Titre : Assemblage et culture d'objets cellulaires sur une structure de contact sous l'action de forces de radiation acoustique axiale et transversale

Domaine technique

L'invention se rapporte au domaine de la biotechnologie et en particulier de l'assemblage de cellules ou particules micrométriques, par exemple en vue de reconstruire ou de modéliser des tissus vivants.

L'invention présente un intérêt particulier mais nullement limitatif dans les secteurs de la thérapie cellulaire, de la modélisation pharmacologique, de l'agro-alimentaire par exemple pour la culture de viande, de micro-algues ou de végétaux, ou encore de l'aérospatial, notamment pour la culture cellulaire en conditions de microgravité.

État de la technique antérieure

Dans le contexte de la recherche portant sur la reconstruction et la modélisation d'organes sur puces (« organ-on-a-chip » en anglais) et d'organoïdes, un nombre croissant d'approches expérimentales visent à permettre la structuration d'ensembles cellulaires.

Les techniques les plus utilisées dans cet objectif incluent la manipulation de cellules au sein de dispositifs microfluidiques et la formation de tissus par fabrication additive.

Une autre technique connue, décrite dans le document suivant, consiste à structurer des feuillets cellulaires par lévitation acoustique dans des hydrogels : Bouyer et al. A bio- Acoustic Levitational (BAL) Assembly Method for Engineering of Multilayered, 3D Brain-Like Constructs, Using Human Embryonic Stem Cell Derived Neuro-Progenitors, Adv. Mater. 2016, 28, 161-167. Cette technique permet d'assembler dans un hydrogel des cellules sous forme de couches ou feuillets dans l'objectif d'établir des connexions entre cellules de différentes couches. Cependant, cette technique ne permet pas de contrôler le développement de telles connexions de manière satisfaisante.

Plus généralement, les techniques d'assemblage connues dans ce domaine sont complexes et coûteuses, peuvent nécessiter des durées importantes pour assembler et cultiver des cellules et, dans la mesure où elles sont mises en œuvre in vitro, peuvent entraîner la mort d'un grand nombre de cellules.

Exposé de l'invention

La présente invention vise à surmonter les inconvénients précités en procurant un dispositif destiné à assembler des objets, comprenant : une cavité configurée pour recevoir un fluide et les objets, un système de génération configuré pour générer dans la cavité, le long d'une direction axiale, une onde acoustique stationnaire de manière à produire une force de radiation acoustique axiale apte à positionner les objets sur des nœuds et/ou des anti-nœuds de pression formés par l'onde acoustique.

Selon l'invention, le dispositif comprend une structure de contact formant une ou plusieurs surfaces s'étendant le long de la direction axiale et le système de génération est configuré pour exercer une force de radiation acoustique transversale apte à déplacer les objets en direction de la ou des surfaces de la structure de contact.

La propagation d'une onde acoustique stationnaire dans la cavité permet en effet de former dans la cavité, le long de la direction axiale, un ou plusieurs nœuds de pression, c'est-à-dire des endroits où la pression du fluide est nulle, et un ou plusieurs anti-nœuds ou ventres de pression, c'est-à-dire des endroits où cette pression est maximale.

De manière connue en soi, en fonction des propriétés des objets et en particulier de leur facteur de densité-compressibilité, ou contraste acoustique par rapport au fluide contenu dans la cavité, la force de radiation acoustique axiale déplace les objets soit vers un nœud de pression lorsque leur contraste acoustique est positif soit vers un anti-nœud de pression lorsqu'il est négatif.

La force de radiation acoustique axiale permet ainsi de former dans la cavité un ou plusieurs agrégats d'objets qui se succèdent le long de la direction axiale, cela de manière extrêmement rapide - typiquement en quelques secondes - et à l'aide d'un matériel particulièrement simple à mettre en œuvre et peu coûteux. La force de radiation acoustique transversale, qui est de préférence générée après un tel positionnement axial des objets, permet de mettre chacun des agrégats ainsi formés en contact avec la structure de contact.

L'invention permet ainsi de réaliser un ou plusieurs assemblages d'objets et de maintenir ces assemblages en lévitation acoustique en appui sur la structure de contact.

En maintenant de tels assemblages en lévitation acoustique pendant la durée requise, par exemple plusieurs heures ou jours, il est possible de favoriser des interactions entre objets lorsque ceux-ci sont vivants, en particulier lorsque ces objets sont des cellules biologiques.

L'invention permet ainsi de réaliser une culture cellulaire en lévitation acoustique, en contrôlant, pour chacun des assemblages, le développement des connexions et interactions entre les cellules de cet assemblage et/ou entre ces cellules et d'autres objets ou éléments qui peuvent être disposés sur ou dans la structure de contact (voir plus loin ci- dessous).

Dans la présente description, un « objet » désigne un élément vivant ou inerte ayant de préférence une taille petite par rapport à la longueur de l'onde acoustique stationnaire générée dans la cavité.

A titre d'exemple non limitatif, les objets peuvent avoir une taille micrométrique, par exemple comprise entre 1 pm et 100 pm, typiquement lorsque la fréquence de l'onde stationnaire a une valeur dans la gamme des MHz.

Pour autre exemple, notamment lorsque la fréquence de génération est dans la gamme des kHz, les objets peuvent avoir une taille millimétrique, par exemple comprise entre 1 mm et 100 mm.

L'invention peut toutefois être mise en œuvre avec des objets de taille différente. Par exemple, les objets ou certains d'entre eux peuvent avoir une taille inférieure à 1 pm, en étant par exemple formés par des bactéries ou des virus, et/ou avoir une taille de plusieurs centaines de pm. De plus, les objets, ou certains d'entre eux, peuvent être des éléments muli-cellulaires ou des objets formés artificiellement ou encore des objets prélevés sur un organe. Le fluide dans lequel les objets sont en suspension est de préférence un liquide qui, selon l'application envisagée, peut comprendre de l'eau ou former un milieu de culture ou plus généralement un milieu aqueux comprenant par exemple un pré-polymère d'hydrogel ou des particules colloïdales.

L'invention fournit par ailleurs une solution particulièrement précise en termes de positionnement des objets dans l'espace et qui permet le cas échéant de contrôler le développement d'interactions intercellulaires.

Le dispositif de l'invention peut ainsi former une puce acousto-fluidique mise en œuvre pour des applications diverses et présenter des caractéristiques structurelles variées, en particulier concernant sa structure de contact.

Dans un mode de réalisation, la structure de contact comprend une ou plusieurs membranes ou parois.

Dans la présente description, une membrane, aussi appelée « paroi », est une structure comprenant typiquement deux surfaces relativement grandes par rapport à une épaisseur de cette structure, c'est-à-dire par rapport à la distance séparant ces deux surfaces.

Dans un mode de réalisation, la cavité comprend plusieurs chambres délimitées par une ou plusieurs desdites membranes.

A titre d'exemple non limitatif, la cavité peut comprendre deux chambres et la structure de contact peut comprendre une unique membrane agencée de sorte qu'une première surface de la membrane délimite l'une de ces chambres et qu'une deuxième surface de la membrane délimite l'autre chambre.

Dans un mode de réalisation, chacune des chambres comprend une partie respective des objets.

Ainsi, dans le cadre de l'exemple précité de compartimentation de la cavité en deux chambres, les objets peuvent être répartis en deux séries, les objets de la première série pouvant être placés dans l'une des chambres et les objets de la deuxième série dans l'autre chambre. Dans cet exemple non limitatif, la force de radiation acoustique transversale peut être configurée de sorte à déplacer les objets de la première série en direction de la membrane afin de regrouper ces objets contre la première surface de la membrane et de sorte à déplacer les objets de la deuxième série en direction de la membrane afin de regrouper ces objets contre la deuxième surface de la membrane.

Les objets de la première série et de la deuxième série disposés au niveau d'une même position le long de la direction axiale peuvent ainsi être regroupés de part et d'autre de la membrane, permettant, par exemple, le développement d'interactions, notamment à travers la membrane lorsque celle-ci est poreuse.

Ainsi, dans un mode de réalisation, une ou plusieurs desdites membranes sont poreuses.

Dans un mode de réalisation, une ou plusieurs desdites surfaces formées par la structure de contact sont des surfaces s'étendant chacune autour d'une direction respective.

De préférence, cette direction est parallèle ou oblique par rapport à ladite direction axiale.

Par exemple, une ou plusieurs desdites surfaces formées par la structure de contact peuvent chacune s'étendre autour d'une direction respective de manière à former une surface de révolution autour de cette direction, par exemple de manière à présenter une géométrie cylindrique.

Une telle surface de révolution peut présenter une section transversale relativement petite par rapport à la longueur de l'onde acoustique stationnaire générée dans la cavité et/ou par rapport à la dimension axiale de cette surface de révolution, de manière à permettre un ou plusieurs assemblages d'objets autour d'une telle surface, par exemple sous forme d'assemblages sphéroïdes ou ovoïdes.

Dans un mode de réalisation, une ou plusieurs desdites surfaces formées par la structure de contact peuvent chacune former une structure creuse, permettant par exemple de perfuser et/ou prélever des objets, éléments ou échantillons biologiques ou chimiques, ou encore pour encapsuler des objets tels que des cellules biologiques dans la structure de contact. Ainsi, dans un mode de réalisation, le dispositif comprend des éléments, tels que des cellules biologiques, reliés à la structure de contact de manière à autoriser des interactions entre ces éléments et un ou plusieurs desdits objets lorsque ceux-ci sont déplacés en direction des surfaces de la structure de contact.

Bien entendu, ces principes peuvent être généralisés de sorte qu'une ou plusieurs desdites surfaces de la structure de contact, que cette dernière prenne la forme d'une ou plusieurs membranes et/ou de structures creuses et/ou agencées autour d'une ou plusieurs directions et/ou d'une ou plusieurs structures tridimensionnelles de toute géométrie, peuvent être cellularisées ou, plus généralement, comprendre ou porter des éléments contenant des informations biologiques, physico-chimiques et/ou physiques, par exemple à l'aide de molécules favorisant ou inhibant la multiplication de cellules, de nanoparticules ou encore d'éléments de texturation micrométriques ou nanométriques.

Dans un mode de réalisation, la structure de contact comprend ou forme une ou plusieurs électrodes et/ou présente des propriétés conductrices.

Dans un mode de réalisation, la structure de contact comprend un matériau perméable au gaz, par exemple le polydiméthylsiloxane, par exemple de manière à diffuser de l'oxygène au cœur du ou des assemblages d'objets.

Dans un mode de réalisation, la structure de contact comprend un ou plusieurs fils formant une ou plusieurs desdites surfaces.

Dans un mode de réalisation, le système de génération comprend un ou plusieurs transducteurs piézoélectriques et/ou ultrasonores qui peuvent comprendre plusieurs éléments organisés de manière matricielle et/ou une ou plusieurs lentilles holographiques acoustiques.

Dans un mode de réalisation, lesdits objets comprennent des objets présentant un contraste acoustique positif par rapport au fluide de sorte que la force de radiation acoustique axiale déplace ces objets vers les nœuds de pression et/ou des objets présentant un contraste acoustique négatif par rapport au fluide de sorte que la force de radiation acoustique axiale déplace ces objets vers les anti-nœuds de pression. L'invention a aussi pour objet un procédé d'assemblage d'objets à l'aide d'un dispositif tel que défini ci-dessus.

Ce procédé comprend une génération de la force de radiation acoustique axiale de manière à positionner les objets sur les nœuds et/ou les anti-nœuds de pression et une génération de la force de radiation acoustique transversale de manière à déplacer les objets en direction de la ou des surfaces de la structure de contact.

La force de radiation acoustique transversale est de préférence générée après positionnement des objets sur les nœuds et/ou les anti-nœuds de pression, par exemple avec un système de génération comprenant une matrice d'éléments piézoélectriques.

En variante, les forces de radiation acoustique axiale et transversale peuvent être générée simultanément, par exemple avec un système de génération comprenant un unique transducteur ou une lentille holographique acoustique.

Le procédé peut mettre en œuvre toutes étapes permettant d'obtenir différentes combinaisons des caractéristiques fonctionnelles décrites ci-dessus, en fonction notamment des caractéristiques structurelles du dispositif et notamment de la structure de contact.

De manière non limitative, l'invention ne couvre pas, au moins dans certains modes de réalisation, des applications dans lesquelles lesdits objets comprennent des cellules souches embryonnaires humaines impliquant la destruction d'un embryon humain et des applications dans lesquelles l'invention serait mise en œuvre de sorte à constituer ou développer un corps humain.

D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront à la lecture de la description détaillée, non limitative, qui suit.

Brève description des dessins

La description détaillée qui suit fait référence aux dessins annexés sur lesquels :

[Fig. 1] est une vue schématique, en coupe axiale, d'un dispositif conforme à l'invention, ce dispositif comprenant une cavité, une membrane poreuse disposée dans la cavité de manière à délimiter deux chambres, un transducteur ultrasonore comportant une matrice d'éléments piézoélectriques et un réflecteur, chacune des chambres contenant des objets cellulaires maintenus en lévitation acoustique sous forme d'agrégats à distance de la membrane ;

[Fig. 2] est une vue schématique du dispositif de la figure 1, les agrégats d'objets cellulaires étant disposés contre la membrane de manière à former des assemblages d'agrégats pouvant développer entre eux des interactions intercellulaires à travers des pores de la membrane ;

[Fig. 3] est une vue schématique, en coupe transversale, d'un dispositif conforme à l'invention qui se distingue de celui de la figure 1 en ce qu'il comprend deux membranes poreuses disposées dans la cavité de manière à délimiter quatre chambres qui contiennent chacune des objets cellulaires maintenus en lévitation acoustique sous forme d'agrégats à distance de la membrane ;

[Fig. 4] est une vue schématique du dispositif de la figure 4, les agrégats d'objets cellulaires étant disposés contre les membranes de manière à former des assemblages d'agrégats pouvant développer entre eux des interactions intercellulaires à travers des pores des membranes ;

[Fig. 5] est une vue schématique, en coupe axiale, d'un dispositif conforme à l'invention, ce dispositif comprenant une cavité, des éléments de contact allongés disposés dans la cavité, un transducteur ultrasonore comportant une matrice d'éléments piézoélectriques et un réflecteur, la cavité contenant des objets cellulaires maintenus en lévitation acoustique sous forme d'agrégats à distance des éléments de contact ;

[Fig. 6] est une vue schématique du dispositif de la figure 5, les agrégats d'objets cellulaires étant disposés autour des éléments de contact.

Description détaillée de modes de réalisation

La figure 1 illustre schématiquement un exemple de dispositif conforme à un premier mode de réalisation de l'invention.

Ce dispositif comprend un récipient qui forme une cavité 1 apte à contenir un fluide et/ou différentes substances, notamment sous forme liquide. De manière générale, la cavité 1 s'étend le long d'une direction axiale Al, qui correspond dans cet exemple à une direction verticale. La cavité 1 présente le long de la direction Al une dimension B1 définissant une hauteur de la cavité 1.

Dans cet exemple, la cavité 1 a une forme globalement cylindrique, la direction Al formant un axe de symétrie de la cavité 1. Dans des variantes non représentées, la cavité 1 peut avoir une autre géométrie, par exemple une section rectangulaire.

Le dispositif de l'invention comprend par ailleurs un système de génération d'ondes acoustiques, en l'occurrence un transducteur 2 doté d'une matrice d'éléments piézoélectriques 2A et 2B ainsi qu'un réflecteur acoustique 3.

En référence à la figure 1, le transducteur 2 est disposé au niveau d'une première extrémité de la cavité 1 selon la direction Al, en l'occurrence verticalement au-dessus de la cavité 1. Le réflecteur s délimite une deuxième extrémité de la cavité 1 selon la direction Al, en étant en l'occurrence disposé verticalement en-dessous de la cavité 1.

Les éléments piézoélectriques 2A et 2B sont répartis transversalement, c'est-à-dire sur la largeur de la cavité 1, de sorte que chacun de ces éléments est situé à une position respective radialement par rapport à la direction Al.

Ce système est configuré pour générer dans la cavité 1 et propager dans le fluide qu'elle contient une onde acoustique stationnaire, selon une direction de propagation axiale qui correspond à la direction Al.

L'onde stationnaire peut être générée par un ou plusieurs des éléments piézoélectriques du transducteur 2, avec une fréquence identique à la fréquence de résonance de la cavité 1, laquelle forme dans ce cas un résonateur. Alternativement, l'onde stationnaire peut avoir une fréquence différente de la fréquence de résonance de la cavité 1.

Dans tous les cas, le système est configuré pour pouvoir générer, notamment, une onde ayant une longueur d'onde A inférieure ou égale au double de la hauteur B1 de la cavité 1, afin de former le long de la direction Al au moins un nœud de pression et au moins un ventre de pression. Le transducteur 2 est dans cet exemple un transducteur à large bande équipé d'une source ultrasonore. Un tel transducteur 2 permet de modifier la position des nœuds de l'onde stationnaire le long de la direction Al et/ou la distance entre ces nœuds, en jouant sur la fréquence de l'onde.

Dans le mode de réalisation de la figure 1, le dispositif comprend une paroi 4, aussi appelée « membrane », qui s'étend dans la cavité 1 de manière à séparer la cavité 1 en deux chambres 5 et 6.

La membrane 4 comprend une première surface 7 qui délimite la chambre 5 et une deuxième surface 8 qui délimite la chambre 6.

La membrane 4 ainsi que ses surfaces ? et 8 s'étendent le long de la direction Al, en l'occurrence parallèlement à cette direction.

Dans cet exemple, la membrane 4 est en nitrocellulose et comprend des pores 9 formant des ouvertures qui traversent la membrane 4 de part en part, de manière à déboucher sur les surfaces 7 et 8.

A titre indicatif, la membrane 4 peut avoir une épaisseur, définie comme la distance entre les surfaces 7 et 8, de 150 pm et des pores ayant un diamètre de 3 pm. De manière non limitative, la dimension de tels pores peut aller de l'échelle nanométrique à l'échelle micrométrique.

Les chambres 5 et 6 sont dans cet exemple remplies d'un fluide contenant des objets 11 et 12 ayant chacun une taille comprise entre 1 pm et 100 pm.

Dans cet exemple non limitatif, les objets 11 sont des cellules biologiques d'un premier type qui sont reçues dans la chambre 5 tandis que les objets 12 sont des cellules biologiques d'un deuxième type reçues dans la chambre 6. Le fluide forme un milieu de culture pour les objets cellulaires 11 et 12.

De manière non limitative, les objets 11 et 12 peuvent être des neurones ou des cellules gliales, tumorales, endothéliales, épithéliales, osseuses ou encore immunitaires.

Dans cet exemple spécifique, chacun des objets 11 et 12 a une masse volumique p ₀ supérieure à la masse volumique p du fluide. Les objets 11 et 12 sont en outre choisis de sorte que la vitesse c ₀ de propagation d'une onde acoustique dans ces objets 11 et 12 soit supérieure à la vitesse c de propagation de cette onde acoustique dans le fluide.

Le dispositif de la figure 1 est dans cet exemple mis en œuvre de manière à pouvoir structurer les objets 11 et 12 de la manière décrite ci-dessous.

Dans un état initial, non représenté, les objets 11 et 12 sont en suspension dans le fluide, respectivement dans les chambres 5 et 6.

Le transducteur 2 est mis en œuvre de manière à générer une onde acoustique stationnaire dans la cavité 1, le long de la direction Al, dans cet exemple avec une longueur d'onde formant quatre nœuds de pression N1-N4. En l'occurrence, l'onde est générée par l'intermédiaire des éléments piézoélectriques 2A, identifiés par des rectangles avec une croix sur la figure 1, les éléments piézoélectriques 2B, identifiés par des rectangles sans croix sur la figure 1, étant inactivés.

Cette onde stationnaire produit une force de radiation acoustique axiale qui s'exerce sur les objets 11 et 12.

Cette force de radiation acoustique axiale FRA _A peut notamment être décrite selon le modèle suivant, connu en soi, de K. Yosioka et Y. Kawasima :

TT

FRA _A = —pf VQ k d ³ F _y sin(fc z) où v ₀ est la vitesse de l'onde, k le nombre d'onde, F _y le facteur de contraste acoustique, ou densité-compressibilité, et z la position axiale de l'objet 11 ou 12 considérée le long de la direction Al, c'est-à-dire le long de la direction de propagation de l'onde.

Le facteur de contraste acoustique, ou densité-compressibilité, F _y peut être défini de la manière suivante : où p ₀ est la masse volumique de l'objet 11 ou 12 considéré et c ₀ la vitesse de propagation de l'onde au sein de l'objet 11 ou 12 considéré. Compte tenu de la masse volumique et de la vitesse de propagation de l'onde acoustique des objets 11 et 12 par rapport au fluide, les objets 11 et 12 présentent un facteur de densité-compressibilité, ou contraste acoustique, positif.

Compte tenu des propriétés respectives précitées du fluide et des objets 11 et 12, à partir dudit état initial dans lequel les objets 11 et 12 sont distribués de manière relativement homogène dans l'ensemble de la cavité 1, la force de radiation acoustique axiale entraîne un déplacement des objets 11 et 12 vers les nœuds de l'onde acoustique stationnaire, de manière à atteindre une configuration telle qu'illustrée sur la figure 1.

La force de radiation acoustique axiale entraîne ainsi un positionnement des objets 11 et 12 sous forme de groupes, aussi appelés « agrégats », de la manière illustrée sur la figure 1, qui sont situés radialement au niveau des éléments piézoélectriques 2A activés.

Ainsi, un groupe 21 d'objets 11 se forme axialement au niveau du nœud de pression NI et radialement au niveau des éléments piézoélectriques 2A situés en regard de la chambre 5. Trois autres groupes 22, 23 et 24 d'objets 11 se forment axialement au niveau des nœuds de pression N2, N3 et N4, respectivement, et radialement au même niveau que le groupe 21.

Symétriquement, un groupe 25 d'objets 12 se forme axialement au niveau du nœud de pression NI et radialement au niveau des éléments piézoélectriques 2A situés en regard de la chambre 6. Trois autres groupes 26, 27 et 28 d'objets 12 se forment axialement au niveau des nœuds de pression N2, N3 et N4, respectivement, et radialement au même niveau que le groupe 25.

Les éléments piézoélectriques 2A actionnés peuvent maintenir les objets 11 et 12 en lévitation acoustique le temps nécessaire pour obtenir une auto-organisation suffisante des agrégats 21 à 28, qui constituent dans cet exemple des structures tridimensionnelles sensiblement ovoïdes.

Le transducteur 2 peut ensuite être commandé de manière produire une force de radiation acoustique transversale afin de déplacer les objets 11 et 12 en direction de la membrane 4, en particulier de sorte que les agrégats 21 à 24, situés dans la chambre 5, soient plaqués sur la surface 7 de la membrane 4 et que les agrégats 25 à 28, situés dans la chambre 6, soient plaqués sur la surface 8 de la membrane 4.

Dans cet exemple, une telle force de radiation acoustique transversale est réalisée en modifiant l'état d'activation des éléments piézoélectriques 2A et 2B, c'est-à-dire en activant progressivement les éléments piézoélectriques radialement en direction de la direction Al et en inactivant, au fur et à mesure de l'activation de nouveaux éléments piézoélectriques, les éléments piézoélectriques préalablement activés.

Le transducteur 2 permet ainsi de contrôler spatialement le champ acoustique dans la cavité 1 de manière à exercer une force de radiation acoustique transversale apte à translater les agrégats 21 à 28 vers la membrane 4, jusqu'à atteindre une configuration telle qu'illustrée sur la figure 2.

De manière connue en soi, la force de radiation acoustique transversale FRA _T peut s'exprimer en fonction du gradient de la densité d'énergie acoustique : où d correspond au diamètre des objets 11 et 12 et E _ac (x,y, z)) au gradient de densité d'énergie acoustique.

Dans la configuration de la figure 2, les éléments piézoélectriques 2A situés radialement au niveau de la membrane 4 peuvent rester activés de manière à maintenir les agrégats 21 à 28 en contact avec la membrane 4, par lévitation acoustique.

L'invention permet ainsi d'assembler des structures d'objets, dans cet exemple des agrégats 21-24 d'objets 11 d'un premier type avec des agrégats 25-28 d'objets 12 d'un deuxième type, sans que les différents types d'objets situés dans un même plan de lévitation acoustique n'entrent en contact direct les uns avec les autres et de sorte qu'un contact puisse dans cet exemple être établi via la membrane poreuse 4.

Une telle membrane 4 permet notamment de contrôler les interactions entre les objets 11 et 12, à travers les pores 9 qui peuvent constituer des passages pour des connexions du type axones lorsque les objets 11 et 12 sont des neurones primaires. De nombreuses variantes peuvent être apportées au dispositif qui vient d'être décrit et à sa mise en œuvre. Par exemple, la hauteur B1 de la cavité 1 et/ou la fréquence de l'onde acoustique stationnaire peuvent être modifiées afin d'augmenter le nombre de nœuds de pression, par exemple de manière à assembler simultanément plusieurs dizaines d'agrégats.

La taille et la forme des objets 11 et 12 peuvent aussi être modifiées, ainsi que la concentration des objets dans la cavité 1, le volume de la cavité 1 ou encore la fréquence de l'onde, afin par exemple de déterminer un nombre d'objets par agrégat ou assemblage ainsi que la taille du ou des assemblages ainsi obtenus. Le choix de l'amplitude et de la fréquence de l'onde acoustique, fixant la magnitude de la force de radiation acoustique peut également être contrôlé pour modifier des dimensions latérale et/ou axiale du ou des assemblages. L'amplitude de la pression acoustique appliquée aux ensembles d'objets peut aussi être contrôlée, par exemple pour forcer une organisation spatiale donnée ou encore pour stimuler les objets et forcer ainsi certaines organisations spatiales et/ou fonctionnalités.

Pour autre exemple, la membrane 4 peut être une paroi en verre ou plus généralement une structure non poreuse, permettant notamment d'utiliser des fluides différents dans chacun des chambres 5 et 6 de la cavité 1. Une telle paroi peut bien entendu être fonctionnalisée et/ou cellularisée et/ou être perméable aux gaz.

D'autres modes de réalisation de l'invention, non limitatifs, sont décrits ci-dessous, étant entendu que la description qui précède s'applique par analogie à ces différents modes de réalisations et à leurs variantes. Dans la description qui suit, ces modes de réalisation sont donc essentiellement décrits selon leurs différences par rapport au mode de réalisation des figures 1 et 2.

Dans le mode de réalisation des figures 3 et 4, la structure de contact 4 comprend non pas une membrane mais deux membranes poreuses 4A et 4B séparant la cavité 1 en quatre chambres 5A, 5B, 6A et 6B. Chacune des chambres 5A, 5B, 6A et 6B comprend des objets 31, 32, 33 et 34, respectivement, de nature différente. Un tel dispositif permet de former des assemblages complexes, en l'occurrence en doublant les types d'objets par rapport au dispositif de la figure 1.

Plus généralement, la structure de contact 4 peut donc être configurée pour compartimenter la cavité de lévitation acoustique en plusieurs chambres indépendantes, avec des milieux de culture différents, selon le besoin. Cela permet notamment de maintenir en lévitation acoustique et de cultiver en trois dimensions un type cellulaire par chambre, cela dans une unique puce acousto-fluidique.

En contrôlant la fréquence des ondes acoustiques émises et/ou la forme du réflecteur, et par conséquent le motif spatial du champ acoustique généré dans la cavité, des objets cellulaires en lévitation peuvent être amenés au contact d'une structure de contact telle qu'une membrane, soit au début de la culture soit au cours de la culture.

Dans ces différents exemples, différentes formes symétriques ou asymétriques de réflecteur s peuvent être mises en œuvre afin de favoriser une organisation spatiale donnée des agrégats d'objets en lévitation acoustique, par exemple une organisation en feuillets, en structures sphéroïdes ou ovoïdes, en anneaux, ou encore en lobes indépendants.

La ou les membranes de la structure de contact peuvent être de nature physico-chimique variée, par exemple être formées d'un hydrogel, d'un élastomère ou encore d'un matériau inorganique, et/ou peuvent comprendre des textures de taille micrométrique ou nanométrique.

L'utilisation de membranes de porosité contrôlée permet de contrôler d'une part l'auto- assemblage de différents agrégats, notamment sphéroïdes, et ainsi de reconstruire des ensembles multicellulaires complexes, et d'autre part la nature des interactions entre des agrégats de nature variée. Il est par exemple possible de contrôler des échanges de solutés, notamment avec des pores de membrane dont la taille est inférieure au micromètre, des extensions cellulaires incluant des axones de neurones, notamment avec une porosité comprise entre 1 pm et 5 pm, ou encore des échanges de cellules ou objets, notamment avec une porosité supérieure à 5 pm. Par ailleurs, la ou les chambres délimitées par une ou plusieurs membranes, ou plus généralement par une structure de contact pouvant être autrement constituée, peuvent être utilisées uniquement pour des étapes initiales de structuration, c'est-à-dire d'assemblages d'objets, ces assemblages pouvant ensuite être cultivés de manière conventionnelle, par exemple en milieu liquide ou dans un hydrogel. Alternativement, le dispositif de l'invention peut être utilisé pour réaliser une culture au long terme en lévitation acoustique.

Dans le mode de réalisation des figures 1 et 2, la force de radiation acoustique transversale est générée par activation sélective d'éléments piézoélectriques du transducteur 2. Cette force peut bien entendu être générée à l'aide d'un autre type d'organe de contrôle de champ acoustique, par exemple avec une lentille holographique acoustique. De manière connue en soi, une lentille holographique acoustique peut être codée sur plusieurs fréquences. Ainsi, une première fréquence peut être utilisée pour organiser les objets sous forme d'agrégats de la manière illustrée sur la figure 1 et une deuxième fréquence pour ramener et maintenir ces agrégats contre la structure de contact 4 et former des assemblages tels qu'illustrés sur la figure 2. Plus généralement, le système de génération d'ondes produisant les forces de radiation acoustique axiale et transversale peut comprendre un ou plusieurs transducteurs ou combinaisons de transducteurs de différents types et/ou positionnés de manière axiale et/ou transversale.

Un autre type de structure de contact est illustré sur les figures 5 et 6.

En référence à la figure 5, le dispositif comprend une structure de contact comportant un réseau d'éléments de contact 40 qui présentent chacun une géométrie allongée le long de la direction axiale Al de la cavité 1.

Dans cet exemple non limitatif, chacun des éléments de contact 40 a une géométrie cylindrique de manière à former une surface externe 41 s'étendant autour d'une direction A2 parallèle à la direction axiale Al de la cavité 1.

De manière analogue au mode de réalisation des figures 1 et 2, le système de génération d'ondes acoustiques du dispositif de la figure 5 comprend lui aussi un transducteur ultrasonore 2 pourvu d'éléments piézoélectriques 2C organisés en matrice et un réflecteur 3 s'étendant chacun dans un plan transversal de la cavité 1 de manière à pouvoir déplacer des objets 42 présents dans la cavité 1.

A partir d'un état initial, non représenté, dans lequel les objets 42 sont en suspension dans le fluide, la force de radiation acoustique axiale résultant de l'onde stationnaire générée par le transducteur 2 entraîne un positionnement des objets 42 sous forme d'agrégats tel qu'illustré sur la figure 5.

Les agrégats d'objets 42 se forment dans cet exemple particulier sur trois nœuds de pression formés par l'onde stationnaire, les objets 42 présentant un contraste acoustique positif par rapport au fluide, transversalement en regard d'éléments piézoélectriques 2C activés, dans cette configuration à distance des éléments de contact 40.

De manière analogue au mode de réalisation des figures 1 et 2, l'activation des éléments piézoélectriques 2C est ensuite modifié pour produire une force de radiation acoustique transversale entraînant un déplacement des agrégats autour des éléments de contact 40 tel qu'illustré sur la figure 6, de manière à former dans cet exemple des assemblages sphéroïdes pouvant ainsi être cultivés.

Les éléments de contact 40 peuvent êtres de différentes natures physico-chimiques et géométriques. Ils peuvent par exemple être pleins ou creux, perméables ou non, électroactifs ou non, ce qui peut permettre notamment de perfuser, stimuler, monitorer et/ou échantillonner les assemblages de façon contrôlée.

Ainsi, dans une variante de réalisation, les éléments de contact 40 peuvent former des électrodes prévues pour mesurer ou imposer une activité électrique. Des éléments de contact 40 électro-actifs et/ou conducteurs permet notamment de modéliser un phénomène de vascularisation, avec stimulation électrique et enregistrement de l'activité électrique des assemblages d'objets 42.

Dans une variante de réalisation, les éléments de contact 40 peuvent être creux et/ou poreux, par exemple afin de pouvoir injecter et piéger dans les éléments de contact 40 et perfuser dans les assemblages d'objets 42 des solutés tels que des composés ou agents biologiques et physiques, des cellules ou encore des virus. La nature de la diffusion/migration de tels solutés peut être contrôlée à travers la porosité des éléments de contact 40.

De telles variantes peuvent être mises en œuvre ou combinées avec d'autres types de structures de contact, par exemple une ou plusieurs membranes 4 telles que décrites ci- dessus en référence aux figures 1 à 4.

Plus généralement, la structure de contact du dispositif de l'invention peut fonctionnalisée de façon à modifier l'interaction entre des objets cellulaires assemblés sur la structure de contact.

De plus, la fonctionnalisation de la structure de contact peut comprendre un greffage d'objets sur une ou plusieurs surfaces de la structure de contact et/ou à l'intérieur de la structure de contact, par exemple à l'intérieur d'éléments de contact 40 tels qu'illustrés sur les figures 5 et 6. Les objets greffés peuvent être des particules conférant de nouvelles propriétés à la structure de contact, par exemple en termes de conductivité électrique, magnétique ou encore acoustique, des substances bioactives influençant le développement des objets cellulaires, ou encore des cellules, par exemple endothéliales ou astrocytaires, ou autres organismes vivants.

Dans une variante de réalisation, les éléments de contact 40 du dispositif des figures 5 et 6 peuvent être formés par un hydrogel durci, par exemple par photopolymérisation confocale. Ces éléments de contact 40 peuvent comprendre des objets cellulaires ou de fonctionnalisation, tels que ceux décrits ci-dessus, piégés dans l'hydrogel formant ces éléments de contact 40. Bien entendu, de tels éléments de contact peuvent avoir toute géométrie tridimensionnelle plus ou moins complexe, formant par exemple une structure en treillis ou autre.

L'invention permet de réaliser de nombreuses applications incluant la reconstruction d'éléments tissulaires complexes, la modélisation d'interactions de plusieurs organes en série, par exemple d'interactions de différentes zones du cerveau, de mise en série ou en parallèle de modèles d'organes, etc. Entre autres exemples d'applications, l'invention permet de faire de la reconstruction tridimensionnelle de voies neuro-anatomiques ou de modèles tridimensionnels de barrières tissulaires du type hémato-encéphalique ou placentaire. Dans le contexte des neurosciences, l'anisotropie de la porosité, par exemple des trous coniques, de membranes permettrait de contrôler la direction de croissance d'axones et/ou nerfs d'un organoïde vers l'autre. Pour autre exemple, des interfaces biologiques complexes peuvent être modélisées par cellularisation de membranes, poreuses ou non, notamment par ensemencement préalable des membranes avec des cellules d'intérêt.