本发明涉及生物技术和医学领域，具体地，本 发明涉及 PRDX2和 /或 PRDX6 的新用途， 更具体地， 涉及 PRDX2和 /或 PRDX6在治疗或预防因 ROS增高引起的 相关疾病、 衰老或损伤中的应用。 背景技术

细胞使用氧气时会产生自 由基， 如活性氧自 由基（reactive oxygen species, ROS)和活性氮自由基（reactive nitrogen species，RNS)。在我们体内， 每一 个细胞一天要产生 2.5 X 10 ^{1 1} 个分子的 ROS， 人体内每天可产生 40x l0 ²¹ 个分子的 自由基。 它们不仅为我们提供和传递为维持生命活动的 能量， 帮助我们消灭细 菌和病原体， 清除体内的毒素和"垃圾"。 它们还是我们体内多种代谢和信号通 路的启动者和调节者， 如 JNK/SAPK、 P38MAPK, IKK/NF-KB, P13K、 Akt、 CD40/CD40L、 PKC等； 激活和调控各种转录因子 (如 AP-1、 Nrf2、 NF-KB、 p53、 ATF- HIF、 HSP、 SIFT- MST/FOXO等）， 影响体内各种基因的转录和表达， 参与体内炎症、 免疫、 生殖、 发育、 代谢、 细胞生长、 增殖、 细胞再生、 修复 等各种重要生命过程的调节，为我们促进和维 护细胞、组织和机体的新陈代谢、 维护和保证正常生命活动。

人体自由基的产生有两方面： 一是人体内各种代谢反应产生的， 二是环境 中的高温、 辐射、 光解、 化学物质等导致共价键均裂产生的外源性自由 基， 如 吸烟、 喝酒、 环境污染、 药物、 疾病等。

我们体内还有强大的抗氧化系统， 如超氧化歧化酶 （SOD) 、 过氧化氢酶 ( CAT) 、 谷胱甘肽过氧化物酶 （GSH— Px) 等等， 可以及时快速清除体内过 剩的 ROS。 在正常生理条件下， 体内氧化和抗氧化系统保持动态平衡， 既保证 正常氧化应激反应， 又防止 ROS对人体的危害。 只有在 ROS生成过盛， 抗氧化 酶表达不足， 氧化和抗氧化平衡失调， ROS不能及时清除， 并在体内大量积蓄， 才会引起细胞和组织的损伤 （即氧化应激） ， 危害人体的健康。

ROS能直接或间接氧化或损伤 DNA、 蛋白质和脂质， 可诱发基因的突变、 蛋白质变性和脂质过氧化， 被认为是人体衰老和各种重要疾病最主要的危 险因 子， 如不育、 白内障、 肿瘤、 心脑血管疾病、 老年痴呆 /神经退行性疾病 （如阿 尔兹海默症、 帕金森病等） 、 糖尿病、 炎症 （如骨关节炎、 风湿性关节炎、 支 气管炎等） 、 感染、 心肌缺血再灌注损伤、 器官移植、 动脉粥样硬化等。

现在"抗氧化"的药物很多， 而真正有效的抗氧化和调控氧化 /抗氧化平衡的 药物却很少。 发明内容

本发明的目的之一是提供 PRDX2蛋白和 /或 PRDX6蛋白在治疗或预防因活 性氧 (ROS)增高引起的损伤、 衰老或疾病方面的新用途。

本发明的目的还在于提供一种以 PRDX2蛋白和 /或 PRDX6蛋白为活性成分 的组合物， 所述组合物包括药物组合物或化妆品组合物等 。

本发明的目的还在于提供了一种改善精子质量 或治疗弱精症引起的男性 不育的方法。

在本发明第一方面中， 提供了一种过氧化物氧化还原酶的用途， 用于制备治 疗或预防因活性氧 (ROS)增高引起的损伤、 衰老或疾病的药物组合物， 其中， 所述 过氧化物氧化还原酶包括： PRDX2蛋白和 /或 PRDX6蛋白。

在另一优选例中， 所述的因活性氧 (ROS)增高引起的损伤、 衰老或疾病， 包 括选自下组的一种或多种：

(I) 由射线或辐射造成的 ROS增高引起的损伤、 衰老或疾病；

(2) 因高血糖 (如糖尿病)造成的 ROS增高引起的损伤、 衰老或疾病；

(3) 因吸烟引起的各种组织损伤；

(4) 因喝酒引起的各种组织损伤；

(5) 因 ROS增高诱发的其他疾病， 所述疾病为选自下组的疾病： 动脉粥样 硬化、 高血压、 癌症、 骨关节炎、 风湿性关节炎、 肺纤维化、 癫痫或神经退 化性问题 (如阿尔兹海默症、 帕金森病）；

(6) 细胞冷冻复苏过程引起的损伤；

(7) 缺血再灌注损伤；

(8) 股骨头无菌性坏死、 或褥疮；

(9) 由于药物 (如化疗药物或有机磷农药等)引起的 ROS增高所致的损伤或 引起的疾病：

(10) 皮肤相关问题 (如皱纹、 斑痕和烧伤等)；

(I I) 糖尿病并发症 （如足病 （坏疽） 、 眼病、 肾病、 脑病等） 。

在另一优选例中， 所述药物组合物用作：

(1) 细胞保护剂、 器官保护剂、 或组织保护剂；

(2) 改善弱精症患者精子质量或治疗男性不育的药 物；

在另一优选例中， 所述的精子为成熟阶段的精子细胞。

(3) 抗衰老、 修复疤痕、 抗皱、 去皱、 祛斑、 美白、 防晒、 预防皮肤癌的 药物或化妆品；

(4) 治疗烧烫伤和角膜损伤的药物；

(5) 促进伤口（如刀伤、 创伤等)愈合的药物； 或 (6) 用于保护组织细胞的氧化损伤 (或抗氧化)的药物或保健品。 在另一优选例中， 所述保护剂为冷冻保护剂。

在另一优选例中， 所述保护剂可用于制备细胞保存液、 器官保存液或组织 保存液， 优选用于制备器官移植保存液。

在另一优选例中， 所述细胞为动物细胞 (优选哺乳动物细胞， 如人细胞)， 其中， 所述细胞包括： 精子、 卵细胞、 或各种组织细胞。

在另一优选例中， 所述组织为动物 (优选哺乳动物， 如人)的各个器官或组 织。

在另一优选例中， 所述的 PRDX2蛋白为哺乳动物的 PRDX2蛋白或其活性片 段或其衍生产物； 所述的 PRDX6蛋白是哺乳动物的 PRDX6蛋白或其活性片段或 其衍生产物。

在另一优选例中， 所述的 PRDX2蛋白为人 PRDX2蛋白或其活性片段或其衍 生产物； 所述的 PRDX6蛋白为人 PRDX6蛋白或其活性片段或其衍生产物。

在另一优选例中， 所述的 PRDX2蛋白或 PRDX6蛋白是重组蛋白。

在另一优选例中， 所述的 PRDX2蛋白包括氨基酸序列如 SEQ ID NO: 4所示 的蛋白或 SEQ ID NO: 4中第 6-164位所示的活性片段，或其与表达标签形成� ��融 合蛋白；

所述的 PRDX6蛋白包括氨基酸序列如 SEQ ID NO: 2所示的蛋白或 SEQ ID NO: 2中第 5-169位所示的活性片段， 或其与表达标签形成的融合蛋白。

在本发明第二方面中， 提供了一种组合物， 所述的组合物含有： （a) PRDX2 蛋白和 /或 PRDX6蛋白； 以及 (b) 药学上、 食品上或化妆品上可接受的载体。

在另一优选例中， 所述的 PRDX2蛋白为哺乳动物的 PRDX2蛋白或其活性片 段或其衍生产物； 所述的 PRDX6蛋白是哺乳动物的 PRDX6蛋白或其活性片段或 其衍生产物。

在另一优选例中， 所述的 PRDX2蛋白为人 PRDX2蛋白或其活性片段或其衍 生产物； 所述的 PRDX6蛋白为人 PRDX6蛋白或其活性片段或其衍生产物。

在另一优选例中， 所述的 PRDX2蛋白或 PRDX6蛋白是重组蛋白。

在另一优选例中， 所述组合物为药物组合物、 食品组合物、 保健品组合物 或化妆品组合物。

在另一优选例中， 所述组合物的剂型包括： 注射剂、 涂剂、 喷雾剂、 乳剂、 霜剂、 膏剂 （包括软膏剂） 、 凝胶剂、 滴剂、 贴剂或面膜。

在另一优选例中， 所述的化妆品的类型为口腔用化妆品 （如用于口腔消 炎） 、 喷雾剂、 乳液、 唇膏、 防晒霜、 日霜、 晚霜、 爽肤水、 或面膜。

在本发明第三方面中， 提供了一种治疗或预防因 ROS增高引起的损伤、 衰 老或疾病的方法， 包括步骤： 对需要治疗的对象， 施用（i)PRDX2蛋白和 /或 PRDX6蛋白、 或 (ii) 本发明第二方面所述的组合物。

在另一优选例中， 所述方法具有以下一种或多种作用：

(i) 改善弱精症患者精子质量；

(ii) 抗衰老、 修复疤痕、 抗皱、 去皱、 祛斑、 美白、 防晒、 或预防皮肤癌；

(iii) 治疗烧烫伤和角膜损伤；

(iv) 促进伤口（如刀伤或创伤等)愈合；

(V) 保护组织细胞的氧化损伤；

(vi) 治疗或预防糖尿病并发症， 如足病 （坏疽） 、 眼病、 肾病、 脑病等。 在另一优选例中， 所述方法还具有以下作用：

(1) 提高弱精症患者的受孕率； 或

(2) 保护成熟阶段的精子细胞。

在另一优选例中， 所述方法还具有以下一种或多种作用：

(1) 缓解视疲劳， 增进和改善视力或防治进行性视力减退；

(2) 对抗光伤害， 对抗脂质过氧化性损伤， 增加细胞对氧自由基的清除能 力， 降低色相差， 治疗近视、 弱视、 老花眼、 青光眼、 飞蚊症等；

(3) 遏制玻璃体中自由基产生， 加速对自由基的清除与排泄， 避免玻璃体 中蛋白质的糖化和氧化， 保护可溶性蛋白的 SH基不受损伤， 使不溶性蛋白还 原成可溶性蛋白， 阻止晶状体混浊化或治疗或预防进行性白内障 的形成与进 展；

(4) 治疗老年性白内障、糖尿病性白内障、外伤性 白内障、辐射性白内障、 后发性白内障、 或治疗未成熟期、 膨胀期、 成熟期的晶体混浊。

在另一优选例中， 所述氧化损伤包括如下一种或多种的损伤：

(1) 放疗或化疗造成的损伤；

(2) 吸烟或喝酒造成的损伤；

(3) 缺血再灌注损伤；

(4) 糖尿病的高血糖造成的损伤。

在本发明第四方面中， 提供了一种改善精子质量或治疗男性不育的方 法， 给弱精症患者施用 (i) PRDX2蛋白和 /或 PRDX6蛋白，或 (ii) 本发明第二方面所 述的组合物。

在本发明第五方面中， 提供了一种本发明第二方面所述的组合物的制 法， 将 PRDX2蛋白和 /或 PRDX6蛋白， 与药学上、 食品中或化妆品上可接受的载体 或赋形剂混合， 从而制得本发明第二方面所述的组合物。

本发明第六方面中， 提供了 Pn -6蛋白在制备治疗角膜损伤的药物中的用 途。

在另一优选例中， 所述的 Prx-6蛋白是人 Prx-6蛋白。

在另一优选例中， 所述的 Prx-6蛋白是重组蛋白。

在另一优选例中， 所述的 Prx-6蛋白包括氨基酸序列如 SEQ ID NO: 2所示的 蛋白或其与表达标签形成的融合蛋白。

本发明第七方面中， 提供了一种用于治疗角膜损伤的药物组合物， 所述的 药物组合物含有 Prx-6蛋白以及药学上可接受的载体， 并且所述的药物组合物为 眼用制剂。

在另一优选例中， 所述的 Prx-6蛋白是人 Prx-6蛋白。

在另一优选例中， 所述的 Prx-6蛋白是重组蛋白。

在另一优选例中， 所述的眼用制剂是滴眼液、 眼用凝胶或眼膏。

在本发明第八方面中， 提供了一种治疗角膜损伤的方法， 包括步骤： 对需 要治疗的对象，将 Prx-6蛋白或本发明第七方面所述的药物组合物� ��入或涂入结 膜囊内。

在另一优选例中， 所述的治疗包括： 抑制角膜新生血管的生成； 修复受损 的角膜上皮细胞； 减轻角膜水肿， 恢复角膜透明度及视力； 清除自由基抗氧化， 促进炎症病变组织恢复。 发明人从初期细胞实验到动物实验， 证明了 PRDX蛋白在清除活性氧和调 节活性氧依赖的信号传导方面起着主要作用， PRDX蛋白是一种极有发展前途、 有效的抗氧化药物成分， 对于因 ROS增高引起的疾病或不利变化具有治疗或预 防作用。 应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各 技术特征和在下文 (如实施例) 中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合 ， 从而构成新的或优选的技术方 案。 限于篇幅， 在此不再一一累述。 附图说明

图 1显示了 Prx-6基因 PCR扩增结果。 泳道 1 : 空白对照； 泳道 2: Prx-6; M: 分子量标准。

图 2显示了 Prx-6 蛋白亲和纯化色谱图。 峰 1 : 杂蛋白； 峰 2 : Prx-6目的蛋 白。

图 3显示了 PRDX6蛋白纯化电泳图（12%SDS-PAGE)。泳道 1 : 蛋白分子量标 准品 (Fermentas); 泳道 2 : 亲和层析纯化并脱盐后的 PRDX6蛋白； 泳道 3 : 峰 1 ; 泳道 4: 上样穿出蛋白； 泳道 5 : 破菌上清 (上样的样品）。 图 4显示了重组 PRDX6蛋白对 HEF细胞的抗氧化保护作用（P<0.05)。

图 5显示了 PRDX2(即 HEL-S-2a)蛋白保护弱精的作用。

图 6显示了 PRDX6(即 HEL-S-128m)蛋白保护弱精的作用。

其中， 上述各图中， 有相同字母的两组间经统计学分析无显著性差 异， 如 A和 AB之间无显著性差异； 无相同字母的两组间经统计学分析有显著性差 异， 如 A和 B之间、 A和 D之间的差异是有显著性的。

图 7显示了用裂隙灯显微镜观察重组 Prx-6蛋白治疗大鼠角膜损伤的结果。 图中， 各图片从左至右依次为： 对照组 (2只）； Prx-6组 (2只）。 从上至下依次为： 紫外线照射前； 紫外线照射后； 治疗 4天； 治疗 8天； 治疗 12天。 具体实施方式

本发明人通过长期而深入的研究，意外地发现 PRDX6蛋白和 PRDX2蛋白可 用于制备治疗或预防因 ROS增高引起的相关疾病的药物组合物。 所述以 PRDX6 蛋白和 /或 PRDX2为活性成分的药物， 不仅可用于保护 HEF等细胞， 还可用于治 疗和预防因 ROS增高引起的多种疾病， 或缓解因 ROS增高引起的症状。 在此基 础上， 发明人完成了本发明。

PRDX6蛋白

如本文所用， 术语" PRDX6蛋白"、 "Prx-6蛋白"、 "HEL-S-128m"等可互换使 用， 都指具有人 PRDX6氨基酸序列的蛋白或多肽。 它们可含有或不含起始的甲 硫氨酸。应理解， 这些术语既包括人 (源)的蛋白， 也包括在其他哺乳动物 (如狗、 牛、 羊、 猴、 啮齿动物 (如小鼠))中的具有同种功能的同系物或同源蛋 白。 此外， 该术语包括野生型和突变型 PRDX6蛋白。

人 PRDX6基因的 cDNA 序列的 GenBank 登录号为： NM— 004905.2， 如 SEQ ID NO: 1所示。人 PRDX6蛋白的氨基酸序列的 GenBank登录号为： NP— 004896.1， 如 SEQ ID NO: 2所示。

应理解， 由于人等哺乳动物的 PRDX6 蛋白的核酸序列和氨基酸序列都是 已知的， 可以用本领域常规的 DNA 重组技术而获得其蛋白。

一类特别优选的蛋白是 PRDX6蛋白类似物， 即在其他哺乳动物 (如牛、 羊、 兔、 狗、 猴、 鼠等)中 PRDX6的同源蛋白。 这些其他物种的同源蛋白的编码序 列， 可根据 PRDX6的序列， 通过杂交或扩增的方法而获得， 进而通过常规重组 方法获得这些同源蛋白。

本发明的蛋白可以是重组多肽、 天然多肽、 合成多肽， 优选重组多肽。 根 据重组生产方案所用的宿主， 本发明的多肽可以是糖基化的， 或可以是非糖基 化的。 本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨 酸残基。 本发明还包括人 PRDX6蛋白的活性片段、 衍生物和类似物。 如本文所用， 术语"活性片段"、 "衍生物"和"类似物 "是指基本上保持本发明的天然人 PRDX6 蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。 本发明的多肽片段、 衍生物或类似物可 以是 «有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基 (优选保守性氨基酸残基)被取 代的多肽， 而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是 由遗传密码编码的， 或 (ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团� �多肽， 或 (iii)成熟多肽与另一 个化合物 (比如延长多肽半衰期的化合物， 例如聚乙二醇)融合所形成的多肽， 或 (iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形� �的多肽 (如前导序列或分泌序 列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列， 或与抗原 IgG 片段的形成的融合蛋 白）。 根据本文的教导， 这些片段、 衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公 知的范围。

在本发明中， 术语"人 PRDX6多肽"指具有人 PRDX6蛋白活性的 SEQ ID NO:2 序列的多肽。 该术语还包括具有与人 PRDX6蛋白相同功能的、 SEQ ID NO:2序列的变异形式。 这些变异形式包括 (但并不限于)： 若干个 (通常为 1-50 个， 较佳地 1-30 个， 更佳地 1-20 个， 最佳地 1-10 个)氨基酸的缺失、 插入和 / 或取代， 以及在 C 末端和 /或 N 末端添加一个或数个 (通常为 20 个以内， 较佳 地为 10 个以内， 更佳地为 5 个以内)氨基酸。 例如， 在本领域中， 用性能相近 或相似的氨基酸进行取代时， 通常不会改变蛋白质的功能。 又比如， 在 C末端 和 /或 N 末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋 白质的功能。 该术语还 包括人 PRDX6蛋白的活性片段和活性衍生物。 一种优选的活性片段是氨基酸序 列如 SEQ ID NO: 2 中第 5-169 位所示的多肽。

PRDX2蛋白

如本文所用， 术语" PRDX2蛋白"、 "Prx-2蛋白"、 "HEL-S-2a"等可互换使用， 都指具有人 PRDX2氨基酸序列的蛋白或多肽。 它们可含有或不含起始的甲硫氨 酸。 应理解， 这些术语既包括人 (源)的蛋白， 也包括在其他哺乳动物 (如狗、 牛、 羊、 猴、 啮齿动物 (如小鼠))中的具有同种功能的同系物或同源蛋 白。 此外， 该 术语包括野生型和突变型 PRDX2蛋白。

人 PRDX2基因的 cDNA 序列的 GenBank 登录号为： NM— 005809.4， 如 SEQ ID NO: 3所示。人 PRDX2蛋白的氨基酸序列的 GenBank登录号为： NP— 005800.3， 如 SEQ ID NO: 4所示。

应理解， 由于人等哺乳动物的 PRDX2 蛋白的核酸序列和氨基酸序列都是 已知的， 可以用本领域常规的 DNA 重组技术而获得其蛋白。

一类特别优选的蛋白是 PRDX2蛋白类似物， 即在其他哺乳动物 (如牛、 羊、 兔、 狗、 猴、 鼠等)中 PRDX2的同源蛋白。 这些其他物种的同源蛋白的编码序 列， 可根据 PRDX2的序列， 通过杂交或扩增的方法而获得， 进而通过常规重组 方法获得这些同源蛋白。

本发明的蛋白可以是重组多肽、 天然多肽、 合成多肽， 优选重组多肽。 根 据重组生产方案所用的宿主， 本发明的多肽可以是糖基化的， 或可以是非糖基 化的。 本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨 酸残基。

本发明还包括人 PRDX2蛋白的活性片段、 衍生物和类似物。 如本文所用， 术语"活性片段"、 "衍生物"和"类似物 "是指基本上保持本发明的天然人 PRDX2 蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。 本发明的多肽片段、 衍生物或类似物可 以是 «有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基 (优选保守性氨基酸残基)被取 代的多肽， 而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是 由遗传密码编码的， 或 (ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团� �多肽， 或 (iii)成熟多肽与另一 个化合物 (比如延长多肽半衰期的化合物， 例如聚乙二醇)融合所形成的多肽， 或 (iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形� �的多肽 (如前导序列或分泌序 列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列， 或与抗原 IgG 片段的形成的融合蛋 白）。 根据本文的教导， 这些片段、 衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公 知的范围。

在本发明中， 术语"人 PRDX2多肽"指具有人 PRDX2蛋白活性的 SEQ ID NO:4 序列的多肽。 该术语还包括具有与人 PRDX2蛋白相同功能的、 SEQ ID NO:4序列的变异形式。 这些变异形式包括 (但并不限于)： 若干个 (通常为 1-50 个， 较佳地 1-30 个， 更佳地 1-20 个， 最佳地 1-10 个)氨基酸的缺失、 插入和 / 或取代， 以及在 C 末端和 /或 N 末端添加一个或数个 (通常为 20 个以内， 较佳 地为 10 个以内， 更佳地为 5 个以内)氨基酸。 例如， 在本领域中， 用性能相近 或相似的氨基酸进行取代时， 通常不会改变蛋白质的功能。 又比如， 在 C末端 和 /或 N 末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋 白质的功能。 该术语还 包括人 PRDX2蛋白的活性片段和活性衍生物。 一种优选的活性片段是氨基酸序 列如 SEQ ID NO: 4 中第 6-164 位所示的多肽。 因活性氧 (Reactive oxygen species, ROS)增高引起的损伤、 衰老或疾病 本发明所述的 PRDX2和 /或 PRDX6可用于治疗和预防因 ROS增高引起的损 伤、 衰老或疾病， 本发明所述的因 ROS增高引起的损伤、 衰老或疾病可以是已知 的各种由于活性氧增高而引起的损伤、衰老或 疾病， 优选包括 (但不限于 1. 如 各种射线或辐射 (包括宇宙射线、地球放射性元素产生的辐射� �紫外线、 X射线、 由电焊、 电脑、 电视、 手机等电器辐射源或肿瘤放射治疗所产生的辐 射)造成的

ROS增高引起的损伤、 衰老或疾病， 例如角膜损伤、 皮肤损伤、 组织损伤 (包括 各种组织)； 2. 如高血糖 (如糖尿病)造成的 ROS增高引起的损伤、 衰老或疾病， 例如胰岛素抵抗、 胰岛 β细胞损伤、 肾脏损伤等； 3. 如吸烟引起的各种组织损 伤， 例如肺部损伤 (如支气管炎、 胰腺损伤、 肝脏损伤)； 4. 如喝酒引起的各种 组织损伤， 如酒精性肝病、 胰腺损伤； 5. 由 ROS增高诱发的其他疾病， 例如动 脉粥样硬化、 高血压、 癌症、 骨关节炎、 风湿性关节炎、 肺纤维化、 癫痫以及 神经退化性问题如阿尔兹海默症、 帕金森病； 6. 如细胞 (包括人或动物的精子、 卵细胞、 任何组织细胞)冷冻复苏过程的损伤； 7. 缺血再灌注损伤， 例如 (但不 限于)： 器官移植时的缺血再灌注损伤， 休克时微循环的疏通、 冠状动脉痉挛的 缓解、 心脏骤停后心脑肺复苏、 动脉搭桥术、 PTCA 、 溶栓疗法等血管再通术 后， 心脏外科体外循环术、 器官移植及断肢再植等； 8. 股骨头无菌性坏死； 9. 长期卧床引起的褥疮； 10. 因使用药物而引起的 ROS增高所导致的的疾病， 如 化疗、 有机磷农药中毒， 自杀服用有毒药物造成过氧化损伤等； 11. 皮肤相关 问题， 例如 (但不限于 皱纹、 斑痕和烧伤等； 12. 糖尿病并发症， 如足病 （坏 疽） 、 眼病、 肾病、 脑病等。 药物组合物和施用方法

本发明的药物组合物包含安全有效量范围内的 PRDX6蛋白和 /或 PRDX2蛋 白及药理上可以接受的赋形剂或载体。 其中"安全有效量"指的是： 蛋白的量足 以明显改善病情， 而不至于产生严重的副作用。 通常， 药物组合物含有 0.1ng-2000mg PRDX6蛋白禾口 /或 PRDX2蛋白 /剂， 更佳地， 含有 l-200mg PRDX6 蛋白和 /或 PRDX2蛋白 /剂。 较佳地， 所述的"一剂"为一个胶囊、 药片或一瓶滴 眼液。

"药学上可以接受的载体"指的是： 一种或多种相容性固体或液体填料或凝 胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够 的纯度和足够低的毒性。 "相容性" 在此指的是组合物中各组份能和本发明的蛋白 以及它们之间相互惨和， 而不明 显降低化合物的药效。药学上可以接受的载体 部分例子有纤维素及其衍生物 (如 羧甲基纤维素钠、 乙基纤维素钠、 纤维素乙酸酯等)、 明胶、 滑石、 固体润滑剂 (如硬脂酸、 硬脂酸镁)、硫酸钙、 植物油 (如豆油、 芝麻油、 花生油、橄榄油等)、 多元醇 (如丙二醇、 甘油、 甘露醇、 山梨醇等)、 乳化剂 (如吐温 ®)、 润湿剂 (如十 二垸基硫酸钠)、 着色剂、 调味剂、 稳定剂、 抗氧化剂、 防腐剂、 无热原水等。

PRDX6蛋白和 /或 PRDX2蛋白或药物组合物的施用方式没有特别限� ��， 代 表性的施用方式包括 (但并不限于)： 口服、 直肠、 肠胃外 (静脉内、 肌肉内或皮 下)、 和局部给药 (如贴剂等)。

用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、 片剂、 丸剂、 散剂和颗粒剂。 在这 些固体剂型中， 活性成分与至少一种常规惰性赋形剂 (或载体)混合， 如柠檬酸 钠或磷酸二钙， 或与下述成分混合： （a) 填料或增容剂， 例如， 淀粉、 乳糖、 蔗糖和硅酸； （b) 粘合剂， 例如， 羟甲基纤维素、 聚乙烯基吡咯垸酮、 蔗糖和 阿拉伯胶； （c) 保湿剂， 例如， 甘油； （d) 崩解剂， 例如， 琼脂、 马铃薯淀粉或 木薯淀粉、 藻酸、 某些复合硅酸盐、 和碳酸钠； （e) 缓溶剂， 例如石蜡； （f) 吸 收加速剂， 例如， 季胺化合物； （g) 润湿剂， 例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯； (h) 吸附剂， 例如， 高岭土； 和 (i) 润滑剂， 例如， 滑石、 硬脂酸钙、 硬脂酸镁、 固体聚乙二醇、 十二垸基硫酸钠， 或其组合。 胶囊剂、 片剂和丸剂中， 剂型也 可包含缓冲剂。

固体剂型如片剂、 糖丸、 胶囊剂、 丸剂和颗粒剂可采用包衣和壳材制备， 如肠衣和其它本领域公知的材料。 它们可包含不透明剂， 并且， 这种组合物中 活性成分的释放可以延迟的方式在消化道内的 某一部分中释放。 可采用的包埋 组分的实例是聚合物质和蜡类物质。 必要时， 活性成分也可与上述赋形剂中的 一种或多种形成微胶囊形式。

用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的 乳液、 溶液、 悬浮液、 糖浆 或酊剂。 除了活性成分外， 液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释 剂， 如水或其它溶剂， 增溶剂和乳化剂， 例知， 乙醇、 异丙醇、 碳酸乙酯、 乙酸乙 酯、 丙二醇、 1，3-丁二醇、 二甲基甲酰胺以及油， 特别是棉籽油、 花生油、 玉 米胚油、 橄榄油、 蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。

除了这些惰性稀释剂外， 组合物也可包含助剂， 如润湿剂、 乳化剂和悬浮 剂、 甜味剂、 娇味剂和香料。

除了活性成分外， 悬浮液可包含悬浮剂， 例如， 乙氧基化异十八垸醇、 聚 氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、 微晶纤维素、 甲醇铝和琼脂或这些物质的混合 物等。

用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受 的无菌含水或无水溶液、 分 散液、 悬浮液或乳液， 和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液 的无菌粉 末。 适宜的含水和非水载体、 稀释剂、 溶剂或赋形剂包括水、 乙醇、 多元醇及 其适宜的混合物。

用于局部给药的 PRDX6蛋白和 /或 PRDX2蛋白的剂型包括软膏剂、 散剂、 贴剂、 喷射剂、 栓剂和吸入剂。 活性成分在无菌条件下与生理上可接受的载体 及任何防腐剂、 缓冲剂， 或必要时可能需要的推进剂一起混合。

本发明蛋白可以单独给药， 或者与其他药学上可接受的化合物或蛋白等联 合给药。

使用药物组合物时， 是将安全有效量的活性成分适用于需要治疗的 哺乳动 物 (如人)， 其中施用时剂量为药学上认为的有效给药剂量 ， 对于 60kg体重的人 而言， 日给药剂量通常为 0.5ng〜2000mg， 优选 2〜50mg。 当然， 具体剂量还应 考虑给药途径、 病人健康状况等因素， 这些都是熟练医师技能范围之内的。 本发明优选提供了一种药物组合物， 它含有安全有效量的本发明 PRDX6蛋 白和 /或 PRDX2蛋白， 以及药学上、 可接受的载体或赋形剂。 这类载体或赋形剂 包括 (但并不限于)： 盐水、 缓冲液、 葡萄糖、 水、 甘油、 乙醇、 泊洛沙姆、 卡波 姆、 或其组合。 例如， 可将本发明蛋白配制于无毒的、 惰性的和药学上可接受 的水性载体介质中， 其中 pH通常约为 5-8， 较佳地 pH约为 6-8， 最佳地 pH约为 6.8-7.6, 尽管 pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症� ��有所变化。

配制好的组合物可通过常规途径进行给予所述 组合物， 其中包括 (但并不限 于)： 局部给予、 口服、 肌内、 静脉内、 结膜下注射等等。

药物制剂应与给药方式相匹配， 本发明的药物组合物： （1) 可以被制成针剂 形式， 例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水 溶液通过常规方法进行制 备。 （2) 诸如膏剂、 滴剂、 喷雾剂、 片剂和胶囊之类的药物组合物， 可通过常规 方法进行制备。 (3) 药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无 菌条件下制造。 (4) 制成栓剂， 具体工艺如下： 1. 将 β-CD加适量乙醇搅拌均匀为糊状， 加 P DX6, PRDX2蛋白研磨包合 45分钟备用。 2.将 36型半合成脂肪酸酶加热溶解 后保温 38°C， 加主药的包合物， 充分混合均匀保温。 3.将混合均匀的保温物灌 膜冷却成形。 4.制备好的栓剂， 在房事前置于女性生殖道中即可， 能提高弱精 症患者的受孕成功率。

活性成分的给予量是指治疗有效量， 例如每天约 1微克 /千克体重-约 10毫克 / 千克体重。 本发明的药物组合物还可以被制成滴眼液、 眼用凝胶或眼膏的形式， 宜在无菌条件下制造。 活性成分的给药量是治疗有效量， 例如每天约 10微克 /千 克体重-约 10毫克 /千克体重。 当然， 具体剂量还应考虑给药途径、 病人健康状况 等因素， 这些都是熟练医师技能范围之内的。 本发明所述的细胞冷冻保护剂

在一优选例中， 本发明提供了精子冷冻保护剂的配方， 它含有 0.1 mg/ml- 1 OOmg/ml的 PRDX2重组蛋白和 PRDX6重组蛋白； 以及一些常用的精 子冷冻保护剂成分， 如氯化钾、 氯化钠、 硫酸镁、 磷酸二氢钠、 碳酸氢钠、 葡 萄糖、 蛋黄、 白蛋白、 甘氨酸、 蔗糖、 甘油。

此外， PRDX2、 PRDX6蛋白可以单独使用， 也可以联合使用。 另夕卜， 本发 明的蛋白还可与其他精子冷冻保护剂一起使用 。 治疗弱精症 在一优选例中， 本发明提供了治疗弱精症的药物组合物， 该药物包含： 含 有 l-100mg 活性成分： PRDX2重组蛋白和 PRDX6重组蛋白； 和药学上可接受的 载体或赋形剂。 这类载体包括 (但并不限于)： 盐水、 缓冲液、 葡萄糖、 水、 甘 油、 吐温 80、 β-CD及其组合。

此外， PRDX2蛋白和 PRDX6蛋白可以单独使用， 也可以两者一起使用， 或 者和其他药物联合使用。 另外， 本发明的蛋白还可与治疗弱精症的其他治疗剂 一起使用。

例如， 本发明的药物组合物具有的作用包括 (但并不限于)： (1) 提高弱精症 患者的受孕率； （2) 保护各成熟阶段的精子细胞。 治疗角膜损伤

在一优选例中， 本发明提供了治疗角膜损伤的药物组合物， 可将本发明蛋 白按 0.05-0.2mg/次的用量直接滴入或涂入结膜囊内。 此外， PRDX2蛋白和 PRDX6蛋白可以单独使用， 也可以联合使用。 此外， 本发明的蛋白还可与治疗 角膜损伤的其他治疗剂一起使用。

具体地， 所述药物组合物还具有以下作用： （1) 缓解视疲劳， 增进和改善 视力， 防治进行性视力减退； 或 (2) 对抗光伤害， 对抗脂质过氧化性损伤， 增 加细胞对氧自由基的清除能力， 降低色相差， 有效治疗近视、 弱视、 老花眼、 青光眼、 飞蚊症等； （3) 遏制玻璃体中自由基产生， 加速对自由基的清除与排 泄， 避免玻璃体中蛋白质的糖化和氧化， 保护可溶性蛋白的 SH基不受损伤， 使不溶性蛋白还原成可溶性蛋白， 可阻止晶状体混浊化， 控制进行性白内障 的形成与进展， 从而有效治疗老年性白内障、 糖尿病性白内障、 外伤性白内 障、 辐射性白内障和后发性白内障以及未成熟期、 膨胀期、 成熟期的晶体混 浊。 治疗烧烫伤

在一优选例中， 本发明提供了治疗烧烫伤的配方， 可将本发明蛋白按 0.1-0.5mg/cm ² 创面的用量直接施涂或喷涂在烧烫伤的创 面。 此外， PRDX2蛋白 和 PRDX6蛋白可以单独使用， 也可以联合使用。 此外， 本发明的蛋白还可与治 疗烧烫伤的其他治疗剂一起使用。 化妆品组合物

本发明提供了一种以 PRDX2蛋白和 /或 PRDX6蛋白为活性成分的化妆品组 合物， 所述组合物可以含有有效量的 PRDX2蛋白和 /或 PRDX6蛋白， 以及化妆 品上可接受的载体或赋形剂。 本发明所述的以 PRDX2蛋白和 /或 PRDX6蛋白为活性成分的化妆品组合物 可以含有任意量的适用于化妆品制剂的 PRDX2蛋白和 /或 PRDX6蛋白， 通常， P RDX2蛋白和 /或 PRDX6蛋白的含量为化妆品组合物总重量的 0.1〜 30 %， 较佳 地为 1〜15%， 最佳地为 3〜8%。

本发明用于制备化妆品制剂的多种载体和赋形 剂可以是本领域技术人员 所熟悉或常用的载体或赋形剂。 具体载体或赋形剂的选择， 应取决于所要制备 的化妆品的类型。

本发明所述的化妆品组合物可以通过本领域技 术人员所熟知的方法制备 得到。 例如 PRDX2蛋白和 /或 PRDX6蛋白可以通过所属领域技术人员熟知的 方法惨混在任何 (水包油和 /或油包水)膏类化妆品 (如雪花膏、 润肤霜、 蜜类、 冷 霜、 粉底)， 美容化妆品 (如唇膏、 胭脂、 眉笔、 眼影粉、 睫毛膏、 眼线液、 指 甲油、面膜等)， 香粉类化妆品 (如香粉、粉饼、爽身粉)， 香水类化妆品 (如香水、 古龙水、 花露水、 奎宁水、 润发水、 化妆水、 须后水等)， 疗效型美容化妆品 (如 皮肤病汉疗护肤剂、 抗粉剌化妆品、 祛斑化妆品， 防皱抗衰老化妆品、 减肥化 妆品、 增白化妆品）， 防晒化妆品， 剃须膏等。

本发明所述的化妆品组合物具有抗衰老、 修复疤痕、 抗皱、 去皱、 祛斑、 美白、 防晒、 或预防皮肤癌的作用。 本发明还涉及这些组合物在一般性皮肤调 理中和特别是在皱纹、 斑痕和烧伤的美容处理中的应用。 本发明主要优点在于： 本发明所述的人 PRDX2蛋白和 /或人 PRDX6蛋白具 有以下作用： （1) 在精子冷冻复苏过程中具有保护精子的作用。 如在传统的精 子冷冻保护剂中添加重组人 PRDX2蛋白和 PRDX6蛋白后，在精子的冷冻复苏过 程中， 能显著提高前向运动精子复苏率及穿卵率 (SPA); (2) 能够改善弱精症患 者的精子质量。 如在辅助生殖技术的精液体外处理过程中， 添加本发明的重组 人 PRDX2蛋白和 PRDX6蛋白， 能够提高处理后活动精子总数， 明显改善处理后 的精子质量， 提高妊娠率； （3) 抗衰老、 修复疤痕、 抗皱、 去皱、 祛斑、 美白、 防晒、 预防皮肤癌的作用； （4) 治疗烧烫伤和角膜损伤的作用； （5) 促进刀伤或 创伤等伤口愈合； （6) 保护组织细胞的氧化损伤的作用。 下面结合具体实施， 进一步阐述本发明。 应理解， 这些实施例仅用于说明 本发明而不用于限制本发明的范围。 下列实施例中未注明具体条件的实验方 法，通常按照常规条件，例如 Sambrook等人， 分子克隆： 实验室手册 (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件， 或按照制造厂商所建 议的条件。 除非另外说明， 否则百分比和份数按重量计算。 本发明所用原料或 试剂均市售可得。 实施例 1 pET32b(+)/PRDX6和 pET32b(+)/PRDX2表达载体构建

1.1 pET32b(+)/PRDX6表达载体构建

根据编码 PRDX6成熟蛋白的基因序列设计并合成了一对特� ��引物， 上游弓 I物： 5，- tatccatatgcccggaggtctgcttc-3 ' (如 SEQ ID NO: 5所示）； 下游引物： 5，-ttactcgagaggctggggtgtgtagcg- 3，（如 SEQ ID NO: 6所示）； 酶切位点分别为 Nfifel 及 Xhol,

以常规方法抽提的人附睾 mRNA (或实验室制备的人附睾 cDNA 文库)为模 板， 进行 RT-PCR 扩增。 结果见图 1， 检测到与理论值相符的 688bp 的扩增片 段。

分离扩增片段 (用胶回收试剂盒从琼脂糖凝胶中回收目的片� �)， 用 N I及 Xhol 进行双酶切。然后， 将经过双酶切的片段连接到已用 N I和^ ol切成线性 的 pET32b(+)表达载体 (购自 Novagen)中， 转化常规的大肠杆菌 TOP 10F' (购自 Invitrogen)o 通过菌落 PCR 的方法筛选阳性克隆， 并测序进一步证实序列及表 达阅读框的正确性， 得到重组表达质粒 pET32b(+) /PRDX6。

该表达载体所表达的 PRDX6 蛋白为 PRDX6-His 融合蛋白， 在 C 端附加 8 个氨基酸 LEHHHHHH, 以便于分离纯化。

1.2 pET32b(+)/PRDX2表达载体构建

构建方法同 1.1， 不同点在于， 使用如下一对引物：

上游引物： 5，- TATCCATATGGCCTCCGGTAACGCGC-3 ' (如 SEQ ID NO: 7所示）； 下游弓 I物： 5，- TTACTCGAGATTGTGTTTGGAGAAATATTC-3，（如 SEQ ID NO: 8所示）；酶切位点分别为 Nfifel 及^ ¾oI。得到重组表达质粒 pET32b(+) /PRDX2。 实施例 2 PRDX6蛋白和 PRDX2蛋白的表达

2.1 PRDX6蛋白的表达

将质粒 pET32b(+) I P DX6 转化大肠杆菌 Origami B(DE3)(购自 Novagen), 将阳性克隆接种于含 l OOug/ml 氨苄青霉素的 LB 培养基中， 37 度摇床培养过 夜。

次日按 1 : 100 转接于含 100ug/ml 氨苄青霉素的 LB 培养基中， 37 度摇床 培养至菌密度 OD600=0.6〜0.8 后， 加入 IPTG 至终浓度 0.4mM 以诱导目的蛋 白 PRDX6 的表达， 3-4h 后离心收集菌体。 2.2 PRDX2蛋白的表达 完成 PRDX2蛋白的表达， 表达方法同 2.1， 不同点在于用 PRDX2蛋白代替 PRDX6蛋白。 实施例 3 PRDX6蛋白和 PRDX2蛋白的纯化

3.1 PRDX6蛋白的纯化

将离心收集的菌体重悬于缓冲液 A中 (20mM 磷酸盐缓冲液， 150mM 氯化 钠， pH7.2)， 冰浴中超声破碎， 20000g 低温 (4 度)离心 15min 取上清为待纯化 的样品。

使用缓冲液 A平衡镍亲和层析柱后， 将样品上柱， 然后用含 50mM 咪唑的 缓冲液 A冲洗柱子去除杂蛋白（峰 1) (见图 2)， 用含 300mM 咪唑的缓冲液 A将目 的蛋白洗脱下来 (峰 2)(见图 2)。

最后用 G-25 脱盐柱将洗脱的蛋白置换于缓冲液 A中以去除咪唑， SDS- PAGE 电泳检测。

经分析， 获得了纯度在 95%以上 PRDX6 蛋白， 分子量约 26.1kD。 （见图 3)。

3.2 PRDX2蛋白的纯化

完成 PRDX2蛋白的纯化， 纯化方法同 3.1， 不同之处在于用 PRDX2蛋白代 替 PRDX6蛋白。 实施例 4 PRDX6蛋白的抗氧化活性 (HEF 细胞氧化损伤实验）

HEF细胞为常用的人胚胎成纤维细胞 (Zavada 等.， Nature New Biology, 240: 124-125(1972)； 或 US 7，811,817)。

用培养基 (高糖 DMEM+5% FBS， 购自 Invitrogen)复苏细胞， 培养 48h。

待细胞长至 90%汇合后， 按照下面实验方法先将实施例 3中获得的 PRDX6 蛋白（PRDX6-His 融合蛋白）加入培养体系中， 再加入 H ₂ O ₂ ， 作用 30min 后， MTT 方法检测细胞存活率。

实验设计：

因素 1 : H ₂ O ₂ 水平（lmM、 0.5 mM、 0.25 mM、 0.125 mM、 0 mM)

因素 2: P DX6-His 水平（0.5mg/ml、 0.25 mg/mK 0.125 mg/mK 0 mg/ml) 各实验组的 H ₂ O ₂ 和 PRDX6-His 浓度如表 1 所示。

表 1

H ₂ O ₂ P DX6-His 细胞死 细胞存

OD ₄₉₀ 均值

(mM) (mg/ml) 亡率(％) 活率(％)

1 0.5 0.0037 99.18 -

0.25 0.0023 99.48 - 0.125 0.007 98.43 -

0 0.0147 96.71 一

0.5 0.014 96.86 3.14

0.25 0.008 98.20 2.90

0.5

0.125 0.0127 97.16 2.84

0 0.0023 99.48 0.52

0.5 0.1993 55.27 44.73

0.25 0.085 80.93 19.07

0.25

0.125 0.006 98.65 1.35

0 0.0143 96.78 3.22

0.5 0.292 34.48 65.52

0.25 0.2897 35.00 65.00

0.125

0.125 0.0123 97.23 2.77

0 0.011 97.53 2.47

0.5 0.4987 -1 1.89 1 11.89

0.25 0.4753 -6.66 106.66

0

0.125 0.444 0.37 99.63

0 0.4457 0 100 结果如表 1和图 4 所示:

H ₂ O ₂ 组 (0.125mM): H ₂ O ₂ 对细胞有很强的毒性作用， 当其浓度为 0.125mM 时， 细胞存活率仅 2.47%。 随着 H ₂ O ₂ 浓度上升， 造成的损伤也越大。

缓冲液 (20mM 磷酸盐缓冲液， 150mM 氯化钠， pH7.2， 含 0.5mg/ml的表 达标签 6 X His)组：当只有所述缓冲液存在时，细胞活率� � PRDX6-His蛋白组 (0.5 mg/ml)相比显著降低。

H ₂ O ₂ + PRDX6-His组： 以 H ₂ O ₂ 浓度为 0.125mM的各组为例， 添加了

0.25mg/ml、 0.5 mg/ml P DX6 蛋白， 其中， 0.25mg/ml的蛋白能使 HEF细胞在 一定程度上抵御 0.125mM 浓度的 H ₂ O ₂ 损伤； 0.5 mg/ml PRDX6可使得存活率 从约 2.5%大幅上升到 65%。

¾0 ₂ +缓冲液 （缓冲液同上） 组： 表明用含有表达标签 6xffis的缓冲液不 能起到保护作用。

上述结果表明： 当体系中同时有 PRDX6-His蛋白存在时细胞存活率显著增 力口。 PRDX6-His蛋白对 H ₂ O ₂ 的过氧化损伤有抵抗作用。 实施例 5 PRDX2, PRDX6蛋白对弱精症患者精子的保护

步骤： 1、 取精子样本， 液化后， 测前向运动精子 (PR)%， 选取 (PR)% < 32%的精 子样本 (即弱精)。

2、 于 BWW培养液中上浮 lh。

3、 用 BWW培养液洗涤精子 3次。

4、 将上述精子分为 3组：

空白对照组 (精子稀释在 BWW+缓冲液 （20mM 磷酸盐缓冲液， 150mM 氯 化钠， ρΗ7·2 ) 中）；

BSA组 (精子稀释在 BWW+300ug/ml 牛血清蛋白（BSA，购自 Amresco )中）； 蛋白组 (精子稀释在 BWW+300ug/ml蛋白中）

5、 分别于孵育 2h和 4h后检测精子各项运动参数。

结果：

(1)对于前向运动精子 (PR)% < 32%的精子样本， 在孵育 2h后， HEL-S-2a蛋 白 （SPPRDX2蛋白） 组精子的活动率、 前向运动精子百分率、 平均路径速率、 直线速率和曲线速率显著高于空白对照组。 HEL-S-2a蛋白组精子的活动率、 前 向运动精子百分率和直线速率显著高于 BSA组。 结果统计分析见图 5。

(2)对于前向运动精子 (PR)% < 32%的精子样本， 在孵育 2h后， HEL-S-128m 蛋白 （SPPRDX6蛋白）组精子的活动率、 前向运动精子百分率、 平均路径速率、 直线速率和曲线速率显著高于空白对照组。 HEL-S- 128m蛋白组精子的活动率、 前向运动精子百分率、 平均路径速率和直线速率显著高于 BSA组。 结果统计分 析见图 6。

在辅助生殖技术的精液体外处理过程中， 添加本发明的重组人 PRDX2蛋白 和 PRDX6蛋白， 能够提高处理后活动精子总数， 明显改善处理后的精子质量， 提高妊娠率。 实施例 6 用于治疗不育症的栓剂处方及制备工艺

栓剂制备工艺， 添加材料及其相应添加量如表 2所示：

1. 将 β-CD加适量乙醇搅拌均匀为糊状， 加蛋白研磨包合 45分钟备用。 2. 将 36型半合成脂肪酸酶加热溶解后保温 38°C， 加主药的包合物， 充分混 合均匀保温。

3. 将混合均匀的保温物灌膜冷却成形。 实施例 7 精子冷冻保护剂处方及保护效果

7.1 精子冷冻保护剂处方

每 100 ml 精子冷冻保护剂中含：

PRDX6蛋白 500mg， PRDX2蛋白 500mg， KC1 0.54 mmol/L,

NaCl 10.0mmol/L, MgSO ₄ 0.05 mmol/L, NaH ₂ PO ₄ 0.03 mmol/L,

NaHCO ₃ 10 mmol/L, 葡萄糖 205.4 mmol/L， 甘氨酸 13.0 mmol/L， 蔗糖 5.0mmol/L， HEPES 2.5 mmol/L, 甘油 14% ( v/v)。

基本配方用双蒸水配制。

调 pH 至 7.4， 0.22um无菌滤器过滤除菌。 7.2 比较本发明的精子冷冻保护剂与商品化产品的 保护效果

7.2.1 材料

精液标本来自健康、 已婚、 已育的 20 名 30〜 35岁志愿献精者， 经泌尿外 科及精液常规检测正常后进入本研究。

7.2.2 方法

每位志愿献精者取精液 2ml以上， 分为 3份。

其中 1份进行冻前精液常规检查及 SPA测定；

剩余 2份分别采用本发明实施例 7所述的冷冻保护剂和商品化的产品进行 冷冻， 6个月后复温， 分别进行精液常规检查及 SPA的测定。

7.2.3 结果如表 3所示：

表 3

组别 份数 精子活动率(％) SPA(%) 冷冻前组 20 73.7±3.4 41.5±4.1 本发明保护剂组 20 61 ·4±2·7 81 ·2±2·5 28·9±3·5 商品化保护剂组 20 52·3±3·6 70.2±3.1 21.2±3.2 与商品化保护剂相比， 本发明的精子冷冻保护剂在精子复苏率和穿卵 率

(SPA)方面有显著提高 (P<0.01)。 实施例 8 活性片段的治疗作用

重复实施例 5和 7，不同点在于：用 SEQ ID NO.: 2 中第 5-169 位所示的 Prx-6 活性片段替代 SEQ ID NO.: 2 所示的全长 Prx-6 蛋白。 用 SEQ ID NO.: 4 中第 6-164 位所示的 Prx-2 活性片段替代 SEQ ID NO.: 4 所示的全长 Prx-2 蛋白。 结果表明， 上述活性片段具有对弱精症患者精子的保护作 用， 明显改善处 理后的精子质量， 提高妊娠率， 其治疗效果与全长 Prx-6或 Prx-2相当。 上述活性 片段同样可作为精子冷冻保护剂， 显著提高精子复苏率和穿卵率。 实施例 9 Prx-6蛋白对角膜损伤的治疗作用

9.1 动物来源： 6周龄 SD大鼠， 烟台毓璜顶医院实验动物中心。

9.2 药物： 实验组： 实施例 3中制备的 Prx-6蛋白； 对照组： 生理盐水。

9.3 角膜损伤模型制备

5%水合氯醛 （7ml/kg体重） 腹腔内注射， 麻醉后选择双星明和新福林眼液 作为散瞳剂， 每 2min l次， 1滴 /次， 20min后， 瞳孔散大后用棉签小心吸除角结 膜的散瞳剂， 置于 300nm紫外线灯下， 固定大鼠与紫外线灯的相对位置高度， 并用紫外照射计测定辐射照度， 控制在 1 X 10 ³ Uw/cm ² , 每天累计辐射剂量 9KJ/m ² , 连续 3天， 造成大鼠角膜损伤模型， 用裂隙灯显微镜观察。

9.4 治疗方法

实验包括： 对照组 (滴生理盐水）、 Prx-6蛋白治疗组 (滴 2mg/ml Prx-6蛋白）。 角膜损伤后 2天开始用药， 每天用药 4次， 每次将 2滴 （约 30 μ 1) 药品滴入大鼠 眼内。

9.5 实验结果

紫外线照射后 2天， 大鼠角膜发生水肿， 透明度明显降低。 治疗第 4天， 对 照组的角膜有较多新生血管生成， 炎症反应严重， 而 Prx-6蛋白治疗组仅有少量 新生血管生成， 并且水肿明显减轻； 治疗第 8天， 对照组角膜的水肿稍减轻， 透明度部分恢复， Prx-6蛋白治疗组角膜透明度大部分恢复； 治疗第 12天， 对照 组角膜透明度仍未完全恢复， Prx-6蛋白治疗组大鼠角膜基本恢复，水肿消除 (图 7)。 （注： 图中从左至右依次为： 对照组 (2只）； Prx-6治疗组 (2只))。 实施例 10 PRDX2、 PRDX6活性测定方法

过氧化氢在 240nm波长下有强烈的吸收， 且与浓度成正比 （A240nm X 22.94=过氧化氢浓度 mM ) ， P DX6, PRDX2均能够分解过氧化氢， 使反应溶 液的吸光度 （A240nm) 随反应时间而降低。 实验方案： 用缓冲液 （20mM磷酸盐缓冲液， 150mM氯化钠， pH7.2 ) 配制

10mM的过氧化氢， 取 500ul， 加入 10ul的蛋白 （BCA法定量） ， 在室温 25 °C下 反应 20min， 通过测定反应前后的吸光度差值， 计算消耗掉的过氧化氢的量， 从而计算出每 ug蛋白在 lmin内能消耗掉的过氧化氢的量 （ nmol ) ， 即 nmol/min/ug, 以此来评价 PRDX6或 PRDX2的活性。

PRDX6的实验结果如表 4所示， 结果表明本发明所述 PRDX6的活性能达到 1 nmol/min/ug以上。

表 4

P DX6的实验结果也表明 PRDX2的活性能达到 1 nmol/min/ug以上 , 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作 为参考， 就如同每一篇文献 被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅 读了本发明的上述讲授内容之后， 本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修 改， 这些等价形式同样落于本申 请所附权利要求书所限定的范围。