技术领域

本发明涉及生物技术领域。 具体地说， 本发明涉及天冬氨酸激酶 ΙΠ(简称 AK III， 又称 LysC)的突变体及其应用。 背景技术

L-赖氨酸是人类和动物营养中最重要的必需氨� ��酸， 在食品工业、 养殖业和 词料工业中有着十分重要的地位。 近年来， 其市场需求稳步增加， 世界市场销售 量已经突破百万吨规模。 目前， 赖氨酸主要采用微生物发酵法来生产。

在许多微生物中 L-赖氨酸的合成途径是以天冬氨酸为前体的， 包括两步和甲 硫氨酸和苏氨酸等氨基酸共用的步骤。 在大肠杆菌中， L-赖氨酸生物合成途径经 过九步的酶催化过程 （如下式所示)。 其中， 天冬氨酸激酶催化赖氨酸生物合成的 第一步反应， 是赖氨酸生产的限速步骤， 它的活力决定着代谢流流向 L-赖氨酸合 成途径的比例。 在大肠杆菌中有三个天冬氨酸激酶， 分别命名为天冬氨酸激酶 I (AK I， 由 thrA基因编码)、 天冬氨酸激酶 II (AK II， 由 metL基因编码)、 天冬氨 酸激酶 ΠΙ (ΑΚ ΠΙ， 由 lysC基因编码， 其编码基因的核苷酸序列如 SEQ ID NO: 1 所示， 其氨基酸序列如 SEQ ID NO: 2所示)。 AK I和 AK II是双功能酶， 都还具 有高丝氨酸脱氢酶活性。 AK I在酶活性水平受到苏氨酸和赖氨酸的反馈抑� �， AK III在酶活性水平受终产物赖氨酸的反馈抑制（ Bearer CF, Neet KE; Stadtman, E. ., Cohen, G.N., LeBras, G.， obichon-Szulmaj ster, H. ( 1961). "Feed-back Inhibition and Repression of Aspartokinase Activity in Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae." J. Biol. Chem. ) 。 AK II在酶活水平不受天冬氨酸家族氨基酸的反馈� �� 制但是受到转录水平严谨调控 （X Dong, PJ Quinn, X Wang. ( 201 1). " Metabolic engineering of Escherichia coli and Corynebacterium glutamicum for the production of L-threonine.，， Biotechnology advances ) 。

从天冬氨酸到 L-赖氨酸的生物合成途径

目前大肠杆菌已经被多家企业改造用来进行赖 氨酸的工业化生产。 由于天冬 氨酸激酶活性收到赖氨酸严谨的调控， 解除赖氨酸对天冬氨酸激酶的反馈抑制是 发展高产赖氨酸菌株的必经之路。 杜邦公司通过随机突变筛选获得了两种解除反 馈抑制的 AK III突变体， 分别是将 352苏氨酸用异亮氨酸替换 (T352I)和 318位甲 硫氨酸用异亮氨酸替换 (M318I) (EP1394257)。 日本味之素公司也获得部分解除赖 氨酸反馈抑制的 ΑΚ ΠΙ突变体 (US005661012、 US2010190216, US2010173368)。

此外， 由于天冬氨酸激酶是 L-赖氨酸、 L-苏氨酸和 L-甲硫氨酸的合成途径所 共用的酶， 例如， 中国专利 CN 1071378C公开了一种解除反馈抑制的天冬氨酸激 酶以及利用该激酶和包含该激酶的宿主生产 L-苏氨酸的方法。 如果能够获得具有 高比活和有效解除 L-赖氨酸反馈抑制的天冬氨酸激酶， 对于 L-赖氨酸、 L-苏氨酸 和 L-甲硫氨酸， 甚至以 L-苏氨酸为前体合成的其他代谢物， 包括 L-异亮氨酸和 L-缬氨酸的生产都具有重要的意义。 因此， 综上所述， 本领域急需具有高酶活和有效解除 L-赖氨酸反馈抑制天冬 氨酸激酶突变体。 发明内容

本发明的目的在于提供具有高酶活和解除 L-赖氨酸反馈抑制的 AK III突变 体以及此类突变体的应用与使用方法。 在第一方面， 本发明提供一种天冬氨酸激酶， 所述天冬氨酸激酶的氨基酸序 列在对应于 SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列的第 340位的氨基酸残基为非天冬氨 酸。

在优选的实施方式中， 所述天冬氨酸激酶来源于埃希氏菌属细菌， 优选地， 来源于大肠杆菌。

在优选的实施方式中， 所述天冬氨酸激酶：

a. 具有如 SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列且第 340位的氨基酸残基为非天冬 氨酸， 或

b. 具有 a)所限定的序列经过一个或几个氨基酸残基， 优选 1-20个、 更优选 1-15个、 更优选 1-10个、 更优选 1-3个、 最优选 1个氨基酸残基的取代、 缺失或 添加而形成的序列， 且基本具有 a)所限定的天冬氨酸激酶功能的由 a)衍生的天冬 氨酸激酶。

在优选的实施方式中，所述天冬氨酸激酶的氨 基酸序列在对应于 SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列的第 340位的氨基酸残基选自以下氨基酸的至少一种 ： Pro、Ala、 Arg、 Lys、 Gln、 Asn、 Val、 lie, Leu、 Met禾口 Phe。

在进一步优选的实施方式中， 所述天冬氨酸激酶的氨基酸序列在对应于 SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列的第 340位的氨基酸残基选自 Pro、 Arg或 Val。

在优选的实施方式中， 所述天冬氨酸激酶：

a. 其氨基酸序列如 SEQ ID NO: 4、 6或 8所示； 或

b. 包含 (a)所限定的序列经过一个或几个氨基酸残基， 优选 1-20个、 更优选

1-15个、 更优选 1-10个、 更优选 1-3个、 最优选 1个氨基酸残基的取代、 缺失或 添加而形成的序列， 且基本具有 a所限定的天冬氨酸激酶功能的由 a衍生的天冬 氨酸激酶。

在进一步优选的实施方式中，所述天冬氨酸激 酶的氨基酸序列如 SEQ ID NO: 4、 6或 8所示。

在优选的实施方式中， 所述天冬氨酸激酶解除赖氨酸反馈抑制。

在另一优选的实施方式中， 在 10 mM浓度的 L-赖氨酸存在下， 所述的天冬 氨酸激酶至少保留 20%以上的活性； 优选地， 30%-40%以上的活性； 更优选地， 50%-60%以上的活性； 更优选地， 70%-80%以上的活性； 最优选， 90%以上的活 性。

在进一步优选的实施方式中， 所述的天冬氨酸激酶在 20 mM浓度的 L-赖氨 酸存在下， 所述的天冬氨酸激酶至少保留 20%以上的活性； 优选地， 30%-40%以 上的活性； 更优选地， 50%-60%以上的活性； 更优选地， 70%以上的活性； 最优 选， 80%以上的活性。

在更进一步优选的实施方式中， 所述的天冬氨酸激酶在 100 mM浓度的 L-赖 氨酸存在下， 所述的天冬氨酸激酶至少保留 20%以上的活性； 优选地， 30%-40% 以上的活性； 更优选地， 50%-60%以上的活性； 更优选地， 70%以上的活性； 最 优选， 80%以上的活性。 在第二方面， 本发明提供编码本发明第一方面所述天冬氨酸 激酶的基因。 在优选的实施方式中， 所述基因的核苷酸序列如 SEQ ID NO: 3、 5或 7所示。 在第三方面， 本发明提供包含本发明第二方面所述编码基因 的载体。 在第四方面， 本发明提供一种宿主细胞， 所述宿主细胞含有本发明第二方面 所述的编码基因。

在优选的实施方式中，所述天冬氨酸激酶的氨 基酸序列在对应于 SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列的第 340位的氨基酸残基选自以下氨基酸的至少一种 ： Pro、Ala、 Arg、 Lys、 Gln、 Asn、 Val、 Ile、 Leu、 Met禾卩 Phe。

在进一步优选的实施方式中， 所述天冬氨酸激酶的氨基酸序列在对应于 SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列的第 340位的氨基酸残基选自 Pro、 Arg或 Val。

在优选的实施方式中， 所述天冬氨酸激酶：

a. 其氨基酸序列如 SEQ ID NO: 4、 6或 8所示； 或

b. 包含 a所限定的序列经过一个或几个氨基酸残基， 优选 1-20个、 更优选 1 -15个、 更优选 1- 10个、 更优选 1 -3个、 最优选 1个氨基酸残基的取代、 缺失或 添加而形成的序列， 且基本具有 a所限定的天冬氨酸激酶功能的由 a衍生的天冬 氨酸激酶。

在另一优选的实施方式中， 所述基因的核苷酸序列如 SEQ ID NO: 3、 5或 7 所示。

在优选的实施方式中， 所述宿主细胞来自埃希氏菌属 （Escherichia)、 棒状杆 菌属 (Corynebacterium)、短杆菌属 (Brevibacterium sp. )、芽孢杆菌属 (Bacillus) ^ 沙雷氏菌属 （Serratia)或弧菌属 (Vibrio)。

在进一步优选的实施方式中， 所述宿主细胞是大肠杆菌 （E. Coli)或谷氨酸棒 状杆菌 (Corynebacterium glutamicum)。

在优选的实施方式中， 所述宿主细胞染色体上整合有本发明第二方面 所述的 编码基因或含有本发明第三方面所述的载体。

在优选的实施方式中， 所述宿主细胞表达本发明的天冬氨酸激酶。

在另一优选的实施方式中， 所述宿主细胞中选自以下的一个或多个基因被 弱 化或表达降低：

a. 编码乙醇脱氢酶的 adhE基因；

b. 编码乙酸激酶的 ackA基因；

c 编码磷酸乙酰转移酶的 pta基因； d. 编码乳酸脱氢酶的 ldhA基因；

e. 编码甲酸转运蛋白的 focA基因；

f. 编码丙酮酸甲酸裂解酶的 pflB基因；

g. 编码丙酮酸氧化酶的 poxB基因；

h. 编码天冬氨酸激酶 1/高丝氨酸脱氢酶 I双功能酶的 thrA基因；

i. 编码高丝氨酸激酶的 thrB基因；

j. 编码赖氨酸脱羧酶的 ldcC基因； 和

h. 编码赖氨酸脱羧酶的 cadA基因。

在另一优选的实施方式中， 所述宿主细胞中选自以下的一个或多个基因被 增 强或过表达：

a.编码解除赖氨酸反馈抑制的二氢二吡啶合成� ��的 dapA基因；

b.编码二氢二吡啶二羧酸还原酶的 dapB基因；

c编码二氨基庚二酸脱氢酶的 ddh基因；

d.编码四氢吡啶二羧酸琥珀酰酶的 dapD和编码琥珀酰二氨基庚二酸脱酰酶 的 dapE;

e.编码天冬氨酸-半醛脱氢酶的 asd基因；

f.编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的 ppc基因； 或

g.编码烟酸胺腺嘌呤二核苷酸转氢酶的 pntAB基因。 在第五方面， 本发明提供本发明第四方面所述宿主细胞在生 产 L-氨基酸中的 应用。 在第六方面，本发明提供一种制备 L-氨基酸的方法，所述方法包括以下步骤: a. 培养权利要求 4所述的宿主细胞， 使之产生 L-氨基酸； 和

b. 从培养液中分离 L-氨基酸。

在优选的实施方式中， 所述方法在 30-45°C， 更优选在 37°C实施。 在第七方面， 本发明提供本发明第一方面所述的天冬氨酸激 酶在生产 L-氨基 酸中的应用。

在本发明第六方面和第七方面的优选实施方式 中，所述的 L-氨基酸为 L-赖氨 酸、 L-苏氨酸、 L-甲硫氨酸、 L-异亮氨酸或 L-缬氨酸。 在第八方面， 本发明提供一种制备 L-赖氨酸、 L-苏氨酸、 L-甲硫氨酸、 L-异 亮氨酸或 L-缬氨酸方法， 所述方法包括以下步骤：

a. 利用本发明第一方面所述的天冬氨酸激酶 （EC 2.7.2.4)， 催化从 L-天冬氨 酸生成 L-赖氨酸、 L-苏氨酸、 L-甲硫氨酸、 L-异亮氨酸或 L-缬氨酸过程中的以下 反应， 进而获得 L-赖氨酸、 L-苏氨酸、 L-甲硫氨酸、 L-异亮氨酸或 L-缬氨酸，

ATP ADP

H ₃ N H £C 2.7.2 H ₃ :N H ό ά

L-天冬氯酸 L-天冬氨酰 -Φ基磷酸； 和

b. 从以上反应体系中分离 L-赖氨酸、 L-苏氨酸、 L-甲硫氨酸、 L-异亮氨酸或 L- 缬氨酸。 在第九方面，本发明提供制备本发明第一方面 所述天冬氨酸激酶的方法，所述方 法包括以下步骤：

a. 改造 SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列的编码序列， 使得编码的氨基酸序列中对 应于 SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列的第 340位的氨基酸残基突变为非天冬氨酸； b. 将 a得到的编码序列直接转染合适的宿主细胞或� �载体引入合适的宿主细胞; c 培养 b得到的宿主细胞；

d. 从步骤 c得到的培养体系中分离所述宿主细胞产生的� �冬氨酸激酶； 和 e. 测定所述天冬氨酸激酶解除赖氨酸反馈抑制的 能力。

在优选的实施方式中， 所述天冬氨酸激酶的氨基酸序列在对应于 SEQ ID NO: 2 所示氨基酸序列的第 340位的氨基酸残基选自以下氨基酸的至少一种 ： Pro、 Ala、 Arg、 Lys、 Gln、 Asn、 Val、 Ile、 Leu、 Met禾卩 Phe。

在进一步优选的实施方式中， 所述天冬氨酸激酶的氨基酸序列在对应于 SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列的第 340位的氨基酸残基选自 Pro、 Arg或 Val。 在本发明的第十方面，本发明提供改造野生型 天冬氨酸激酶使之解除赖氨酸反馈 抑制的方法， 所述方法包括以下步骤：

a. 将野生型天冬氨酸激酶的氨基酸序列与 SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列作比 对； 和

b. 改造所述野生型天冬氨酸激酶的编码序列， 使得编码的氨基酸序列中对应于 SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列的第 340位的氨基酸残基突变为非天冬氨酸；

c 将 b得到的编码序列直接转染合适的宿主细胞或� �载体引入合适的宿主细胞; d. 培养 c得到的宿主细胞；

e. 从步骤 d得到的培养体系中分离所述宿主细胞产生的� �冬氨酸激酶； 和 f. 测定所述天冬氨酸激酶解除赖氨酸反馈抑制的 能力。

在优选的实施方式中， 所述天冬氨酸激酶的氨基酸序列在对应于 SEQ ID NO: 2 所示氨基酸序列的第 340位的氨基酸残基选自以下氨基酸的至少一种 ： Pro、 Ala、 Arg、 Lys、 Gln、 Asn、 Val、 Ile、 Leu、 Met禾卩 Phe。

在进一步优选的实施方式中， 所述天冬氨酸激酶的氨基酸序列在对应于 SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列的第 340位的氨基酸残基选自 Pro、 Arg或 Val。 应理解， 在本发明范围内中， 本发明的上述各技术特征和在下文 (如实施例)中具 体描述的各技术特征之间都可以互相组合， 从而构成新的或优选的技术方案。 限于篇 幅， 在此不再一一累述。 附图说明

图 1比较了本发明的 AK III突变体和野生型 AK III的粗酶液相对酶活。

图 2显示了含 6-His Tag的本发明天冬氨酸激酶 (D340R)以及 I418T、 F413A、 G401K和 Y420A的突变体和野生型 AK III的纯酶相对酶活。 具体实施方式

发明人经过广泛而深入的研究， 出乎意料地发现对大肠杆菌来源的天冬氨酸 激酶 III的第 340位进行遗传改造， 获得的天冬氨酸激酶 III突变体不仅具有优秀 的酶活性， 还有效解除了 L-赖氨酸的反馈抑制， 从而能用于高效生产 L-赖氨酸。 在此基础上完成了本发明。 本发明的天冬氨酸激酶

本文所用的术语 "本发明的天冬氨酸激酶"和 "本发明的多肽"可互换使用， 并具有本领域普通技术人员通常理解的含义。 本发明的天冬氨酸激酶具有将磷酸 基团转移到天冬氨酸的活性。

在具体的实施方式中， 本发明天冬氨酸激酶的氨基酸序列在对应于 SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列的第 340位的氨基酸残基为非天冬氨酸。

在优选的实施方式中， 本发明天冬氨酸激酶的氨基酸序列在对应于 SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列的第 340位的氨基酸残基选自以下氨基酸的至少一种 ： Pro、 Ala, Arg、 Lys、 Gln、 Asn、 Val、 lie, Leu、 Met禾口 Phe。

在优选的实施方式中， 本发明天冬氨酸激酶的氨基酸序列在对应于 SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列的第 340位的氨基酸残基选自 Pro、 Arg或 Val。

在优选的实施方式中， 本发明天冬氨酸激酶：

(a) 其氨基酸序列如 SEQ ID NO: 4、 6或 8所示； 或

(b) 包含 (a)所限定的序列经过一个或多个氨基酸残基的 取代、 缺失或添加而 形成的序列， 且基本具有 (a) 所限定的天冬氨酸激酶功能的由 (a)衍生的天冬氨酸 激酶。

在具体的实施方式中，本发明的天冬氨酸激酶 在 10 mM以上浓度的赖氨酸存 在下，优选地 20 mM， 更优选地， 在 100 mM以上浓度的赖氨酸存在下， 有效解除 赖氨酸反馈抑制。

本领域普通技术人员不难知晓， 在多肽的某些区域， 例如非重要区域改变少 数氨基酸残基基本上不会改变生物活性， 例如， 适当替换某些氨基酸得到的序列 并不会影响其活性（可参见 Watson等， Molecular Biology of The Gene, 第四版， 1987， The Benjamin/Cummings Pub. Co. P224)。 因此， 本领域普通技术人员能够 实施这种替换并且确保所得分子仍具有所需生 物活性。

因此， 本发明的多肽可以在对应于 SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列的第 340 位的氨基酸残基为非天冬氨酸的基础上作进一 步突变而仍具备本发明天冬氨酸激 酶的功能和活性。例如本发明的天冬氨酸激酶 (a) 其氨基酸序列如 SEQ ID NO: 4、 6或 8所示； 或 (b) 包含 (a)所限定的序列经过一个或多个氨基酸残基， 优选 1-20 个、 更优选 1- 15个、 更优选 1-10个、 更优选 1-3个、 最优选 1个氨基酸残基的取 代、 缺失或添加而形成的序列， 且基本具有 (a) 所限定的多肽功能的由 (a)衍生的 多肽。

在本发明中， 本发明的天冬氨酸激酶包括与氨基酸序列如 SEQ ID NO: 4、 6 或 8所示的天冬氨酸激酶相比， 有至多 20个、 较佳地至多 10个， 再佳地至多 3 个， 更佳地至多 2个， 最佳地至多 1个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换 而形成的突变体。 这些保守性变异的突变体可根据， 例如下表所示进行氨基酸替 换而产生。

本发明还提供了编码本发明多肽的多核苷酸。 术语 "编码多肽的多核苷酸" 可以是包括编码此多肽的多核苷酸， 也可以是还包括附加编码和 /或非编码序列的 多核苷酸。 因此， 本文所用的 "含有" ， "具有" 或 "包括" 包括了 "包含" 、 "主要 由……构成"、 "基本上由……构成"、和 "由 …构成"； "主要由……构成"、 "基本上由……构成" 和 "由……构成" 属于 "含有" 、 "具有" 或 "包括" 的 下位概念。 对应于 SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列的第 340位的氨基酸残基

本领域普通技术人员均知道， 可在某个蛋白的氨基酸序列中对一些氨基酸残 基作出各种突变， 例如取代、 添加或缺失， 但得到的突变体仍能具备原蛋白的功 能或活性。 因此， 本领域普通技术人员可对本发明具体公开的氨 基酸序列作出一 定改变而得到仍具有所需活性的突变体，那么 这种突变体中与 SEQ ID NO: 2所示 氨基酸序列的第 340位的氨基酸残基相对应的氨基酸残基可能就 不是第 340位， 但如此得到的突变体仍应落在本发明的保护范 围内。

本文所用的术语 "对应于" 具有本领域普通技术人员通常理解的意义。 具体 地说， "对应于" 表示两条序列经同源性或序列相同性比对后， 一条序列与另一 条序列中的指定位置相对应的位置。 因此， 就 "对应于 SEQ ID NO: 2所示氨基酸 序列的第 340位的氨基酸残基"而言， 如果在 SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列的一 端加上 6-His标签， 那么所得突变体中对应于 SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列的第 340位就可能是第 346位； 而如果删除 SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列中的少数氨 基酸残基，那么所得突变体中对应于 SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列的第 340位就 可能是第 338位， 等等。 再例如， 如果一条具有 400个氨基酸残基的序列与 SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列的第 20-420位具有较高的同源性或序列相同性，那么 所 得突变体中对应于 SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列的第 340位就可能是第 320位。

在具体的实施方式中， 所述同源性或序列相同性可以是 80%以上， 优选 90% 以上， 更优选 95%-98%， 最优选 99%以上。

本领域普通技术人员公知的测定序列同源性或 相同性的方法包括但不限于： 计算机分子生物学 (Computational Molecular Biology), Lesk， A.M.编， 牛津大学出 版社， 纽约， 1988 ; 生物计算： 信息学和基因组项目（Biocomputing:Informatics and Genome Projects), Smith, D.W.编， 学术出版社， 纽约， 1993 ; 序列数据的计算 机分析（Computer Analysis of Sequence Data), 第一部分， Griffin, A.M.禾卩 Griffin, H.G.编， Humana Press,新泽西， 1994;分子生物学中的序列分析（Sequence Analysis in Molecular Biology) , von Heinje , G.，学术出版社， 1987和序列分析引物（Sequence Analysis Primer), Gribskov, M.与 Devereux, J.编 M Stockton Press, 纽约， 1991 和 Carillo, H.与 Lipman, D.， SIAM J. Applied Math.， 48: 1073(1988)。 测定相同 性的优选方法要在测试的序列之间得到最大的 匹配。 测定相同性的方法编译在公 众可获得的计算机程序中。 优选的测定两条序列之间相同性的计算机程序 方法包 括但不限于： GCG程序包 （Devereux, J.等， 1984)、 BLASTP、 BLASTN和 FASTA(Altschul， S， F.等， 1990)。 公众可从 NCBI和其它来源得到 BLASTX程 序 （BLAST手册， Altschul, S.等， NCBI NLM NIH Bethesda, Md.20894; Altschul, S.等， 1990)。 熟知的 Smith Waterman算法也可用于测定相同性。 宿主细胞

本文所用的术语"宿主细胞"具有本领域普通技� ��人员通常理解的含义， 即， 能够产生本发明天冬氨酸激酶的宿主细胞。 换言之， 本发明可以利用任何宿主细 胞， 只要本发明的天冬氨酸激酶能在该宿主细胞中 表达。

例如， 在具体的实施例中， 本发明利用的是包含外源性的本发明天冬氨酸 激 酶编码基因的宿主细胞， 优选 AK缺陷型大肠杆菌菌株。 但本领域普通技术人员 应该知道， 本发明不限于包含外源性编码基因的宿主细胞 。 例如， 本发明的宿主 细胞中包含的天冬氨酸激酶的编码基因不仅可 以是重组载体或质粒， 还有可能是 基因组上整合有所述酶的编码基因， BP , 在基因组整合上的酶的编码基因可能是 通过转入质粒进行同源重组得到， 也有可能在基因组上定点突变相应的位点而得 到。

在具体的实施方式中， 本发明的宿主细胞能够高效产生 L-氨基酸， 且具有对 L-赖氨酸的抗反馈抑制能力。

在具体的实施方式中， 本发明的宿主细胞能够产生 L-赖氨酸、 L-苏氨酸、 L- 甲硫氨酸、 L-异亮氨酸或 L-缬氨酸。

在具体的实施方式中，所述天冬氨酸激酶的氨 基酸序列在对应于 SEQ ID NO:

2所示氨基酸序列的第 340位的氨基酸残基选自以下氨基酸的至少一种 ： Pro、Ala、 Arg、 Lys、 Gln、 Asn、 Val、 Ile、 Leu、 Met禾口 Phe。

在优选的实施方式中，所述天冬氨酸激酶的氨 基酸序列在对应于 SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列的第 340位的氨基酸残基选自 Pro、 Arg或 Val。

在优选的实施方式中， 所述天冬氨酸激酶：

(a) 其氨基酸序列如 SEQ ID NO: 4、 6或 8所示； 或

(b) 包含 (a)所限定的序列经过一个或多个氨基酸残基的 取代、 缺失或添加而 形成的序列， 且基本具有 (a) 所限定的天冬氨酸激酶功能的由 (a)衍生的天冬氨酸 激酶。

在优选的实施方式中， 所述基因的核苷酸序列如 SEQ ID NO: 3、 5或 7所示。 在优选的实施方式中， 所述的宿主细胞来自埃希氏菌属 （Escherichia)、 棒状 杆菌属 (Corynebacterium)、 短杆菌属 (Brevibacterium sp. )、 芽孢杆菌属

(Bacillus), 沙雷氏菌属 （Serratia)或弧菌属 (Vibrio)。

在优选的实施方式中， 所述的宿主细胞是大肠杆菌 （E. Coli)或谷氨酸棒状杆 菌 (Corynebacterium glutamicum)。

在优选的实施方式中， 所述宿主细胞中选自以下的一个或多个基因被 弱化或 表达降低：

a. 编码乙醇脱氢酶的 adhE基因；

b. 编码乙酸激酶的 ackA基因；

c 编码磷酸乙酰转移酶的 pta基因；

d. 编码乳酸脱氢酶的 ldhA基因；

e. 编码甲酸转运蛋白的 focA基因；

f. 编码丙酮酸甲酸裂解酶的 pflB基因；

g. 编码丙酮酸氧化酶的 poxB基因；

h. 编码天冬氨酸激酶 1/高丝氨酸脱氢酶 I双功能酶的 thrA基因；

I. 编码高丝氨酸激酶的 thrB基因；

j. 编码赖氨酸脱羧酶的 ldcC基因； 和

h. 编码赖氨酸脱羧酶的 cadA基因。

此外， 本领域普通技术人员应理解， 就 L-赖氨酸的生产而言， 细胞中特定生 物合成途径、 糖酵解、 回补代谢中一种或多种酶的增强或过表达是有 益的。 因此， 在一些实施方式中， 除本发明所述基因外， 可同时增强或过表达其它相关基因， 例如， 选自以下的一个或多个基因被增强或过表达：

a.编码解除赖氨酸反馈抑制的二氢二吡啶合成� ��的 dapA基因（EP1477564) ; b.编码二氢二吡啶二羧酸还原酶的 dapB基因 (EP1253195);

c编码二氨基庚二酸脱氢酶的 ddh基因 (EP1253195)。

d.编码四氢吡啶二羧酸琥珀酰酶的 dapD和编码琥珀酰二氨基庚二酸脱酰酶 的 dapE(EP1253195);

e.编码天冬氨酸-半醛脱氢酶的 asd基因 (EP1253195);

f.编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的 ppc基因 (EP1253195); 或

g.编码烟酸胺腺嘌呤二核苷酸转氢酶的 pntAB基因 (EP1253195)。 此外， 出于实验便利的目的， 本发明利用本身的天冬氨酸激酶失活的突变菌 株检测本发明天冬氨酸激酶突变体的酶活以及 解除赖氨酸反馈抑制的能力。 但本 领域普通技术人员应该知道在设置对照的前提 下， 本身的天冬氨酸激酶未失活的 天然菌株也可用于检测本发明天冬氨酸激酶突 变体的酶活以及解除赖氨酸反馈抑 制的能力。 本发明多肽或本发明宿主细胞的应用

本发明多肽可作为天冬氨酸激酶催化从 L-天冬氨酸合成 L-赖氨酸过程中的 以下反应， 进而获得 L-赖氨酸： H ₃ H H EC 2.7.2.4 H _:i rf H o 0

L-天冬氨酸 L-天冬氨酰 -4-基磷酸

此外， 本领域普通技术人员已知天冬氨酸激酶是 L-赖氨酸、 L-苏氨酸和 L- 甲硫氨酸以及从 L-苏氨酸合成 L-异亮氨酸和 L-缬氨酸的共同合成途径所用的酶。 因此， 本领域普通技术人员结合本发明的教导和现有 技术， 不难明白本发明的多 肽或宿主细胞不仅可用于生产 L-赖氨酸， 还可用于生产 L-苏氨酸、 L-甲硫氨酸、 L-异亮氨酸和 L-缬氨酸。

进一步地， 本领域普通技术人员不难明白， 也可分离本发明天冬氨酸激酶高 水平产生的中间体， L-天冬氨酰 -4-基磷酸， 以便用于， 例如 L-苏氨酸、 L-甲硫氨 酸、 L-异亮氨酸和 L-缬氨酸等各种下游产物的生产。

在具体的实施方式中， 本发明的宿主细胞可以在 30-45°C， 优选 37°C产生 L- 赖氨酸。 解除赖氨酸反馈抑制

本领域技术人员应理解， 本文所用的术语 "解除赖氨酸反馈抑制" 是指一种 原本受到赖氨酸反馈抑制的酶， 在经过改造后令其受赖氨酸抑制程度降低。 这种 降低是通过两种酶在相同赖氨酸浓度下的抑制 程度比较获得的。 "解除赖氨酸反 馈抑制" 包含了反馈抑制的部分解除到全部解除。 而抑制程度是指在一定浓度的 赖氨酸存在下， 与不存在赖氨酸时相比， 天冬氨酸激酶酶活性损失（即受到抑制） 的比例。 在这种条件下， 天冬氨酸激酶酶活性保留下来的比例， 称为酶活残存比 例或酶活保留比例或相对酶活， 由于：

酶活损失比例 + 酶活残存比例 = 100%，

所以经常用酶活残存比例表示抑制程度。酶活 残存比例越高，抑制程度越低。 相应的， "解除赖氨酸反馈抑制" 也通常用改造前后两个酶残存酶活比例的比较 来刻画。

在具体的实施方式中， 在 lO mM L-赖氨酸存在下， 本发明的天冬氨酸激酶至 少能保留 20%以上的活性， 与野生型天冬氨酸激酶相比， 解除了赖氨酸反馈抑制； 优选地，保留 30-40%以上的活性；更优选， 50%-60%以上的活性；更优选， 70%-80% 以上的活性； 更优选， 90%以上的活性。

在优选的实施方式中， 本发明的天冬氨酸激酶在 20 mM浓度的 L-赖氨酸存 在下， 本发明的天冬氨酸激酶至少能保留 20%以上的活性， 与野生型天冬氨酸激 酶相比， 解除了赖氨酸反馈抑制； 优选地， 保留 30-40%以上的活性； 更优选， 保 留 50%-60%以上的活性； 更优选， 保留 70%以上的活性； 更优选， 保留 80%以上 的活性。

在优选的实施方式中， 本发明的天冬氨酸激酶在 100 mM浓度的 L-赖氨酸存 在下， 至少能保留 20%以上的活性， 与野生型天冬氨酸激酶相比， 解除了赖氨酸 反馈抑制； 优选地， 保留 30-40%以上的活性； 更优选， 保留 50%-60%以上的活 性； 更优选， 保留 70%以上的活性； 更优选， 保留 80%以上的活性。 增强 /弱化

本发明中术语 "增强" 是指微生物由 DNA编码的一种或多种酶的胞内活性 的增加， 包括但不限于通过增加编码基因的拷贝数， 通过增强转录或翻译强度， 或换用编码具有升高活性的酶的基因或等位基 因， 及任选地组合使用这些方法。

本发明中术语 "弱化" 是指微生物中由 DNA所编码的一种或多种酶或蛋白 质的胞内活性降低或消除， 包括但不限于通过删除部分或全部编码基因、 基因阅 读框移码突变、 弱化转录或翻译强度、 或使用编码具有较低活性的相应酶或蛋白 质的基因或等位基因， 及任选地组合使用这些方法。 固定化酶

本文所用的术语 "固定化酶" 具有本领域普通技术人员常规理解的含义。 具 体地说， 该术语表示水溶性酶经物理或化学方法处理后 ， 使酶与水不溶性大分子 载体结合或把酶包埋在其中， 使得酶在水中溶性凝胶或半透膜的微囊体从而 导致 流动性降低。

固定化的酶仍具有酶活性， 在催化反应中以固相状态作用于底物。 酶经固定 化后一般稳定性增加， 易从反应系统中分离， 且易于控制， 能反复多次使用。 便 于运输和贮存， 有利于自动化生产。 固定化酶是近十余年发展起来的酶应用技术， 在工业生产、 化学分析和医药等方面有诱人的应用前景。

本领域普通技术人员鉴于本文的教导， 不难将本发明的天冬氨酸激酶处理成 固定化酶， 进而用于催化从天冬氨酸到 L-赖氨酸的反应， 从而既能高效地产生 L- 赖氨酸， 又能有效解除赖氨酸反馈抑制。 本发明的应用与优点

1. 本发明提供的各种天冬氨酸激酶、其编码基因 以及包含所述编码具有的宿 主细胞可以在工业上应用以产生 L-赖氨酸和其它氨基酸；

2. 本发明提供的各种天冬氨酸激酶是一种高比活 和有效解除 L-赖氨酸反馈 抑制的天冬氨酸激酶。 因此， 本发明的各种天冬氨酸激酶、 其编码基因以及包含 所述编码基因的宿主细胞不仅能高效地产生 L-赖氨酸， 还能有效解除赖氨酸反馈 抑制， 在工业上的应用前景广阔；

3. 本发明提供的各种天冬氨酸激酶以及它们的编 码基因有助于阐明与理解 L-赖氨酸生物合成途径以及反馈抑制的相关机� ��， 从而为进一步利用基因工程手 段改造相关蛋白质或宿主细胞提供了理论基础 与材料。 下面结合具体实施例， 进一步阐述本发明。 应理解， 这些实施例仅用于说明 本发明而不用于限制本发明的范围。 下列实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照常规条件如 Sambrook等人， 分子克隆： 实验室手册 (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件， 或按照制造厂商所建议的条 件。 实施例 1. AK III突变体的获得

1. AK III野生型基因的克隆

将 E.coli MG1655(获自 ATCC 700926, 可参考 Blattner F 等， The complete genome sequence of Escherichia coli K-12. Science 277: 1453-62 (1997))在 LB培养基 (胰蛋白胨 10 g/L， 酵母粉 5 g/L， 氯化钠 10 g/L， pH 7.0)中， 37°C， 200 rpm, 培 养 12-16 h后， 收集细胞， 采用 Biomiga基因组小提试剂盒提取基因组 DNA。 以 大肠杆菌基因组为模板， 通过三轮 PCR获得在野生型 lysC基因前加上组成型启 动子及合适的 SD序列， 并在片段两端加上合适的酶切位点。

具体操作为：

AAATTGTTGTCTCCAAAT (SEQ ID NO: 9)和 TTACTCAAACAAATTACTATG CAGTTTTTG (SEQ ID NO: 10)为引物，从 E.coli MG1655基因组 DNA上扩增 lysC 基因 (野生型 lysC的编码基因， 其氨基酸序列为 SEQ ID NO: 2， 其核苷酸序列为 一轮 PCR产物为模板， 以 TTGACGGCTAGCTCAGTC

第二轮 PCR; 再以第二轮的 PCR产物为模板， 以 13)为 引物进行第三轮 PCR， 最后所获得的 DNA片段带上了 Xbal和 Sacl的酶切位点。 通过 Xbal和 Sacl将最后获得的 DNA片段克隆至 pWSK29质粒， 所得质粒命名 为 pWSK29-lysC。

2. AK III的定点突变

利用 Stratagene系列 QuikChange®XL- II定点突变试剂盒， 通过引物

D340P-F/D340P- (见表 1)对质粒 pWSK29-lysC进行 PCR引入突变位点， 获得的 质粒经过 PCR产物回收， 除去 PCR体系中的酶及缓冲体系中的盐离子后， 采用 Dpnl酶切 1 h除去甲基化的模板质粒 DNA，处理后的质粒转入感受态细胞 TranlO (购自北京全式金生物技术有限公司）， 所获得的正确突变质粒命名为 pSLLl , 携 带的 lysC突变体核苷酸序列如 SEQ ID NO: 3所示， 翻译的氨基酸序列如 SEQ ID NO: 4所示。

再通过引物 D340V-F/D340V-R (见表 1)对质粒 pWSK29-lysC进行 PCR引入 突变位点， 获得的质粒经过 PCR产物回收， 除去 PCR体系中的酶及缓冲体系中 的盐离子后， 采用 Dpnl酶切 l h除去甲基化的模板质粒 DNA， 处理后的质粒转 入感受态细胞 TranlO, 所获得的正确突变质粒命名为 pSLL2， 携带的 lysC突变体 核苷酸序列如 SEQ ID NO: 5所示， 翻译的氨基酸序列如 SEQ ID NO: 6所示。

最后通过引物 D340R-F/D340R-R (见表 1)对质粒 pWSK29-lysC进行 PCR弓 I 入突变位点， 获得的质粒经过 PCR产物回收， 除去 PCR体系中的酶及缓冲体系 中的盐离子后， 采用 Dpnl酶切 1 h除去甲基化的模板质粒 DNA， 处理后的质粒 转入感受态细胞 TranlO, 所获得的正确突变质粒命名为 pSLL3， 携带的 lysC突变 体核苷酸序列如 SEQ ID NO: 7所示， 翻译的氨基酸序列如 SEQ ID NO: 8所示。

表 1. 点突变所用引物表

实施例 2. AK III突变体的体外效果检测

1. AK III的表达

将前面构建好的野生型型质粒 pWSK29-lysC以及突变体质粒 pSLLl、 pSLL2 禾口 pSLL3分别电转化至 E.coli GT3(参见 Theze, J., Margarita, D.， Cohen, G. N., Borne, F.，and Patte, J. C.， Mapping of the structural genes of the three aspartokinases and of the two homo serine dehydrogenases of Escherichia coli K-12. J. BacterioL, 1 17 133-143 (1974)； 另可参见 US005661012A)菌株， 依次获得的菌株分别命名为 E.coliGT3(p WSK29-lysC) , E.coliGT3(pSLLl)、 E.coliGT3(pSLL2)和

E.coliGT3(pSLL3), 以实现其组成型表达。

2. AK III的酶活检测

将 E.coliGT3 (pWSK29-lysC)、 E.coliGT3 (pSLLl)、 E.coliGT3 (pSLL2)和 E.coliGT3 (pSLL3)菌株分别在 LB培养基上 37°C过夜培养，然后按照 2%转接装有 50 ml LB培养基的 500 ml三角瓶， 补加 50 mg/L的氨苄青霉素， 37°C， 200 rpm 培养至 OD600约为 0.6。 收集培养好的菌体， 用 20 mM的 Tris-HCl (pH 7.5)缓冲 液洗一次， 再重悬在 3 ml含 20 mM的 Tris-HCl (pH 7.5)缓冲液中， 200 W超声破 碎 10 min (每超声 1秒停 3秒）， 然后在 13000 rpm离心 30 min， 取上清作为粗酶 液。

酶活测定： 1 ml反应液中含有 200 mM Tris-HCl (pH 7.5)、 10 mM MgSO4* 6H2O、 lO mM L-天冬氨酸、 10 mM ATP、 160 mM 盐酸羟胺和适量的粗酶液及所 需浓度的 L-赖氨酸， 37°C反应 20 min，加入 1 ml 5% (w/v) FeCB终止酶活，取 200 ul在酶标仪上测定 OD540 (Black and Wright, 1954)。

结果见图 1所示，野生型的 AK III在 1 mM的赖氨酸时只残存约 80%的酶活， 10 mM时残存约 40%的酶活， 说明酶活受到赖氨酸的反馈抑制； 而 3个突变体的 酶活在高达 100 mM的残存酶活达到 100%，说明 340位氨基酸突变能够有效的解 除赖氨酸的反馈抑制。 实施例 3. 野生型和突变型 ΑΚ ΠΙ产生 L-Lys的能力

将前面构建好的野生型型质粒 pWSK29-lysC以及突变体质粒 pSLLl、pSLL2、 和 pSLL3分别电转化至 SCEcL3 (实验室构建的一株大肠杆菌突变株， E.Coli MG1655 Δ adhE Δ ackA Δ pta Δ ldhA Δ focA Δ pflB Δ poxB Δ thrAB Δ lcdC)菌株（可参 照文献 Kaemwich Jantama, Xueli Zhang, J.C. Moore, K.T. Shanmugam,S.A.

Svoronos,L.O. Ingram Eliminating side products and increasing succinate yields in engineered strains of Escherichia coli C. Biotechnology and Bioengineering, Vol. 101, No. 5， December 1， 2008所述， 以 E.coliMG1655为出发菌株， 通过 red重组技术 依次敲除 adhE、 ackA, pta、 ldhA、 foe A, pflB, poxB、 thrA、 thrB禾卩 lcdC十个 基因的编码序列获得突变株)， 依次获得的菌株分别命名为 SCEcL3

(pWSK29-lysC), SCEcL3 (pSLLl), SCEcL3 (pSLL2)禾口 SCEcL3 (pSLL3)， 用于发 酵产生赖氨酸。

发酵培养基如下： 葡萄糖 40 g/L， 硫酸铵 10 g/L， 磷酸 0.6 mL/L， 氯化钾 0.8 g/L， 甜菜碱 0.4 g/L， 硫酸镁 1.2 g/L， 硫酸锰 0.03 g/L， 硫酸亚铁 0.03 g/L， 玉米 浆有机氮 0.4 g/L， 5%消泡剂 0.5 mL/L， 苏氨酸 0.2 g/L。 采用汇和堂的可控 pH的 高通量摇床发酵， 500 ml三角瓶装 100 mL发酵培养基， 补加 50 ug/mL的氨苄青 霉素， 接种 2 mL LB过夜培养的菌液在 37°C、 200 rpm、 稀释的氨水控制 pH 6.8， 发酵 20 ho

在 SCEcL3菌株中过表达 AK III野生型和突变体的赖氨酸产量见表 2所示， 过表达 AK III野生型和突变体的生长及耗糖情况基本一致 ， 但在 20小时糖几乎 耗尽时， 过量表达突变的 ΑΚ ΠΙ可以产 0.28-0.54g/L的赖氨酸， 而过量表达野生 型的 AK III几乎不产赖氨酸， 突变体比野生型菌株赖氨酸产量有明显提高。

表 2. 过表达 AK III野生型和突变体的赖氨酸产量

实施例 4. 不含赖氨酸时野生型和突变型 AK III的比酶活

参照实施例 2的实验方法， 利用 BCA蛋白定量分析试剂盒 （购自伯乐公司， 货号： 23227)—进行粗酶液的总蛋白定量， 不含赖氨酸时野生型和突变型 AK III 的比酶活测定结果如表 3所示。

表 3. 不含赖氨酸时野生型和突变型 AK III的比酶活

结果显示 340位的天冬氨酸突变为脯氨酸得到的突变型 AK III (340P)的绝对 酶活不但没有下降， 还略有升高； 而 340位的天冬氨酸突变为缬氨酸 （340V)或精 氨酸 （340R)得到的突变型 AK III的绝对酶活相对于野生型 AK III有所降低。 但 结合实施例 2和 3的结果， 发明人出乎意料地发现， 340V、 340R以及 340P具备 优秀的解除赖氨酸反馈抑制能力。 在产物赖氨酸存在下， 340V或 340R的相对酶 活与 340P的相似。 实施例 5. 6-His tag标记的本发明多肽

将 lysC的野生型基因、带有 D340R点突变和带有 I418T点突变的 lysC基因， 通过 Ndel和 Xhol限制性内切酶位点克隆至质粒 pET21a+ (购自 NOVAGEN公 司）， 所得质粒通过电转化的方式转入大肠杆菌 E.coli BL21 (DE3)中， 这就能够实 现 LysC蛋白的表达，并且在 C端带上了 6-His tag标记。蛋白纯化采用 His SpinTrap columns (购自 GE 公司， 产品货号 28-4013-53)， 具体方法参照产品说明书， 纯化 后的蛋白采用实施例 2所示的方法进行酶活测定， 结果如图 2所示， 由于本实施 例的酶活都是用纯化后的酶测定的， 所以与前面实施例粗酶测定相比有一定的差 异， 但体现的效果是一致的。

本实施例的实验结果证明在本发明多肽的任一 侧加上少数氨基酸残基得到的 进一步突变的多肽也能具备与本发明多肽相同 相似的功能和活性。 实施例 6. 双突变所得 AK III的解除反馈抑制

采用前述实施例的方法， 利用下述引物 (表 4)， 发明人还对野生型 AK III的 413位、 401位、 418位和 420位进行突变， 并检测所得突变体的相对酶活， 发现 野生型 AK III的 413位、 401位这两个突变体并没有解除赖氨酸反馈抑制 ， 野生 型 AK III的 418位、 420位这两个突变体解除赖氨酸反馈抑制的能力 弱于野生型 AK III的 340位突变体（图 2)。

表 4. 点突变所用引物表

发明人在 AK III 第 340位突变的基础上将 413位、 401位作了进一步突变， 并检测了所得突变体的相对酶活， 发现得到的双突变 AK III突变体， 例如 F413A 和 G401K的抗赖氨酸反馈抑制与本发明的天冬氨酸� ��酶相似。

综上所述， 本实施例的实验结果证明 340位对于天冬氨酸激酶解除赖氨酸反 馈抑制的能力至关重要， 而在本发明天冬氨酸激酶的基础上作进一步突 变得到的 多肽也能具备与本发明天冬氨酸激酶相同相似 的功能和活性。 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作 为参考， 就如同每一篇文献被 单独引用作为参考那样。 此外应理解， 在阅读了本发明的上述内容之后， 本领域 技术人员可以对本发明作各种改动或修改， 这些等价形式同样落于本申请所附权 利要求书所限定的范围。