技术领域

本发明涉及环糊精和胶原蛋白交联剂， 具体涉及一种环糊精多醛交联剂的 应用方法。 说 背景技术

胶原蛋白是一种生物天然高分子物质， 英文学名 collages胶原蛋白存在于 书

所有细胞动物体内， 是体内含量最多的一类蛋白质， 存在于几乎所有组织中， 是细胞外基质成分。 胶原蛋白拥有特殊的 3股螺旋肽链结构， 赋予胶原蛋白许 多良好的生物和化学特性。 胶原蛋白具有良好的生物相容性， 生物可降解性， 低抗原性； 具有细胞适应性、 细胞增殖左右和促进血小板凝聚的作用； 具有较 好的可溶解性， 无毒性， 独特的纤维形成特性； 以及易于改性和来源广泛等优 点。 因此， 胶原蛋白作为一种非常重要的生物材料， 被广泛应用与伤口敷料、 人工皮肤、 美容、 药物缓释、 组织工程支架和细胞培养等方面， 胶原蛋白的价 值越来越受到人们的重视。

但是， 从动物组织中提取的纯胶原蛋白存在着力学强 度不高， 作为组织修 复材料不能承受体内的力学环境， 在体内降解速度过快和热稳定性不够等问题。 因此人们通过各种方法对胶原蛋白进行改性， 包括物理交联、 化学交联等方法。 其中用的比较多的是化学交联。 在化学交联中主要的交联剂有： 戊二醛、 碳化 二亚胺 （EDC)、 环氧化合物、 京尼平、 乙醛酸、 含硫化合物、 己二异氰酸酯、 酰基叠氮及二苯基磷酸盐、 双醛淀粉等。 上述化学交联剂都可以比较有效的提 高胶原蛋白的力学强度和稳定性等， 但也都通过交联或多或少产生一些缺点， 比如有些会产生细胞毒性、 有些会使胶原材料有颜色、 有些则有钙化潜力、 有 些不能明显改善胶原材料的某些缺点等。

环糊精是由 6〜8个 D-(+)吡喃葡萄糖单元通过 α-1， 4-糖苷键相结合的环状低 聚糖， 分别对应 α、 β、 Υ环糊精， 环糊精分子的模型像一个内空去顶的锥型圆 筒。 在环糊精分子的环形结构中， 极性羟基位于环糊精单位的边缘， 仲位和伯 位极性羟基从边缘伸出， 所以上下以及外部都分布有亲水基团， 具有亲水性。 环糊精空腔内部排列着配糖氧桥原子。 由于氧原子的非键合电子指向中心， 使 空腔内具有很高的电子密度； 吡喃葡萄糖环 C-3， C-5上的氢原子位于空腔内并 覆盖了配糖氧原子， 使空腔内部成为疏水性空间。 该疏水空腔可通过疏水作用 力、 氢键、 范德华力等作用形成包合物， 因而表现出特殊的吸附性能。 环糊精 能与许多有机化合物、 卤素及某些无机化合物形成稳定的包合复合物 。 它像分 子袋一样可以使许多化合物或化合物的某些基 团包合起来， 改善被包合物质的 水溶性、 稳定性以及其他理化性质。 环糊精对于被包含的物质可以起到缓释剂 的作用， 且其对人没有明显的毒副作用。 环糊精的优点使其能广泛应用与生物 医学的各个领域。 发明内容

为解决上述现有技术的不足之处， 本发明的目的在于提供一种环糊精多醛 交联剂的应用方法， 该方法中将环糊精多醛交联剂用于对胶原的改 性， 环糊精 多醛交联剂在提高胶原的力学强度和稳定性的 同时， 不会产生细胞毒性。

为实现上述发明目的， 本发明采用如下技术方案：

一种环糊精多醛交联剂的应用方法， 所述环糊精多醛交联剂用于对胶原的 改性； 其中所述环糊精多醛交联剂的化学结构为：

优选的， 所述环糊精多醛交联剂用于多孔海绵状改性胶 原的制备。 优选的， 所述多孔海绵状改性胶原的制备方法包括如下 歩骤：

( 1 ) 将环糊精多醛交联剂水溶液与胶原水溶液混合 ， 并在 2〜6 °C反应 20〜30h， 得到改性胶原溶液；

(2)将歩骤（1 )得到的改性胶原溶液在 35〜38°C保温 15〜20min， 然后将 改性胶原溶液转移至模具中， 再将模具在 -15〜- 25°C冷冻 40〜50h， 制备改性胶 原凝胶；

(3 ) 将模具在室温下放置 4〜6h后将改性胶原凝胶取出， 并将其干燥得到 所述多孔海绵状改性胶原。

优选的，歩骤（1 )中环糊精多醛交联剂水溶液的质量浓度为 0.075%〜0.6%， 胶原水溶液的质量浓度为 0.6%。

优选的， 歩骤 （1 ) 中反应温度为 4°C。

优选的， 歩骤（2) 中改性胶原溶液在 37°C水浴中保温， 冷冻温度为 -20°C。 优选的， 歩骤 （3 ) 中所述的干燥方法为冷冻干燥。

相对于现有技术， 本发明具有如下优点及有益效果：

( 1 )本发明使用醛基个数为 2或 3的环糊精多醛做交联剂； 由于该环糊精 多醛交联剂具有无毒性、 交联效果好的优点， 特别适用于对胶原的改性。 将醛 基个数为 2或 3的环糊精多醛用于胶原的改性， 改性胶原交联效率高， 并且改 性后的胶原材料热稳定性大大提高、 耐降解性能显著增强。

(2)本发明将环糊精多醛与胶原蛋白交联， 既可以弥补胶原蛋白的一些缺 点， 改善胶原材料的性能， 同时也避免了引入戊二醛等有细胞毒性的化学 交联 剂， 不仅保持了胶原原有的一些特性， 还引入了一些环糊精的优良性能， 如特 殊刚性结构， 包合配位特性， 分子识别和组装等性能， 大大扩展了胶原的应用 范围。 附图说明

图 1是环糊精多醛的合成路线示意图； 图 2是环糊精多醛交联胶原原理图；

图 3是 β-环糊精和 β-环糊精多醛的红外光谱图 （FTIR);

图 4是 β-环糊精多醛的核磁共振图 （1H-NMR);

图 5是 β-环糊精多醛与胶原交联前后的红外光谱图 （FTIR);

图 6是 β-环糊精多醛交联胶原的交联度测试图；

图 7是 β-环糊精多醛与胶原交联前后的 DSC图；

图 8是 β-环糊精多醛与胶原交联前后的力学性能图；

图 9是 β-环糊精多醛与胶原交联前后的酶解度图。 具体实施方式

下面结合实施例与附图对本发明作进一歩详细 的描述， 但本发明的实施方 式不限于此。

本发明的原理如图 1和 2所示， 利用 2-碘酰基苯甲酸（ΙΒΧ)将环糊精氧化 成环糊精多醛衍生物， 即一种多官能团化合物， 作为交联剂。 然后用环糊精多 醛的醛基与胶原上的活性氨基反应生成希夫碱 来交联改性胶原， 使胶原的力学 性能、 热稳定性能和耐降解性能大大的提高。 本发明适合 α-环糊精、 β-环糊精和 环糊精。

本发明环糊精多醛交联剂的合成方法包括如下 歩骤：

( 1 )将 0.5mmol纯化后的环糊精加入 5〜8ml二甲基亚砜中、 并将环糊精完 全溶解， 得到混合物；

(2) 向歩骤 （1 ) 所得的混合物中加入 2.2〜2.8当量的 2-碘酰基苯甲酸，并 在保持搅拌、 25〜30°C的条件下反应 30〜48小时，然后对反应液过滤、保留滤液；

(3 ) 将歩骤 （2) 中得到的滤液滴入到丙酮中， 并过滤、 保留沉淀；

(4)将歩骤（3 ) 中得到的沉淀在 30〜40°C下真空干燥 24h， 然后再用去离 子水溶解；

(5 )将歩骤（4)所得的溶液过滤、 保留滤液， 将滤液冷冻干燥 48h， 得到 所述环糊精多醛交联剂。

实施例 1

(一） 制备环糊精多醛交联剂：

称取 0.5mmol纯化后的 β-环糊精于 50ml烧瓶中， 向烧瓶中加入 7ml极性非 质子溶剂二甲基亚砜（DMSO), 磁力搅拌环糊精至溶解完全后， 向其中加入 2.4 当量的温和氧化剂 2-碘酰基苯甲酸（IBX)。然后在磁力搅拌下在 25°C下反应 48 小时， 反应结束后过滤， 将滤液滴入到 150ml的丙酮中， 将析出来的物质过滤 得沉淀， 将沉淀用真空干燥箱在 35°C下真空干燥 24h， 最后将烘干后的样品用 50ml去离子水溶解， 过滤除掉杂质， 滤液经冷冻干燥得浅黄色样品。

经检测， β-环糊精多醛产率为 90%。

(二） 改性胶原：

将歩骤 （一） 制备的环糊精多醛交联剂配制成 5种质量浓度为 0.075%、 0.15%、 0.30%、 0.45%、 0.60%的环糊精多醛水溶液， 然后使用这 5种不同浓度 的环糊精多醛水溶液分别按如下歩骤对胶原进 行改性：

( 1 )将环糊精多醛水溶液与质量浓度为 0.6%的胶原水溶液均匀混合，并在 4°C冰箱里反应 24h， 得到改性胶原溶液；

(2) 将歩骤 （1 ) 得到的改性胶原溶液置于 37°C水浴中 18min， 并用吸管 将改性胶原溶液滴入一定形状的模具中， 随后将模具放在 -20°C冰箱中冷冻 48h， 制备改性胶原凝胶；

(3 )将模具在室温下放置 6h后将改性胶原凝胶取出， 然后通过冷冻干燥机 对改性胶原凝胶进行干燥， 得到多孔海绵状改性胶原。

(三）实施例 1的 β-环糊精多醛及多孔海绵状改性胶原产物经过 冷冻干燥后， 进行表征分析。

FT-IR分析在 NICOLET760形红外分光光度计上进行， 样品制备采用 KBr 压片法。 -NMR分析采用 Bruker400MHz核磁共振仪， 溶剂为氘代 DMSO。 β- 环糊精多醛改性胶原的 DSC分析在美国 ΡΕ公司生产的 DIAMOND DSC型差示 扫描量热仪上进行，准确称取 5〜10mg样品于 DSC坩埚中，以空坩埚作为参比， 从 35 °C加热至 210°C， 升温速率为 5 °C/min， 样品室的氮气流量为 20mL/min。 β-环糊精多醛改性胶原的交联度测定采用茚三 酮法， 以甘氨酸溶液作标准曲线， 用 LAMBDA950型紫外分光光度计在 570nm处测定其紫外吸光度值。 合成的 β- 环糊精多醛衍生物中醛基含量的测定利用 "碱消耗法"， 具体歩骤是： 准确称取 一定质量的 β-环糊精多醛衍生物于 250ml锥形瓶中， 精确加入 O.Olmol/L的氢氧 化钠溶液 30， 将锥形瓶置于 70°C水浴中加热 4min后， 迅速用自来水冲洗使之 冷却， 然后加入 0.01mol/L的 H ₂ S0 ₄ 溶液 20ml和蒸水 30ml， 加入酚酞指示剂， 充分振荡使其混合均匀， 滴定至终点。 计算公式如下：

每摩尔 β—环糊精多醛中醛基个数= ( CiVi-2C ₂ V2 ) I ( G/1131 )

式中： CI—— NaOH溶液的浓度， mol/L;

VI——消耗 NaOH溶液的体积， L;

C2—— H2S04溶液的浓度， mol/L；

V2——消耗 H2S04溶液的体积， L;

G——样品质量， g _;

1131一一环糊精多醛的分子质量， g/mol。

经过 3次重复实验后得到结论： 平均每摩尔 β-环糊精多醛中醛基的个数约为 2.5 个。 图 3为本实施例的 β-环糊精多醛和 β-环糊精的 FTIR图， 对比两图谱可以很 明显的看出 β-环糊精多醛在 1733.93 cnr ¹ 处有一新生成的峰， 此峰为醛基的特征 峰， 说明合成的产物中有醛基生成。另外， 图中 3376 cnr ¹ 为 -OH的伸縮振动峰， 2926 cnr ¹ 为 -CH ₂ 伸縮振动峰， 1158 cnr ¹ 为 C-O-C伸縮振动峰， 1081 cnr ¹ 为 C-0-H 弯曲振动峰， 1030 (^1_ ¹ 为（ -0和0 -0耦合振动峰， 707 cnr ¹ 为环振动峰。 可见 这些 β-环糊精多醛的吸收峰都与 β-环糊精的红外光谱图无明显区别，这表明利 用 2-碘酰基苯甲酸 （ΙΒΧ) 氧化 β-环糊精合成多醛类衍生物并没有破坏 β-环糊精的 特殊结构， 这使得合成的 β-环糊精多醛衍生物保持了 β-环糊精的许多优良性能。 图 4是本实施例的 β-环糊精多醛的 -NMR谱图， 从图谱中可以看出 δ 9.70 (s, 1H), 9.53 (s, 1H), 5.68 (s, 14H), 4.94 (s, 2H), 4.84 (s, 5H), 4.43 (s, 4H), 3.64 (s, 24H), 3.56 (s, 14H 这其中 δ 9.70 (s, IH), 9.53 (s, IH)为醛基氢的特征峰， 即本发 明生成的产物中确实有醛基的生成， 而且 δ 4.94与 δ 4.84峰面积之比为 2: 5〜3：

4之间， 这表明本发明合成的 β-环糊精多醛中每摩尔的醛基数在 2〜3之间， 有 2〜3个活性基团， 适合做交联剂使用。

图 5是本实施例的质量浓度为 0.45%的 β-环糊精多醛水溶液与胶原交联前后 的 FTIR图， 33 1 8CHT ¹ 为酰胺 Α带峰 （Ν— Η伸縮振动：)， 3071 cnr ¹ 为酰胺 B带 峰 （N— H伸縮振动：)， 1655 cnr ¹ 为酰胺 I带峰 （C= 0伸縮振动：)， 1549 cnr ¹ 为酰 胺 II带峰 （N— H弯曲振动)，从图中可以看出与胶原三螺旋构� ��相关的酰胺 I带 的位置和强度基本没有变化， 而且仍有较高的吸收峰， 表明交联后胶原的三股 螺旋结构没有被破坏。而酰胺 B带和酰胺 I带的吸收峰强度在交联后有所减少， 即氨基含量减少， 这表明 β-环糊精二醛与胶原发生了交联作用。另外， 由于希夫 碱的 C=N伸縮振动峰约 1660 cm" ¹ 被胶原的酰胺 I带的峰遮蔽，所以在红外图谱 中并没有发现新的吸收峰。

图 6是本实施例的 β-环糊精多醛交联胶原的交联度测试图， 其中 Col-C-1到 Col-C-5是不同浓度的 β-环糊精多醛交联胶原的交联度， β-环糊精多醛浓度依次 为 0.075%、 0.15%、 0.30%、 0.45%和 0.60%， 随着 β-环糊精多醛浓度的增加，交 联度也随之增加， 最高达到了 91%左右。 当交联剂浓度较低的时， 随着交联剂 浓度的提高， 交联度增加的比较快， 而当交联剂浓度达到 0.45%时， 再增加交联 剂的浓度， 交联度则变化不大， 这主要是当交联剂浓度超过 0.45%时， 胶原中的 自由氨基基本反应完全。 Col-G-6是 0.25%戊二醛交联胶原的交联度， 交联度为 81.26%, 而 0.25%戊二醛的醛含量约为 0.3%β-环糊精多醛中醛基含量的 4倍左 右， 但其交联度却还没有 0.3%β-环糊精多醛交联胶原的交联度高， 所以 β-环糊 精多醛是一种交联效率较好的交联剂。

图 7是本实施例的质量浓度为 0.45%的 β-环糊精多醛水溶液与胶原交联前后 的 DSC图，热变性温度为胶原特有的三螺旋结构完 全破坏的温度。从图中可知， 纯胶原的热变性温度为 71.4°C。用 β-环糊精多醛交联改性后的胶原的热变性温度 为 88.3 °C， 比纯胶原的热变性温度提高了 16.9°C。 用戊二醛交联改性后的胶原 的热变性温度为 82.3 °C， 比纯胶原的热变性温度提高了 10.9°C。 由此可知 β-环糊 精多醛交联胶原可以显著的提高胶原的热稳定 性， 甚至比戊二醛改性胶原更加 有效，这也再次证明胶原与 β-环糊精二醛之间发生了交联。胶原分子间作 用力的 增加使得肽链的活动受到约束， 发生相变化的难度增大， 表现为变性所需的热 能和温度增加， 材料的热稳定性增加， 从而可以扩大材料的应用范围。

图 8是本实施例的 β-环糊精多醛与胶原交联前后的力学性能图， 胶原水凝胶 在很多应用领域中主要受到压应力， 因此对胶原水凝胶进行了压縮测试。 将圆 柱体胶原凝胶（直径约为 6mm,高 15mm)用生物力学试验机以 lmm/min对其进 行压縮测试， 用得到的应力-应变曲线初始的直线部分进行� �性拟合， 直线斜率 定为压縮模量。 从图中可以看出纯胶原的压縮模量只有约 0.6KPa,随着环糊精多 醛交联剂的浓度的增加， 其压縮强度也不断增加， 最高达到了 3.522KPa， 比纯 胶原提高了近 6倍。 可见用环糊精多醛交联后其压縮强度明显提高 ， 力学性能 十丄幽日 J fJinU。

图 9是本实施例的 β-环糊精多醛与胶原交联前后的酶解稳定性图 ，将纯胶原 的相对酶解度定为 100%， 从图中可以看出随着交联剂浓度的增加， 改性胶原材 料的酶解度依次减少， 交联剂浓度越高， 酶解度越小， 表明交联剂浓度越高， 交联效果越好，胶原材料的耐酶解能力越强。 其中当新型交联剂浓度为 0.6%时， 相对酶解度为 28.68%， 其酶解度明显低于纯胶原， 这表明新型交联非常有效的 提高了胶原的生物稳定性， 使其降解速率得以大大降低。 同时说明新交联剂与 胶原发生交联反应， 在分子内及分子间形成了一系列的化学键， 甚至在分子间 形成了网状交联， 从而使其更稳定。 从上图还可知用戊二醛交联的胶原材料的 相对酶解度约为 30.05%， 可知新型交联剂改性的胶原材料的抗酶解能力 比戊二 醛的还略好， 这进一歩说明了新型交联剂能有效的提高胶原 的抗酶解能力， 延 缓了胶原的降解时间， 这主要是由于交联作用使酶无法和胶原分子充 分接触， 酶的降解作用只能在胶原材料的表面进行， 因此减缓了胶原的降解。 实施例 2

(一） 制备环糊精多醛交联剂：

称取 0.5mmol纯化后的 Y -环糊精于 50ml烧瓶中， 向烧瓶中加入 5ml极性 非质子溶剂二甲基亚砜 （DMSO), 磁力搅拌环糊精至溶解完全后， 向其中加入 2.2当量的温和氧化剂 2-碘酰基苯甲酸 （IBX)。 然后在磁力搅拌下在 25°C下反 应 30小时， 反应结束后过滤， 将滤液滴入到 150ml的丙酮中， 将析出来的物质 过滤得沉淀， 将沉淀用真空干燥箱在 35°C下真空干燥 24h， 最后将烘干后的样 品用 50ml去离子水溶解， 过滤除掉杂质， 滤液经冷冻干燥得最终样品。

经检测， 环糊精多醛产率为 87%。

(二） 改性胶原：

将歩骤 （一） 制备的环糊精多醛交联剂配制成 5种质量浓度为 0.075%、 0.15%、 0.30%、 0.45%、 0.60%的环糊精多醛水溶液， 然后使用这 5种不同浓度 的环糊精多醛水溶液分别按如下歩骤对胶原进 行改性：

( 1 )将环糊精多醛水溶液与质量浓度为 0.6%的胶原水溶液均匀混合，并在 4°C冰箱里反应 24h， 得到改性胶原溶液；

(2) 将歩骤 （1 ) 得到的改性胶原溶液置于 37°C水浴中 20min， 并用吸管 将改性胶原溶液滴入一定形状的模具中， 随后将模具放在 -20°C冰箱中冷冻 48h， 制备改性胶原凝胶；

(3 )将模具在室温下放置 6h后将改性胶原凝胶取出， 然后通过冷冻干燥机 对改性胶原凝胶进行干燥， 得到多孔海绵状改性胶原。 实施例 3 称取 0.5mmol纯化后的 β-环糊精于 50ml烧瓶中， 向烧瓶中加入 8ml极性非 质子溶剂二甲基亚砜（DMSO), 磁力搅拌环糊精至溶解完全后， 向其中加入 2.8 当量的温和氧化剂 2-碘酰基苯甲酸（IBX)。然后在磁力搅拌下在 25°C下反应 30 小时， 反应结束后过滤， 将滤液滴入到 150ml的丙酮中， 将析出来的物质过滤 得沉淀， 将沉淀用真空干燥箱在 35°C下真空干燥 24h， 最后将烘干后的样品用 50ml去离子水溶解， 过滤除掉杂质， 滤液经冷冻干燥得最终样品。

经检测， 环糊精多醛最终产率达到了 91%。

(二） 改性胶原：

将歩骤 （一） 制备的环糊精多醛交联剂配制成 5种质量浓度为 0.075%、 0.15%、 0.30%、 0.45%、 0.60%的环糊精多醛水溶液， 然后使用这 5种不同浓度 的环糊精多醛水溶液分别按如下歩骤对胶原进 行改性：

( 1 )将环糊精多醛水溶液与质量浓度为 0.6%的胶原水溶液均匀混合，并在 4°C冰箱里反应 24h， 得到改性胶原溶液；

(2) 将歩骤 （1 ) 得到的改性胶原溶液置于 37°C水浴中 18min， 并用吸管 将改性胶原溶液滴入一定形状的模具中， 随后将模具放在 -20°C冰箱中冷冻 48h， 制备改性胶原凝胶；

(3 )将模具在室温下放置 6h后将改性胶原凝胶取出， 然后通过冷冻干燥机 对改性胶原凝胶进行干燥， 得到多孔海绵状改性胶原。 实施例 4

(一） 制备环糊精多醛交联剂：

称取 0.5mmol纯化后的 α-环糊精于 50ml烧瓶中， 向烧瓶中加入 7ml极性非 质子溶剂二甲基亚砜（DMSO), 磁力搅拌环糊精至溶解完全后， 向其中加入 2.6 当量的温和氧化剂 2-碘酰基苯甲酸（IBX)。然后在磁力搅拌下在 28°C下反应 30 小时， 反应结束后过滤， 将滤液滴入到 150ml的丙酮中， 将析出来的物质过滤 得沉淀， 将沉淀用真空干燥箱在 35°C下真空干燥 24h， 最后将烘干后的样品用 50ml去离子水溶解， 过滤除掉杂质， 滤液经冷冻干燥得最终样品。

经检测， 环糊精多醛最终产率达到了 90%。

(二） 改性胶原：

将歩骤 （一） 制备的环糊精多醛交联剂配制成 5种质量浓度为 0.075%、 0.15%、 0.30%、 0.45%、 0.60%的环糊精多醛水溶液， 然后使用这 5种不同浓度 的环糊精多醛水溶液分别按如下歩骤对胶原进 行改性：

( 1 )将环糊精多醛水溶液与质量浓度为 0.6%的胶原水溶液均匀混合，并在 4°C冰箱里反应 24h， 得到改性胶原溶液；

(2) 将歩骤 （1 ) 得到的改性胶原溶液置于 37°C水浴中 15min， 并用吸管 将改性胶原溶液滴入一定形状的模具中， 随后将模具放在 -20°C冰箱中冷冻 48h， 制备改性胶原凝胶；

(3 )将模具在室温下放置 6h后将改性胶原凝胶取出， 然后通过冷冻干燥机 对改性胶原凝胶进行干燥， 得到多孔海绵状改性胶原。 实施例 5

(一） 制备环糊精多醛交联剂：

称取 0.5mmol纯化后的 β-环糊精于 50ml烧瓶中， 向烧瓶中加入 7ml极性非 质子溶剂二甲基亚砜（DMSO), 磁力搅拌环糊精至溶解完全后， 向其中加入 2.4 当量的温和氧化剂 2-碘酰基苯甲酸（IBX)。然后在磁力搅拌下在 30°C下反应 48 小时， 反应结束后过滤， 将滤液滴入到 150ml的丙酮中， 将析出来的物质过滤 得沉淀， 将沉淀用真空干燥箱在 35°C下真空干燥 24h， 最后将烘干后的样品用 50ml去离子水溶解， 过滤除掉杂质， 滤液经冷冻干燥得最终样品。

经检测， 环糊精多醛最终产率达到了 92%。

(二） 改性胶原：

将歩骤 （一） 制备的环糊精多醛交联剂配制成 5种质量浓度为 0.075%、 0.15%、 0.30%、 0.45%、 0.60%的环糊精多醛水溶液， 然后使用这 5种不同浓度 的环糊精多醛水溶液分别按如下歩骤对胶原进 行改性：

( 1 )将环糊精多醛水溶液与质量浓度为 0.6%的胶原水溶液均匀混合，并在 4°C冰箱里反应 24h， 得到改性胶原溶液；

(2) 将歩骤 （1 ) 得到的改性胶原溶液置于 37°C水浴中 15min， 并用吸管 将改性胶原溶液滴入一定形状的模具中， 随后将模具放在 -20°C冰箱中冷冻 48h， 制备改性胶原凝胶；

(3 )将模具在室温下放置 6h后将改性胶原凝胶取出， 然后通过冷冻干燥机 对改性胶原凝胶进行干燥， 得到多孔海绵状改性胶原。 实施例 6

(一） 制备环糊精多醛交联剂：

称取 0.5mmol纯化后的 β-环糊精于 50ml烧瓶中， 向烧瓶中加入 7ml极性非 质子溶剂二甲基亚砜（DMSO), 磁力搅拌环糊精至溶解完全后， 向其中加入 2.6 当量的温和氧化剂 2-碘酰基苯甲酸（IBX)。然后在磁力搅拌下在 30°C下反应 48 小时， 反应结束后过滤， 将滤液滴入到 150ml的丙酮中， 将析出来的物质过滤 得沉淀， 将沉淀用真空干燥箱在 35°C下真空干燥 24h， 最后将烘干后的样品用 50ml去离子水溶解， 过滤除掉杂质， 滤液经冷冻干燥得最终样品。

经检测， 环糊精多醛最终产率达到了 93%。

(二） 改性胶原：

将歩骤 （一） 制备的环糊精多醛交联剂配制成 5种质量浓度为 0.075%、 0.15%、 0.30%、 0.45%、 0.60%的环糊精多醛水溶液， 然后使用这 5种不同浓度 的环糊精多醛水溶液分别按如下歩骤对胶原进 行改性：

( 1 )将环糊精多醛水溶液与质量浓度为 0.6%的胶原水溶液均匀混合，并在 4°C冰箱里反应 24h， 得到改性胶原溶液；

(2) 将歩骤 （1 ) 得到的改性胶原溶液置于 37°C水浴中 15min， 并用吸管 将改性胶原溶液滴入一定形状的模具中， 随后将模具放在 -20°C冰箱中冷冻 48h， 制备改性胶原凝胶；

(3 )将模具在室温下放置 6h后将改性胶原凝胶取出， 然后通过冷冻干燥机 对改性胶原凝胶进行干燥， 得到多孔海绵状改性胶原。

上述实施例为本发明较佳的实施方式， 但本发明的实施方式并不受上述实 施例的限制， 其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下 所作的改变、 修饰、 替代、 组合、 简化， 均应为等效的置换方式， 都包含在本发明的保护范围之内。