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Title:
APPLICATION OF INULA LINEARIIFOLIA LACTONE A IN PREPARATION OF MEDICINE FOR TREATING MYOCARDITIS
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2013/188996
Kind Code:
A1
Abstract:
The present invention provides an application of Inula lineariifolia lactone A in the preparation of a medicine for treating a myocarditis. The Inula lineariifolia lactone A has a structure shown in a formula (I). In an animal medicine effect test, the Inula lineariifolia lactone A has a certain coxsackie virus resistance, and has an curative effect on a myocarditis in a model of autoimmune myocarditis of a mouse. The present invention further provides a pharmaceutical composition prepared from the Inula lineariifolia lactone A and a routine medicinal carrier, wherein the pharmaceutical composition may be a tablet, a dispersible tablet, a lozenge, an orally disintegrating tablet, a sustained release tablet, a capsule, a soft capsule, a dripping pill, a granule, an injection, a powder injection or an aerosol and the like.

Inventors:
ZHANG WEIDONG (CN)
SHAN LEI (CN)
JIN HUIZI (CN)
SU JUAN (CN)
LI HUILIANG (CN)
SHEN YUNHENG (CN)
XU XIKE (CN)
LIU RUNHUI (CN)
Application Number:
PCT/CN2012/001306
Publication Date:
December 27, 2013
Filing Date:
September 25, 2012
Export Citation:
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Assignee:
UNIV PLA 2ND MILITARY MEDICAL (CN)
International Classes:
A61K31/365; A61K9/08; A61K9/12; A61K9/14; A61K9/20; A61K9/22; A61K9/48; A61P9/00; A61P29/00; C07D307/93
Foreign References:
CN101830875A2010-09-15
Other References:
HUANG, ZHIGANG ET AL.: "Relationship between nitric oxide and the development of viral myocarditis in mice.", CHINESE JOURNAL OF ENDEMIOLOGY., vol. 19, no. 5, September 2000 (2000-09-01), pages 330 - 332, XP008175945
See also references of EP 2865380A4
LI-YUE NIE ET AL., JOURNAL OF NATURAL PRODUCTS, vol. 73, no. 6, 2010, pages 1117 - 1120
Attorney, Agent or Firm:
SHANGHAI XIN TIAN PATENT AGENT CO., LTD. (CN)
上海新天专利代理有限公司 (CN)
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Claims:
权利 要 求

1、 线叶旋覆花内酯 A在制备治疗心肌炎药物中的应用, 其特征在于所述线 叶旋覆花内酯 A的结构式如下:

2、 根据权利要求 1所述的应用, 其特征在于, 所述线叶旋覆花内酯 A通过 下列方法制备得到- 将线叶旋覆花干燥全草粉碎, 以 8~20倍重量的 80~95%乙醇回流提取 1~3 次, 每次 2~3小时, 合并提取液, 提取液减压浓缩成流浸膏, 流浸膏相当于 lml 含线叶旋覆花 0.8-1.2g, 流浸膏加 1~3倍重量的水稀释后, 以石油醚 0.5~2倍量 V/V萃取 3~5次, 得到石油醚部分; 将上述石油醚部分应用硅胶柱层析, 以体积 比为 100: 0-1: 1的石油醚 /乙酸乙酯系统梯度洗脱, 薄层层析检测, 收集含线 叶旋覆花内酯 A的流分, 再经 C18反相柱层析, 以重量比为 50: 100-70: 100的 甲醇 /水进行洗脱, 薄层层析检测, 得线叶旋覆花内酯 A纯品。

3、 根据权利要求 1所述的应用, 其特征在于所述药物为由线叶旋覆花内酯 A 作为活性成分与药用载体制成的药物组合物。

4、根据权利要求 3所述的应用,其特征在于所述药物组合物为片剂、分散片、 含片、 口崩片、 缓释片、 胶囊剂、 软胶囊剂、 滴丸、 颗粒剂、 注射剂、 粉针剂或 气雾剂。

Description:
线叶旋覆花内酯 A在制备治疗心肌炎药物中的应用 技术领域

本发明涉及中药, 具体涉及线叶旋覆花内酯 A在制备治疗心肌炎药物中的 应用。 背景技术 心肌炎是心肌发生的局限或弥漫性炎症, 可原发于心肌, 也可是全身 性疾病的一部分。 病因有感染、 理化因素、 药物等, 最常见的是病毒性心 肌炎。 近年来, 由于抗生素的广泛应用, 因链球菌感染引起的风湿热逐渐减少, 风湿性心肌炎发病明显减少,而病毒性心肌炎 发病却日益增多。病毒性心肌炎可 由多种病毒感染引起, 其中以柯萨基病毒 B最常见, 水痘、 EB病毒也可引起。 据研究, 约有 5%病毒感染者感染后可累及心脏发生心肌炎。 可为病毒感染后的 直接侵袭心肌,也可为病毒感染后的自身免疫 反应所致。病毒性心肌炎的病变轻 重不一。 轻度、 局限性病变者可毫无症状, 心电图无异常表现, 血沉、 心肌酶也 无升高。重者则有明显症状, 出现心脏弥漫性扩大,心力衰竭, 以致有显著气急, 不能平卧; 有的严重心率失常, 以致发生反复晕厥, 甚至猝死。 目前, 西医对心 肌炎及心肌病的治疗效果还不理想.对病毒性 肌炎患者来说,没有特效的抗病 毒药物.对慢性心肌炎患者的心律失常疗效欠 .中医中药在心肌炎的防治中积 累了丰富的经验, 对降低死亡率、 减少后遗症有明显的优势。

线叶旋覆花 [Inula lineariifolia Turcz. (syn. Inula linariaefolia) ] 是菊科旋覆花属植物, 多年生草本,俗名窄叶旋覆花、条叶旋覆花、 小朵旋覆花。 广产于我国东北部、 北部、 中部和东部, 如河南、 河北等省。 也分布于蒙古、朝 鲜、 俄罗斯(远东地区)和日本。 生于山坡、 荒地、 路旁、 河岸, 极常见。 中药 旋覆花即为旋覆花或大花旋覆花等的头状花序 , 而植物全草 (金沸草)亦供药用。 线叶旋覆花过去在华东等部分地区也作旋覆花 使用,并且作为下气、行水、消炎、 软坚之药, 曾被收载于 1963年版中国药典(一部), 但病人服后有恶心、 呕吐等 反应, 目前已停止使用。

本发明人对线叶旋覆花进行了系统的化学成分 研究,分离得到大量倍半萜类 化合物, 相关研究结果发表了学术论文 [Journal of Natural Products (Li-Yue Nie, Hui-Zi Jin„ et al, J Nat Prod, 2010, 73 (6): 1117-1120)。经进一步研究发现线叶旋 覆花内酯 A具有治疗心肌炎的功效, 宜研究开发新药。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于研究设计线叶 旋覆花的提取物线叶旋覆花 内酯 A用于制备治疗心肌炎药物。

本发明提供了线叶旋覆花内酯 A在制备治疗心肌炎药物中的应用。 线 构式如下:

本发明所述线叶旋覆花内酯 A是通过下列方法制备得到的:

将线叶旋覆花千燥全草粉碎, 以 8~20倍重量的 80~95%乙醇回流提取 1~3 次, 每次 2~3小时, 合并提取液, 提取液减压浓缩成流浸膏, 流浸膏相当于 lml 含线叶旋覆花 0.8-1.2g, 流浸膏加 1~3倍重量的水稀释后, 以石油醚 0.5~2倍量 V/V萃取 3~5次, 得到石油醚部位。将上述石油醚部位应用硅胶 柱层析, 以体积 比为 100: 0-1: 1的石油醚 /乙酸乙酯系统梯度洗脱, 薄层层析检测, 收集含线 叶旋覆花内酯 A的流分, 再经 C 18 反相柱层析, 以重量比为 50: 100-70: 100的 甲醇 /水进行洗脱, 薄层层析检测, 得线叶旋覆花内酯 A纯品。

本发明将制备得到的线叶旋覆花内酯 A进行动物药效试验, 观察该化合物对 结果小鼠生命的保护、 生命延长、 体重、 心指数、 病理形态学等的影响, 以及对 心功能、血清中和抗体滴度、心肌组织病毒滴 度的检测, 结果提示线叶旋覆花内 酯 A具有一定的抗柯萨奇病毒的活性, 且有显著的量效关系。线叶旋覆花内酯 A 腹腔注射给药 ZO mg/kg'd- 1 能较好的阻止小鼠自身免疫性心肌炎 (EAM) 模型的 发病过程; 灌胃给药 lOO mg/kgA 1 对 EAM也具有一定的疗效。 因此, 线叶旋覆花 内酯 A可用于制备治疗心肌炎的药物。

本发明所述线叶旋覆花内酯 A在制备治疗心肌炎的药物为由线叶旋覆花内 酯 A作为活性成分与常规药用载体制成的药物组 物。所述药物组合物可以是片 剂、 分散片、 含片、 口崩片、 缓释片、 胶囊剂、 软胶囊剂、 滴丸、 颗粒剂、 注射 剂、 粉针剂或气雾剂等。 有较大的临床应用价值。 附图说明

图 1 腹腔注射线叶旋覆花内酯 A后小鼠 HW/BW变化

图 2 腹腔注射线叶旋覆花内酯 A后小鼠心脏形态学

图 3 灌胃线叶旋覆花内酯 A后小鼠心脏形态学

图 4腹腔注射线叶旋覆花内酯 A(XX-3)后 TNF-a变化

图 5 腹腔注射线叶旋覆花内酯 A后心肌 HE染色

具体实施方式

实施例 1 线叶旋覆花内酯 A的制备

将线叶旋覆花干燥全草 50Kg粉碎, 以 90%乙醇 750L回流提取 2次, 每次 2小时, 合并提取液, 提取液减压浓缩成流浸膏, 流浸膏相当于 lml含线叶旋覆 花 1.0g, 流浸膏加水 50L稀释后, 以石油醚每次 50L萃取 5次, 得到石油醚部 分。 将石油醚部分应用硅胶柱层析, 以体积比为 100: 0-1: 1的石油醚 /乙酸乙 酯系统梯度洗脱, 薄层层析检测, 收集含线叶旋覆花内酯 A的流分, 再经 C 18 反相柱层析, 以重量比为 50: 100-70: 100的甲醇 /水进行洗脱, 薄层层析检测, 得线叶旋覆花内酯 A纯品 45.3g。

(得到的化合物先采用质谱测定分子量 366, 分子式 C 19 H 28 0 7 , 再进行核磁 共振分析得到碳谱、氢谱以及二维谱数据, 进行结构解析, 与已知化合物线叶旋 覆花内酯 A的数据一致而确证 )。

实施例 2 线叶旋覆花内酯 A抗柯萨奇病毒小鼠体内药效试验

一, 材料和方法

受试样品: 线叶旋覆花内酯 A化合物 (实施例 1制得)。

病 毒: 柯萨奇 B组病毒 B3型 Nancy株 (CVB3)。

病毒感染剂量: 10LD 5G 病毒 0.2ml经腹腔感染小鼠。

动 物: Balb/c,雄性小鼠, 13-15g。 上海西普尔 -比克实验动物有限 公司, 动物合格证号: SCXX (沪) 2008-0016。

阳性对照药: 重组人干扰素 a-2a, 因特芬, 沈阳三生制药有限责任公司, 产品批号 20090708。 药液配制和给药途径: 称取受试样品: 线叶旋覆花内酯 A化合物, 研磨后 悬浮于 0.5%CMC (羧甲基纤维素) 溶液 配制成 10mg/ml的溶液。

口服给药。 一日一次, 每次 0.5 ml, 共给药 7天。

实验分组: 病毒感染组, 每组 10只, 给予 0.5%CMC溶液。

正常对照组, 每组 10只, 给予 0.5%CMC溶液。

阳性药物对照组,每组 10只,皮下注射重组人干扰素 a-2a悬浮于 0.5%CMC 溶液, 每只小鼠 1.5万单位, 每 2天注射一次, 共注射 4 次。

药物治疗高剂量组 lOOmg/kg, 每组 10只, 口服给予线叶旋覆花内酯 A 药物治疗中剂量组 50mg/kg, 每组 10只, 口服给予线叶旋覆花内酯 A 药物治疗低剂量组 10mg/kg, 每组 10只, 口服给予线叶旋覆花内酯 A 观测指标: 生命保护、 体重、 中和抗体、 病毒滴度, 心肌组织病理切片,心 脏超声。

试验过程: 小鼠病毒感染后 (除正常对照组外) 2小时内给药, 共给药连续 7天, 观察至 14天。 每天记录其发病率、 死亡数。 计算平均生存天数、 延长生 命率, 以 p值计算差别。

另设组, 每组 10只, 感染给药, 第 7天时称重, 取 4只检测心功能, 并杀 剖小鼠,采血检测中和抗体、取心脏称重计算 心指数,并研磨心脏,用含 10%三 抗的 MEM液以 1:10稀释, 在细胞模型上检测小鼠柯萨奇病毒滴度 (观察心肌 分离的病毒感染的细胞病变)。

二、 实验结果

表 1 线叶旋覆花内酯 A对 CVB3感染小鼠生命的保护

与病毒组比较, *: P<0.05, **: P<0.01

结果显示用药组 100mg/kg, 50mg/kg, 10mg/kg, 都能延长生存时间, 延长 百分率分别达到 28.77%, 23.29%, 21.92%。 干扰素也能延长生存时间, 但是与 病毒对照组相比均未见显著性差异。 表 2 线叶旋覆花内酯 A对 CVB3感染小鼠第 7天时小鼠心肌病毒滴度测定.

-: 0%, ±:25% , +:50%, ++100%

结果显示病毒感染后的心肌可感染宿主细胞造 成细胞病变,病毒组心肌中的 病毒诱导的细胞病变达到 90%。 线叶旋覆花内酯 A对柯萨奇病毒在心肌中的复 制有一定的抑制作用, 100mg/kg治疗组将细胞病变降低到 40%。 线叶旋覆花内酯 A对 CVB3病毒感染存活小鼠体重的影响

用药前 4天 8天 14天

M±SD P M±SD P M±SD P M±SD P 病毒组 14.65±0.59 1 12.84±0.92 0**

lOOmg/Kg 14.57±0.55 0.75 15.13±0.88 0.00021** 16.1±1.05 0** 18.21±0.86 Q**

50mg/Kg 14.58±0.49 0.77 15.14±0.68 0** 16.03±0.96 18.33±0.80 0** lOmg/Kg 14.59±0.71 0.84 15.23±1.01 15.59±0.89 0** 17.92±1.10 Q** 干扰素 14.53±0.59 0.65 14.80±1.50 0.0016** 15.82±0.47 0** 18.07±0.88 0** 正常组 14.65±0.56 16.77±0.75 19.06±0.77 22.65±1.03

所有组别都与正常组相比, **: P<0.01 , *: P<0.05

结果显示: 病毒感染后 4天, 小鼠体重明显下降, 在第 8天时病毒组小鼠全 部死亡, 给药组小鼠体重有所增加, 但与正常组相比仍有显著差异。 表 4 : 线叶旋覆花内酯 A对 CVB3感染鼠血清中和抗体的作用

表中的 1:X表示血清稀释倍数, 稀释倍数越高表明抗体中和能力越强, 结 果显示:线叶旋覆花内酯 A提高 CVB3感染小鼠中和抗体, 7天时有一定的量效 关系。

实施例 3 线叶旋覆花内酯 A对小鼠自身免疫性心肌炎(EAM)模型的治疗作 用

3.1 EAM造模方法

猪心肌肌球蛋白 (PCM,1 mg/ml; Sigma, St. Louis, MO) (SIGMA),与等体积弗 氏完全佐剂 (FCA, Sigma St. Louis, MO), 充分乳化均匀, 混合成均质乳化液, 且其中人结核分枝杆菌 H37Ra珠 (Difco, Detroit, MI)终浓度为 5 mg/ml 。 于第 0 天取乳化液 0.2 ml (含抗原 200μ 8 ) 于每只小鼠双侧腹股沟和腋下多点皮下注 射, 初次免疫后第 7天按相同方法加强免疫 1次。 动物分组, 每组 6只。

3.2给药方式

时间: 从免疫的当天开始即每天给予小鼠线叶旋覆花 内酯 Α, 连续给药 21 天。

方式: 采取了两种给药方式

①腹腔注射。线叶旋覆花内酯 Α (实施例 1制得)溶于 PBS (磷酸盐缓冲液) (含有 5% DMSO (二甲基亚砜))。 设 4个浓度梯度:

• 2.5 mg/kg-d- 1 (每次 2.5 mg/kg 每天一次)

參 5 mg/kg-d" 1

• 10 mg/kg-d" 1

參 20 mg/kg-d" 1

②灌胃给药。 线叶旋覆花内酯 A悬于 0.5%的 CMC-Na (羧甲基纤维素钠) 中。 设 3个浓度梯度:

• 10 mg/kg-d" 1

• 50 mg/kg-d" 1

• 100 mg/kg-d" 1

3.3 实验结果

小鼠于第 21天脱颈处死, 剪取心脏, 称重、 拍照、 病理切片 (HE (苏木精- 伊红) 染色)、 细胞因子 TNF-a 的变化。

( 1 ) 心脏与体重比 (HW/BW)

小鼠心肌炎发病后心脏 /体重的比值应比模型组偏大, 若药物有效, 则比重 小, 与正常组近似。 实验结果发现, 线叶旋覆花内酯 A ( XX-3 ) 腹腔注射 20 mg/kg - 1 后 HW/BW变化明显, 如图 1所示。

(2) 心脏形态学

小鼠 EAM发病后, 心脏由于炎症细胞的浸润, 而在形态上上表现为肿大、 苍白。腹腔注射线叶旋覆花内酯 A ( XX-3 )后各剂量给药组的动物心脏形态上, 均仍能观察到心脏的不痛程度的肿大等病变, 但与模型组和溶媒对照组同病变比 较,其病变程度和波及范围均己呈现不同程度 的改善,提示受试药对靶小鼠心肌 炎症具有一定疗效,其中以 SO mg/kg 1 药效最佳。灌胃给药实验结果也显示线叶 旋覆花内酯 A对小鼠 EAM模型具有一定疗效,最佳药效剂量为 20 mg/kg,H。见图 2、 3。

(3 ) TNF-a变化

TNF-a作为前炎症因子, 在 EAM发病过程中起了较为重要的作用。 于初次 免疫后 21天后眼眶后静脉丛取血, 采集血液放置抗凝试管中, 于 3000 r /min离 心后留取血清标本, 冻存于 -20°C备用。 测试结果如图 4所示, 模型组在初次免疫 21天后, 血清中 TNF-a的表达与 对照组相比显著性提高 ("P < 0.01)。 腹腔注射给予线叶旋覆花内酯 A与模型组 比较, 血清中 TNF-a的水平均下降, 在 20 mg/kg 组有显著性差异 (#P < 0.05)。

模型组于空白组比较, W P<0. 01 ; 20mg/kg 组与模型组比较, # P<0. 05。

(4) 病理切片 (常规 HE染色)

脱颈处死小鼠, 取出心脏, 去除余血, 将每个心脏用 10%甲醛固定, 石蜡包 埋, 间断切片, 常规 HE染色, 显微镜下观察。 模型组可见灶内心肌细胞变性坏 死, 胞质红染、核消失,伴部分肌溶解, 间质增宽, 内有多种炎症细胞弥散浸润; 对照组未见明显异常。 见图 5

各剂量给药组的动物心脏组织切片中, 均仍能观察到心肌细胞局灶性坏死、 钙化或表现有不同程度的灶片状心肌炎症等病 变,但与模型组和溶媒对照组同病 变比较,其病变程度和波及范围均已呈现不同 程度的改善,提示线叶旋覆花内酯 A对小鼠心肌炎症具有一定疗效, 其中以腹腔注射 SO mg/kg 和灌胃口服 100 mg/kg 1 药效最佳 (均为本实验给药的最高剂量)。 实施例 4

片剂: 线叶旋覆花内酯 A 50g

乳糖 280g

玉米淀粉 62g

硬脂酸镁 8g

制备方法: 将线叶旋覆花内酯 A、 乳糖和玉米淀粉混合, 用水均匀湿润, 把湿润后的混合物过筛(16目筛)并干燥(60° 烘干 30min), 再过筛(14目), 加入硬脂酸镁, 然后将混合物压片, 每片重 400mg, 线叶旋覆花内酯 A含量为 50mg。

实施例 5:

注射液: 线叶旋覆花内酯 A 6g

葡萄糖 50g

制备方法: 将线叶旋覆花内酯 A和葡萄糖溶解于适量的注射用水 中, 过滤所得溶液, 在无菌条件下装入输液瓶 (每瓶 100ml) 中, 每瓶含线叶旋 覆花内酯 A 6mg。

实施例 6:

注射用冻干粉针剂: 线叶旋覆花内酯 A 60g

甘露醇 240g

制备方法: 将线叶旋覆花内酯 A和甘露醇溶解于适量的注射用水中, 过滤 所得溶液, 在无菌条件下装入西林瓶(10ml西林瓶, 每瓶 2ml) 中, 冻干, 每支 含线叶旋覆花内酯 A 60mg。