CAMPO DA INVENÇÃO

Linhagens de Escherichia coli patogênica para aves (APEC) causam infecções extra-intestinais e são responsáveis por significativas perdas económicas na indústria avícola mundial. Recentemente, foram descritos isolados de APEC geneticamente relacionados a diversas outras E.coli extraintestinais (ExPEC) de origem humana, indicando a possibilidade das mesmas constituírem risco zoonótico para humanos.

A presente invenção visou à deleção de três genes (hcp, que codifica uma proteína estrutural e secretada; elpV, que codifica uma ATPase; e icmF, fator de multiplicação intracelular); e criação de 3 linhagens mutantes de E.coli que apresentam virulência atenuada in vivo com uma significativa diminuição de características relacionadas à patogenicidade.

Esta invenção descreve também com o método para produção de vacinas a partir do uso das linhagens mutantes, a vacinas originadas e seus usos.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO O Brasil é, atualmente, o maior exportador mundial e o terceiro maior produtor de carne de frango, estando atrás apenas dos Estados Unidos e da China (Associação de Brasileira dos Produtores e Exportadores de Frango; ABEF, 2011 - www.abef.com.br). Este cenário demonstra a importância que a indústria avícola representa para as economias interna e exportadora brasileiras, gerando empregos e alimentos de alto valor protéico com relativo baixo custo. A indústria avícola apresenta fatores que podem afetar significativamente os seus rendimentos, causar diminuição da produtividade e, por conseguinte, aumento de custo. Entre esses fatores, destacam-se as infecções causadas por microrganismos patogênicos (vírus, bactérias e fungos) e, principalmente, pela bactéria Escherichia coli, agente significativo de morbidade e mortalidade (Gross, W.B. COLIBACILLOSIS: DISEASE OF POULTRY. 9th ed., lowa State University Press, Ames, lowa, p. 138-144, 1991).

Escherichia coli é um bacilo gram negativo, anaeróbio facultativo, cuja temperatura ideal de crescimento varia entre 25°C e 37°C, podendo crescer até a 45°C, e em faixas de pH entre 4,4 e 9,0 (Reed, G. H. FOODBORNE ILLNES (PART 8) Escherichia coli, dairy, food and environmental sanitation. v. 14, p. 329 - 330, 1994). O género Escherichia, pertencente à família Enterobacteriacea, possui diferentes grupos antigênicos, os quais são caracterizados por diversas combinações do antígeno O (antígeno lipopolissacarídico somático constituinte da membrana externa), antígeno K (antígeno polissacarídico capsular) e antígeno H (antígeno protéico flagelar), o que origina aproximadamente 181 sorotipos, descritos atualmente (Piatti, R.M.; Baldassi, L. PREVALÊNCIA DE ESCHERICHIA COLI O78:K80 NA MICROBIOTA DE AVES DA REGIÃO OESTE DO ESTADO DE SÃO PAULO. Arq. Inst Biol. v. 74, p. 357- 359, 2007). Algumas linhagens de £. coli fazem parte da microbiota normal do trato intestinal do hospedeiro, sendo benéficas para os mesmos. Entretanto, há uma grande variedade de infecções entéricas e extraintestinais causadas por estes microrganismos em diversos tipos de hospedeiros (Ron, E.Z. HOST APECIFICITY OF SEPTICEMIC ESCHERICHIA COLI: HUMAN AND AVIAN PATHOGENS. Cur Opin Microbiol. v.9, p.28-32, 2006).

As denominadas Escherichia coli patogênicas para aves (APECs) estão associadas a diversas doenças, entre as quais, destacam-se: septicemia, síndrome da cabeça inchada, onfalite e celulite.

A septicemia, doença causada pela linhagem descrita na presente invenção, é uma doença infecciosa sistémica que inclui inflamação dos sacos aéreos, pericardite e perihepatite, com a falência de múltiplos órgãos das aves infectadas (Rodriguez-Siek, K.E.; Giddings, C.W.; Doetknott, C. Characterizing THE APEC PATHOTYPE. Vet. Res. p.241, 2005).

Entre os fatores de virulência já descritos mais estudados em amostras APEC, estão as fímbrias do tipo 1 e P, aerobactina, produção de cápsula, lipopolissacarídeo (LPS), colicina V, proteínas relacionadas à resistência ao soro e sistemas de aquisição de ferro (Ewers, C; Li, G.; Wilking, H.; Kiessling, S.; Alt, K.; Antão, E.M.; Laturnus, C; Diehl, H.; Glodde, S.; Homeier, T.; Bohnke, U.; Steintuck, H.; Philipp, H.C.; Wieler, L.H. AVIAN PATHOGENIC, UROPATHOGENIC AND NEWBORN MENINGITIS-CAUSING ESCHERÍCHIA COLI: HOW CLOUSE ARE THEY? Int J. Med. Microbiol. v.287, p. 163-76, 2007).

Há, porém, diversos outros mecanismos de virulência conhecidos em Escheríchia coli e em outros patógenos bacterianos em geral. Um exemplo muito significativo é a secreção de certas proteínas no meio exterior à bactéria e, também, diretamente no interior das células do hospedeiro (Economou, A.; Christie, P.J.; Fernandez, R.C.; Palmer, T.; Plano, G.V.; Pugsley, A.P. SECRETION BY NUMBERS: PROTEIN TRAFFIC IN PROKARYOTES. Mol Microbiol. v.62, p.308-319, 2006).

Os mecanismos moleculares pelos quais proteínas são secretadas por bactérias gram-negativas e positivas envolvem estruturas macromoleculares protéicas, os chamados sistemas de secreção, que podem ser mais ou menos complexos em termos de composição e regulação (Boyer, F.; Fichant, G.; Berthod, J.; Vandenbrouck, Y.; Attree, I. DISSECTING THE BACTERIAL TYPE VI SECRETION SYSTEM BY A GENOME WIDE IN SILICO ANALYSIS: WHAT CAN BE LEARNED FROM AVAILABLE MICROBIAL GENOMIN RESOURCES? BMC genomics. v.10, p.104, 2009). Estes complexos macromoleculares são capazes de influenciar a resposta do hospedeiro ao agente infeccioso, liberando fatores de virulência para o ambiente extracelular, ou os translocando para o interior de células hospedeiras. Para serem secretadas, as proteínas necessitam destes sistemas para tornar possível o processo de atravessar a membrana interna, o espaço periplasmático e a membrana celular externa de bactérias gram-negativas (Thanassi, D.G.; Hultgren, S.J. MULTIPLE PATHWAYS ALLOW PROTEIN SECRETION ACROSS THE BACTERIAL OUTER MEMBRANE. Curr Opin CelI Biol. v.12, p. 420-30, 2000).

Os sistemas de secreção de proteínas exercem importantes funções na virulência e sobrevivência bacteriana dentro de células eucarióticas, assim como na adaptação ao ambiente, sendo amplamente distribuídos entre as bactérias (Economou et ai, 2006).

Em bactérias gram-negativas há seis classes de sistemas de secreção de proteínas (Sistemas de Secreção Tipo I a VI) os quais têm sido caracterizados por mediarem o transporte de proteínas para o exterior celular bacteriano. Os sistemas de secreção tipo I, III, IV e VI exportam proteínas através das membranas interna e externa, em um único passo. Outras proteínas são exportadas previamente para o espaço periplasmático via sistemas Sec ou Tat (reconhecem sequência N-terminal hidrofóbica e aminoácidos básicos de sequência N-terminal de proteínas, respectivamente) e, então, translocadas através da membrana externa via sistemas de secreção tipo II ou tipo V (Tseng, T.T.; Tyler, B.M.; Setúbal, J.C. PROTEIN SECRETION SYSTEMS IN BACTERIAL-HOST ASSOCIANTIONS, AND THEIR DESCRIPTION IN THE GENE ONTOLOGY. BMC microbiology. v.103, p.1528-1533, 2009).

Bactérias gram-positivas também dispõem dos mesmos sistemas de secreção encontrados em bactérias gram-negativas e possuem, ainda, um sistema específico deste grupo, o Sistema de Secreção Tipo VII. Apesar de bactérias gram-positivas possuírem somente uma membrana, algumas espécies de Mycobacterium, possuem uma parede celular externa constituída por lipídeos, chamada micomembrana. Por esta razão, bactérias que pertencem a este grupo possuem o sistema de secreção tipo VII, capaz de transportar proteínas através desta parede celular (Tseng ef al., 2009).

O Sistema de Secreção Tipo VI

O enfoque da presente invenção é o Sistema de Secreção Tipo VI (SST6), recentemente descrito, o qual influencia na interação com o hospedeiro, promove sucesso na infecção e auxilia na adaptação ao ambiente (Boyer ef al., 2009; Tseng ef al., 2009; Bingle, L.E.; Bailey, C.M.; Pallen, MJ. TYPE VI SECRETION: A BEGINNER'S GUIDE. Curr Opin Microbiol. v.11, p.3-8, 2008; Filloux, A.; Hachani, A.; Bleves, S. THE BACTERIAL TYPE VI SECRETION MACHINE: YET ANOTHER PLAYER FOR PROTEIN TRANSPORT ACROSS MEMBRANES. Microbiology. v.154, p.1570-1583, 2008; Wu, H.Y.; Chung, P.C.; Shih, H.W.; Wen, S.R.; Lai E.M. SECRETOME ANALYSIS UNCOVERS AN HCP-FAMILY PROTEIN SECRETED VIA A TYPE VI SECRETION SYSTEM IN AGROBACTERIUM TUMEFACIENS. J Bacteriol. v.190, p.2841-2850, 2008).

O "cluster" do SST6 é composto por 15 a 20 genes, conservados tanto em bactérias patogênicas quanto em não patogênicas (Filloux ef al., 2008; Boyer ef al., 2009). Uma ampla análise de genomas bacterianos identificou um grupo de 13 proteínas conservadas, que constitui o chamado "núcleo" do SST6 e um conjunto de proteínas não conservadas, com funções regulatórias e acessórias. Subclasses do SST6 diferenciam-se no conteúdo dessas proteínas acessórias, sugerindo que este sistema evoluiu para se adaptar a vários microambientes e ao desenvolvimento de funções especializadas (Cascales, E. THE TYPE VI SECRETION TOOLKIT. EMBO reports. v.9, p.735-741, 2008; Bingle ef a/., 2008). Em Pseudomonas aeruginosa estes genes acessórios codificam elementos de uma via de regulação pós-transcricional que modulam a atividade do Sistema de Secreção através de mudanças do estado de fosforilação da proteína Fha1 (Mougous, J.D.; Gifford, C. A.; Ramsdell, T. L; Mekalanos, J. J. THREONINE PHOSPHORYLATION POST-TRANSLATIONALLY REGULATES PROTEIN SECRETION IN PSEUDOMONAS AERUGINOSA. Nat Celi Biol. v.9, p.797- 803, 2007), o que estimula o funcionamento do SST6. Em outras espécies já foram caracterizados mecanismos regulatórios do operon do SST6 que envolvem ativadores transcricionais da família AraC ou ainda Sigma 54. Em muitos casos, estes elementos regulatórios são também codificados dentro do operon (Filloux ef a/., 2008).

Apesar da clara importância do SST6 na patogênese bacteriana, muitas bactérias que possuem este sistema não são patógenos, nem simbiontes. Trabalhos prévios demonstram que o SST6 agiria, também, limitando a replicação bacteriana ou virulência, favorecendo relações comensais ou mutualísticas entre bactérias e seus hospedeiros. Um exemplo da contribuição do SST6 favorecendo uma colonização em longo prazo, foi uma mutação no locus sciS (que codifica parte do SST6), de Salmonella typhimurium, a qual resultou em aumento da replicação bacteriana dentro de macrófagos e aumento na virulência em modelos in vivo (Parsons, D.A.; Heffron, F. SC/S, AN ICMF HOMOLOG IN SALMONELLA ENTÉRICA SEROVAR TYPHIMURIUM, LIMITS INTRACELLULAR REPLICATION AND DECREASES VIRULENCE. Infect. Immun. v.73, p.4338-4345, 2005). Fato similar ocorreu em Helicobacter hepaticus (Chow, J.; Mazmanian, S.K. A PATHOBIONT OF THE MICROBIOTA BALANCES HOST COLONIZATION AND INTESTINAL INFLAMMATION. Celi Host Mie robe. v.7, p.265-276, 2010). Entretanto, o SST6 também poder ser requerido para a virulência de patógenos humanos e de outros animais, como Vibrio cholerae, Edwardsiella tarda, Pseudomonas aeruginosa, Fransciella tularensis, e em patógenos de plantas, como Agrobacterium tumefaciens, Pectobacterium atrosepticum e Xanthomonas oryzae (Bingle ef a/., 2008; Shrivastava, S.; Mande, S.S. IDENTIFICATION AND FUNCTIONAL CHARACTERIZATION OF GENE COMPONENTS OF TYPE VI SECRETION SYSTEM IN BACTERIAL GENOMES. PLoS ONE. v.3, p.2955, 2008; Filloux et a/., 2008; Wu et al., 2008; Cascales, 2008). Em bactérias patogênicas já foi demonstrado que este sistema de secreção está relacionado a diversas características da virulência, como a resistência à predação por amebas em Vibrio cholerae e Burkholderia cenocepacia (Aubert, D.F.; Flannagan, R.S.; Valvano, M.A. A NOVEL SENSOR KINASE-RESPONSE REGULATOR HYBRID CONTROLS BIOFILM FORMATION AND TYPE VI SECRETION SYSTEM ACTIVITY IN BURKHOLDERIA CENOCEPACIA. Infect Immun. v. 76, p.1979-1991 , 2008; Pukatzki, S.; Ma, A.T.; Sturtevant, D.; Krastins, B.; Sarracino, D.; Nelson, W.C. IDENTIFICATION OF A CONSERVED BACTERIAL PROTEIN SECRETION SYSTEM IN VIBRIO CHOLERAE USING THE DICTYOSTELIUM HOST MODEL SYSTEM. Proc Natl Acad Sei USA. v.103, p.1528-1533, 2006), virulência global do patógeno Edwardsiella tarda (Rao, P.; Yamada, Y.; Tan, Y.; Leung, K.Y. USE OF PROTEOMICS TO IDENTIFY NOVEL VIRULENCE DETERMINANTS THAT ARE REQUIRED FOR E. TARDA PATHOGENESIS. Mol Microbiol. v.53, p.573-586, 2004) e inibição da atividade fagocítica de macrófagos em Aeromonas hydrophila (Suarez, G.; Sierra, J.; Sha, J.; Wang, S.; Erova, T.; Fadl, A MOLECULAR CHARACTERIZATION OF A FUNCTIONAL TYPE VI SECRETION SYSTEM FROM A CLINICAL ISOLATE OF AEROMONAS HYDROPHILA. Microb Pathog. v.44, p.344-361, 2008). Também pode ser requerido para uma eficiente colonização de raiz pelas bactérias fixadoras de nitrogénio Mesorhizobium loti e Rhizobium leguminosarum (Bingle et ai, 2008; Bladergroen, M.R., Badelt, K. and Spaink, H.P. INFECTION BLOCKING GENES OF A SYMBIOTIC RHIZOBIUM LEGUMINOSARUM STRAIN THAT ARE INVOLVED IN TEMPERATURE-DEPENDENT PROTEIN SECRETION. Mol. Plant-Microbe Interact. v.16, p. 53-64, 2003). Alguns exemplos de bactérias não simbiontes que possuem genes do SST6 são Myxococcus xanthus, Dechlotomonas aromática e Rhodopirellula baltica, sugerindo que o mesmo pode contribuir, também, para a adaptação ambiental. Um trabalho recente sugere, ainda, que o SST6 pode mediar interações antagónicas entre bactérias, sendo que em uma competição bacteriana, seria favorecida a espécie que o possuísse (Jani, A.J.; Cotter, P.A. TYPE VI SECRETION: NOT JUST FOR PATHOGENESIS ANYMORE. Celi Host Mier ob. v.8, p.2-6, 2010).

Apesar de terem sido realizados diversos estudos sobre o SST6, as funções exatas dos genes deste sistema ainda são especulativas. Acredita- se que as proteínas que não são secretadas, podem ser tanto componentes estruturais do aparato de secreção, quanto auxiliar no transporte de proteínas de alguma outra forma, como por exemplo, fornecendo a energia necessária para translocar os substratos através do canal de secreção (Filloux eí a/., 2008).

Os componentes do SST6 que foram parcialmente caracterizados, até o momento, incluem uma ATPase CIpV (caseinolytic protease V - membro da família de proteínas Hsp100/Clp), um gene homólogo de Icm-F (intracellular multiplication F - proteína transmembrana que estabilizaria o complexo protéico na membrana) e as proteínas estruturais e secretadas Hcp (hemolysin coregulated protein - que forma o tubo hexamérico transmembrana através do qual as proteínas são secretadas) e VgrG (Valine- glycine repeat protein - estrutura pontiaguda localizada acima do tubo Hcp, que supostamente perfuraria a célula hospedeira, para a secreção das proteínas efetoras) (Bingle ef a/., 2008; Filloux eí a/., 2008; Cascales, 2008). A maioria destes componentes estudados não é secretada, mas é necessária para a secreção do efetor VgrG, que é, supostamente, estrutural e secretado (Bingle ef a/., 2008; Cascales, 2008). A proteína CIpV

ATPases são frequentemente utilizadas por sistemas de secreção para fornecerem energia para o processo do transporte. No caso do SST6, o gene cIpV pertence a uma superfamília de ATPases a qual energiza a formação de um canal hexamérico, através do qual proteínas são transportadas num mecanismo também dependente de hidrólise de ATP (Bingle et a/., 2008; Cascales, 2008). O gene cIpV é um membro da família Hsp100/Clp. As proteínas desta família agem em uma rede de controle de qualidade de proteínas em células procarióticas para desagregar, degradar e redobrar proteínas mal formadas ou agregadas (Schlieker, C; Zentgrafer, H.; Dersch, P.; Mogk, A. CLPV, A UNIQUE HSP100/CLP MEMBER OF PATHOGENIC BACTÉRIA. Biol Chem. v.386, p. 1115-1127, 2005) A proteína CIpV, aparentemente, não possui atividade de desagregação, mas é capaz de realizar a função de transporte e redobramento de proteínas (Bingle eí a/., 2008; Filloux ef a/., 2008; Cascales, 2008, Schlieker et al, 2005). Em um estudo anterior, foi demonstrado que a mutação de cIpV em Pseudomonas aeruginosa, ou mesmo a perda da região protéica responsável pela atividade ATPásica, é suficiente para abolir a capacidade de secreção deste sistema ( ougous, J.D.; Cuf, M.E.; Raunser, S.; Shen, A.; Zhou, .; Gifford, C.A.; Goodman, A.L.; Joachimiak, G.; Ordonez, C.L.; Lory, S.; Walz, T.; Joachimiak, A.; Mekalanos, J.J. A VIRULENCE LOCUS OF PSEUDOMONAS AERUGINOSA ENCODES A PROTEIN SECRETION APPARATUS. Science, v.312, p.1526-1530, 2006). Um trabalho apresentado por Bonemann e colaboradores (Bõnemann, G.; Pietrosiuk, A.; Diemand, A.; Zentgraf, H.; Mogk, A. RE ODELLING OF VIPA/VIPB TUBULES BY CLPV-MEDIATED THREADING IS CRUCIAL FOR TYPE VI PROTEIN SECRETION. Embo J. v.28, p.315-325, 2009) desafiam este conceito, por sugerir outro papel para a proteína CIpV de V/Mo cholera no SST6. Os dados sugerem que Hcp e VgrG não interagem com CIpV. Os autores demonstraram que CIpV interagiria com duas proteínas não caracterizadas do SST6, VipA e VipB (complexos tubulares que integram o SST6), as quais são citosólicas e não secretadas. VipA e VipB seriam capazes de formar microtúbulos e a atividade de CIpV resultaria na clivagem de grandes complexos de VipA-B em pequenos complexos, que formariam o canal de secreção. Este processo de "desmontagem" requereria o reconhecimento de VipA-B pela porção N-terminal de CIpV. Esta seria uma teoria a mais sobre a montagem do canal de secreção do sistema.

As proteínas Hcp e VgrG

Hcp (hemolysin coregulated protein) é uma proteína que forma anéis hexaméricos, que se sobrepõem para dar origem ao tubo transmembrana através do qual as proteínas são secretadas, enquanto VgrG (Valine-glycine repeat protein) é uma proteína que forma uma estrutura pontiaguda localizada na extremidade superior do tubo Hcp e que, supostamente, perfuraria a célula hospedeira, para a secreção das proteínas bacterianas efetoras no interior da mesma (Bingle ef a/., 2008; Filloux et a/., 2008; Cascales, 2008).

Análises das sequências de proteínas VgrG confirmam que algumas regiões C-terminal das mesmas possuem domínios que mostram similaridades com adesinas ou proteínas com funções enzimáticas (Cascales, 2008), enquanto outras extensões C-terminal possuem uma variedade de domínios conservados que estão implicados em várias funções biológicas, incluindo a ligação ao citoesqueleto de actina da célula hospedeira e degradação da camada de peptidoglicano (Pukatzki, S.; McAuley, S.B.; lyata, S.T. THE TYPE VI SECRETION SYSTEM: TRANSLOCATION OF EFFECTORS AND EFFECTOR DOMAINS. Curr Opin Microbiol. v.12, p.11- 17, 2009). Quando expresso em células eucarióticas, o domínio de VgrG que favorece essa ligação na actina, causa colapso do citoesqueleto da célula hospedeira (Sheahan, K.L.; Cordero, C.L.; Satchell, K.J. IDENTIFICATION OF A DOMAIN WITHIN THE MULTIFUNCTIONAL VIBRIO CHOLERA RTX TOXIN THAT COVALENTLY CROSS-LINK ACTIN. Proc Natl Acad USA. v.101, p.9798-9803, 2004). Esta interação entre VgrG e actina é direta e requer ATP como fonte de energia (Pukatzki, S.; Ma, A.T.; Revel, A.T.; Sturtevant, D.; Mekalanos, JJ. TYPE VI SECRETION SYSTEM TRANSLOCATES A PHAGE TAIL SPIKE-LIKE PROTEIN INTO TARGET CELLS WHERE IT CROSS-LINKS ACTIN. Prot Natl Acad USA. v.104, p.15508-15513, 2007). Este conjunto de proteínas da família VgrG, que contém domínios não estruturais, que exercem um papel na patogênese, são chamados VgrGs "evoluídos" (Pukatzki eí a/., 2007). Estas características, porém, não são gerais, pois uma grande quantidade de organismos que contém SST6 não codifica proteínas VgrGs "evoluídas" (Pukatzki ef a/., 2009).

Proteínas homólogas de Hcp e VgrG têm sido detectadas em sobrenadantes de cultura celular da maioria das bactérias que possui SST6 e em fluidos de células eucarióticas infectadas, sugerindo que essas proteínas são também exportadas (Filloux ef ai., 2008). Mutações em genes hcp ou vgrG, em V. cholerae e Edwardsiella tarda, previnem a secreção de Hcp e VgrG, respectivamente, reforçando a hipótese de que essas proteínas são componentes secretáveis do aparato (Filloux ef a/., 2008). Há evidências, em V. cholerae, de que uma das proteínas VgrG secretada, que possui atividade de ligação no citoesqueleto de actina, in vitro, tenha a função de realizar uma possível translocação para dentro de macrófagos, por um mecanismo dependente de SST6 (Pukatzki ef a/., 2007). A presente invenção reforça a hipótese que as proteínas VgrGs formam um complexo que pode agir como uma estrutura que penetra a membrana, transportando o domínio efetor de VgrG para o citoplasma do hospedeiro. Contudo, ainda não é claro se VgrG age como um transportador ou como um efetor sob condições fisiológicas, ou se ambas as funções são igualmente importantes (Pukatzki ef a/., 2007).

Recentes cristalografias de proteínas das famílias de Hcp e VgrG demonstraram que elas apresentam grande similaridade com as proteínas do tubo e da cauda de bacteriófagos, sendo que estes sistemas seriam estruturalmente e evolutivamente relacionados (Leiman, P.G.; Basler, M.; Ramagopal, U.A.; Bonanno, J.B.; Sauder, J.M.; Pukatzki, S.; Burley, S.K.; Almo, S.C.; Mekalanos, J.J. TYPE VI SECRETION APPARATUS AND PHAGE TAIL-ASSOCIATED PROTEIN COMPLEXES SHARE A COMMON EVOLUTIONARY ORIGIN. Proc Natl Acad Sei USA. v.106, p.4154-4159, 2009; Pell, L.G.; Kanelis, V.; Donaldson, L.W.; Howell, P.L.; Davidson, A.R. THE PHAGE LAMBDA MAJOR TAIL PROTEIN STRUCTURE REVEALS A COMMON EVOLUTION FOR LONG TAILED PHAGES AND THE TYPE VI BACTERIAL SECRETION SYSTEM. Proc Natl Acad Sei USA. v.106, p.4160- 4165, 2009). De acordo com esse modelo, muito similar ao proposto para Vibrio cholerae, o SST6 seria uma cauda de bacteriófago invertida (Leiman, P.G.; Basler, M.; Ramagopal, U.A.; Bonanno, J.B.; Sauder, J.M.; Pukatzki, S.; Burley, S.K.; Almo, S.C.; Mekalanos, J.J. TYPE VI SECRETION APPARATUS AND PHAGE TAIL-ASSOCIATED PROTEIN COMPLEXES SHARE A COMMON EVOLUTIONARY ORIGIN. Proc Natl Acad Sei USA. v.106, p.4154-4159, 2009; Pell eí a/., 2009) e as estruturas Hcp e VgrG formariam um pilus na superfície bacteriana. As moléculas de VgrG possuiriam duas funções, uma seria como parte integrante da estrutura, sendo localizada no final do tubo Hcp e responsável pela perfuração da membrana da célula eucariótica, e outra como molécula efetora injetada dentro desta mesma célula, conforme já sugerido por alguns autores (Pukatzki ef a/., 2007; Bingle eí a/., 2008; Filloux eí a/., 2008; Cascales, 2008).

A proteína Icm-F Os genes icm-F-like contêm vários domínios transmembrana, localizados na membrana interna bateriana, sendo essenciais para replicação intracelular em várias linhagens (Bingle ef a/., 2008; Sexton, J.A.; Miller, J.L.; Yoneda, A.; Kehl-Fie, T.E.; Vogel J.P. LEGIONELLA PNEUMOPHILA DOTU AND ICMF ARE REQUIRED FOR STABILITY OF THE DOT/ICM COMPLEX. Infect Immun. v.72, p. 5983-5992, 2004). A proteína IcmF, segundo o modelo proposto por Cascales (2008), seria uma proteína transmembrana que, supostamente, interagiria com a parte citosólica do SST6, assim como com a ATPase CIpV (Cascales, 2008). IcmF apresenta uma proteína homóloga constituinte do sistema de secreção dot/icm, inicialmente caracterizado em Legionella pneumophila. Neste sistema, IcmF interagiria com a proteína DotU, formando um complexo DotU/lcmF, com a função de montar e estabilizar o complexo responsável pela secreção de fatores de virulência (VanRheenen, S.; Duménil, G.; Isberg, R.R. ICMF AND DOTU ARE REQUIRED FOR OPTIMAL EFFECTOR TRANSLOCATION AND TRAFFICKING OF THE LEGIONELLA PNEUMOPHILA VACUOLE. Infect Immun. v.72, p.5972-5982, 2004).

Pela importância apresentada SST6 na patogênese de diversos agentes bacterianos e ao fato de que nada relacionado a este tipo de sistema já tenha sido descrito em qualquer linhagem de Escheríchia coli patogênica para aves (APEC), identificou-se através do sequenciamento de nucleotídios, a presença dos genes icm-F, clpV e hcp do SST6 na linhagem SEPT 362. Dessa forma, geraram-se três mutantes, a partir da exclusão desses genes, os quais foram utilizados para a elaboração de vacinas úteis para a prevenção de sepyicemia em aves.causada por Escherichia coli, agente significativo de morbidade e mortalidade.

BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

Infecções causadas por Escherichia coli patogênica para aves

(APEC) resultam em perdas económicas significativas na indústria avícola mundial. Além disso, as APECs pertencem a um grupo de E.coli extraintestinais e vêem sendo consideradas como potenciais patógenos para seres humanos, por apresentarem uma grande similaridade genômica com outras ExPECs patogênicas, como UPEC (Escherichia coli Uropatogênica) e NMEC (Escherichia coli causadora de meningite em recém-nascidos) (Moulin- Schouleur, M., M. Reperant, S. Laurent, A. Bree, S. Mignon-Grasteau, P. Germon, D. Rasschaert, and C. Schouler. EXTRA-INTESTI AL PATHOGENIC ESCHERICHIA COLI STRAINS OF AVIAN AND HUMAN ORIGIN: LINK BETWEEN PHYLOGENETIC RELATIONSHIPS AND COMMON VIRULENCE PATTERNS. J Clin Microbiol. v.45, p.3366-3376, 2007; Johnson, T.J.; Nolan, L.K. PATHOGENOMICS OF THE VIRULENCE PLASMIDS of Escherichia coli. Microbiol. Mol. Bio. Rev. v.73, p. 750 - 774, 2009).

As Escherichia coli, assim como outras bactérias, formam uma enorme diversidade de associações, mutualísticas ou patogênicas, com uma vasta gama de hospedeiros. A secreção de proteínas tem um importante papel na modulação dessas interações. Dentre as várias ferramentas utilizadas pela bactéria para influenciar a resposta do hospedeiro, aparatos que secretam proteínas e toxinas são cruciais para virulência e sobrevivência bacteriana dentro do hospedeiro (Economou et al., 2006; Jani & Cotter, ei a/., 2010; Bingle et al., 2008).

Em bactérias gram-negativas, onde a secreção protéica e de outros subprodutos envolve a translocação por entre as membranas interna e externa, atualmente são conhecidos seis classes de sistemas de secreção de proteínas.

O Sistema de Secreção Tipo VI (T6SS) foi recentemente descrito e está presente em uma grande diversidade de bactérias patogênicas, comensais e simbiontes, que interagem com células euca óticas e entre si (Boyer ef a/., 2009; Shrivastava & Mande et al., 2008; Cascales, 2008; Jani & Cotter, 2010).

Por essa razão, devido a influencia de genes do SST6 na patogênese de uma linhagem de Escheríchia coli septicêmica para aves, a presente invenção identificou os genes hcp, clpV e icmF, constituintes do Sistema de Secreção de interesse. Depois de identificados, foram realizados experimentos de PCR em tempo real e microarranjos para verificação e confirmação da expressão dos mesmos (Anexo 1A). Estes genes foram, então, deletados do genoma da amostra selvagem SEPT362, gerando três mutantes, Ahcp, AcipV e AicmF.

A presente invenção promove atenuação da linhagem de

Escheríchia coli patogênica para aves através Da delação dos genes hcp, clpV e icmF, do SST6, os quais podem influenciar a expressão da fímbria tipo 1 , estão envolvidos nos processos de adesão e invasão, formação de biofilme, rearranjo do citoesqueleto de células hospedeiras e são importantes para patogenicidade in vivo.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Na Figura 1 visualizam-se os iniciadores utilizados para detecção e seqCienciamento dos genes do SST6, sendo que SEQ ID:01 representa a sequência direta para o gene Hcp, SEQ ID:02, a sequência reversa para este mesmo gene; SEQ ID:03 representa a sequência direta para o gene icmF, SEQ ID:04, a sequência reversa para este mesmo gene; e, finalmente, vê-se que a SEQ ID.05 representa a sequência direta para o gene c/pV, SEQ ID:06, a sequência reversa para este mesmo gene.

Visualizam-se, na Figura 2, os Iniciadores utilizados para amplificação do fragmento de DNA para a recombinação homóloga. Sublinhados estão os iniciadores utilizados para amplificação do gene da canamicina e não sublinhados estão os 50 nucleotídeos de homologia com gene a ser recombinado. Na SEQ ID:07 está representada a sequência direta do gene clpV e em SEQ ID:08 a sequência reversa do mesmo gene; Na SEQ ID:09 está representada a sequência direta do gene Hcp e em SEQ ID:10 a sequência reversa do mesmo gene; Finalmente, na Na SEQ ID:11 está representada a sequência direta do gene IcmF e em SEQ ID:12 a sequência reversa do mesmo gene.

Na Figura 3, visualizam-se os iniciadores utilizados na amplificação do cassete de cloranfenicol, sendo SEQ ID13 a sequência direta para o gene e SEQ ID 14 a sequência reversa para o mesmo gene. 59

Os iniciadores utilizados nas reações de complementação das linhagens mutantes são visualizados na Figura 4. Sublinhados estão sítios de restrição para as enzimas utilizadas e em negrito sublinhado estão indicados os nucleotídeos que indicam o início da transcrição. A SEQ ID: 15 representa a sequência direta do gene CIpV e a SEQ ID: 16 a sequência reversa para o mesmo gene; A SEQ ID: 17 representa a sequência direta do gene Hcp e a SEQ ID: 18 a sequência reversa para o mesmo gene; A SEQ ID: 19 representa a sequência direta do gene Icm-F e a SEQ ID: 20 a sequência reversa para o mesmo gene; E, finalmente, a SEQ ID: 21 representa a sequência direta do gene VgrG e a SEQ ID: 22 a sequência reversa para o mesmo gene.

Na Figura 5 é possível verificar-se a invasão das linhagens estudadas às células HeLa, em meio DMEM. Os números são apresentados em Unidades Formadoras de Colónias.

A viabilidade das linhagens utilizadas na presente invenção dentro de macrófagos J744 é demonstrada na Figura 6.

Na Figura 7 observamos a capacidade de formação de biofilme em superfície abiótica pelas linhagens utilizadas no desenvolvimento da presente invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DOS ANEXOS

No Anexo 1, observa-se a a comparação da transcrição dos genes hcp, clpV e icmF in vitro, nas linhagens SEPT362 e EHEC 86-24, indicado por A. Em B, pode-se observar a transcrição dos genes hcp, clpV e icmF in vitro, na presença de células HeLa, 3h e 6h após a infecção. E, finalmente, em C, é possível verificar-se a transcrição do gene cipV em diferentes órgãos, comparado com a expressão in vitro. O resultado sugere que o SST6 é extremamente mais expresso in vivo, em aves de 21 dias de idade.

O teste de sobrevivência em pintos SPF é mostrada no Anexo 2 de um dia de idade infectados com 10 ⁹ bactérias das linhagens analisadas. Em A, temos o teste comparando a patogenicidade da linhagem Ahcp com a linhagem SEPT362; Em B, visualiza-se o teste comparando a patogenicidade da linhagem AcIpV com a linhagem SEPT362 e, em C, temos o teste comparando a patogenicidade da linhagem AicmF com a linhagem SEPT362.

No Anexo 3, verificamos a motilidade das linhagens utilizadas;

Nos quadros A e B temos os padrões de motilidade das linhagens estudadas, enquanto em C, são mostradas as medições dos aios de motilidade das linhagens selvagem (SEPT362), mutante AicmF e complemento AicmFC. Em D, é possível verificar-se a expressão dos genes relacionados à montagem flagelar nas linhagens SEPT362 e AicmF, enquanto em E temos o Heat Map mostrando o resultado da expressão dos genes responsáveis pela montagem do flagelo, de acordo com experimentos de microarranjo.

Pode-se visualizar o perfil das proteínas de membrana no Anexo 4, sendo A o marcador de peso molecular (Fisher® BioReagents EZ-Run Prestained Protein Ladder), B representa SEPT362, C representa AicmF, D representa AcIpVe E, Ahcp;

No Anexo 5 mostra-se a alteração do arranjo do citoesqueleto de actina em células HeLa devido à infecção pelas linhagens selvagem e mutantes. A imagem A representa a linhagem SEPT362, a imagem B representa a linhagem Ahcp, a imagem C representa a linhagem ÂcIpV e a imagem D, a linhagem AicmF.

O Anexo 6 apresenta a adesão das linhagens utilizadas na presente invenção a células HeLa, sendo que em A, vemos a adesão da linhagem selvagem SEPT362 a células HeLa; em B a adesão da linhagem mutante Ahcp a células HeLa; em C a adesão da linhagem mutante complementada Ahcp C a células HeLa; em D, a adesão da linhagem mutante AcIpV a células HeLa; em E a adesão da linhagem mutante complementada AclpV C a células HeLa; e, finalmente, em F a adesão da linhagem mutante AicmF a células HeLa; em G, a adesão da linhagem mutante complementada AicmF C a células HeLa.

DESCRIÇÃO DETALHADA

Infecções causadas por Escherichia coli patogênica para aves (APEC) resultam em perdas económicas significativas na indústria avícola mundial. Além disso, as APECs pertencem a um grupo de E.coli extraintestinais e vêem sendo consideradas como potenciais patógenos para seres humanos, por apresentarem uma grande similaridade genômica com outras ExPECs patogênicas, como UPEC {Escherichia coli Uropatogênica) e NMEC (Escherichia coli causadora de meningite em recém-nascidos) (Moulin- Schouleur et a/., 2007; Johnson & Nolan, 2009).

As Escherichia coli, assim como outras bactérias, formam uma enorme diversidade de associações, mutualísticas ou patogênicas, com uma vasta gama de hospedeiros. A secreção de proteínas tem um importante papel na modulação dessas interações. Dentre as várias ferramentas utilizadas pela bactéria para influenciar a resposta do hospedeiro, aparatos que secretam proteínas e toxinas são cruciais para virulência e sobrevivência bacteriana dentro do hospedeiro (Economou ef a/., 2006; Jani & Cotter, ef a/., 2010; Bingle ef a/., 2008).

Em bactérias gram-negativas, onde a secreção protéica e de outros subprodutos envolve a translocação por entre as membranas interna e externa, atualmente são conhecidos seis classes de sistemas de secreção de proteínas.

O Sistema de Secreção Tipo VI (T6SS) foi recentemente descrito e está presente em uma grande diversidade de bactérias patogênicas, comensais e símbiontes, que interagem com células eucarióticas e entre si (Boyer ef a/., 2009; Shrivastava & Mande ef a/., 2008; Cascales, 2008; Jani & Cotter, 2010).

Por essa razão, a presente invenção visou à determinação o silenciamento de genes do SST6 envolvidos na patogênese de uma linhagem de Escheríchia coli septicêmica para aves.

Características da linhagem de interesse

lsolou-se a linhagem patogênica SEPT362 (SOROTIPO OR:H10), do fígado de uma ave (galinha poedeira) com quadro clínico de septicemia. Esta linhagem possui 5 plasmídios, com 2,7 MDa, 4,7 MDa, 43 Da, 56 MDa e 88 MDa cada e resistência aos antibióticos Estreptomicina (lOO g/ml), Ampicilina (100pg/ml) e Tetraciclina (50Mg/ml). A partir dessa linhagem selvagem, foram deletados três genes (hcp, icmF e elpV) do SST6, gerando três mutantes, conforme descrito na tabela 1.

Tabela 1 : Linhagens isoladas na presente invenção Meios de cultura utilizados

• Luria-Bertani (LB): Para 1 L de meio de cultura: Triptona - 1g; Extrato de Levedura - 0,5g; NaCI - 1g, pH 7,4.

• DMEM: Dulbecco ^' s modified eagle médium: 1000mg/L D- glicose; 584mg/L L-glutamina; 110mg/L piruvato de sódio. Extração de DNA genômico

DNA genômico deve ser extraído cultivando-se 50 ml da linhagem bacteriana por 18 horas, sem agitação, em meio LB, a 37°C. As células devem então ser centrifugadas e ressuspendidas em 3 ml de tampão de isolamento (0,15M Tris/HCI; 0,1 M EDTA - pH 8,0). A esse volume adicionam-se 500μΙ de solução SDS 20% (Dodecil Sulfato de Sódio, diluído em água deionizada autoclavada).

A amostra deve ser incubada a 65°C por 5 minutos e, a seguir, adicionam-se a ela 6 ml de solução fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (23:24:1 ), em seguida, deve-se, então, homogeneiza-la e centrifuga-la a 14000rpm a 4°C, por 5 minutos, descartando-se posteriormente, a camada aquosa. Ao volume restante adicionam-se, cuidadosamente, 10 ml de solução de etanol 95% gelado e o sedimento formado deve ser removido com um bastão de vidro e dissolvido em tampão TE (10mM Tris/HCI; 1 mM EDTA). Para a remoção de RNA, adicionam-se 4μΙ de RNAse (ΙΟμς/μΙ) a 300μΙ da extração de DNA e a amostra incubada a 37°C por 3 horas.

Para re-precipitação, ao DNA genômico tratado com RNAse, são adicionados 900μΙ de solução de re-precipitação (88% isopropanol; 0,2M acetato de potássio) e centrifuga-se a amostra por 10 minutos a 6000rpm. Após essa etapa, deve-se lavar a amostra com solução de etanol 70% gelada, deixa-se o sedimento secar ao ar livre e ressuspende-se este em 300μΙ de tampão Tris -EDTA. Com este DNA genômico realiza-se o sequenciamento, utilizando-se os mesmos iniciadores utilizados para a PCR de identificação dos genes do sistema de secreção tipo VI, na linhagem septicêmica 362. O sequenciamento inicial dos genes é realizado para a exata construção dos iniciadores utilizados para a técnica de deleção "Lambda Red", abaixo descrita.

Reações de PCR e iniciadores para detecção e sequenciamento dos genes do SST6

Genes do sistema de secreção tipo VI na amostra SEPT362, foram identificados através de experimentos de PCR (Polymerase Chain Reaction - Reação em cadeia da Polimerase), com a enzima Taq polymerase, conforme descrito na tabela 2. Os ciclos utilizados nas reações de detecção e os iniciadores utilizados nas reações de detecção e sequenciamento dos nucleotídeos estão descritos na tabela 3 e Figura 1.

Tabela 2. Componentes utilizados nas reações de PCR para identificação dos genes de SST6 7 59

Tabela 3. Ciclos das reações de PCR para identificação dos genes de SST6.

Construção dos mutantes Ahcp, AicmF e AdpV

Os genes hcp, icmF e elpV devem ser excluídos do cromossomo da linhagem de E. coli, através da técnica de "lambda red", conforme descrito por Datsenko e Wanner (2000).

Primeiramente, deve-se eletroporar-se o plasmídio pKD46, que expressa a enzima recombinase e que, na presente invenção, foi modificado pela inserção de um cassete de cloranfenicol - abaixo descrito - devido a impossibilidade de seleção bactéria selvagem possuir resistência à ampicilina (resistência original do plasmídio pKD46) na linhagem selvagem SEPT362.

Em seguida, utiliza-se o plasmídio pDK46 como molde para amplificação do cassete do gene da canamicina por PCR (tabelas 4 e 5). Os iniciadores (Figura 2) para a amplificação do cassete de canamicina devem conter em suas extremidades, sequências de 50 nucleotídeo homólogas aos genes que se deseja excluir. As reações de amplificação do cassete devem ser submetidas à eletroforese, recortadas do gel de agarose e purificadas, para, então, serem eletroporadas dentro da bactéria selvagem, já previamente eletroporada com o plasmídio pKD46.

Os microarranjos utilizados para cada um dos genes deletados foram registrados no Gene Expression Omnibus (GEO) do National Center of Biotechnology Information (NCBI). Adicionalmente, os iniciadores das sequencias gênicas que foram deletadas, que são observadas na Figura 2, são representadas pelos seguintes códigos: gene elpV, código NC_013008.1 , gene hcp, código NC_013008.1 e gene IcmF, com código NC_002695.1.

Após esse passo, as células devem ser plaqueadas em LB-ágar com canamicina (para seleção dos mutantes que sofreram recombinação homóloga e receberam o cassete de canamicina no lugar do gene alvo) e crescidas a 42°C, para perderem o plasmídio pKD46 (que possui uma origem de replicação termo-sensível). Para a confirmação da recombinação homóloga e perda do plasmídio pKD46, devem-se selecionar colónias resistentes à canamicina e sensíveis ao cloranfenicol.

Adicionalmente, deve-se eletroporar o plasmídio "helper" pCP20 em todas as linhagens mutantes, pois ele contém uma recombinase (flp) responsável pela eliminação dos nucleotídeos localizados entre as regiões FRT, encontradas flanqueando o cassete de resistência à canamicina, presente no interior do gene agora recombinado.

Esta eliminação do cassete de canamicina favorece uma mutação apolar, garantindo que a expressão dos genes adjacentes a esta mutação não é prejudicada. Nas etapas de recombinação (entrada) e retirada do cassete de canamicina do interior do gene excluído, são feitas PCRs e sequenciamentos dos genes, para a confirmação das corretas mutações apoiares.

Para a construção dos fragmentos de DNA que foram utilizados na recombinação homóloga para geração das linhagens mutantes Ahcp, AicmF e AcIpV, devem ser realizadas reações de PCR utilizando-se a enzima Pfx DNA polymerase, conforme descrito na tabela 4. Os ciclos dessas reações e os iniciadores utilizados estão descritos na tabela 5 e figura 2, respectivamente.

Tabela 4. Componentes utilizados nas reações de PCR para amplificação dos fragmentos de DNA para recombinação homóloga.

Fase Temperatura Tempo

Desnaturação

94°C 2 minutos

Inicial

Desnaturação 94°C 15 segundos

Genes

Pareamento 30 segundos

clpV e icmF: 60°C F hcp: 58°C

Extensão 68°C 2 minutos

Tabela 5. Ciclos utilizados na amplificação dos fragmentos de DNA para recombinação homóloga.

Construção do plasmídio pKD46 com a inserção do cassete de cloranfenicol

O plasmídio pKD46, que carrega o gene da recombinase e que será introduzido na bactéria na qual será realizada a recombinação homóloga, deve ser modificado, pois uma vez que ampicilina (resistência original do plasmídio pKD46) é uma das resistências encontradas em SEPT362, a seleção de bactérias receptoras do plasmídio pKD46 seria impossibilitada, caso não houvesse inserção de um cassete de resistência a outro antibiótico. Para isso, o cassete de resistência ao antibiótico cloranfenicol amplificado, utilizando-se o plasmídio pACYC184 como molde. Os componentes utilizados nessa reação de PCR estão descritos na tabela 2. Os ciclos e os iniciadores utilizados estão descritos nas tabelas 6 e Figura 3.

Tabela 6. Ciclos da reação de PCR para amplificação do cassete de cloranfenicol. O plasmídio pKD46 deve ser, então, digerido com a enzima de restrição Xmnl, para a qual o possui um único sítio de restrição, localizado logo após o promotor do gene bla (ampicilina), gene este previamente retirado do plasmídio. O gene de resistência ao cloranfenicol deve ser purificado do gel através de técnicas enzimáticas e purificação de DNA por membrana de sílica, ligado ao plasmídio pKD46 e transformado na linhagem competente de E.coli indicada na presente invenção, conforme descrito abaixo. As linhagens SEPT362, receptoras do plasmídio, devem ser crescidas em placas de LB adicionadas de 100pg/ml do antibiótico cloranfenicol.

Preparação de células competentes, transformação e eletroporação

A preparação de células competentes, transformação e eletroporação devem ser realizadas segundo Sambrook et ai. (Sambrook, J; Fritsch, E.F.; Maniatis, T. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. 2 ^nd Edition. Cold Spring harbor Laboratory Press, NY, p.1584, 2001),

Reações de ligação

Todas as reações de ligação da presente invenção devem ser realizadas utilizando-se a enzima T4 DNA ligase e incubadas a 16°C por 14 horas.

Construção das linhagens complementadas dos mutantes

Para a construção das linhagens complementadas dos mutantes, utiliza-se o plasmídio pACYC184, de baixo número de cópias, como vetor de expressão. Amplificam-se os genes a serem complementados com as sequências dos nucleotídeos correspondentes ao início e ao fim dos genes, flanqueados por sítios de restrição das mesmas enzimas que foram utilizadas para cortar o vetor plasmidial (BamHI e Sall - reação abaixo descrita). Os componentes das reações de PCR estão descritos na tabela 4, os ciclos descritos na tabela 5 e iniciadores indicados na Figura 4.

Os genes devem ser amplificados e submetidos à eletroforese e, em seguida, suas bandas são recortadas e purificadas do gel de agarose, utilizando-se técnicas enzimáticas e purificação de DNA por membrana de sílica. Após esta purificação, os fragmentos devem ser, novamente, digeridos com as enzimas de restrição BamHI e Sall e, em seguida, purificados do gel de agarose.

O plasmídio pACYC184 deve ser digerido com as mesmas enzimas de restrição e, também, submetido à eletroforese e purificação do gel de agarose, utilizando-se a mesma técnica descrita no parágrafo anterior. A reação de ligação deve ser incubada a 16°C por 14 horas, utilizando-se a enzima T4 DNA ligase. Esta reação de ligação é então submetida à eletroforese e os plasmídios corretamente ligados, recortados e purificados do gel de agarose, utilizando-se técnicas enzimáticas e purificação de DNA por membrana de sílica. Para a confirmação de que os genes são inseridos em quadro de leitura correto, para que o promotor do cassete de tetraciclina possa garantir a expressão do gene complementado, devem ser feitos seqtienciamentos dos plasmídios complementados. Realiza-se então a eletroporação dos plasmídios complementados nas respectivas bactérias mutantes e selecionam-se as bactérias complementadas em placa de LB-agar (LB adicionado de 1 % de ágar) suplementadas com 50 g/ml do antibiótico cloranfenicol.

Em seguida, realizam-se reações de PCR em tempo real para a verificação da expressão do gene complementado.

Reações de cortes com as enzimas BamHI e Sall

Para a reação de complementação dos genes excluídos nas linhagens mutantes, devem ser realizados cortes duplos no plasmídio pACYC184, utilizando-se simultaneamente as enzimas BamHI e Sall, pois ambas possuem uma eficiência de 100% com o mesmo tampão NEB3, próprio da enzima de restrição, nas seguintes condições: 1x tampão de digestão; 100 g/ml de BSA (Albumina de Soro Bovino); 10 unidades de enzima de restrição; 1 μg de DNA; Água miliQ autoclavada para 50μΙ de reação, em uma hora de incubação a 37°C.

Produção de vacina para septicemia

Com a deleção dos genes hcp, clpV e icmF da amostra selvagem SEPT362 foram geradas três linhagens mutantes atenuadas em sua patogenicidade para septicemia em aves. Isso ocorre porque esses genes hcp, clpV e icmF do SST6 influenciam na expressão da fímbria tipo 1 , envolvida nos processos de adesão e invasão, formação de biofilme, rearranjo do citoesqueleto de células hospedeiras e são importantes para patogenicidade in vivo. Em geral, os níveis da expressão dos genes hcp, clpV e icmF do SST6 aumentam significativamente na presença de células hospedeiras (Anexo 1B) e ainda mais durante uma infecção in vivo (Anexo 1C). As linhagens mutantes Ahcp, AclpV e AicmF, porém, tiveram sua adesão a células hospedeira muito diminuída em relação à linhagem selvagem (Anexo 6 e Figura 8).

Este fato ocorreu devido aos genes constituintes do operon da fímbria tipo 1 terem suas expressões drasticamente diminuídas. Esta fímbria, produzida por muitas linhagens de E.coli, é um apêndice que promove a aderência bacteriana a células eucarióticas, sendo o operon responsável pela montagem desta fímbria, composto por 9 genes (Bahrani-Mougeot, F. K.; Buckles, E. L; Lockatell, C. V.; Hebel, J. R.; Johnson, D. E.; Tang, C. M.; Donnenberg, M. S. TYPE 1 FIMBRIAE AND EXTRACELLULAR POLYSACCHARIDES ARE PREEMINENT UROPATHOGENIC Escherichia co/ Virulence Determinants In The Murine Urinary Tract. Mol. Microbiol. v.45, p.1079 -1093, 2002; Boudeau, J.; Barnich, N.; Darfeuille-Michaud, A. TYPE 1 PILIMEDIATED ADHERENCE OF Escherichia coli STRAIN LF82 ISOLATED FROM CROHN'S DISEASE IS INVOLVED IN BACTERIAL INVASION OF INTESTINAL EPITHELIAL cells. Mol. Microbiol. v.39, p.1272- 1284, 2001; Gunther, I. N.; Snyder, J. A.; Lockatell, V.; Blomfield, I.; Johnson, D. E.; Mobley, H. L. ASSESSMENT OF VIRULENCE OF UROPATHOGENIC ESCHERICHIA COLI TYPE 1 FIMBRIAL MUTANTS IN WHICH THE INVERTIBLE ELEMENT IS PHASE-LOCKED ON OR OFF. Infect. Immun. v.70, p.3344-3354, 2002.; Khan, N. A.; Kim, Y.; Shin, S.; Kim, K. S. FIMH- EDIATED ESCHERICHIA COLI K1 INVASION OF HUMAN BRAIN ICROVASCULAR ENDOTHELIAL CELLS. Cell.Microbiol. v.9, p.169-178, 2007), portanto, a baixa expressão da fímbria tipo 1 é a principal responsável pela diminuição da capacidade de adesão dos mutantes a células hospedeiras. Esta fímbria é importante na virulência, estando envolvida nos processos de adesão e invasão de células eucarióticas, colonização da traquéia e trato intestinal (Edelman, S.; Leskela, S.; Ron, E.; Apajalahti, J.; Korhonen, T.K. IN VITRO ADHESION OF AVIAN PATHOGENIC ESCHERICHIA COLI 0:78 STRAIN TO SURFACES OF THE CHICKEN INTESTINAL TRACT AND TO ILEAL MUCUS. Vet. Microbiol. v.91, p.41-56, 2003; Bahrani-Mogeout et al., 2002).

As linhagens mutantes, porém, ainda expressam normalmente outras fímbrias, como a curli, o que explica que ainda permaneça um baixo nível da capacidade de adesão nas linhagens bacterianas mutantes. Adicionalmente, verifica-se que a não alteração na expressão de outras fímbrias, indica que a associação do SST6 com a fímbria tipo 1 é específica.

A fímbria tipo 1 exerce um importante papel na formação do biofilme, e o SST6 também está envolvido com esta característica (Bernard, C.S.; Brunet, Y.R.; Gueguen, E.; Cascales, E. NOOKS AND CRANNIES IN

TYPE VI SECRETION REGULATION. J. Bacteriol. v.192, p. 3850-3860,

2010; Aschtgen, M. S.; Bernard, C. S.; De Bentzmann, S.; Lloubes, R.;

Cascales, E. SCIN IS AN OUTER MEMBRANE LIPOPROTEIN REQUIRED FOR TYPE VI SECRETION IN ENTEROAGGREGATIVE Escherichia colí. J. Bacteriol. v.190, p.7523-7531, 2008; Enos-Berlage, J. L.; Guvener, Z. T.; Keenan, C. E.; McCarter, L. L. GENETIC DETERMINANTS OF BIOFILM DEVELOPMENT OF OPAQUE AND TRANSLUCENT Vibrio parahaemolyticus. Mol. Microbiol. v.55, p.1160-1182, 2005; Waite, R. D.; Paccanaro, A.; Papakonstantinopoulou, A.; Hurst, J. M.; Saqi, M.; Littler, E.; Curtis, M. A. CLUSTERING OF PSEUDOMONAS AERUGINOSA TRANSCRIPTOMES FROM PLANKTONIC CULTURES, DEVELOPING AND MATURE BIOFILMS REVEALS DISTINCT EXPRESSION PROFILES. BMC Genomics v.7, p.162, 2006). Portanto, é possível relacionar-se o decaimento na formação de biofilme nestes mutantes (Figura 7) com a baixa expressão da fímbria tipo 1.

Linhagens de Escherichia coli normalmente sintetizam flagelo, o que facilita a propulsão e quimiotaxia bacterianas (Apel, D.; Surette, M. G. BRINGING ORDER TO A COMPLEX MOLECULAR MACHINE: THE ASSEMBLY OF THE BACTERIAL FLAGELLA. Biochimica et biophysica acta. v. 1778, p.1851 -1858, 2008.) estando sua presença, provavelmente, envolvida com a promoção de uma adesão estável e colonização de mucosas (Ottemann, K. M.; Miller, J. F. ROLES FOR MOTILITY IN B ACTE RI AL-HOST INTERACTIONS. Mol. microbiol. v.24, p.1109-1117, 1997).

O mutante AicmF teve sua motilidade abolida e constatou-se que a expressão dos genes envolvidos na cascata de montagem flagelar foi drasticamente diminuída nessa linhagem, quando comparada à linhagem selvagem. Dessa forma, visualizamos que o gene icmF possui relação com a motilidade, pois a deleção do mesmo prejudica a expressão de genes flagelares.

Adicionalmente, as linhagens mutantes foram analisadas quanto à expressão dos reguladores globais CRP (cyclic AMP receptor protein) e OmpR (outer membrane protein R), que também regulam a expressão de genes responsáveis pela montagem flagelar. Observou-se que a expressão de ompR não foi alterada, porém a expressão de CRP é levemente menor. Estas análises sugerem que o gene icmF poderia, de alguma forma, interagir com CRP, e a deleção deste gene alteraria a expressão do regulador, o que interferiria na expressão de genes responsáveis pela montagem do flagelo.

Considerando que o gene icmF já foi previamente relacionado com motilidade (Das, S.; Chakrabortty, A.; Banerjee, R.; Roychoudhury, S.; Chaudhuri K. COMPARISON OF GLOBAL TRANSCRIPTION RESPONSES ALLOWS IDENTIFICATION OF Vibrio cholerae GENES DIFFERENTIALLY EXPRESSED FOLLOWING INFECTION. FEMS Microbiol. Lett. v.190, p.87- 91, 2000), podemos considerar também, que a própria IcmF poderia atuar como mais um regulador da cascata flagelar e a exclusão desta proteína levaria a alteração da expressão dos genes para a montagem do flagelo.

Adicionalmente, o mutante icmF foi o que apresentou maior redução na formação de biofilme, decaindo quase 80% em relação à linhagem selvagem (Figura 7) e, ao mesmo tempo, este mutante apresentou a motilidade abolida (Anexo 3B). Todos os mutantes apresentaram redução em sua capacidade de invasão a células epiteliais, em diferentes graus (Figura 5), quando comparadas à linhagem selvagem, fato que também pode ser relacionado à diminuição da expressão da fímbria tipo 1 , previamente caracterizada por contribuir para este processo em E.coli (Boudeau ef a/., 2001 ; Mulvey, M.A. ADHESION AND ENTRY OF UROPATHOGENIC Escherichia co/i. Celi Microbiol. V. 4, p.257-271, 1998; Mobley, H. L.; Chippendale, G. R.; Tenney, J. H.; Hull, R. A.; Warren, J. W. EXPRESSION OF TYPE 1 FIMBRIAE MAY BE REQUIRED FOR PERSISTENCE OF Escherichia co/i IN THE CATHETERIZED URINARY TRACT. J. Clin. Microbiol. v.25, p.2253- 2257, 1987).

Adicionalmente, sabe-se que linhagem selvagem SEPT362 é capaz de se replicar dentro de macrófagos, porém, somente a linhagem AicmF aprsesentou diminuição nesta característica (Figura 6), sendo, portante, icmF é importante para a replicação bacteriana dentro de macrófagos e outras células eucarióticas.

Quanto ao rearranjo do citoesqueleto de actina, este foi notável nos mutantes AcIpV e ò cp, enquanto nenhuma mudança significativa ocorreu no mutante AicmF (Anexo 5). AclpV e Ahcp interagem diretamente com VgrG, que, além de ser uma proteína estrutural do SST6, possui propriedades efetoras, capazes de rearranjar o citoesqueleto de actina da célula hospedeira (Bingle et ai., 2008; Filloux et ai., 2008; Pukatzki et a , 2009). Por sua vez, o gene ic F não apresentaria esta interação . direta com a proteína VgrG, fazendo com que a exclusão deste gene não altere a função efetora de VgrG, de rearranjo de actina do hospedeiro.

Dessa forma, com a geração das linhagens mutantes Ahcp, AcIpV e AicmF, com patogenicidade atenuada para septicemia em aves, possibilita a utilização das mesmas na confecção de vacinas para prevenção da doença e combate a sua propagação.

EXEMPLOS

1. Teste de invasão celular

Células HeLa foram cultivadas meio DMEM suplementado com 10% de Soro Fetal Bovino. A cada dois dias as células eram lavadas três vezes com PBS 1x (Tampão Fosfato Salina - NaCI 137 mM, Fosfato 10 mM, KCI 2,7 mM, e pH de 7,4) a 37°C e o meio DMEM substituído por um novo. Assim que a garrafa 75 cm ³ atingiu uma confluência de 90%, foram adicionados 2 ml de tripsina e deixados por 5 minutos à temperatura ambiente, para que as células HeLa se desprendessem da superfície à qual estavam aderidas. As células foram, a seguir, homogeneizadas, divididas em 3 reservatórios iguais ao original (no caso de replicação celular), ou passadas para placas de cultura celular (para testes in vitro), sendo nesse caso, distribuído 1 ml para cada poço.

Por sua vez, culturas bacterianas das linhagens selvagem e mutantes foram crescidas por 18 horas, aerobicamente em meio LB, a 37°C, sem agitação. Foram, a seguir, diluídas 1 :100 em meio DMEM e crescidas a 150rpm até atingirem uma densidade óptica (D.0. ₆ oo) de 0,8. O RNA de triplicatas biológicas foi extraído utilizando-se fenol, clorofórmio e isopropanol.

Para comparações entre a expressão de genes do SST6 na presença e ausência de células eucarióticas, garrafas de 75 cm ³ , previamente cultivadas in vitro com células HeLa em meio DMEM foram infectadas com 1x10 ⁷ com as linhagens SEPT 362 e mutantes com uma MOI (multiplicity of infection) de 100:1. Garrafas sem células HeLa foram utilizadas como controle negativo.

Após 90 minutos de interação bactéria - célula HeLa, em uma estufa a 37°C e 5% C0 ₂ , as células foram tratadas com 50 pg/ml de gentamicina por 90 minutos para matar qualquer bactéria extracelular. A seguir, as células foram lavadas com PBS 1x a 37°C e incubadas por 3 horas com meio DMEM fresco. Após um período de 3 e 6 horas de infecção, as bactérias foram recuperadas (como descrito para o teste de adesão bacteriana) e o RNA extraído.

As células foram, a seguir, lisadas com uma solução de Triton X- 100 a 1 %, (diluído em PBS 1x), por 5 minutos. Foram feitas diluições seriadas das bactérias, que foram plaqueadas em LB-ágar para determinação de unidade formadora de colónia (UFC).

Para se verificar a expressão gênica global das linhagens modificadas na presente invenção, foram realizados experimentos de microarranjo. Para este experimento, inicialmente é extraído o RNA das amostras e logo após, a partir deste RNA, era realizada a síntese do cDNA (em razão da maior estabilidade da molécula de DNA, quando comparada com a de RNA).

O RNA total foi extraído de culturas das linhagens SEPT362, Ahcp, AclpV e AicmF e crescidas aerobicamente em meio LB, a 37°C, por 18 horas e diluídas 1 :100 em DMEM. As novas culturas foram crescidas sob agitação (150rpm), a 37°C, até atingirem a densidade óptica de 0,8 a 600nm. O RNA de cada linhagem foi extraído utilizando-se fenol, clorofórmio e isopropanol.

Por sua vez, o procedimento de síntese de cDNA, para a realização de experimentos de microarranjo, foi iniciado com 10 g de RNA total de cada linhagem, que foram extraídos conforme descrito anteriormente. A primeira reação foi montada para uma hibridização RNA - iniciador, conforme indicado na tabela 7 (segundo o protocolo Affymetrix).

Tabela 7. Reação para hibridização RNA - iniciador, para construção fragmento de cDNA. A reação de hibridização RNA - iniciador foi feita com as seguintes temperaturas:

- 70 °C por 10 minutos

- 25 °C por 10 minutos

Após esse passo de hibridização RNA - iniciador, foi realizada a reação de síntese de cDNA, conforme descrita na tabela 8.

Tabela 8. Componentes da reação de síntese do cDNA.

A reação foi incubada nas seguintes temperaturas:

- 25°C por 10 minutos

- 37°C por 60 minutos

- 42°C por 60 minutos

- Inativação do SuperScript II a 70°C por 10 minutos Após a síntese de cDNA, houve a remoção de RNA, com a adição de 20μΙ de NaOH 1 N, com incubação a 65°C por 30 minutos e adição de 20μΙ de HC1 1 N para neutralizar a reação.

Após a eliminação de qualquer traço de RNA, foi feita a purificação do cDNA com a utilização de membranas de sílica. Os cDNAs foram quantificados através de um espectrofotômetro e a concentração de cada amostra foi determinada como sendo maior que 1 ,5pg.

Para que pudessem ser devidamente hibridizados (hibridação por complementariedade de bases) com as sondas constituintes do aparelho de microarranjo, todo cDNA deveria ser previamente fragmentado. Os componentes da reação de fragmentação das moléculas de cDNA estão descritos na tabela 9.

A reação foi incubada a 37°C por 10 minutos e a DNase I inativada a 98°C por 10 minutos. Para a análise da digestão do cDNA, que deveria conter fragmentos entre 50 e 200 pares de base, as amostras foram aplicadas em um gel gradiente (4% a 20%) de agarose. A corrida foi feita a 150V por aproximadamente 2 horas. Após a corrida, o gel foi corado com corante sensível à fluorescência e os tamanhos dos fragmentos digeridos analisados.

O cDNA fragmentado foi aplicado diretamente à reação final de marcação do cDNA, conforme descrito na tabela 10. Esta marcação ocorre para garantir a devida detecção da hibridização no aparelho de microarranjo.

Tabela 10. Reação de marcação do cDNA, para detecção da hibridização no microarranjo.

A reação foi incubada a 37°C por 15 minutos e após esse tempo, foram adicionados 2μΙ de EDTA 0,5M para parar a reação.

Para a verificação da eficiência da marcação, foi realizado o seguinte procedimento:

Para cada reação a ser testada, foram separadas duas alíquotas de 200ng cada, do cDNA fragmentado e marcado com biotina. A uma das alíquotas foram adicionados 5μΙ de neutravidina (2mg/ml) e a reação incubada à temperatura ambiente por 5 minutos. As duas reações foram aplicadas a um gel gradiente de agarose (4% a 20%), que depois da eletroforese, foi corado com corante sensível à fluorescência e analisado. Foi observado que a neutravidina se ligou à biotina, o que determinou que a reação estava pronta para a hibridização no microarranjo.

Experimentos de PCR em tempo real foram utilizados para verificação do funcionamento dos microarranjo e o Affymetrix GeneChip E. coli Genome 2.0 array foi utilizado para comparar a expressão gênica da linhagem SEPT362 (selvagem) com as linhagens mutantes Ahcp, AclpV e AicmF. O GeneChip E. coli Genome 2.0 array inclui aproximadamente 10000 sondas para todos os 20366 genes presentes em quatro linhagens de E. coli : K-12 (MG1655), CFT073 (linhagem uropatogênica), EDL933 (linhagem enterohemorragica), e 0157:H7-Sakai (linhagem enterohemorragica) (http://www.affvmetrix.com/products/arravs/specific/ecoli2.a ffx).

Todo o processamento, marcação e hibridização do RNA previamente purificado foram realizados como descrito pelo manual Affymetrix Gene Expression Technical Manual

(http://www.affvmetrix.com/suPDort technical/manual/expression manual.affx). conforme descrito acima. Os resultados foram analisados pelo programa de análise Genechip da Affimetrix, sendo os dados obtidos comparados para a análise da expressão gênica, diminuída ou aumentada dos diversos genes.

Através da análise dos resultados de PCR tempo real (Anexo 1A), confirmamos que a linhagem SEPT362 expressa genes do SST6 em níveis significativamente maiores do que a linhagem EHEC 86-24. A transcrição dos genes hcp, clpV e icmF foram, respectivamente, 5,0 vezes, 3,5 vezes e 2,0 vezes maiores na linhagem SEPT362 do que na linhagem EHEC 86-24.

Pelo fato de que o SST6 vem sendo descrito como mais expresso na presença do hospedeiro (Filloux eí a/., 2008), foram realizados experimentos que demonstraram que, na linhagem SEPT362, esse sistema é expresso tanto in vitro, na presença de células HeLa, quanto durante uma infecção in vivo (Anexo 1C). A Anexo 1B demonstra que a expressão dos genes hcp, clpV e icmF é aumentada em 3 horas e ainda mais em 6 horas após a infecção de células HeLa. Juntos, esses dados demonstram que a linhagem SEPT362 expressa o Sistema de Secreção Tipo VI e que esse sistema é mais expresso na presença de células eucarióticas e ainda mais durante um processo de infecção in vivo.

2. Verificação de patogenicidade in vivo

Para a verificação da alteração da patogenicidade das linhagens mutantes, foram realizados testes de patogenicidade in vivo, em aves de corte linhagem Cobb.

As linhagens selvagem e mutantes foram crescidas durante a noite em meio LB, a 37°C e, a seguir, lavadas duas vezes e ressuspendidas em 0,85% (5,0ml) de solução salina esterilizada. Um total de 10 ⁹ UFC/ml de cada linhagem (selvagem, mutantes e os complementos) foi injetada dentro do saco aéreo direito de grupos de dezesseis aves SPF machos, de 1 dia de idade. Os grupos foram observados durante um período de sete dias e a sobrevivência analisada a cada 12 horas (de Pace, F.; Nakazato, G.; Pacheco, A.; Boldrin de Paiva, J.; Sperandio, V.; Dias da Silveira, W. THE TYPE VI SECRETION SYSTEM PLAYS A ROLE IN TYPE 1 FIMBRIAE EXPRESSION AND PATHOGENESIS OF AN AVIAN PATHOGENIC Escheríchia coli STRAIN. Infect immun. v.78, p.4990 - 4998. 2010).

Como resultados, observou-se que em razão de várias características relacionadas à patogenicidade terem sido atenuadas nos mutantes analisados, foi investigado se esse sistema de secreção também contribuiria para a patogenicidade in vivo (Anexo 2).

Os resultados demonstraram que dentro de 24 horas 43,75% dos pintos infectados com SEPT362 sobreviveram, e 2 dias pós-infecção, somente 12,5% desses animais permaneceram vivos, até o sétimo dia de experimento, quando foram sacrificados. Dos pintos infectados com a linhagem mutante Âhcp, foi observado que 87,5% sobreviveram até o segundo dia, 62,5% sobreviveram até o dia 3, 56,25% até o dia 4, 43,75% até o dia 5, e 25% se mantiveram vivos até o último dia do experimento, quando foram sacrificados. Para animais infectados com o mutante LclpV, foi observado que 93,75% sobreviveram no primeiro dia, 68,75% sobreviveram até o terceiro dia, 62,5% sobreviveram até dia 4, 50% até o dia 6 e 43,75% sobreviveram até o último dia do experimento.

A análise estatística desses dados indicam que os mutantes hcp e àcipV apresentaram uma significativa atenuação na patogenicidade in vivo e que o mutante AcipV apresenta uma atenuação ainda maior do que o mutante Ahcp, supostamente por participar da energização de outros mecanismos metabólicos, além do SST6. Quanto ao mutante AicmF, observou-se que 75% dos pintos sobreviveram ao primeiro dia de experimento. Nos segundo e terceiro dias de experimento, 37,5% dos pintos sobreviveram, e no quarto dia sobreviveram 31 ,5%. Do quinto dia até o último dia de experimento, 18,75% permaneceram vivos. Apesar de ter havido uma pequena redução na patogenicidade do mutante AicmF, esta não foi estatisticamente significativa. Nenhuma mortalidade foi observada para o grupo controle (não infectados).

A complementação dos mutantes in trans recuperou parcialmente o fenótipo da linhagem selvagem, sendo mais patogênicos do que os mutantes, mas não tão virulentos como a SEPT362. Isso pode acontecer devido ao fato de que esses genes complementados foram clonados dentro de plasmídios e a diferente cinética de infecção dos complementos pode ser devido à diferença das dosagens gênicas, assim como a manutenção dos plasmídios durante a infecção.

3. Adesão bacteriana a células epiteliais

Em razão da linhagem APEC SEPT362 ser capaz de invadir células epiteliais e de já ter sido demonstrado que o SST6 afeta a polimerização da actina de células hospedeiras (Pukatzki ef a/., 2007; Leiman et ai., 2009; Ma, A. T.; McAuley, S.; Pukatzki, S.; Mekalanos, J. J. TRANSLOCATION OF A Vibrío cholerae TYPE VI SECRETION EFFECTOR REQUIRES BACTERIAL ENDOCYTOSIS BY HOST CELL. Celi. v.5, p.234- 243, 2009), foi avaliada qualitativa e quantitativamente a habilidade de linhagens de E.coli em invadir e aderir a células HeLa, segundo protocolo previamente descrito (Torres, A. G.; Giron, J.A.; Perna, N.T.; Burland, V.; Blattner, F.R.; Avelino-Flores F.; Kaper, J.B. IDENTIFICATION AND CHARACTERIZATION OF LPFABCCDE, A FIM BRIAL OPERON OF ENTEROHEMORRHAGIC Escherichia coíi 0157.H7. Infect. Immun. v.70, p.5416-5427, 2002), com algumas modificações.

Resumidamente, as linhagens bacterianas foram crescidas em meio LB por 18 horas, a 37°C e 1x10 ⁷ bactérias foram adicionadas, em quadruplicata, aos poços das placas de cultura celular de 12 poços, previamente cultidas in vitro com células HeLa, em meio DMEM, suplementado com 10% de Soro Fetal Bovino. Após a adição das bactérias, o experimento foi realizado por 3 horas, a 37°C, em uma estufa com 5% de CO ₂ . Uma das réplicas da cultura celular foi lavada três vezes com tampão PBS 1x, fixada com metanol 100% e corada com corante Giemsa (0,75%), para avaliação microscópica. As outras três réplicas foram lavadas e lisadas com Triton X-100 (0,1%) diluído em tampão PBS 1x e plaqueadas em meio LB-ágar para a quantificação do número de células bacterianas aderidas. Os dados da aderência foram expressos como a média das unidades formadoras de colónias (UFC) da triplicata. Diferenças estatísticas foram expressas em valor de P, conforme determinado por Teste T.

Os resultados demonstraram que esse sistema de secreção possui um papel na invasão celular de SEPT362. No mutante Ahcp observa-se uma diminuição significativa, de uma ordem de magnitude, na invasão a células HeLa, comparada com a linhagem selvagem, característica esta que pôde ser complementada com esse gene em trans. Curiosamente, conforme demonstrado na Figura 5, a linhagem AcIpV invade mais que a linhagem Ahcp, porém, ainda, em uma proporção menor que a linhagem selvagem. Estes resultados demonstraram que este sistema de secreção, presente em SEPT362, exerce um papel na invasão a células HeLa. Já a linhagem AicmF apresenta uma drástica redução na invasão a células HeLa, perfil diferente do observado para os outros mutantes, o que sugere que o gene icmF pode estar relacionado à invasão celular, independentemente do SST6.

4. Teste de motilidade

Para o teste de motilidade foram preparadas placas de meio LB semi-sólido em uma concentração de 0,3% de ágar, sendo as linhagens semeadas, por picada, com uma agulha esterilizada. Estas placas foram mantidas a 37°C para serem analisadas nos períodos de 8h, 12h e 16 horas após o cultivo inicial. Para a avaliação da capacidade de motilidade, os diâmetros dos halos de crescimento formados foram medidos em milímetros e cada linhagem foi comparada com a selvagem. Para analisar o motivo do fenótipo não móvel da linhagem AicmF, foram verificadas as expressões de alguns genes flagelares, por PCR em tempo real (Sperandio, V.; Torres, A. G.; Kaper, J.B. QUORUM SENSING Escherichia coli REGULATORS B AND C (QseBC): A NOVEL TWO-COMPONENT REGULATORY SYSTEM INVOLVED IN THE REGULATION OF FLAGELLA AND MOTILITY BY QUORUM SENSING IN E. coli. Mol microbiol. v.43, p.809-821, 2002). O teste de motilidade mostrou que a linhagem AicmF perdeu completamente sua capacidade de se mover (Anexo 3 B e C), enquanto que nos outros mutantes, essa característica não foi significativamente alterada (Anexo 3A). Para verificar o porquê do mutante AicmF ter perdido esta característica, foram analisadas as expressões de alguns genes que compõem a cascata de montagem flagelar, por PCR em tempo real (Anexo 3 D). Os resultados demonstraram que os genes flagelares flhC, flhD, flgM, fíiA e motA tiveram suas expressões diminuídas pelo menos 10 vezes no mutante AicmF, quando comparadas com a expressão da linhagem selvagem SEPT362. Dados do microarranjo (Anexo 3 E) também demonstram a diminuição da expressão destes genes na linhagem mutante. Analisando-se as expressões de alguns reguladores globais e da cascata flagelar, constatou-se que a expressão de ompR (outer membrane protein R) não sofreu mudanças estatisticamente significativas, enquanto que a expressão de CRP (cyclic AMP receptor protein) foi de quase 0,5 vez menor na linhagem AicmF, quando comparada à selvagem

SEPT362. Estes dados indicam que a deleção do gene icmF pode ter influenciado na expressão da CRP, que também é um regulador da cascata flagelar ou ainda, que a própria IcmF pode ser um dos reguladores. A complementação restaurou o padrão de motilidade da linhagem selvagem. 5. Analise dos perfis das expressões das proteínas de membrana da linhagem selvagem SEPT362 e das amostras mutantes.

Extração de proteínas de membrana As linhagens bacterianas foram crescidas por 18 horas, a 37°C e diluídas 1 :100 em 100ml de meio LB e novamente cultivadas sob agitação (150rpm), a 37°C até atingirem a densidade óptica (D.oeoo) 0,8. A seguir, as células foram centrifugadas a 8000rpm por 15 minutos e lavadas por ressuspensão em tampão TE (Tris 20mMm pH 7,5, EDTA 1mM) por duas vezes, sendo a seguir, ressuspendidas em 1ml de TE adicionado de 1 mg/ml de lisozima. As amostras foram mantidas em gelo por 15 minutos e sonicadas, também em gelo, por 3 vezes, de 15 segundos cada. A seguir, as amostras foram centrifugadas a 12000rpm por 15 minutos, a 4°C e o sobrenadante transferido para um novo tubo, o qual foi centrifugado por 1 hora a 60000rpm. Ao sedimento, onde se encontrariam somente as proteínas de membrana, foi adicionado tampão TE, novamente centrifugado por 1 hora a 60000rpm e, a seguir, ressuspendido com 50μΙ de ULB (Urea lyses buffer - 7M uréia, 2M tiouréia, 2% CHAPS - 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1- propanesulfonate).

Descoloração e digestão dos peptídeos

Para análise e identificação das proteínas em MALDI-TOF, as bandas de interesse foram cortadas do gel de poliacrilamida (cortes de aproximadamente 1cm x 1mm). Cada fragmento foi cortado em pequenos pedaços de aproximadamente 1 mm e, para serem descorados, foram adicionados 50μΙ de solução 1 (2:1 acetonitrila, 25mM NH4HC03), por 15 minutos. O sobrenadante foi removido e adicionados 50μΙ de solução 2 (25mM NH4HC0 ₃ ), por 10 minutos. O sobrenadante foi removido e os dois primeiros passos repetidos. Após o procedimento de descoloração dos fragmentos, esses foram secos em centrífuga "speed vac" por 30 minutos. Para a digestão com tripsina, os fragmentos foram rehidratados em 12 μΙ de solução 3 (12,5ng/pl de tripsina - Promega® - em 50mM de NH4HCO3). As amostras foram mantidas a 37°C, por 16 horas e então levadas para análise em MALDI- TOF.

Análise em MALDI-TOF

Um volume de 1 μΙ de cada amostra foi adicionado a 1 μΙ de matriz MALDI-TOF (a-cyano-4-hydroxicinnamic acid - CHCA) em uma placa de ouro para amostra de MALDI p100 e completamente secas (ambiente), para permitir a cristalização da matriz e dos peptídeos. O aparelho foi utilizado apresentava voltagem de aceleração de 20kV e intensidade do laser de 1900-2000. Os picos coletados foram analisados no programa Protein Prospector (UCFS), utilizando-se o banco de dados Swiss prot 2008.06.10.

No Anexo 4, constatamos que a amostra AicmF deixou de expressar uma proteína de 51KDa, que por meio da técnica de MALDI-TOF, foi identificada como sendo a flagelina, o que reforça os resultados relacionados à motilidade. Ainda no perfil protéico das proteínas de membrana, observa-se que uma proteína de 55KDa está ausente na amostra àclpV. Através de MALDI-TOF esta proteína foi identificada como Glicose-6-fosfato-1- desidrogenase, que atua nos metabolismos dos carboidratos. Esta enzima catalisa o primeiro passo no metabolismo da pentose, que gera ribose para síntese de nucleosídeos e NADPH para o metabolismo redutivo e para reações reparadoras (Csonka, L.N.; Fraenkel, D.G. PATHWAYS OF NADPH FORMANTION IN Escherichia coli. J Biol Chem. v. 252, p.3382-3391, 1997).

Sugere-se então, que clpV contribua para a energização celular deste processo. Não foi encontrado nada na literatura que relacione a deficiência de glicose-6-fosfato-1-desidrogenase com patogenicidade bacteriana. Para não mudar o foco do trabalho, optamos por não investigar os efeitos metabólicos desta proteína na linhagem mutante AcIpV. Trabalhos futuros poderão ser realizados para a abordagem deste tema.

6. Teste de viabilidade em macrófagos

Para testar a viabilidade das bactérias selvagem e mutantes dentro de macrófagos, foi utilizada a linhagem de macrófagos J774. Essa linhagem foi cultivada por 18 horas numa placa de cultura celular de 24 poços, numa estufa a 5% C02, a 37°C, em meio DMEM suplementado com glutamina (1 %). As linhagens bacterianas foram crescidas em caldo LB durante 18 horas, a 37°C e opsonizadas com soro de camundongo 20%, a 37°C, por 15 minutos e adicionadas numa concentração de 1 x 10 ⁷ , em quadruplicata, a macrófagos em meio DMEM fresco. Após 30 minutos de interação bactéria/célula eucariótica, bactérias não aderentes foram removidas com três lavagens com PBS 1x e expostas a 50pg/ml de gentamicina, por 90 minutos, para matar qualquer bactéria extracelular. Após esse período, a placa foi novamente lavada por três vezes e incubada por mais 3 horas, com meio DMEM fresco. As células foram lisadas com Triton X-100 1 % (diluído em PBS 1x) e diluições seriadas das bactérias foram plaqueadas em LB-ágar para quantificação de UFC (Vanrheenen et al., 2004; Zusman, T.; Feldman, M.; Halperin, E.; Segal G. CHARACTERIZATION OF THE icmH AND icmF GENES REQUIRED FOR Legionella pneumophila INTRACELLULAR GROWTH, GENES THAT ARE PRESENT IN MANY BACTÉRIA ASSOCIATED WITH EUKARYOTIC CELLS. Infect Immun. v.72, p.3398-3409, 2004; Sexton et a/., 2004).

Muitas bactérias que causam doenças septicêmicas são capazes de sobreviver à fagocitose e se multiplicarem dentro de macrófagos (Grassi, G. A.; Finlay, B. B. PATHOGENESIS OF ENTERIC Salmonella INFECTIONS. Curr. Opin. Gastroenterol. v.24, p.22-26, 2008).

Os resultados do teste de viabilidade dentro de macrófagos revelaram que a linhagem SEPT362 sobrevive e é viável dentro de macrófagos e que nas linhagens mutantes Ahcp e AcIpV essa característica não foi modificada, portanto, sugere-se os genes hcp e elpV não participam dos processos de viabilidade intracelular. Porém, observou-se que o mutante AicmF apresentou uma significativa redução na viabilidade dentro de macrófagos (Figura 6). Trabalhos anteriores também demonstraram essa relação (Vanrheenen ef a/., 2004; Zusman et ai., 2004; Sexton ef a/., 2004), o que concorda com os resultados aqui apresentados.

7. Teste para visualização do citoesqueleto de actina (Fluorescent Actin Staininq - FAS)

À medida que o rearranjo de actina na célula hospedeira é fundamental para a invasão bacteriana e que o SST6 contribui para a invasão a células epiteliais (Figura 4), foram realizados testes para a verificação do rearranjo do citoesqueleto de actina em células HeLa durante a infecção da linhagem selvagem e dos mutantes.

Para a visualização do rearranjo do citoesqueleto de actina das células hospedeiras, devido à infecção bacteriana, foi utilizado o teste FAS, conforme descrito por Knutton et al. (Knutton, S.; Baldwin, T.; Williams, P. H.; McNeish, A. S. ACTIN ACCUMULATION AT SITES OF BACTERIAL ADHESION TO TISSUE CULTURE CELLS: BASIS OF A NEW DIAGNOSTIC TEST FOR ENTEROPATHOGENIC AND ENTEROHEMORRHAGIC

Eschenchia coli. Infect Immun. v.57, p.1290-1298, 1989), com algumas modificações. Culturas celulares bacterianas selvagem e mutantes foram crescidas aerobicamente, por 18 horas, em LB a 37°C. Essas bactérias foram utilizadas para infectar monocamadas confluentes de células HeLa, cultivadas em lamínulas de vidro, a 37°C e CO 2 a 5%. As células HeLa foram infectadas com 10 ⁷ bactérias, por 3 horas, a 37°C e 5% de C0 ₂ . As lamínulas foram fixadas com solução de formaldeído 2% (diluída em PBS 1x pré aquecido a 37°C), lavadas com PBS 1x, permeabilizadas com 0,2% de Triton X-100 (diluído em PBS 1 X pré aquecido a 37°C) por 4 minutos e tratadas com FITC-faloidina (1pg/ml) por 20 minutos a 37°C, para visualização do acúmulo de actina. 500nM de iodeto de propídio foram adicionados para corar as bactérias e então as lamínulas foram lavadas com 2x SSC (200mM NaCI, 30mM citrato de sódio, pH 7,0). As amostras foram visualizadas por imunofluorescência, utilizando-se um microscópio Zeiss Axiovert. Foram examinadas três lamínulas para cada linhagem e as imagens salvas para o estudo do rearranjo do citoesqueleto de actina.

A linhagem SEPT362 induz a formação de estruturas parecidas com pregas no citoesqueleto de células HeLa, assim como o mutante AicmF. Estas estruturas possuem certa similaridade, mas não são as conhecidas lesões "attaching and effacing", provocadas pelo Sistema de Secreção Tipo III. Já nos mutantes AclpV e Ahcp, foi verificado que o nível de rearranjo do citoesqueleto é significativamente menor do que o causado pela SEPT 362 (Anexo 5). Sabe-se que proteína VgrG (proteína que provavelmente forma a estrutura pontiaguda da superfície do Sistema de Secreção Tipo VI) possui um domínio C-terminal que pode ligar-se à actina da célula hospedeira (Bingle eí a/., 2008; Filloux et a/., 2008; Pukatzki et a/., 2009). Sugere-se, que as linhagens mutantes AclpV e Ahcp não sejam capazes de formar esta estrutura no final do canal de secreção, fazendo com que a actina não sofra as alterações que ocorrem na presença do canal íntegro (linhagem selvagem SEPT362). Curiosamente, o mutante AicmF não apresenta o mesmo padrão de modificação de actina sofrido pelos mutantes AclpV e Ahcp, por isso, sugere-se que, ao contrário dos genes clpV e hcp, este não possua relação direta com o efetor VgrG, o qual proporciona alterações no citoesqueleto.

8. Teste para verificação de formação de Biofilme

Para verificar a capacidade de formação de biofilme nas linhagens selvagem e mutantes, foram realizados testes em triplicata, de acordo com Christensen et ai. (Christensen, G. D.; Simpson, W. A.; Younger, J. J.; Baddour, L. M; Barrett, F. F.; Melton, D. .; Beachey, E. H. ADHERENCE OF COAGULASE-NEGATIVE STAPHYLOCOCCI TO PLASTIC TISSUE CULTURE PLATES: A QUANTITATIVE MODEL FOR THE ADHERENCE OF STAPHYLOCOCCI TO MEDICAL DEVICES. Journal of clin microbiol. v.22, p.996-1006, 1985), com algumas modificações. Culturas bacterianas foram crescidas por 18 horas em LB, a 37°C e, a seguir, inoculadas em meio DMEM, diluídas 1 :100, em placa de cultura celular de 24 poços, em um volume final de 1000μΙ. As placas foram incubadas a 37°C em uma estufa de CO2 a 5%, por 24 horas. No final do período de incubação, o meio de cultura foi aspirado e o provável crescimento bacteriano aderido ao fundo da placa foi lavado por três vezes com PBS. A formação de biofilme foi fixada com 1000μΙ de etanol 75% em cada poço, por 10 minutos e lavado por três vezes com PBS 1x para remoção do etanol. A coloração foi realizada utilizando-se uma solução 0,5% de cristal violeta, por 5 minutos. Depois de quatro lavagens com PBS, as placas foram secas à temperatura ambiente e o cristal violeta solubilizado com adição de 1000μΙ de etanol 95% em cada poço. Após dois minutos, 150 μΙ desta solução foram transferidos para uma placa microtitter e a absorbância determinada espectrofotometricamente a 570nm com um enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA MultiskanOEX - Thermo Isher Scientific, EUA). Todos os passos foram realizados à temperatura ambiente.

Como mostrado na Figura 7, as mutações dos genes do Sistema de Secreção Tipo VI fizeram com que houvesse uma diminuição na formação de biofilme pelas linhagens estudadas, quando comparadas com a selvagem SEPT362. Os presentes dados corroboram trabalhos anteriores que também mostraram uma relação entre o Sistema de Secreção Tipo VI e capacidade de formação de biofilme (Aubert ef a/., 2008; Schwarz, S.; West, E.; Boyer, F.; Chiang, W.C.; Carl, M.A.; Hood, R.D. Burkholderia TYPE VI SECRETION SYSTEMS HAVE DISTINCT ROLES IN EUKARYOTIC AND BACTERIAL CELL INTERACTIONS. P/os Path. In press. 2010; Bernard et ah, 2010). As linhagens complementadas puderam, parcialmente, recuperar o padrão de produção de biofilme da amostra selvagem, com exceção da linhagem AclpV C, que recuperou essa capacidade totalmente. O fato das linhagens complementadas não alcançarem exatamente o mesmo padrão da linhagem selvagem pode ocorrer devido a diferenças nas dosagens gênicas, devido ao fato dos genes terem sido clonados dentro de plasmídio, e não mais fazerem parte do genoma da bactéria.