| JP2006249035 | ACTIVE OXYGEN REMOVER |
| JP2001017096 | EXTRACTION OF PROPOLIS EXTRACT |
| JP2004043376 | ANGIOTENSIN-CONVERTING ENZYME INHIBITOR |
RIBEIRO VALENTÃO, Patricia Carla (Rua Anìbal Cunha, 164, -047 Porto, P-4050, PT)
FERREIRA DE SOUSA, Carla Sara (Rua Anìbal Cunha, 164, -047 Porto, P-4050, PT)
MICAEL PEREIRA, David Alexandre (Rua Anìbal Cunha, 164, -047 Porto, P-4050, PT)
FERRERES DE ARCE, Federico (Campus Universitario de Espinardo, Murcia, E-30100, ES)
BRANQUINHO DE ANDRADE, Paula Cristina (Rua Anìbal Cunha, 164, -047 Porto, P-4050, PT)
RIBEIRO VALENTÃO, Patricia Carla (Rua Anìbal Cunha, 164, -047 Porto, P-4050, PT)
FERREIRA DE SOUSA, Carla Sara (Rua Anìbal Cunha, 164, -047 Porto, P-4050, PT)
MICAEL PEREIRA, David Alexandre (Rua Anìbal Cunha, 164, -047 Porto, P-4050, PT)
FERRERES DE ARCE, Federico (Campus Universitario de Espinardo, Murcia, E-30100, ES)
Claims
[Claim 1] Extracto aquoso da larva de Pieris brassicae alimentada com couve tronchuda caracterizado por compreender compostos complexos derivados de quercetina, de estrutura geral (I), em que:
Ri e soforόsido e R 2 e glucόsido; ou
Ri e (feruloil)triglucόsido e R 2 e glucόsido; ou
Ri e (p-cumaroil)soforόsido e R 2 e H; ou
Ri e soforόsido e R 2 e H; ou
Ri e (feruloil)triglucόsido e R 2 e H, bem como compostos complexos derivados do campferol, de estrutura geral (II), em que:
Ri e soforόsido e R 2 e glucόsido; ou
Ri e soforόsido e R 2 e soforόsido; ou
Ri e (sinapoil)triglucόsido e R 2 e glucόsido; ou
Ri e (feruloil)triglucόsido e R 2 e glucόsido; ou
Ri e (p-cumaroil)triglucόsido e R 2 e glucόsido; ou
Ri e (metoxicafeoil) soforόsido e R 2 e glucόsido; ou
Ri e (cafeoil)soforόsido e R 2 e glucόsido; ou
Ri e 0-cumaroil)triglucόsido e R 2 e H; ou
Ri e (p-cumaroil)soforόsido e R 2 e H; ou
Ri e (metoxicafeoil)soforόsido e R 2 e H; ou
Ri e soforόsido e R 2 e H; ou
Ri e (di-sinapoil)triglucόsido e R 2 e glucόsido; ou
Ri e (feruloil/sinapoil)triglucόsido e R 2 e glucόsido; ou
Ri e glucόsido e R 2 e H.
[Claim 2] Extracto aquoso da larva de Pieris brassicae alimentada com couve tronchuda, de acordo com a reivindicacao anterior, caracterizado por conter os compostos quercetina 3-Osoforόsido-7-0 ■ glucόsido, campferol 3-O-soforόsido-7-O-glucόsido, campferol 3-C>-soforόsido-7-0-soforόsido, quercetina 3-0 - (feruloi^triglucόsido-V-O-glucόsido, campferol 3-0 - (sinapoirjtriglucόsido-T-ø-glucόsido, campferol 3-0 - (feruloil)triglucόsido-7-(?-glucόsido, campferol 3-O-(p - cumaroil)triglucόsido-7-O-glucόsido, campferol 3-O - (metoxicafeoil)soforόsido-7-O-glucόsido, campferol 3-0 - (cafeoil)soforόsido-7-0-glucόsido, quercetina 3-O-(p - cumaroil)soforόsido, campferol 3-(9-(p-cumaroil)triglucόsido, campferol 3-0-(p-cumaroil)soforόsido, campferol 3-0 - (metoxicafeoil)soforόsido, quercetina 3-Osoforόsido, campferol 3-0-soforόsido, campferol 3-0-(di-sinapoii)triglucόsido-7-0 - glucόsido, campferol 3-O-(feruloil/sinapoil)triglucόsido-7-6> - glucόsido, quercetina 3-0-(feruloil)triglucόsido e campferol 3-0 - glucόsido.
[Claim 3] Extracto aquoso da couve tronchuda, de acordo com a reivindicacao 1, caracterizado por conter os compostos campferol 3-0-soforotriόsido-7-(9-glucόsido, campferol 3-0 - (metoxicafeoil/cafeoiOsoforόsido-V-O-glucόsido, campferol 3-0 - soforόsido-7-O-glucόsido, campferol 3-(9-soforotriόsido-7-O - soforόsido, campferol 3-O-soforόsido-7-O-soforόsido, campferol 3-O-tetraglucόsido-7-O-soforόsido, campferol 3-O - (sinapoil/cafeoil)soforόsido-7-O-glucόsido, campferol 3-0 - (feruloiI/cafeoil)soforόsido-7-O-glucόsido, campferol 3-O - soforotriόsido, campferol 3-(9-(sinapoil)soforόsido, campferol 3- O-(feruloil)soforotriόsido, campferol 3-O-(feruloil)soforόsido e campferol 3-0-soforόsido.
[Claim 4] Extracto aquoso, de acordo com as reivindicagδes anteriores, caracterizado por ser utilizado como antioxidante. [Claim 5] Extracto aquoso da larva de Pieris brassicae alimentada com couve tronchuda, de acordo com a reivindicacao anterior, caracterizado por ser utilizado na prevencao da gota.
[Claim 6] Utilizacao do extracto aquoso da larva de Pieris brassicae, de acordo com as reivindicacδes anteriores, caracterizado por ser aplicado como antioxidante contra radicals livres. |
Description
EXTRA CTO A QUOSO DA LAR VA DE PIERIS BRASSICAEERESPECTIVA UTILIZ Aς AO COMO AN-
TIOXIDANTE
Campo da Invenςao
[1] A presente invencao diz respeito a extractos aquosos padronizados de larva de Pieris brassicae, alimentada com couve tronchuda, para serem utilizados como antioxidantes nas indύstrias alimentar, farmaceutica, cosmetica, ou dos plasticos, constituindo, tambem, uma vantagem econόmica para os produtores de couve tronchuda que sofrem perdas avultadas com esta praga. Antecedentes da Invenςao
[2] Um radical livre e definido como qualquer especie com existencia independente, que contem um ou mais electrδes desemparelhados. Uma vez que os electrδes sao mais estaveis quando emparelhados, os radicals livres apresentam maior reactividade do que as especies nao radicalares. O encontro de dois radicals livres resulta na combinacao dos seus electrδes desemparelhados e na formacao de uma ligacao covalente [I].
[3] No que diz respeito ao Homem, a presenca de agentes oxidantes no organismo resulta da (i) producao a nivel intracelular, na sequencia de processos biolόgicos normais, (ii) libertacao pelas celulas envolvidas em processos inflamatόrios, e (iii) da presenca de xenobiόticos, que por si so podem ter actividade prό-oxidante, podendo tambem induzir a formacao de agentes oxidantes nas celulas [2].
[4] Dada a facilidade que este agentes apresentam para aceitar electrδes das moleculas alvo, podem modificar a sua estrutura e/ou funcao. Assim, os agentes oxidantes podem interagir com componentes estruturais, como a membrana plasmatica, material genetico e processos enzimaticos; adicionalmente, podem tambem alterar moleculas do meio extracelular, modificando assim a arquitectura dos tecidos, moleculas envolvidas na defesa dos tecidos e mediadores celulares [2].
[5] O metabolismo aerόbio conduz a formacao de especies reactivas de oxigenio (ROS), dai resultando a necessidade permanente de eliminacao ou inactivagao dessas especies reactivas, para manutencao da homeostasia. Em algumas circunstancias, podera existir um desequilibrio entre prό-oxidantes e antioxidantes, com favorecimento dos primeiros, surgindo um quadro de stress oxidative A perda de controlo dos processos oxidativos endόgenos associados a utilizacao de oxigenio pelas celulas e o factor de- terminante nos danos relacionados com esta situagao. Tais danos podem afectar todos os tipos de moleculas, incluindo acidos nucleicos, lfpidos, protefnas e hidratos de carbono. Deste modo, o stress oxidativo esta envolvido em processos de mutagenese,
carcinogenese, processos inflamatόrios, envelhecimento, arteriosclerose, peroxidacao lipidica, oxidacao e fragmentacao de protemas, bem como em alteragόes dos hidratos de carbono [3, 4, 5]. No organismo humano a capacidade que os agentes oxidantes ap- resentam para alterar as moleculas de forma deleteria e controlada por antioxidantes endόgenos e exόgenos, que incluem sistemas enzimaticos e compostos de baixo peso molecular. A accao antioxidante de um composto pode resultar da intercepcao de especies reactivas prό-oxidantes (como radicals livres, ROS, especies reactivas de azoto ou iδes metalicos), da inibicao da sua formacao e/ou da regulacao dos mecanismos de defesa antioxidante ou por correcgao do dano causado [6].
[6] Os agentes antioxidantes nao sao relevantes unicamente na medicina preventiva e em terapeutica. A sua presenca nos alimentos e importante, pois minimizam a alteracao ou decomposigao das substantias gordurosas em contacto com o ar , retardam a formacao de produtos de oxidacao tόxicos, contribuem para a manutencao da qualidade nu- tricional e aumentam o tempo de armazenamento [7]. Para alem do aspecto da preservacao, a sua ocorrencia nos alimentos constitui um suplemento de defesa para o organismo. No entanto, as reaccδes de oxidacao nao sao uma preocupacao exclusiva da indύstria alimentar. Assim, os agentes antioxidantes sao tambem necessarios para prevenir a deterioracao de outros produtos oxidaveis, tais como cosmeticos, produtos farmaceuticos e plasticos [6].
[7] Por outro lado, a utilizacao de antioxidantes sinteticos tern vindo a ser restringida devido a toxicidade que apresentam, o que suscitou o interesse em encontrar materias- primas de origem vegetal que possam fornecer antioxidantes [8]. Nos ύltimos anos tern vindo a ser exploradas as propriedades antioxidantes dos compostos fenόlicos, uma classe amplamente distribuida na natureza, com actividade anti-radicalar, capacidade para quelatar metais e inibir sistemas produtores de radicals livres [6].
[8] A Pieris brassicae L. (Lepidoptera: Pieridae) e um insecto cuja larva constitui uma praga frequente em culturas de varias especies de Brassica, nomeadamente de couve tronchuda (Brassica oleracea L. variedade costata DC). O sequestra de compostos fenόlicos, nomeadamente de flavonόides, por algumas famflias de Lepidoptera e conhecido, sabendo-se que estes compostos participam na pigmentacao das asas das borboletas. A presenca de flavonόides nos insectos esta directamente associada a sua ocorrencia na dieta da larva, pois os insectos nao conseguem sintetizar de novo estes compostos, nem os seus precursores. Assim, o sequestro e a metabolizacao dos flavonόides pelos insectos dependem directamente da composicao da planta hospedeira [9, 10, 11, 12].
[9] Os ύnicos dados relativos ao sequestro e metabolizacao de flavonόides pela larva de
P. brassicae foram publicados recentemente, tendo a couve tronchuda como planta hospedeira [13]. Foram identificados vinte flavonόis, derivados complexos da
quercetina e do campferol, dos quais apenas tres eram comuns a folha de couve tronchuda, sugerindo que esta larva podera constituir uma fonte de compostos bioactivos indisponfveis na natureza. Ate agora nao foi desenvolvido nenhum estudo envolvendo esta larva, tendo em vista o seu potencial antioxidante.
[10] Documentos anteriores envolvendo P. brassicae dizem respeito a obtencao de muteinas com afinidade para macromoleculas [14] e para ligacao a digoxina e digitoxina [15] a partir de protemas do insecto, a descoberta de pesticidas com ac- tividade contra P. brassicae [16, 17, 18, 19, 20], e ao desenvolvimento de urn metodo que utiliza a hemolinfa do insecto para diagnόstico rapido de meningite bacteriana [21]. Nenhum destes trabalhos envolvia o extracto que e o objecto da presente invencao, nem os compostos nele presentes.
[11] O documento US2006018983 [22] revela diferentes misturas de varios vegetais, com capacidade para proteger o sangue de reaccδes de oxidacao. Nesse trabalho foram usadas as partes comestiveis desses vegetais na forma triturada, ou o sumo resultante da sua compressao. Contudo, nenhuma destas misturas incluia a couve tronchuda ou o seu extracto aquoso e desconhece-se qual a sua composicao quimica.
[12] O documento KR20030068640 [23] divulga a obtencao de um composto, o campferol 3-6>-galactόsido-6'-acetato, com capacidade para interceptar o radical hidroxilo. Este composto foi isolado do extracto metanόlico das agulhas de pinheiro, por um processo envolvendo diversos passos de fraccionamento e purificacao.
[13] O documento NZ516367 [24] revela a utilizacao de um extracto rico em proanto- cianidinas na reducao e prevencao da oxidacao de protemas e danificacao do acido desoxirribonucleico, que ocorrem naturalmente nos mamiferos. Esse extracto foi obtido das cascas de pinheiro.
[14] O documento US6514527 [25] diz respeito a farmacocinetica de misturas contendo quercetina 3-0-glucόsido, quercetina 4'-0-glucόsido, quercetina 3-Orutinόsido e quercetina, para administracao oral.
[15] O documento US5762936 [26] revela a obtencao de extractos das pelfculas das sementes de lentilhas com capacidade antioxidante. Estes extractos foram preparados usando varios solventes organicos, isoladamente ou em mistura com agua, e eram ricos em glicόsidos de procianidina e prodelfinidina.
[16] Todavia, nenhum dos documentos anteriormente citados revela o extracto aquoso da larva de um insecto como fonte de compostos com actividade antioxidante. Desta forma, e objecto da presente invencao o extracto aquoso da larva de P. brassicae, al- imentada com couve tronchuda, que apresenta actividade antioxidante contra ROS, nomeadamente contra os radicals superόxido e hidroxilo, e capacidade para inibir a xantina oxidase. Este extracto e obtido simplesmente por decoccao da larva, sendo composto por diversos glicόsidos complexos de campferol e quercetina (flavonόis),
alguns dos quais acilados, nao dispomveis na natureza e de sintese laboratorial difϊcil e dispendiosa.
Sumario da Invenςao
[17] A procura de agentes antioxidantes de origem natural e o facto de a larva de P. brassicae sequestrar e metabolizar os compostos fenόlicos da couve tronchuda (planta hospedeira), com associagao de actividade antioxidante comprovada [27, 28, 29], tornam a presente invencao muito interessante no que diz respeito a sua utilizacao como antioxidante com aplicagao nas indύstrias alimentar, farmaceutica e cosmetica.
[18] Desta forma, a presente invencao divulga um extracto de insecto, nomeadamente da larva de P. brassicae alimentada com couve tronchuda com actividade antioxidante, sendo essa actividade avaliada relativamente ao radical 2,2-difenil-l-picrilhidrazilo (DPPH) e a ROS (radicals superόxido e hidroxilo), tendo-se verificado um elevado potencial antioxidante do extracto aquoso. Adicionalmente, foi observada capacidade para inibir a xantina oxidase (XO), uma enzima envolvida no desenvolvimento de gota.
[19] Com a aplicacao desta invenςao e possivel obter um extracto de origem natural com actividade antioxidante, rico em compostos de sintese laboratorial complexa e raros na natureza.
[20] Dada a actividade deste extracto, a indύstria farmaceutica pode utiliza-lo para prevenir a oxidacao dos seus produtos, prolongando os respectivos prazos de validade e os periodos de armazenamento, depois de abertas as embalagens, ou em formulacδes indicadas para prevencao de doencas mediadas por radicals livres, nomeadamente da gota. A indύstria cosmetica pode usa-lo com o mesmo fim e ainda em formulacδes destinadas a retardar o envelhecimento. A indύstria alimentar pode usa-lo para manter a seguranga e qualidade e alargar o periodo de armazenamento dos seus produtos. A sua utilizacao tambem e vantajosa em indύstrias que requeiram o uso de antioxidantes, tais como a dos plasticos e borracha. Adicionalmente, tira-se partido de uma praga frequente das culturas de couve tronchuda, que geralmente provoca elevadas perdas econόmicas aos seus produtores. Breve Descriςao das Figuras
[21] Fig. 1. Efeito dos extractos aquosos da larva de Pieris brassicae e da planta hospedeira sobre o DPPH.
[22] Fig. 2. Efeito do extracto aquoso da larva de Pieris brassicae sobre o radical superόxido gerado nos sistemas enzimatico X/XO e quimico NADH/metossulfato de fenazina e sobre a xantina oxidase.
[23] Fig. 3. Efeito do extracto aquoso da planta hospedeira sobre o radical superόxido gerado nos sistemas enzimatico X/XO e quimico NADH/metossulfato de fenazina e sobre a xantina oxidase.
[24] Fig. 4. Efeito do extracto aquoso da larva de Pieris brassicae sobre o radical hidroxilo gerado no sistema de Fenton e na ausencia de acido ascόrbico (-AA), e na quelatacao de iδes metalicos (-EDT A).
[25] Fig. 5. Efeito do extracto aquoso da planta hospedeira sobre o radical hidroxilo gerado no sistema de Fenton e na quelatacao de iδes metalicos (-EDTA).
[26] Fig. 6. Efeito do extracto aquoso da planta hospedeira sobre o radical hidroxilo gerado na ausencia de acido ascόrbico (-AA).
[27] Os valores apresentados em cada grafico correspondem a media ± erro padrao (n=3).
Abreviaturas: X/XO, xantina/xantina oxidase; NADH/PMS, NADH/metossulfato de fenazina. Descriςao Geral da Invenςao
[28] A presente invencao diz respeito a um extracto aquoso da larva de P. brassicae tendo a B. oleracea var. costata (couve tronchuda) como planta hospedeira, com actividade antioxidante.
[29] Sabe-se ja que a larva de P. brassicae alimentada com esta especie e capaz de se- questrar e metabolizar esses compostos, apresentando, por isso, um perfil fenόlico diferente do da planta hospedeira [13]. Contudo, o potencial antioxidante desta larva nunca foi avaliado. Nesta invencao e verifϊcado pela primeira vez que o extracto aquoso da larva de P. brassicae alimentada com couve tronchuda possui actividade contra especies radicalares e capacidade para inibir a XO (Fig. 3A), uma enzima que cataliza a conversao metabόlica da xantina em acido ύrico, estando portanto envolvida no processo de desenvolvimento de gota [30].
[30] 1. Obtencao dos extractos
Para a presente invencao foi usado um extracto de larva de P. brassicae alimentada com couve tronchuda, obtido por decoccao. Foi preparado um extracto aquoso para ser compativel com o meio aquoso, tal como ocorre no organismo, facilitando a assimilacao. Adicionalmente, este extracto foi escolhido de modo a nao interferir com os sistemas usados nos ensaios de avaliacao do potencial antioxidante. O extracto aquoso obtido foi liofilizado para prevenir alteracδes, permitindo que o mesmo extracto pudesse ser usado em todos os ensaios de avaliacao do potencial antioxidante. Assim, obtem-se um extracto de preparacao facil, com consumo reduzido de tempo e dinheiro, sem recurso a solventes organicos.
[31] Paralelamente foi preparado do mesmo modo um extracto de couve tronchuda, a planta hospedeira da larva, para comparacao dos resultados.
[32] 2. Caracterizacao dos extractos
A caracterizacao dos extractos foi efectuada por cromatografia liquida de alta pressao, usando uma coluna de fase reversa, com deteccao por dfodos. Esta e a tecnica de eleigao para analise de compostos fenόlicos, sensfvel e rapida, que evita que os
compostos polares fiquem retidos na coluna e permite o registo do espectro de UV- visfvel de todos os compostos [31].
[33] O extracto aquoso da larva de P. brassicae apresenta os compostos fenόlicos que constam da Tabela 1, e cujas estruturas sao as seguintes,
Derivados da quercetina (I)
Derivados do campfe rol (I D
[34] Em que para os derivados da quercetina (compostos de formula geral I):
Ri e soforόsido e R 2 e glucόsido; ou
Ri e (feruloil)triglucόsido e R 2 e glucόsido; ou
Ri e (p-cumaroil)soforόsido e R 2 e H; ou
Ri e soforόsido e R 2 e H; ou
Ri e (feruloil)triglucόsido e R 2 e H.
[35] E em que para os derivados do campferol (compostos de formula geral II):
R 1 e soforόsido e R 2 e glucόsido; ou
Ri e soforόsido e R 2 e soforόsido; ou
Ri e (sinapoil)triglucόsido e R 2 e glucόsido; ou
Ri e (feruloil)triglucόsido e R 2 e glucόsido; ou
Ri e (p-cumaroil)triglucόsido e R 2 e glucόsido; ou
Ri e (metoxicafeoil)soforόsido e R 2 e glucόsido; ou
Ri e (cafeoil)soforόsido e R 2 e glucόsido; ou
Ri e (p-cumaroil)triglucόsido e R 2 e H; ou
R 1 e (p-cumaroil)soforόsido e R 2 e H; ou R 1 e (metoxicafeoil)soforόsido e R 2 e H; ou Ri e soforόsido e R 2 e H; ou R 1 e (di-sinapoil)triglucόsido e R 2 e glucόsido; ou R 1 e (feruloil/sinapoil)triglucόsido e R 2 e glucόsido; ou R 1 e glucόsido e R 2 e H. [36] Tabela 1. Compostos fenόlicos no extracto aquoso da larva de P. brassicae
[Table 1] [Table ]
[37] O extracto aquoso da couve tronchuda apresenta os conipostos fenόlicos que constam da Tabela 2. [38] Tabela 2. Compostos fenόlicos no extracto aquoso de couve tronchuda [Table 2] [Table ]
[39] Assim, verifica-se que o campferol 3-O-soforόsido-7-O-glucόsido, o campferol 3-0 ■ soforόsido-7-<9-soforόsido e o campferol 3-6>-soforόsido sao os ύnicos compostos commas aos dois extractos. Apesar do padrao de glicosilacao ser o mesmo, a quantidade relativa de compostos com glicosilacao apenas na posicao 3 e maior no extracto da larva do que no da planta hospedeira, indicando que ha metabolizacao dos compostos da couve glicosilados nas posiςδes 3 e 7.
[40] 3. Avaliagao da actividade antioxidante
Para esta invengao recorreu-se a tecnicas que ja anteriormente tinham sido usadas para avaliagao da capacidade antioxidante da couve tronchuda [27, 28, 29]. De um modo geral, a actividade antioxidante do extracto da larva revelou-se superior a do extracto da planta hospedeira, apresentando ainda capacidade para inibir a XO, que a planta nao possui. A composicao dos dois extractos tem grande influencia nas re- spectivas propriedades antioxidantes: o diferente perfil fenόlico dos extractos faz com que apresentem comportamentos distintos, conforme descrito de seguida.
[41] Para o desenvolvimento desta invengao recorreu-se ao radical DPPH, um radical livre estavel capaz de aceitar um electrao ou atomo de hidrogenio, tornando-se num nao radical, dificilmente oxidavel. Devido ao electrao desemparelhado, o DPPH apresenta uma forte absorvencia a 515 nm, que desaparece se o electrao emparelhar. Este ensaio fornece informagao basica acerca da actividade anti-radicalar dos extractos [32].
[42] Foi realizado um microensaio no qual foi monitorizada a diminuigao de absorvencia registada a 515 nm que ocorre por redugao do radical pelo antioxidante. A juncao do extracto aquoso da larva de P. brassicae ao radical DPPH levou a um forte decrescimo da absorvencia, de modo dependente da concentragao (IC 50 = 97,2 μg/ml), superior ao observado com a couve tronchuda (IC 50 = 678 μg/ml) (Fig. 1).
[43] Nesta invengao recorreu-se tambem ao radical superόxido (O 2 " ), um radical que e formado in vivo por fagόcitos activados, por redugao do oxigenio em resultado da fuga de electrδes da cadeia respiratόria, ou por acgao da XO na conversao da hipoxantina em xantina e da xantina em acido ύrico [I].
[44] Foi realizado um microensaio no qual o radical superόxido foi gerado na reacgao de oxidacao da xantina a acido ύrico, catalisada pela XO. O radical superόxido reduziu o azul de nitrotetrazόlio (NBT) a formazano. A adigao do extracto aquoso da larva de P. brassicae diminuiu a velocidade de redugao do NBT, de modo dependente da concentragao (IC 25 = 251 μg/ml) (Fig. 2), tal como a planta hospedeira (IC 25 = 186 μg/ ml) (Fig. 3).
[45] Subsequentemente, foi testado o efeito sobre a XO, uma vez que uma diminuigao na velocidade de redugao do NBT neste metodo pode ser atribuida nao so a capacidade para interceptar o radical superόxido, mas tambem a menor formagao deste radical por inibigao da enzima [33]. Procedeu-se a monitorizagao espectrofotometrica da conversao da xantina em acido ύrico, que apresenta um maximo de absorgao a 295 nm, tendo-se verificado que o extracto aquoso da larva de P. brassicae tem capacidade para inibir a enzima de modo dependente da concentragao (IC 25 = 358 μg/ml) (Fig. 2), enquanto que a planta hospedeira nao tem efeito sobre a enzima (Fig. 3). Como referido acima, estes resultados podem ser relevantes em caso de prevengao da gota, na
qual estao envolvidas concentracδes elevadas de acido ύrico na corrente sanguήiea [30].
[46] Para esclarecer o comportamento dos extractos relativamente ao radical superόxido, o microensaio de redugao do NBT foi tambem efectuado usando o sistema qufmico NADH/metossulfato de fenazina para gerar este radical. A capacidade do extracto aquoso da larva de P. brassicae para interceptar o radical de modo dependente da concentracao (IC 2 s = 7,4 μg/ml) (Fig. 2) revelou-se muito superior a da couve tronchuda (IC 25 = 59 μg/ml) (Fig. 3).
[47] Assim, foi verificado que o extracto aquoso da larva de P. brassicae alimentada com couve tronchuda tern acgao protectora contra o radical superόxido devido a sua capacidade para interceptar este radical e tambem para impedir a sua formacao por inibicao da XO.
[48] Para o desenvolvimento da presente invengao recorreu-se, ainda, ao radical hidroxilo, considerada a especie mais reactiva em quimica e biologia devido ao seu poder oxidante elevado e rapidez em combinar com praticamente qualquer molecula presente nas celulas. A sua formacao requer a presenga de metais de transigao, sendo o ferro e o cobre os mais importantes, in vivo. A reaccao entre o acido hipocloroso e o radical superόxido, a protonacao e decomposicao do peroxinitrito e a exposicao da agua a radiacao ionizante estao tambem na origem deste radical [1, 33].
[49] Foi realizado um ensaio no qual o radical hidroxilo foi gerado por um sistema de
Fenton constituido por perόxido de hidrogenio, Fe 3+ -EDTA e acido ascόrbico. O radical hidroxilo degradou a desoxirribose, formando-se malonildialdeϊdo. A reaccao posterior deste composto com o acido tiobarbitύrico resultou num cromόforo de cor rosa [34]. A adicao do extracto aquoso da larva de P. brassicae diminuiu a formacao de substantias reactivas ao acido tiobarbitύrico, de modo dependente da concentracao (IC 25 = 6,1 μg/ml) (Fig. 4), sendo este efeito ligeiramente superior ao verificado com a planta hospedeira (IC 25 = 9,2 μg/ml) (Fig. 5).
[50] Posteriormente, para estudar o potencial prό-oxidante dos extractos, o ensaio foi repetido usando o mesmo sistema, mas privado de acido ascόrbico [35]. O extracto aquoso da larva de P. brassicae revelou alguma capacidade para reduzir o iao ferrico apenas para concentracδes superiores a 7,8 μg/ml (Fig. 4), enquanto que a planta hospedeira aumentou a producao de radical hidroxilo para todas as concentracδes testadas (Fig.6).
[51] Foi, ainda, avaliada a capacidade dos extractos para quelatar iδes metalicos, recorrendo-se ao mesmo sistema mas na ausencia de EDTA [34, 36]. Nem o extracto aquoso da larva de P. brassicae (Fig. 4), nem o da planta hospedeira (Fig. 5) impediram a degradacao da desoxirribose por complexacao do ferro.
[52] Consequentemente, foi possϊvel demonstrar a capacidade antioxidante do extracto
aquoso da larva de P. brassicae contra especies reactivas de oxigenio biologicamente importantes, bem como o seu efeito inibidor da xantina oxidase, constituindo esta invengao um passo importante para a aplicacao deste extracto como antioxidante e na prevencao da gota.
[53] A presente invencao pode ser aplicada na obtencao de extractos aquosos padronizados, contendo compostos raros na natureza e de sϊntese laboratorial difϊcil e dispendiosa devido a sua estxutura quimica complexa, para serem utilizados como an- tioxidantes pelas indύstrias alimentar, farmaceutica, cosmetica e dos plasticos. O facto de as larvas de P. brassicae terem utilidade constitui, tambem, uma vantagem econόmica para os produtores de couve tronchuda que sofrem perdas avultadas com esta praga. Descriςao Detalhada da Invenςao
[54] 1. Obtencao dos extractos
1.1. Larva de P. brassicae e couve tronchuda (planta hospedeira) Foram utilizadas larvas selvagens de P. brassicae, no quarto instar, e folhas de couve tronchuda, com 45 dias, nas quais as larvas se desenvolveram. Todo o material foi colhido num campo em Samil, Braganca, Nordeste de Portugal e imediatamente transportado para o laboratόrio. As folhas de couve tronchuda foram congeladas a -20 0C. As larvas foram privadas de alimento durante 1 hora e depois congeladas a -20 0 C. Folhas e larvas foram posteriormente liofilizadas.
[55] 1.2. Preparacao dos extractos aquosos
O extracto aquoso de larva de P. brassicae foi preparado do modo seguinte: 0,4 g de larvas liofilizadas e pulverizadas foram extraidos com 400 ml de agua, a ebulicao, durante 30 minutos. Na preparacao do extracto de couve tronchuda usaram-se 2 g de folhas liofilizadas e pulverizadas, que foram extraidos durante 30 minutos com 400 ml de agua, a ebulicao. Os extractos obtidos foram filtrados por funil de Bϋchner, congelados a - 20 0 C e depois liofilizados.
[56] 2. Caracterizacao dos compostos fenόlicos presentes nos extractos
A determinagao dos compostos fenόlicos presentes nos extractos aquosos de larva de P. brassicae e de folhas de couve tronchuda foi feita de acordo com o procedimento de Ferreres e colaboradores [13], conforme se descreve a seguir.
[57] 20 μL de cada extracto liofilizado e redissolvido em agua foram analisados num sistema para cromatografia de alta pressao Gilson, usando uma coluna Spherisorb ODS2 (Waters, 25,0 x 0,46 cm; 5 μm de tamanho de particula). A eluigao foi efectuada a um fluxo de 1 ml/minuto, com um sistema eluente composto por uma mistura de acido fόrmico a 5% em agua (A) e metanol (B), em gradiente: 0 minutos - 10% B, 25 minutos - 20% B, 40 minutos - 50% B, 45 minutos - 50% B, 46 minutos - 90% B, 50 minutos - 90% B, 55 minutos - 100% B, 58 minutos - 100% B e 60 minutos - 10% B.
A deteccao foi feita por um detector de diodos Gilson, com registo dos cromatogramas a 330 nin. Os dados espectrais de todos os conipostos foram registados no intervalo de 200 a 400 nm. Os dados foram processados utilizando o Unipoint System Software (Glison Medical Electronics). Para a quantificacao dos diversos compostos recorreu-se a um padrao externo, utilizando a area do pico correspondente no cromatograma. Todos os compostos foram quantificados como campferol 3-0-rutmόsido.
[58] 3. Avaliacao da actividade antioxidante dos extractos
3.1. Substantias e reagentes utilizados
O radical 2,2-difenil-l-picril-hidrazilo (DPPH), xantina (2,6-di-hidroxipurina), xantina oxidase (XO) (EC 1.1.3.22), forma reduzida da beta-nicotinamida adenina dinucleόtido (NADH), metossulfato de fenazina (PMS, Ci 4 Hi 4 N 2 O 4 S), cloreto de azul de nitrotetrazόlio (NBT, C 4O H 3O Cl 2 NiOO 6 ), sal dissόdico do acido etilenodiaminatetracetico (EDTA), acido 2-tiobarbitύrico (C 4 H 4 N 2 O 2 S) e a 2-desoxi-D-ribose foram adquiridos a Sigma (St. Louis, Mo., USA).
[59] O hidrόxido de sόdio (NaOH), hidrόxido de potassio (KOH), di-hidrogenofosfato de potassio (KH 2 PO 4 ), hidrogenofosfato dissόdico di-hidratado (Na 2 HPO 4 .2H 2 O), acido L-(+)-ascόrbico, perόxido de hidrogenio (H 2 O 2 ) a 30%, e o acido tricloroacetico (CCl 3 COOH) foram obtidos da Merck (Darmstadt, Alemanha) e a solucao de cloreto ferrico (FeCl 3 ) a 45% da Riedel-de Haen (Seelze, Alemanha).
[60] Todos os reagentes tinham grau de pureza 'Pro analysi'. A agua foi tratada num sistema de purificacao de agua Milli-Q (Milipore, Bedford, MA).
[61] 3.2. Avaliacao da actividade face ao DPPH
A actividade face ao DPPH foi avaliada num microensaio, usando um leitor de placas Multiskan Ascent (Thermo Labsystems), de acordo com o procedimento de Silva e co- laboradores [37], conforme se descreve a seguir:
(i) Para o extracto de larva de P. brassicae foi preparada uma serie de diluicδes cor- respondentes a 0,08; 0,16; 0,31; 0,62 e 1,25 mg/ml. Para o extracto de couve tronchuda foi preparada uma serie de diluicδes correspondentes a 0,62; 1,25; 2,5; 5 e 10 mg/ml. Em todos os ensaios foi realizado um controlo;
(ii) As diluicδes dos extractos e o controlo preparados foram colocados, em triplicado, em placas de 96 pocos para leitura no leitor de placas. A mistura reactiva em cada poco era composta por 25 μL de solucao de extracto liofilizado, dissolvido em agua, ou apenas agua no caso do controlo, e 200 μL de DPPH 150 μM dissolvido em metanol. Os ensaios sao conduzidos a temperatura ambiente, com registo da absorvencia a 515 nm, 30 minutos apόs a adicao da solucao de DPPH. Para cada caso realizaram-se tres ensaios.
[62] Os resultados foram expressos em percentagem de intercepcao do DPPH rela- tivamente ao controlo (Fig.l).
[63] 3.3. Avaliacao da actividade face ao radical superόxido
O radical superόxido reage com o NBT, reduzindo-o a formazano, um composto azul que apresenta um maximo de absorgao a 560 nm. Qualquer molecula capaz de se- questrar este radical conduzira a uma diminuiςao na velocidade de reduςao do NBT [33]. A actividade anti-radicalar foi determinada espectrofotometricamente num leitor de placas Multiskan Ascent (Thermo Labsystems) programado na funcao cinetica, monitorizando o efeito de cada extracto na reducao do NBT induzida pelo radical superόxido, a 562 nm. [64] 3.3.1. Mέtodo nao-enzimάtico (NADH/PMS)
Neste metodo a PMS reduzida pelo NADH reage com o oxigenio produzindo radical superόxido. A capacidade dos extractos para sequestrar este radical foi avaliada de acordo com o metodo de Valentao e colaboradores [38], conforme se descreve a seguir.
(i) Para o extracto de larva de P. brassicae foi preparada uma serie de diluicδes cor- respondentes a 8; 16; 31; 62 e 125 μg/ml. Para o extracto de couve tronchuda foi preparada uma serie de diluicδes correspondentes a 0,31; 0,62; 1,25; 2,5 e 5 mg/ml. Em todos os ensaios foi realizado um controlo;
(ii) Todos os componentes do sistema (extractos liofilizados, NADH, NBT e PMS) foram dissolvidos em tampao de fosfatos (KH 2 PO 4 19 mM, pH 7,4);
(iii) As diluicδes dos extractos e o controlo foram colocados, em triplicado, em placas de 96 pogos para leitura no leitor de placas. Em cada poco adicionou-se, num volume final de 300 μL, 50 μL de solucao de extracto liofilizado, dissolvido em tampao de fosfatos, ou apenas tampao de fosfatos no caso do controlo, solucao de NADH 166 μM, solucao de NBT 43 mM e soluςao de PMS 2,7 μM. Os ensaios foram conduzidos a temperatura ambiente, durante 2 min, sendo iniciados com a adicao da solucao de PMS. Para cada caso realizaram-se tres ensaios. [65] Os resultados foram expresses em percentagem de inibigao da reducao do NBT rela- tivamente ao controlo (Fig. 2 e 3). [66] 3.3.2. Metodo enzimάtico (XJXO)
Neste metodo a xantina oxidase catalisa a oxidacao da xantina a acido ύrico, com formacao de radical superόxido. A capacidade dos extractos para sequestrar este radical foi avaliada de acordo com o metodo de Valentao e colaboradores [38], conforme se descreve a seguir:
(i) Para o extracto de larva de P. brassicae foi preparada uma serie de diluicδes correspondentes a 0,62; 1,25; 2,5; 5 e 10 mg/ml. Para o extracto de couve tronchuda foi preparada uma serie de diluigδes correspondentes a 0,31; 0,62; 1,25; 2,5 e 5 mg/ml. Em todos os ensaios foi realizado um controlo;
(ii) A xantina (0,55 mg) foi dissolvida em hidrόxido de sόdio 1 μM, a xantina
oxidase (60 μL) em EDTA 0,1 mM e os restantes componentes da mistura (extractos liofilizados e NBT) em tampao de fosfatos (Na 2 HPO 4 .2H 2 O 50 mM com EDTA 0,1 mM, pH 7,8);
(iii) As diluicoes dos extractos e o controlo foram colocados, em triplicado, em placas de 96 pocos para leitura no leitor de placas. Em cada poco adicionou-se, num volume final de 300 μl, 50 μl de solucao de extracto liofilizado, dissolvido em tampao de fosfatos, ou apenas tampao de fosfatos no caso do controlo, solucao de xantina 44 μM, solucao de xantina oxidase 0,29 U/ml e solucao de NBT 50 μM. Os ensaios foram conduzidos a temperatura ambiente, durante 2 min, sendo iniciados com a adigao da solucao de xantina oxidase. Para cada caso realizaram-se tres ensaios. [67] Os resultados foram expressos em percentagem de inibigao da reducao do NBT rela- tivamente ao controlo (Fig. 2 e 3). [68] 3.4. Efeito dos extractos sobre a xantina oxidase
Atendendo a que uma diminuicao na velocidade de reducao do NBT, observada quando se aplica o metodo enzimatico, pode ser atribuida nao so a capacidade de se- questrar o radical superόxido, mas tambem a inibicao da xantina oxidase [33], o efeito provocado pelos extractos na actividade da enzima foi avaliado. Para isso procedeu-se a monitorizacao espectrofotometrica da conversao da xantina em acido ύrico, que apresenta um maximo de absorcao a 295 nm. As determinacδes foram realizadas em triplicado, num espectrofotόmetro de feixe duplo (Helios alfa, Unicam) programado na fungao cinetica, para absorcao a 295 nm, de acordo com o metodo de Valentao e colab- oradores [32], conforme se descreve a seguir:
(i) Para o extracto de larva de P. brassicae foi preparada uma serie de diluicoes cor- respondentes a 0,62; 1,25; 2,5; 5 e 10 mg/ml. Para o extracto de couve tronchuda foi preparada uma serie de diluicoes correspondentes a 0,31; 0,62; 1,25; 2,5 e 5 mg/ml. Em todos os ensaios foi realizado um controlo;
(ii) A xantina (0,55 mg) foi dissolvida em hidrόxido de sόdio 1 μM, a xantina oxidase (60 μL) em EDTA 0,1 mM e os extractos liofilizados em tampao de fosfatos (Na 2 HPO 4 .2H 2 O 50 mM com EDTA 0,1 mM, pH 7,8);
(iii) A mistura reactiva continha, num volume final de 600 μl, 100 μl de solucao de extracto liofilizado, dissolvido em tampao de fosfatos, ou apenas tampao de fosfatos no caso do controlo, solucao de xantina 44 μM e solucao de xantina oxidase 0,29 U/ml. Os ensaios foram conduzidos a temperatura ambiente, durante 2 min, sendo iniciados com a adicao da solucao de xantina oxidase. Para cada caso realizaram-se tres ensaios. [69] Os resultados foram expressos em percentagem de inibigao da actividade da xantina oxidase relativamente ao controlo (Fig. 2 e 3). [70] 3.5. Avaliagao da actividade face ao radical hidroxilo
O radical hidroxilo e gerado em misturas constituidas por perόxido de hidrogenio e
Fe 3+ -EDTA, sendo a reacgao acelerada pela presenca de agentes redutores como o acido ascόrbico (sistema de Fenton) [33, 39]. Foi usado o metodo da desoxirribose, no qual o radical hidroxilo produzido pelo sistema de Fenton degrada o acύcar, com formacao de malonildialdeido por aquecimento em meio acido. Este composto e detectado pela reaccao com o acido tiobarbitύrico, na qual origina um cromόforo de cor rosa com um maximo de absorcao a 532 nm [34]. A actividade dos extractos face ao radical hidroxilo foi avaliada de acordo com o procedimento de Valentao e colab- oradores [40], conforme se descreve a seguir:
(i) As determinacόes foram realizadas em triplicado, num espectrofotόmetro de feixe duplo (Helios alfa , Unicam) programado na funcao fotometrica, para absorgao a 532 nm;
(ii) Para o extracto de larva de P. brassicae e para o extracto de couve tronchuda foram preparadas series de diluicoes correspondentes a 0,02; 0,08; 0,31; 1,25 e 5 mg/ml. Em todos os ensaios foi realizado um controlo;
(iii) Os extractos liofilizados, o acido ascόrbico, o H 2 O 2 e a desoxirribose foram dis- solvidos em tampao de fosfatos (KH 2 PO 4 -KOH 10 mM, pH 7,4) e o FeC13 em solucao aquosa de EDTA;
(iv) A mistura reactiva continha, num volume final de 1 ml, 100 μl de solucao de extracto liofilizado, dissolvido em tampao de fosfatos, ou apenas tampao de fosfatos no caso do controlo, 100 μl de solucao de acido ascόrbico (concentracao final 50 μM), 50 μl de solucao de FeCl 3 (concentracao final 20 μM, em solucao de EDTA 2 mM), 50 μl de H 2 O 2 (concentracao final 1,42 mM) e 100 μl de solucao de desoxirribose (concentracao final 2,8 mM). Esta mistura foi incubada a 37 0 C durante 1 hora. Apόs esse perϊodo, adicionou-se 1 ml de acido tricloroacetico a 2,8% e 1 ml de solucao de acido tiobarbitύrico a 1% (m/v) (solucao extemporanea). A solucao resultante foi aquecida durante 15 minutos em banho de agua a 100 0 C. Depois de arrefecida ate a temperatura ambiente leu-se a sua absorvέncia a 532 nm. Para cada caso realizaram-se tres ensaios.
[71] Os resultados foram expresses em percentagem de intercepςao do radical hidroxilo relativamente ao controlo (Fig. 4 e 5).
[72] Qualquer substantia que apresente capacidade para reduzir o iao metalico, necessario a producao de radical hidroxilo, pode actuar como prό-oxidante aumentando a sua formacao [35]. Para avaliar o potencial prό-oxidante dos extractos, o mesmo ensaio acima descrito foi efectuado sem adicao da solucao de acido ascόrbico. Os resultados foram expressos em percentagem de intercepcao do radical hidroxilo relativamente ao controlo (Fig. 4 e 6).
[73] A degradagao da desoxirribose ocorre igualmente se no sistema de Fenton se omitir o
EDTA. Compostos com capacidade para complexar ferro retiram o metal e tornam-no
inactivo ou com pouca actividade na reaccao de Fenton, impedindo, assim, a degradacao da desoxirribose [36]. Para avaliar a capacidade dos extractos para quelatar metais foi executado o mesmo sistema, mas privado de EDTA. Os resultados foram expressos em percentagem de intercepcao do radical hidroxilo relativamente ao controlo (Fig. 4 e 5).
[74] Os resultados obtidos e apresentados nas Fig. 1 a 6 demonstram a importancia da invencao descrita para o extracto aquoso da larva de Pieris brassicae alimentada com couve tronchuda, rico em compostos de estrutura complexa e sintese laboratorial diffcil, dotado de actividade antioxidante e de inibiρao da XO, confirmadas pelos parametros avaliados.
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