L'expression "membrane biologique artificielle" recouvre, dans son acception la plus générale, des membranes obtenues à partir de produits d'origine biologique et utilisées dans des domaines très divers, tels que la chirurgie, la médecine, la pharmacie mais aussi l'industrie chimique, textile ou du papier. Les propriétés requises pour ces applications sont esentiellement des propriétés d'élasticité, de bonne tenue mécanique, de résistance chimique et de compatibilité avec des milieux divers.

Comme constituant de telles membranes, on a déjà proposé d'utiliser de 1'elastine en mettant à profit ses propriétés d'élasticité et son caractère à la fois hydrophile et hydrophobe.

Ainsi, dans la demande FR n"8503057 du 01.03.85 au nom de l'INSERM, on a rapporté un produit à base d'élastine et de fibrine soluble (à savoir de monomères de fibrine) particulièrement approprié pour l'élaboration de biomatériaux et matériaux supports, tels que tissus artificiels ou supports de cultures cellulaires.

La recherche de matériaux plus spécialement adaptés pour effectuer des greffes sur des vaisseaux de petit calibre a conduit 1'inventeur de la présente demande à étudier le comportement de différents produits biologiques vis-à-vis d'une trame de matériau polymère servant de support.

Les travaux effectués ont montré qu'en faisant réagir de l'elastine ou des dérivés d'élastine, dans certaines conditions, avec une autre protéine du tissu conjonctif, on obtient un matériau proteique adhérant fortement au matériau support utilisé, possédant les propriétés de protéines structurelles et répondant ainsi, de manière particulièrement satisfaisante, aux exigences requises envers les membranes biologiques. L'invention a donc pour but de fournir de nouvelles compositions de matériaux protéiques dotées de propriétés importantes d'élasticité, de robustesse et, le cas échéant, d'adhésivité et conservant leurs propriétés avec divers additifs. Elle vise également à fournir un procédé permettant d'obtenir aisément ces compositions.

L'invention a également pour but de fournir des membranes biologiques utiles plus spécialement en tant que tissus conjonctifs artificiels et comme matériaux supports pour des cultures cellulaires.

Les compositions de matériaux protéiques de l'invention sont essentiellement telles qu'obtenues par réaction d'une solution aqueuse concentrée de collagène de typé I et/ou III et d'élastine ou de peptides d'élastine de poids moléculaire (PM) supérieur à environ 10.000, solubles dans l'eau, tels qu'obtenus par solubilisation de l'elastine.

Dans la suite de la description, ces peptides d'élastine dont il est question ci-desus seront appelés "peptides solubilisés d'élastine" et désignés par 1'abbréviation PSE.

Une telle composition présente des qualités d'élasticité et de tenue mécanique permettant de la comparer aux protéines structurelles. Elle possède également des propriétés d'adhésivité élevées

particulièrement précieuses pour l'utilisation dans les applications biologiques envisagées.

Une composition de matériau proteique préférée est essentiellement telle qu'obtenue par réaction d'élastine et de collagène de type I et de type III. La proportion de collagène de type III par rapport à celle de collagène de type I est avantageusement supérieure à 50% en poids, en particulier d'au moins 70% en poids (poids sec). On notera que le collagène de type III tel que commercialisé, renferme de telles quantités de collagène de type I.

L ¹ elastine est une elastine d'origine humaine ou animale, native ou mature, ou le cas échéant, leurs dérivés. Il s'agit généralement d'élastine extraite de tissus animaux, en particulier de ligament nucal de boeuf, ou d'aorte de porc, de bovidé ou humaine.

Une autre composition préférée de 1'invention est essentiellement telle qu'obtenue par réaction de peptides solubilisés d'élastine et de collagène de type III.

Le collagène utilisé dans ces compositions, selon une disposition de l'invention, est du collagène extrait de placenta humain.

Ces compositions, contrairement à l'elastine, ne donnent pas de réaction avec les monomères de fibrine.

Dans une disposition préférée de l'invention, le rapport elastine ou PSE/collagène (p/p, par rapport au poids sec) est de 10 à 1 environ, de préférence de l'ordre de 2,5. En variante, les compositions de l'invention comprennent un matériau composite dans lequel les PSE et le collagène sont fixés à un matériau de substitution de l'os.

Le matériau de substitution de 1•os est avantageusement choisi parmi les matériaux biocompatibles

et dotés de propriétés d'osteoconduction (c'est-à-dire capables d'être recolonisés par les structures organiques ou vivantes susceptibles de fabriquer l'os, grâce à leurs propriétés de surface et leur porosité) et d'ostéinduction (c'est-à-dire capables de créer un environnement favorable au déclenchement de l'ostéogénèse) .

De tels matériaux sont notamment à base de Ca ⁺⁺ , de phosphate tricalcique ou d'apatites. Un matériau particulièrement approprié est constitué par

1'hydroxyapatite.

L'invention vise ainsi des compositions telles qu'obtenues par réaction d'hydroxyapatite avec des PSE et du collagène de type I et/ou III.

Le procédé de préparation des compositions de matériaux protéiques définies ci-dessus est caractérisé en ce qu'il comprend:

- la mise en contact, avec une solution aqueuse concentrée de collagène de type I et/ou III, dans des conditions permettant la formation d'un gel, d'élastine ou de peptides d'élastine de PM au moins égal à environ

10.000, ces peptides étant solubles dans un mélange 50-50 d'alcool tertiobutylique-potasse 1M dans de l'eau, - la récupération du gel formé et son traitement ultérieur, si souhaité.

La concentration en collagène de la solution aqueuse est d'environ au moins 3 mg/ml, notamment de l'ordre de 3 à 10 mg/ml. Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, l'étape de mise en contact est réalisée dans des conditions physiologiques, à savoir à 37*C environ, à un pH de l'ordre de 7 à 7,5.

L'elastine ou les PSE sont respectivement en suspension ou dissous dans un tampon de pH de 7 à 7,5

environ, de préférence de pH 7,4, dont les élément constitutifs favorisent ou tout au moins n'inhibent pa la réaction recherchée. Des tampons renfermant pa exemple, des cations, Na ⁺ , Ca** et/ou Mg**, des anions P0 ₄ et/ou Cl ^" apparaissent avantageux à cet égard.

Un tampon particulièrement approprié, qui renferm l'ensemble des ions ci-dessus, est constitué par l tampon PB qui répond à la composition molaire suivante : imM P0 ₄ , 150mM NaCl, 2mM Ca* ^* , ImM Mg .

Des gels particulièrement résistants à l'écrasemen sous le doigt sont obtenus à partir d'élastine ou de PS de tampon et de collagène utilisés dans un rappor d'environ 2,5. ce rapport peut être modifié selon l'application d la composition.

L'elastine est généralement obtenue à partir de tissus animaux par dissolution et élimination des protéines d'accompagnement. Comme tissus, on utilise de préférence le ligament nucal de boeuf ou l'aorte de porc ou de bovidé.

Les peptides d'élastine résultent par exemple de l'hydrolyse de l'elastine par traitement alcalin notamment avec de la potasse 1 M, traitement acide, par exemple avec de l'acide oxalique ou traitement enzymatique avec de l'élastase.

Le collagène provient plus spécialement de placenta humain.

Pour disposer de membranes utilisables dans les applications envisagées ci-après, on ajoute successivement aux PSE des additifs permettant d'améliorer les qualités du gel et de lui conférer des propriétés utiles dans les applications envisagées, puis le collagène.

Parmi les additifs avantageux utilisés seuls ou en combinaison, on citera la fibronectine et la laminine, qui favorisent les qualités cohésives du gel, le collagène de type IV qui améliore les qualités adhésives, des hormones de croissance, des éléments nutritifs, des vitamines, des protéoglycanes tels que l'héparane et le dermatane-sulfate, des enzymes, des antiseptiques, des catalyseurs ou des oxydo-réducteurs. Ces additifs conservent la structure des matériaux protéiques de l'invention.

De nombreux autres additifs, agents thérapeutiques, antibactériens, sont utilisables et seront aisément choisis par l'homme de l'art en fonction des propriétés recherchées, et mis en oeuvre selon les doses appropriées compte tenu des applications envisagées.

Le mélange formé est ensuite incubé à une température de l'ordre de 37 ^β C jusqu'à la formation du gel. Une dispersion satisfaisante des différents éléments du mélange est assurée par une mélangeur par exemple de type VORTEX*.

Lorsqu'on souhaite imprimer une forme et une dimension donnée à la composition, on réalise la réaction dans un moule approprié, en mettant à profit le caractère modulable des compositions de l'invention. Il est ainsi possible d'obtenir la composition qui sera utilisée comme biomatériau sous forme de tubulures, filaments ou de bandes.

La composition est démoulée et, le cas échéant, séchée pour éliminer l'excès d'eau.

La conservation est effectuée à l'état humide en présence d'un antiseptique ou à l'état lyophylisé. Dans ce cas, le produit est rehydraté par mise en contact avec de l'eau physiologique stérile avant utilisation.

Pour l'élaboration de compositions formées de matériaux composites, on fait avantageusement réagir le matériau de substitution de l'os avec des PSE et ensuite

5 avec du collagène. Les conditions de température et de pH sont en particulier telles qu'indiquées ci-dessus.

Comme déjà rapporté, les compositions de l'invention présentent de remarquables propriétés d'élasticité, de robustesse ainsi qu'une grande étanchéité, des propriétés 10 de biocompatibilité, et le cas échéant d'adhésivité.

Ces propriétés sont particulièrement avantageuses pour l'élaboration de membranes biologiques artificielles.

L'invention vise donc également des membranes 15 caractérisées en ce qu'elles comprennent une composition de matériaux protéiques telle que définie ci-dessus.

Ces membranes présentent un intérêt tout particulier en tant que tissus conjonctifs artificiels.

Par leur constitution, elles sont très proches de la 20 lamina densa des membranes basales, et plus spécialement, lorsqu'elles renferment du collagène type III, du sous- endothélium artériel.

Les membranes de l'invention sont utilisables notamment comme pièces d'obturation, de soutien et de 25 renforcement. lles peuvent constituer des pièces de soutien temporaire permettant d'initier puis de guider le processus de réparation tissulaire.

Elles sont appliquées à l'aide de colles 30 biocompatibles ou fixées par sutures. En variante, leurs propriétés d'adhésivité élevée permet leur fixation à l'endroit souhaité sans recours à d'autres moyens.

Selon un aspect de grand intérêt de l'invention, ces membranes adhèrent fortement aux matériaux supports 35

8 polymères habituellement utilisés comme trames dans la préparation de biomatériaux.

On constate en outre qu'elles favorisent la cicatrisation.

On notera que, de manière avantageuse, ces membranes n'induisent pas de phénomène de coagulation étant dépourvues de fibrine et ne se fixant pas à la fibrine.

Dans le traitement des brûlés, elles permettent de compenser certaines pertes de tissus.

Elles présentent aussi un grand intérêt pour fabriquer des vaisseaux artificiels de faible calibre.

D'une manière générale, les membranes de l'invention sont utilisables dans tous les domaines de la chirurgie notamment digestive, vasculaire, urinaire, génitale et obstétricale, maxilo-faciale et plastique, dermatologique, foetale et néonatale ainsi que vétérinaire.

Le choix d'un ou plusieurs additifs particuliers permet de disposer aisément des membranes appropriées pour une application donnée.

Ainsi, en considérant comme additifs par exemple les protéoglycanes, il est possible de préparer des membranes utilisables comme sous-endothélium artériel en utilisant de l'heparane sulfate, ou encore des membranes substituts de cartilage avec des chondroîtines sulfates. De même, pour reconstituer un interface épiderme-derme, il est spécialement avantageux d'ajouter aux compositions de l'invention le ératane-sulfate. L'invention fournit ainsi à l'homme de l'art les moyens de réaliser une membrane adaptée à ses besoins.

Les membranes de l'invention constituent également des matériaux supports particulièrement utiles pour les cultures cellulaires.

Des cultures cellulaires variées peuvent être développées, en opérant dans les conditions habituelles, à l'aide de ces supports. On citera notamment les cultures de cellules musculaires lisses, de fibroblastes, de kératinocytes, de cellules épithéliales et de cellules endothéliales. Les rendements obtenus sont élevés.

Ces membranes jouent également le rôle de socle dermique lorsqu'on ensemence des cellules épithéliales en vue de reconstituer un morceau d'epiderme. Ce dernier est ensuite transplantable sur l'organisme d'un receveur.

Les membranes élaborées à partir des matériaux composites évoqués ci-dessus, plus particulièrement ceux renfermant de l'hydroxyapatite avec des PSE et du collagène sont utilisables comme supports de culture d'ostéoblastes.

Les membranes à base de matériaux composites se présentent sous forme de gels. Les culots de centrifugation sont utilisables dans des études biochimiques.

L'invention vise également des kits renfermant les éléments nécessaires pour effectuer une réparation tissulaire ou une culture cellulaire.

On rapporte dans les exemples qui suivent, donnés à titre illustratif, d'autres caractéristiques et avantages de l'invention.

Les figures auxquelles il est fait référence dans ces exemples représentent

- les figures la et lb, des photos prises au microscope électronique à balayage, à différents grossissements, de matériaux protéiques de l'invention,

- la figure 2, la variation de la quantité en mg de produit sec en fonction de la quantité de collagène ajoutée en mg (essai avec 40 mg de PSE) , et

- la figure 3, la radioactivité, en cpm/mg du culot de centrifugation lavé, correspondant à une composition de l'invention, en fonction de la quantité de collagène ajoutée, et du temps de réaction.

L'elastine utilisée dans ces exemples est de 1'elastine commercialisée par SIGMA provenant de ligament nucal de boeuf.

Le collagène de type I + III ou le collagène de type III et la fibronectine sont des produits commercialisés par l'Institut Mérieux, obtenus à partir de placenta humain. Le collagène de type I + III renferme 73% de type

III et 27% de type I.

EXEMPLE 1 : PREPARATION DE GEL ELASTINE-COLLAGENE A une suspension d'élastine broyée et tamisée de 40 mg dans 1 ml de tampon PB de pH 7,4 (ImM P0 ₄ , 150mM NaCl, 2mM Ca**, ImM Mg**) , on ajoute 1 ml de gel de collagène type I + III, soit à 3 mg/ml, soit à 6 mg/ml. On homogénéise au VORTEX ^R pendant 5 sec, on verse ensuite le mélange dans un moule à 37 ^β C sans agiter pendant 15 min., 1, 2, 12 heures. On récupère le produit, on le lave et on le sèche.

En variante, au lieu de verser le mélange dans un moule, on effectue l'incubation dans un récipient puis on sépare le produit formé par centrifugation (10 min/

3000t/mn) Le produit récupéré se présente sous forme d'une seule phase homogène.

Une étude des structures a été entreprise à 1'aide de la microscopie électronique à balayage. Cette technique permet d'observer - en analyse immédiate - une association très étroite entre l'elastine et le collagène (voir figure la (grossissement de 5600) et figure lb (grossissement 33600)).

EXEMPLE 2 : PREPARATION DE GEL PEPTIDES SOLUBILISES D *ELASTINE-COLLAGENE

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* PREPARATION DES PEPTIDES SOLUBLISES D'ELASTINE

On utilise 1 g d'élastine. Après broyage et tamisage, l'elastine est mise en suspension dans 50 ml d'alcool tertiobutylique. On ajoute 50 ml de potasse 1M dans l'eau, sous agitation suffisante pour maintenir une émulsion. A 25*C, on obtient une dissolution complète de l'elastine au bout de 48 heures.

On ajoute alors 50 ml d'eau et on neutralise à pH 7 par addition d'acide acétique.

Par dialyse durant environ 14 heures contre l'eau courante, on élimine l'alcool tertiobutylique, les sels et les peptides de poids moléculaire inférieur ou égal à 10.000 environ. On effectue ensuite une dialyse contre 1'eau permutée (2 bains de deux heures environ) .

La préparation est congelée à -40*c et lyophylisée aux fins de conservation. Le rendement est de 65 à 85%. ETUDE DE LA STABILITE DU GEL OBTENU 50 mg de peptides issus de la solubilisation de l'elastine (marqués avec de l'iode ¹²⁵ ) sont solubilisés dans 2 ml de PB. On ajoute 2 ml de solution de collagène III dans l'eau (10 mg/ml). On homogénéise au VORTEX ^R (5 sec). On place au bain-marie à 37*C pendant 5 heures. On centrifuge 10 min. à 6.000t/min. Le culot est lavé par 5 ml d'eau pendant 15 min., ensuite par 5 ml d'eau pendant 1 heure, puis par 5 ml d'eau jusqu'au lendemain. Après chaque lavage, on mesure la radio-activité du culot.

Le produit est alors abandonné 7 jours et une autre série de lavage à l'eau est effectuée. Le produit lavé est placé dans l'eau . 25 ^β C pendant 18 jours sans changer d'aspect. Après centrifugation, le produit est séché à l'air (25-29 ^β C) durant deux jours.

On obtient un matériau compact - alors qu'au cours des lavages, il avait été assez dilacéré pour des raisons

12 d'efficacité de l'opération - et très résistant. ce moment-là, repris dans l'eau, il fournit une matrice plus plastique qui, en présence d'acide acétique 1/2 (pH ≈ 1) , n'est pas solubilisée mais donne à terme un gel assez semblable au premier. * REACTION AVEC LE COLLAGENE DES PSE

1ère expérimentation : avec PSE, non marqués à l'iode ¹²⁵ , on met en contact puis homogénéise (5 sec, VORTEX ^R ) , des doses croissantes de PSE - de 0, 5, 10, 20,

30, 40, 60 et 100 mg dans 1 ml PB 7,4 à 37'C - avec 1 ml du gel de collagène I + III à 3mg/ml.

On observe que les gels se forment d'autant plus rapidement et se présentent sous une forme d'autant plus compacte que la quantité de PSE est élevée.

La centrifugation, 10 min à 5000 t/min, au bout d'une heure, permet la séparation des gels : de 5 à 20 mg PSE, ils sont mous ; de 30 à 100 mg PSE, beaucoup plus fermes. Les plus résistants à l'écrasement sous les doigts sont les gels obtenus avec 30 et 40 mg de PSE. Les gels ont été amenés à sec, à l'air, et pesés. On observe une certaine proportionalité du poids obtenu en fonction du poids de PSE.

2ème expérimentation : On opère comme indiqué ci- dessus, en utilisant des doses de 10, 20, 30, 40, 60 et 80 mg de PSE dans 1 ml de PB, pH 7,4 et 1 ml de collagène I + III.

Avec 40 mg de PSE, on utilise 1, 2 et 3 ml de solution de collagène. 3ème expérimentation : On opère comme indiqué ci- dessus mais avec une quantité fixe de PSE (40 mg/ml) et des doses croissantes de collagène I + III à 10 mg/ml, soit 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 et 20 mg.

Le gel se prend en masse rapidement à partir de 6 mg, les tubes à 14 et 20 mg sont beaucoup plus opaques.

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Pour les décanter, on ajoute H ₂ 0/EtOH avant la centrifugation. Tous les gels obtenus sont lavés, et mis à sécher sur papier filtre. On observe une assez bonne 5 proportionalité entre la quantité de produit obtenu après séchage du gel et la quantité de collagène (voir figure 2).

4ème expérimentation : Pour étudier des gels PSE- collagène, on utilise des PSE marqués à l'iode ¹²⁵ et on 1 ₀ détermine les événements produits par la mesure de la radio-activité retenue sur le précipité.

Une solution de PSE-I ¹²⁵ est préparée à 5 mg/ml et à

4.600 cpm/mg à laquelle on ajoute les doses croissantes de collagène : 0.5, 1, 2, 4 et 6 mg précédé de la

15 quantité suffisante de tampon PB 7,4, pour 2 ml volume final. Le gel se forme bien.

On centrifuge 30 à 40 min. à 5500 t/min. puis on mesure la radio-activité du surnageant, du culot brut, puis du culot lavé 2 fois avec H ₂ 0. 2 ₀ Cette expérience est réalisée sur des temps variables : 1, 2 et 4 heures.

Les résultats obtenus sont rapportés sur la figure 3 qui donne la mesure de la radio-activité (cpm/mg) sur le culot lavé en fonction de la quantité pondérale de ₂ 5 collagène, et ce en fonction du temps de l'expérience.

La courbe avec les symboles correspond à une durée d'expérience de 1 heure, celle avec les symboles O, à une durée de 2 heures et celle avec les symbolesA, à une durée de 4 heures. ₃₀ EXEMPLE 3 ; PREPARATION DE GELS COMPORTANT DE LA IBRONECTINE, DE LA LAMININE ET DU COLLAGENE DE TYPE IV On utilise de la fibronectine marquée en solution dans un tampon P0 ₄ 0,1 M, NaCl 0.15 pH 7,2, à 1,2 mg/ml et 8,10 ⁶ cmp/mg.

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On prépare des PSE à 10 mg/ml PB 7.4. A 1 ml de cette solution, on ajoute 10, 20, 50, 100 et 200 μl de la solution de fibronectine-I ¹²⁵ . On incube 30 min à 37'C et ajoute 0,4 ml de collagène I + III et la qsp de PB 7,4 pour 2 ml de volume final. On homogénise au VORTEX ^R (5 sec.) et conserve sans agitation 4 heures à 37*C. La centrifugation à 5500 t/min. pendant 40 min. permet de séparer culots et surnageants. On constate que l'addition de fibronectine accélère la formation du gel : il se forme instantanément pour 200 μl de fibronectine. Des lavages répétés, d'abord courts et dans l'eau, puis 14 heures environ dans l'eau à 20"C, ne diminuent que de 17% en moyenne la radio-activité retenue dans le gel et portée par la fibronectine, ce qui démontre 1'importance de 1'affinité de la fibronectine vis-à-vis des constituants du gel.

On utilise de la laminine (Sigma) et du collagène de type IV (Mérieux) marqués en solution dans le tampon P0 ₄ 0,1 M utilisé dans l'essai avec la fibronectine - laminine 500.000 cp /ml, collagène IV 850.000 cpm/mg.

On prépare des PSE à 10 mg/ml dans PB 7,4. A 1 ml de cette solution, on ajoute 10, 20, 50, 100 et 200 μl de la solution de laminine ou de collagène IV. On incube 15 min. à 37*C. On ajoute qsp pour 2 ml (volume final) de PB 7,4 et 0,4 ml de collagène I + III. On homogénéise au VORTEX" (5 sec) et conserve sans agitation 4 heures à 37 ^β C. La centrifugation à 5500 t/min. pendant 40 min. permet de séparer culots et surnageants. On constate que le gel résultant est d'autant plus compact que la quantité de laminine ou de collagène IV, est élevée. Des lavages répétés ou longs, ne libèrent pas la radio-activité liée aux culots, ce qui démontre l'affinité importante avec ces 2 protéines.

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EXEMPLE 6 ; ETUDE DES PROPRIETES D'ADHESIVITE DE GEL PSE-COLLAGENE SUR DU DACRON ^R

Un échantillon de prothèse en Dacron* (cylindre de 1 cm de longueur, 0,6 cm de diamètre) est mis à incuber dans du tampon PB de pH 7,4 pendant 4 heures. Dans le même temps, on prépare le gel : PSE-collagène en opérant comme suit : A 1 ml de PSE-I ¹²⁵ (10 mg/ml), on ajoute 0,6 ml de TPS de pH 7,4 et 0,4 ml de collagène type III (10 mg/ml) , en prenant bien soin d'homogénéiser entre chaque addition. On abandonne 4 heures à 37'C. Puis, on centrifuge 10 min. à 5000 t/min. et on lave 2 fois le culot par 2 ml d'eau permutée (pH 6) . Pour la longueur de prothèse utilisée, on a recours à 2 fois cette quantité de gel.

On applique alors le gel à la spatule à l'intérieur du matériel en Dacron ^R , en l'étirant, puis on laisse sécher à l'air durant environ 14 heures. On obtient une prothèse un peu moins souple mais qui a retenu du matériel radio-actif.

Cette prothèse est alors lavée à l'eau (2 ml) sans agitation trop brusque pendant 5 heures, 1'eau étant renouvelée après chaque mesure. A la 6e heure, on plonge la prothèse dans un bêcher contenant 100 ml d'eau sous assez vive agitation magnétique. Au cours de tous ces lavages, la radio-activité restant sur la prothèse est évaluée jusqu'à la 23e heure.

Les résultats obtenus montrent que le gel PSE- collagène apparaît assez bien retenu sur le Dacron ^R alors qu'il n'a pas été fortement fixé. Cette expérimentation confirme également, outre l'adhésivité, le caractère d'insolubilité du matériau dans l'eau.

EXEMPLE 7 t PREPARATION D'UN MATERIAU COMPOSITE A BASE D'HYDROXYAPATITE, DE PEPTIDES SOLUBILISES D'ELASTINE ET DE COLLAGENE

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On fait réagir tout d'abord de l'hydroxyapatite (ci-après hA) avec PSE-I ¹²⁵ à 37'C, pH 7,4. On obtient un produit hA-PSE-I ¹²⁵ ayant fixé 25 à 30% de la radioactivité.

On fait ensuite réagir ce produit avec du collagène de type I + III, à 37'C et pH 7,4.

Le produit résultant est un matériau composite du type hA-PSE-collagène, se présentant sous forme d'un gel autour de hA, qui reste solidement fixé après plusieurs lavages.

On utilise avantageusement PSE à raison de 20 mg/ml. Les sites d'association offerts par hA sont saturés avec 2 x 1 ml au bout de 15 min. d'incubation à 37'C. La réaction de hA-PSE avec le collagène est réalisée par exemple avec 40 mg de hA-PSE, 1,2 ml de tampon à pH 7,4 et 0,8 ml (8 mg) de collagène I + III.