EXTRACTO ACUOSO DE TOMASA CON ACTIVIDADES ANTI AG REGANTE PLAQUETARIA Y ANTITROM BOTICA, Y PROCEDIMIENTO DE OBTENCIÓN DEL

MISMO

MEMORIA DESCRIPTIVA

La presente invención se refiere a un extracto acuoso con propiedades antiplaquetarias y antitrombóticas obtenido a partir de un residuo de la industria procesadora de tomate (tomasa), el que se produce en gran cantidad y que tiene escaso valor comercial, y a un aditivo de alimentos que contiene dicho extracto acuoso utilizado en la generación de alimentos de consumo masivo en la población, como por ejemplo en matrices de harina, yogurt, y jugo, para generar múltiples derivados de los mismos tales como panes, galletas, snacks, pastas, jugos y yogurt, entre otros.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

En la actualidad la nutrición está experimentando un cambio en ciertas áreas de interés. Así, aunque las carencias nutricionales constituyen una prioridad en el área de salud el centro de interés actual también se ubica en la relación entre la alimentación y la prevención de enfermedades crónicas no transmisibles.

Los consumidores son, cada vez, más conscientes de su alimentación y buscan en el mercado aquellos productos que contribuyan a su salud y bienestar. En especial de aquellos alimentos que ejercen una acción beneficiosa sobre algunos procesos fisiológicos y/o reducen el riesgo de padecer una enfermedad.

Desde hace una par de décadas, las Enfermedades Cardiovasculares (ECV), entre las que se encuentran infarto agudo al miocardio, enfermedad cerebrovascular y trombosis arterial periférica, son la primera causa de muerte en todo el mundo, representando el 30 por ciento, según cifras del año 2009 de la Organización Mundial de la Salud (OMS).

Chile no está ajeno a esta realidad, ya que estas enfermedades causan el 27% de las muertes en el país, según cifras del INE 2012.

En ese contexto, se ha identificado a la dieta (en conjunto con el ejercicio y el dejar de fumar) como la principal forma de disminuir las muertes por ECV, siendo una dieta rica en frutas y hortalizas un factor importante. En ese sentido el tomate ha sido una de las hortalizas de mayor poder para contribuir a la disminución de este tipo de enfermedades.

Durante los últimos diez años se han estudiado las ECV en la población chilena (Programa de Investigación en Factores de Riesgo Cardiovascular, http://pifrecv.utalca.cl). En ese contexto, se han iniciado investigaciones sobre las actividades biológicas de frutas y hortalizas, por ejemplo, la determinación de la actividad antitrombótica de extractos de frutas y vegetales ampliamente consumidos en la zona central de Chile (Torres-Urrutia et al. Blood Coagul Fibrinolysis. 2011 Apr: 22(3): 197-205), especialmente en la prevención primaria de ECV. Así, se han estudiado efectos saludables del tomate (Solanum lycopersicum) adicionales a su conocida actividad antioxidante (Palomo et al. Rev. Chil. Nutr. Junio 2009: 36 (2): 152- 158), tanto en fruto fresco como en producto de proceso (Bustamante et al. Rev. Med. Maule 2012: 28 (1): 8-11).]

Se conoce que el tomate contiene compuestos que inhiben la agregación plaquetaria inducida por trombina además de la ya conocida adenosina (Dutta-Roy et al. Platelets. 2001 Jun;12(4):218-227). Se ha detectado mediante estudios in vitro e in vivo que el extracto del tomate tiene efectos antitrombóticos naturales (Yamamoto J. et al. Br J Nutr. 2003; 90: 031-1038). En particular se divulga un potencial mecanismo de cómo el extracto acuoso de tomate inhibe la agregación de plaquetas (Lazarus S, Garg M. Int J Food Sci Nutr. 2004:55:249-256). Análisis de fracciones de extracto de tomate permitió aislar compuestos responsables de la inhibición de agregación plaquetaria (O'Kennedy N, et al. Am J Clin Nutr. 2006; 84:570-579). Un estudio adicional muestra el efecto de la administración de extracto de tomate como suplemento dietético para uso en la prevención de ECV (O'Kennedy N, et al. Am J Clin Nutr. 2006; 84:561-569).

El artículo de Palomo I. et al. (Rev Chil Nutr. 2010; 37: 524-533) muestra que el consumo regular de tomates presenta efectos antioxidantes, hipolipemiante y antiagregante plaquetario. Adicionalmente, demostró que el procesamiento del tomate no deteriora mayormente su actividad biológica y mejora la biodisponibilidad de licopeno. Además, señala que los efectos sobre la actividad antilipemiante y efecto antiplaquetario del tomate no han sido bien estudiados. Se han realizado estudios para evaluar la actividad antitrombótica de extractos de frutas y vegetales ampliamente consumidos en Chile, entre los cuales destacó el extracto de tomate como uno de los que presentaba una mayor inhibición de la agregación plaquetaria inducida por ADP y ácido araquidónico (Torres-Urrutia C, et a/. Blood Coagul Fibrinolysis. 2011 ; 22:197- 205).

Estudios posteriores han evaluado y caracterizado la actividad del tomate como antiagregante plaquetario utilizando extracto acuoso y metabólico de tomate. Adicionalmente se aislaron los principios antiagregantes de distintas fracciones detectándose que no contenían licopeno pero si nucléosidos (Fuentes EJ, et al. Blood Coagul Fibrinolysis 2012; 23:109-117; Fuentes E, Castro I, Astudillo L, Gutiérrez M, Palomo I. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, 2012:1-10).

En la solicitud de patente internacional WO 99/55350 A1 (Antithrombotic Agents, 998, Dutta-Ray) se divulga el empleo de un extracto de fruta o su fracción activa como método de profilaxis o tratamiento de un estado de enfermedad iniciada por agregación plaquetaria. El extracto de la fruta o fracción activa, se obtuvo de frutas peladas sin semillas de las plantas de las familias Solanaceae, Rutaceae, Cucurbitaceae, Rosaceae, musáceas, Anacardiaceae, Bromeliaceae, Vitaceae, Arecaceae, Ericaceae y Lauraceae. Los componentes activos del extracto de tomate fueron analizados por espectrometría de masas y resonancia magnética nuclear, y se concluyó que corresponde a una mezcla de nucléosidos.

Por otro lado, la solicitud US 2009/0123584 A1 (Therapeutic Uses Of Tomate Extracts, 2009, Niamh O'Kennedy) se refiere a una fracción activa de tomate para la fabricación de un medicamento que permita la prevención o inhibición de trombosis venosa y la formación de coágulo de fibrina, donde el extracto puede ser aplicado en pacientes que estén en mayor riesgo de sufrir trombosis venosa en virtud de pertenecer a una o más (en cualquier combinación) de las siguientes situaciones de riesgo: obesos, fracturas, uso de anticonceptivos orales, terapia de reemplazo hormonal, embarazadas, cáncer, quimioterapia, síndrome antifosfolipído y trombofilia hereditaria.

La oficina europea de patentes otorgó en 2009 a LycoRed Ltd. la patente EP 1423020 B1 por el Proceso de Extracción de Carotenoides (Carotenoid Extraction Process), 2009, LycoRed Ltd.). Esta patente divulga una composición de licopeno de tomate y otros fito nutrientes, incluyendo fitoeno, fitoflueno, tocoferoles, fitosteroles y beta- caroteno, a diferencia de otros productos de licopeno disponibles actualmente en el mercado. Los estudios clínicos demuestran que una mayor ingesta de licopeno de los tomates se asocia con un riesgo menor de ECV, y también puede ofrecer beneficios adicionales para el manejo de la presión arterial.

En Chile, la región del Maule concentra cerca del 66 por ciento de la producción de tomate industrial. La producción por temporada de tomate procesado en la región es cercana a las 600 mil toneladas. Esta producción genera un residuo conocido como tomasa, que corresponde a la piel y semilla del tomate luego del procesamiento del tomate para la obtención de su pasta. Son cerca de 18 mil toneladas de tomasa que se generan en cada temporada bn la región y hoy en día su utilidad se reduce solo a ser vendida a muy bajo precio o regalada para consumo animal. Este residuo, en general es utilizado como suplemento nutricional para animales. Adicionalmente, el residuo no consumido por los animales, causa contaminación del terreno agrícola.

En vista del problema de contaminación producido por la industria del tomate, se presenta la oportunidad de utilizar la tomasa para la obtención de un producto funcional con propiedades antitrombóticas que podría ser útil como aditivo en alimentos saludables y con ello prevenir las ECV.

En el desarrollo de la presente invención se obtiene un extracto acuoso de tomasa, que es un subproducto del procesamiento agroindustrial del tomate, que posee propiedades antitrombóticas y antiagregante plaquetario, que tiene un gran efecto en la prevención de ECV. Aún más, del análisis del extracto acuoso, obtenido de tomasa, se logra determinar que el mismo posee un poder antitrombótico mucho más efectivo que el mismo tomate, lo que representa un resultado inesperado de la presente invención.

En la presente invención, el residuo del procesamiento industrial del tomate (tomasa), que causa contaminación del terreno agrícola, se somete a tratamiento de modo de obtener un extracto acuoso o un extracto en polvo que posee propiedades antiplaquetarias y antitrombóticas, y que es útil como aditivo de alimentos.

El extracto de tomasa obtenido contribuye a disminuir los factores de riesgo cardiovasculares y además, permite entregar valor agregado a la tomasa. DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

La Figura 1 muestra el efecto inhibitorio de la agregación plaquetaria de extracto acuoso de tomasa ¡n vitro, al usar ADP 8 μΜ como agonista. Se observa diferencias en la pendiente, área bajo la curva y en la agregación máxima (n = 3 experimentos).

La Figura 2 muestra el efecto de extracto acuoso de tomasa sobre la formación de trombosis arterial in vivo, donde Occ es el porcentaje de oclusión.

La Figura 3 muestra un diagrama de flujo del proceso de obtención de extracto acuoso de tomasa, así como la posterior liofilización para obtener el producto de tomasa en polvo.

DESCRIPCION DE LA INVENCIÓN

Existe una gran cantidad de residuo agroindustrial proveniente del procesamiento del tomate, denominado tomasa, al mismo tiempo se han identificado compuestos presentes en el tomate con acción anticoagulante y antitrombótica.

De acuerdo a lo anterior, la presente invención se refiere a un extracto de tomasa con propiedades antiplaquetarias y antitrombóticas útil como aditivo de alimentos, tal como un aditivo bioactivo (sin imporjtar la estructura de los compuestos presentes) a partir del residuo agroindustrial tomasa con actividades antiagregante plaquetaria y antitrombótica. Procedimiento de obtención de extracto acuoso

El procedimiento para la obtención de un extracto a partir de residuo agroindustrial de tomate o tomasa, comprende las etapas de:

i) Moler o triturar los sólidos;

ii) solubilizar los sólidos de la etapa ii) utilizando un solvente;

iii) extraer los compuestos de interés de la solución de la etapa iii) por ultrasonido; iv) filtrar la suspensión para separar los sólidos del extracto acuoso de tomasa.

Descripción detallada de la invención

La materia prima utilizada fue obtenida a partir de residuos de la industria procesadora del tomate (tomasa) de la empresa Sugal Chile (plantas Talca y Quinta de Tilcoco). La tomasa, que corresponde principalmente a cáscaras y semillas del tomate, se puede someter a un proceso de secado, por ejemplo, en una estufa por dos días a 60°C, con la finalidad de eliminar el contenido de agua presente en la mezcla. El producto, correspondiente a sólidos de irregular tamaño, se somete a un proceso de molienda o trituración con el fin de generar un polvo grueso de tomasa reduciendo de este modo el tamaño de partícula y aumentando así el área de exposición al solvente a utilizar en la siguiente etapa, facilitando de esta manera el proceso de extracción. A continuación, los sólidos triturados son disueltos en un solvente (por ejemplo, agua destilada o agua potable) para formar una suspensión, con la finalidad que los compuestos presentes en dichos sólidos triturados (tomasa secada y molida) y que son solubles en dicho solvente se disuelvan y puedan ser extraídos en forma de solución acuosa. La mezcla anterior correspondiente a sólidos en suspensión es sometida a una etapa de extracción de los compuestos de interés mediante ultrasonido, para romper las paredes de las células vegetales y así liberar a los compuestos solubles presentes en el interior de dichas células en el solvente de elección. A continuación, dicha suspensión es sometida a un proceso de filtrado, para separar los sólidos del líquido utilizando por ejemplo, membranas o gasa. El líquido obtenido a partir de este proceso corresponde al extracto acuoso de tomasa, el cual, de manera opcional, puede ser sometido a un proceso de secado para la obtención de extracto acuoso seco de tomasa. El proceso de secado se puede llevar a cabo, por ejemplo, mediante un proceso de liofilización con la finalidad de almacenarlo hasta su posterior uso en alimentos funcionales (ver diagrama de flujo del proceso en la Figura 3).

En una realización de la invención, la tomasa se somete directamente a molienda o trituración, en vista que el proceso de secado no es esencial para la obtención del extracto acuoso de la invención. Sin embargo, una tomasa seca favorece la molienda y, por consiguiente, el proceso de extracción y el rendimiento del extracto obtenido. A continuación se solubilizan los sólidos provenientes de la molienda de la tomasa mediante el uso de un solvente y se extraen los compuestos de interés de la solución mediante ultrasonido para finalmente filtrar la suspensión y separar los sólidos del extracto acuoso de tomasa.

En otra realización de la invención, el extracto acuoso de tomasa obtenido después de la etapa de filtración es sometido a un proceso de liofilización para generar un extracto acuoso seco de tomasa. Dicho proceso es el que provoca menos modificaciones en el producto y menos pérdidas de los componentes. Se detectó que la actividad se mantuvo igual a la observada en el extracto acuoso generado antes de la etapa de liofilización.

Ejemplo 1 :

Tomasa fue secada en un horno a 60 °C durante dos días, y posteriormente triturada y disuelta en una proporción de 1 g de tomasa por 1 mi de agua destilada. La suspensión se sometió a ultrasonido durante 5 min y después se filtró dos veces a través de gasa. El extracto acuoso obtenido se liofilizó para generar extracto acuoso seco de tomasa y se almacenó a -80 °C hasta su uso.

Basado en el Codex Alimentarius, los productos derivados del tomate pueden estar contaminados con productos químicos como insecticidas, herbicida, etc., dado que la piel del tomate está directamente expuesta a estas sustancias químicas. A pesar de lo anterior, el análisis de multi residuos F-H arrojó la presencia de tres compuestos: difenoconazol, pirimetanil y lambda cihalotrina, los cuales se encontraban en concentraciones dentro de los niveles permitidos, esto es bajo el Límite Máximo de Residuos (LMR) de tomasa (ver Tabla 1).

Tabla 1.

Análisis Resultado LOQ LMR en Tomate

mg/kg (ppm) mg/kg (ppm) mg/Kg

Difenoconazol 0,051 0,010 0,5

í

Pirimetanil 0,010 0,010 0,7

Lambda Cihalotrina 0,020 0,010 0,1 (*) Normas alimentarias FAO/OMS CODEX Alimentarius

(**) Reglamento (UE) N° 459/2010 de la Comisión de 27 mayo 2010.

< LOQ = Menor al Límite de Cuantificación.

LMR=Límite Máximo de Residuos de Tomates.

Por su parte, el análisis microbiológico de la tomasa mostró estar dentro de la norma: Recuento total <30000 (UFC/g), Hongos <5000 (UFC/g), Coliformes totales <10 (UFC/g), S. aureus <10 (UFC/g), E. coli <10 (UFC/g) y ausencia de Salmonella (en 25

0).

Entre los principios bioactivos presentes en el tomate o los subproductos del mismo, se han encontrado tocoferoles, fitosteroles, carotenoides (principalmente licopeno) y adenosina (inhibidor de la función plaquetaria) (Vági E, Simándi B, Vásárhelyiné KP, Daood H, Kéry Á, Doleschall F, Nagy B: The Journal of Supercritical Fluids 2007;40:218-226). Adicionalmente, la tomasa contiene semilla de tomate que posee otros compuestos, entre ellos ácidos grasos insaturados (ácidos linoleico, oleico y palmítico, entre otros) (Cámara M, Del Valle M, Torija M, Castilho C: ISHS Acta Horticulturae 542: VII International Symposium on the Processing Tomate 542 2001 :175-180; Giannelos P, Sxizas S, Lois S, Zannikos F, Anastopoulos G. Industrial Crops and Products 2005;22:193-199). Se ha demostrado que el ácido linoleico fue capaz de inhibir la formación de trombosis arterial, expresión del factor tisular y agregación plaquetaria (Holy, E.W., Forestier, M., Richter, E.K., Akhmedov, A., et al. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 2011 , 31 , 1772-1780). Además, se ha informado de que α-tocoferol inhibe la agregación plaquetaria a través de un mecanismo dependiente de PKC, lo que puede explicar la disminución de la expresión de P-selectina (Freedman, J.E., Farhat, J.H., Loscalzo, J., Keaney, J.F. Circulation. 1996, 94, 2434-2440, Murohara, T., Ikeda, H., Otsuka, Y., Aoki, M., et al. Circulation. 2004, 110, 141-148).

La caracterización químico-biológica de la tomasa en polvo mostró los siguientes resultados: a) Química proximal

El análisis proximal se realiza en la tomasa sin procesar (fresca). La tomasa contiene alrededor de 28 mg de licopeno en 10Og de materia fresca de tomasa y fenoles totales que corresponden a alrededor de 21 mg de ácido gálico en 100g de muestra fresca de tomasa. El resultado del análisis químico proximal es el siguiente: Proteína Total 16,8%; Cenizas 4,7%; Fibra Cruda 42,9%; Humedad 13,6%; Grasa con Hidrólisis Acida 12,7%; Calcio 0,120%; Cobre 8,990 mg/kg; Fósforo Total 0,440%; Hierro 54,390 mg/kg; Sodio 0,0220%; Zinc 22,54 mg/kg y Extracto no Nitrogenado 9,3%. b) Actividad antiplaquetaria de tomasa

Las siguientes son evidencias in vitro, in vivo y ex vivo de la actividad antiplaquetaria de la tomasa:

Estudios in vitro. Al estudiar la actividad antiagregante plaquetaria in vitro de tomasa, observamos que esta última presentó un potente efecto antiagregante, el cual es independiente del agonista usado (ADP, colágeno, TRAP-6 y ácido araquidónico). Comparación de las propiedades exhibidas del extracto acuoso de pulpa de tomate y del extracto acuoso de tomasa. Del análisis del extracto acuoso de tomasa se logra determinar que el mismo posee un poder antitrombótico mucho más efectivo que el mismo tomate, lo que representa un resultado inesperado de la presente invención. El extracto acuoso de pulpa tomate sólo fue capaz de inhibir la agregación plaquetaria alrededor del 41 ±4 y 19±2% con ADP y colágeno, respectivamente. Mientras que el extracto acuoso de tomasa inhibió la agregación plaquetaria usando cuatro agonistas (ADP: 35±5%, colágeno: 36±6%, TRAP-6: 22±4% y ácido araquidónico: 20±3%). Dichos resultados se muestran en las Tablas 2, 3 y 4, donde la inhibición de la agregación plaquetaria inducida se compara con el control negativo. Los valores en las Tablas 2, 3 y 4 se presentan como un promedio ± error promedio estándar (n = 3), donde el agonista ADP se uso en 8 μΜ, el colágeno en 1 ,5 pg/mL, TRAP-6 30 μΜ y ácido araquidónico 1 mM, mientras que los extractos se utilizaron en una concentración de 1 mg/mL. *P < 0,05 versus el control negativo (solución salina al 0,9%).

Tabla 2: Actividad antiagregante plaquetaria de extractos de tomate maduro y verde.

Agregación máxima (%)

ADP Colágeno TRAP-6 AA

Tomate Maduro

Cáscara 51 ±0.08* 71 ±0.02* 80±0.03 74±0.06

Pulpa 53±0.09* 73±0.04* 83±0.05 85±0.06 ucilago de semillas 37±0.08 ^* 51±0.14* 78±0.03 80±0.09

Tomate Verde

Cáscara 86±0.02 84+0.04 84+0.02 76±0.02

I

Pulpa 48±0.05* 73±0.02* 78±0.02 80±0.09

Mucilago de semillas 42±0.08* 84±0.09 72+.0.07 84±0.06

Control negativo 85+0.02 90±0.04 91±0.01 84±0.14

AA, ácido araquidónico. * p<0,05. Tabla 3: Actividad antiagregante plaquetaria de extractos de tomasa.

Agregación máxima (%)

ADP Colágeno TRAP-6 AA

.Extracto acuoso de tomasa 55±0.12* 58±0.05* 71 ±0.04* 68±0.05*

.Extracto acuoso de semillas 4ܱ0.09* 10±0.01* 59±0.06* 59±0.11*

EExtracto de éter de petróleo 26±0.04* 18±0.G3* 23±0.03* 20±0.05*

Control negativo 85±0.02 90±0.04 91±0.01 84±0.14

AA, ácido araquidónico. ^* p<0,05.

Tabla 4. Actividad antiagregante plaquetaria del extracto acuoso de tomasa usando cuatro agonistas.

Inhibición de la agregación plaquetaria (%)

ADP Colágeno TRAP-6 Ácido

araquidónico

Tomasa (1 mg/mL) 35+5* 36±6* 22±4* 20±3*

Pulpa de tomate (1 mg mL) 41±4* 19±2* NS NS

^* p<0,05.

En la figura 1 se muestra en forma representativa la actividad inhibitoria del extracto de tomasa, utilizando como agonista ADP.

Estudios in vivo y ex vivo. En ratas Wistar, observamos que la administración oral de extracto acuoso de tomasa (1g/kg/día, durante 15 días), prolongó el tiempo de sangría (grupo estudio 4,5±0,7 min vs grupo control 2,9±0,5 min, p<0,05) y disminuyó el área bajo la curva en el estudio de agregación plaquetaria (grupo estudio 270+58 vs grupo control 370±61 , p<0,05) (ver Tabla 5). Tabla 5. Actividad antiagregante plaquetaria en ratas sometidas a dosis de tomasa.

Tiempo de sangría Agregación Plaquetaria

Dosis (min) Tiempo La¾ Pendiente Máxima Area tejo la

(a) agregación (%) curva

9Ί¾/¾Κ. 4.5+0.7 *f 0.3±0.01 75±7 49+3 * 270± 58

Q.1 gftgfd¾ ₂ .9± 0.3* 0.4± 0.1 82±2 51±2 277+ 27

Contal 2.9+0.5 f 0.3± 0.1 8B+9 58±5 * 370± 61

^* p < 0,05; ip< ^¡ 0,05

c) Actividad anti plaquetaria de una composición de extracto acuoso de tomasa más maltodextrina.

Se preparó una composición de tomasa más maltodextrina pensando en la generación de una galleta con tomasa fresca. Se realizaron mezclas de tomasa en polvo con maltodrextrina, las que fueron sometidas a pruebas detectándose que la actividad antiagregante plaquetaria se mantuvo en dichas mezclas, concluyendo que no hubo diferencias significativas con respecto al uso de aditivo en la inhibición de la agregación plaquetaria.

d) Actividad antitrombótica de tomasa

Para estudiar la prevención del desarrollo de trombosis arterial en la arteria mesentérica, a animales (ratones 20-25 g) anestesiados se les administró solución salina (control negativo), ácido acetilsalicílico (control positivo) o tomasa en una dosis de 200 mg de tomasa/ kg de peso corporal por inyección intraperitoneal. Se examinó el efecto de tomasa en la formación de trombosis arterial, como se muestra en la figura 2. Durante el tiempo (60 min) en que se controló el flujo de sangre arterial, tomasa inhibió significativamente la oclusión arterial. Administración de tomasa (oclusión: 73,3±1.5%, n=3) mostró reducciones significativas en el tamaño de la oclusión arterial en comparación con el control negativo (oclusión 100%, n=3) (p <0,05).