说 明 书 树豆酮酸 A在制备糖尿病伴随症及髙脂血症药物中的应� � 技术领域 本发明涉及化合物的新用途， 具体涉及树豆酮酸 A及其药用衍生物， 特别 是树豆酮酸 A及其药用盐或酯在制备糖尿病伴随症或高脂� �症药物中的应用。 背景技术 高脂血症是由于脂肪代谢紊乱引起的血中总胆 固醇（TC)、甘油三酯 （TG) 和低密度脂蛋白胆固醇 （LDL-C) 单项或多项水平高于正常标准。 高脂血症的 主要危害是导致动脉粥样硬化。 动脉血管堵塞使全身重要器官长期供血供氧不 足， 造成脏器器质性的和功能性的损伤， 从而导致众多的相关疾病。 其中最为 常见的一种致命性疾病就是冠心病。 高血脂是促进高血压、 糖耐量异常、 糖尿 病的一个重要危险因素， 还会导致脂肪肝， 肝硬化， 胰腺炎， 胆石症， 高尿酸 血症， 肾功能衰竭等。 高脂血症可分为原发性和继发性两类。 其中原发性高血 脂症主要是由于遗传或者饮食不当等原因造成 。 而继发性高血脂症则是由其他 中间原发疾病如糖尿病、 肥胖症、 甲状腺疾病、 肾脏疾病、 肝病、 胰腺疾病等 引起。 肥胖伴高脂血症者更容易出现胰岛素抵抗进而 诱发糖尿病。

糖尿病是由于体内胰岛素绝对或相对分泌不足 而引起的以糖、 脂肪、 蛋白 质等代谢紊乱为主的内分泌疾病， 其中 2型糖尿病占整个糖尿病比例的 93.7% , 并且中国是全球 2型糖尿病患病率增长较快的国家之一。 由于长期慢性高血糖 诱发脂肪和蛋白代谢紊乱， 继而引起一系列的眼、 肾、 神经、 心血管等并发症， 对人类健康、 寿命和生活质量构成了严重威胁， 同时也是糖尿病患者致残和早 亡的主要原因。 很多糖尿病人都伴有高脂血症， 因此人们通常把糖尿病与高脂 血症称为姐妹病， 并认为高血脂是糖尿病的继发症。 高血脂诱发胰岛素抵抗进 而诱发糖尿病， 而糖尿病引起脂代谢紊乱进而引致高血脂， 所以高血脂症和高 血糖症之间之间是相互促进的关系。

胰岛素抵抗是 2型糖尿病的重要病因和显著特征， 从理论上分析， 糖尿病 病人针对胰岛素抵抗的治疗将大大减少其他降 糖药物的用量， 减轻胰腺胰岛细 胞分泌胰岛素的压力， 延缓 2型糖尿病向 1型转化的进程， 使糖尿病病人减少 并发症的发生， 降低死亡率。 目前针对胰岛素抵抗的常用治疗药物为胰岛素 增 敏剂， 噻唑垸二酮类 (TZDs)是一类比较得到公认的胰岛素增敏剂。 其代表药物 有曲格列酮、 吡格列酮、 罗格列酮。 但是， 这类药物通过激活过氧化物酶体增 殖子活化受体 Y (PPAR Y ) 活性增强胰岛素敏感性的同时， 还可增加脂肪细胞 的增殖， 从而导致水钠潴留， 体重增加甚至肥胖等。 TZDs还可致贫血、 血红蛋 白和红细胞减少， 对心功能不全者宜慎重应用。 作为第一个噻唑垸二酮类药物， 曲格列酮经过 140万例人次研究， 暴露有肝脏毒性的缺点， 于上市后三年被美 国 FDA禁止临床使用。 2010年 9月以来， 应用广泛的马来酸罗格列酮由于可能 导致心脏出现问题而相继被欧盟药品管理局、 美国食品药品管理局和中国国家 食品药品监督管理局建议暂停使用， 仅用于那些其他药品不能控制血糖的 2型 糖尿病患者， 大大限制了这类药物的使用。 因此， 虽然有罗格列酮缓解糖尿病 人高血脂症状的报道， 但作为治疗慢性代谢疾病的药物， 需要终身服用， 其安 全性是首要条件。因此 PPAR γ激活剂类型的胰岛素增敏剂并不适合糖尿病� ��长 期服用， 更不适合用于治疗高脂血症， 或者糖尿病伴随的其他疾病如肝损伤， 胰腺损伤或者肾损伤等。

树豆酮酸 A 是本发明人发现的一种新化合物 （CN101422450A) , 并通过 ob/ob 型先天性肥胖高血糖小鼠证明其具有降糖减肥 的功效。 树豆酮酸 A 的药 用衍生物， 特别其药用酯或盐， 可以按常规方法制备得到。 这些衍生物在体内 可以重新解离出树豆酮酸 A, 具有与树豆酮酸 A类似的生物活性。 在之前的申 请文件中， 并未涉及治疗糖尿病伴随症或高脂血症用途的 研究。

发明内容 本发明的目的在于提供树豆酮酸 A及其药用衍生物在制备治疗糖尿病伴随 症药物中的应用。

特别的， 树豆酮酸 A药用衍生物为树豆酮酸 A的药用盐或药用酯； 其药用 盐优选为树豆酮酸 A的钠盐、 钾盐、 钙盐； 其酯优选为树豆酮酸 A的甲基酯、 乙基酯、 丙基酯、 异丙基酯、 丁基酯、 异丁基酯、 叔丁基酯。 这些药用盐和酯 在体内可以转化或水解成树豆酮酸 A, 产生与树豆酮酸 A相一致的疗效。

糖尿病伴随症为糖尿病伴高脂血症、 糖尿病伴肝脏损伤、 糖尿病伴肾脏损 伤或糖尿病伴胰腺损伤。

2型糖尿病 SD大鼠模型动物的特点是糖尿病和高脂血症。 动物实验数据表 明， 树豆酮酸 A在降低 2型糖尿病 SD大鼠血糖的同时， 显著降低了动物的血 清甘油三酯水平、 总胆固醇水平和低密度脂蛋白胆固醇水平， 表明树豆酮酸 A 可以治疗或改善糖尿病伴高脂血症。

2型糖尿病 SD大鼠给予树豆酮酸 A进行试验治疗， 结果表明， 与模型组相 比， 治疗组动物的肝体比、 AST、 ALT均有显著下降， 病理学研究结果证实， 树豆酮酸 A可减少肝细胞的点状坏死， 其预防肝肿大和保护肝脏的作用优于罗 格列酮。 实验数据表明树豆酮酸 A可以治疗或改善糖尿病伴肝脏损伤。

给予树豆酮酸 A后， 糖尿病 SD大鼠与模型组相比， 胰岛素敏感指数、 胰 岛 β细胞功能指数显著升高， 胰岛素抵抗指数显著下降。 病理学研究结果证实， 树豆酮酸 A可逆转糖对大鼠胰岛组织的损伤， 并对胰脏具有保护和修复作用。 先天性肥胖 Zucker大鼠模型动物的特点是血糖值基本正常， 但出生后其血 清甘油三酯水平、 总胆固醇水平异常偏高， 形成典型的高脂血症。 动物实验数 据表明，树豆酮酸 A能够显著降低先天性肥胖 Zucker大鼠的血清甘油三酯水平、 总胆固醇水平， 表明树豆酮酸 A具有治疗或改善高脂血症的作用。

附图说明 图 1. 不同治疗组大鼠胰脏组织 HE染色病理切片图 （xlOO), 图中， （A) 正常对照组， （B ) 2型糖尿病模型组， （C) 树豆酮酸 A治疗组， （D) 文迪雅治 疗组；

图 2. 不同治疗组大鼠肝脏组织 HE染色病理切片图 （xlOO), 图中， （A) 正常对照组， （B ) 2型糖尿病模型组， （C) 树豆酮酸 A治疗组， （D) 文迪雅治 疗组；

图 4. 药物对 3T3-L1前脂肪细胞分化的影响图 (xlOO) (油红染色法）； 图 5. 树豆酮酸 A对脂肪细胞 PPARY和 C/ΕΒΡα mRNA水平的影响图； 图 6. 药物对脂肪细胞 GLUT4表达的影响。

具体实舫式 下面结合实验及实验数据， 进一步说明本发明。

树豆酮酸 A在 SD大鼠 2型糖尿病动物模型上的药效学实验结果

动物分组及给药： 选取高糖高脂膳食伴腹腔注射小剂量链脲佐菌 素诱导的 糖尿病 SD雄性大鼠， 根据空腹血糖和体重均匀分为模型组、治疗组 以及阳性对 照组。 每组 8只。 另有 8只正常大鼠作随行观察。

( 1 ) 模型组： 等体积混合的吐温 -80 和二甲基亚砜用蒸馏水十倍稀释， 以 每 100 g体重 lmL进行腹腔注射， 每日一次， 直到实验结束。

(2) 治疗组： 树豆酮酸 A用等体积混合的吐温 80和二甲基亚砜溶解， 配 成 10 mg/mL的储备液。临用时将储备液用蒸馏水十倍� ��释，以每 100 g体重 1 mL 进行腹腔注射， 每日一次， 直到实验结束， 剂量为 10 mg/kg/d。

(3 ) 阳性药组： 马来酸罗格列酮片 （商品名文迪雅， 葛兰素史克公司） 加 水崩解后制成 0.4 mg/mL的悬液， 以每 100 g体重 1 mL灌胃， 每日一次， 直到 实验结束， 剂量为 4 mg/kg/d。

测定方法：

( 1 ) 空腹血糖测定： 给药期间每隔 7天大鼠尾静脉取血， 用罗康全活力型 血糖仪 （罗氏） 测定空腹 8 h血糖值；

(2)葡萄糖耐受量测定： 末次给药后次日大鼠禁食 4 h， 测定空腹 4 h血糖 值（0时）后， 立即按 2 g/kg灌服葡萄糖溶液， 并测定灌服葡萄糖后 30 min、 60 min、 120 min血糖值， 即大鼠葡萄糖耐受量 OGTT;

( 3 )血清生化分析： 末次给药后日大鼠禁食 16 h后， 腹主动脉采血， 离心 分离得血清， 采用全自动生化分析仪检测大鼠血清中甘油三 酯 （TG)、 胆固醇

(TC)、高 /低密度脂蛋白（H/LDL-C),肝脏谷草转氨酶 AST、谷丙转氨酶 ALT、 尿素、 肌酐水平。 大鼠胰岛素 ELISA试剂盒测定血清胰岛素水平， 并计算胰岛 素敏感指数 ISI [=1/ (空腹血糖 X胰岛素） ]， 稳态胰岛抵抗指数 HOMA-IR=

(FBGxFINS/22.5 ), 稳态胰岛 β细胞功能指数 HBCI [=22.5χ胰岛素 / (空腹血糖 -3.5 ) ]。

(4)脏器组织及病理切片： 处死大鼠， 剖取肝脏称重， 计算脏器系数 RLB ( =肝重 /体重）， 同时取胰、 肾脏。 经 HE染色显微镜下进行观察病理切片并拍 照。 实验结果：

(1)树豆酮酸 A显著降低 2型糖尿病大鼠的空腹血糖水平： 表 1显示， 正 常大鼠在实验期间的 FBG水平保持在 7.5mM以下， 而模型组大鼠的 FBG则从 实验开始时的 22.5 ± 4.5 mM 上升到实验结束时的 26.8 ± 4.7 mM。 说明建立的 糖尿病模型稳定可靠。 T2DM大鼠经连续四周的树豆酮酸 A或文迪雅治疗后， 其 FBG水平分别为 18.7 ± 8.0 mM和 20.1 ± 7.9 mM， 和模型组 FBG比较有显著 性差异 （P<0.05)。 说明树豆酮酸 A同文迪雅一样， 可降低 T2DM大鼠的 FBG 水平。

树豆酮酸 A对 2型糖尿病大鼠的 FBG水平的影响

与正常动物组相比， "><0.001； 与模型组相比， ^# Ρ<0.05ο

(2) 树豆酮酸 Α可改善 2型糖尿病大鼠的葡萄糖耐受性： 由表 2可知， 治疗 结束时， 治疗组空腹 4 h血糖值明显低于模型组 CP<0.05 。 在灌服葡萄糖溶液 30min时各组血糖均达最高值， 且模型组大鼠空腹血糖值最高， 随后各组血糖逐 渐下降。 两治疗组分别在 60 min、 120 min 两个时间点血糖显著低于模型组 (P<0.05), 提示树豆酮酸 A可有效改善糖尿病大鼠葡萄糖耐受量。

大鼠的糖耐受性的影响 （平均值士标准差)

数据与模型组相比， <0.05; "P< 0.01o (3) 树豆酮酸 A可修复 2型糖尿病大鼠的胰岛损伤， 改善胰岛素抵抗状态： 由表 3可知， 模型组大鼠和正常大鼠的血清胰岛素水平 （INS ) 无明显差异， 但 ISI和 HOMA-IR较正常组明显增大而 HBCI明显降低， 模型组大鼠显示出典型 的胰岛素抵抗状态。 经树豆酮酸 A治疗的大鼠， INS 较模型组无明显变化， 但 ISI、 HBCI和模型组比较都显著升高 （Ρ<0.05 )， 而 HOMA-IR则显著降低 (P <0.05 )， 提示树豆酮酸 A治疗糖尿病大鼠后， 大鼠的胰岛素敏感性和胰岛 β细 胞功能都有显著改善， 胰岛素抵抗减少。

树豆酮酸 Α对大鼠胰岛素敏感性的影响 （平均值士标准差 )

数据与正常对照组比较， <0.001 ; 数据与模型组比较， ^# Ρ<0.05 不同治疗组大鼠的胰组织 HE染色病理切片结果如图 1显示。 图中， （A) 正常对照组， （B ) 2型糖尿病模型组， （C ) 树豆酮酸 A治疗组， （D ) 文迪雅治 疗组。

和正常大鼠比较， 模型组大鼠胰腺腺泡萎縮， 腺泡縮小， 间质增宽； 胰腺 间质呈泡间和小叶周围纤维化及脂肪变性； 胰腺的脂肪浸润， 脂肪分布呈灶性， 脂肪多见于胰腺小叶的分隔中； 胰小岛炎也较正常组严重。 给药组胰岛腺泡发 育良好， 间质纤维和脂肪变性少见， 其中树豆酮酸 A对大鼠胰岛的修复更为明 显， 基本达到正常大鼠的胰岛形态， 提示树豆酮酸 A对可逆转糖尿病对胰岛组 织造成的损伤。

(4) 树豆酮酸 A可显著降低 2型糖尿病大鼠的血脂水平： 表 4显示， T2DM 模型大鼠的 TG、 TC、 LDL-C水平都显著高于正常大鼠， 表现出明显的高脂血 症。 经 10mg/kg/d的树豆酮酸 A连续四周治疗后， 大鼠血清中 TG、 TC和 LDL-

C水平较模型组都有显著下降， 而且效果稍强于 4mg/kg/d的文迪雅。 说明树豆 酮酸 A对高血脂症的 T2DM大鼠具有调节血脂、 改善高血脂症的作用。

表 4 树豆酮酸 A对 T2DM大鼠血脂水平的影响 （平均值士标准差）

### 与正常动物组相比， <0.01, Ρ< 0.001； 与模型组相比， ^# Ρ<0.05, ^## Ρ<0.01, Ρ< 0.001

(5) 树豆酮酸 Α可改善 2型糖尿病大鼠的肝损伤，修复肝功能：由表 5可知，

2型糖尿病大鼠的 AST和 ALT较正常大鼠显著升高， 肝体比显著增大， 表现出 明显的肝肿大和肝损伤。 经树豆酮酸 A治疗 4周后的大鼠， 其肝体比、 AST及

ALT水平较模型组均有显著下降 (^<0.05或 Ρ<0.01)，其中 AST和 ALT水平已经 达到正常大鼠的水平。 经文迪雅治疗的大鼠 ALT明显下降（Ρ<0.05)， 肝体比和

AST虽有下降， 但与模型组大鼠比较不具有显著性差异 （Ρ>0.05)。

表 5 树豆酮酸 Α对糖尿病大鼠肝损伤及肝功能的影响 （Mean±SD)

数据与正常组比较， <0.05， "Ρ<0.01, "*Ρ<0.001; 与模型组比较， ^# Ρ<0.05， ^## Ρ<0.01 肝脏组织 HE染色病理切片结果如图 2显示。 图中， （A)正常对照组， （B)

2型糖尿病模型组， （C) 树豆酮酸 A治疗组， （D) 文迪雅治疗组。 由图 2可见， 正常组大鼠肝组织结构完整、 清晰、 肝小叶结构正常， 未见 肝细胞点状坏死及脂肪变性等异常改变。 模型组及各给药组均有不同程度的肝 细胞点状坏死。 以模型组最重， 表现为多数动物肝脏出现较为严重的肝细胞点 状坏死。 两给药组与模型比较， 肝细胞点状坏死的程度有所好转， 其中树豆酮 酸 A组肝细胞点状坏死的程度有明显好转， 提示树豆酮酸 A具有保护肝脏， 预 防肝肿大及恢复肝功能方面的作用， 且作用该更优于文迪雅。

(6) 树豆酮酸 A对 2型糖尿病大鼠的肾脏损伤具有修复作用： 如表 6所示， 糖尿病模型组大鼠的肾尿素和肌酐水平较正常 大鼠均有显著增加 (P<0.001)， 模 型大鼠表现出一定程度的肾功能损伤。 测得树豆酮酸 A治疗组的尿素和肌酐水 平略小于模型组， 文迪雅的尿素水平略高于模型组， 但和模型组比较均无显著 性差异。

树豆酮酸 A对大鼠肾功能指数的影响 （平均值 ±标准差 )

与正常对照比， " Ρ<0.01 但是肾脏 HE染色病理切片结果（图 3 )却表明树豆酮酸 A对糖尿病大鼠的 肾脏具有保护作用。 图中， （A) 正常对照组， （B ) 2型糖尿病模型组， （C) 树 豆酮酸 A治疗组， （D) 文迪雅治疗组。

由图 3 可见， 和正常大鼠比较， 模型组大鼠萎縮肾小管管腔扩张， 基膜弥 漫性增厚， 近端小管上皮细胞出现糖原空泡； 而树豆酮酸 A组大鼠肾脏形态正 常， 未见糖原沉积； 文迪雅组糖原沉积的程度小于模型组大鼠。提 示树豆酮酸 A 保护肾脏的作用优于罗格列酮。

树豆酮酸 A在先天肥胖 Zucker大鼠模型上的药效学实验结果 动物分组及给药： 选取 8周龄的健康 SPF级 Zucker fa/fa大鼠， 根据空腹血 糖和体重均匀分为模型组 （ _n= 7 )、 树豆酮酸 A高中低剂量治疗组 （n=7)、 文迪 雅治疗组 （n=6)。 另有 8只同龄雄性 Zucker瘦鼠做为随行观察。

( 1 ) 模型组： 等体积混合的吐温 80和二甲基亚砜用蒸馏水十倍稀释， 以 每 10 g体重 100 进行腹腔注射， 每日一次， 直到实验结束。

(2) 治疗组： 树豆酮酸 A用等体积混合的吐温 80和二甲基亚砜溶解， 分 别配成 20 mg/mL、 10mg/mL、 5mg/mL的储备液。 临用时将各储备液用蒸馏水 十倍稀释， 以每 100 g体重 lmL进行腹腔注射， 每日一次， 直到实验结束， 剂 量分别为 20、 10、 5 mg/kg/d o

( 3 )文迪雅治疗组： 文迪雅加水崩解后制成 0.4 mg/mL的悬液， 以每 100 g 体重 lml灌胃， 每日一次， 直到实验结束， 剂量为 4 mg/kg/d。

测定方法： 给药开始时和给药结束次日大鼠禁食 16h， 眼眶静脉丛采血， 离 心分离得血清。 采用甘油三酯、 胆固醇检测试剂盒 （长春汇力生物公司） 测定 血清中甘油三酯 （TG) 和胆固醇 （TC) 水平。

实验结果：

树豆酮酸 A显著降低 Zucker fa/fa大鼠的 TG和 TC水平： 如表 7所示，

Zucker fa/fa大鼠在实验开始时血清中 TG和 TC水平分别为 2.23 ± 0.07mmol/L 和 3.37 ± 0.09 mmol/L, 明显高于 Zucker瘦鼠的 0.63 ± 0.07mmol/L (P<0.001)和 0.51 ± 0.02mmol/L (P<0.01), 已表现为高血脂症状。实验结束时， Zucker瘦鼠的 血清 TC和 TG值保持稳定，而 Zucker fa/fa模型组大鼠的血清 TG和 TC值已经 稳步上升到了 5.03 ± 0.02 mmol/L和 4.35 ± 0.06 mmol/L, 高血脂症状更加严重。 经树豆酮酸 A或文迪雅治疗的 Zucker fa/fa大鼠， 其血清 TG和 TC水平较同龄 的模型鼠要低得多， 尤其是血清 TC水平较治疗前还有所下降。 树豆酮酸 A不 仅显著抑制 Zkcher fa/fa大鼠血清 TG水平的上升趋势， 还能有效降低大鼠的血 清 TC水平， 同时并不加剧大鼠的肥胖。而文迪雅治疗组在 调节血脂的同时粗肥 胖作用也很明显：治疗结束时大鼠体重达 453 ± 22g，明显高于模型组的 396 ± 37g 表 7. 树豆酮酸 A对 Zucker fa/fa大鼠血脂的影响

数据与 Zucker瘦鼠相比，" P < 0.001， "* P < 0.001；与模型组相 tt , ^## P < 0.01， * ^# ?<0.001。 树豆酮酸 A对小鼠 3T3-L1前脂肪细胞增殖的影响

细胞株：小鼠前脂肪细胞 3T3-L1。采用含 10%胎牛血清 (FBS )的高糖 DMEM 培养基常规培养， 当细胞融合达 80%左右时需传代。

药物配制：

树豆酮酸 A: DMSO溶解成 20mM的储备液， 临用时以培养基稀释到工作 浓度；

马来酸罗格列酮： 纯度 >98%， 购自广州市药检所。 DMSO溶解成 20 mM储 备液， 临用时以培养基稀释到工作浓度；

洛伐他汀： 纯度 99%， 购自广州市药检所。 精密称取 4 mg， 溶解 150 L 乙醇， 加入 0.1 M NaOH 225 50°C水浴 2 h， HC1调 pH值至 7.5， 最后加入 蒸馏水至终体积 1 mL， 配制成 10 mM储备液备用。临用时以培养基稀释为工作 浓度。 增殖抑制试验： 收集对数生长期的 3T3-L1前脂肪细胞用培养基配成 5χ10 ⁴ 个 /mL的单细胞悬液， 以每孔 100 μL接种于 96孔培养板， 置于 37°C、 饱和湿 度、 5% C0 ₂ 的细胞培养箱中培养 24小时使细胞贴壁。 吸去培养基， 加入含有 不同浓度的树豆酮酸 A的新鲜培养基， 在细胞培养箱中作用 48小时。 每孔加入 10 μL浓度为 5mg/mL的 MTT溶液，继续孵育 4 h。弃去上清，每孔加入 150 μL DMSO, 待沉淀完成溶解混匀后， 用酶标仪在 492 nm波长下测定吸光度， 求得 不同浓度药物对细胞生长的抑制率和半数抑制 浓度。 实验中每个浓度设置三个 复孔， 并设立溶剂空白对照。 马来酸罗格列酮和洛伐他丁作为对照药物。 实验 结果为三次重复实验的平均值。 实验结果： 见表 8。 树豆酮酸 A作用 48小时对 3T3-L1前脂肪细胞的增殖 具有一定的抑制作用， 半数抑制浓度 ₅ 。 = 301μΜ。其抑制效果和马来酸罗格列 酮相当，后者 IC _5Q = 362 M。洛伐他丁的细胞毒性相对要强于树豆酮酸 Α和马来 酸罗格列酮， IC ₅ 。 = 37.5 M。

拍

树豆酮酸 Α对 3T3-L1前脂肪细胞成脂分化的影响 细胞株和药物： 同树豆酮酸 A对小鼠 3T3-L1前脂肪细胞增殖的影响。 成脂分化诱导实验： 将 3T3-L1细胞悬液接种于 96孔板， 待其生长融合汇 片后 2天，用含有 lO g/mL胰岛素、 Ι μΜ 地塞米松和 0.5 mM 3-异丁基 -1-甲基 黄嘌呤的新鲜培养基进行分化诱导 48小时，再用含有 lO g/mL胰岛素的新鲜培 养基继续诱导 48小时， 最后用不含诱导剂的新鲜培养基继续于细胞培 养箱继续 培养 4天， 期间 2天须更换一次新鲜培养基。 整个分化过程持续 8天。 为了测 试树豆酮酸 A对成脂分化的影响， 不同浓度的树豆酮酸 A从分化诱导的第一天 开始即随同分化试剂一起加入到培养基。 马来酸罗格列酮和洛伐他丁作为对照 数据测定:将结束分化的细胞先用 10%的福尔马林于室温固定 20分钟， PBS 洗涤两次后再用 5mg/mL的油红异丙醇液染色 30分钟。蒸馏水洗去多余的油红， 晾干培养板。 先于一百倍显微镜下观察脂肪细胞被油红染色 的情况并拍照， 后 每孔加入 15(^L异丙醇溶解细胞内油红，于 540nm波长处测定油红的吸收值（油 红吸收值和生成脂肪的数量成正比）。 根据吸收值计算不同浓度的药物对脂肪生 成率的影响， 分析药物对 3T3-L1前脂肪细胞成脂分化的影响。 试验中， 每个样 品浓度设置三个复孔。 每个实验重复三次。

实验结果： 树豆酮酸 A抑制 3T3-L1前脂肪细胞的成脂分化。 图 4表明， 未 分化的 3T3-L1前脂肪细胞基本未被油红染色， 说明无脂肪生成。 添加分化诱导 剂进行正常分化的细胞内则可见大量红色油状 点， 说明细胞内存在大量油滴， 3T3-L1前脂肪细胞已经完成了向脂肪细胞的转化 。 当树豆酮酸 A与分化诱导剂 共同作用于分化的细胞时， 可见随着树豆酮酸 A浓度的增加， 被油红染色的细 胞越少， 说明树豆酮酸 A剂量依赖地抑制了脂肪的形成。 洛伐他丁和马来酸罗 格列酮组则分别表现出了预期的抑制和促进脂 肪形成的作用。量化的数据如表 9 所示： 和正常分化组（模型）油红吸收值比较发现， 50 μΜ、 75 μΜ、 100 μΜ和 150 μΜ的树豆酮酸 Α作用组油红吸收值也就是生成脂肪数量较正� ��分化组分别 减少了 24.6%、 39.1%、 57.6%和 74.2%。而马来酸罗格列酮在 25μΜ时使脂肪生 成率高出了正常分化组 41%。 本实验的结果表明， 树豆酮酸 Α可有效抑制前脂 肪细胞向脂肪细胞分化， 减少脂质的堆积， 在调节血脂的时候可避免马来酸罗 格列酮促体重增加的副作用。

药物对 3T3-L1前脂肪细胞分化的影响 （平均值 ±标准偏差)

数据与正常分化组相比， Ρ < 0.001， *" Ρ < 0.001 树豆酮酸 Α对 3T3-L1细胞中 ΡΡΑΚγ和 C ΕΒΡα表达的影响

PPARy和 C/ΕΒΡα是脂肪生成中两个非常重要的调节子� �在脂肪生成过程中 被激活。 上一实验已证实树豆酮酸 A显著抑制 3T3-L1前脂肪细胞的成脂分化， 因此本实验采用实时定量 PCR技术探讨了树豆酮酸 A对处于成脂分化过程的 3T3-L1细胞中这两个调节子表达的影响。

细胞株和药物作用： 同树豆酮酸 A对小鼠 3T3-L1前脂肪细胞增殖的影响。 实时定量 PCR:处于成脂分化诱导第 5天的 3T3-L1细胞的总 RNA采用总

RNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司， 北京）提取； 第一链 cDNA则采用 cDNA synthesis kit (TOYOBO, 日本)合成； 实时定量 PCR实验使用了基因特异 性引物 （Maygene 表 1， 广州） 和实时定量 PCR 扩增的预混和溶液 (THUNFRTBIRD SYBR qPCR Mix, TOYOBO, 日本）。 所有试剂盒的使用都遵 照厂家的说明书要求进行操作。基因表达水平 采用 ABI 7300RT-PCR系统进行分 析。 实验重复三次， 以 β-actin作为内标。

实验结果：如图 5所示，树豆酮酸 A呈剂量依赖性地抑制 ΡΡΑΙ γ和 C/EBPa mRNA水平的表达。提示树豆酮酸 A不仅是作为 ΡΡΑΙ γ活性的特异性抑制剂被 公开于前一专利 ZL200810199012.6, 同时也是 ΡΡΑΙ γ表达的抑制剂， 该结果为 树豆酮酸 Α的体内、 体外减脂作用提供了进一步的机制说明。

树豆酮酸 A对胰岛素抵抗型脂肪细胞葡萄糖代谢的影响� �其机理研究结果 如前所述， 树豆酮酸 A在 2型糖尿病鼠模型上具有降血糖、 增加胰岛素敏 感性的作用。 糖尿病的原因是由于动物胰岛素抵抗， 导致细胞对葡萄糖的摄取 下降从而使血糖中葡萄糖含量过高所致。 罗格列酮作为胰岛素增敏剂的机制是: 激活 PPAR Y , 刺激对胰岛素更为敏感的小脂肪细胞增生， 并刺激葡萄糖转运蛋 白 GLUT4在脂肪细胞内的表达。为了进一步探讨树� ��酮酸 A有别于罗格列酮的 胰岛素增敏机制， 本实验利用胰岛素抵抗的脂肪细胞， 探讨了树豆酮酸 A对细 胞葡萄糖摄入的影响， 以及对细胞内葡萄糖转运蛋白 GLUT4表达的影响。

方法： 首先 3T3-L1前脂肪细胞如实施例 4所述进行 8天的分化诱导， 使其转化成为成熟的脂肪细胞， 该细胞对胰岛素敏感。 为了诱导其产生胰岛素 抵抗， 在其培养基中加入了 1 μΜ的地塞米松。将胰岛素敏感细胞的培养基� �换 为新鲜的高糖 DMEM, 胰岛素抵抗细胞的培养基更换为含 1 μΜ地塞米松新鲜 高糖 DMEM, 分别加入 25μΜ的树豆酮酸 A或 10 μΜ马来酸罗格列酮， 并以不 加药的细胞为空白对照， 于 24h、 48h时用 GOD-POD葡萄检测试剂盒测定培养 基上清液中的葡萄糖含量， 分析药物对 3T3-L1正常脂肪细胞和胰岛抵抗脂肪细 胞葡萄糖代谢的影响。 3T3-L1脂肪细胞经地塞米松和药物作用第 5天时 Western Blot法检测正常敏感细胞、胰岛抵抗细胞及给� �的胰岛素抵抗细胞中 GLUT4蛋 白的表达。

实验结果：

( 1 )树豆酮酸 A增加了胰岛素抵抗的脂肪细胞对葡萄糖的消� �： 测得不同 药物处理的细胞经过 24h或 48h培养后， 培养基中剩余葡萄糖的浓度见表 10。 可以看出， 胰岛素可显著增加敏感细胞的糖消耗， 但树豆酮酸 A和马来酸罗格 列酮都不影响胰岛素敏感的脂肪细胞的糖消耗 ， 两组细胞的培养基中葡萄糖剩 余浓度和对照组比较无明显差异 (P>0.05)。 和敏感细胞相比较， 地塞米松处理过 的脂肪细胞培养基中葡萄糖含量明显较高 (P<0.05)， 说明其葡糖糖消耗减少， 胰 岛素抵抗状态明显。 但是当树豆酮酸 A或马来酸罗格列酮作用于该细胞时， 培 养基中葡萄糖含量都大为减少 6Ρ<0.001 )， 说明二者都能改善细胞的胰岛素抵 抗状态。 其中， 25μΜ的树豆酮酸 Α使抗性细胞的葡萄糖摄取恢复到了敏感细 胞的水平， 而马来酸罗格列酮则是葡萄糖的摄取超过了敏 感细胞的水平。 且两 者逆转地塞米松致胰岛素抵抗的作用更优于 10- ⁸ M的胰岛素。 本实验说明树豆 酮酸 A具有逆转脂肪细胞胰岛素抵抗， 增加糖代谢的作用。

表 10 3T3-L1胰岛抵抗 /敏感脂肪细胞培养基中葡萄糖含量 （平均值 ±标准差） 浓度 培养基中葡萄糖含量 （mM)

组别

(μΜ) 24 h 48 h 对照组 11.20±0.42 4.52±0.58 胰岛素敏感细胞 胰岛素 0.01 8.15±0.63*" 1.77±0.57"*

(未加地塞米松处理) 树豆酮酸 A 25 12.62±0.21 5.15±0.24

罗格列酮 10 11·59±0·34 4.17±0.18 对照组 14.08±0.29*** 11.80±0.68*" 胰岛素抵抗细胞 胰岛素 0.01 11·17±0·31漏 ν.δθΐθ.βθ***

(加地塞米松处理） 树豆酮酸 A 25 10.72i0.33***

罗格列酮 10 7.50±0.41 ^### 1·21±0·36漏 数据与胰岛素敏感细胞对照相比， *"Ρ< 0.001 ; 与胰岛素抵抗细胞对照相比， ^### Ρ< 0.001

(2) 树豆酮酸 Α不影响胰岛素抵抗的脂肪细胞内 GLUT4水平。 蛋白印迹 试验结果如图 6显示，模型组胰岛素抵抗细胞的 GLUT4蛋白表达水平与胰岛素 素敏感细胞正常对照组比较明显降低，树豆酮 酸 A组 GLUT4蛋白的表达与模型 组相比无显著性差异， 而罗格列酮组 GLUT4 蛋白的表达与模型组相比显著升 高， 恢复到正常细胞的表达水平。 树豆酮酸 A降糖作用不是通过增加葡萄糖转 运子 GLUT4起效的。