Technisches Gebiet

Die Erfindung betrifft eine Anordnung zur Probenaufbereitung und Analyse von Pestiziden in Proben mittels Chromatographie. Pestizide werden zum Schutz von Pflanzen gegen Schädlinge eingesetzt. Da diese als Rückstände in die Nahrungskette gelangen können, werden gesetzliche Grenzwerte festgelegt, deren Einhaltung durch Analyse kontrolliert wird. Die Analyse von Pestiziden erfolgt für verschiedene Proben mit unterschiedlicher Probenmatrix. Es ist daher Ziel der Analyse, die Pestizide in den Proben möglichst gut von der Matrix zu trennen und anschließend zu analysieren. Aufgabe der Entwicklung ist neben der Erreichung einer hohen Richtigkeit, die Probenvorbereitung und -analyse zu automatisieren und den Arbeitsaufwand und Verbrauch an Chemikalien für die Analyse gering zu halten. Stand der Technik

Die Veröffentlichung „Validation of a Simple and Rapid Multiresidue Method (QuEChERS) and its Implementation in Routine Pesticide Analysis" von M.Anastassiades, E. Scherbaum und D. Bertsch, Poster auf dem MGPR Symposium, Mai 2003 in Aix en Provence, Frankreich offenbart ein vereinfachtes Verfahren zur Probenvorbereitung für die instrumentelle Analyse von Pestiziden mittels GC-MSD oder LC-MS. Das Verfahren ersetzt verschiedene Schritte durch einfachere Schritte. Dabei erfolgt die Zugabe verschiedener Chemikalien, wie MgS0 ₄ , NaCl und Acetonitril und es werden verschiedene Aufbereitungsschritte, wie Schütteln oder Zentrifugieren zur Probenaufbereitung durchgeführt.

Die unter dem Begriff „S19" bekannte, modulare Multimethode zur Bestimmung von Pflanzenschutzmittelrückständen in Lebensmitteln von Specht umfasst im wesentlichen die Extraktion und Verteilung, Gelpermeationschromatographie (GPC), die Chromatographie an einer kleinen Kieselgelsäule und die anschließende gaschromatographische Bestimmung mit verschiedenen Detektoren. Bei der ChemElut- Methode nach Alder wird die homogenisierte Probe, nach Einstellung eines einheitlichen Wassergehalts, mit Methanol extrahiert und anschließend der zentrifugierte Extrakt durch flüssig-flüssig-Verteilung an Diatomeenerde gereinigt. Dadurch können die zu analysierenden Pestizide von störenden Matrixkomponenten abgetrennt werden. Die zur Elution notwendige relativ große Menge an Dichlormethan wird schließlich eingeengt und der Rückstand in einem zur Messung geeigneten Lösungsmittel, meist Methanol, aufgenommen.

Bei allen bekannten Verfahren erfolgt eine Automatisierung durch Nachahmung der gewöhnlich von Hand durchgeführten Verfahrensschritte. Dabei erfolgt die Extraktion der Probe mit unterschiedlichen Lösungsmitteln. Die Reinigung und Messung des Extrakts erfordert eine Vielzahl verschiedener Schritte im Labor (flüssig-flüssig Verteilung, SPE, GPC, ...).

Zur Vereinfachung der aufwendigen Probenvobereitung stehen leistungsfähige Detektoren zur Verfügung. Die Automatisierung erfolgt in Anlehnung an den oben aufgeführten Stand der Technik.

Nachteilig bei allen bekannten Verfahren ist der hohe Arbeitsaufwand und der hohe Materialverbrauch. Bei einigen Verfahren sind die Richtigkeit der Ergebnisse und die Anzahl der analysierbaren Pestizide begrenzt. Offenbarung der Erfindung

Es ist Aufgabe der Erfindung, die Probenaufbereitung wirtschaftlicher zu gestalten und den Arbeitsaufwand und Materialverbrauch zu senken. Erfindungsgemäß wird die Aufgabe mit einer Anordnung gelöst, die enthält:

(a) eine Hydrophilic liquid interaction chromatography (HILIC)- Chromatographiesäule mit einer ersten Pumpe für überwiegend wasserarmes und/oder unpolares Laufmittel;

(b) eine solid phase extraction (SPE)-Anreicherungsanordnung;

(c) eine zweite Chromatographiesäule mit einer zweiten Pumpe für überwiegend wasserreiches und/oder polares Laufmittel;

(d) einen Detektor; und

(e) eine Ventilanordnung zur Steuerung des Proben- und Matrixstroms, welche derart ausgebildet ist, dass der Probenstrom in einer ersten Schaltstellung der Ventilanordnung von der HILIC-Chromatographiesäule zur SPE- Anreicherungsanordnung leitbar ist und in einer zweiten Schaltstellung die in der SPE-Anreicherungsanordnung angereicherte Probe in umgekehrter Richtung von der SPE-Anreicherungsanordnung durch die zweite Chromatographiesäule zum Detektor leitbar ist.

Dabei wird in einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung im ersten Schaltzustand der Ventilanordnung das überwiegend wasserreiche und/oder polare Laufmittel mit der zweiten Pumpe in umgekehrter Richtung durch die zweite Chromatographiesäule gepumpt und anschließend abgeleitet.

Die erfindungsgemäße Anordnung erlaubt eine vollständige Automatisierung der Probenvorbereitung und Analyse. Die Rohextrakte werden direkt gereinigt, d.h. von störender Matrix befreit, und analysiert. Die Extraktion der Probe vor der Aufgabe erfolgt mit einem wasserarmen und/oder unpolaren Lösungsmittel. Hierzu eignet sich Acetonitril (ACN) besonders gut. Ein Mischungsverhältnis von 95 Vol.-% ACN und 5 Vol.-% Wasser hat sich als besonders vorteilhaft herausgestellt. Das Extrakt kann direkt zur Messung verwendet werden. Die Aufreinigung des Extrakts erfolgt chromatographisch an der HILIC-Chromatographiesäule und automatisiert.

Die Verwendung einer HILIC-Säule ist besonders deshalb vorteilhaft, weil dort die Pestizide von störenden Matrixkomponenten gut getrennt werden können. Die Pestizide eluieren früher als die Matrix und werden in der SPE-Anreicherungsanordnung aufgefangen. Die Matrix bleibt in der HILIC-Chromatographiesäule und kann später eluiert werden. Man erkennt, dass anders als bei den bisherigen Automatisierungsversuchen hier nicht eine bestehende Methode imitiert wird, sondern ein neues Verfahren mit einer neuen Anordnung angewendet wird. Statt eine flüssig-flüssig Verteilung vorzunehmen, wird eine HILIC-Chromatographiesäule eingesetzt. Während die Pestizide im zweiten Schritt in der zweiten, analytischen Chromatographiesäule analysiert werden, kann die HILIC- Chromatographie säule gereinigt werden .

Vorzugsweise wird die zweite, analytische Chromatographiesäule als reverse-phase (RP)-Chromatographiesäule betrieben. Überraschenderweise hat sich herausgestellt, dass die Kopplung einer HILIC-Chromatographiesäule mit einer RP-Chromatographiesäule als Pestizid-Multimethode besonders reproduzierbare Ergebnisse mit guten Nachweisgrenzen und Empfindlichkeiten ergibt.

Die erfindungsgemäße Anordnung erlaubt die Erfassung des Wirkstoffspektrums der bekannten, klassischen Verfahren ohne manuelle Probenvorbereitung. Die Anreicherung in der SPE-Anreicherungsanordnung hat den weiteren Vorteil, dass hohe Injektionsvolumina verwirklicht werden können. Dadurch werden die Nachweisgrenzen und die Empfindlichkeit weiter erhöht.

Die angereicherten Komponenten werden im zweiten Schaltzustand mit beginnendem Gradienten im Backflush- Verfahren auf die zweite, analytische Säule transferiert. Gleichzeitig wird die Matrix von der HILIC-Chromatographiesäule eluiert und die Säule für die nächste Analyse konditioniert. „Wegwerfartikel" werden zur Reinigung nicht eingesetzt. Das schont die Umwelt und macht das Verfahren und die Anordnung besonders wirtschaftlich.

Eine bevorzugte Ausgestaltung der Erfindung verwendet als wasserreiches und/oder polares Laufmittel zumindest 90 Vol.-% Wasser zu Beginn der Analyse. Weiterhin kann das wasserreiche und/oder polare Laufmittel 3 bis 7 Vol.- , vorzugsweise 5 Vol.-% Acetonitril und/oder MeOH enthalten. Mit diesem Laufmittel werden die angereicherten Pestizide von der SPE-Anreicherungsanordnung im Backflush- Verfahren zur zweiten, analytischen Chromatographiesäule geleitet.

Die zweite Chromatographiesäule kann eine High Performance Liquid Column (HPLC)- Säule sein. Es kann aber auch eine Gaschromatographie (GC)- Säule eingesetzt werden. Dann erfolgt die Elution in der SPE-Anreicherungsanordnung offline. Das Eluat wird dann in der GC-Säule analysiert. Mit anderen Worten: die HILIC-Chromatographiesäule und die SPE-Anreicherungsanordnung dienen der Probenvorbereitung für eine GC-Säule. Bei dieser Verwendung wird die angereicherte Probe aus der SPE- Anreicherungsanordnung mit einem Laufmittel, beispielsweise Essigester und/oder Aceton, in ein Gefäß gespült und dann mit der GC-Säule analysiert. In einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung wird ein Teil des Probenstroms, der im ersten Schaltzustand während einer ausgewählten Anreicherungszeit durch die SPE-Anreicherungsanordnung hindurch fließt, direkt zum Detektor geleitet. Dies sind insbesondere nicht-anreicherungsfähige, polare Pestizide. Sie werden direkt zum Detektor geleitet und dort gemessen. Gleichzeitig wird die Matrix abgetrennt. Als Detektor ist insbesondere ein Massenspektrometer geeignet.

Die beschriebene Anordnung kann mit folgenden Verfahrensschritten besonders vorteilhaft betrieben werden:

(a) Aufgeben einer in einem überwiegend wasserarmen und/oder unpolaren Laufmittel gelösten Probe auf eine HILIC-Chromatographiesäule mit einem überwiegend wasserarmen und/oder unpolaren Laufmittel;

(b) Anreichern zumindest eines großen Teils der in der Probe enthaltenen Pestizide in einer SPE-Anreicherungsanordnung; (c) Leiten des mit Pestiziden in der SPE-Anreicherungsanordnung angereicherten Probeteils in umgekehrter Richtung von der SPE-Anreicherungsanordnung durch die zweite Chromatographiesäule mit überwiegend wasserreichem und/oder polarem Laufmittel durch Umschalten einer Ventilanordnung nach einer ausgewählten Anreicherungsdauer; und

(d) Detektieren der in der zweiten Chromatographiesäule getrennten Probenbestandteile.

Ein Teil des Probenstroms, der während einer ausgewählten Anreicherungszeit durch die SPE-Anreicherungsanordnung hindurch fließt, wird dabei vorteilhafterweise direkt detektiert.

Das Verfahren ist besonders vorteilhaft, wenn die HILIC-Chromatographiesäule während eines Teils der Analysenzeit im zweiten Schaltzustand mit der Pumpe am Massenspektrometer regeneriert wird und während der verbleibenden Analysenzeit ein Pestizidprobenteil für die Gaschromatographie mittels der Säule erstellt wird. Dieses hat zur Folge, dass während der LC-MS-Analytik sofort die Probenvorbereitung für die GC- Analytik stattfinden kann. Ausgestaltungen der Erfindung sind Gegenstand der Unteransprüche. Ein Ausführungsbeispiel ist nachstehend unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen näher erläutert.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig.l ist eine schematische Darstellung einer Anordnung zur Probenvorbereitung und Analyse von Pestiziden in einer ersten Schaltstellung.

Fig.2 zeigt die Anordnung aus Figur 1 in einer zweiten Schaltstellung.

Beschreibung des Ausführungsbeispiels Figuren 1 und 2 zeigt eine Anordnung zur automatischen Analyse von Pestiziden in Proben, die allgemein mit 10 bezeichnet ist. Die Anordnung umfasst eine Gradientenpumpe 12, welche zu Beginn mit einem Laufmittel, bestehend aus 5 Vol.-% Wasser und 95 Vol.-% ACN zu einer HILIC-Chromatographiesäule 14 in einem Ofen 16 pumpt. Die Anordnung umfasst eine weitere Gradientenpumpe 18, welche ein Laufmittel zu Beginn bestehend aus 5 Vol. -ACN und/oder MeOH und 95 Vol.-% Wasser zu einem Ventil 20 pumpt.

In dem in Figur 1 gezeigten Schaltzustand ist der Ausgang der HILIC- Chromatographiesäule 14 über das Ventil 20 mit einer SPE-Anreicherungsanordnung 22 verbunden. Die SPE-Anreicherungsanordnung ist im vorliegenden Ausführungsbeispiel eine kurze C8 Säule. Durch Zumischung von Wasser vor der SPE-Anreicherungssäule (nicht dargestellt) wird die Polarität des Eluats erhöht, so dass die Pestizide angereichert werden können.

Der Ausgang der SPE-Anreicherungsanordnung führt über ein weiteres Ventil 24 in einem Ofen 26 zum Probenraum eines LC-MS-Detektors 32. In dem Ofen 26 ist eine RP- HPLC-Säule (C18-Säule) 28 angeordnet. In dem in Figur 1 gezeigten Schaltzustand führt der Laufmittelstrom aus der Pumpe 18 über das Ventil 24 zur HPLC-Säule 28. Der Ausgang der HPLC-Säule 28 ist über das Ventil 20 mit einer Entsorgung 30 verbunden.

Figur 2 zeigt die gleiche Anordnung wie in Figur 1. Hier sind die Ventile 20 und 24 jedoch anders geschaltet. Das Laufmittel wird mit der Gradientenpumpe 12 durch die HILIC-Säule 14 über das Ventil 20 zur Entsorgung 30 geleitet. Dabei wird die HILIC- Säule gereinigt und so für die nächste Analyse vorbereitet.

Das wasserreiche Laufmittel wird mit der Gradientenpumpe 18 über das Ventil 24 zur SPE-Anreicherungsanordnung 22 geleitet. Dort strömt es in umgekehrter Richtung wie in Figur 1 durch die SPE-Anreicherungsanordnung 22 zum Ventil 20. Das Ventil 20 ist derart geschaltet, dass die Probe mit den Pestiziden über das Ventil 20 zur Analyse in die HPLC-Säule 28 fließt. Der Ausgang der HPLC-Säule 28 ist über das Ventil 24 mit dem LC-MS-Detektor 32 verbunden. Die Anordnung arbeitet wie folgt:

Das Verfahren startet mit der Injektion von 5 μΐ der ungereinigten Extraktlösung. In der ersten Ventilstellung der Ventile 20 und 24 wird die in ACN und Wasser im Volumenverhältnis 95:5 gelöste Probe (Rohextrakt) mit den zu analysierenden Pestiziden von der Pumpe 12 durch die HILIC-Chromatographiesäule 14 geleitet. Dort wird der größte Teil der nicht-interessierenden, störenden Matrix von den Pestiziden getrennt. Die Matrix bleibt überwiegend in der HILIC-Chromatographiesäule 14. Die Pestizide eluieren dabei zum größten Teil alle sehr zeitig etwa nach 1 bis 4 Minuten. Große Teile der Matrix sind zu diesem Zeitpunkt noch auf der HILIC Säule. Der verbleibende Probenanteil fließt zur SPE- Anreicherungsanordnung 22. Dort reichern sich die meisten Pestizide an. Ein kleiner Teil der Pestizide, insbesondere kleinmolekulare, polare Pestizide, bleiben nicht in der SPE-Anreicherungsanordnung 22, sondern fließen während dieser Anreicherungsperiode (Figur 1) durch die SPE-Anreicherungsanordnung 22 hindurch direkt zum Detektor 32. Sie werden somit bereits in dieser Ventilstellung detektiert.

Nach etwa 4 Minuten ist die Matrix in ausreichendem Maße in der HILIC von den zu analysierenden Pestiziden getrennt. Dann werden die Ventile 20 und 24 geschaltet, so dass sich die in Figur 2 dargestellte Situation ergibt. Bei dieser Schaltstellung werden die in der SPE-Anreicherungsanordnung angereicherten Pestizide mit dem wasserreichen Laufmittel aus 95 Vol.-% Wasser und 5 Vol.-% ACN in umgekehrter Richtung von der SPE-Anreicherungsanordnung 22 zur HPLC-Säule 28 geleitet. Gradientenpumpe 2 eluiert die Komponenten von der SPE-Anreicherungsanordnung im Gegenflussprinzip auf die analytische HPLC-Säule. Dort werden die von der Matrix im Wesentlichen befreiten Pestizide getrennt und mit dem Detektor 32 detektiert. Dies geschieht durch den Gradient, der für die Trennung auf der HPLC-Säule 28 verwendet wird. Beginnend mit hohem Wassergehalt wird die Elutionskraft durch Steigerung des Methanol und/oder ACN-Gehalts langsam erhöht. Gleichzeitig wird die HILIC-Chromatographiesäule 14 mit der Gradientenpumpe 12 regeneriert bzw. gereinigt.

In einem nicht-dargestellten, alternativen Ausführungsbeispiel wird eine GC-Analyse vorgenommen, statt die von der Matrix getrennte Probe zu einer HPLC-Säule zu leiten. Dabei wird die Probe von der SPE- Anreicherungsanordnung zunächst in ein separates Gefäß gespült. Die so vorbereitete Probe kann dann in bekannter Weise mittels Gaschromatographie analysiert werden.