NUOVI COMPOSTI CON ATTIVITA’ FARMACOLOGICA Riassunto dell’invenzione La presente invenzione ha per oggetto una nuova classe di composti e le composizioni farmaceutiche che li contengono come ingredienti attivi. I composti dell’invenzione sono efficaci nella prevenzione o nel trattamento delle malattie che coinvolgono direttamente il sistema dell’urochinasi, il suo recettore e il suo inibitore naturale (uPA, uPAR e PAI), e/o indirettamente i suoi co-recettori come i recettori del formil-peptide (FPRs), le integrine e il fattore di crescita dell’endotelio vascolare (VEGF). I composti dell’invenzione sono efficaci nella prevenzione o nel trattamento di una vasta gamma di patologie come complicanze del diabete (retinopatia, nefropatia e neuropatia diabetica), glaucoma neovascolare, rubeosi dell’iride, maculopatia degenerativa senile, retinopatia del prematuro, retinite pigmentosa, colon irritabile, morbo di Crohn, retto-colite ulcerosa, angioedema ereditario, teleangectasia emorragica ereditaria, malattie da accumulo lisosomiale, artrite reumatoide, psoriasi, morbo di Alzheimer, morbo di Parkinson, malattie coronariche, malattia distruttiva ossea, endometriosi, fibrosi polmonare, sclerosi sistemica, lupus eritematoso, tumori, danno polmonare acuto, sindrome da distress respiratorio acuto, danno renale acuto e malattia renale allo stadio terminale. Stato della tecnica L'invasione dello stroma da parte di cellule endoteliali proliferanti implica l'attivazione di enzimi proteolitici necessari per degradare la membrana basale dell'endotelio e la matrice extracellulare, consentendo così la migrazione delle cellule endoteliali attraverso le proteine della matrice lisata (Duran, C.L. et al., 2017. Compr. Physiol.8, 153-235). Tra i sistemi di proteasi coinvolti nell'angiogenesi, un ruolo centrale è svolto da un sistema formato dall’uPA, dal suo recettore uPAR e dal suo inibitore PAI. Tale sistema, oltre a regolare la proteolisi extracellulare mediante la degradazione della matrice extracellulare, attiva anche molte vie di segnale intracellulare, svolgendo così un ruolo più ampio, in più stadi, che caratterizzano diverse condizioni patologiche ed in particolare è un fattore chiave per la capacità invasiva dei tumori maligni. Di seguito si riportano alcune delle principali malattie associate al sistema uPA/uPAR/PAI, che rappresenta anche un efficace marcatore della progressione delle malattie [Madunić, J., 2018. Thromb. Haemost.118, 2020-2036; Dinesh, P. et al., 2018. Pharmacol. Res.134, 31- 39; Napolitano, F. et al., 2018. Front. Immunol.9, 574; Rosetti, F. et al., 2016. Immunol. Rev. 269, 175-193; Rubina, K.A. et al., 2017. Arch. Dermatol. Res. 309, 433-442; Davis, J. et al., 2003. J. Biol. Chem.278, 19054-19061; Walker, D.G. et al., 2002. Brain Res.926, 69-79; Reuland, C.J. et al., 2020. Med. Hypotheses 138, 109602; Pan, H., et al., 2018. Exp. Ther. Med. 15, 5517-5522; Farris, S.D. et al., 2011. J. Biol. Chem. 286, 22665-22677; Schuliga, M. et al., 2018. Int. J. Biochem. Cell. Biol.97, 108-117; Huang, J.M. et al., 2018. Front. Pharmacol.9, 1016; Huang, W. et al., 2017. Oncotarget 8, 66951-66959; Genua, M. et al., 2016, Inflamm. Bowel Dis.22, 2390-2401; Locri, F. et al., 2019. J. Mol. Med.1-11; Cammalleri, M. et al., 2019. J. Cell. Mol. Med. 1–17; Marsili, S. et al., 2017. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 58, 5802-5802; Rezzola, S. et al., 2017. Diabetologia 60, 719-728; Cammalleri, M. et al., 2017. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci.58, 3138-3148; Cammalleri, M. et al., 2016. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci.57, 2600-2611; Dal Monte, M. et al., 2015. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 56, 2392-2407; Paueksakon, P. et al., 2002. Kidney Int. 61, 2142- 2148; Hafer-Macko, C.E. et al., 2007. Neurology 69, 268-274; Kovacs, K. et al., 2015. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 56, 6523-6530; Castellano, G. et al., 2018. J. Allergy Clin. Immunol.142, 883-891; Sadick, H. et al., 2005. Haematologica 90, 818-828; DeGraba, T. et al., 2001. Ann. Neurol. 47, 229-233; Shetty, S. et al., 2007. Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol.295, L967-7; Chalkias, A. et al., 2020. Mol. Diagn. Ther.24, 517–521; Hall, A. et al., 2018. BMC Nephrology 19, 191; Zhao, Y. et al., 2015. PLoS ONE 10, e0132869; Dal Monte, M. et al., 2018. J. Cell. Mol. Med.23, 1034-1049]. Da questo quadro di riferimento emerge che il sistema uPA/uPAR/PAI rappresenta un importante target terapeutico in numerosissime patologie. Dalla letteratura sono noti molti composti che interferiscono con il sistema uPA/uPAR/PAI, i quali sono stati proposti per il trattamento di alcune importanti patologie, ma che ad oggi non hanno trovato ancora una valida applicazione come farmaci. Questi composti possono essere divisi in tre classi principali: 1) inibitori dell’attività proteolitica dell’uPA; 2) inibitori dell’uPAR; 3) inibitori dell’interazione tra uPAR e i suoi co-recettori. Alla prima classe appartengono, ad esempio, i composti rivendicati in US 2004/266766 proposti come agenti terapeutici per il trattamento malattie associate all'urochinasi, come tumori maligni e formazione di metastasi. L'invenzione riguarda in particolare inibitori selettivi dell’uPA, basati su aril-guanidina. Alla seconda classe appartengono i composti rivendicati in WO02069885, US6277818, WO2010102253. Questi ultimi sono peptidi inibitori dell’attivazione dell’uPA da parte dell’uPAR, e sono stati proposti per il trattamento di cancro epiteliale dell’ovaio persistente o ricorrente, carcinoma delle tube di Falloppio, carcinoma primario del peritoneo, edema retinico e maculopatia degenerativa senile. Alla terza classe appartengono i composti rivendicati in WO2008017372, WO2017121766, WO2017121764 che rivendicano tetra e penta peptidi che interferiscono con il sistema uPA/uPAR/PAI. Il peptide più studiato è UPARANT [Cammalleri, M. et al., 2019. Cells 8, 925; Cammalleri, M. et al., 2017. J. Diabetes Res. Article ID 2904150, 18 pages; Rezzola, S. et al., 2017. Diabetologia 60, 719-728; Cammalleri, M. et al., 2017. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci.58, 3138-3148; Dal Monte, M. et al., 2018. J. Cell. Mol. Med. 1–16; Cammalleri, M. et al., 2019. J. Cell. Mol. Med.23, 5176–5192; Cammalleri, M. et al., 2016. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci.57, 2600-2611; Locri, F. et al., 2019. J. Mol. Med. 97, 1273–1283; Dal Monte, M. et al., 2015. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci.56, 2392-2407; Carriero, M.V. et al., 2014. Mol. Cancer Ther.13, 1092-1104; Motta, C. et al., 2016. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci.57, 5723-5735; Boccella, S. et al., 2017. Inflamm. Res.66, 701-709; Rezzola, S. et al., 2017. Diabetologia 60, 719-728], che è stato proposto per la terapia di retinopatia diabetica, retinite pigmentosa, rubeosi dell’iride, maculopatia degenerativa senile, edema maculare, retinopatia del prematuro e nefropatia diabetica; WO2017178333 rivendica peptidi retroinversi di UPARANT proposti per il trattamento di melanoma e sarcoma metastatico. Il peptide ciclico [SRSRY] è descritto per il trattamento di osteosarcoma, condrosarcoma (Ingangi, V. et al., 2016. Oncotarget 7, 54474–54487) e malattie infiammatorie dell’intestino (Genua, M. et al., 2016. Inflamm. Bowel Dis. 22, 2390-2401). Tutti questi composti hanno in comune la caratteristica di essere inibitori della migrazione cellulare e della neoangiogenesi. Essi interferiscono con il sistema uPA/uPAR/PAI e sono tutti di natura peptidica e pertanto sono particolarmente costosi. Descrizione dell’invenzione I composti dell’invenzione si configurano come composti di ridotte dimensioni molecolari, di facile sintesi e purificazione, che possono essere prodotti a bassissimo costo e risultano più potenti inibitori della migrazione cellulare e della neoangiogenesi, oltre a presentare una significativa attività antiinfiammatoria. Pertanto, essi sono specificamente efficaci nella prevenzione o nel trattamento delle malattie in cui il sistema uPA/uPAR/PAI e/o i suoi co-recettori, come i recettori FPRs o le integrine o del VEGF, sono direttamente o indirettamente coinvolti. Le patologie associate alla disregolazione del sistema uPA/uPAR/PAI possono essere facilmente individuate sulla base dei valori anomali nei fluidi biologici della forma solubile di uPAR (SuPAR) come riportato nell’ampia letteratura disponibile [Wu CZ, et al.. Clin Biochem 2015; 48: 1324-1349; Zhang Q, et al. J Clin Lab Anal 2020; 34: e23097; Håkansson KEJ, et al. Respir Res 2019; 20: 258; Enocsson H, et al. J Autoimmun 2020; 106: 102340; Garnæs E, et al. PLoS One 2019; 14: e0220697; Gussen H, et al. J Intensive Care 2019; 7: 26; Frary CE, et al. Eur J Prev Cardiol 2019; 27: 570-578; van Oort PM, et al. ERJ Open Res 2019; 5: 00212-2018; Tsai PK, et al. Int J Environ Res Public Health 2019; 16: 1035; Gumus A, et al.Int J Chron Obstruct Pulmon Dis 2015; 10: 357-365; Guthoff M, et al. Sci Rep 2017; 7: 40627; Theilade S, et al. J Intern Med 2015; 277: 362-371; Eugen-Olsen J, et al. Eur J Clin Invest 2016; 46: 305–311; Okulu E, et al. J Clin Lab Anal 2015; 29: 347-352; Hoenigl M, et al. Clin Biochem 2013; 46: 225– 229]. SuPAR è presente nel siero, ma può anche essere trovato nel fluido cerebro-spinale, nelle urine, nella saliva o nel fluido pleurico e peritoneale e pericardico. La quantificazione dei livelli di suPAR è stata proposta anche per la valutazione della gravità in una serie di patologie, tra cui polmonite pneumococcica, [Loonen AJM, et al. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2017; 36: 1541-1547] polmonite nei bambini [Wrotek A, et al. Respir Physiol Neurobiol 2015; 209: 120-123] e fibrosi polmonare idiopatica [Johnson S, et al. Int J Radiat Biol 2020; 1–9]. SuPAR predice un rischio elevato dell’insorgenza della sindrome da distress respiratorio acuto nei pazienti con sepsi ed è positivamente associato a infiammazione e mortalità [Chen D, et al. Exp Ther Med 2019; 18: 2984–2992]. A titolo di esempio, i composti dell’invenzione possono essere adoperati nella prevenzione o nel trattamento di molte patologie come complicanze del diabete (retinopatia, nefropatia e neuropatia diabetica), glaucoma neovascolare, rubeosi dell’iride, maculopatia degenerativa senile, retinopatia del prematuro, retinite pigmentosa, colon irritabile, morbo di Crohn, retto-colite ulcerosa, angioedema ereditario, teleangectasia emorragica ereditaria, malattie da accumulo lisosomiale, artrite reumatoide, psoriasi, morbo di Alzheimer, morbo di Parkinson, malattie coronariche, malattia distruttiva ossea, endometriosi, fibrosi polmonare, sclerosi sistemica, lupus eritematoso, tumori, danno polmonare acuto, sindrome da distress respiratorio acuto, danno renale acuto e malattia renale allo stadio terminale. La loro attività biologica è più potente rispetto ai prodotti fino ad oggi noti e si manifesta a concentrazioni più basse. Descrizione dettagliata dell’invenzione La presente invenzione ha per oggetto composti di formula generale 1: 1 in cui: R ₁ è scelto fra S, O, NH, SO, SO ₂ o CH(Y), dove Y è H oppure un alchile contenente da 1 a 9 atomi di carbonio; R2 è un gruppo CH(X) o C2H3X, dove X è H o un alchile contenente da 1 a 9 atomi di carbonio; R ₃ è un gruppo aromatico o eteroaromatico contenente da 6 a 13 atomi di carbonio; R ₄ e R ₇ , uguali o diversi tra loro, sono scelti fra NHC=O, C=ONH, C=OO, OO=C, NHC=S, C=SNH, CH=CH, CH ₂ , oppure O; R ₅ e R ₈ , uguali o diversi tra loro, sono un gruppo basico scelto fra guanidina, imidazolo, ammino pirimidina, ammina, benzammidina; R ₆ è H o un alchile contenente da 1 a 9 atomi di carbonio; Z ₁ e Z ₂ , uguali o diversi tra loro, sono N, CH o C-COOH; n e m, uguali o diversi tra loro sono un intero da 1 a 5; e loro sali farmaceuticamente accettabili. Esempi di gruppi alchile contenenti da 1 a 9 atomi di carbonio sono metile, etile, n- propile, isopropile, n-butile, ter-butile. Esempi di gruppi aromatici contenenti da 6 a 13 atomi di carbonio sono fenile, 1- o 2-naftile, o indolo. Z ₁ e Z ₂ sono preferibilmente CH mentre il gruppo basico è preferibilmente un gruppo guanidino. Sono preferiti composti di formula generale 1 in cui: R ₁ è S, SO o SO ₂ ; R ₂ è CH ₂ , (CH ₂ ) ₂ o CH ₂ CH(CH ₃ ); R ₃ è fenile, 1-naftile, 2-naftile o indolo; R ₄ e R ₇ , uguali o diversi tra loro, sono NHC=O, C=ONH, C=OO, OO=C, NHC=S, C=SNH, CH=CH, CH ₂ oppure O; R ₅ e R ₈ , uguali o diversi tra loro, sono un gruppo a carattere basico scelto nel gruppo costituito da guanidina, imidazolo, ammino piridina, ammina, benzammidina; R ₆ è H o tert-butile; n e m, uguali o diversi tra loro sono un intero da 1 a 5; Z ₁ e Z ₂ , uguali o diversi tra loro, sono N, CH, o C-COOH; Maggiormente preferiti sono i composti di formula generale 1 in cui: R ₁ è S, SO o SO ₂ ; R ₂ è CH ₂ , (CH ₂ ) ₂ o CH ₂ CH(CH ₃ ); R ₃ è fenile, 1-naftile, 2-naftile o indolo; R ₄ e R ₇ , uguali o diversi tra loro, sono NHC=O oppure O; R ₅ e R ₈ sono un gruppo guanidino; R ₆ è H o tert-butile; n e m, uguali o diversi tra loro, sono 2 o 3; Z ₁ e Z ₂ , uguali o diversi tra loro, sono N o CH. Ancora più preferiti sono i composti di formula generale 1 in cui: R ₁ è S, SO o SO ₂ ; R ₂ è CH ₂ o (CH ₂ ) ₂ ; R ₃ è fenile, 1-naftile o 2-naftile; R ₄ e R ₇ , uguali o diversi tra loro, sono NHC=O oppure O; R ₅ e R ₈ sono guanidina; R ₆ è H o tert-butile; n e m, uguali o diversi tra loro, sono 2 o 3; Z ₁ e Z ₂ sono CH. I composti dell’invenzione possono essere sintetizzati adattando allo scopo metodi noti, ad esempio adattando alle esigenze sintetiche quanto descritto da Tew G.N. et al., 2002. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.99, 5110-5114. Essi si ottengono in altissime rese e con grande purezza. Lo schema 1 descrive una procedura sintetica generalizzata per l’ottenimento dei composti dell’invenzione. Nello schema, i gruppi Z e R e gli indici n e m hanno gli stessi significati riportati in precedenza. Schema 1. Schema generalizzato per la sintesi dei composti rivendicati. I composti dell’invenzione sono potenti inibitori della migrazione cellulare e della neoangiogenesi, che si manifesta a concentrazioni sub-fM, indotta da vari stimoli chemiotattici come il VEGF, il peptide fMLP, il peptide SRSRY o il siero fetale e presentano una significativa attività anti-infiammatoria. I composti dell’invenzione possono pertanto prevenire e curare molte patologie in cui il sistema uPA/uPAR/PAI e/o i suoi co-recettori, come i recettori FPRs, le integrine o il VEGF, sono direttamente o indirettamente coinvolti. Tali impieghi potranno facilmente essere determinati da un esperto del settore, ad esempio sulla base dei livelli di SuPAR nei fluidi biologici. I composti dell’invenzione possono essere adoperati per prevenire e curare patologie quali complicanze del diabete (retinopatia, nefropatia e neuropatia diabetica), colon irritabile, morbo di Crohn, retto-colite ulcerosa, tumori, danno polmonare acuto, sindrome da distress respiratorio acuto, danno renale acuto e malattia renale allo stadio terminale, glaucoma neovascolare, rubeosi dell’iride, maculopatia degenerativa senile, retinopatia del prematuro, retinite pigmentosa, angioedema ereditario, teleangectasia emorragica ereditaria, malattie da accumulo lisosomiale, endometriosi, fibrosi polmonare, sclerosi sistemica, lupus eritematoso, artrite reumatoide, psoriasi, morbo di Alzheimer, morbo di Parkinson, malattie coronariche, malattia distruttiva ossea. Ancora più preferibilmente, i composti dell’invenzione possono essere adoperati per prevenire e curare complicanze del diabete (retinopatia, nefropatia e neuropatia diabetica), colon irritabile, morbo di Crohn, retto-colite ulcerosa, tumori, danno polmonare acuto, sindrome da distress respiratorio acuto, danno renale acuto e malattia renale allo stadio terminale, glaucoma neovascolare, rubeosi dell’iride, maculopatia degenerativa senile, retinopatia del prematuro, retinite pigmentosa, angioedema ereditario, teleangectasia emorragica ereditaria, malattie da accumulo lisosomiale. I composti dell’invenzione presentano una grande efficacia nella prevenzione e trattamento delle patologie in cui è coinvolto il sistema uPA/uPAR/PAI, in particolare rispetto ai composti noti inibitori dell’interazione tra uPAR e i suoi co-recettori (WO2008017372, WO2017121766, WO2017121764, WO2017178333, WO02069885, US6277818, WO2010102253, Ingangi, V. et al., 2016. Oncotarget 7, 54474–54487; Genua, M. et al., 2016. Inflamm. Bowel Dis. 22, 2390-2401). Diversamente dai composti noti, i composti dell’invenzione non sono costituiti da alfa-amminoacidi e pertanto possono essere prodotti su scala industriale a costi molto più bassi. La loro struttura chimica consente inoltre di superare i ben noti limiti dei composti di natura peptidica ad oggi noti, quali ad esempio: bassa emivita plasmatica, degradazione da parte di proteasi, instabilità termica e dal pH, immunogenicità. I composti dell’invenzione sono anche strutturalmente molto diversi dagli inibitori dell’attività proteolitica dell’uPA che sono basati su aril guanidina (US 2004/266766) e dai composti inibitori dell’attivazione di uPAR (WO02069885, US6277818, WO2010102253). Per i previsti impieghi terapeutici, i composti dell’invenzione possono essere formulati come tali, oppure sotto forma di sali, in composizioni farmaceutiche somministrabili per via orale, parenterale, topica, aerosol o transdermica, eventualmente in associazioni con altri ingredienti attivi. I dosaggi unitari sull’uomo possono variare entro ampi limiti, tipicamente da 0,1 μg a 1 g per dose, preferibilmente tra 0,1 mg e 100 mg, che saranno comunque facilmente determinabili dall’esperto a secondo della patologia da trattare, della sua gravità e delle condizioni del paziente, in particolare peso, sesso ed età. I seguenti esempi illustrano l’invenzione in maggior dettaglio. ABBREVIAZIONI: uPA - urochinasi Attivatore del Plasminogeno; uPAR - recettore dell’urochinasi Attivatore del Plasminogeno; PAI - Inibitore dell’Attivatore del Plasminogeno; FPRs - Recettori del Formil Peptide; VEGF - Fattore di crescita dell’endotelio vascolare; suPAR - recettore dell’urochinasi Attivatore del Plasminogeno solubile; ESI-MS - Ionizzazione ElectroSpray-Spettrometria di Massa; NMR - Spettroscopia di Risonanza Magnetica Nucleare; TFA - Acido Trifluoroacetico; DMSO – Dimetilsolfossido; ACN – Acetonitrile; HPLC - Cromatografia Liquida ad Alta Pressione; FCS/FBS - Siero Fetale vitello/Bovino; DMEM - Terreno di cultura Eagle modificato di Dulbecco; EBM - terreno basale Eagle; HUVEC - Cellule Umane Endoteliali della Vena Ombelicale; CAM - Membrana Corio-Allantoidea; PBS - Tampone Fosfato Salino. ESEMPIO 1 Preparazione di 2,6-N,N’-di(3-guanidil)-propanammide-4-t-butil-1-(2- feniletil)sulfanil-benzene (IRI-N-19001), composto di formula generale 1 in cui: R ₁ è S; R ₂ è (CH ₂ ) ₂ ; R ₃ è fenile; R ₄ e R ₇ sono NHC=O; R ₅ e R ₈ , sono guanidina; R ₆ è tert-butile; n= 2; Z ₁ e Z ₂ sono CH; 1) Preparazione di 2,6-dinitro-4-t-butil-fenil(4-metil)-benzensulfonato (C ₁₇ H ₁₈ N ₂ O ₇ S; peso molecolare: 394.43). 2,6-Dinitro-4-t-butil-fenolo (30 g, 125 mmol) e tosil cloruro (24 g, 125 mmol) furono disciolti in 450 ml di CH ₂ Cl ₂ e fu aggiunta di-isopropil-etilammina (24 mL, 138 mmol) alla soluzione. La miscela fu lasciata sotto agitazione a temperatura ambiente per 2 ore. La soluzione fu lavata con una soluzione al 10% acido citrico ed in seguito con una soluzione satura di NaCl. La fase organica fu seccata su Na ₂ SO ₄ . Il solvente fu rimosso mediante rotoevaporazione e il prodotto fu ottenuto come solido cristallino leggermente giallo e con rese quantitative (46.2 g). ¹ H NMR (600 MHz, CDCl ₃ ), δ: 1.40 (s, 9H), 2.50 (s, 3H), 7.39 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.80 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 8.11 (s, 2H). ESI-MS: calcolato 395.4 ([M-H] ⁺ ); trovato 432.2 ([M-K] ⁺ ). 2) Preparazione del 2,6-dinitro-4-t-butil-1-(2-feniletil)sulfanil-benzene (C ₁₈ H ₂₀ N ₂ O ₄ S; peso molecolare: 360.43). Il 2,6-dinitro-4-t-butil-fenil-(4-metil)-benzensulfonato (30.0 g, 76 mmol), il 2-feniletil sulfano (10 g 72 mmol) e la di-isopropil-etilammina (13.3 mL, 76 mmol) furono disciolti in 480 mL di CH ₂ Cl ₂ . La soluzione fu lasciata sotto agitazione in atmosfera di azoto per 18 ore. La soluzione fu estratta con diclorometano e lavata in sequenza con 0.5 M NaOH, 10% acido citrico, con una soluzione satura di Na ₂ CO ₃ e con una soluzione satura di NaCl. La fase organica fu anidrificata su Na ₂ SO ₄ . Il crudo fu cromatografato su gel di silice (150 g; eluenti: esano ed acetato di etile, da 100:0 a 96:4), ottenendo 25.1 g di un solido bianco (resa: 92 %). ¹ H NMR (600 MHz, CDCl ₃ ), δ: 1.37 (s, 9H), 2.87 (t, J = 8.2 Hz, 2H), 3.17 (t, J = 7.7 Hz, 2H), 7.15 (d, J = 7.3 Hz, 2H), 7.19 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 7.27 (t, J= 7.4 Hz, 2H), 7.79 (s, 2H). ESI-MS: calcolato 360.4 ([M-H] ⁺ ); trovato 383.2 ([M-Na] ⁺ ), 399.2 ([M-K] ⁺ ). 3) Preparazione del 2,6-diammino-4-t-butil-1-(2-fenetil)sulfanil benzene (C ₁₈ H ₂₀ N ₂ S; peso molecolare: 300.46). Il 2,6-dinitro-4-t-butil-1-(2-fenetil)sulfanil benzene (10.0 g, 28 mmol), il cloruro di ammonio (7.9 g, 148 mmol) e lo zinco in polvere (14 g, 214 mmol) furono sospesi in 360 mL di metanolo. La miscela fu lasciata sotto agitazione al buio e in atmosfera di argon per 18 ore. La miscela di reazione fu seccata per rotoevaporazione, risospesa in toluene e filtrata su celite (eluenti: toluene ed acetato di etile, 1/1 v/v). Il filtrato fu seccato per rotoevaporazione, ottenendo un solido bianco con resa quantitativa (8.4 g). ¹ H NMR (600 MHz, DMSO-d ₆ ), δ: 1.17 (s, 9H), 2.78 (s, 4H), 5.04 (bs, 4H), 6.04 (s, 2H), 7.16-7.21 (m, 3H), 7.24-7.30 (m, 2H). ESI-MS: calcolato 301.2 ([M-H] ⁺ ); trovato 301.3. 4) Preparazione del 2,6-N,N’-di(3-guanidil)-propanamide-4-t-butil-1-(2- fenetil)sulfanil-benzene (C ₂₆ H ₃₈ N ₈ O ₂ S; peso molecolare: 526.70). L’acido Boc-3-ammino-propanoico (7.6 g, 40 mmol) fu disciolto in tetraidrofurano anidro (475 mL) e portato a -78°C con un bagno di ghiaccio secco/acetone e isobutilcloroformiato (6.2 mL, 48 mmol) fu aggiunto lentamente alla soluzione. La miscela fu lasciata sotto agitazione per un’ora. Il 2,6-diammino-4-t-butil-1-(2-feniletil)sulfanil benzene (6.0 g, 20 mmol) e la trietilammina (17.6 mL, 120 mmol) furono aggiunti alla stessa temperatura e la reazione fu lasciata sotto agitazione per 18 ore, portando progressivamente la temperatura verso la t.a. La miscela di reazione fu seccata al rotoevaporatore ed il residuo fu risospeso in 95% acido trifluoroacetico alla temperatura di 0°C per la rimozione del gruppo Boc. La reazione fu progressivamente riscaldata a t.a., lasciata sotto agitazione per 2 ore e quindi seccata mediante rotoevaporazione. Il residuo fu disciolto in una miscela di acqua ed acetonitrile (350 mL, 1/1 v/v) ed alla sospensione fu aggiunta la 1H-pirazolo-1-carbossiammidina (16.8 g, 152 mmol). La miscela così ottenuta fu lasciata sotto agitazione magnetica per 18 ore. Il solvente fu rimosso sotto pressione ridotta. Il residuo fu purificato mediante cromatografia a fase inversa (RP-C18, eluenti: acqua 0.1% TFA (v/v), acetonitrile 0.1% TFA (v/v)), ottenendo 5.3 g di un solido bianco. Resa (sale di trifluoroacetato): 34%. ¹ H NMR (600 MHz, H ₂ O/D ₂ O = 90/10), δ: 1.24 (s, 9H), 2.61-2.65 (m, 6H), 2.86 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 3.47 (q, J = 6.4 Hz, 4H), 7.09 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.18 (bt, J = 5.8 Hz, 2H), 7.20-7.21 (m, 1H), 7.26 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 7.49 (bs, 2H), 9.53 (bs, 2H). ESI-MS: calcolato 527.30 ([M-H] ⁺ ), trovato 527.15. ESEMPIO 2 Preparazione della N,N'-(5-(tert-butil)-2-(fenetilsulfinil)-1,3-fenilene) bis(3(guanidil)propanammide) (IRI-N-19001-SO) (C ₂₆ H ₃₈ N ₈ O ₃ S; peso molecolare: 542.7), composto di formula generale 1 in cui: R ₁ è S=O; R ₂ è (CH ₂ ) ₂ ; R ₃ è fenile; R ₄ e R ₇ sono NHC=O; R ₅ e R ₈ , sono guanidina; R ₆ è tert-butile; n= 2; m=2; Z ₁ e Z ₂ sono CH; Il composto ottenuto nell’esempio 1 è stato sciolto nella minima quantità di acqua ossigenata al 30% e tenuto per 1h sotto agitazione. Il prodotto è liofilizzato e si ottiene quantitativamente il prodotto desiderato. ESEMPIO 3 Preparazione del 2,6-N,N’-di(3-guanidil)-propanamide-4-t-butil-1-(1- naftilmetil)sulfanil-benzene (IRI-N-19006), composto di formula generale 1 in cui: R ₁ è S; R ₂ è CH ₂ ; R ₃ è 1-naftile; R ₄ e R ₇ sono NHC=O; R ₅ e R ₈ , sono guanidina; R ₆ è tert-butile; n= 2; m=2; Z ₁ e Z ₂ sono CH; 1) Preparazione di naftalen-1-il metantiolo (C ₁₁ H ₁₀ S; peso molecolare: 174.26). Ad una soluzione di 1-(clorometil)-naftalene (4.77 mL, 0.030 mol) in etanolo (15 mL) fu aggiunta la tiourea (2.28 g, 0.030 mol). La miscela fu riscaldata alla temperatura di riflusso e lasciata sotto agitazione magnetica alla stessa temperatura per 2 ore. La sospensione fu raffreddata a temperatura ambiente, filtrata, il solido lavato più volte con etanolo, ed il filtrato fu concentrato al rotoevaporatore fino ad ottenere una sospensione bianca. Una soluzione di acido cloridrico 4 M fu aggiunta fino a pH 2. La miscela fu estratta con diclorometano e lavata con una soluzione satura di NaCl. Le fasi organiche riunite furono anidrificate su Na ₂ SO ₄ e il solvente fu rimosso mediante rotoevaporazione, ottenendo un olio incolore con rese quantitative (5.20 g). ¹ H NMR (600 MHz, CDCl ₃ ), δ: 1.84 (t, 1H), 4.12 (d, 2H), 7.3-8.1 (m, 7H). 2) Preparazione del (4-(t-butil)-2,6-dinitrofenil)(naftalen-1-il-metil)-sulfano (C ₂₁ H ₂₀ N ₂ O ₄ S; peso molecolare: 396.46). Il 2,6-dinitro-4-t-butil-fenil-(4-metil)-benzensulfonato (1.0 g, 2.5 mmol), il naftalen-1-il metantiolo (442 mg, 2.5 mmol), e la di-isopropil-etilammina (426 μL, 2.5 mmol) furono disciolti in 15 mL di CH ₂ Cl ₂ . La soluzione fu lasciata sotto agitazione in atmosfera di azoto per 18 ore. La soluzione fu poi estratta con diclorometano e lavata in sequenza con 0.5 M NaOH, 10% acido citrico, con una soluzione satura di Na ₂ CO ₃ e infine con una soluzione satura di NaCl. Le fasi organiche riunite furono anidrificate su Na ₂ SO ₄ ed il solvente fu rimosso mediante rotoevaporazione. Il crudo fu cromatografato su gel di silice (30 g; eluenti: esano ed acetato di etile, da 100:0 a , ottenendo 876 mg di un solido leggermente giallino. Resa: 88 %. ¹ H NMR (600 MHz, CDCl ₃ ), δ: 1.38 (s, 9H), 4.68 (s, 2H), 7.36 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 7.42 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 7.50 (t, J = 7.0 Hz, 1H), 7.57 (t, J = 6.9 Hz, 1H), 7.79 (s, 2H), 7.80 (d, J = 8.3, 1H), 7.85 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 8.12 (d, J = 8.4 Hz, 1H). ESI-MS: calcolato 397.11 ([M-H] ⁺ ), trovato 434.80 ([M-K] ⁺ ). 3) Preparazione della 5-(t-butil)-2-((naftalen-1-il-metil)-tio)-benzene-1,3- diammina (C ₂₁ H ₂₄ N ₂ S; peso molecolare: 336.50). Il (4-(t-butil)-2,6-dinitrofenil)(naftalen-1-il-metil)-sulfano (450 mg, 1.14 mmol), il cloruro di ammonio (323 mg, 6.04 mmol) e lo zinco in polvere (565 mg, 8.64 mmol) furono sospesi in 13 mL di metanolo. La miscela fu lasciata sotto agitazione al buio e in atmosfera di argon per 18 ore. La miscela di reazione fu seccata per rotoevaporazione, risospesa in toluene e filtrata su celite (eluenti: toluene ed acetato di etile, 1/1 v/v), ottenendo un filtrato leggermente giallino. Il filtrato fu seccato per rotoevaporazione, ottenendo un solido leggermente giallino con resa quantitativa (406 mg). ¹ H NMR (600 MHz, DMSO-d ₆ ), δ: 1.17 (s, 9H), 4.20 (s, 2H), 5.01 (bs, 4H), 6.03 (s, 2H), 7.36-7.39 (m, 2H), 7.51-7.58 (m, 2H), 7.82 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 7.92 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 8.24 (d, J = 8.2 Hz, 1H). ESI-MS: calcolato 337.17 ([M-H] ⁺ ); trovato 337.20. 4) Preparazione della N,N'-(5-(t-butil)-2-((naftalen-1-il-metil)-tio)-1,3- fenilene)-bis(3-((diamminometilene)-ammino)-propanammide) (C ₂₉ H ₃₈ N ₈ O ₂ S; peso molecolare: 562.74). L’acido Boc-3-ammino-propanoico (98 mg, 298 μmol) fu disciolto in tetraidrofurano anidro (5 mL) e portato a -78°C con un bagno di ghiaccio secco/acetone e isobutilcloroformiato (49 mg, 358 μmol) fu aggiunto lentamente alla soluzione. La miscela fu lasciata sotto agitazione per un’ora. La 5-(t-butil)-2-((naftalen-1-il-metil)-tio)-benzene- 1,3-diammina (50 mg, 149 μmol) e la trietilammina (12 μL, 894 μmol) furono aggiunte e la reazione fu lasciata sotto agitazione per 18 ore. La miscela di reazione fu seccata al rotoevaporatore ed il residuo fu risospeso in 95% acido trifluoroacetico alla temperatura di 0°C. La reazione fu lasciata sotto agitazione per 2 ore e quindi seccata mediante rotoevaporazione. Il residuo fu disciolto in una miscela di acqua ed acetonitrile (10 mL, 1/1 v/v) e alla sospensione fu aggiunta la 1H-pirazolo-1-carbossiammidina (219 mg, 1.5 mmol). La miscela così ottenuta fu lasciata sotto agitazione magnetica per 18 ore. Il solvente fu rimosso sotto pressione ridotta. Il residuo fu purificato mediante cromatografia a fase inversa (RP-C18, eluenti: acqua 0.1% TFA (v/v), acetonitrile 0.1% TFA (v/v)), ottenendo 51 mg di un solido bianco. Resa (sale di trifluoroacetato): 44%. ¹ H NMR (600 MHz, H ₂ O/D ₂ O = 90/10), δ: 1.20 (s, 9H), 2.16 (t, J = 6.6 Hz, 4H), 3.30 (t, J = 6.7 Hz, 4H), 4.17 (s, 2H), 6.62 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 7.11 (t, J = 7.7 Hz, 1H), 7.48 (bs, 2H), 7.52 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 7.58 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 7.71 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.89 (d, J = 8.7 Hz, 1H). ESI- MS: calcolato 563.28 ([M-H] ⁺ ), trovato 563.15. ESEMPIO 4 Di seguito si riportano le caratteristiche di composti sintetizzati con i metodi rispettivamente descritti negli esempi 1 e 3. Tutti i campioni sono stati caratterizzati mediante HPLC analitico utilizzando una colonna Vydac 208TP C85 µm, 150 x 4.6 mm. Eluenti: A (H ₂ O 0.1% TFA); B (ACN 0.1% TFA). IRI-N-19001-NH ₂ : N,N'-(5-(tert-butil)-2-(fenetiltio)-1,3-fenilene)bis(3- amminopropanammide) In cui, R ₁ è S; R ₂ è (CH ₂ ) ₂ ; R ₃ è fenile; R ₄ e R ₇ sono NHC=O; R ₅ e R ₈ , sono ammina; R ₆ è t-butile; n= 2; m=2; Z ₁ e Z ₂ sono CH. Formula: C ₂₄ H ₃₄ N ₄ O ₂ S. Peso molecolare: 442.6. Metodo HPLC analitico: 1.0- 1.5 min :10 %B; 1.5-20.0 min: 10-95% B; 20.0-22.5 min: 95% B; 22.5-25.0 min: 95-10% B; 25.0-27.5 min: 10% B. Flusso: 1.0 mL/min. Tempo di ritenzione HPLC: 10.2 min. Analisi mediante spettrometria di massa (ESI-MS): m/z 443.20 ([M-H] ⁺ ). Spettro NMR protonico: ¹ H NMR (600 MHz, DMSO-d ₆ ), δ: 1.36 (s, 9H), 2.79 (t, J = 7.8 Hz, 2H), 2.84- 2.86 (m, 4H), 2.98 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 3.15-3.20 (m, 4H), 7.26 (d, J = 7.4 Hz, 2H), 7.30 (t, J= 7.3 Hz, 1H), 7.38 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 7.82 (bs, 2H), 7.92 (bs, 4H). IRI-N19001-NH ₂ -SO: N,N'-(5-(tert-butil)-2-(fenetilsulfinil)-1,3-fenilene) bis(3- amminopropan ammide), composto di formula generale 1, in cui: R ₁ è S=O; R ₂ è (CH ₂ ) ₂ ; R ₃ è fenile; R ₄ e R ₇ sono NHC=O; R ₅ e R ₈ , sono ammina; R ₆ è t-butile; n= 2; m=2; Z ₁ e Z ₂ sono CH; Formula: C ₂₄ H ₃₄ N ₄ O ₃ S. Peso molecolare: 458.6. Metodo HPLC analitico: 1.0- 1.5 min :10 %B; 1.5-20.0 min: 10-95% B; 20.0-22.5 min: 95% B; 22.5-25.0 min: 95-10% B; 25.0-27.5 min: 10% B. Flusso: 1.0 mL/min. HPLC: 9.51 min. Analisi mediante spettrometria di massa (ESI-MS): m/z 459.20 ([M-H] ⁺ ). Spettro NMR protonico: ¹ H NMR (600 MHz, DMSO-d ₆ ), δ: 1.35 (s, 9H), 2.74 (t, J = 6.7 Hz, 4H), 3.08-3.20 (m, 6H), 3.47-3.52 (m, 1H), 3.75-3.79 (m, 1H), 7.34 (t, J = 7.0 Hz, 1H), 7.37 (d, J= 7.3 Hz, 2H), 7.43 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 7.97 (bs, 6H). IRI-N-19001: N,N'-(5-(tert-butil)-2-(fenetiltio)-1,3-fenilene)bis(3- ((diamminometilene)ammino) propanammide), composto di formula generale 1, in cui: R ₁ è S; R ₂ è (CH ₂ ) ₂ ; R ₃ è fenile; R ₄ e R ₇ sono NHC=O; R e R ₈ , sono guanidina; R ₆ è t- butile; n= 2; m=2; Z ₁ e Z ₂ sono CH; Formula: C ₂₆ H ₃₈ N ₈ O ₂ S. Peso molecolare: 526.3. Metodo HPLC analitico: isocratico, 25% B (ACN 0.1% TFA); durata: 10 minuti. Tempo di ritenzione HPLC: 5.28 min. Analisi mediante spettrometria di massa (ESI-MS): m/z 527.2 ([M-H] ⁺ ). Spettro NMR protonico: ¹ H NMR (600 MHz, H ₂ O/D ₂ O = 90/10), δ: 1.24 (s, 9H), 2.61-2.65 (m, 6H), 2.86 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 3.47 (q, J = 6.4 Hz, 4H), 7.09 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.18 (bt, J = 5.8 Hz, 2H), 7.20-7.21 (m, 1H), 7.26 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 7.49 (bs, 2H), 9.53 (bs, 2H). IRI-N-19001-SO: N,N'-(5-(tert-butil)-2-(fenetilsulfinil)-1,3-fenilene)bis(3- ((diamminometilene) ammino)propanammide), composto di formula generale 1, in cui: R ₁ è S=O; R ₂ è (CH ₂ ) ₂ ; R ₃ è fenile; R ₄ e R ₇ sono NHC=O; R ₅ e R ₈ , sono guanidina; R ₆ è t- butile; n= 2; m=2; Z ₁ e Z ₂ sono CH; Formula: C ₂₆ H ₃₈ N ₈ O ₃ S. Peso molecolare: 542.70. Metodo HPLC analitico: isocratico, 25% B (ACN 0.1% TFA); durata: 10 minuti. Tempo di ritenzione HPLC: 3.66 min. Analisi mediante spettrometria di massa (ESI-MS): m/z 543.20 ([M-H] ⁺ ). Spettro NMR protonico: ¹ H NMR (600 MHz, H ₂ O/D ₂ O = 90/10), δ: 1.29 (s, 9H), 2.63-2.66 (m, 4H), 2.97-3.02 (m, 1H), 3.06-3.10 (m, 1H), 3.34-3.39 (m, 1H),3.43-3.50 (m, 4H), 3.64-3.69 (m, 1H), 7.27 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 7.32 (t, J = 7.3 Hz, 1H), 7.38 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 7.56 (s, 2H), 10.10 (bs, 2H). IRI-N-19025-NH ₂ : N,N'-(5-(tert-butil)-2-(fenetiltio)-1,3-fenilene)bis(4- amminobutanammide), composto di formula generale 1, in cui: R ₁ è S; R ₂ è (CH ₂ ) ₂ ; R ₃ è fenile; R ₄ e R ₇ sono NHC=O; R ₅ e R ₈ , sono ammina; R ₆ è t-butile; n= 2; m=3; Z ₁ e Z ₂ sono CH; Formula: C ₂₆ H ₃₈ N ₄ O ₂ S. Peso molecolare: 470.7. Metodo HPLC analitico: 1.0- 1.5 min :10 %B; 1.5-20.0 min: 10-95% B; 20.0-22.5 min: 95% B; 22.5-25.0 min: 95-10% B; 25.0-27.5 min: 10% B. Flusso: 1.0 mL/min. Tempo di ritenzione HPLC: 11.16 min. Analisi mediante spettrometria di massa (ESI-MS): m/z 471.25 ([M-H] ⁺ ). Spettro NMR protonico: ¹ H NMR (600 MHz, DMSO-d ₆ ), δ: 1.35 (s, 9H), 1.94 (dt, J =14.9, 7.3 Hz, 4H), 2.54 (t, J=7.1 Hz, 4H), 2.78 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.96-2.99 (m, 6H), 7.25 (d, J = 7.4 Hz, 2H), 7.30 (t, J= 7.1 Hz, 1H), 7.38 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 7.80 (bs, 2H), 7.83 (bs, 4H). IRI-N-19025-NH ₂ -SO: N,N'-(5-(tert-butil)-2-(fenetilsulfinil)-1,3-fenilene)bis(4- amminobutan ammide), composto di formula generale 1, in cui: R ₁ è S=O; R ₂ è (CH ₂ ) ₂ ; R ₃ è fenile; R ₄ e R ₇ sono NHC=O; R ₅ e R ₈ , sono ammina; R ₆ è t-butile; n= 2; m=3; Z ₁ e Z ₂ sono CH; Formula: C ₂₆ H ₃₈ N ₄ O ₃ S. Peso molecolare: 486.7. Metodo HPLC analitico: 1.0- 1.5 min :10 %B; 1.5-20.0 min: 10-95% B; 20.0-22.5 min: 95% B; 22.5-25.0 min: 95-10% B; 25.0-27.5 min: 10% B. Flusso: 1.0 mL/min. Tempo di ritenzione HPLC: 9.93 min. Analisi mediante spettrometria di massa (ESI-MS): m/z 487.20 ([M-H] ⁺ ). Spettro NMR protonico: ¹ H NMR (600 MHz, DMSO-d ₆ ), δ: 1.35 (s, 9H), 1.91 (dt, J =14.9, 7.4 Hz, 4H), 2.47 (t, J=7.1 Hz, 4H), 2.94 (t, J = 7.4 Hz, 4H), 3.09-3.13 (m, 1H), 3.16-3.20 (m, 1H), 3.49- 3.54 (m, 1H), 3.68-3.72 (m, 1H), 7.33-7.37 (m, 3H), 7.43 (t, J= 7.6 Hz, 2H), 7.90 (bs, 6H). IRI-N-19025: N,N'-(5-(tert-butil)-2-(fenetiltio)-1,3-fenilene)bis(4- ((diamminometilene)ammino)butanammide), composto di formula generale 1, in cui: R ₁ è S; R ₂ è (CH ₂ ) ₂ ; R ₃ è fenile; R ₄ e R ₇ sono NHC=O; R ₅ e R ₈ , sono guanidina; R ₆ è t- butile; n = 2; m =3; Z ₁ e Z ₂ sono CH; Formula: C ₂₈ H ₄₂ N ₈ O ₂ S. Peso molecolare: 554.76. Metodo HPLC analitico: isocratico, 25% B (ACN 0.1% TFA); durata: 10 minuti. Tempo di ritenzione HPLC: 7.24 min. Analisi mediante spettrometria di massa (ESI-MS): m/z 555.30 ([M-H] ⁺ ). Spettro NMR protonico: ¹ H NMR (600 MHz, H ₂ O/D ₂ O = 90/10), δ: 1.30 (s, 9H), 1.93 (m, 4H), 2.48 (t, J = 7.6 Hz, 4H), 2.71 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 2.94 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 3.24 (t, J = 6.7 Hz, 4H), 7.16 (d, J = 7.7 Hz, 2H), 7.21 (bs, 1H), 7.27 (t, J = 7.1 Hz, 1H), 7.33 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 7.57 (s, 2H), 9.51 (bs, 2H). IRI-N-19025-SO: N,N'-(5-(tert-butil)-2-(fenetilsulfinil)-1,3-fenilene)bis(4- ((diamminometilene)ammino)butanammide), composto di formula generale 1 in cui: R ₁ è S=O; R ₂ è (CH ₂ ) ₂ ; R ₃ è fenile; R ₄ e R ₇ sono NHC=O; R ₅ e R ₈ , sono guanidina; R ₆ è t- butile; n = 2; m =3; Z ₁ e Z ₂ sono CH; Formula: C ₂₈ H ₄₂ N ₈ O ₃ S. Peso molecolare: 570.8. Metodo HPLC analitico: isocratico, 25% B (ACN 0.1% TFA); durata: 10 minuti. Tempo di ritenzione HPLC: 4.24 min. Analisi mediante spettrometria di massa (ESI-MS): m/z 571.30 ([M-H] ⁺ ). Spettro NMR protonico: ¹ H NMR (600 MHz, H ₂ O/D ₂ O = 90/10), δ: 1.29 (s, 9H), 1.85 (dt, J= 7.4, 15.0 Hz, 4H), 2.41 (t, J = 7.8 Hz,4H), 3.01-3.06 (m, 1H), 3.11-3.16 (m, 1H), 3.19 (t, J=7.3 Hz, 4H), 3.30-3.36 (m, 1H), 3.69-3.73 (m,1H), 7.29 (d, J = 7.3 Hz, 2H), 7.32 (t, J = 7.3 Hz, 1H), 7.38 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 7.56 (bs, 2H). IRI-N-19002: N,N'-(2-(benziltio)-5-(tert-butil)-1,3-fenilene)bis(3- ((diamminometilene)ammino)propanammide), composto di formula generale 1 in cui: R ₁ è S; R ₂ è CH ₂ ; R ₃ è fenile; R ₄ e R ₇ sono NHC=O; R ₅ e R ₈ , sono guanidina; R ₆ è t-butile; n= 2; m=2; Z ₁ e Z ₂ sono CH; Formula: C ₂₅ H ₃₆ N ₈ O ₂ S. Peso molecolare: 512.68. Metodo HPLC analitico: isocratico, 25% B (ACN 0.1% TFA); durata: 10 minuti. Tempo di ritenzione HPLC: 4.54 min. Analisi mediante spettrometria di massa (ESI-MS): m/z 513.10 ([M-H] ⁺ ). Spettro NMR protonico: ¹ H NMR (600 MHz, H ₂ O/D ₂ O= 90/10), δ: 1.22 (s, 9H), 2.59 (t, J = 13.0 Hz, 4H), 3.46 (q, J = 6.4 Hz, 4H), 3.67 (s, 2H), 6.89-6.90 (m, 2H), 7.14-7.16 (m, 3H), 7.20 (bt, 2H), 7.53 (bs, 2H), 9.25 (bs, 2H). IRI-N-19004: N,N'-(5-(tert-butil)-2-((naftalen-2-ilmetil)tio)-1,3-fenilen e)bis(3- ((diammino metilene)ammino)propanammide), composto di formula generale 1 in cui: R ₁ è S; R ₂ è CH ₂ ; R ₃ è 2-naftile; R ₄ e R ₇ sono NHC=O; R ₅ e R ₈ , sono guanidina; R ₆ è t- butile; n= 2; m=2; Z ₁ e Z ₂ sono CH; C ₂₉ H ₃₈ N ₈ O ₂ S. Peso molecolare: 562.74. Metodo HPLC analitico: isocratico, 25% B (ACN 0.1% TFA); durata: 12 minuti. Tempo di ritenzione HPLC: 10.21 min. Analisi mediante spettrometria di massa (ESI-MS): m/z 563.10 ([M-H] ⁺ ). Spettro NMR protonico: ¹ H NMR (600 MHz, H ₂ O/D ₂ O= 90/10), δ: 1.21 (s, 9H), 2.44 (bt, J = 6.5 Hz, 4H), 3.24-3.34 (m, 4H), 3.83 (s, 2H), 7.12 (bs, 1H), 7.18 (d, J = 9.3 Hz, 1H), 7.43-7.47 (m, 2H), 7.51 (bs, 2H), 7.60 (bd, J = 7.3 Hz, 1H), 7.73 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 7.80 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 9.12 (bs, 2H). IRI-N-19006: N,N'-(5-(tert-butil)-2-((naftalen-1-ilmetil)tio)-1,3-fenilen e)bis(3- ((diammino metilene)ammino)propanammide), composto di formula generale 1 in cui: R ₁ è S; R ₂ è CH ₂ ; R ₃ è 1-naftile; R ₄ e R ₇ sono NHC=O; R ₅ e R ₈ , sono guanidina; R ₆ è t- butile; n= 2; m=2; Z ₁ e Z ₂ sono CH; Formula: C ₂₉ H ₃₈ N ₈ O ₂ S; Peso molecolare: 562.74; Metodo HPLC analitico: isocratico, 25% B (ACN 0.1% TFA); durata: 12 minuti; Tempo di ritenzione HPLC: 8.03 min. Analisi mediante spettrometria di massa (ESI-MS): m/z 563.10 ([M-H] ⁺ ); Spettro NMR protonico: ¹ H NMR (600 MHz, H ₂ O/D ₂ O = 90/10), δ: 1.20 (s, 9H), 2.16 (t, J = 6.6 Hz, 4H), 3.30 (t, J = 6.7 Hz, 4H), 4.17 (s, 2H), 6.62 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 7.11 (t, J = 7.7 Hz, 1H), 7.48 (bs, 2H), 7.52 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 7.58 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 7.71 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.89 (d, J = 8.7 Hz, 1H). ESEMPIO 5 Saggi di attività anti-angiogenica ex vivo su anelli di aorta di ratto Aorte toraciche provenienti da ratti maschi di 5-10 settimane furono tagliate in anelli da circa 1 mm. Gli anelli furono collocati sul fondo di una piastra da 24 pozzetti (posizionando l’asse luminale parallelamente al fondo del pozzetto) e incubati con una soluzione polimerizzante di fibrina. Dopo 5 min, ai pozzetti fu aggiunto VEGF (30 ng/mL) in un appropriato mezzo di coltura in presenza o in assenza dei composti dell’invenzione alla concentrazione di 100 μM. Il mezzo fu cambiato tre volte alla settimana a partire dal giorno 3. La risposta angiogenica fu misurata contando il numero di nuovi vasi che germogliavano nel tempo (Tabella 1). I filamenti endoteliali furono contati dopo 6 giorni di incubazione. Tabella 1 - Filame numero di anelli) ottenuti incubando gli anelli con VE mposti indicati. Composto Filamenti VEGF 17±4 VEGF/IRI-N-19001 1.0±0.4 VEGF/IRI-N-19002 1.4±0.5 VEGF/IRI-N-19004 1.2±0.5 VEGF/IRI-N-19025 1.9±1.1 ESEMPIO 6 Saggi in vivo sulla Membrana Corio-Allantoidea (CAM) 42 uova di gallina fertilizzate furono disinfettate con una soluzione etanolica al 20% e incubate alla temperatura di 37-38 °C e al 40-60% di umidità all’interno di un’incubatrice per uova a rotazione. Le uova furono posizionate orizzontalmente e incubate per i successivi 11 giorni per favorire lo sviluppo embrionale. Il giorno 11, mediante speratura, fu identificata la posizione della CAM per 36 uova, fu rimossa la camera d’aria e furono aperte fessure nel guscio tali da poter posizionare filtri di carta sterile imbevuti degli effettori a diverse concentrazioni (V = 2.5 uL) in corrispondenza della CAM. Al giorno 14, le CAM furono fotografate utilizzando uno stereomicroscopio (Carl Zeiss Vision GmbH). Mediante scheletonizzazione delle immagini e il software AngioTool64 0.6a fu effettuata un’analisi quantitativa (conta dei vasi provenienti dal filtro) e determinata la percentuale di neovascolarizzazione alle diverse concentrazioni di effettori (Tabella 2). Tabella 2 - Effetto dei composti indicati sulla neo-vascolarizzazione di CAM. ) VEGF165/IRI-N-19004-0.001 ug 33 VEGF165/IRI-N-19004-0.0001 ug 38 ESEMPIO 7 Test di attività anti-infiammatoria in vivo Topi maschi immunocompetenti C57Bl/6N (8-10 settimane) furono infettati con ceppi di P. aeruginosa RP73 (da 4 a 6 x 10 ⁵ CFU, Colony Forming Units), incorporati in microsfere di agar. Le microsfere furono preparate seguendo procedure di letteratura (Bayes HK, Ritchie N, Irvine S, Evans TJ. A murine model of early Pseudomonas aeruginosa lung disease with transition to chronic infection. Sci Rep.2016 Nov 2;6:35838. doi: 10.1038/srep35838) e furono somministrate ai topi mediante iniezione intra-tracheale. Somministrazioni sottocutanee dei composti dell’invenzione, alla concentrazione di 12 mg/kg, o del veicolo furono eseguite sui topi 18 ore prima dell’inoculazione del batterio e furono ripetute quotidianamente per 6 giorni. L’analisi dello stato di salute generale dei topi fu condotta da una a due volte al giorno per tutta la durata dell’esperimento. Dopo 6 giorni dall’infezione, i topi furono sacrificati mediante inalazione di anidride carbonica. L’analisi del fluido broncoalveolare (BALF) indicò una significativa riduzione del numero di neutrofili nei topi trattati rispetto a quelli trattati con il solo veicolo. Non fu registrata una significativa riduzione del numero di macrofagi nei topi trattati rispetto a quelli trattati con il solo veicolo (Tabella 3). Tabella 3. Effetto in vivo dei composti indicati (alla dose di 12 mg/kg) sul reclutamento di neutrofili e macrofagi in topi C57Bl/6N. - - - ± - ± - ± IRI-N-19025 -50±10 -55±9 -8±5