Aplicaciones de la halocina H7. CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se encuadra dentro del campo técnico de las aplicaciones de determinado tipo de sustancias proteicas denominadas bacteriocinas producidas por las halobacterias .

Más concretamente, la presente invención se refiere a las diversas aplicaciones de una bacteriocina concreta, a saber, la halocina H7 derivadas de su mecanismo de acción a nivel de la membrana celular. ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR A LA INVENCIÓN

Las halobacterias son microorganismos proca- rióticos halófilos extremos. Su habitat natural lo consti- tuyen medios con elevadas concentraciones de sales tales como las salinas solares o los lagos salados. Estos microorganismos, tan sencillos como las bacterias en su organización celular, están incluidos en el "dominio" de las Archaea (Woese, CR, Kankler, 0, Weelis, ML, 1990. Proc . Nati. Acad. Sci. USA 87; 4576), es decir han evolucionado paralela e independientemente del resto de los seres vivos . Esto supone importantes diferencias en composición química, genética y capacidades biosintéticas y metabólicas con respecto a los otros "dominios": Bacteria y Eucarya. Entre las múltiples características peculiares de las halobacterias, las más destacables o definitorias que los distinguen respecto de otros microorganismos halófilos se refieren a su espectro de crecimiento en elevadas concentraciones de sales, su pigmentación, la composición de lípidos de su membrana celular y la resis¬ tencia a ciertos antibióticos tales como la penicilina.

La taxonomía de este grupo de microorganismos ha sido recientemente modificada en base a un exhaustivo estudio de sus características morfológicas, composición y pruebas metabólicas (Torreblanca, M. Rodríguez-Valera, F.

Juez, G. Ventosa, A. Kamekura, M. Kates, M. 1986. Sistem. Appl. Microbiol. 8; 89-99). Asimismo, existe una reciente revisión bastante completa sobre microorganismos halófilos, en la que se recopilan diversos aspectos de su estudio (Rodríguez-Valera, F. 1988. Halophilic bacteria Vol . I- II. Ed. F. Rodríguez-Valera. CRC Press, Boca Ratón, Florida). Sin embargo, existe una propiedad interesante de las halobacterias a la cual no se ha prestado la atención debida. Dicha propiedad es su capacidad de producción de sustancias proteicas del tipo de las bacteriocinas denomi¬ nadas halocinas. Las bacteriocinas son sustancias capaces de inhibir el crecimiento de otros microorganismos a través de mecanismos de acción que afectan a objetivos específicos y vitales para la célula (Reeves, P, 1972 Bacteriol. Rev. 29; 24-45; »Tagg, JR, Dajany, AS, annamaker, L , 1976. Bact.Rev. 40: 722-756). A pesar de haberse descrito multitud de sustancias del tipo de las bacteriocinas, el número de ellas que se han estudiado en profundidad es muy reducido y solo de unas pocas se conoce con precisión el mecanismo de acción (Konisky, J, 1982. Ann. Rev. Micro¬ biol.36 ; 125-144), debido en gran parte a la dificultad que ello entraña. No obstante el potencial farmacológico que representan estas sustancias es probablemente incalculable. La producción de halocinas es una característica casi universal de las halobacterias (Meseguer, I. Ventosa, A. Rodríguez-Valera, F. 1986. FEMS Microbiol. Lett. 36: 177-182; Torreblanca, M. Meseguer, I. Ventosa, A. 1994. Lett. Appl. Microbiol. 19; 201-205) aunque en la actualidad solo se han estudiado dos halocinas H6 y H4 (Meseguer, I. Rodríguez-Valera, F. 1985. FEMS. Microbiol. Lett. 28:

177-182; Torreblanca, M. Meseguer, I. Rodríguez-Valera, F. 1989. J. Gen. Microbiol. 135; 2655-1661) existe una gran diversidad de ellas.

Las halobacterias, además, poseen capacidad para producir halocinas, sustancias proteicas del tipo de

las bacteriocinas, con un potencial farmacológico muy importante.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a las aplicaciones de la halocina H7, aislada de una nueva variedad de Haloferax σibbonsii, la variedad "alicante

SPH7", depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo con la referencia CECT 4547.

Concretamente, la halocina H7 es una proteína con un peso molecular de 30.500 + 500.

Tanto la halocina H7 como la nueva cepa CECT 4547 se describen en la solicitud de Patente copendiente nε 9500467 del solicitante, presentada simultáneamente y cuya descripción se incorpora aquí como referencia. Las aplicaciones de la halocina H7 derivan de su mecanismo de acción a nivel de la membrana celular. La halocina H7 es una sustancia de tipo antibiótico capaz de alterar el equilibrio bioenergético existente en las membranas biológicas. La halocina H7 inhibe de forma específica el intercambiador de sodio-protón localizado en la membrana celular. Dada la importancia de este mecanismo en el mantenimiento del volumen y el pH intracelular, la halocina H7 posee aplicaciones de gran interés relacionadas con el papel fisiológico y fisiopatológico del intercambiador sodio-protón. La actividad del intercambiador sodio-protón se demuestra por la extrusión de iones sodio contenidos en vesículas de membrana, al acidificar artificialmente el medio externo. La salida del sodio del medio intravesicular es muy lenta "per se" debido a la baja permeabilidad de la membrana a estos iones. Al acidificarse el medio externo, el intercambiador se activa, favoreciendo la rápida extrusión de iones sodio al medio externo. La disminución de la concentración de sodio en las vesículas se determina cromatográficamente. El efecto que produce la halocina H7

es una retención del sodio intravesicular como consecuencia de la inactivación del intercambiador sodio-protones (ver Tabla I) .

TABLA I: Inhibición de la extrusión de sodio en vesículas de membrana por la halocina H7.

Tiempo (min) % Na ⁺ retenido en vesículas

Control H7

0 100 100

1 74 98 2 40 96

3 37 94

4 32 93

5 26 92

6 23 91 El intercambiador Na ⁺ -H ⁺ está presente en todos los tipos celulares. Se sabe que participa, a nivel celular en varios procesos, como por ejemplo, a) el control del pH intracelular, b) el control de la concentración de Na ^* intracelular, c) el control del volumen celular y el control de la división celular (Motáis et al, Biochim Biophvs Acta 10. 1075 ( 2 ) : 169-180, 1.991; Maidurna et al, Br J Cáncer. 67 (2) ; 297-303. 1993; Harguindey y Cragoe Med Hypotheses. 39 (3); 229-37, 1992). Desde el punto de vista tisular parece ser que interviene en varios procesos fisiológicos y patológicos de vital importancia como la diuresis, la hipertensión arterial, la isquemia cardiaca y cerebral, la división de las células tu orales, el trans¬ porte epitelial, la activación de los acrofagos, etc. Rolfe et al (Am J Respir Cell Mol Biol. 6 f 6 i : 576-582, 1992) han señalado que el intercambiador sodio-protón participa eh la liberación de citokinas por parte de los macrófagos. La inhibición de dicho intercambiador podría ser de gran utilidad en los procesos en los que se precisa de in unosupresión (trasplantes, autoin unidad, etc) . Asimismo, la actividad del intercambiador sodio-protón está

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aumentada en la hipertensión esencial en el humano y en los modelos animales de hipertensión (Canessa et al, Hyperten- sión. 17 (3): 340-348, 1991; Rosskopf et al Hypertensión. 21 (5' : 607-617, 1993). La asociación frecuente diabetes- hipertensión tendría como mecanismo común el aumento de actividad de dicho intercambiador (Dudeya et al, Kidney Int. 42 (5): 1184-1190, 1992; Dudeja PK et al J Clin Invest. 87 ( 5 ) : 1755-1762, 1991; Dusing et al. Clin Investía. 71 (2); 119-25, 1993). La inhibición del inter- cambiador puede mejorar la resistencia a la insulina. Por último, el intercambiador sodio-protón participaría en los procesos de reperfusión durante un período de isquemia. Durante la reperfusión del miocardio el gradiente de H ⁺ es muy alto (pH intracelular muy grande comparado con fuera) . Como consecuencia se produce una carga de sodio intracelu¬ lar que fuerza al intercambiador sodio-calcio a operar en sentido inverso y se produce un aumento del calcio citosó- lico hasta niveles tóxicos y, como consecuencia, la muerte celular. Al disponer de un buen bloqueador del intercambia- dor sodio-protón puede mejorarse dicho cuadro.

En la actualidad no se dispone de inhibidores fisiológicos del intercambiadcr sodio-protón. El amiloride y sus derivados inhiben el intercambiador pero no lo hace de forma específica. El amiloride es también un inhibidor del intercambiador sodio-protón, de otros intercambiadores, como el intercambiador sodio-calcio y de canales inespecí- ficos de sodio. A pesar de estas limitaciones el amiloride se está utilizando en terapéutica como diurético. No obstante, es grande el número de efectos secundarios. Por otra parte los derivados de amiloride que han mostrado un efecto más específico sobre el intercambiador sodio-protón tienen el grave inconveniente de ser difíciles de revertir.

Las ventajas más destacables que presenta la halocina H7 son las siguientes: 1.- Al ser un producto de naturaleza peptídica

tiene reversibilidad de acción terapéutica y la facilidad para etabolizarse propia de las sustancias proteicas.

2.- Es una sustancia natural de tipo antibió¬ tico, su poder bactericida está basado en su acción inhibidora del intercambiador sodio-protón.

3.- Es un inhibidor específico, activo a concentraciones muy bajas lo que disminuye los efectos secundarios .

4.- Puede operar en un gran rango de concen- traciones de sales, temperatura y pH, lo que le convierte en el fármaco de elección en determinados procesos.

5.- Es resistente a la acción de la tripsina, lo que permite su utilización en el tracto intestinal.

6.- Al tratarse de un péptido sensible a pronasa su efecto puede terminarse cuando se desee.

De acuerdo con lo anterior, las aplicaciones de la halocina H7, objeto de la presente invención, son las siguientes:

- Diurético y antihipertensivo; - Protector en los procesos de isquemia cardíaca y nerviosa;

- Reductor de la resistencia a la insulina en la diabetes no insulino-dependiente;

- Inhibidor de la formación de ácido clorhí- drico en la mucosa gástrica;

- Inhibidor del crecimiento celular;

- Regulador del volumen celular;

- Regulador del crecimiento de otras bacterias y organismos icrobiológicos; - Inmunomodulador;

- Inhibidor del transporte epitelial. MODOS DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención se ilustra adicionalmen- te mediante el siguiente experimento, el cual no pretende ser limitativo de su alcance.

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Demostración del efecto de H7 sobre el intercambiador sodio-protón de mamíferos:

De particular importancia a la hora de reivindicar sus usos terapéuticos es la demostración del efecto de H7 sobre células de mamíferos tal y como se demuestra en la siguiente serie de experimentos. En ratones que recibieron una inyección única de 2.250 unidades arbitrarias/gr de peso del ratón (se define como una unidad arbitraria, a la mínima cantidad de H7 capaz de producir un efecto inhibidor visible del crecimiento de Halobacterium salinariu en doble capa) se observaron los siguientes efectos: a) Aumento sensible de la concentración de Na ^* e en orina de 24 h (la concentración de orina pasaba de 350- 380 mmol/1 en controles a 700 mmol/1 en ratones tratados con halocina H7) dicho efecto se corresponde con una pérdida neta de iones sodio ya que coincide en el tiempo con un aumento en la formación de orina que pasa de 0,25- 0,30 ml/24 h en ratones control a 0,32-0,45 ml/24 h en ratones a los que se inyectó halocina H7, b) Disminución en la concentración de K ⁺ en orina pasando de 375-440 mmol/1 en controles a 240 mmol/1 en ratones tratados con H7. Una disminución tan intensa en la concentración no puede deberse al efecto dilutor del aumento de la diuresis. Los efectos descritos son compatibles con la acción inhibidora de H7 sobre el intercambiador sodio-protón de la membrana lu inal del epitelio renal. Los efectos descritos revirtie¬ ron espontáneamente a las 48-72 h.