Nano-dispersions aqueuses et nano-émulsions de traitement des eaux

Domaine de l’invention

[0001] La présente invention concerne des nano-dispersions aqueuses et des nanoémulsions destinées à décontaminer des eaux ou à prévenir leur contamination par des agents pathogènes, notamment des eaux utilisées pour l’aquaculture, ou les eaux de breuvage des animaux terrestres, pouvant selon le dosage être utilisé comme traitement préventif des infections des animaux.

État de la technique

[0002] Au niveau mondial, la demande de poisson est en augmentation du fait de la combinaison de plusieurs facteurs : croissance démographique, urbanisation et multiplication des richesses. Selon des recherches portant sur l'offre et la demande de poisson, la production aquacole devra doubler d'ici à 2030 pour pouvoir satisfaire la demande et les besoins croissants à l'échelon planétaire. Actuellement, le poisson représente près de 20 pour cent des aliments d'origine animale consommés dans le monde. Ce qui en fait une cible intéressante, comme décrit dans la suite de ce document, sachant que les principes s’appliquent également aux élevages d’animaux terrestres, et aux animaux domestiques, avec chacun leur spécificité.

[0003] Selon des estimations actuelles, les rendements de la pêche de capture marine ne devraient augmenter que très faiblement. Seule l'aquaculture pourra donc permettre de satisfaire la demande.

[0004] L’aquaculture représente 50 % du poisson consommé dans le monde. Le secteur se développe comme tous les élevages intensifs avec l’utilisation d’antibiotiques pour faire face aux maladies qui touchent les exploitations. Cette surexposition aux antibiotiques participe au développement de l’antibiorésistance et la propagation des pathogènes. C’est devenu une préoccupation majeure de ce secteur, sous la pression des consommateurs.

[0005] On peut citer des grandes familles de pathogènes récurrents des élevages, rencontrés dans les exploitations : les photobacterium (par exemple sous espèce damselae), les vibrionacea (par exemple les alginolyticus, photobacterium, ou vibrio), les pseudomonas (par exemple anguilliseptica). [0006] Face à ces pathogènes, les pisciculteurs ont le plus souvent recours à l’utilisation d'antibiotiques. Mais, à la fin du traitement, la flore présente généralement une résistance accrue à l’antibiotique utilisé, de nombreux gènes de résistances sont portés par des plasmides qui peuvent se transmettre d’une espèce bactérienne à l’autre. Le risque de sélectionner des souches pathogènes résistantes incite donc à limiter le recours aux antibiotiques (Pham 2017). Les chercheurs se retrouvent donc face au besoin de trouver d’autres alternatives et principes actifs pour lutter contre les pathogènes et la multi-résistance.

[0007] Le traitement de choix des maladies microbiennes reste l'antibiothérapie. Des abus dans son utilisation ont malheureusement conduit à l’apparition de souches résistantes et à de fréquents échecs de traitement. Il existe aussi un risque de transmission des résistances plasmidiques à d'autres bactéries, y compris celles pathogènes pour l'homme, et d'accumulation de résidus dans la chair des poissons et dans les effluents des piscicultures. Des législations sévères ont considérablement restreint l'emploi des antibiotiques en milieu aquatique, posant de gros problèmes aux pisciculteurs dont l'arsenal antibactérien est de plus en plus limité.

[0008] Parmi les alternatives utilisées pour remplacer les antibiotiques, on trouve les huiles essentielles. L’utilisation de l’huile de cannelle, contenant majoritairement de la cinnamaldéhyde, a déjà été intégrée à la diète de tilapias infectés par streptococcus iniae et a réduit le taux de mortalité des poissons qui était très élevé (Rattanachaikunsopon & Phumkhachom, 2010). Les effets des huiles essentielles sur des poulets d’élevage ont également été décrits (Brenes and Roura, Animal Feed Science and Technology, 158, 2010, 1-14).

[0009] Usuellement les traitements sont effectués en balnéothérapie dans les élevages aquacoles. Mais comme il s’agit de molécules volatiles et hydrophobes, le trempage des poissons dans un bassin contenant des HE reste complexe, difficile à mettre en œuvre et peu recommandé à grande échelle dans les exploitations utilisant des cages en pleine mer, ou raccordées à un cours d’eau.

[0010] Il y a par conséquent un besoin grandissant pour des systèmes alternatifs permettant de protéger efficacement les élevages notamment aquacoles de ces pathogènes de façon ciblée, en substitution à l’utilisation systématique des médicaments antibiotiques, et particulièrement dans une approche préventive, qui n’induit pas d’antibiorésistance, c’est un enjeu doublé des contraintes de mise en œuvre des huiles qu’il faut administrer efficacement et simplement aux espèces cibles (élevage aquacole, et distribution dans les eaux de breuvage pour les espèces terrestres).

Description brève de l’invention

[0011] L’invention a pour objet une nano-dispersion aqueuse comprenant des particules minérales, un agent de dispersion amphiphile et des molécules actives, telle que les particules sont des amas de feuillets de phyllosilicates exfoliés de taille D90 en nombre inférieure à 1 000 nanomètres, et telle que les molécules actives comportent des huiles essentielles.

[0012] Les amas de feuillets de phyllosilicates de très petite taille servent de support aux molécules d’huiles essentielles qui sont liées physiquement à la surface des feuillets de phyllosilicates avec un agent de surface amphiphile, cela a l’avantage de stabiliser ces molécules et de les concentrer à leur surface. La petite taille des amas de feuillets permet ainsi de largement disperser les molécules actives, qui lorsqu’elles sont hydrophobes et de faible densité ont tendance à se regrouper pour former des grosses gouttes, voire des films lipidiques en surface de l’eau. Ces molécules actives peuvent être des huiles essentielles ou des combinaisons d’huiles essentielles.

[0013] Avantageusement, la taille D50 en nombre des particules est inférieure à 750 nm, préférentiellement inférieure à 200 nm et très préférentiellement inférieure à 100 nm. [0014] Dans des modes de réalisation, la taille D50 en nombre des particules va de 10 à 800 nm, de préférence de 10 à 750 nm, de préférence de 20 à 500 nm, de préférence de 20 à 400 nm, de préférence de 20 à 300 nm, de préférence de 20 à 200 nm, de préférence de 20 à 100 nm, de préférence de 20 à 90 nm, de préférence de 25 à 70 nm, de préférence de 25 à 50 nm. [0015] La diminution de taille des amas de feuillets de phyllosilicates a l’avantage de favoriser la dispersion des molécules actives tout en ayant une concentration locale élevée en molécule active, et ainsi de renforcer leur efficacité. À l’aide de ces feuillets de phyllosilicates de taille nanométrique, on augmente la surface de contact avec les huiles essentielles, qui restent labiles, car elles peuvent se désorber, ce qui favorise leur efficacité. Par ailleurs elles se retrouvent ainsi dispersées dans le volume d’eau sur leur support en phyllosilicate, et peuvent interagir avec les pathogènes. [0016] Cette nano-dispersion aqueuse est très simple à mettre en œuvre dans un bassin d’eau aquacole ou dans des eaux de breuvage d’animaux terrestre. La petite taille des amas de feuillets facilite leur mise en suspension dans les eaux avec une sédimentation lente.

[0017] L’invention a aussi pour objet une nano-émulsion avec une phase aqueuse continue et une phase lipidique dispersée, dans laquelle la phase lipidique dispersée contient des lipides, des particules minérales constituées d’amas de feuillets de phyllosilicates gonflés par de l’eau et exfoliés, au moins une huile essentielle et un agent de dispersion amphiphile, et dans laquelle la taille D50 en nombre des gouttes de la phase lipidique dispersée est inférieure à 800 nm et de préférence inférieure à 300 nm.

[0018] Dans des modes de réalisation, la taille D50 en nombre des gouttes de la phase lipidique dispersée va de 10 à 800 nm, de préférence de 20 à 700 nm, de préférence de 50 à 500 nm, de préférence de 75 à 400 nm, de préférence de 50 à 300 nm, de préférence de 100 à 300 nm.

[0019] L’eau de la phase lipidique est physisorbée entre les feuillets de phyllosilicates pour les gonfler (espace interfoliaire), ce qui permet d’atteindre des tailles de particules plus petites par exfoliation, et l’agent de dispersion, avec une partie hydrophile et une partie hydrophobe, est adsorbé à la surface des amas de feuillets par sa partie hydrophile. Cela rend partiellement hydrophobe les feuillets, favorise l’exfoliation des phyllosilicates et permet une bonne dispersion des feuillets de phyllosilicates dans les lipides.

[0020] En d’autres termes, la phase lipidique ne comprend pas d’eau autre que l’eau adsorbée dans les feuillets de phyllosilicates.

[0021] L’agent de dispersion amphiphile de la nano-dispersion aqueuse et de la nanoémulsion peut être choisi dans le groupe de l’éthyle lauroyl arginate (LAE), des tensioactifs cationiques à base d’arginine en 16 carbones et plus, des phospholipides, du e-polylysine et leurs combinaisons.

[0022] Avantageusement, l’agent de dispersion est un phosphoglycéride.

[0023] Très avantageusement, l’agent de dispersion est une phosphatidyle choline et préférentiellement la lécithine. [0024] Ces agents de dispersion vont se lier aux fonctions silanolates des phyllosilicates par la partie cationique de leur structure.

[0025] De préférence, les phyllosilicates de la nano-dispersion aqueuse et de la nanoémulsion ont majoritairement des cations de sodium en position interfoliaires. [0026] Les cations de sodium interfoliaires ont l’avantage d’opposer moins de résistance à l’augmentation de la distance interfoliaire des feuillets phyllosilicates dits sodiques et ainsi de favoriser leur gonflement par des molécules d’eau ainsi que leur exfoliation. Les phyllosilicates sodiques présentent ainsi des avantages sur la taille de la dispersion pour obtenir des amas de feuillets plus petits, cela favorise les dispersions fines d’huile essentielle et ainsi on obtient un plus grand rapport surface sur volume des amas de phyllosilicates qui supportent les molécules actives d’huile essentielle, et cela augmente la statistique de rencontre entre les molécules actives et les pathogènes.

[0027] Très préférentiellement, les phyllosilicates sont des smectites qui sont majoritairement des feuillets de montmorillonites. [0028] Avantageusement, la teneur en agent de dispersion amphiphile de la nanodispersion aqueuse est comprise entre 0,2 et 2,0 % en poids relativement au poids des particules minérales.

[0029] Avantageusement, la teneur en agent de dispersion de la phase lipidique dispersée de la nano-émulsion est avantageusement comprise entre 10 % et 400 % et préférentiellement entre 20 % et 300 % en poids relativement au poids de particules de la phase lipidique.

[0030] Lorsque la teneur en agent de dispersion tel que de la lécithine est insuffisante, le caractère hydrophobe des particules d’argile est insuffisant, ce qui ne les stabilise pas dans la phase lipidique [0031] À des teneurs en agent de dispersion trop élevées, on perd le caractère hydrophile des particules et les molécules d’huiles essentielles se retrouvent en compétition avec l’agent de dispersion à la surface des particules, ce qui ne favorise pas leur disponibilité à la surface des particules de phyllosilicates.

[0032] Pour des particules de phyllosilicates exfoliées avec une surface spécifique de l’ordre de 300 m2/g, la gamme préférentielle de teneur en agent de dispersion correspond à un taux de couverture des fonctions silanol par l’agent de dispersion compris entre 20 et 60 %, soit entre 30 et 130 % de la masse d’argile engagée à apporter en agent de dispersion tel que la lécithine de soja.

[0033] Avantageusement, la teneur en eau de la phase lipidique dispersée de la nanoémulsion est comprise entre 10 % et 300 % et préférentiellement entre 20 % et 200 % en poids relativement au poids de particules de la phase lipidique.

[0034] En-dessous de 10 % d’eau en poids relativement au poids des particules, les feuillets de phyllosilicates ne sont pas suffisamment prégonflés et il n’est pas possible d’obtenir une diminution suffisante des tailles de particules lors de leur exfoliation.

[0035] Au-delà de 300 %, la quantité d’eau ne permet plus aux molécules de l’agent de dispersion de venir se lier physiquement à la surface des feuillets et les feuillets ne sont pas suffisamment hydrophobes pour servir de support aux molécules actives comme les huiles essentielles.

[0036] Les nano -dispersions aqueuses et les émulsions nanométriques peuvent être utilisées comme agent de décontamination d’eaux aquacoles et d’eaux de breuvage d’animaux terrestres, ou comme moyen de traitement préventif des pathologies chez l’animal au travers de son hydratation quotidienne, ou dans le traitement préventif des animaux contre le développement d’agents de contamination dans leur organisme. Ils peuvent ainsi servir pour protéger ces eaux de la prolifération d’agents pathogènes. Dans certaines applications indirectes, ces systèmes peuvent constituer un appétant pour inciter la prise d’eau des animaux.

[0037] Les émulsions nanométriques présentent l’avantage de pouvoir rester en suspension homogène sous la force de l’agitation thermique, ce qui permet de les stocker sur de longues périodes tout en restant très faciles à homogénéiser lors de leur utilisation. [0038] Selon un autre mode d’utilisation, les nano-dispersions aqueuses et les émulsions nanométriques peuvent compléter un aliment, un complément alimentaire ou un premix.

[0039] Selon encore un autre mode d’utilisation, les dispersions aqueuses et les émulsions nanométriques peuvent être utilisées comme agent conservateur naturel, à base d’huiles essentielles pour des préparations dont le paramètre activité de l’eau est supérieur à 0,45. [0040] L'activité de l'eau ne représente pas la teneur en eau (ou humidité) mais bien la disponibilité de cete eau. Plus l'activité de l'eau est élevée, plus la quantité d'eau libre est grande et plus les micro-organismes ont la capacité de se développer.

[0041] Les émulsions nanométriques obtenues par cette approche sont des particules très stables mécaniquement, ainsi qu’au cours du temps, et peuvent être introduites facilement dans une extrudeuse pour être coextrudées au cœur des aliments en granulés. Elles seront ainsi des véhicules idéaux pour l’incorporation d’huiles essentielles dans des aliments sous forme de premix, qui facilite la manipulation (car réduit le risque d’inhalation, ou d’évaporation des huiles essentielles). Les premix se retrouvent ainsi également sous une forme galénique qui favorise leur métabolisation avec des tailles de gouttes de l’ordre de la centaine de nanomètres.

[0042] Leur présence dans un aliment, un complément alimentaire ou un premix a l’avantage de favoriser la conservation dans le temps de ces aliments, compléments ou premix, les propriétés bactériostatiques des huiles essentielles sous forme de particules dispersées à l’échelle nanométrique constituent un avantage considérable dans la conservation des aliments, ce qui limite les recours aux traitements thermiques, qui dégradent la qualité nutritionnelle en particulier les micro-nutriments, ou aux agents de conservation qui peuvent être controversés malgré leur utilisation massive.

[0043] L’invention a aussi pour objet un procédé de préparation d’une nano-émulsion, comportant les étapes suivantes : dissoudre l’agent de dispersion dans la phase aqueuse de la phase lipidique et obtenir une solution homogène ; ajouter les phyllosilicates et mélanger avec un pétrin la pâte obtenue ; ajouter les lipides de la phase lipidique ; cisailler la composition obtenue ; ajouter la phase aqueuse ; apporter de l’énergie de cisaillement pour obtenir une émulsion micrométrique ; et reprendre l’émulsion micrométrique avec un homogénéisateur haute pression ou un microfluidisateur pour obtenir une émulsion nanométrique.

[0044] L'objectif de l'invention est un mode d’utilisation des huiles essentielles qui permet de limiter leur volatilité tout en ayant une grande efficacité avec des quantités utilisées maîtrisées. Cette mise en œuvre des huiles essentielles dans une forme dispersée à l’échelle nanométrique de façon stable favorise la statistique de rencontre avec les pathogènes. Le stockage et l’incorporation des huiles essentielles dans des pratiques en nutrition animale seront grandement facilités par la stabilité et l’homogénéité des dispersions.

Description des Figures

[0045] L’invention est décrite ci-après à l’aide des figures 1 à 10, données uniquement à titre d’illustration :

La figure. 1 présente un schéma de structure d’une bentonite ;

La figure. 2 présente la formule de la lécithine ;

La figure. 3 présente schématiquement l’évolution de la teneur en lécithine en fonction de la surface spécifique de l’argile et pour plusieurs taux de couverture ; La figure. 4 présente schématiquement l’évolution de la taille des gouttes de la phase dispersée en fonction de la taille et de la concentration des particules minérales ;

La figure. 5 présente la taille des particules minérales pour deux concentrations d’argile ;

La figure. 6 présente la mesure de la taille de différentes argiles dispersées dans l’eau ;

La figure. 7 présente la taille des gouttes lipidiques d’une émulsion ;

La figure. 8 présente un schéma de l’émulsion obtenue ;

La figure. 9 présente schématiquement l’évolution de la taille des gouttes de la phase dispersée en fonction de la taille et de la concentration des particules minérales ; et

La figure. 10 présente un schéma de mesure de l’angle de contact entre une goutte d’eau pure et la surface d’argiles.

Description détaillée de l’invention

[0046] Une émulsion est du genre « huile dans eau », lorsque (i) la phase dispersante est une phase aqueuse et (ii) la phase dispersée est une phase organique (hydrophobe, lipidique ou huileuse). Une telle émulsion est encore désignée couramment par « émulsion directe » ou par le sigle « H/E ». [0047] Dans le cadre de la présente invention, on entend par molécule « labile », une molécule liée à un substrat par des interactions physiques, ioniques, ou des forces de Van der Waals, non covalentes, ce qui lui donne une capacité d’accroche ou d’organisation réversible. [0048] Dans le cadre de la présente invention, la composition comprend des phyllosilicates exfoliés c’est-à-dire des phyllosilicates dont les feuillets ont été séparés par exfoliation.

[0049] Par le terme « exfolié », on entend les phyllosilicates ayant subi une exfoliation, c’est-à-dire une séparation plus ou moins complète de ses feuillets individuels. Le procédé d’exfoliation comprend usuellement trois phases :

- (1) gonflement des feuillets de phyllosilicate par de l’eau,

- (2) L’adsorption d’une molécule hydrophobe à la surface des particules de phyllosilicates, pour la rendre compatible avec des lipides, par exemple de la lécithine, et - (3) L’apport d’énergie de cisaillement pour séparer les particules de phyllosilicate dans la phase dispersante.

[0050] Dans le cadre de l’invention, on utilise indifféremment le terme « argiles » ou « particules minérales » pour désigner et décrire les phyllosilicates.

[0051] Dans ce qui suit, le D50 en nombre d’un échantillon de particules représente la taille des particules pour laquelle 50% des particules de l'échantillon possèdent une granulométrie inférieure à cette valeur, par analogie un D90 en nombre représente la taille des particules pour laquelle 90% des particules de l'échantillon possèdent une granulométrie inférieure à cette valeur.

[0052] On entend par « émulsion nanométrique » ou « nano-émulsion) une émulsion dont les gouttes de la phase dispersée ont une taille D50 en nombre inférieure à 800 nanomètres (nm), de préférence inférieure à 500 nanomètres (nm), de manière particulièrement inférieure à 300 nanomètres (nm) et un D90 en nombre inférieur à 1000 nm.

[0053] On entend par « nano-dispersion » ou « dispersion nanométrique » une dispersion dont les particules colloïdales de phyllosilicates sont dispersées avec une taille D50 en nombre inférieure à 1000 nanomètres (nm). [0054] L'activité de l'eau (symbole pour activity of water) représente la pression de vapeur d’eau p d’un produit humide divisée par la pression de vapeur saturante po à la même température :

[0055] aw = p/p ₀ [0056] Ce paramètre traduit les interactions de l'eau avec la matrice du produit humide.

[0057] L'activité de l'eau est l'un des principaux paramètres influençant la conservation des aliments ou des produits pharmaceutiques. Les micro-organismes ont besoin d’eau « libre » (libre pour les réactions biochimiques) pour se développer. L'activité de l'eau ne représente pas la teneur en eau (ou humidité) mais bien la disponibilité de cette eau. Plus l’activité de l’eau est élevée, plus la quantité d’eau libre est grande (1 étant le maximum) et plus les micro-organismes se développeront.

[0058] Dans des modes de réalisations, l’activité de l’eau est de 0 à 1, de préférence de 0,45 à 1, de préférence de 0,6 à 1, de préférence supérieure à 0,45. [0059] La présente invention concerne ainsi une nano -dispersion aqueuse et une nanoémulsion comportant des particules et des molécules actives liposo lubies. Les particules sont constituées d’amas de feuillets de phyllosilicates de taille D50 en nombre inférieure à 1 000 nanomètres (nm). Les molécules actives peuvent être des huiles essentielles (HE) ou des combinaisons d’huiles essentielles. Lipides

[0060] Les lipides de la phase lipidique, ou hydrophobe, ou huileuse, ou organique des émulsions nanométriques, sont choisis selon les applications envisagées parmi les huiles végétales, les huiles minérales, les huiles de synthèse, les solvants organiques hydrophobes et les polymères liquides hydrophobes. La phase lipidique de la nano- émulsion comprend des agents bactériostatiques, tels que des huiles essentielles. Elle peut aussi contenir des acides gras insaturés, des antioxydants et des vitamines.

[0061] Dans les exemples, on utilise de l’huile de tournesol. Huiles essentielles

[0062] Depuis des siècles, l'homme utilise les plantes comme moyen de prévention et ou guérison contre les maladies. Plus précisément les extraits de ses plantes, furent utilisés comme remèdes chez de nombreuses civilisations à travers le globe. [0063] La norme Afnor NF T 75 - 006 (2000) définit les huiles essentielles comme étant « des produits obtenus, soit à partir de matières naturelles végétales par entraînement à la vapeur d'eau, soit par des procédés mécaniques à partir de l'épicarpe des citrus, soit par distillation sèche. L'huile essentielle ainsi obtenue est séparée de la phase aqueuse par des procédés physiques. [0064] Une huile essentielle est une substance odorante et volatile, non grasse, extraite d’un végétal sous forme liquide. Elle provient d’une sécrétion élaborée par certains végétaux et contenue dans des structures spécialisées (poils, poches et canaux sécréteurs). Selon l’huile essentielle, la totalité de la plante aromatique, voire plus spécifiquement certains de ses organes (racine, écorce, feuille, fleur, fruit, graine...) seront sélectionnés pour en extraire les composés aromatiques. Une huile essentielle a une composition moléculaire complexe qui lui confère des vertus uniques. Elle ne contient ni protéines, ni lipides, ni glucides, ne renferme pas de minéraux ni de vitamines : elle n’a donc aucune valeur nutritionnelle.

[0065] À température ambiante, les huiles essentielles sont liquides, hormis quelques cas particuliers : les huiles essentielles de myrrhe et de santal sont plutôt visqueuses et celles de rose et de camphrier peuvent être cristallisées. À basse température, certaines huiles essentielles cristallisent : celles d’anis, de menthe des champs ou de thym saturéioïde lorsque les flacons sont stockés au réfrigérateur.

[0066] Les huiles essentielles sont volatiles, cette volatilité explique leur caractère odorant ainsi que leur mode d’obtention par entraînement à la vapeur d’eau. Ils sont très solubles dans les huiles grasses (qui constituent un très bon support lorsque l’on souhaite les diluer), les lipides (d’où le principe de l’enfleurage anciennement utilisé pour extraire les HE en les mettant en contact avec une graisse animale comme la lanoline), l’éther, la plupart des solvants organiques ainsi que dans l’alcool (de titre élevé). De caractère liposo lubie : les huiles essentielles ne se dissolvent pas dans l’eau, il faut donc impérativement utiliser un tensio-actif pour permettre leur mise en suspension dans l’eau. Elles possèdent un indice de réfraction élevé et ont souvent un pouvoir rotatoire. La plupart d’entre elles sont colorées.

[0067] Étant donné la grande complexité de la composition chémotypique des huiles essentielles, malgré de possibles synergies certains auteurs préfèrent étudier l’effet d’un composé isolé pour pouvoir ensuite le comparer à l’activité globale de l’huile.

[0068] L’activité des composants des HE dépend de leur structure chimique. Les terpènes oxygénés (carvacrol, thujone par exemple) présentent une activité antimicrobienne plus élevée que les terpènes non oxygénés (a- et b-pinène, limonène par exemple). De plus, le caractère lipophile de leur squelette hydrocarboné ainsi que le caractère hydrophile de leurs groupes fonctionnels sont déterminants vis-à-vis de leur activité antimicrobienne. Ainsi, l’ordre d’activité antimicrobienne de ces composés est le suivant : phénols > aldéhydes > cétones > alcools > éthers > hydrocarbures.

[0069] Parmi les constituants d’huile essentielle, il a été démontré que les composés phénoliques possédaient une activité antimicrobienne importante. Il semble que la présence du groupe hydroxyle soit liée à l'inactivation des enzymes microbiennes. Très probablement, ce groupe interagit avec la membrane cellulaire, provoquant des fuites de composants cellulaires, une modification des acides gras et des phospholipides, ainsi qu'une altération du métabolisme énergétique et une influence sur la synthèse de matériel génétique. Les phyllosilicates

[0070] Les phyllosilicates sont des minéraux argileux du groupe des silicates construits par empilement de couches tétraédriques (« T ») où les tétraèdres partagent trois sommets sur quatre (les oxygènes « basaux »), le quatrième sommet (l’oxygène « apical ») étant relié à une couche octaédrique (« O ») occupée par des cations différents (Al, Mg, Le, Ti, Li, etc.). La figure 1 présente un exemple de structure de phyllosilicate. Ces structures empilées forment des feuillets organisés (tels que décrit dans le détail ci-dessous) dont leur charge de surface est négative sur une large plage de pH (4<pH<9), qui seront stabilisés par des contres-ions cationiques. Ces contres- ions seront monovalents, ou divalents, ce qui confère à l’argile une capacité à être gonflée dans l’eau plus ou moins fortement, par insertion de molécules d’eau entre les feuillets. [0071] Les smectites sont un groupe de minéraux argileux, et donc des silicates, plus précisément des phyllosilicates.

[0072] Leur composition type est où A représente un cation interfoliaire (élément alcalin ou alcalino-terreux), D un cation octaédrique, T un cation tétraédrique, O l’oxygène et Z un anion monovalent (généralement OH-).

[0073] Elles cristallisent dans le système monoclinique.

[0074] Ce sont des phyllosilicates de structure TOT (ou 2:1), c'est-à-dire constitués de feuillets comportant deux couches tétraédriques tête-bêche, liées entre elles par les cations octaédriques. Les feuillets sont liés entre eux par les cations interfoliaires.

[0075] On distingue les smectites dioctaédriques (beïdellite, montmorillonite, nontronite, etc.) et trioctaédriques (hectorite, saponite, etc.).

[0076] La montmorillonite est une argile de type 2/1, dite encore TOT (pour tétraèdre/octaèdre/tétraèdre). Cela signifie qu’un feuillet de montmorillonite est formé de trois couches : une couche octaédrique Al(OH )sO : 7 atomes pour 6 sommets + l'aluminium au centre. Les OH- et l'oxygène étant partagés entre les différents octaèdres qui composent la couche. et deux couches tétraédriques qui recouvrent de chaque côté la couche octaédrique à sa base ; S1O4 : 5 atomes pour 4 sommets + le silicium au milieu. Les oxygènes étant partagés entre les différents tétraèdres qui composent la couche.

[0077] Les imperfections dans le cristal sont compensées par des cations interfoliaires, généralement monovalents ou divalents, qui assurent la neutralité électrique du minéral.

[0078] L’ensemble des phyllosilicates peut être utilisé, mais les smectites et particulièrement les montmorillonites ont l’avantage, du fait de leur structure lamellaire avec un écartement entre les feuillets plus élevé que les autres phyllosilicates, de pouvoir être gonflés par des petites molécules avec des propriétés hydrophobes qui vont améliorer T exfoliation des plaquettes argileuses et ainsi faciliter leur dispersion dans la composition lipidique. Les autres phyllosilicates, mais aussi les micas et les talcs peuvent aussi être ainsi exfoliés, mais l’énergie qui serait nécessaire pour disperser les feuillets lamellaires dans la phase lipidique serait beaucoup plus élevée. [0079] Dans les exemples, on utilise de la bentonite comme phyllosilicate. Les bentonites sont des argiles majoritairement composées de montmorillonite, dont les cations interfoliaires sont usuellement soit du calcium, soit du sodium, du potassium, leur combinaison ou d’autres ions métalliques. [0080] La bentonite est chargée négativement à la surface (sur la longueur) et positivement sur les côtés (largeur) ce qui lui permet d’interagir avec d’autres molécules chargées.

[0081] Les argiles sont hydrophiles et les smectites dont la bentonite ont une capacité de gonflement. Cette particularité permet d’adsorber des molécules hydrosolubles dans l’espace interfoliaire des argiles par l’intermédiaire d’une phase aqueuse. L’eau est dite physisorbée à la surface des feuillets d’argile via les groupements silanols.

[0082] Dans la description, on utilisera également le terme « argile » pour faire référence aux phyllosilicates.

Agent de dispersion ou de surface [0083] On utilise usuellement comme agent de dispersion ou de surface une molécule avec une partie hydrophobe et une partie hydrophile. L’adhésion de cet agent de dispersion par interaction physique aux particules minérales permet de rendre hydrophobe les feuillets d’argile et d’obtenir une bonne dispersion de ces feuillets d’argile dans une phase lipidique. [0084] Il est avantageux d’utiliser un agent de dispersion présentant une tête polaire cationique et une chaîne hydrophobe, soluble dans la phase lipidique, tels que les phospholipides présentant des fonctions polaires cationiques telles que pour la sérine, l’éthanolamine ou encore la choline, on obtient ainsi de la phosphatidylsérine, de la phosphatidyléthanolamine, ou encore de la phosphatidylcholine, plus connue sous le nom de « lécithine ». C’est un lipide de la classe des phosphoglycérides. L’arginine greffée sur une chaîne alkyle longue (Cl 6 et plus) peut également jouer ce rôle d’agent de dispersion. On peut aussi utiliser l’éthyle lauroyl arginate (LAE). On peut aussi utiliser la e-polylysine comme agent de surface.

[0085] Tous ces agents de dispersion sont labiles car ils se lient à la surface des amas de feuillets de phyllosilicates par des interactions non covalentes, ce qui leur donne une capacité d’accroche ou d’organisation réversible en fonction des conditions physicochimiques (pH, force Ionique, température, etc...). [0086] La phosphatidylcholine possède (figure 2) : un pôle hydrophile : la choline (1) et le groupe phosphate (2) ; une queue hydrophobe : les résidus d’acides gras (ici, les résidus d'acides palmitique (5) et oléique (4)) ; et le glycérol (3) relie ces deux pôles hydrophile et hydrophobe.

[0087] Le groupe phosphate est chargé négativement, tandis que la choline est chargée positivement. La phosphatidylcholine est donc zwitterionique.

[0088] Elle est à la fois hydrophile et lipophile, et son équilibre hydrophile-lipophile (HLB) peut varier entre 2 et 9,5 selon les résidus d'acides gras de la queue hydrophobe.

Procédé d’obtention d’une émulsion

[0089] Pour stabiliser les émulsions, une démarche consiste à employer des composés dits « émulsifiants » ou « émulsionnants ».

[0090] Ces composés émulsifiants sont le plus souvent des agents tensioactifs émulsionnants (dits encore « agents de surface ») qui, grâce à leur structure amphiphile, se placent à l'interface huile/eau et stabilisent les gouttelettes dispersées.

[0091] Cependant, les composés émulsifiants de ce genre n'offrent pas toujours la stabilité recherchée dans le temps, avec un équilibre permanent des agents tensio-actifs entre l’interface à stabiliser et les micelles en solution. De plus, les agents tensioactifs de synthèse présentent souvent des inconvénients sur le plan écologique ou alimentaire, car ils perturbent les systèmes biologiques par une interaction forte avec les membranes cellulaires.

[0092] Ces composés émulsifiants/émulsionnants peuvent également consister en des particules solides, qui permettent l'obtention d'émulsions dites « émulsions de Pickering ».

[0093] Les émulsions de Pickering sont des émulsions qui sont stabilisées par des particules en suspension colloïdales dans la phase aqueuse venant s'ancrer à l'interface huile/eau interprété comme un effet de mouillage à l’interface des deux phases, avec une forte stabilité.

[0094] Contrairement aux agents tensio-actifs qui s'adsorbent et se désorbent continuellement sous l’effet de l’agitation thermique, les particules en suspension colloïdale s'adsorbent fortement aux interfaces et l’énergie de désorption des particules devient suffisamment élevée pour rendre le phénomène irréversible.

[0095] Les particules de phyllosilicates ont ainsi un rôle d’émulsifiant pour stabiliser les émulsions selon un objet de l’invention. Ces émulsions sont ainsi des émulsions de Pickering.

[0096] L’objectif de cette étape est l’obtention d’une émulsion stable avec une phase dispersée en forme de gouttes dans une phase continue. La phase lipidique comprend la dispersion de phyllosilicates dans de l’huile précédemment décrite. La phase aqueuse est composée de l’eau pouvant être complétée par un sel monovalent, avec une concentration entre 0 et 100 mM dans l’eau, avec avantageusement du NaCl à une concentration inférieure à 50 mM et très avantageusement à 25 mM. Cette force ionique a été choisie pour limiter les répulsions électrostatiques dues aux charges de surface des particules d’argile. Pour disperser les deux phases non miscibles, on va apporter une énergie de cisaillement appliquée en batch, à température ambiante, avec par exemple un dispositif rotor/stator avec un entrefer de 150 micromètres avec un mobile de 30 mm, à 4500 rpm pendant 4 min.

[0097] Pour obtenir une émulsion selon l’un des objets de l’invention, on utilise toujours une phase lipidique dans laquelle des particules d’argile sont dispersées et stabilisées avec un agent de dispersion ou de surface en présence d’eau comme précédemment décrit.

[0098] Le caractère direct ou inverse de l’émulsion obtenue est principalement fonction des viscosités relatives de la phase continue et de la phase dispersée, de la proportion de phase dispersée par rapport à la phase continue au démarrage de l’émulsification, sachant que la phase dispersée peut être ensuite ajoutée goutte à goutte pour augmenter la proportion, on peut réaliser ainsi des émulsions à plus de 65% en poids de phase dispersée.

[0099] La taille de gouttes de la phase dispersée obtenues est fonction de la taille de particules d’argile et de la concentration de ces particules d’argile. La figure 9 présente schématiquement les évolutions observées. [00100] Pour une taille de particules d’argile donnée, le diamètre de gouttes diminue avec la concentration ; plus on met de particules, plus celles-ci peuvent stabiliser d’interfaces et donc il en résulte des gouttes de la phase dispersée de plus petits diamètres. Cependant, la taille des particules d’argile va imposer une taille minimale de gouttes ; on ne peut pas faire de gouttes plus petites que les particules stabilisantes.

[00101] Il est à noter que la stabilisation des gouttes d’émulsions par des particules d’argile induit une rigidifïcation de l’interface avec des gouttes qui perdent leur sphéricité. Par ailleurs la taille limite de gouttes observée sur le plateau à forte concentration d’argile dépend de l’énergie de cisaillement apportée pour fragmenter les gouttes.

[00102] Les émulsions stabilisées par des phyllosilicates organisés à la surface des gouttelettes, permettent d’avoir des gouttelettes lipidiques stabilisées contre la coalescence par une barrière physique de charge dominante négative en surface pour une large gamme de pH allant de pH 4 et pH 10. Cette charge négative est apportée par les liaisons silanolates de surface des plaquettes d’argile. Ces silanolates de charge négative, peuvent interagir avec des molécules (L-arginine, L-Lysine) ou des polymères cationiques (chitosan, acide hyaluronique, polylysine, etc...), ce qui permet de changer les interactions de surface des gouttelettes et ainsi les fonctionnaliser ou changer leur attractivité pour différents supports. Il est également possible de les fonctionnaliser par liaison covalente par condensation de silanes préparés pour apporter des fonctions particulières. Une diversité de silanes pouvant se condenser par une ou plusieurs silanes sont envisageables. On peut citer à titre d’exemple les mono, di ou tri ethoxy aminopropylsilanes. De nombreuses molécules sont utilisables pour ensuite coupler de façon covalente la fonction amine apportée par les silanes. Une chimie simple peut être utilisée avec des agents de couplage comme les isothiocyanates, les N- hydroxysuccimide ester (NHS-ester), isocyanates, acyl azides, sulfonyl chlorides, aldéhydes, glyoxals, epoxides, oxiranes, carbonates, aryl halides, imidoesters, carbodiimides, anhydrides, and fluorophenyl esters

[00103] Les surfaces des particules sont ainsi fonctionnalisables pour interagir avec des antigènes de surface sur les bactéries, ou des biofïlms bactériens. Nano-dispersion aqueuse de particules de phyllosilicates

[00104] La préparation d’une nano-dispersion aqueuse de particules de phyllosilicates comprend les étapes suivantes :

[00105] (1) Préparer une solution aqueuse de phyllosilicates : homogénéiser la solution avec un rotor stator et laisser reposer ; [00106] (2) Ajouter à la solution aqueuse de phyllosilicates une quantité donnée de l’agent de dispersion, par exemple la e-polylysine ; homogénéiser au vortex ;

[00107] (3) Ajouter à la solution précédente une quantité donnée d’huile essentielle ;

[00108] (4) Homogénéiser la solution complétée dans un bain d’ultra-sons pour obtenir la nano-dispersion aqueuse de phyllosilicates. [00109] Dans des modes de réalisation, la teneur en phyllosilicates dans la nanodispersion aqueuse va de 0,005 à 20 % en poids.

[00110] Dans des modes de réalisation, la teneur en phyllosilicates dans la nanodispersion aqueuse va de 0,5 à 20 % en poids, préférentiellement de 1 à 20 % en poids. [00111] Dans des modes de réalisation, la teneur en phyllosilicates dans la nanodispersion aqueuse va de 0,005 à 5 % en poids, préférentiellement de 0,005 à 2 % en poids.

[00112] Dans des modes de réalisation, la teneur en phyllosilicates dans la nano- dispersion aqueuse va de 0,5 et 35 % en poids et de préférence de 0,5 à 15 % en poids, par rapport au poids de la composition lipidique.

Procédé de préparation d’une nano-émulsion

[00113] L’invention a aussi pour objet des émulsions nanométriques. Ces émulsions se composent d’une phase lipidique et d’une phase aqueuse continue. [00114] L’objectif est l’obtention d’une émulsion nanométrique selon l’un des objets de l’invention.

[00115] Pour associer deux systèmes qui n’ont à l’origine aucune affinité, l’un apolaire (les lipides - huiles essentielles) et l’autre polaire (phase aqueuse - phyllosilicates), on va : (1) Dissoudre l’agent de dispersion dans l’eau de gonflement de l’argile et obtenir un mélange homogène ;

(2) Ajouter l’argile et mélanger avec un pétrin la composition obtenue pour gonfler les feuillets de phyllosilicate par l’eau, et adsorber l’agent de dispersion à la surface des particules de phyllosilicates, pour les rendre compatibles avec la phase lipidique ;

(3) Ajouter les lipides de la phase lipidique ;

(4) Apporter de l’énergie de cisaillement à la composition obtenue pour disperser/exfolier les feuillets d’argile dans la phase lipidique ;

(5) Ajouter l’eau de la phase aqueuse externe avec par exemple un rapport de phase huileuse/phase aqueuse de 40/60 ;

(6) Apporter de l’énergie de cisaillement à la composition obtenue pour disperser la phase lipidique dans la phase aqueuse et obtenir une émulsion micrométrique ; et

(7) Reprendre cette émulsion et la cisailler avec encore plus d’énergie par traitement dans un homogénéisateur haute pression ou un microfluidisateur et obtenir une émulsion nanométrique. [00116] Les étapes (1) à (4) ont pour but la préparation de la phase lipidique de la nanoémulsion selon l’un des objets de l’invention.

[00117] Cette phase lipidique comporte des lipides, par exemple de l’huile de tournesol à laquelle on ajoute au moins une huile essentielle comme agent antibactérien, des phyllosilicates, de l’eau de gonflement des phyllosilicates et un agent de dispersion amphiphile.

[00118] L’étape (1) est obtenue par l’apport d’eau en quantité suffisante pour solubiliser l’agent de dispersion et imprégner les feuillets d’argile.

[00119] Les argiles sont connues pour leurs propriétés absorbantes d’eau, et ils peuvent gonfler selon leur composition chimique et structurelle entre 2 fois leur masse en eau, jusqu’à 20 fois leur masse en eau. Les argiles ainsi gonflées forment un gel dont les feuillets plus ou moins gonflés et plus ou moins exfoliés intègrent la totalité du volume d’eau. Il n’est pas nécessaire de saturer la totalité de la capacité d’absorption de l’eau des argiles pour obtenir une dispersion satisfaisante de l’argile dans la phase lipidique, c’est pourquoi nous limitons l’apport d’eau à 300 % en poids par rapport à l’argile. À l’inverse il est nécessaire que les argiles soient un minimum imprégné d’eau pour favoriser leur dispersion. Les argiles exfoliables sont usuellement conservées à un taux d’humidité de 10 %. Il est indispensable de ne pas descendre sous le seuil des 5 % pour éviter l’effondrement des feuillets de phyllosilicate, conduisant à une structure qui perd sa capacité d’exfoliation.

[00120] Une teneur en eau insuffisante de l’eau de gonflement de la phase lipidique ne permet pas une bonne exfoliation des phyllosilicates.

[00121] Lorsqu’il y a une teneur en eau trop élevée, les feuillets d’argile sont plus faciles à exfolier mais ils sont imprégnés d’eau et ils ont moins de capacité pour adsorber les molécules de l’agent de dispersion amphiphile. Ils gardent leur caractère hydrophile.

[00122] De préférence, la teneur en eau est comprise entre 10 et 400 % et très préférentiellement entre 20 % et 200 % relativement au poids de phyllosilicates ou argiles de la phase lipidique. [00123] A l’étape (2) on utilise un agent de dispersion, tel que de la lécithine comme agent dispersant/exfo liant. Celle-ci va s’adsorber en surface des feuillets d’argile par interaction ionique entre les fonctions ammoniums et les groupes silanol des argiles. La lécithine ou Ge-polylysine est pré-dissoute dans l’eau de l’étape (1) pour faciliter son incorporation. La quantité de lécithine ou de e-polylysine peut varier entre un taux de couverture de la surface d’argile de 5 % à 100 %. Ce taux de couverture est calculé en fonction de la surface extérieure d’argile totale après l 'exfoliation, et le nombre de charges anioniques en surface des feuillets (usuellement il y a de l’ordre de cinq fonctions silanol par nanomètre au carré, 5/nm ² ) accessibles par les molécules de lécithine ou de e-polylysine (feuillets les plus gonflés (écartés par l’eau)). Il dépend donc de la surface spécifique de l’argile accessible par l’agent dispersant.

[00124] Il est par conséquent nécessaire de travailler sur différents taux d’agent de dispersion, selon les argiles utilisées, qui présenteront des quantités de silanols suffisamment accessibles aux molécules de lécithine. Il faut viser les taux de couverture optimal entre 20 % et 60 % des silanols de surface des particules selon la taille de particules et l’hydrophobation souhaitée. Ainsi différents types de particules pourront être préparées pour stabiliser les émulsions directes. [00125] La figure 3 présente schématiquement l’évolution de la teneur nécessaire en lécithine en poids relativement à la teneur en poids d’argile en fonction de la surface spécifique des argiles exfoliés pour plusieurs taux de couverture des silanols des feuillets d’argile par la lécithine.

[00126] Cette figure montre que la teneur en lécithine optimale pour obtenir une bonne exfoliation suivie d’une émulsification directe stable est comprise entre 13 % et 129 % en masse relativement à la masse de l’argile pour un taux de couverture de 20 % et respectivement une surface spécifique d’argile de 100 m ² /g et 1000 m ² /g. Pour un taux de couverture de 60 % la teneur en lécithine optimale est comprise entre 39 % et 387 % en masse relativement à la masse de l’argile et respectivement une surface spécifique d’argile de 100 m ² /g et 1000 m ² /g.

[00127] Lorsque la teneur en agent de dispersion tel que de la lécithine est insuffisante, le caractère hydrophobe des particules d’argile est insuffisant.

[00128] Lorsque la quantité d’agent de dispersion tel que de la lécithine permet de couvrir les silanols de surface des particules, on favorise la dispersion des argiles dans la phase lipidique. À des taux de couverture proche de 100 % on perd le caractère hydrophile des argiles, elles deviennent très stables en environnement lipidique, ce qui les rend moins susceptibles de migrer à l’interface eau-huile pour stabiliser l’émulsion. [00129] Il y a une compétition entre l’agent de dispersion tel que la lécithine et les molécules d’eau pour la physisorption à la surface des argiles, donc un excès d’agent de dispersion sera défavorable à la quantité d’eau adsorbable et par conséquence à la qualité de l’exfoliation des particules d’argiles en particules de taille nanométrique. [00130] Pour la bentonite utilisée, avec une surface spécifique de l’ordre de 300 m ² /g, on doit donc avoir une teneur optimale en lécithine de l’ordre de 30 à 130 % en poids relativement à la masse de l’argile avec un taux de couverture compris entre 20 et 60 % des silanols de surface de l’argile.

[00131] Une mesure de l’angle de contact entre une goutte d’eau pure et la surface des argiles à la fin de l’étape (2), c’est-à-dire avant d’ajouter les lipides (3) et l’énergie de cisaillement (4), permet de vérifier que la quantité d’agent de dispersion ou de surface est satisfaisante

[00132] A l’étape (3), on ajoute à la pâte obtenue à l’étape (2) les lipides de la phase lipidique de la nano-émulsion. La phase lipidique résultante est telle que le taux de phyllosilicates, c’est-à-dire le poids en phyllosilicates, est supérieur à 0,2 % en poids par rapport au poids de la phase lipidique et de préférence compris entre 0,2 % et 20 % en poids. Ces taux de phyllosilicates permettent d'obtenir aisément des émulsions directes à l'étape (6).

[00133] L’étape (4) peut être obtenue par un cisaillement appliqué en batch au moyen par exemple d’un Silverson (cisaillement rotor-stator), un traitement complémentaire par ultrasons ou à l’aide d’un homogénéisateur haute pression est aussi possible pour réduire la taille des particules.

[00134] À l’étape (5) on ajoute l’eau de la phase aqueuse. Avantageusement, cette phase aqueuse peut être complétée par un sel monovalent, avec une concentration entre 0 et 100 mM dans l’eau, avec avantageusement du NaCl à une concentration inférieure à 50 mM et très avantageusement de 25 mM.

[00135] À l’étape (6) l’apport d’énergie de cisaillement peut être réalisé avec un rotor/stator avec un entrefer de 150 micromètres et un mobile de 30 mm, à une vitesse de 2000 à 5000 rpm pendant 3 à 30 min, de préférence 4000 rpm pendant 5 min, encore plus préférentiellement à 4500 rpm pendant 4 min.

[00136] Afin de réduire les diamètres moyens des gouttes, à l’étape (7) des émulsions préformées ont été passées à travers un homogénéisateur haute pression (HP) (GEA Niro Soavi Panda Plus 2000, Italie) jusqu'à 5 fois à 1000 bar à température ambiante. L’homogénéisateur HP était équipé d’une soupape haute pression (soupape HP) et d’une soupape basse pression (soupape BP). Dans cette étude, la pression à la vanne BP a été ajustée à 100 bar et la vanne HP a été utilisée pour arriver à une pression de traitement de 1000 bar qui correspond à la somme des pressions aux deux vannes.

[00137] Par cisaillement d’une composition liquide, on entend l’application de forces de cisaillement dans un entrefer positionné entre un rotor et un stator. Cet entrefer peut être compris selon les équipements entre 0,1 mm et 2 mm. Cette force de cisaillement dans l’entrefer s’exprime sous forme d’un gradient de cisaillement, qui sera d’autant plus fort que la vitesse de rotation du rotor est élevée, que le diamètre du rotor est élevé, et que l’entrefer est faible. Dans des équipements du commerce, la vitesse du rotor peut varier entre quelques rpm jusqu’à 12000 rpm. Pour traduire les paramètres en valeur universelle utilisables sur tout type d’équipement, on détermine la vitesse à l’extrémité du rotor, qui doit être de l’ordre de 2,5 m/s, pour un entrefer de 150 μm sur l’équipement M5 de chez Silverson.

[00138] Il est important d’appliquer la bonne vitesse, pour apporter le bon niveau d’énergie qui permet de fracturer les gouttelettes d’émulsion à la bonne taille, alors que le temps de traitement permet d’obtenir une bonne homogénéité de traitement du volume à émulsionner. [00139] Une variation de la vitesse (gradient de cisaillement) permet de moduler la taille des émulsions, qui va varier entre 1 μm à 10 000 rpm, et 70 μm à 1 000 rpm. Le temps de traitement est déterminé pour cet équipement pour des volumes d’émulsions maximum de 3 L. Méthodes

Méthode 1 : Mesures de la taille de particules d’une dispersion aqueuse ou lipidique (DLS)

[00140] La taille des particules minérales obtenues dans un milieu aqueux ou lipidique est mesurée par diffusion dynamique de la lumière (en anglais Dynamic Light Scattering ou DLS). Les expériences ont été réalisées avec un instrument Malvem Nano ZS. Toutes les mesures ont été effectuées à une température de 20 °C avec un angle de détection de 173°. Le diamètre hydrodynamique a été obtenu à partir de l'analyse de la fonction de corrélation utilisant le logiciel Malvem DTS, et en faisant l’approximation d’une forme sphérique des particules ou amas de feuillets de phyllosilicates en prenant en compte les dimensions les plus importantes des particules. La viscosité de l’huile de tournesol est de 66 cSt.

[00141] L’échantillon testé est amené par dilution à une concentration de 0,1 % en poids de particules relativement au poids du médium (eau ou huile). 1 mn avant la mesure on agite l’échantillon testé avec un vortex.

[00142] Les figures 5 et 6a à 6d présentées donnent l’évolution du nombre de particules en fonction de leur taille en coordonnées semi-logarithmiques.

[00143] La figure 6 présente les tailles des particules de quatre phyllosilicates différents après dispersion et exfoliation dans de l’eau comme précédemment décrit.

[00144] Les concentrations de phyllosilicates sont de 5 % en poids relativement à l’ensemble de la composition lors de l’exfoliation et de 0,1 % lors de la mesure des tailles de particules.

[00145] La figure. 6(a) présente la courbe de tailles obtenue pour une bentonite du Wyoming. Le D50 est de : 255 nm.

[00146] La figure. 6(b) présente la courbe de tailles obtenue pour une argile verte surfine d’origine France, montmorillonite - illite. Le D50 est de : 295 nm.

[00147] La figure. 6(c) présente la courbe de tailles obtenue pour une bentonite de Lafaure. Le D50 est de : 295 nm.

[00148] La figure. 6(d) présente la courbe de tailles obtenue pour une bentonite de Smectagri. Le D50 est de : 712 nm.

[00149] Pour ces quatre figures nous avons l’axe des abscisses qui représente le diamètre des particules, alors que l’axe des ordonnées représente le pourcentage de la population en nombre des particules au diamètre considéré.

[00150] Dans les quatre essais, la taille D90 des particules est bien inférieure à 1 micromètre.

Méthode 2 : Mesure d’angles de contact

[00151] Une mesure de l’angle de contact entre une goutte d’eau pure et la surface des argiles à la fin de l’étape (2), c’est-à-dire avant d’ajouter les lipides (3) et l’énergie de cisaillement (4), permet de vérifier que la quantité d’agent de dispersion ou de surface est satisfaisante. Pour que les feuillets d’argile puissent remplir leur rôle de particules émulsifiantes minérales, il est nécessaire que l’angle de contact soit compris entre 35 et 45 degrés et de préférence entre 37 et 42 degrés. Au-delà et en deçà des valeurs indiquées, la stabilité des émulsions n’est pas suffisante. Un angle de contact inférieur à 30 degrés indique que la surface des argiles est trop hydrophile pour stabiliser les émulsions. Un angle supérieur à 50 degrés indique que la surface est trop hydrophobe pour stabiliser les émulsions.

[00152] Les argiles sont déposées en couche mince à l’aide d’une spatule sur un support solide plan. Afin de limiter les effets dus à l’irrégularité (rugosité) de la surface, des gouttes d’eau pure de 2 pL seulement sont déposées sur les argiles. Les images obtenues lors des dépôts permettent de plus de considérer que le mouillage obéit au modèle de Wenzel. Les rugosités des surfaces obtenues avec les différentes argiles pouvant être considérées comme relativement similaires, les angles de contact mesurés sont considérés comme représentatifs de la mouillabilité des argiles, même si les valeurs sont légèrement inférieures aux angles qui seraient obtenus sur les même surfaces à l’état lisse.

[00153] Lorsque l’état d’équilibre est atteint, la goutte déposée est observée à l’aide d’une caméra numérique à fort grossissement et l’équation de l’enveloppe de la goutte est obtenu par régression non linéaire en supposant que l’enveloppe de la goutte suit la forme d’une ellipse. L’angle de contact est obtenu par mesure de la pente de la tangente à l’enveloppe de la goutte au point d’intersection avec la droite parallèle au plan de la couche d’argile (voir figure 17).

[00154] Chaque liquide est déposé à 2 endroits différents de la couche d’argile, et l’angle de contact de chaque goutte est mesuré 3 fois. L’erreur absolue sur chaque mesure d’angle peut être estimée à +/- 2 degrés.

[00155] L’angle de contact mesuré est de 37 à 39 degrés. Ainsi, les particules d’argiles obtenues selon le procédé de l’invention conduiront à l’obtention de nano-émulsions stables. EXEMPLES

Exemple 1 : Test in vitro de l’activité d’huiles essentielles liées à des particules de phyllosilicates dans une dispersion aqueuse

[00156] Plusieurs essais ont été réalisés pour montrer l’intérêt des particules de phyllosilicates comme support des huiles essentielles et ainsi améliorer leur efficacité spécifique d’une part et illustrer l’obtention de gouttes lipidiques de taille appropriée d’autre part.

[00157] Le choix des microorganismes a été porté sur trois espèces bactériennes provoquant des pathologie fréquentes chez le poisson, plus spécifiquement la daurade (sparus aurata).

[00158] Ce sont des espèces qui provoquent des maladies induisant une mortalité massive dans la plupart des cultures de différentes espèces de poissons, Elles sont majoritairement gram négatif. Les microorganismes nous ont été fournis par l’institut Pasteur, sous forme de lyophilisât bactérien, avec les références suivantes : [00159] Vibrio alginolyticus CIP 103336T

[00160] Photobacterium damselae ssp. Piscicida CIP 104404T

[00161] Pseudomonas anguilliseptica CIP 106711T

[00162] En plus des souches étudiées, deux souches témoins ont été utilisées :

[00163] Escherichia coli, fournis par le laboratoire de microbiologie à Polytech Clermont Ferrand.

[00164] Staphylococcus aureus (Réf. : cip 53-156), fournis par le LMGE, Université Clermont Auvergne.

[00165] Le test de l’efficacité d’une composition selon l’invention, d’une huile essentielle, liée à des particules de bentonite a été réalisé par la méthode de l’aromatogramme.

[00166] C’est une méthode inspirée de l’antibiogramme qui permet de déterminer l’activité inhibitrice de croissance des huiles essentielles par la mesure du diamètre d’inhibition autour d’un puits central dans lequel sera introduit la dispersion contenant l’huile essentielle. Une suspension du germe considéré est préparée en eau distillée stérile et ajustée à par exemple 10 ⁸ bactéries/ml. Chaque suspension (100 mΐ) est étalée sur une boite de Pétri de 90 mm de diamètre comprenant un milieu nutritif pour les germes (gélose). On crée dans la gélose un puits de 6 mm de diamètre dans lequel on vient introduire une composition selon l’invention.

[00167] L’activité inhibitrice de croissance est déterminée par les diamètres d’inhibition autour des puits après 24 à 48 h.

[00168] La nano-dispersion aqueuse selon l’un des objets de l’invention est constituée de :

Eau distillée stérile : 10 g

Bentonite : 0,5 g - e-Polylysine : 1 ml de solution (à 0,36 g/l)

Huile essentielle : 50 mg.

[00169] L’ordre d’addition est respecté selon la composition ci-dessus, et chaque ingrédient est vigoureusement agité avant l’ajout de l’ingrédient suivant. Ainsi la bentonite est gonflée et exfoliée puis lie physiquement les molécules d’huile essentielle à la surface des particules via l’agent de dispersion. Ce protocole est celui précédemment décrit. L’ordre de grandeur de la taille D50 en nombre des particules de bentonite est de 300 nm.

[00170] Cela constitue une solution mère de dispersion d’huile essentielle supportée. Pour les essais on introduit 200 mΐ de cette dispersion d’huile essentielle à 4,55 mg/ml dans le puits de la boîte de Pétri, ce qui représente 0,9 lmg d’huile essentielle.

[00171] On effectue aussi un contrôle avec des antibiotiques : Chloromphenicol pour V. alginolyticus et P. anguilliseptica à des quantités de 30 pg et 8 pg respectivement dans le puits de la boite de Pétri, et Ciprofloxacin avec une quantité de 5 pg pour P. damselae spp. piscicida [00172] Le tableau suivant montre les diamètres d’inhibition moyens obtenus pour les huiles essentielles qui ont démontré une activité inhibitrice notable.

[00173] Les 7 huiles essentielles (HE), décrites dans le tableau ci-dessus, ont donné une signature d’inhibition significative de la croissance et commune pour les trois espèces étudiées. En ce qui concerne P. anguilliseptica, on observe plus de sensibilité vis-à-vis de la majorité des HE. Les sept HE les plus inhibitrices sont : Cannelle de Chine, Origan compact, Lemongrass, Palmarosa, Thym à Thymol et Sarriette des montagnes.

[00174] Ces résultats montrent tout l’intérêt de l’utilisation d’une nano-dispersion aqueuse selon l’un des objets de l’invention comportant des particules de phyllosilicates support d’huiles essentielles. [00175] Ces résultats permettent de déterminer les conditions optimales pour la préparation et l’obtention des nano-émulsions selon l’invention. Exemple 2 : Exfoliation de phyllosilicates dans de l’huile

[00176] Pour mesurer la taille des particules dans la phase lipidique d’une nanoémulsion, on a suivi le protocole de préparation d’une nano-émulsion en s’arrêtant à la fin de l’étape (4) d’apport d’une forte énergie de cisaillement. Puis on a prélevé des échantillons pour qualifier la taille des particules de phyllosilicate dispersées dans la phase lipidique.

[00177] La figure 5 présente le résultat de mesures de taille de particules de bentonite dispersées dans la phase lipidique pour deux concentrations de bentonite : 1 % et 10 %. A une concentration de 1 %, la distribution de tailles présente un maximum vers 1 micromètre. A une concentration de 10 %, le maximum s’est nettement décalé vers les petites tailles. Le nombre maximum de particules a une taille de l’ordre de 25 nanomètres. L’augmentation de concentration pour une énergie de cisaillement donnée entraîne une diminution de taille des particules (par friction entre les particules) qui traduit une amélioration de la dispersion. Exemple 3 : Préparation d’une émulsion nanométrique

[00178] Des émulsions directes ont été préparées en utilisant un rapport phase lipidique/phase aqueuse de 40/60. L’émulsification a été réalisée par apport d’énergie de cisaillement avec un dispositif rotor/stator avec un entrefer de 150 micromètres et un mobile de 30 mm, à 4500 rpm pendant 4 minutes. Les émulsions ainsi obtenues restent micrométriques, car l’énergie apportée est insuffisante. Pour réduire la taille, les émulsions ainsi obtenues sont ensuite cisaillées avec une énergie plus importante et plus efficace, avec un homogénéisateur haute pression ou un microfluidiseur.

[00179] La taille des gouttes ainsi obtenues est mesurée comme pour les particules par diffusion dynamique de la lumière (en anglais Dynamic Light Scattering ou DLS). La figure 7 montre le diamètre moyen des gouttes lipidiques de la phase dispersée. Le D50 est de 300 nanomètres.

[00180] Comme la taille des gouttes est directement liée à celle des particules, la taille de ces particules peut être estimée être de l’ordre de 50 nanomètres.

[00181] La figure 8 présente schématiquement l’émulsion 20 obtenue. [00182] On voit les particules lipidiques 28 dispersées dans une phase aqueuse 26. [00183] Les particules ou gouttes lipidiques, qui comportent une composition comme précédemment décrite sont stabilisées par les particules minérales de phyllosilicate dispersées. Ces particules de toute petite taille qui conservent un certain caractère hydrophile vont préférentiellement se disposer à l’interface eau/huile, c’est ce qui est représenté à la référence 24.

[00184] Ce produit lipidique est obtenu à partir d’une émulsion directe huile/eau obtenue par dispersion dans de l’eau d’une composition lipidique comme précédemment décrite. L’émulsion peut être concentrée par séparation de la phase aqueuse, cette séparation peut être réalisée par tout moyen, notamment par ultrafiltration.

[00185] Les émulsions nanométriques concentrées ainsi obtenues permettent de travailler sur des applications exigeantes sur la quantité d’eau apportée par l’émulsion, telles que les préparations par voie sèche d’aliments, les coating d’aliments secs. Les solutions concentrées permettent également de réduire les volumes et de concentrer les principes actifs, ce qui facilite la logistique des produits, et permet de travailler sur des applicatifs nécessitant des quantités et des concentrations de principe actifs plus importants.

[00186] Les émulsions nanométriques sont un excellent moyen de maximisation de statistique de rencontre entre les pathogènes et les principes actifs, car en diluant ces derniers dans une matrice lipidique et en les supportant sur les feuillets de phyllosilicates à l’interface, puis en réduisant la tailles des objets à l’échelle nanométrique, on multiplie par plusieurs ordres de grandeur le nombre particules pouvant interagir avec les pathogènes. En effet des émulsions de 20 microns (taille de gouttes usuellement obtenue avec un cisaillement rotor-stator), les gouttes embarquent environ un volume de 510 mht', alors qu’une goutte de 300 nm (taille obtenue après homogénéisation à haute pression) encapsulent un volume environ de 0,11 μm ³ . On en déduit que pour le même volume de phase lipidique dispersée nous avons de l’ordre de 4640 fois plus de particules en suspension. C’est ce nombre important de gouttes qui favorise la statistique de rencontre entre les pathogènes et les principes actifs contenus dans les dispersions nanométriques et rend plus efficace (à la même concentration de principe actif soit 5 à 50 mg HE /ml de phase lipidique) les traitements contre les pathogènes dans des environnements exigeants. Par exemple nous pouvons citer la décontamination des bassins de production des zooplanctons tels que les Rotifers, les Copepodes ou les Artémias, qui produisent des quantités importantes de pathogènes, en particulier la Vibrio. Aujourd’hui les élevages d’Artémia sont lavés à l’eau douce, puis au peroxyde d’hydrogène, ce qui est un traitement très agressif pour ce zooplancton.