯片、 荧光显影技术、 细胞流式计数等。

另一方面， 本发明还包括对 DKK4 DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的 多克隆抗体和单克隆抗体， 尤其是单克隆抗体。 这里， "特异性"是指抗体能结 合于 DKK4基因产物或片段。较佳地，指那些能与 DKK4基因产物或片段结合但不 识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本 发明的抗体可以通过本领域内技术 人员己知的各种技术进行制备。

本发明所述 DKK4抗体可以通过 ELISA、 Western印迹分析，或者与检测基团 偶联， 通过化学发光、 同位素示踪等方法来检测。

DKK4 (Dickkopf 同源物 4) 染色体定位于 8pll. 2- pl l. 1， 为一种分泌型糖 蛋白，参与机体发育及 Wnt信号转导途径的调控，其通过与 Wr t信号转导途径相 应的受体结合来调控细胞的分化、增殖、迁移 或癌变等特性， 在肿瘤发生方面发 挥重要作用， 本发明人通过试验证明 DKK4基因可用于制备诊断或治疗胃肠道间 质瘤药物。

本发明首次提出利用基于血清 /组织中 DKK基因及其产物的检测来达到早期 诊断 GIST或对接受手术治疗的 GIST患者进行预后判断，建立在基因水平上的� � 通量芯片筛选 +实时定量 PCR验证和蛋白水平上的大样本临床样本验证， 结果可 靠， 且根据实验结果， DKK4无论是在基因水平还是蛋白水平上都能够� �著区分 肿瘤与非肿瘤、 高危肿瘤与低危肿瘤， 结果的重复性好， 且其在不同组别间的表 达量的差异巨大， 具有较好的临床应用价值。 附图说明

图 1 : 实时定量 PCR结果显示， 在 24例胃肠道间质瘤 （14例高危、 10例低危） 的新鲜肿瘤标本中， 低危组 （以 标注） 中 DKK4基因的表达量显著低于高危组 (以▲标注) 中的表达量 （p=0. 0029， fold change=42. 16)。

图 2: 免疫组化染色结果 （瘤旁正常组织， 阴性反应）

图 3: 免疫组化染色结果 （肿瘤组织， 阴性反应）

图 4: 免疫组化染色结果 （肿瘤组织， 弱阳性反应）

图 5: 免疫组化染色结果 （肿瘤组织， 阳性反应）

图 6: 免疫组化染色结果 （肿瘤组织， 强阳性反应）

图 7: 通过 Kaplan- Meier方法绘制的 326例胃肠道间质瘤患者的总生存曲线， 其中 DKK4染色阴性以♦标注， 弱阳性以秦标注， 阳性以▲标注， 强阳性以園标 注。

图 8: 通过 Kaplan-Meier方法绘制的 326例胃肠道间质瘤患者的无复发生存曲 线， 其中 DKK4染色阴性以令标注， 弱阳性以翁标注， 阳性以▲标注， 强阳性以 國标注。

图 9: 纵坐标为 DKK4血浆浓度， 左侧散点为胃肠道间质瘤患者血浆标本， 右侧 为非胃肠道间质瘤人群血浆标本。 具体实施方式

实施例 1. 实时定量 PCR分析：

1. 1 主要试剂

RNA抽提试剂 RNAiso Plus购自宝生物工程有限公司， 逆转录试剂盒 High Capacity cDNA Reverse Transcription Kits购自 Invitrogen公司， 焚光定量 PCR试剂盒 Power SYBR Green PCR Master Mix购自 Invitrogen公司， DKK4 及管家基因 P -肌动蛋白的引物设计采用 Primer 3软件， 引物合成由上海生工生 物工程技术服务有限公司完成， 其余试剂均为分析纯。

1. 2 胃肠道间质瘤病人肿瘤组织样品的收集

胃肠道间质瘤患者的肿瘤组织来源于上海交通 大学医学院附属仁济医院。 手术后组织标本立即置液氮中冷冻， 随后保存于- 80°C超低温冰箱。

1. 3 实时荧光定量分析 PCR分析

总 RNA抽提： 将超低温冻结的 RNA提取样品称量后迅速转移至用液氮预冷 的研钵中， 用研杵研磨组织， 其间不断加入液氮， 直至研磨成粉末状。 向研钵中 加入适量的 RNAiso Plus, 将研磨成粉末状的样品完全覆盖， 然后室温静置， 直 至样品完全融化，再用研杵继续研磨至裂解液 呈透明状。将匀桨液转移至离心管 中， 室温静置 5分钟。 12，000 g 4°C离心 5分钟。 小心吸取上清液， 移入新的离 心管中。 加入 RNAiso Plus的 1/5体积量的氯仿， 剧烈振荡 15秒， 待溶液充分 乳化后， 再室温静置 5分钟， 12, 000 g 4°C离心 15分钟。 吸取上清液转移至另 一新的离心管中。 向上清中加入等体积的异丙醇， 上下颠倒离心管充分混匀后， 在 15〜30°C下静置 10分钟。 12, 000 g 4°C离心 10分钟。 弃去上清， 沿管壁加 入 75%的乙醇 1 ml， 上下颠倒洗涤离心管管壁， 12, 000 g 4°C离心 5分钟后弃 去乙醇。 室温干燥沉淀 2〜5分钟， 加入适量的 RNase-free水溶解沉淀后用 Nanodrop2000测定 RNA浓度后于- 80 °C保存。

逆转录合成 cDNA: RNA解冻后在 0. 2mlPCR管中配置反应溶液， 反应体系如 下表：

加样后将反应管置于 PCR仪， 热循环体系为 25°C 10分钟—— 37Γ 120分钟 •85°C5分钟—— 4°C保存。

Realtime PCR检测： 在 96孔板中配制 20ul反应体系。每反应设 3个复孔， 以 Ρ -肌动蛋白为内参基因进行相对定量检测 DKK4基因表达量。

Realtime扩增体系如下表:

将加好样品的 96孔板放在 ABI9300荧光定量 PCR仪中进行反应，热循环体 下-.

Realtime PCR结果用 2-ΔΔσΤ法进行分析。 实验结果如图 1所示， 在 24 例胃肠道间质瘤 （14例高危、 10例低危） 的新鲜肿瘤标本中， 低危组中 DKK4 基因的表达量显著低于高危组中的表达量 （p=0. 0029， fold change=42. 16 )„ 实施例 2. DKK4在胃肠道间质瘤病人组织中的表达情况

2. 1 主要试剂

DKK4单抗（ab38589)及二抗山羊多克隆抗兔 IgG (ab6721 )购自 abeam公 司。 DAB显色剂及其底物试剂盒购自赛默飞公司。 其余试剂均为国产分析纯。

2. 2 胃肠道间质瘤组织芯片阵列的构建

胃肠道间质瘤患者的肿瘤组织来源于上海交通 大学医学院附属仁济医院。 芯片阵列构建由苏州新芯生物技术有限公司完 成， 点阵直径 1. 6mm, 层厚 3mm。 芯片一包括 139例胃肠道间质瘤肿瘤组织及相应邻近正常组 织， 芯片二包括 189 例胃肠道间质瘤肿瘤组织。

2. 3 免疫组织化学染色

脱蜡水化： 二甲苯 10分钟——二甲苯 1/2 10分钟——无水乙醇 5分钟一 一 95%乙醇 5分钟—— 70%乙醇 10分钟—— PBS洗。

抗原修复： 电炉加热 0. 01M枸橼酸钠缓冲溶液 （pH6. 0) 至 95°C左右， 放 入组织芯片加热 15分钟， PBS洗。

消除内源性酶： 3%过氧化氢 37°C孵育 30分钟， PBS洗。

抗原封闭： 10%山羊血清室温孵育 1小时。

一抗孵育： 滴加一抗 （DKK4单抗） 150ul， 4°C孵育过夜， PBS洗。

二抗孵育： 滴加二抗 （羊抗兔多抗） 150ul， 室温孵育 1小时， PBS洗。 发色： DAB显色 5-10分钟， 显微镜下控制发色程度， PBS洗。

苏木精复染 1分钟， 自来水冲洗 15分钟。

脱水、 封片、 镜检。

2. 4 组织芯片结果判断

以胞浆着色为阳性反应部位，对每个阵列点阳 性细胞的阳性强度按无着色、 淡黄色、 棕黄色和棕褐色分别打 0、 1、 2、 3分， 着色阳性面积按无着色、 着色 <1/3、 1/3〜2/3、 〉2/3分别打 0、 1、 2、 3分， 然后根据两项打分之和判断其结 果： 0分为阴性， 1-2分为弱阳性， 3-4分为阳性， 5-6分者为强阳性 (注： 每张 切片选择有代表性的区域， 在 400倍视野下进行计数， 共计 5个视野， 取其平均 值以避免随意性）

2. 5 统计学分析

将组织芯片结果输入 SPSS20. 0中进行分析， 以卡方检验分析 DKK4表达与 临床病理资料相关性， 显著性水平定义为 p〈0. 05。 以 Kaplan-Meier法进行生存 分析， 显著性水平定义为 p<0. 05。

免疫组化染色典型结果见图 2-图 6。 分析结果显示 DKK-4在瘤旁正常组织 中阳性表达率远低于在肿瘤中阳性表达率 （7. 2% vs 86. 5%)， 且 DKK4的表达与 肿瘤直径 （p<0. 001 )、 核分裂相 （p=0. 02 )、 和肿瘤分级 （p〈0001 ) 呈正相关， 还与 GIST患者术后生存状态 （p=0. 031 ) 及复发或转移 （p=0. 041 ) 密切相关。 通过 Kaplan-Meier方法绘制生存 /复发曲线，根据 DKK- 4表达强弱进行分组患者 的生存 /复发曲线也可得以明显区分， 见图 7-图 8。