技术领域 本发明涉及植物蛋白及其编码基因与应用， 特别是涉及一个来源于棉花的 ATP水 解酶 ATPase-1及其编码基因， 以及其在培育耐盐性提高的转基因植物中的应 用。

背景技术 盐胁迫是世界农业生产最重要的非生物逆境危 害之一， 盐渍土壤通常以钠盐、 钙 盐或镁盐为主， 成为影响植物生长、 导致粮食和经济作物减产的主要因素。 世界上盐 碱土的面积约有 4亿公顷， 占灌溉农田的 1/3。 盐碱地在中国分布广泛， 现有盐碱地面 积约 0. 4亿公顷。 随着我国人口增加， 耕地减少， 盐碱地资源的开发利用有着极其重 要的现实意义。 而植物抗盐碱、 耐干旱能力的提高和适宜在盐碱地上生长并具 有较高 经济和生态价值的植物种或品系的选育， 则是利用盐碱地经济、 有效的措施。 对绝大 多数农作物来说，大多数植物对盐碱、干旱的 耐受性差，只能生长在氯化钠含量为 0. 3% 以下的土壤上，土壤中过量的 Na ⁺ 会对植物体的正常的生长代谢产生毒害作 用。因此如 何在盐渍环境下提高作物产量就成为全世界农 业生产中十分重要的问题。

植物的耐盐性是一个十分复杂的数量性状，其 耐盐机制涉及从植株到器官、组织、 生理生化直至分子的各个水平。 各国的科学家也为此做了大量的工作， 并取得了很多 新进展， 特别在利用高等模式植物拟南芥来研究植物的 耐盐分子机理方面， 使该领域 的研究有了突破性的进展 （Zhu JK. 2002. Salt and drought stress singal transduction in plants. Annu. Rev. Plant Biol. 53 : 1247- 1273 ; Zhang ZL. 201 1. Arabidopsis Floral Initiator SKB 1 Confers High Salt Tolerance by Regulating Transcription and Pre-mRNA Splicing through Altering Histone H4R3 and Small Nuclear Ribonucleoprotein LSM4 Methylation. Plant Cell, 23 : 396-41 1 ) 。 高等植物细胞可通过多种途径感受外界环境中 物化参数的 变化， 从而将胞外的信号转化为胞内信号， 通过系列的信号传导最后将胁迫信号传递 至细胞核内， 激活转录因子， 而被激活的转录因子再作用于功能基因， 启动逆境应答 基因的表达从而提高植物的耐逆性。 尽管研究者已从不同侧面开展了大量研究， 但由 于其机制十分复杂， 植物抗盐中的许多重要问题仍有待探索。 例如， 植物抗盐的关键 因子仍未找到； 植物耐盐的分子机制并不十分清楚 ₍

发明内容 本发明人利用 SSH (抑制差减杂交） 与 RACE ( cDNA末端快速扩增） 相结合的 方法克隆了棉花的一个 ATP水解酶 （本文命名为 ATPase- 1 ) 的编码基因， 并测定了 其 DNA序列。 并且发现通过转基因技术将其导入植株并使其 表达后， 可明显改善转 基因植株的耐盐性， 而且这些性状可稳定遗传。

本发明第一方面提供棉花的一个 ATP水解酶 ATPase- 1 的编码基因 （本文命名为 GhATPase-1 ) ， 其序列为 SEQ ID NO : 2。

本发明第二方面提供一种重组表达载体， 其含有本发明第一方面所述的基因， 其是通过所述基因插入到一种表达载体而获得 的， 并且所述基因的核苷酸序列与所 述重组表达载体的表达控制序列可操作地连接 ； 优选地， 所述表达载体是 pCAMBIA2300 _; 优选地， 所述重组表达载体为附图 2所示的 35 S-GhATPase- l-2300载 体。

本发明第三方面提供一种重组细胞， 其含有本发明第一方面所述的基因或者本 发明第二方面所述的重组表达载体； 优选地， 所述重组细胞为重组农杆菌细胞。

本发明第四方面提供一种改善植物耐盐性的方 法， 包括： 将本发明第一方面所 述基因或者本发明第二方面所述的重组表达载 体导入植物或植物组织并使所述基因 表达； 优选地， 所述植物是拟南芥。

本发明第五方面提供一种制备转基因植物的方 法， 包括： 在有效产生植物的条 件下培养含有本发明第一方面所述基因或者本 发明第二方面所述的重组表达载体的 植物或植物组织； 优选地， 所述植物是拟南芥。

本发明第六方面提供本发明第一方面所述的基 因、 本发明第二方面所述的重组 表达载体或者本发明第三方面所述的重组细胞 用于改善植物耐盐性以及用于植物育 种的用途； 优选地， 所述植物是拟南芥。

本发明第七方面提供由本发明第一方面所述的 基因编码的蛋白质， 其氨基酸序 列如 SEQ ID NO : 1所示。 附图说明

图 1是 G/zATPsae-1基因的植物表达载体 （ 35S-GhATPase-l-2300 ) 构建流程 （图 la-lb) 。

图 2是 G/zATPase-1基因的植物表达载体 （35S-GhATPase-l-2300 ) 的质粒图。

图 3是转 GhATPase- 1基因的 T 1代拟南芥植株的耐盐实验结果， T lh2表现出 明显的耐盐性， T lh8、 T lhlO的结果与其类似， 在此未示出。

图 4 为利用反转录 PCR 对 1\代转基因拟南芥植株和非转基因对照植株中 GhATPase-1 基因的转录水平进行分子水平检测的结果。 M 为 DNA Ladder Marker ( DL2000 ) ， 1-8为耐盐 T1代转基因拟南芥植株 （分别属于 Tlh2、 Tlh8、 TlhlO三 个株系）， 9为质粒 PCR阳性对照 （35S-GhATPase-l-2300质粒） ， 10-13为非转基因 对照拟南芥植株。

具体实施方式 提供以下实施例， 以方便本领域技术人员更好地理解本发明。 所述实施例仅出 于示例性目的， 并非意在限制本发明的范围。

下面实施例中提到的未注明来源的限制性内切 酶均购自 New England Biolabs公司。 实施例 1. 盐胁迫下棉花 SSH文库构建：

具体方法为：

按照 Clontech公司的 PCR-select ^TM cDNA Subtraction Kit试剂盒说明书所示的方法 通过抑制差减杂交方法构建 SSH文库（抑制差减文库） 。 在实验过程中以盐处理的棉 花根组织中提取的 mRNA作为样本（Tester) , 以未处理的棉花根组织中提取的 mRNA 作为对照 （Driver) 。 具体步骤如下：

( 1 ) 供试材料：

非洲棉 （国家棉花中期库， 获取单位中国棉花研究所， 统一编号： ZM-06838 ) 播 种到灭过菌的蛭石上， 在 25 °C、 光暗周期 16h/8h条件下培养， 每周浇 1/2MS培养基 ( 9. 39 mM KN0 ₃ ， 0. 625 mM KH2P0 ₄ ， 10. 3 mM NH ₄ N0 ₃ ， 0. 75 mM MgS0 ₄ ， 1. 5 mM CaCl ₂ ， 50 μ M KI , 100 μ M H ₃ B0 ₃ , 100 μ M MnS0 ₄ ， 30 μ M ZnS0 ₄ ， 1 μ M Na ₂ Mo0 ₄ ， 0. 1 μ M CoCl ₂ ， 100 μ M Na ₂ EDTA, 100 μ M FeS0 ₄ ) 一次。 当苗株长高达 25-30 cm时用于实验。

( 2 ) 材料处理：

将供试幼苗分为 2组， 每组 4株。 第一组为对照组， 在 25 °C、 光照下培养， 放置 到 1/2MS液体培养基中； 第二组为处理组， 25 °C、 光照下培养， 放置到添加有终浓度 为 200 mM NaCl的 1/2MS液体培养基中， 处理 6小时。 处理完毕后及时剪取两组幼苗 的根， 用液氮迅速冷冻后， 于 -70 °C冰箱中保存。

( 3 ) 总 RNA提取：

分别取对照组和盐处理组的棉花根 0.5 g， 用植物 RNA 提取试剂盒 （购自 Invitrogen)提取总 RNA。 用 HITACHI公司的紫外分光光度计 U-2001测定所得总 RNA 在 260 nm和 280 nm的吸光度值， OD ₂₆ 。/OD ₂₈ 。比值为 1.8-2.0， 表明总 RNA纯度较 高， 用 1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测总 RNA的完整性， 28S条带的亮度约为 18S条带 的 2倍， 表明 RNA的完整性良好。 使用 Qiagen公司的 Oligotex mRNA纯化试剂盒（从 总 RNA中纯化 polyA+ RNA) 分离 mRNA。

( 4 ) 抑制差减杂交：

按 Clontech公司的 PCR-select ^TM cDNA Subtraction Kit试剂盒说明书所示的方法进 行抑制差减杂交。 先将 Driver mRNA和 Tester mRNA分别反转录， 得到双链 cDNA, 再以 2 μ g Tester cDNA和 2 μ g Driver cDNA作为起始材料进行差减杂交。 在 37°C水 浴下分别将 Tester cDNA和 Driver cDNA用 Rsa I酶切 1.5小时， 然后将酶切后的 Tester cDNA分成两等份， 连接上不同的接头， 而 Driver cDNA不连接头。 两种连有不同 接头的 Tester cDNA分别与过量的 Driver cDNA混合， 进行第一次正向差减杂交。 将 两种第一次正向差减杂交的产物混合， 再与新变性的 Driver cDNA进行第二次正向 差减杂交， 通过两次抑制性 PCR扩增富集差异表达基因的片段 （PCR进行前， 第二 次正向差减杂交产物进行末端补平） 。

( 5 ) 差减文库的构建与初步筛选、 克隆、 鉴定

依照 pGEM-T Easy试剂盒（购自 Promega) 的说明书， 将所述第二次正向差减杂 交 cDNA片段的第二次抑制性 PCR扩增产物 （使用 QIAquick PCR Purification Kit纯 化， 购自 Qiagen)与 pGEM-T Easy载体连接， 其具体步骤如下： 在 200 μ 1 PCR管中 依次加入下列成分： 纯化的合并后的正向差减杂交 cDNA 片段的第二次抑制性 PCR 产物 3 μ 1、 2 X T4 DNA连接酶缓冲液 5 μ 1、 pGEM-T Easy载体 1 μ 1、 Τ4 DNA连接 酶 1 μ 1， 于 4°C连接过夜。 然后取 10 μ ΐ连接反应产物， 加入到 100 μ 1感受态大肠 杆菌 JM109感受态细胞 （购自 TAKARA) 中， 冰浴 30分钟、 热休克 60秒、 冰浴 2 分钟， 然后加入 250 μ 1 LB液体培养基（含有 1%胰蛋白胨（Tryptone,购自 OXOID)、 0.5%酵母提取物（Yeast Extract, 购自 OXOID )禾 P 1% NaCl (购自国药））后置于 37°C 摇床中， 以 225 rpm振荡培养 30分钟， 然后从中取 200 μ 1菌液接种于含 50 μ g/ml 氨苄青霉素、 40 g/mL X-gal ( 5-溴 -4氯 -3-吲哚 - β -D-半乳糖苷） 、 24 g/mL IPTG (异 丙基 - β -D-硫代吡喃半乳糖苷）（X-gal/IPTG均购自 TAKARA) LB (同上） 固体培养板 上， 37°C培育 18小时。 计数培养板中直径 > 1 mm的清晰白色及蓝色菌落， 随机挑取 300 个白色菌落 （编号： Gh-S2-001 至 Gh-S2-300 ) 。 将所挑取白色菌落分别接种于 96孔细胞培养板（CORNING) 中的含 50 μ g/ml氨苄青霉素的 LB液体培养基（同上） 中， 37 °C培养过夜后加甘油至甘油终浓度为 20% (体积比） ， 然后于 - 80°C保存备 用。 使用巢式 PCR弓 I物 Primer 1和 Primer 2R(来自 Clontech公司的 PCR-select ^TM cDNA Subtraction Kit试剂盒） 对培养得到的菌液分别进行 PCR扩增验证， 共验证 231个阳 性克隆， 然后将所有阳性克隆送英潍捷基 （上海） 贸易有限公司测序。

( 6 ) 差异克隆的 cDNA测序分析：

将 DNA测序结果去除载体和不明确序列及冗余的 cDNA后， 共得到 203个有效 表达序列标签 (Expressed sequence tag, EST ) ( Unigene ) 。 实施例 2棉花 ATP水解酶基因 GhATPase-1的克隆

将所述鉴定的棉花 SSH文库中来自菌落 Gh-S2-117的克隆子去掉冗余 DNA后， 序 列为 SEQ ID No: 3， 序列分析表明该序列编码的蛋白属于 ATP水解酶。 本文将 SEQ ID No : 3 序列对应的全长编码基因命名为 GhATPase-1， 其对应的蛋白命名为 ATPase-l o

SEQ ID No: 3：

1 ACACTGGA¾A GCAGCTGCAG AAATAATCGT AGCCATGTGC TCAGACTATT ATGAGAGCAA 61 TGGGC GCATA AC GTCCATGG ATGAAGACCA AAGGAC CAGA ATTGAAACAA TAATCCAAAG

121 TATGC CCGCT AC TAGCTTAC GATGCATTGC TTTTC CTCAT AAC CAAGTCT CACA¾AAACA

181 CATGGAATC T GTTGATCATA GCGAAAAGAC ACATCA¾AGA ATA¾AACi¾AG ATGC TCTAAC

2, 4 . C T T G C T AG G G ATAGTTGGTT TGAAGG AT C C AT GT CG C C C A G G T G T 'C A.¾ A A A.AG C T GT GG A

301 AGCTTGTAAA TCTGCAGGGG TGGACATCAA AATGATTACT GGAGACAATA TTTTCACAGC 361 A^AAGCTATA GCTGCAGAAT GTGGAATTCT AGGAGCAGAT TACL¾ATGAAG AAAGTGGACA

421 AGCTATAGAA GGTATTG,¾AT TTCGAAATTA CACACCTGAA GAGAGAATGG AGAAGATCGG

481 GAAGATCAAG GTGATGGCAA GG CCTCTCC ATTTGACAAG CTTCTGATGG T

GhATPase-1全长编码基因的克隆 根据已经获得的 SEQ ID No: 3序列， 设计如下两条特异性引物， 作为 3 ' RACE 的 5 ' 端特异性引物。

GhATPase- 1 GSP 1： SEQ ID No： 4：

GCTGCAGAAT GTGGAATTCT AG

GhATPase- 1 GSP2: SEQ ID No: 5：

GTGATGGCAA GGTCCTCTCC AT

实验步骤按试剂盒说明书操作 （ 3 ' RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends试剂盒购自 Invitrogen公司） 。

用 SEQ ID NO: 4 与通用引物 AUAP (试剂盒自带） ， 以盐处理组棉花提取的 mRNA反转录得到的 cDNA为模板进行第一轮 PCR扩增。 具体步骤如下：

50 μ 1 PCR反应体系： 5 μ 1 ΙΟ Χ Εχ Buffer 3 μ 1 2.5 mM 的 dNTP、 2.0 μ 1 cDNA、 1.0 μ 1 Ex Taq (购自 TAKARA) 、 10 μ M的引物 SEQ ID NO: 4和 AUAP各 2.0 μ ΐ以及 35 μ ΐ 双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5分钟， 33个循环（94°C变 性 30秒， 58 °C退火 30秒， 72°C延伸 2分钟） ， 72°C延伸 10分钟。

将所得的 PCR产物用双蒸水稀释 50倍后取 2.0 μ ΐ作为模板， 用 SEQ ID NO: 5 与通用引物 AUAP进行第二轮 PCR扩增， 具体步骤如下：

50 y l PCR反应体系： 5 μ 1 lO X Ex Buffer 3 μ 1 2.5 mM的 dNTP、 2.0 μ 1稀释 的第一轮 PCR产物、 1.0 μ 1 Ex Taq 10 μ M的引物 SEQ ID NO: 5禾 P AUAP各 2.0 μ 1以及 35 μ 1的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5分钟， 33个循环（94°C变性 30秒， 58 °C退火 30秒， 72°C延伸 2分钟） ， 72°C延伸 10分钟。

回收第二轮 PCR 产物中片段约为 1300 bp 的条带 （Gel Extraction Kit 购自 OMEGA)， 并将其连接于 pGEM-T Easy载体， 然后转化到大肠杆菌 JM109感受态细 胞中 （具体方法同上）， 并将转化后的菌液涂布于含 50 g/mL氨苄青霉素、 40 ^glmL X-gaK 24 g/mL IPTG的 LB固体培养基上进行筛选。 随机挑取 10个白色菌落分别接种 于含有 50 g/ml氨苄青霉素的 LB液体培养基中， 37°C培养过夜后加甘油至甘油终 浓度为 20% (体积比） ， -80°C保存备用。 用 SEQ ID NO: 5与通用引物 AUAP进行 菌液 PCR扩增验证， 得 4个阳性克隆， 将 4个阳性克隆送至英潍捷基 （上海） 贸易 有限公司测序测序， 获得该基因的 cDNA的 3 ' 端。

根据已经获得的 GhATPase-1 基因片段， 设计如下三条特异性引物， 作为 5 ' RACE的 3 ' 端特异性引物。 GhATPase-1 GSP3 : SEQ ID No: 6：

CAAACCAACT ATCCCTAGCAAG

GhATPase-1 GSP4: SEQ ID No: 7：

TCTGCTCCTT TGGTCTTCAT CC

GhATPase-1 GSP5 : SEQ ID No: 8：

GCACATGGCT ACGATTATTT CTG 实验步骤按试剂盒说明书操作 （ 5 ' RACE System for Rapid Amplification of cDNA

Ends试剂盒购自 Invitrogen公司） 。

用 SEQ ID NO: 7与通用引物 AAP (试剂盒自带）， 以盐处理组棉花提取的 mRNA 反转录得到的 cDNA (反转录引物 SEQ ID NO: 6， dCTP加尾） 为模板进行第一轮 PCR扩增， 具体步骤如下：

50 μ 1 PCR反应体系： 5 μ 1 ΙΟ Χ Εχ Buffer 3 μ 1 2.5 mM 的 dNTP、 2.0 μ 1 cDNA、 1.0 μ 1 Ex Taq (购自 TAKARA) 、 10 μ M的引物 SEQ ID NO: 7和 AAP各 2.0 μ 1以及 35 μ 1的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5分钟， 33个循环 （94°C 变性 30秒， 55 °C退火 30秒， 72°C延伸 2分钟） ， 72°C延伸 10分钟。

将所得的 PCR产物用双蒸水稀释 50倍后取 2.0 μ ΐ作为模板， 用 SEQ ID NO: 8 与引物 AUAP进行第二轮 PCR扩增， 具体步骤如下：

50 y l PCR反应体系： 5 μ 1 lO X Ex Buffer 3 μ 1 2.5 mM的 dNTP、 2.0 μ 1稀释 的第一轮 PCR产物、 1.0 μ 1 Ex Taq 10 μ M的引物 SEQ ID NO: 8禾 P AUAP各 2.0 μ 1以及 35 μ 1的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5分钟， 33个循环（94°C变性 30秒， 58 °C退火 30秒， 72°C延伸 2分钟） ， 72°C延伸 10分钟。

回收第二轮 PCR 产物中片段约为 1800 bp 的条带 （Gel Extraction Kit 购自

OMEGA) ， 并将其连接于 pGEM-T Easy载体， 然后转化到大肠杆菌 JM109感受态细 胞中 （具体方法同上）， 并将转化后的菌液涂布于含 50 ^lmL氨苄青霉素、 40 ^glmL X-gaK 24 g/mL IPTG的 LB固体培养基上进行筛选。 随机挑取 10个白色菌落分别接种 于含有 50 μ _§ /ιη1氨苄青霉素的 LB 液体培养基中， 37°C培养过夜后加甘油至甘油终浓 度为 20% (体积比）， -80°C保存备用。 用 SEQ ID NO: 8与引物 AUAP进行菌液 PCR 扩增验证（反应体系及反应条件同上） ， 得到 6个阳性克隆， 选取其中 4个克隆送至 英潍捷基 （上海） 贸易有限公司测序， 获得该基因的 cDNA 的 5 ' 端。 所得的 5 'RACE产物克隆测序后， 将其与上述 3'RACE产物测序结果以及 SEQ ID No: 3序列进行拼接， 获得（¾ 2 ¾ -7全长 cDNA序列 SEQ ID No: 9：

1 AAAGCACAAA ACAGACTTCC AATTCAAGCA CTTCTTCCAA CTGGTTAAAG AAACCCAGCA

61 ACAACCATGT CTAGCAGTGA CGGTAATCAA ATTTACGATT GCGGTACATT ACTTTTCAAA

121 GTCACCACCT CTGGCTTCAC CACCGCTCAA AAGCGTTGGA GGATTGCCTA TGCATCGATA

181 TATTCTGTGC GGGTAATGCT TTCTCTTGCC AAGGAGATAA TATCGAAGAG AGGTATTGAA

241 CAACCCTCGA TCATCTCGGA TTTGCATCCT TACGTTGCGC TAGATGTTGA ACCCTCGAGC

301 TCTCCGCATT GGGGTGAAAA ATTTTCATCT TCCTCCTTTG CTCCGAAAAT TGATCGGAAG

361 AGACTTGTGG AGACCGTGAA AGAAAAGGAC TTGGTTTCTC TTCACCAGCT TGGAGGAGTC

421 GAAGGCATTG CCGCTGCTCT TGGAACAAAT CCTGAAAAGG GAATCCGAGA TGATGATCGA

481 GACGTTGTGA AAAGACAGGA GATGTTTGGT ACCAATACTT ACCACAAGCC ACCTCCCAAA

541 GGGTTACTGT ATTTTGTCCT GGATGCTTTC AAGGACACCA CAATTCTTAT CCTCCTGGTC

601 TGTGCTGCTC TTTCTCTTGG TTTTGGTATC AAAGAGCATG GTGCAGCAGA GGGTTGGTAT

661 GAAGGCGGAA GTATTTTCGT TGCCGTCTTT CTTGTGATTG TTGTCTCTGC ACTCAGTAAC

721 TTCAGACAGG AGACTCAATT TGACAAGCTA TCAAAAATAA GTAACAATAT CAAAGTCGAA

781 GTTGTTAGAG GTGGCCGCCG TCGACAAGTA TCTATTTTTG ATCTTGTTGT TGGAGATGTT

841 GTCTTCCTGA AGATTGGAGA TCAAATTCCA GCAGATGGGC TGTTCTTGGA CGGTTATTCA

901 CTGCAAGTGG ATGAATCGAG CATGACAGGA GAAAGTGACC ATATGGAAGT AGATGCCACC

961 AGGAACCCGT TCCTTTTTTC TGGTTCGAAA GTGGCAGATG GTTATGGTCA AATGCTTGTA

1021 GCATCCGTGG GAATGGATAC TACATGGGGA GAAATGATGA GCTCGATAAC CAGTGATAAA

1081 AACGAAAGAA CTCCACTACA AGAACGACTT GACAGACTTA CCTCTTCTAT CGGAAAGGTA

1141 GGTCTTGCGG TTGCCTTTCT AGTCCTTGTA GTCTTATTAA TTCGTTATTT CACTGGGAAT

1201 ACAGAAGATG ACAATGGGAA CACGGAGTAT ATTGGTAGCA AGACCAGCGT AGATGATATC

1261 TTAAATGCTG TTGTTCGTAT AGTTTCGGCT GCAGTAACTA TTGTGGTAGT TGCAATTCCG

1321 GAAGGTCTAC CATTGGCTGT CACTCTTACA CTTGCTTACT CAATGAAAAG AATGATGGCT

1381 GATCAGGCAA TGGTTAGAAA ACTTTCAGCT TGTGAAACGA TGGGCTCAGC TACCATCATT

1441 TGTACTGACA AAACTGGAAC CTTGACACTA AACCAGATGA AGGTAACCCA GTTTTGGCTC

1501 GGCCAAGAGT CCATCAAGGA AGATCATTCC AACATCATTG ACCACGCTGT TCTTGAATTA

1561 TTCTACCAAG GTGTTGTTTT GAACACAACT GGTAGTGTTT GCAAACCCGT CTCCGGATCC

1621 CTACCTGAAT TTTGTGGCAG TCCAACAGAA AAGGCGATTC TTTCTTGGGC TGTCTTAGGT

1681 TTGGATCTGG ATATGGAAAA ATTGAAGCAA AAATACAGCA TTCTCCATGT TGAAACTTTC

1741 AACTCGGAGA AAAAGAGAAG TGGGGTTTCA GTAAGGAGAA AAACAGATGA AACTCTTCAT

1801 GTACACTGGA AAGGAGCTGC AGAAATAATC GTAGCCATGT GCTCAGACTA TTATGAGAGC

1861 AATGGGGGCA TAAGGTCCAT GGATGAAGAC CAAAGGAGCA GAATTGAAAC AATAATCCAA

1921 AGTATGGCCG CTAGTAGCTT ACGATGCATT GCTTTTGCTC ATAAGCAAGT CTCACAAAAA

1981 GAGATGGAAT GTGTTGATGA TAGCGAAAAG AC AC AT C AAA GAATAAAAGA AGATGGTCTA

2041 ACCTTGCTAG GGATAGTTGG TTTGAAGGAT CCATGTCGCC CAGGTGTCAA AAAAGCTGTG

2101 GAAGCTTGTA AATCTGCAGG GGTGGACATC AAAATGATTA CTGGAGACAA TATTTTCACA

2161 GCAAAAGCTA TAGCTGCAGA ATGTGGAATT CTAGGAGCAG ATTACAATGA AGAAAGTGGA 2221 CAAGCTATAG AAGGTATTGA ATTTCGAAAT TACACACCTG AAGAGAGAAT GGAGAAGATC

2281 GGGAAGATCA AGGTGATGGC AAGGTCCTCT CCATTTGACA AGCTTCTGAT GGTACATGAG

2341 GTGGCAAAGG AGAGCTCAGA CATTGTCATA TTGGATGATA ATTTCAGCTC AGTTGCCACA

2401 GTTTTAAGAT GGGGAAGATG TGTATATAAC AACATACAGA AATTCATTCA ATTTCAGCTT

2461 ACCGTTAATG TTGCTGCTCT TGTAATTAAC TTCATTGCAG CAGTTTCTGC TGGTGAGGTT

2521 CCCTTGACAG CCGTTCAATT GCTGTGGGTA AACCTCATCA TGGACACCTT AGGTGCTCTA

2581 GCCCTTGCAA CAGATAGGCC CACCAAGGAA CTAATGAAGA AGCCGCCCGT CGGTCGAACT

2641 GAGCCCCTCA TTACTAATGT CATGTGGAGG AATCTTTTAG CCCAAGCAGT ATACCAGATA

2701 GCTATTCTCT TGATCTTGCA ATTTAGAGGT GAATCTATGT TCAATGTGCC TAAGAGGGTA

2761 AAGGACACAC TGATTTTCAA TACTTTCGTT CTCTGCCAAG TTTTCAACGA ATTCAACGCA

2821 AGGAAGTTGG AGAAGCAAAA CGTCTTCCAA GGCATTCTTC AGAACAGATT GTTTCTGGGA

2881 ATCGTGGGCA TAACCATCAT TCTTCAGGTG GTTATGGTGG AATTTCTAAA GAAGTTTGCA

2941 GATACTGAGA GATTGGAACT ATGGCAGTGG GGGGTTTGTA TCTTATTCGC AGCTTTCTCA

3001 TGGCCAATTG CATGGGTTGT GAAGCTCATA CCTGTTTCGG ACAAACCCTT CTTCAGTTAT

3061 CTCAAGCGAT CAAAATCATC TTCACAATTA AATAAGTCAT CTACCACAAG AAACCTTCAA

3121 TCTGCAGGCA TGGAACTAGA AGTGCAATAA GATCATGTTC TGAAAGAACA AGGATGTAAG

3181 TTCAAAATCA CTTCACTGAC ACAAAGGACA ACATAAGGAG ATCATGATTC TAGATTTCGT

3241 ATACTTTAAG AGCTACTAAC TTATATTTAT GTATGTATAT GTAAAATGAC TTTTCTGATA

3301 AAGGCCTTGG AACCATTGGT CCCAGATTCA ATCTAACCTC ATGGAGCTTT GCTCTTATCT

3361 TTACCTAGGA TGTTTCTAGT TCCACGCCAA TTGTTAGTTG ACCCTTTAGT AATGGCTTAT

3421 TCCTTTCTAA ATCTGAAACA GGATCATATG TGCTACCTAT TGTACTTATT CTCGTAAAAA

3481 TGAAATACCC TTAATGTATC TACCTAAAAA AAAAAAAAAA AAAAA 根据 SEQ ID NO: 9序列设计一对引物如下:

SEQ ID No: 10：

ATGTCTAGCA GTGACGGTAA TC SEQ ID No: 11：

TTATTGCACT TCTAGTTCCA TGC 通过 SEQ ID NO: 10和 SEQ ID NO: 11来克隆 G/L4 Pa - 全长编码基因。 采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶， 以上述棉花的 cDNA为模板进行 PCR反应。 50 y l PCR反应体系： 10 y l 5 X PS Buffer、 3 μ 1 2.5 mM的 dNTP、 2.0 μ 1 cDNA 1.0 μ 1 PrimeSTAR HS DNA聚合酶、 10 μ M的引物 SEQ ID NO: 10和 SEQ ID NO: 11各 2.0 μ 1以及 30 μ 1的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5分 钟， 33个循环 （94°C变性 30秒， 58 °C退火 30秒， 72 °C延伸 3分钟） ， 72°C延伸 10 分钟。

PCR扩增产物加 A尾： PCR产物中加入 2.5倍体积的无水乙醇， -20°C放置 10分 钟， 离心， 去上清， 晾干， 然后用 21 μΐ双蒸水溶解所得沉淀。 然后向其中加入 2.5 μ 1 lOXEx Buffer 0.5 μ 15 mM的 dATP、 1.0 lExTaq。 反应条件： 70°C反应 30分 钟。 将得到的约 3000 bp的 DNA片段回收（Omega回收试剂盒）， 并将其连接至 pGEM T-easy载体上得到 GhATPase-lpGEM质粒， 然后将连接产物转化大肠杆菌 JM109感受 态细胞中 （方法同上）， 并将转化后的菌液涂布于含 50 g/mL氨苄青霉素、 40 g/mL X-gaK 24 g/mLIPTG的 LB固体培养基上进行筛选。 随机挑取 10个白色菌落分别接种 于含有 50 g/ml氨苄青霉素的 LB 液体培养基中， 37°C培养过夜后加甘油至甘油终 浓度为 20% (体积比）， -80°C保存备用。 用 SEQ ID NO: 10与 SEQ ID NO: 11进行 菌液 PCR扩增验证 （反应体系及反应条件同上） ， 得到 3个阳性克隆， 选取其中 3 个阳性克隆送至英潍捷基 （上海） 贸易有限公司测序， 所得序列为 SEQ ID NO: 2， 其编码的蛋白质的氨基酸序列为 SEQ ID NO: 1。

ATPase-1蛋白的氨基酸序列： SEQ ID NO: 1

1 SSSDGNQIY DCGTLLFKVT

21 TSGFTTAQKR WRIAYASIYS

41 VRV LSLAKE IISKRGIEQP

61 SIISDLHPYV ALDVEPSSSP

81 HWGEKFSSSS FAPKIDRKRL

101 VETVKEKDLV SLHQLGGVEG

121 IAAALGTNPE KGIRDDDRDV

141 VKRQE FGTN TYHKPPPKGL

161 LYFVLDAFKD TTILILLVCA

181 ALSLGFGIKE HGAAEGWYEG

201 GSIFVAVFLV IVVSALSNFR

221 QETQFDKLSK IS丽 IKVEVV

241 RGGRRRQVSI FDLVVGDVVF

261 LKIGDQIPAD GLFLDGYSLQ

281 VDESS TGES DH EVDATRN

301 PFLFSGSKVA DGYGQ LVAS

321 VG DTTWGE SSITSDKNE

341 RTPLQERLDR LTSSIGKVGL

361 AVAFLVLVVL LIRYFTGNTE

381 DDNGNTEYIG SKTSVDDILN

401 AVVRIVSAAV TIVVVAIPEG

421 LPLAVTLTLA YS KR ADQ

441 A VRKLSACE T GSATIICT

461 DKTGTLTLNQ KVTQFWLGQ

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Α^ΊΞΊΛΥΗαΐ i SHaa^isa T8^ 60 o 1 GGAAGTATTT TCGTTGCCGT CTTTCTTGTG ATTGTTGTCT CTGCACTCAG TA¾CTTCAGA o

661 CAGGAGACTC AATTTGACA , ATA¾GTAACA A ATCAAAGT CGAAGTTGTT

721 AGAGGTGGCC GCCGTCGACA AGTATCTATT TTTGATCTTG TTGTTGGAGA TGTTGTCTTC

781 CTGAAGATTG GAGATCA^AT TCCAGCAGAT GGGCTGTTCT TGGACGGTTA TTCACTGCAA

841 GTGGATGAAT CGAGCATGAC AGGAGAAAGT GACCATATGG AAGTAGATGC CACCAGGAAC

901 CCGTTCCTTT TTTCTGGTTC GAAAGTGGCA GATGGTTATG GTCAAATGCT TGTAGCATCC

961 GTGGGAATGG ATACTACATG GGGAGAAATG ATGAGCTCGA TAACCAGTGA

AGAACTCCAC TAC¾AGA¾CG ACTTGACAGA CTTACCTCTT CTATCGGAAA GGTAGGTCTT

1 081 GCGGTTGCCT TTCTAGTCCT TGTAGTCTTA TTAATTCGTT ATTTCACTGG GAATACAGA

1141 GATGACAATG GGAACACGGA GTATATTGGT AGCAAGACCA GCGTAGATGA TATCTTAAAT

GCTGTTGTTC GTATAGTTTC GGCTGCAGTA ACTATTGTGG TAGTTG ¾AT TCCGGAAGGT

1261 CTACCATTGG CTGTCACTCT TACACTTGCT TACTCAATGA AAAGAATGAT GGCTGATCAG

1321 GCAATGGTTA GA AACTTTC AGCTTGTGAA ACGATGGGCT CAGCTACCAT CATTTGTACT

1381 GACAAAACTG GAACCTTGAC ACTA^ACCAG ATGAAGGTAA CCCAGTTTTG GCTCGGCCAA

144 1 GAGTCCATCA AGGAAGATCA TTC ¾ACATC ATTGACCACG CTGTTCTTGA ATTATTCTAC

1501 CAAGGTG'TTG TTTTGAACAC AAGTGG AGT GTTTGCAAAC CCGTCTCCGG ATGCCTACCT

1561 GAA TTTGTG GCAGTCCAAG AGAAAAGGCG ATTGTTTCTT GGGCTGTCT AGGTTTGGAT

1621 CTGGATA GG AAAAA'TTGAA AGCATTCTGC ATGTTGA/iAC TT CAACTCG

1681 GAGAA/iAAGA GAAGTGGGG TTCAGTi AGG AGAAA ACAG A'TGAAACTCT TCATGTAGAC

1741 TGGAAAGGAG CTGCAGA^\ AA CGTAGCC ATG GCTCAG ACTATTATGA GAGCAATGGG

18 01 GGCATAAGGT GC/iTGGATGA AGACCAAAGG AGCAGAAT G AAACAATAA'T CCAAAGTATG

18 61 GL_U CTAGTA GCTTAGGATG CA TGCTTTT GCTCATAAGC AAGTCTCACA AAAAGAGATG

^ Q 21 GAA GTG TG ATGATAGCGA AAAGACACAT CAAAGAATAA AAGAAG— TGG TCTAACC TG

1981 CTAGGGA AG TTGGT TGAA GGATCCATGT CGCCCAGG G TCA ^AAAAGC TG GGAAGCT

2 041 TGTAAATCTG CAGGGGTGGA CATCAAAATG ATTACTGGAG ACAATATTT CACAGCAAAA

2101 GCTATAGCTG CAGAA GTGG AATTCTAGGA GCAGATTACA ATGAAGAAAG TGGACAAGCT

2161 ATAGAAGGTA TGAATTTCG AAATTACACA CCTGAAGAGA GAATGGAGAA GATCGGGAAG

2221 ATCAAGGTGA TGGCAAGGTC CTCTCCATTT GACAAGCT C TGATGGTACA TGAGGTGGCA

2281 AAGGAGAGCT CAGACATTG CATATTGGAT GATAATTTCA GCTCAGTTGC CACAGTT TA

AGATGGGGAA GATGTGTATA TAACAACATA CAGAAATTCA TTCAA TTCA GC TACCGTT

24 01 AATGTTGCTG CTCTTGTAA TAACTTCATT GCAGCAGTTT C GCTGGTGA GGTTCCC TG

ACAGCCG TC AATTGCTGTG GGTAAAC TC ATCATGGACA CCTTAGGTGC TC AGCCCTT

GCAACAGATA GGCCCACCAA GGAACTAATG AAGAAGCCGC CCGTCGGTCG ^ACTGAGCCC

2581 CTCATTACTA ATGTCATGTG GAGG^ATCTT TTAGCCCAAG CAGTATACCA GATAGCTATT

2641 CTCTTGATCT TGC^ATTTAG AGGTGAATCT ATGTTC^ATG TGCCTAAGAG GGTA^AGGAC

2701 ACACTGATTT TCAATACTTT CGTTCTCTGC ¾AGTTTTCA ACGAATTCA , CGCAAGGAAG

2761 TTGGAGA¾GC AA^ACGTCTT CC AGGCATT CTTCAG^ACA GATTGTTTCT GGGAATCGTG

2821 GGCATAACCA TCATTCTTCA GTGGAATTTC TA^AGAAGTT TGCAGATACT

2881 AACTATGGCA TGTATCTTAT TCGCAGCTTT CTCATGGCCA

2 941 ATTGCATGGG TTGTGAAGCT CATACCTGTT TCGGACAAAC CCTTCTTCAG TTATCTCAAG

CATCTTCACA ATTA^ATAAG TCATCTACCA CAAGA ACCT TCAATCTGCA

3 061 GGCATGGAAC TAGAAGTGCA ATAA 实施例 3 GhATPase-1基因的植物表达载体的构建

选择植物双元表达载体 pCAMBIA2300 (购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公 司） 作为植物表达载体， 用 Pnos启动子替换 ΝΡΤΠ基因含双增强子的 35S启动子， 以降低 ΝΡΤΠ 蛋白在植物中的表达。 选择 35S 启动子及 Tnos 终止子分别作为 G/L4 Pa - 基因的启动子和终止子， 构建流程图如图 1所示。

使用引物 SEQ ID NO: 12和 SEQ ID NO: 13， 以植物表达载体 pBI121质粒（购 自北京华夏远洋科技有限公司） 为模板扩增 Pnos， 采用 TaKaRa 的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶。 50 l PCR反应体系： 10 l 5 X PS Buffer、 3 μ 1 2.5 mM的 dNTP、 1.0 μ 1 ρΒΙ121质粒、 1.0 μ ΐ PrimeSTAR HS DNA聚合酶、 10 μ M的引物 SEQ ID NO: 12和 SEQ ID NO: 13各 2.0 μ ΐ以及 31 μ 1的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 分钟， 33个循环 （94°C变性 30秒， 56°C退火 30秒， 72°C延伸 30秒） ， 72 °C延伸 10 分钟。 通过 EcoRI、 Bglll酶切将所得的 PCR产物按试剂盒说明 （Promega, T4 连接 酶试剂盒） 连接到 pCAMBIA2300获得 pCAMBIA2300-l。

SEQ ID NO: 12

GCACGAATTC ggcgggaaac gacaatctga

SEQ ID NO: 13

ATCCAGATCTAGATCCGGTGCAGATTATTTG

用引物 SEQ ID NO: 14和 SEQ ID NO: 15以 pBI121质粒为模板扩增 Tnos, 采 用 TaKaRa 的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶。 50 μ 1 PCR 反应体系： 10 μ ΐ 5 X PS Buffer 3 μ 1 2.5 mM的 dNTP、 1.0 μ 1 pBI121质粒、 1.0 μ 1 Prime STAR、 10 μ Μ的 引物 SEQ ID NO: 14和 SEQ ID NO: 15各 2.0 μ 1以及 31 μ 1的双蒸水。 PCR反应条 件： 94°C预变性 5分钟， 33个循环 （94°C变性 30秒， 58 °C退火 30秒， 72 °C延伸 30 秒）， 72°C延伸 10分钟。 通过 Kpnl、 EcoRI酶切将所得的 PCR产物连接（Promega T4 连接酶试剂盒） 到 pCAMBIA2300-l获得 pCAMBIA2300-2。

SEQ ID NO: 14：

AAGGGTACCGAATTTCCCCGATCGTTCAAA SEQ ID NO: 15：

TCAGAATTCCCAGTGAATTCCCGATCTAGTA 用引物 SEQIDNO: 16和 SEQIDNO: 17以 pCAMBIA2300质粒为模板扩增 35S 启动子。 采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶。 50 μ 1 PCR反应体系： 10 μ 1 5XPS Buffer、 3 μ 1 2.5 mM 的 dNTP、 1.0 μ 1 pCAMBIA2300 质粒、 1.0 μ 1 PrimeSTAR HS DNA聚合酶、 10 μ M的引物 SEQ ID NO: 16禾 P SEQ ID NO: 17各 2.0 μΐ以及 31 μΐ双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5分钟， 33个循环 （94°C变 性 30秒， 58°C退火 30秒， 72°C延伸 30秒） ， 72°C延伸 10分钟。 通过 HindIII、 Sail 酶切将所得的 PCR 产物连接 （连接方法同上） 到 pCAMBIA2300-2 获得 pCAMBIA2300-3。

SEQIDNO: 16：

ACTAAGCTTTAGAGCAGCTTGCCAACATGGTG

SEQIDNO: 17：

TGAGTCGACAGAGATAGATTTGTAGAGAGAGACT 用引物 SEQ ID NO: 18和 SEQ ID NO: 19扩增 G/^ Pa^- 编码基因的全长序 列（模板是实施例 2所获得阳性 GhATPase-1-pGEM质粒）， 采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA 聚合酶。 50 μ 1 PCR 反应体系： 10 μΐ 5XPS Buffer 3 μ 1 2.5 mM 的 dNTP 1.0 μ 1 GhATPase-1-pGEM质粒、 1.0 μ 1 PrimeSTAR HS DNA聚合酶、 10 μ M 的引物 SEQIDNO: 18和 SEQIDNO: 19各 2.0 μ 1以及 31 μ 1双蒸水。 PCR反应条 件： 94°C预变性 5分钟， 33个循环 （94°C变性 30秒， 58°C退火 30秒， 72°C延伸 3 分钟） ， 72°C延伸 10分钟。 通过 Xbal、 Smal酶切将所得的 PCR产物连接 （连接方 法同上）到 pCAMBIA2300-3， 经验证后获得植物表达载体 35S-GhATPase-l-2300 (图 2) 。

SEQIDNO: 18

ACTTCTAGA ATGTCTAGC AGTGACGGTAAT C SEQIDNO: 19

ACTCCCGGGTTATTGCACTTCTAGTTCCATGC

实施例 4 35S-GhATPase-l-2300表达载体转化农杆菌

农杆菌 LBA4404 (购自 Biovector Science Lab, Inc) 感受态细胞的制备： 将农杆 菌 LBA4404在含 50 μ g/ml利福平和 50 μ g/ml链霉素的 LB固体培养基上划单斑接 种， 28°C培养 1至 2天。 挑取单菌落接种于 5 ml含 50 μ g/ml利福平和 50 μ g/ml链 霉素的 LB液体培养基中， 28°C下摇动培养过夜（约 12-16小时）至 OD ₆ 。。值为 0.4， 形成种子菌液。 取 5 ml培养活化后的菌液 （1 :20的比例） 接种于 100 ml含 50 μ g/ml 利福平和 50 μ g/ml 链霉素的 LB 液体培养基中， 28 °C摇动培养 2-2.5 小时至 OD _6QQ =0.8。 冰浴菌液 10 分钟， 每隔 3 分钟摇匀一次， 使所述细菌均匀进入休眠状 态。 于 4°C下 4000 g离心 10分钟， 弃上清液； 加入 1 ml冰预冷的 10% (体积比） 甘 油重悬浮菌体， 4°C下 4000 g离心 10分钟， 收集沉淀； 用冰预冷的 10% (体积比） 甘油重复洗 3-4次； 然后加入适量冰预冷的 10% (体积比）甘油重新悬浮细菌沉淀， 即制得 LBA4404感受态细胞， 以 40 μ ΐ/管将其分装， 于 -70°C保存备用。

转化农杆菌： 在冰上融化所述的 LBA4404感受态细胞， 向 40 μ 1的所述感受态 细胞中加入 1 μ 1实施例 3获得的质粒 35S-GhATPase-l-2300， 混匀后冰浴约 10分钟。 将冰浴后的感受态细胞和 35 S-GhATPase- 1 -2300质粒的混合物用微量移液器转移到冰 预冷的 0.1cm规格的电击杯 （购自 Bio-Rad) 中， 轻敲使悬浮液到达电击杯底部， 注 意不要有气泡。 将所述电击杯放到电击室的滑道上， 推动滑道将电击杯放至电击室 基座电极处。 将 MicroPulser (购自 Bio-Rad) 的程序设置为 "Agr" ， 电击一次 。 立 即取出电击杯， 加入 28°C预热的 200 μ1 ίΒ培养基。 快速而轻柔的用微量移液器将感 受态细胞打匀。 将悬浮液转入 1.5 ml的离心管， 在 28°C下 225 rpm摇动培养 1小时。 取 100-200 μ ΐ的菌液涂布于相应的抗性筛选培养基平板上 （LB固体培养基， 含 50 μ g/ml利福平、 50 μ g/ml链霉素、 50 μ g/ml卡那霉素） ， 28°C培养。 筛选阳性转化 克隆， 并将其菌液于 -70°C保存备用。 实施例 5 受体材料拟南芥培养

选择吸水性好， 土质松软的蛭石配合营养土 （1 : 1 ) 作为拟南芥种植土壤。 直径 9 cm的花盆， 每盆播种 20-30颗种子 （哥伦比亚型， 来自美国俄亥俄州立 大学的拟南芥生物资源中心） 。 播种以后在花盆上罩上薄膜， 给植株的生长提 供一个湿润的环境。 恒温 22°C， 光照强度 3500-4000 lx， 光照周期为 12小时黑 暗、 12小时光照培养， 每 7天浇灌一次 1/2MS , 培养 30天后， 每盆保留 4-5棵 植株， 光照周期调整为 8小时黑暗、 16小时光照培养， 待大部分植株都抽薹之 后， 在花序基部剪掉整个主苔， 去其顶端优势， 约 1 周后在腋芽部位长出 4-6 个新生侧苔， 待侧苔花序形成花蕾并部分开花或形成 1-2个角果时， 便可用于 转化。 实施例 6 拟南芥花浸转化：

将实施例 4获得的已转化 35S-GhATPase-l-2300表达载体的农杆菌菌液接 种至含有 10-50μ ₈ /ηι1卡那霉素 （kan) 的 LB液体培养基中培养过夜， 第二天早 上按 1:50接种至含有 50μ ₈ /ηι1卡那霉素的新的 LB培养基 （1L) 中， 培养约 8 个小时， 至农杆菌液 OD600在 1.0到 1.2之间。 室温 5000 rpm离心 5分钟， 弃 上清， 将农杆菌沉淀悬浮于浸染培养基（1/2MS液体培� ��基， 并含有 5%蔗糖； 用 KOH调至 pH5.7; 0.02% Silwet L-77 ) 中， 使 OD600在 0.8左右。 将实施例 5 制备的用于转化的拟南芥的上部缓缓、 螺旋式浸入所述含农杆菌的浸染培养 基内， 轻轻顺时针晃荡， 约 2分钟， 用透明塑料罩盖严以保持湿度， 放入温室 过夜。 24小时后移去塑料透明罩， 用水浇透。 之后 2-3周， 保证植株水分充足。 当植株停止开花， 第一个果荚成熟变黄时， 用纸袋套住， 当纸袋内的所有果荚 变黄后， 停止浇水， 1-2周干燥后收取种子， 进行转化子筛选， 同时取未经转化 处理的拟南芥果荚作为对照。 实施例 7 拟南芥转基因阳性转化子的筛选

种子消毒： 先用 70%乙醇浸泡 10分钟， 并不时地使种子悬浮； 然后用无菌 水洗四次， 并不时地使种子悬浮。然后， 将处理后的种子均匀涂布在含 50 μ ₈ /ηι1 卡那霉素的 1/2MS固体筛选培养基表面上春化 2天 （一块 150 mm直径的平皿 最多播种 1500粒种子）， 4°C春化 2天， 然后在恒温 22°C、 光照强度 3500-4000 lx光照周期为 12小时黑暗 /12小时光照的条件下培养 7-10天。转基因种子在所 述筛选培养基（MS+kan) 平板上萌发 2周以后， 将能够萌发并正常生长的植株 转入土壤继续培养。 剪取所述能够在筛选培养基上正常生长的每株 植物的 1-2 个叶片， 提取其 DNA作为模板， 用 SEQ ID NO: 18和 SEQ ID NO: 19作为引 物进行 PCR检测 （反应体系及条件同上） ， 去除 PCR检测呈阴性的植株， 收 集 PCR检测呈阳性的植株的种子， 分别标记为 T0hl-T0h22。 实施例 8 过表达 GhATPase-1的转基因拟南芥 T1代植株的种植 选择吸水性好， 土质松软的蛭石配合营养土 （1 : 1 ) 作为拟南芥种植土壤。 将 T0hl-T0h22的每种转化子及未转基因对照拟南芥� �子各播种 2盆，每盆播种 20-30颗种子。播种以后在花盆上罩上薄膜，给� ��株的生长提供一个湿润的环境。 恒温 22°C，光照强度 3500-4000 lx，光照周期为 12小时黑暗、 12小时光照培养， 每 7天浇灌一次 1/2MS。 培养 25天后， 每株转基因拟南芥剪取 1-2个叶片提取 DNA作为模板， 用 SEQ ID NO: 18和 SEQ ID NO: 19作为引物进行 PCR检测 (反应体系及条件同上） ， 去除 PCR检测呈阴性的植株， 每盆保留 7-8棵 PCR 检测呈阳性的苗， 继续培养 10天后， 每盆保留大小较一致的 5-7棵转基因拟南 芥苗或对照拟南芥苗进行耐盐实验。 实施例 9 过表达 GhATPase-1的转基因拟南芥 T1代植株的耐盐实验 将实施例 8中转基因拟南芥、 对照拟南芥各保留一盆植株不作处理， 正常 浇灌 1/2MS , 同时各一盆植株浇灌含有 150 mM NaCl的 1/2MS , 在恒温 22°C、 光照强度 3500-4000 lx、 12小时光培养 /12小时暗的条件下培养 14天后观察实 验结果。 T1 代转基因植株 （TO 代转基因植株的种子长成的植株） 的耐盐性鉴 定表明， T1代转基因植株 Tlh2、Tlh8、TlhlO三个株系表现出明显的耐盐性� �见 图 3， 以 Tlh2例， Tlh8、 TlhlO的结果与类似， 在此未示出） 。 实施例 10 在转录水平上验证 G/L4 Pa - 基因的表达

将实施例 9中耐盐性好的 T1代转基因植株中随机选取 8棵（分别属于上述 Tlh2、 Tlh8、 TlhlO三个耐盐株系）， 实施例 9中对照植株随机选取 4棵， 各剪取盐（150 mM NaCl)处理 14天的叶片 0.05 g， 用植物 RNA提取试剂盒（Invitrogen)提取总 RNA。 紫外分光光度测定所得总 RNA在 260 nm和 280 nm的吸光度值， 计算各个 RNA浓 度。 依照 Invitrogen反转录试齐 Ll盒 Superscript III Reverse Transcriptase所示方法进行反 转录（取 1 μ _§ 总 RNA作为模板， 反转录引物为 SEQ ID NO: 11 )。 使用引物 SEQ ID

NO: 10和 SEQ ID NO: 20 ( SEQ ID NO: 20： TTACAAGAGC AGCAACATTA ACGGT) 扩增 G/L4 Pa^- 片段， 检测其转录情况。 采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶， 以上述反转录得到的 cDNA为模板进行 PCR反应。 50 μ 1 PCR反应体 系： 10 yl 5XPS Buffer, 3 μ 12.5 mM的 dNTP， 2.0 μ 1 cDNA, 1.0 μ 1 Prime STAR HSDNA聚合酶、 10 μ M的引物 SEQ IDNO: 10和 SEQIDNO: 20各 2.0 μ 1， 以及

30 μΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5分钟， 32个循环 （94°C变性 30秒， 58°C退火 30秒， 72°C延伸 2分钟）， 72°C延伸 10分钟。 产物电泳结果如图 4所示： M为 DNA Ladder Marker (DL2000, 购自深圳瑞真生物技术有限公司） ， 1-8为耐盐 T1代转基因拟南芥植株， 10-13为非转基因对照拟南芥植株， 9为质粒 PCR阳性对照 (35S-GhATPase-l-2300质粒）。 图中所示条带大小与阳性对照的大小一致（约 为 2400 bp)。 结果表明， 耐盐 T1代转基因拟南芥植株中 G/^ ¼^- 有显著转录， 非转基因 对照拟南芥植株中没有 GhATP -1的转录。