VENEGAS FAUNDEZ FELIPE (CL)
MONRÁS CHARLES JUAN PABLO (CL)
US20110260109A1 | 2011-10-27 |
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REIVINDICACIONES 1) Método para la síntesis de nanopartículas (NPs) semiconductoras, fluorescentes de sulfuro de cadmio (CdS) CARACTERIZADO porque comprende: a) Mezclar: i. Un tiol como fuente de azufre y como compuesto de envoltura; ii. Una sal de cadmio; iii. Un compuesto que contenga o genere una fuente de fosfato; b) Agregar una solución tampón a la mezcla obtenida en la etapa (a), a un pH entre 7 - 10, en presencia o ausencia de oxígeno y a una temperatura entre 15 - 80°C; c) Incubar la solución obtenida en (b) a una temperatura entre 15 - 80°C, durante un período de tiempo de incubación de 1 - 9 días, hasta obtener fluorescencia; d) Evaluar la fluorescencia de las NPs de CdS, exponiéndolas a un transiluminador UV (a 365 nm). 2) Método de acuerdo a la reivindicación 1 CARACTERIZADO porque el tiol como fuente de azufre y como compuesto de envoltura, corresponde a glutatión (GSH), cisteína (CYS) y ácido mercaptosuccínico (MSA). 3) Método de acuerdo a la reivindicación 2 CARACTERIZADO porque la concentración del compuesto de tiol se encuentra entre 0,25 y 15 mM. 4) Método de acuerdo a las reivindicaciones anteriores CARACTERIZADO porque la sal de cadmio puede ser seleccionada entre CdCI2, Cd(NO3)2 x 4H2O y Cd(CH3COO)2 x 2H2O. 5) Método de acuerdo a la reivindicación 4 CARACTERIZADO porque la sal de cadmio corresponde preferentemente a una solución de cloruro de cadmio a una concentración de 30-300 μΜ. 6) Método de acuerdo a las reivindicacionesanteriores CARACTERIZADO porque el compuesto dador de fosfato puede corresponder a fosfato inorgánico en forma de K2HPO4, y moléculas fosforiladas tales como glucosa-6-fosfato (G6P), glicerol- 2-fosfato (G2P), fructosa-1 ,6-bisfosfato (F1.6BP), adenosina monofosfato (AMP), adenosina difosfato (ADP) y/o adenosina trifosfato (ATP), entre otras. 7) Método de acuerdo a la reivindicación 6 CARACTERIZADO porque el compuesto dador de fosfato se encuentra en una concentración entre 10 μΜ - 100 mM. 8) Método de acuerdo a la reivindicación 7 CARACTERIZADO porque el compuesto dador de fosfato, preferentemente tiene una concentración de 10 mM. 9) Método de acuerdo a las reivindicaciones anteriores CARACTERIZADO porque la solución tampón puede corresponder a tampón fosfato salino: KH2PO4/K2HPO4 (PBS), ácido 3-(N- morfolino) propanosulfónico (MOPS), ácido (4-(2-hidroxietil)-1- piperazinetanosulfónico(HEPES), Tris-HCI o citrato de sodio. 10) Método de acuerdo a la reivindicación 9 CARACTERIZADO porque la solución tampón se encuentra en una concentración entre 1 y 100 mM. 11 ) Método de acuerdo a la reivindicación 10 CARACTERIZADO porque la solución tampón, preferentemente tiene una concentración de 10 mM. 12) Método de acuerdo a las reivindicaciones anteriores CARACTERIZADO porque la temperatura de incubación preferida es de 37°C. 13) Método de acuerdo a la reivindicación 1 CARACTERIZADO porque antes de la etapa (d), se filtra la solución obtenida en la etapa (c) de incubación, para eliminar los reactivos que no reaccionaron durante la etapa (c). 14) Método de acuerdo a la reivindicación 13 CARACTERIZADO porque luego de la etapa de filtración, las NPs de CdS también se concentran y se lavan. 15) Método de acuerdo a la reivindicación 14 CARACTERIZADO porque la etapa de concentración se lleva a cabo a través de una centrifugación a 7000 G, durante 30 minutos. 16) Nanopartículas semiconductoras, fluorescentes de CdS, obtenidas mediante el método de las reivindicaciones anteriores CARACTERIZADAS porque al ser excitadas a 350 nm presentan un espectro de absorción con picos de absorción a 380 y 360 nm (patrón espectroscopia de absorción), al ser excitadas a 350 nm mediante fotoluminiscencia presentan picos a 550 nm y 560 nm (espectroscopia fluorescencia), y de acuerdo microscopía electrónica de transmisión tienen un tamaño de entre 5-12 nm. 17) Uso de NPs semiconductoras fluorescentes de CdSde acuerdo a la reivindicación 16 CARACTERIZADO porque sirven para la detección y monitoreo de receptores, proteínas, enzimas y estructuras celulares en cultivo celular de forma in vitro; en el mareaje y monitoreo de receptores, proteínas, enzimas estructuras celulares de forma in vivo; sondas de detección imagenología y dispositivos fotovoltaicos. |
CADMIO.
La presente invención se refiere a un método de producción en medio acuoso de nanopartículas (en adelante.NPs) semiconductoras y fluorescentes (denominadas quantum dots, en adelante QDs) de sulfuro de cadmio (CdS), utilizando moléculas fosforiladas en el proceso de síntesis. Dicho método permitiría generar NPsútiles en el monitoreo y mareaje in vivo de moléculas fosforiladas al interior de una célula, permitiendo localizar receptores, enzimas y moléculas que presenten en su estructura o que metabolicen moléculas fosforiladas o grupos fosfato.
El método propuesto permite producir NPs semiconductoras y fluorescentes, del tipo, QDs de CdS, mediante una metodología que incluye adicionar una sal inorgánica que contenga Cd.la adición de moléculas fosforiladas como dador degrupos fosfatos, y la adición de tioles. En particular, elmétodo propuesto comprende mezclar un tiol como fuente de azufre y como agente de envoltura, adicionar cloruro de cadmio, e incluir un compuesto que contenga fosfato inorgánico (P¡). La regulación de las concentraciones y proporciones de los reactivos permite controlar el tipo de fluorescencia (color) y el tamaño de las NPs de CdS. El objetivo de la adición de un compuesto dador de grupos fosfato dentro de la reacción, es favorecer la formación de QDs de CdSa bajas temperaturas (entre 15 y 80 °C) y en un menor tiempo, pues el fosfato es la base de la síntesis ya que es el elemento iniciador de la nucleación de los cristales de CdS. En este sentido, también es posible desarrollar la síntesis utilizando moléculas fosforiladas encontradas en organismos biológicos como por ejemplo, pero sin limitarse, glucosa-6-fosfato, glicerol-2-fosfato, fructosa-1 ,6-bisfosfato, adenosínamonofosfato, entre otros.
Las NPs de CdS producidas mediante el método de la presente invención, presentan ventajosas características: son semiconductoras,
i fluorescentes y biocompatibles. El método descrito corresponde a una metodología sencilla y eficiente, pues en primer lugar se utiliza una menor concentración y por tanto una menor cantidad de ciertos reactivos, como por ejemplo la sal CdCI 2 . En segundo lugar, la presencia de fosfato dentro del procedimiento de síntesis favorece la reacción de formación de los QDs de CdS permitiendo que la síntesis ocurra en un menor período de tiempo y temperaturas menores a otros métodos descritos. Esto último, provoca que el método sea más sencillo, evitando complicaciones intrínsecas relacionadas con el trabajo a altas temperaturas tales como la posible descomposición de algunos reactivos, y más importante aún, evitando posibles accidentes del usuario, además prescindiendo de atmosferas inertes como Ar o N 2 . El hecho de que el método pueda ser llevado a cabo a bajas temperaturas, gracias a la presencia de fosfato, permite prescindir de maquinaria y equipos de incubación a altas temperaturas.
Otra importante ventaja del método de la presente invención son las potenciales aplicaciones de los QDs generados. Los QDs de CdS producidos mediante este método presentan en su cubierta grupos tiol y fosfato, lo que les confiere mayor solubilidad, y por tanto, les otorga beneficios en cuanto a su utilización in vivo si es que se quisieran incorporar los QDs al interior de células u organismos. Adicionalmente, al poder incorporar dentro del proceso sintético intermediarios fosforilados, pueden eventualmente las NPs ser direccionadas a un receptor celular en particular para marcar células, e incluso, permitir visualizar la cantidad de estos receptores mediante microscopía de fluorescencia (excitando los QDs). Otra posible aplicación de los QDs de CdS producidos mediante el método divulgado, es su uso en la localización de enzimas capaces de reconocer sustratos fosforilados, pues los QDspodrían unirse a este tipo de enzima, y ser monitoreadas de forma/n vivo dentro de una célula. También los QDs producidos por este método podrían ser utilizados en celdas solares sensibilizadas por QDs (QDSSC).
Antecedentes del Estado del Arte:
Se han descrito con anterioridad métodos para la síntesis de QDs de Cdque involucren dentro de la metodología la adición de un compuesto parte de la envoltura del QDspara estabilizar la síntesis y aumentar su biocompatibilidad. Sin embargo, no existen antecedentes previos deun método realizado a temperatura ambiente para generar QDs de CdS que utilicen dentro de la síntesis moléculas de fosfato para favorecer la eficacia de reacción en estas condiciones de temperatura. Adicionalmente, no existe un método que permita producir QDs de CdS que incorporen en su cubierta grupos tiol y fosfato para aumentar su biocompatibilidad e interacción con células, lo que favorece sus potenciales aplicaciones ya sea en cultivo celular {in vitro), en mareaje in vivo, entre muchas otras aplicaciones.
A continuación, se presentan algunas invenciones e investigaciones relacionadas con métodos de síntesis de QDs de Cd:
El documento WO 2012090161 A1 se refiere a un método para la síntesis de QDs de CdTe-GSH en un medio acuoso. El método comprende los pasos: a) preparar una solución precursora de cadmio en una solución tampón de citrato, b) adicionar GSH a la mezcla preexistente aplicando agitación, c) adicionar a la mezcla anterior un oxianión de teluro (teluro de potasio o de sodio) como dador de teluro, d) esperar que la mezcla reaccione, e) detener la reacción incubándola a baja temperatura. El precursor de cadmio corresponde a una sal soluble de cadmio (CdCI 2 , CdSO4 o Cd(CH3CO2)2) y la solución tampón puede corresponder a una solución tampón de citrato, fosfato, Tris-HCI y medios de cultivo de microorganismos como LB (triptona, NaCI y extracto de levadura) o M9 (Na 2 HPO 4 , KH 2 PO4, NaCly NH 4 CI). La temperatura de reacción es de 37- 130°C. Este documento apunta a la síntesis de QDs de CdTe con una cubierta de GSH como agente capeador, y no hace referencia a la síntesis de CdS. Cabe destacar, que la metodología propuesta en la presente solicitud presenta nuevas características respecto a lo reportado en WO 2012090161 como lo son: utilizar concentraciones de una sal de cadmio en el orden micromolar lo que resulta en un método más económico y menos tóxico, el tiempo de obtención de los QDs a bajas temperaturas es más rápido obteniéndose NPs en días, siendo que el tiempo de síntesis del arte previo es del rango de semanas. Más aun, la principal diferencia es que en la metodología de la presente invención se utiliza fosfato para la síntesis, no así en el caso del documento. Esto es una diferencia fundamental relacionada con el tipo de NP formada y el mecanismo de síntesis química involucrada, además de las características finales de biocompatibilidad y toxicidad que presentara el QDs final. Esta característica no es posible desprenderla del arte del estado previo, pues no es evidente adicionar moléculas fosforiladas en el proceso de síntesis para permitir quela reacción se realice a bajas temperaturas de forma eficiente.
El documento US 8491818 B2 presenta entre los alcances de la invención la preparación acuosa de QDs de CdS. La metodología propuesta en este documento consiste básicamente en hacer reaccionar una solución acuosa de Cd(NO3) 2 Con MSA (ácido mercaptosuccínico), en agitación, y adicionar NH 4 OH para ajusfar a un pH cercano a 7-9. Posteriormente, se adiciona una cantidad determinada de solución acuosa de Na 2 S en agitación durante 3-5 min. Toda la reacción se realiza en un ambiente libre de oxígeno. Tras esto la suspensión es ultrasonicada y filtrada, para ser incubada a 0°C y luego almacenada a 4°C. Si bien, el alcance de la invención incluye la síntesis de QDs de CdS, en la metodología no se establece el uso de fosfato inorgánico o moléculas que presenten grupos fosfato. Lo único similar con este método podría surgir de la idea de utilizar tioles como agentes de cubierta, sin embargo, en la presente invención el compuesto de tiol además de utilizarse como agentede cubierta, también se utiliza como fuente del sulfuro necesario para formar las NPs de CdS.
En CN103215042Ase divulga un método de síntesis de QDs de CdSe en fase acuosa, el que de forma general comprende mezclar CdC , selenito de sodio y MSA (ácido mercaptosuccínico), adicionar una solución tampón, agitar, ajustar pH a 5, luego adicionar NaBH 4 , calentar a una temperatura de 60°C, y dejar reaccionar por una hora. Los QDs resultantes corresponden a QDs del tipo MSA-CdSe. A pesar de que en esta invención la metodología incluye el uso de un agente estabilizador o de cubierta derivado de un compuesto que contenga grupos tiol en su estructura, no se hace referencia a la adición de un compuesto que aporte grupos fosfato en la reacción para obtener QDs con una capa externa de tiol y fosfato que le otorga nuevas propiedades. Adicionalmente, en este documento se sintetizan NPs de CdSe y no CdS.
En el documento WO 2013019090 A1 se divulga una composición que incluye NPs hidrofílicas que tienen adherido a su superficie monosacáridos-fosfato o un derivado de estos, una solución coloidal de la composición, y un agente de contraste de RMI (resonancia magnética de imagen) que incluye la solución colodial. Específicamente, se divulgan NPs hidrofílicas que presentan una superficie modificada por adición de moléculas de monosacáridos-fosfato o derivados de estos en la superficie de partículas inorgánicas. Las NPs corresponden a partículas inorgánicas que pueden ser del tipo metal, metal calcogénico, óxido metálico, materiales magnéticos, aleaciones magnéticas, materiales semiconductores y estructuras híbridas, sin hacer referencia a NPs conformadas por cadmio. Si bien, las NPs generadas a partir del método descrito en WO 2013019090 presentan grupos fosfato en su cubierta, la metodología de síntesis es diferente a la propuesta en la presente invención. Así, en WO 2013019090 A1 la preparación de las NPsse realiza de forma separada de la unión de moléculas azúcar-fosfato, sin ser la adición de una molécula dadora de grupos fosfato un componente importante en la reacción de síntesis. En el método aquí propuesto, la adición de fosfato como parte del procedimiento de síntesis, favorece la eficacia de reacción, y permite que ésta pueda ser llevada a cabo a temperatura ambiente y en presencia de oxígeno, teniendo la adición de fosfato un propósito totalmente diferente.
Existen diversos artículos de divulgación científica que se refieren a la síntesis de QDs de Cd que comprende un agente de cubierta o molécula del tipo tiol como envoltura. Así, en el documento científico "Synthesis of GlutathioneCoatedQDs" (referencia) se presentan los tipos de QDs más utilizados, sus metodologías de preparación, y principalmente, la estrategia metodológica de adición de un agente de cubierta como GSH a los QDs.De forma específica, en el punto 4.1.3 se reseña lo establecido en el estado del arte acerca de NPs de CdS-GSH, describiéndose la preparación de NPs de CdS a partir de precursores como CdC y su reacción con diferentes agentes como CH 3 CSNH 2 a temperatura ambiente y la adición final de una solución de GSH (Liangef al. 2010). En este artículo de revisión se indica que en el estudio de Thangaduraí y colaboradores se prepararon NPs de CdS con un compuesto de envoltura del tipo tiol. En este trabajo se probaron las moléculas 1 ,4-ditiotreitol (DTT), 2-mercaptoetanol, CYS, metionina y GSH (Thangaduraí et al. 2008). El agente de cubierta se adicionó en forma de solución acuosa a una solución acuosa de Cd(NO 3 ) 2 . El trabajo concluye que el mejor compuesto para conformar la envoltura de la NPses GSH. Sin embargo, no se hace referencia a la adición de fosfato inorgánico o moléculas que comprendan grupos fosfato para mejorar la eficiencia de síntesis. En el documento científico "Surface modification of CdS QDs using thiols— structural and photophysical studies" (Thangadurai P.ef al, 2008a) se presenta un estudio de las características estructurales, térmicas y de emisión de diferentes tipos de tioles orgánicos para QDs de CdS. Se evaluaron 5 tioles orgánicos como cubierta de QDs de CdS: (i) 1 ,4- ditiotreitol (DTT), (¡i) 2-mercaptoetanol (ME), (iii) CYS, (iv) metionina, and (v) GSH. Al comparar QDs sin cubierta de tipo tiol y QDs con tioles en la superficie, la presencia de moléculas tipo cubierta en la estructura de los QDs le confieren un mayor tamaño y por ende una mayor superficie de contacto a los QDs, y mejora sus propiedades fluorescentes. Nuevamente, este tipo de documento no se refiere a la adición de moléculas fosforiladas o fosfato inorgánico como parte de la mezcla de reacción con el objetivo de aumentar la eficiencia de la síntesis.
Adicionalmente, en el artículo de divulgación científica "Synthesis of glutathione-capped CdS QDs and preliminary studies on protein detection and cell fluorescence image" (Jiang C. et al, 2007) se presenta una metodología de preparación de QDs de CdS-GSH. En términos generales, el protocolo de producción de los QDsCdS-GSH descrito incluye mezclar una solución de CdCI 2 con agua y ajustar el pH a 10,2, saturar con burbujas de N 2 por cerca de 20 min y luego adicionar GSH (relación Cd:GSH de 1 :1 ) a la solución de CdCI 2 , y mantener agitación y calor constante bajo en una atmósfera de N 2 durante 10 min.
La metodología descrita en los artículos científicos citados difiere del método aquí propuesto puesto que dentro de la reacción de síntesis no se incluye como reactivo una molécula dadora de grupos fosfato. La adición de este tipo de reactivo considera una propuesta con características anteriormente no descritas, pues permite la producción de QDs a bajas temperaturas (incluyendo temperatura ambiente) y la posibilidad de realizar la síntesis en presencia de oxígeno. Por tanto el método aquí propuesto se basa en el uso del fosfato para la formación de la nanoestructura.
Otros documentos como el artículo de divulgación científica "Low temperature synthesis of ZnS and CdZnS shells on CdSe quantum dots" (Zhu H. et al, 2010) describen protocolos en los que se adicionan compuestos inorgánicos que presentan átomos de fósforo en su estructura. En este documento se presenta un método para sintetizar QDs de ZnS, CdZnS yCdSe a temperaturas de entre 65°C y 180°C. Se destaca el uso de pequeñas cantidades de trioctilfosfina y óxido de trioctilfosfina en las soluciones precursoras, y en el cual se utiliza tiourea como fuente de azufre (grupos sulfuro). El método se presenta como un protocolo general para estructuras CdZnS mediante la mezcla de cadmio y acetato de zinc como precursores. La invención descrita en este documento apunta a la formación de QDs mediante una síntesis química a la que se le adicionan compuestos que contienen fósforo pero que no consideran la liberación o formación de grupos fosfato como parte de la envoltura de la NP, ni menos como un agente potenciador de la reacción.
En conclusión, características del método propuesto, tales como, realizar la síntesis a temperatura ambiente, en presencia de oxígeno y en menor tiempo para producir QDs de CdSle confiere a la metodología características no descritas anteriormente. De forma particular, las NPs producidas mediante este método presentan características únicas en cuanto a su solubilidad y biodisponibilidad, lo que permite su uso en el monitoreo in vivo de marcadores celulares, teniendo un potencial uso en el área de la medicina y de la investigación.
Descripción de las figuras:
Figura 1 : Efecto de fosfato, cadmio y la temperatura en la síntesis in vitro de QDs de CdS. A) Las soluciones contenían P¡ (fosfato inorgánico) 10 mM, CdCI 2 54,5 μΜ y GSH 5 mM y fueron incubadas a 37 °C de 1 a 4 días.
B) Las soluciones contenían P¡: 0; 7,5; 10; 20 y 75 mM; CdCI 2 150 μΜ más MSA 5 mM y fueron incubadas a 37 °C por 6 días.
C) Las soluciones contenían P¡ 10 mM, CdCI 2 30, 150 y 300 μΜ y MSA 5 mM. El tiempo de incubación va desde 1 a 6 días para 37 °C, y de 0,5; 1 ,0; 1 ,5; 2,0; 2,5; 3 y 4 h para 80°C.
En A), B) y C) las muestras contienen 1 mL de volumen final y fueron expuestas a un transiluminador UV (a 365 nm).
Figura 2: Caracterización de las NPs producidas in vitro.
A y B) Espectros de absorbancia y fluorescencia (excitación a 350 nm) de NPs azules (línea continua) y NPs naranja (línea discontinua).
C y D) Determinación del tamaño de NPs azules y naranjas mediante DLS.
E y F) TEM de NPs naranjas.
E) Visión general de la solución de NPs donde se observa aglomerados nanométricos y
F) NPs individuales a una mayor magnificación de la imagen. Las reglas son de 100 y 20 nm, respectivamente.
Figura 3: Espectro FTIR de NPs sintetizadas in vitro.
De arriba abajo se registra el espectro FTIR de P¡, MSA y NPs (naranjas) respectivamente. Las señales características de cada compuesto han sido registradas en las gráficas en magnitudes en cm "1 .
Figura 4: Síntesis de QDs de sulfuro de cadmio utilizando moléculas orgánicas fosforiladas. Se evaluó la síntesis de QDs utilizando diferentes moléculas fosforiladas como fuente de fosfato: adenosintrifosfato (ATP), adenosindifosfato (ADP), adenosinmonofosfato (AMP), Fructosa 1 ,6 bifosfato (F1 ,6 BP), glucosa-2-fosfato (G2P), glucosa-6-fosfato (G6P).
En A) se observan los resultados de la síntesis de QDs con las diferentes fuentes de fosfato entre 1 y 12 días de incubación.
En B) se presentan los espectros de absorbancia (arriba) y fluorescencia (abajo) de NPs verdes purificadas de una reacción entre MSA (5 mM), CdCI 2 (54,5 μΜ) y G6P (10 mM).
En C) se presenta el espectro FTIR de G6P (control) y las NPs verdes sintetizadas con G6P.
Descripción de la invención:
La presente invención se refiere a un método de síntesis de NPs semiconductoras fluorescentes (QDs) de CdS.
El método propuesto consiste en la producción de QDs de CdS mediante un procedimiento en el que se utilizan moléculas fosforiladas como fuente de fosfato, el cual se lleva a cabo en un medio acuoso, en presencia de oxígeno, a temperatura ambiente, y más particularmente, a temperaturas entre 15 y 80 °C.
El método propuesto comprende los pasos de: a) Mezclar: i. Un tiol como fuente de azufre y como compuesto de envoltura; ii. Una sal de cadmio; iii. Un compuesto que contenga o genere una fuente de fosfato; b) Agregar una solución tampón a la mezcla obtenida en la etapa (a), a un pH entre 7-10, en presencia o ausencia de oxígeno y a una temperatura entre 15 - 80°C; c) Incubar la solución obtenida en (b) a una temperatura entre 15 - 80°C, durante un período de tiempo de incubación de 1 - 9 días, hasta obtener fluorescencia. d) Evaluar la fluorescencia de las NPs de CdS, exponiéndolas a un transiluminador UV (a 365 nm).
La regulación de las concentraciones y proporciones de los reactivos permite controlar el tipo de fluorescencia (color) y el tamaño de las NPs de CdS.
La mezcla de reacción es llevada a cabo en un ambiente acuoso a un pH entre 7-10 gracias a la adición de una solución tampón que permita mantener este pH, en presencia o ausencia de oxígeno y a bajas temperaturas. En el método se pueden utilizar diferentes soluciones tampón, utilizadas comúnmente en Biología Molecular y Bioquímica, a una concentración de 1 a 100 mM, los que poseen un pH celular de 7,4, dentro de los cuales se pueden citar:
> PBS (tampón fosfato salino: KH2PO4/K2HPO4).
> Ácido 3-(N-morfolino) propanosulfónico (MOPS,C 7 Hi 5 N0 4 S).
> Ácido (4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetanosulfónico (HEPES,
> Tris-HCI (Tris: (HOCH 2 ) 3 CNH 2 ).
> Citrato de sodio (Na3C 3 H 5 0(COO)3). El tampón preferido corresponde al tampón PBS a una concentración de entre 1 a 100 mM, preferentemente 10 mM, pues es el que mostró mejores resultados (datos no mostrados).
La mezcla de reacción comprende: i. Un tiol como fuente de azufre y como compuesto de envoltura de los QDs, en rangos de concentración entre 0,25-15 mM, tales como:
> Glutatión (GSH: C 10 H 17 N3O 6 S).
> Cisteína (CYS: C 3 H 7 N0 2 S).
> Ácido mercaptosuccinico (MSA: C 4 H 6 0 4 S).
ii. Una sal de cadmio a una concentración de 30-300 μΜ tales como:
> CdCI 2 .
Cd(N0 3 ) 2 x 4H 2 0.
Cd(CH 3 COO) 2 x 2H 2 0.
iii. Y un compuesto o molécula fosforilada como fuente de fosfato a concentraciones entre 10 μΜ y 100 mM, tales como:
> Fosfato inorgánico en forma de K 2 HP0 .
> Glucosa-6-fosfato (G6P).
> Glicerol-2-fosfato (G2P).
> Fructosa-1 ,6-bisfosfato (F1.6BP).
> Adenosina monofosfato (AMP).
> Adenosina difosfato (ADP).
> Adenosina trifosfato (ATP).
En una forma preferida de la invención, la mezcla de reacción comprende la mezcla de una solución tampón de PBS a una concentración de 10 mM con una solución de CdCI 2 a una concentración de 54,5 μΜ, una solución de MSA a una concentración de 5 mM y una solución de glucosa-6-fosfato a una concentración de 10 mM. La mezcla es incubada a 37°C durante 1-9 días para evaluar su fluorescencia al ser expuestas a un transiluminador UV (a 365 nm).
Preferentemente luego de la incubación, para eliminar los reactivos que no reaccionaron durante la incubación (excedentes) y también a modo de enriquecer en NPs las mezclas de reacción, se filtra la mezcla de reacción en filtros Amicon con un tamaño de poro de 3 kDa (0,3-0,5 nm) y se centrifuga en un rango de 3000 y 10000 G (preferentemente a 7000 G) hasta obtener una solución concentrada en NPs, preferentemente durante 30 minutos, o más dependiendo del volumen inicial de reacción. Las soluciones concentradas son lavadas con agua destilada miliQ mediante el mismo procedimiento de centrifugación en los tubos Amicon.
En la presente invención, tiol se refiere sin limitarse a GSH, MSA, CYS, entre otros. El compuesto tiol corresponde a la fuente de azufre para la formación de los QDs de CdS, y también es parte de la cubierta que envuelve a las NPs. El método funciona utilizando otros tioles tales como: ditiotreitol, ácido tioglicólico, entre otros, a diferentes temperaturas de funcionamiento y con un rendimiento de producción variable.
Cuando se refiere a moléculas fosforiladas corresponde a moléculas que contengan al menos un grupo fosfato en su estructura, pudiendo ser, sin limitarse, moléculas fosforiladas como; glucosa-6- fosfato, glicerol-2-fosfato, fructosa-1 ,6-bisfosfato, adenosina monofosfato, adenosina difosfato, adenosina trifosfato, entre otros.
En la presente invención, la metodología propuesta permite sintetizar QDs de CdS de forma más eficiente, en presencia de oxígeno y en condiciones de bajas temperaturas. Cuando se refiere a bajas temperaturas corresponden a temperaturas de entre 15 y 80°C. Más particularmente, se refiere a temperaturasmenores a 65°C. De forma preferente, la temperatura de realización de la metodología es de 37°C. Los quantum dots de CdS generados a partir del método presentado tienen características particulares respecto a otras nanopartículas. Para dos muestras (azul y naranja), al ser caracterizadas mediante espectroscopia de absorción y excitadas a una longitud de onda de 350 nm presentan un espectro con picos de absorción a 380 y 360 nm; al ser caracterizadas mediante espectroscopia de fluorescencia y ser excitadas a 350 nm presentan un patrón con picos a los 450 y 560 nm; y presentan un tamaño de entre 5-12 nm de acuerdo a análisis de técnicas demicroscopía electrónica de transmisión (TEM) y dispersión dinámica de la luz (DLS).
Mediante técnicas de microscopía de alta resolución se determinó que los QDs producidos están compuestos por cadmio, azufre, moléculas orgánicas correspondientes a la cubierta de tioles pero además a moléculas de fosfato en su superficie. La difracción de rayos X confirmó que correspondían a cristales de sulfuro de cadmio.
Los QDs de CdS sintetizados a partir delmétodo de la invención, presentan importantes características ventajosas y potenciales utilidades. Debido a su cubierta compuesta por moléculas del tipo tiol y grupos fosfato, estos QDs son biocompatibles. Esto último permite la inclusión de los QDs de CdS en células, pudiendo ser monitoreadas de acuerdo a la afinidad en interacción de los grupos fosforilados y grupos fosfatos con ciertos receptores y enzimas celulares.
Gracias a las características descritas, es posible realizar el monitoreo de la fluorescencia de los QDs en sistemas biológicos. De esta forma, los QDs sintetizados pueden ser utilizados en la detección y el monitoreo de receptores, proteínas, enzimas y estructuras celulares en cultivo celular de forma in vitro, también en el mareaje y monitoreo de receptores, proteínas, enzimas y estructuras celulares de forma in vivo y como sondas de detección en imagenología. Ejemplos:
Ejemplo 1 : Procedimiento de preparación de QDs de sulfuro de cadmio in vitro y evaluación de las concentraciones de Pi y CdCI^ y temperaturas de incubación en la eficiencia de síntesis:
En este ejemplo se describe la metodología de preparación de QDs de CdS y la evaluación de distintas concentraciones de los componentes fosfato inorgánico y CdCI 2 en la mezcla de reacción. Adicionalmente, se determinaron las temperaturas de incubación más eficientes para el método.
El procedimiento de síntesis de Quantum dots de CdS propuesto presenta las siguientes etapas: a) Mezclar: i. Un tiol como fuente de azufre y como compuesto de envoltura; ii. Una sal de cadmio; iii. Un compuesto que contenga o genere una fuente de fosfato; b) Agregar una solución tampón a la mezcla obtenida en la etapa (a), a un pH entre 7-10, en presencia de oxígeno y a una temperatura entre 15 - 80°C; c) Incubar la solución obtenida en (b) a una temperatura entre 15 - 80°C, durante un período de tiempo de incubación de 1 - 9 días, si se utiliza una temperatura de 80 °C la reacción ocurre en horas, hasta obtener fluorescencia. d) Evaluar la fluorescencia de las NPs de CdS, exponiéndolas a un transiluminador UV (a 365 nm). Posteriormente, para eliminar los reactivos que no reaccionaron durante la incubación (excedentes) y a modo de enriquecer en NPs las mezclas de reacción, se filtró la mezcla de reacción en filtros Amicon con un tamaño de poro de 3 kDa (0,3-0,5 nm) y se centrifugó a 7000 G hasta obtener una solución concentrada en 200 μΙ_. Las soluciones concentradas fueron lavadas con agua destilada miliQ mediante el mismo procedimiento de centrifugación en los tubos Amicon.
Los componentes principales en la metodología de síntesis propuesta son el fosfato inorgánico y la sal de cadmio. Para determinar las mejores condiciones de síntesis de los QDs de CdS se evaluaron distintas concentraciones de fosfato inorgánico y CdC como sal de cadmio.
Para esto, se utilizó fosfato inorgánico (Pi) en forma de K 2 HP0 4 , ácido mercaptosuccinico como fuente de tiol pues es el tiol de mayor rapidez en aparición de fluorescencia y menor precipitación (datos no mostrados), y se varió tanto la concentración de P¡ como la de Cd y la temperatura de síntesis.
Entonces, se evaluaron soluciones que contenían:
> P¡ a una concentración de 10 mM, CdCI 2 a una concentración de 54,5 μΜ y MSA a una concentración de 5 mM, las que fueron incubadas a una temperatura de 37 °C durante un período de 1 a 4 días.
> P¡ a distintas concentraciones: 0; 7,5; 10; 20 y 75 mM; CdCI 2 a una concentración de 54,5 μΜ y MSA a una concentración de 5 mM, las que fueron incubadas a una temperatura de 37 °C durante un período de 6 días.
> P¡ a una concentración de 10 mM, CdCI 2 a una concentración de 30, 50 y 150 μΜ y MSA a una concentración de 5 mM. El período de incubación va desde 1 a 6 días para una temperatura de 37 °C, y de 0,5; 1 ,0; 1 ,5; 2,0; 2,5; 3 y 4 h para una temperatura de 80 °C.
Las muestras contienen 1 ml_ de volumen final y fueron expuestas a un transiluminador UV (a 365 nm).
A partir de esto, se determinó que el P¡ es capaz de generar soluciones que cambian de color de fluorescencia en el tiempo (Fig. 1A), y que la concentración de P¡ regula el color de fluorescencia obtenido a un tiempo fijo (en concentraciones mM) (Fig. B). Por otra parte, la cantidad de Cd agregado también regula el color de fluorescencia obtenido (en concentraciones μΜ) (Fig. 1 C), observándose fluorescencia luego de un día cuando se utiliza bajas temperaturas, 37°C e incluso hasta 15°C (datos no mostrados), o a las horas de incubación, a temperaturas de 80°C (Fig. 1 C).
Ejemplo 2: Caracterización de QDs de sulfuro de cadmio producidos utilizando compuestos del tipo tiol como envoltura y fosfato inorgánico en su síntesis:
En este ejemplo se presenta la caracterización de las NPs de CdS producidas con el método presentado en el ejemplo 1.
Para la caracterización se utilizaron como muestras dos soluciones fluorescentes de distinto color (naranja y verde-azul) las que fueron purificadas para obtener material nanoparticulado (ver metodología). Se determinó el tamaño de los QDs de CdS y se evaluaron sus propiedades espectrofotométricas y de fluorescencia.
Espectroscopia de absorción y fluorescencia, y Dispersión dinámica de la luz (DLS):
Las propiedades espectroscópicas de las NPs sintetizadas fueron determinadas usando un espectrofotómetro/fluorímetro con lector de placas, Synergy H1 (Biotek). El perfil de absorbancia de soluciones concentradas de QDs sintetizados in vitro fue medido entre 300 y 700 nm, y para registro de la emisión de fluorescencia fueron excitadas a 350 nm con una ganancia de 100% y la fluorescencia colectada entre 400 y 700 nm. Las mediciones de DLS en las NPs se llevaron a cabo en cubetas plásticas desechables de 4 pasos ópticos utilizando un equipo de dispersión Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments Limited, UK).
Se observó que ambas soluciones presentan el típico hombro correspondiente al plasmón de superficie descrito para QDs de CdS solubles en agua, bajo 400, 380 y 360 nm, respectivamente (Fig. 2A). Además, emiten fluorescencia en 450 y 560 nm respectivamente (Fig. 2B). La diferencia en los máximos de fluorescencia está relacionada con el tamaño del material nanoparticulado en las soluciones, encontrándose tamaños promedios de 7,5 y 3,5 nm para la solución naranja y verde-azul respectivamente (Fig. 2D y 2C, respectivamente).
Microscopía electrónica de transmisión (TEM):
Las imágenes de microscopía electrónica de transmisión fueron colectadas usando un microscopio a 80 kV marca Phillips Tecnai 12 BioTwin. Para la preparación de las muestras se tomaron entre 1 y 3 pL de soluciones de QDs sintetizados y purificados, los que fueron puestos sobre grillas de cobre (grilla TEM Formvar carbón 300 mesh cobre, tamaño de agujero de grilla 63 pm) y deshidratadas completamente bajo una ampolleta de luz visible convencional.
Mediante microscopía electrónica (TEM) se corroboró la presencia de partículas aglomeradas de tamaño inferior a 20 nm (Fig. 2E), por consiguiente una dilución de estas permitió observar NPs individuales con tamaños que fluctúan entre 5 a 12 nm (Fig. 2F), para una solución naranja de QDs. Espectroscopia infrarroja con transformada de Fourier (FTIR):
Los QDs de CdS producidos también fueron caracterizados de acuerdo a su espectro IR. Para esto, se tomaron muestras de QDs, las que fueron liofilizadas a sequedad para eliminar el agua de la solución. El polvo de NPs se mezcló con KBr, confeccionando pastillas que se midieron en un equipo de FTIR sólido, Spectrum Two (Perkin Elmer), entre 4000 y 400 cm "1 . Adicionalmente, se realizaron los controles pertinentes, midiéndose el espectro IR de los reactivos por separado (tioles, fosfato, CdCI 2 , moléculas fosforiladas, entre otros), utilizando el mismo equipo y con la misma preparación.
La naturaleza química de las NPs producidas en presencia de P¡ fue evaluada mediante espectroscopia FTIR (Fig. 3). Se observaron señales de P¡ y MSA, sugiriendo que las NPs poseen en su cubierta P¡ y tiol. Para el P¡ se encontró la señal del grupo P0 4 (1085 cm "1 ) y la señal que evidencia el estiramiento P-O-P en fosfatos alifáticos (996 cm "1 ), a su vez para el MSA se observaron las bandas correspondientes a los estiramientos CH y CH 2 (entre 3000 y 1800 cm "1 ), la banda del estiramiento C-S (1390 cm "1 ) y el cambio desde COOH (MSA puro)→ COO- (NPs) (1700→1563 cm "1 ). Finalmente, la señal del estiramiento S-H del MSA (2569 y 2566 cm "1 ) desapareció en la muestra de NPs, sugiriendo una unión covalente del tiol a la NP a través del grupo sulfhidrilo. Además de estas características se observó una robusta banda de estiramiento de O-H a los 3400 cm "1 perteneciente al agua y/o MSA, por lo que probablemente las NPs presenten en su superficie moléculas de agua, característica también previamente descrita para QDs de CdS solubles en agua (Ha y cois., 2011 , Srinivasa y cois., 2011 , Kumar y cois., 2012, Zhang y cois., 2004).
Ejemplo 3: Síntesis de quantum dots de CdS/n vitro mediante la adición de moléculas dadoras de grupos fosfato: En este ejemplo se presenta la metodología de síntesis de QDs de sulfuro de cadmio a partir de la adición de moléculas dadoras de grupos fosfato en las mezclas de reacción. Por tanto, se reemplazó el P¡, de la síntesis anteriormente señalada, por moléculas fosforiladas encontradas en organismos biológicos; glucosa-6-fosfato (G6P), glicerol-2-fosfato (G2P), fructosa-1 ,6-bisfosfato (F1.6BP), adenosina monofosfato (AMP), adenosina difosfato (ADP), adenosina trifosfato (ATP), entre otros. Cada molécula fosforilada quedó a una concentración final de 10 mM.
Se preparó una mezcla de reacción entre MSA (5 mM), CdCl 2 (54,5 μΜ) y las distintas moléculas dadoras de grupos fosfato (10 mM). Las mezclas se incubaron durante 12 días, evaluándose día a día la aparición de fluorescencia al ser expuestas a un transiluminador UV (a 365 nm).
Se determinó que soluciones de MSA/Cd tratadas con AMP, F1.6BP, G6P o G2P, exhiben un comportamiento de fluorescencia variable en el tiempo (Fig. 4A), sugiriendo que estas moléculas pueden gatillar la síntesis de QDs al igual que el P¡, no así ADP o ATP, que no son capaces de generar fluorescencia en el tiempo en las condiciones mostradas.
Luego, para comprobar que las soluciones fluorescentes que contienen MSA/Cd/molécula fosforilada, pueden generar QDs de CdS igual que las soluciones tratadas con P¡, una solución (de color verde) tratada con 10 mM de G6P fue concentrada y purificada (ver metodología).
Las NPs obtenidas presentaron un espectro de absorbancia como de fluorescencia correspondiente a lo esperado para QDs de CdS; hombro de absorbancia entre 350 y 400 nm y una emisión de fluorescencia de a 500 nm correspondiente a NPs color verde (Fig. 4B). En cuanto a la composición analizada mediante espectroscopia FTIR; la solución fluorescente verde presentó las bandas de estiramiento CH y CH 2 (entre 3000 y 1800 cm "1 ) y estiramiento C-S (1390 cm "1 ) característicos del MSA, y al igual que en QDs sintetizados con P¡ no se observa la banda correspondiente al grupo sulfhidrilo, lo que sugiere que el tiol se encuentra unido covalentemente al QDs a través del grupo sulfhidrilo en la muestra, además entre 1090-1100 cm "1 la señal del grupo fosfato, y los estiramientos asimétrico y simétrico del P-O-C son encontrados tanto en el control (solo G6P) como en las NPs entre 970- 980 y ~816 cm "1 respectivamente (Fig. 4C). Finalmente, un análisis preliminar de tamaño señaló que la solución contiene material nanoparticulado de aproximadamente 35 nm de diámetro. El cambio de color de fluorescencia en el tiempo, es evidencia de la presencia de QDs. Finalmente, las NPs sintetizadas presentan moléculas de G6P que conforman su capa externa de recubrimiento, aumentando el radio hidrodinámico de las NPs.