Sector técnico.

El campo de esta invención es ei de la biotecnología, en particular, la obtención de cepas vacunales vivas de Vibrio cholera, específicamente, la adición de mutaciones definidas para prevenir o limitar la posibilidad de la readquisición y (o) la posterior dispersión de los genes de la toxina de cólera por dichas cepas vacunales vivas y un método para conservarlas y utilizarlas como vacunas.

Técnica anterior Primero, definiciones : Durante la descripción de la invención se utilizan algunos términos específicos de la temática cólera, cuyo significado relacionamos a continuación : Entiéndase por virus CTX (P la partícula de ADN y proteína producida por V. cholera que tiene la capacidad de transferir a otros vibrios el ADN contenido en su interior que comprende los genes de la toxina de cólera.

Entiéndase por toxina del cólera aquella proteína que cuando es producida por el microorganismo es el principal factor responsable de los síntomas clínicos de esta enfermedad.

Entiéndase por genes de las toxinas que forman parte del genoma del fago Cox$, además de los genes de la toxina del cólera ; los genes de la proteína ZOT, cuya actividad es responsable de la destrucción de las uniones estrechas entre las células del epitelio del intestino; y el de la proteína ACE, cuya actividad es accesoria a la de la toxina del cólera.

Entiéndase por cepas o vacunas de V. cholera bien toleradas, aquellas que mediante aigún procedimiento han sido desprovistas del grueso de la reactogenicidad, lo cual en términos prácticos significa que poseen niveles de seguridad suficientes para ser utilizadas para la vacunación en comunidades lejanas de la atención médica sin que constituyan un peligro para la vida de los vacunados. Esto se traduce en que generen diarreas en 8% o menos de los vacunados, dicha diarrea caracterizada por no exceder

los 600 mi (gramos), en que solo el 1% de los vacunados o menos padezcan dolor de cabeza, dicho dolor de cabeza caracterizado por ser leve y de corta duración sin exceder las 6 horas, y finalmente en que produzcan vómitos en menos del 0.1 % de los vacunados, dichos vómitos caracterizados por un solo episodio menor o igual a 500 ml.

Entiéndase por hemaglutinina proteasa (HA/P), aquella proteína secretada por V. cholera que tiene actividad dual ; siendo una de ellas la capacidad para aglutinar los eritrocitos de determinadas especies y la otra su propiedad de degradar o procesar otras proteínas como la mucina y la toxina del cólera.

Entiéndase por celA aquella secuencia nucleotídica que codifica para la síntesis de la endoglucanasa A, proteína producida por cepas de Clostridium themocellum, cuya característica esencial es su actividad 3 (1-4) glucan-glucano hidrolasa que le confiere capacidad para digerir la celulosa y sus derivados.

Entiéndase por MSHA, la estructura fimbrial de la superficie de V. cholera que tiene la capacidad de aglutinar eritrocitos de diferentes especies, siendo dicha actividad inhibida por la manosa.

Entiéndase por conversión a la virulencia con los genes del fago COX0 mediada por VGJCP, et evento en el cual una cepa de V. cholera que haya sido atenuada por supresión del fago CTX#, readquiere nuevamente todos los genes de CTX (P, caracterizado este evento por ser mediado y completamente dependiente del fago VGJCP y la interacción de VGJ# con su receptor, la MSHA.

Entiéndase por posibilidad de diseminar el fago CTX# en un proceso mediado por VGJCP, aquella que tiene el fago VGJ$ de recombinar su ADN con el de CTXq) para formar un híbrido (HybP$) estable y diseminarlo hacia nuevas cepas de V. cholera, llevando siempre los genes del fago CTXCP activos, entre ellos los de la toxina del cólera, atributos de virulencia que pueden pasar a cepas ambientales no patogénicas, cepas vacunales y (o) hacia otras especies.

Segundo, información del arte anterior : El cólera es una enfermedad diarreica aguda causada por una infección oral con la bacteria V. cholera. Luego de más de 100 años de

investigaciones en cólera, aún no existe una vacuna segura, eficaz y barata contra la enfermedad. Con posterioridad a 1817 el hombre ha documentado siete pandemias de cólera, las primeras seis fueron causadas por cepas del biotipo Clásico y la séptima está caracterizada por el predominio de cepas de biotipo El Tor. Recientemente, a principios de enero de 1991, la última pandemia se extendió hasta América del Sur, causando más de 25 000 casos de cólera y por encima de 2 000 muertes en Perú, Ecuador y Chile. En enero de 1991, un nuevo serogrupo de V. cholera apareció en la India y Bangladesh, ei 0139, mostrando un gran potencial epidémico y generando una gran amenaza para los países del tercer mundo. Los hechos anteriores refuerzan la necesidad de obtener una vacuna efectiva contra los serogrupos 01 (biotipo El Tor) y 0139 de V. cholera.

Al rebasar un episodio de cólera, el ser humano permanece inmunizado contra su agente causal por un período mínimo de tres años. En base a este conocimiento, se han hecho múltiples esfuerzos para atenuar el microorganismo y obtener una vacuna viva que al ser inoculada por vía oral asemeje el proceso infeccioso natural y produzca una sólida respuesta inmune sin causar reacciones adversas en los vacunados (diarreas, vómitos o fiebre). Dichas vacunas tienen mutaciones del tipo de las supresiones en su cromosoma, especialmente en los genes que codifican toxinas. Dichas supresiones están encaminadas a desproveer al microoi ganismo cie su potencial para producir cólera. Por ejemplo, la supresión de los genes de la toxina del cólera y de otras toxinas codificadas en el profago CTXO, es una manipulación genética obligatoria durante la construcción de un candidato vacuna) vivo. Ver patentes de James B. Kaper, WO 91/18979 y John Mekalanos WO 9518633 de los años 1991 y 1995, respectivamente.

Mutantes de este tipo han sido ensayados como vacunas orales de una sola dosis, mostrando estar sustancialmente atenuados y generar una fuerte respuesta inmunológica, la cual ha sido protectora contra una nueva infección y la aparición de la enfermedad (Kaper J. B. y Levine M. Patentes US 06,472, 276 y 581,406). Sin embargo, el principal obstáculo para el uso generalizado de dichos mutantes ha sido que están sustancial pero no completamente atenuados y producen reacciones adversas inaceptables durante la vacunación (Levine y cols., Infect. and Imm. Vol 56, N°1, 1988).

Por lo tanto, alcanzar el grado suficiente de atenuación es el principal problema a solucionar durante la obtención de una vacuna viva efectiva contra el cólera. Existen al menos tres candidatos vacunales vivos de los cuales se ha documentado niveles aceptables de seguridad, es decir grado suficiente de atenuación y fuerte potencial inmunogénico. Ellos son V. cholera CVD103HgR (Biotipo Clásico, serotipo Inaba) (Richie E. y cols, Vaccine 18, (2000) : 2399-2410.), V. cholera Perú-15 (Biotipo El Tor, serotipo Inaba) (Cohen M., y cols. (2002). Infection and Immunity, Vol 70, No. 4, pag 1965-1970) y V. cholera 638 (Biotipo El tor, serotipo Ogawa) (Benítez J. A. y cols, (1999). Infection and Immunity. Feb; 67 (2) : 539-45.).

La cepa CVD103HgR es el componente antigénico activo de una vacuna viva oral contra el cólera licenciada en varios países del mundo, las cepas Perú-15 y 638 son otros dos candidatos vacunales vivos contra el cólera que están próximos a ser evaluados en estudios de campo.

Sin embargo, existe un segundo problema de importancia a resolver en los candidatos vacunales vivos, y es el de la seguridad ambiental, especialmente relacionado con la posible readquisición y diseminación de los genes de la toxina del cólera, dado que se conoce y enfatiza la existencia de mecanismos de transferencia horizontal de la información genética en las bacterias. De acuerdo con esto, las cepas vacunales de V. cholera que han sido atenuadas por supresión de los genes de la toxina de ! cóiera en el laboratorio, tendrían riesgo de adquirir nuevamente dichos genes fuera de las condiciones controladas de los laboratorios, en un evento de infección con el fago CTXO (Waldor M. K. y J. J. Mekalanos, Science 272 : 1910-1914) procedente de otros vibriones y posteriormente contribuir a su diseminación.

Este proceso cobraría especial importancia durante campañas de vacunación masivas donde millones de personas ingieren cientos o miles de millones de bacterias atenuadas y se mantienen excretándolas en cantidades similares durante al menos 5 días. Las bacterias liberadas al medio ambiente tendrían entonces la posibilidad de intercambiar material genético con otras bacterias de la misma o diferentes especies del ecosistema. Por estas razones, en la actualidad es deseable obtener candidatos vacunales provistos de ciertas barreras que impidan o limiten la adquisición y diseminación de CTX¢, y

especialmente de los genes de la toxina del cólera. Precisamente en este tema se inscribe la presente solicitud de invención.

Los virus bacterianos, conocidos también como bacteriófagos, tienen un potencial extraordinario para la transferencia de genes entre bacterias de la misma o diferentes especies. Tal es el caso del fago CTXq) (Waldor M. K. y J. J. Mekalanos, 1996, Science 272 : 1910-1914,) en V. cholera. CTXq) porta los genes que codifican la toxina del cólera en V. cholera e ingresa a la bacteria a través de la interacción con un Pili denominado TCP, por tener una expresión corregulada con la toxina del cólera, y que está expuesto en la superficie externa de la misma. De acuerdo con datos publicados en la literatura internacional, en condiciones óptimas de laboratorio este fago alcanza títulos inferiores o iguales a 106 partículas por mi de cultivo en la fase de saturación, lo que permite clasificarlo como un bacteriófago moderadamente prolífico. Igualmente el TCP, receptor de este fago, tiene condiciones restrictivas para su producción. A pesar de estas limitaciones de CTC, la existencia de este par bacteriófago-receptor, limita en cierta medida la mejor aceptación de las vacunas vivas de cólera, por lo que desproveer a las bacterias de la vía de ingreso del fago es una modificación deseable a ser introducida en las mismas.

Existen dos formas teóricas de impedir el ingreso de CTXq) a V. <BR> <BR> <BR> <BR> cholerae, 1) suprimiendo la expiesión del TCP ó 2) ret@ando del TCP los sitios involucrados en la interacción con el fago durante su ingreso. Ninguna de las dos formas ha sido implementada debido a que si los vibrios no expresan TCP, no colonizan eficientemente el intestino delgado humano y por tanto no generan una sólida respuesta inmunológica y además porque no ha sido posible encontrar sitios involucrados en la interacción TCP-CTX<) cuya modificación no afecte también el proceso de colonización (Taylor R.

2000. Molecular Microbiology Vol (4), 896-910).

Ante la dificultad de eliminar de las cepas vacunales la vía de ingreso del virus, los investigadores han recurrido a estrategias que impidan su integración al cromosoma bacteriano y su herencia estable, consistentes en la supresión del sitio de integración de este bacteriófago y en la inactivación de gen recA para que no recombine y se integre en otros sitios del cromosoma (Kenner y cols. 1995. J. Infect. Dis. 172 : 1126-1129).

En fecha reciente se describió que el ingreso de CTXO a V. cholera depende de los genes ToIQRA, sin embargo esta mutación crea fenotipos sensibles no deseados en candidatos vacunales de cólera y no ha sido implementada (Heilpern and Waldor. 2000. J. Bact. 182 : 1739).

No se han descrito otros métodos que impidan el ingreso de fagos portando determinantes esenciales de virulencia a cepas vacunales de V. cholera u otras cepas vacunales.

El objeto principal de la presente solicitud de invención está relacionado con el fago VGJ y la posibilidad de este de transferir los genes de la toxina de cólera, utilizando la fimbria Hemaglutinina sensible a manosa (MSHA) como receptor. En específico consiste en proteger las cepas vacunales vivas de la infección con VGJ$ mediante mutaciones de supresión o modificación que impidan el correcto funcionamiento de esta fimbria.

En el conocimiento anterior de esta fimbria, se pueden resumir los siguientes aspectos. El producto génico de gen mshA fue originalmente descrito como la subunidad estructural mayoritaria de una fimbria de la superficie celular de V. cholera que tiene capacidad para aglutinar eritrocitos de diferentes especies ; dicha aglutinación es inhibida por manosa (Jonson G. y cols (1991). Microbial Pathogenesis 11 : 433-441). Como tal, la MSHA fue considerada un factor de virulencia de la bacteria (Jonson G. y cois (1994).

Moleculai Microbiology 13.109-118). De acuerdo con la importancia alribuiclo, se obtuvieron mutantes deficientes en la expresión de la MSHA para estudiar su posible papel en la virulencia, pudiéndose demostrar que la MSHA, a diferencia de TCP, no se requiere para la colonización del intestino delgado humano por cepas El Tor y 0139 de V. cholera (Thelin KH y Taylor RK (1996). Infection and immunity 64 : 2853-2856). La MSHA se ha descrito también como el receptor del bacteriófago 493 (Jouravleva E. y cols (1998). infection and Immunity, Vol 66, No 6, pag 2535-2539), algunas evidencias acerca del cual sugieren que este fago está involucrado en el surgimiento de los vibrios 0139 (Jouravleva E. y cols, (1998). Microbiology 144 : 315-324).

Posteriormente se ha descrito que la fimbria MSHA tiene participación en la formación de biopelículas en superficies bióticas y abióticas que contribuyen a la sobrevivencia bacteriana fuera del laboratorio y el hospedero (Chiavelli D. A. y cols, (2001). Appi. Environ Microbioì Jul ; 67 (7) : 3220-25 y Watnick P.

I. and Kolter R. (1999). Mol. Microbiol. Nov, 34 (3) : 586-95). A partir de los datos anteriores se evidencia que aunque se han realizado numerosas investigaciones relacionadas con la fimbria MSHA, de ninguna de ellas se infiere que sea el receptor de un fago que transduce de forma muy eficiente los genes de la toxina del cólera y no solo estos genes sino el genoma completo de CTX<, lo cual puede contribuir notablemente a su diseminación.

Adicionalmente, búsquedas recientes no han demostrado la existencia de solicitudes de invención relacionadas con esta fimbria para vacunas, como factor de virulencia o como receptor de fagos que medien la dispersión de CTXcP.

Por otra parte, se ha convertido en práctica común entre los que desarrollan vacunas vivas contra el cólera, establecer que la bacteria viva se suministre en forma de una suspensión que parta de la forma liofilizada y que previamente se administre al vacunado una solución antiácida para regular el pH stomacal y para que la suspensión continúe hacia el intestino sin que la bacteria sea dañada a su paso por el estómago y logre colonizar en el lumen intestinal.

La elaboración de la vacuna en forma liofilizada, además de presentar la ventaja de mejorar la conservación de la cepa, facilita la preparación de las dosis, garantiza un almacenamiento prolongado, limita los riesgos de contaminación y facilita la cumercíaiizaoón y distribución al prescindir de una cadena de frío a muy bajas temperaturas, generalmente no disponible en los países subdesarrollados donde prolifera la enfermedad.

Aunque durante mucho tiempo se consideró a Vibrio cholera como un microorganismo muy sensible al proceso de liofilización, en los últimos años se ha profundizado en el efecto de los aditivos y se ha incrementado la viabilidad. Es así como en trabajos dirigidos a conservar por este medio la cepa vacunal CVD103HgR Clásica Inaba, del Centro para el Desarrollo de Vacunas, Universidad de Maryland, Estados Unidos, el Instituto Suizo de Sueros y Vacunas, de Berna (ISSVB), desarrolló una formulación de la que, en un trabajo publicado en Vaccine, 8,577-580, 1990, S. J. Cryz Jr, M. M.

Levine, J. B. Kaper, E. Fürer y B. Althaus señalan que está compuesta fundamentalmente por azúcares y aminoácidos. Posteriormente, en información divulgada sobre la vacuna Mutacol Berna (RxMed

Pharmaceutical Information-MUTACOL BERNA, http//www. rxmed. com. ), se publicó que la bacteria se liofiliza en un medio compuesto por sacarosa, aminoácidos y ácido ascórbico y una vez liofilizada, se le añade lactosa y aspartamo.

En un trabajo sobre la conservación por liofilización de la cepa salvaje 569B Clásica Inaba, publicado en Cryo-Letters, 16,91-101 (1995) por H. Delgado, T. Moreira, L. Luis, H. García, T. K. Martino y A. Moreno, se compara el efecto de diferentes aditivos sobre la viabilidad post liofilización y después de almacenamiento a diferentes temperaturas. Se demuestra que es posible lograr que al cabo de 3 días de almacenamiento a 45° C, la pérdida de viabilidad sea igual a 1 orden logarítmico.

En la patente CU 22 847 se reivindica un método de liofilización donde las formulaciones tienen como componentes de base, combinaciones de proteínas purificadas o leche descremada con adición de polímeros y/o glicina, además de peptona bacteriológica o hidrolizado de caseína y sorbitol, con buenos resultados en cuanto a la viabilidad de cepas de Vibrio cholera de diferente serogrupo, biotipo y serotipo. La bacteria liofilizada no se afecta al ser disuelta en una solución de bicarbonato de sodio 1,33%, sugerida para regular el pH estomacal.

Además de aspirar a mantener una alta viabilidad, toda formulación vacuna) <BR> <BR> <BR> <BR> ani@colerica liofilizada destinada a paises de @egiones tropicales, debe presentar otros requisitos, como ser de sencilla composición, fácil preparación y manipulación, que presente alta solubilidad y buen aspecto al ser disuelta, no requerir de temperaturas muy bajas para el almacenamiento prolongado y poder tolerar altas temperaturas de almacenamiento al menos por tiempos cortos, así como soportar la presencia eventual de oxígeno y de humedad en el envase, así como permitir la conservación de cepas de diferente serogrupo, biotipo y serotipo. Esto se logra seleccionando adecuadamente la composición de la formulación. Se debe destacar también que aunque se trate de una vacuna oral, el hecho de disponer de una formulación libre de derivados bovinos, permitiría compatibilizar criterios con los organismos regulatorios internacionales que tratan de evitar cualquier vestigio de contaminación con la encefalitis espongiforme del ganado bovino, trasmisible a los humanos al utilizar en vacunas sustancias de ese origen.

Divulgación de la invención.

La presente invención propone la generación de una nueva versión de cepas vivas atenuadas para inmunizar contra el cólera mediante la modificación de sus propiedades, fundamentalmente mediante el mejoramiento de sus propiedades de seguridad biológica durante la colonización intestinal y en el ambiente, fuera de los laboratorios.

La presente invención surge a partir de a necesidad de proteger las cepas vacunales vivas de la readquisición de fago CTXO y los genes de la toxina del cólera y también de impedir su potencial diseminación a partir de los candidatos vacunales. Específicamente surge a partir del descubrimiento del fago VGJ y su caracterización en nuestro laboratorio.

VGJ es un fago filamentoso aislado de una cepa de V. cholera 0139 y tiene la capacidad de infectar V. cholera 01 de todos los serotipos y biotipos y también otras cepas de V. cholera 0139. La secuencia de este fago no fue descrita durante la secuenciación completa del genoma de V. cholera, indicando que no estaba presente en la cepa N16961 (01, El Tor Inaba). De una amplia lista de cepas 01 existentes en nuestro laboratorio, ninguna tiene secuencias homólogas a VGJcP, mientras que las cepas MO45, SG25-1 y MD012C, de V. cholera 0139, si lo poseen.

El fago VGJcP ingresa a V. cholera utilizando como receptor la fimbria IVISHA. Una vez en el interioi bacteriano puede mantenerse en forma replicativa o integrarse específicamente en un sitio del cromosoma bacteriano. Este es un fago muy activo que alcanza títulos mayores de 1011 partículas por mi de cultivo.

La característica más importante de este fago, en virtud de la siguiente aplicación de invención es su capacidad para realizar una transducción especializada del fago CTXO y por consiguiente de los genes de la toxina del cólera. Este proceso ocurre mediante recombinación sitio-específica entre los genomas de CTXQ y VGJO, seguido de la encapsidación y exportación de este genoma cointegrado en la cápsida de VGJCP. Esta partícula viral híbrida se denominó HybP$. Un cultivo de bacterias coinfectadas con CTXO y VGJ$ produce títulos mayores de 1011 partículas de VGJX por mi y de 107-108 partículas del fago híbrido (HybP#) por mi, lo cual es al menos 100 veces superior a los títulos de CTXq) por si solo.

Es también importante comprender, a los fines de esta aplicación, que el fago CTXO tiene como receptor al TCP, el cual requiere condiciones especiales para su expresión, mientras VGJO tiene como receptor la fimbria MSHA, un antígeno que se expresa abundantemente en todas las condiciones estudiadas y cuya producción ha sido reportada incluso en condiciones ambientales. También otros vibrios producen la MSHA, lo que incrementa el riesgo de transmisión, incluso a bacterias de otras especies.

Es además importante saber que una vez que HybP$ ha infectado un nuevo hospedero mantiene una producción estable de partículas en el rango de 107 _ 101 por ml de cultivo en la fase de saturación, por lo que tiene un alto potencial para transmitir y diseminar los genes de la toxina de cólera.

Otro aspecto de sumo interés a los fines de esta invención es que los genes de la toxina del cólera en HybP$ son activos y permiten producir 50 ng/mi de toxina durante el cultivo in vitro y que la infección de una cepa atenuada con HybP$ la convierte en virulenta cuando se evalúa por el modelo del ratón lactante.

De acuerdo con estos datos, un objetivo primario de la presente invención es describir la adición de mutaciones a cepas vacunales de V. cholera para prevenir que se infecten con VGJ (P o con HybP$, así como la necesidad de utilizar candidatos vacunales que no contengan VGJq) en su dotacion genética para vritar la diseminacion de CTX# asistida por VGJ#, en caso de readquisición de CTX# Ejemplos de estas mutaciones son aquellas mutaciones espontáneas estables que conduzcan a la falta de expresión de la fimbria MSHA en la superficie celular. Así, el fago VGJ$ o su derivado HybP no encuentra su receptor y no puede establecer una infección de los mismos.

Otros ejemplos de estas mutaciones son las mutaciones de supresión en el gen estructural de la subunidad mayoritaria MshA, por la misma razón.

La utilización de candidatos vacunales desprovistos de las secuencias de VGJCP en su dotación genética se puede lograr sencillamente haciendo una búsqueda por hibridación de ADN en diferentes cepas, para identificar cuales no tienen fragmentos homólogos al fago VGJ#, descrito en esta solicitud de invención, aunque otros procedimientos ya conocidos pudieran ser empleados para desproveer una cepa infectada del fago VGJ#.

Ejemplos de cepas vacunales útiles como cepas de partida para la adición de las mutaciones mencionadas son las que no tengan señales de hibridación con una sonda VGJ# específica y que se les haya verificado en el arte anterior que debido a su genotipo, manifiesten un fenotipo de ser bien toleradas cuando son administradas a los seres humanos. Dicho genotipo incluye mutaciones de supresión del fago CTXO dejando un RS1 remanente y la inactivación insercional de gen hap por el gen celA. Dichas cepas se logran mediante un método tradicional de supresión de los genes del fago CTXO en una cepa patogénica de V. cholera, seguido de la inactivación de gen de la hemaglutinina proteasa (hap) por la inserción de gen marcador celA en su secuencia codificadora. Ver el artículo científico de Robert y cols., Vaccine, vol 14 N°16, 1517-22,1996), el artículo científico de Benítez J. A. y cols, (1999), Infection and Immunity. Feb ; 67 (2) : 539-45, y la solicitud de invención W09935271A3, de Campos y cols, 1997. Otras cepas con estas características y que adicionalmente tienen incorporadas mutaciones de auxotrofías también son útiles para obtener las cepas con las características de interés de la presente solicitud de invención.

De acuerdo con la descripción en los párrafos anteriores, un objetivo primario de esta invención es proteger la utilización de mutaciones de supresión o espontáneas que conduzcan a la ausencia de la fimbria MSHA del extenor de los vibrios para asi irr pedi que cdndidatos vacunales vlVOs para inmunizar contra el cólera readquieran los genes de la toxina del cólera mediante la infección con el fago híbrido HybP< y lo diseminen.

Entre las inclusiones preferidas de esta invención resulta cualquier cepa vacunal de V. cholera de los biotipos y serotipos existentes o cualquier cepa no toxigénica de otro serotipo emergente que haya sido manipulada genéticamente para suprimir el genoma del fago CTXO, mutar el gen hap y adicionarle alguna otra mutación, como por ejemplo la introducción de alguna auxotrofía (lisina o metionina) y que además haya sido modificada acorde con las propuestas de la presente solicitud de invención.

Entre las inclusiones preferidas se encontraría también el uso de esta versión bien tolerada, mejorada por la imposibilidad de adquirir el fago CTX en un evento asistido por VGJO y por la ausencia de VGJCP que disminuye el

riesgo de dispersión de CTX$, como presentadora de antígenos heterólogos al sistema inmune de mucosas.

Para obtener estos mutantes en la expresión de la fimbria MSHA se han utilizado técnicas tradicionales de biología molecular que no son objeto de protección del presente documento.

La presente invención protege además métodos para conservar estas cepas por liofilización con el fin de poder preparar vacunas que presenten una adecuada y rápida disolución post liofilización, sin que influya en su viabilidad el hecho de ser disueltas en una solución de bicarbonato de sodio al 1,33%.

Es también objeto de la invención que mediante la adecuada selección de los componentes, las formulaciones liofilizadas garanticen que las pérdidas de viabilidad de las cepas de Vibrio cholera se reduzcan a menos de 1 orden logarítmico como consecuencia del almacenamiento, independientemente del serogrupo, serotipo o biotipo o de haber sido liofilizadas por separado o unidas formando parte de un mismo preparado.

Entre los componentes de la formulación pueden figurar la lactosa (L), la peptona (P), el extracto de levadura (E) y el sorbitol (S). La concentración total no debe sobrepasar el 10%.

Ejemplos de realización.

Ejemplo 1. Descubrimiento del fago VGJçP y sus caracterísiticas principales.

VGJ$ fue descubierto como un elemento extracromosomal transmisible en un clon de la cepa SG25-1 (Calcutta, India, 1993), gentilmente donada a nuestro laboratorio por el profesor Richard A.

Finkelstein. Experimentos simples mostraron la transmisibilidad de este elemento. El filtrado de sobrenadantes de caldos de cultivo de la cepa donante, portadora del elemento, creciendo en cualquier condición estándar, digamos LB (NaCI 10g/l, Triptona 10 g/l y extracto de levadura 5 g/t), fue capaz de transferir a una cepa receptora virgen, un elemento extracromosomal de igual talla y mapa de restricción que el presente en la cepa donante de partida. La propiedad de transmitirse de esta forma sin necesidad del contacto donante-receptor, es típica de los fagos.

Ensayo de infección. La cepa donante fue cultivada hasta alcanzar una densidad óptica a 600 nm igual a 2.0. Una alícuota del cultivo fue filtrada por membranas de 0.22 im para eliminar las bacterias. El filtrado se chequeó sembrando una alícuota de 50 pil en placa de LB sólido e incubando a 37°C toda una noche para comprobar su esterilidad por ausencia de unidades formadoras de cotonías. Se usaron 100 jd del sobrenadante libre de células, o diluciones del mismo, para infectar 20 il de un cultivo fresco de la cepa usada como receptora. La mezcla fue incubada durante 20 minutos a temperatura ambiente (TA) y seguidamente esparcida en medio LB sólido o líquido según convino y puesta a crecer a 37°C durante toda una noche. La infección fue chequeada por la presencia de forma replicativa (FR) y ADN de simple cadena de VGJCP en los cultivos resultantes de vibrios infectados.

Purificación del fago VGJ (P. La purificación de partículas virales fue realizada partiendo de 100 ml de un cultivo de la cepa de V. cholera 569B (Clásica Inaba) infectada con VGJ<). Las partículas virales fueron purificadas del sobrenadante de cultivo de la cepa 569B infectada debido a que esta cepa tiene un profago CTX defectivo. La biomasa bacteriana fue sedimentada por centrifugación a 8000 x g durante 10 min. Posteriormente el sobrenadante fue filtrado a través de membranas de 0.22 µm. Las partículas presentes en el filtrado fueron precipitadas por centrifugación a 12000 g durante 20 minutos, luego de la adición de polietilenglicol 6000 al 5 % y NaCI al 3 % e incubación en hielo por 30 minutos. El precipitado con las partículas virales fue disuelto en 1 ml de salina amortiguada con fosfato (PBS).

Caracterización del fago VGJO. Las partículas precipitadas retuvieron la capacidad de infectar nuevos cultivos vírgenes de 569B y mantuvieron su estabilidad en PBS durante al menos 6 meses a 4°C.

Habiendo purificado las partículas virales, el ácido nucleic genómico de VGJ# fue extraído con fenol cloroformo. El análisis del ácido nucleico por digestión con distintas enzimas demostró sus características. El mismo fue resistente a la digestión con ribonucleasa H indicando que el genoma es de ADN y no de ARN (no mostrado); este ADN fue también resistente al tratamiento con diferentes enzimas de restricción pero sensible al tratamiento con nucleasa Mung-Bean y nucleasa S1 (resultados no mostrados),

indicando que el genoma de fago está constituido por ADN de simple cadena (ADNsc). Los resultados de una electroforesis de ADN genómico en presencia de naranja de acridina demostraron coincidencia con los anteriores. El naranja de acridina intercalado en el ADN de doble cadena fluoresce verde mientras que intercalado en el ADN de simple cadena fluoresce naranja. Como se esperaba ei ADN genómico del fago fluoresció naranja indicando su naturaleza de simple cadena (resultado no mostrado) y el ADN plasmídico observado en las cepas infectadas fluoresció verde denotando estar compuesto por ADN doble cadena.

Identidad del genoma de las partículas de VGJ<P con el de la forma replicativa intracelular. Experimentos de Southern blot hibridados con una sonda obtenida a partir del ADN de las partículas virales demostraron la identidad entre este y eì ADN del elemento extracromosomal en la cepa donante SG25-1uy ìa cepa 569B infectada. Este resultado confirma que el ADN de simple cadena (ADNsc) del genoma viral es producido por la FR citoplasmática y sugiere a la vez que estamos en presencia de un fago filamentoso que utiliza un mecanismo de círculo rodante para producir ADNsc a partir de su genoma, el cual se ensabla y exporta en partículas virales.

La forma replicativa del fago, aislada de la cepa 569B infectada, fue mapeada mediante un análisis de restricción. Dicho mapa demostró que el tamaño del genoma del bacteriofago (# 7 500 b) era diferente y generaba un patrón electroforético diferente al de todos los fagos filamentosos específicos de V. cholera reportados hasta el momento en la literatura internacional.

Estos resultados aseguraron que el fago aislado de SG25-1 no había sido descrito anteriormente y se denominó VGJ¢.

Titulación de VGJO. Se procedió como en el ensayo de infección, solo que las células infectadas con diluciones del sobrenadante a titular fueron inoculadas en una capa de agar suave sobre placas de LB sólido. Las placas sembradas se incubaron toda la noche a 37°C y las placas opacas (focos de infección) observadas fueron contadas.

Este ensayo demostró que un cultivo de 569B infectado con VGJX puede producir 3 x 1O partículas de fago por mi de cultivo, io oual es inusualmente alto comparado con otros fagos filamentosos descritos en V.

cholera como CTXct), que exhibe títulos hasta un máximo de 106 partículas por ml.

Microscopia electrónica. Diferentes cantidades de partículas purificadas de VGJO fueron teñidas negativamente con una solución de acetato de uranilo al 4 % (m/v) y observadas sobre una rejilla Formvar recién preparada en un microscopio electrónico de trasmisión JEOL JEM 200EX (JEOL, Japón).

La observación al microscopio electrónico (ME) de partículas purificadas mostró que efectivamente se trata de un bacteriófago filamentoso (Fig. 1).

Obtención y titulación de VGJk$-kn. La forma replicativa de VGJO fue linealizada por su único sitio @bal. Un fragmento Xbal conteniendo el origen de replicación oriR6K y un gen de resistencia a kanamicina proveniente del pUC4K fue insertado en el sitio Xbal de VGJ (P. Esta forma replicativa fue introducida en V. cholera 569B y las particulas producidas fueron designadas VGJ#-kn.

La cepa donante, 569B infestada con VGJO-kn, fue cultivada hasta alcanzar una densidad óptica a 600 nm igual a 2.0. Una alícuota del cultivo fue filtrada por membranas de 0.22 pim para separar las bacterias. El filtrado se chequeo sembrando una alícuota de 50 µl en placa de LB sólido e incubando a 37°C toda una noche para comprobar su esterilidad por ausencia de unidades formadoras de colonias. Se usaron 100 vil dey sobrenadante libre de células (conteniendo el fago), o diluciones del mismo, para infectar 20 plì de un cultivo fresco de la cepa usada como receptora. La mezcla fue incubada durante 20 minutos a temperatura ambiente (TA).

Seguidamente, diluciones seriadas (factor 10) de la mezcla fueron esparcidas en placas con medio LB sólido suplementado con kanamicina e incubadas a crecer durante toda una noche a 37°C. Las colonias que crecen en presencia de la selección del antibiótico adquirieron la resistencia a kanamicina debido a la infección con el fago marcado VGJCP-kn. Varias de estas colonias fueron chequeadas para confirmar la infección, estudiando la presencia de la forma replicativa de VGJcp-kn por su patrón de restricción.

Los ensayos de titulación realizados por este método coincidieron con el método de las placas opacas con VGJ# salvaje, demostrando que un cultivo de 569B infectado con VGJ p-kn produce alrededor de 2 x 1011 partículas del fago VGJ#-kn por mililitro de cultivo.

Secuencia nucleotídica. La secuenciación nucleotídica de VGJ (I) permitió determinar el tamaño exacto de su genoma, 7542 bases (SEQ. ID : No 1) con un 43,39% de G+C. Su análisis permitió además identificar los marcos abiertos de lectura (ORF, del inglés open reading frame), los cuales fueron traducidos teóricamente a sus, productos proteicos y luego comparados con las bases de datos de proteínas.

La organización genómica de VGJ () fue similar a la de fagos filamentosos bien conocidos como los del grupo Ff (M13, fd y f1) de E. coli y a la de otros fagos filamentosos de V. cholera (CTX#, fs1, fs2 y VSK) y Vibrio parahaemolyticus (Vf12, Vf33 y Vf03k6). VGJO, a diferencia de los fagos del grupo Ff no presenta un gen homólogo al gen IV de estos fagos.

Este gen es de una porina esencial para el ensamblaje y extrusión de las partículas de los fagos del grupo Ff. El hecho de no estar presente un gen homólogo al gen IV en VGJ<) sugiere que este fago pudiera utilizar una porina del hospedero para el ensamblado y exportación de las partículas virales en la membrana, tal como ocurre en el caso del fago CTXo Es importante señalar que el análisis de la secuencia de VGJ mostró que existe una estrecha interrelación evolutiva entre este fago y los fagos fs1 y VSK con los cuales comparte varios ORFs altamente homólogos. El ADN de VGJ comparte también más de un 70 % de homología nucleotídica a través de gran parte de su genoma con los fagos fs1 y VSK. Sin embargo, existen zonas de genoma altamente divergentes y ORFs no compartidos entre estos fagos, además de presentar un tamaño genómico diferente y no se ha descrito anteriormente que fs1 o VSK sean capaces de transmitir los genes de la toxina del cólera En la secuencia nucleotídica de VGJ fueron identificados dos secuencias homólogas a los sitios att de fagos conocidos a través de los cuales estos se integran en el cromosoma de sus hospederos. Estos sitios att de VGJ se encuentran parcialmente sobrelapados y en dirección opuesta

uno con respecto al otro. Este arreglo de los sitios att fue encontrado también en los fagos Cf1c, Cf16-v1 y (jLF de X. campestris así como en Vf33 y Vf03K6 de V. parahaemolyticus y en VSK de V. cholera. Los fagos antes mencionados excepto Vf33 y VSK se integran en el cromosoma de sus hospederos por el sitio att que corre en el mismo sentido de la cadena negativa de la forma replicativa de estos fagos. Todavía no se conoce el lugar exacto por el cual VF33 y VSK se integran pero a partir del estudio anterior podemos predecir con alta probabilidad que se integran por el sito att homólogo ai sitio por el cual se integran los demás fagos mencionados. Ei único sitio att ubicado en el genoma de CTXc) por el cual este fago se integra en el cromosoma de V. cholera también se encuentra en la misma dirección de la cadena negativa de su FR.

Ejemplo 2. Identificación de receptor.

Los fagos filamentosos de V. cholera anteriormente reportados utilizan como receptor fimbrias tipo V. Ejemplos de estas fimbrias en V. cholera son el pili corregulado con la toxina (TCP) o la hemaglutinina sensible a manosa (MSHA). Teniendo en cuenta esto, para determinar el receptor a través del cual VGJX reconoce e infecta a V. cholera se realizaron ensayos de infección en dos mutantes derivados de la cepa C6706, KHT52(#tcpA10) y KHT46(#mshA). Tanto la cepa parental C6706 como su derivada KHT52 fueron sensibles a la infección con VGJ$, a diferencia de la cepa KHT46, la cual fue resistente a la infección con el fago.

Este resultado sugirió que MSHA es el receptor de VGJCP lo cual fue confirmado complementando la cepa KHT46 con el plásmido pJM132, portador del gen estructural de la mshA lo que hace que KHT46 recupere la sensibilidad a la infección con VGJ$. En el caso descrito la resistencia o susceptibilidad a VGJq) se evaìuó por la ausencia o presencia de forma replicativa en cultivos de la cepa receptora analizada luego del ensayo de infección mediante un procedimiento tradicional de purificación de plasmidios.

Para ofrecer un título numérico de las partículas que se transducen en cada caso, se utilizó un ensayo de infección con VGJc)-Kn como se describió anteriormente, resultando lo siguiente :

C6706 y su mutante KHT52 (mutante en la expresión de TCP) fueron sensibles a VGJO-KN y como cepas indicadoras mostraron títulos de 1011 unidades formadoras de placas por mi, mientras KHT46 (mutante en la expresión de MSHA) indicó títulos no detectables (< 5 unidades formadoras de placas por mi) al ser infectadas con las mismas preparaciones de VGJ « Q- kn. La introducción de un gen msM complementador condujo a la infección de KHT46 por VGJO-kn. Dichos resultados muestran que la introducción de una mutación que impida la expresión de la fimbria MSHA confiere sustancial protección a la infección con VGJO.

Otros ensayos fueron realizados para comparar la capacidad de infección de HybP y CTXO en cepas Clásicas y El Tor. Estos datos fueron obtenidos mediante el uso de sus derivados marcados con kanamicina.

Veáse los resultados en la Tabla 1.

Ya antes se ha descrito cómo se obtuvo el fago CTXO-KN. Este se obtuvo mediante la inserción de un cassette de resistencia a kanamicina, proveniente del plasmidio pUC4K (Amershan Biosciences), en el sitio único Not I de la forma replicativa de CTX#, para originar CTX$-kn.

El fago HybP$-Kn se produjo desde la cepa 569B coinfectada con CTXzP-Kn y con VGJ y luego se amplificó selectivamente infectando la cepa KHT52. Las colonias de KHT52 que adquirieron la resistencia a kanamicina <BR> <BR> <BR> <BR> aportada po@ CTX#-Kn a HybP#-kn fueron purificadas y continuaron exportando partículas virales de este fago híbrido hacia el sobrenadante.

Para comprobar la eficiencia de infección sobre una cepa Clásica y sobre una cepa El Tor, se utilizaron suspensiones de CTX$-kn e HybP#-kn de igual título (1-5 x 105 partícuias/ml) para infectar las cepas indicadoras 569B (Clásica) y C7258 (El Tor). En ambos casos la cepa receptora o indicadora había sido crecida en condiciones óptimas para la expresión de TCP, receptor de CTX#. El ensayo se hizo como sigue : 200 LI de la preparación de fagos fueron mezclados con 20 p 108 UFC) de un cultivo fresco de las cepas indicadoras durante 20 minutos a temperatura ambiente.

Posteriormente, la mezcla de infección fue extendida en placas de LB con kanamicina, las cuales fueron incubadas a 37°C, durante toda una noche.

Las colonias resistentes resultantes surgen por infección con los fagos, los que contienen genes de resistencia a kanamicina en sus genomas y

demuestran la capacidad de cada fago para infectar diferentes cepas en condiciones de cultivo de rutina en el laboratorio. En la Tabla 1 se muestran los resultados obtenidos.

Tabla 1. Titulación de CTX p-kn y el fago híbrido (HybP#-kn) en 569B y C7258. No. de colonias Knr de la cepa receptora Fags 569B C7258 CTX p-Kn 5. 8 x 10t 0 HybP#-kn 1. 5 # 105 7.5 # 104 Como se observa en la Tabla 1, el fago híbrido se transduce eficientemente hacia la cepa El Tor (portando a CTX#), mientras CTXO por si solo lo hace a niveles muy bajos, inferiores al límite de detección del ensayo. Los resultados indican la importancia de la transmisión de CTXO mediada por VGJO entre cepas de V. cholera y cobran mayor relevancia por la existencia del receptor MSHA funcional en casi la totalidad de las cepas de esta bacteria.

Ejemplo 3. Movilización de CTX# mecanismo y conversión a la virulencia.

La infección con VGJ# de cepas de V. cholera 01 u 0139 que porten un fago CTX$ activo origina la producción de partículas infectivas que portan el genoma del fago CTÁ insertado en el genoma de VGJ# A estas partículas de fago híbrido les hemos llamado HybP$. Los títulos de HybPcP han sido evaluados mediante el uso de un fago híbrido portador de un marcador de kanamicina (HybP#-Kn), utilizando diferentes cepas como indicadoras. La Tabla 1 muestra dichos títulos.

HybP#-Kn fue purificado a partir de preparaciones procedentes de la cepa 569B (HybP<)-Kn) y la simple cadena fue secuenciada para determinar los sitios de unión entre CTXcP y VGJO. La Figura 2 muestra gráficamente la estructura del cointegrado e indica la secuencia nucleotídica de las uniones entre ambas secuencias, lo que explica el mecanismo por el cual VGJ transduce a CTXCP hacia otras cepas de V. cholera. HybP$-Kn ingresa a V. cholera utilizando el mismo receptor que VGJO, o sea MSHA.

La cepa V. cholera 1333 es una cepa atenuada del arte anterior similar a las cepas que fueron útiles para obtener los derivados de la presente invención. Esta cepa deriva de la cepa patogénica C6706. Como se muestra en la Figura 4, la inoculación de 105 unidades formadoras de colonias de dicha cepa en ratones lactates no tiene efecto letal, aún cuando permanece colonizando por espacio de 15 días. Se realizaron varios experimentos de determinación de virulencia, concebidos para demostrar el efecto de la infección con HybP$-Kn sobre la reconversión a la virulencia.

Mientras una dosis de 105 UFC de la cepa 1333 no tiene efecto letal, las cepas C6706 y 1333 (HybP$-Kn) tienen perfiles de letalidad muy similares, y no permiten supervivencia de los animales inoculados más allá del quinto día (Figura 4).

Ejemplo 4. Expresión constitutiva del receptor de VGJO, la fimbria MSHA, en diferentes condiciones de cultivo.

Para estudios de expresión de la MshA, subunidad mayoritaria de la fimbria MSHA, las cepas de V. cholera, C7258, C6706, y CA401, fueron crecidas en diferentes medios de cultivos microbiológicos rutinarios y en medios de cultivos de células superiores. Los cultivos empleados fueron : LB pH 6.5 (NaCI, 10 g/l ; triptona bacteriológica, 10 g/l ; extracto de levadura, 5 g/l), AKI (peptona bacteriologica, 15 g/l, extracto de levadura, 4 g/l, NaCl, 0 5 g/l ; NaHCOs, 3 g/l), TSB (digerido pancreático de caseína, 17 g/l ; digerido papaínico de semilla de soja, 3.0 g/l; NaCl, 5 g/l ; fosfato de potasio dibásico, 2.5 g/l ; glucosa, 2.5 g/l), Dulbecco's (glucosa, 4.5 g/l ; HEPES, 25 mM; piridoxina, HCI, HaHCO3), Protein Free Hybridoma Medium (formulación sintética libre de suero y proteínas, suplementada con NaHCO3, 2.2 g/l; glutamina, 5 mg/I ; rojo fenol, 20 g/t) y Syncase (NaH2PO4, 5 g/ ; KH2PO4, 5 911. ; casaminoácidos, 10 g/l ; sacarosa, 5 g/l y NH4CI, 1.18 g/l). En todos los casos se inoculó una colonia en 50 ml de caldo de cultivo y se creció en zaranda durante 16 horas a 37°C, con la excepción de la condición AKI en la que las cepas fueron crecidas primero a 30°C en condiciones estáticas durante 4 horas y posteriormente incubadas a 37°C en zaranda durante 16 horas. En cada caso, la biomasa bacteriana fue sedimentada por centrifugación y

utilizada para preparar lisados celulares. Cantidades equivalentes de los lisados celulares fueron ensayados en Western Blot, realizando la inmunodetección de MshA con el anticuerpo monoclonal 2F12F1. La cepa mutante de MSHA (KHT46) fue utilizada como control negativo del experimento. Todas las cepas estudiadas, excepto la cepa control KHT46 mostraron la capacidad de producir MshA en todas las condiciones de cultivo empleadas. Igualmente dichas cepas, cultivadas en las condiciones anteriores tienen la capacidad de hemaglutinar eritrocitos de pollo (sensible a manosa), en títulos iguales o superiores a 1 : 16 y son eficientemente infectadas por VGJO-kn, exhibiendo títulos superiores a 101° partículas por mililitro de cultivo.

Ejemplo 5. Obtención de mutantes espontáneos deficientes en la expresión de MSHA y evaluación de la resistencia a la infección La cepa KHT46, mutante de supresión de la fimbria MSHA, derivado de V. cholera C6706 (01, El Tor, Inaba), demostró un estado refractario a la infección por el fago VGJO, el fago VGJ$-KN y el fago híbrido HybP (P. Sin embargo, esta es una cepa patogénica que no es propiedad de los inventores de la presente solicitud, ni de la persona jurídica que la presenta, ei Centro Nacional de Investigaciones Científicas, en Ciudad de La Habana, Cuba.

Para obtene@ los mutantes espontáneos deficientes en la expresión de la MSHA superficial de la presente solicitud, se partió de un mutante de supresión en los genes de la toxina del cólera que durante el proceso de obtención resultó afectado en su capacidad de ensamblar la MSHA en la superficie celular. Dichos mutantes aunque son capaces de producir la subunidad estructural de la MSHA, no la ensamblan en su superficie y por tanto no son detectables los títulos de hemaglutinación sensible a manosa, y no adsorben la actividad de un anticuerpo monoclonal específico contra la MSHA en un ELISA de competencia. Dado que este fenotipo es notablemente estable, estos mutantes fueron manipulados genéticamente en lo subsiguiente para introducirles una mutación insercional en el gen de la hemaglutinina proteasa, siguiendo el procedimiento descrito en la patente WO 99/35271"V. cholera vaccine candidates and the methods of their constructing"de Campos J. y cois y en el artículo de Robert y cols., Vaccine,

vol 14 N°16, 1517-22,1996. Los mutantes resultantes fueron denominados JCG01 y JCG02, ambos de serogrupo 01, biotipo El Tor, serotipo Ogawa.

JCG01 y JCG02 demostraron un estado refractario a la infección con el fago VGJ<Í)-Kn, una variante de fago VGJO que porta un marcador de resistencia a kanamicina. Una suspención de VGJq)-Kn que tenía un título comprobado de ~ 1011 unidades por ml, no mostró capacidad para infectar dichas cepas (títulos no detectables, inferiores a 5 unidades por ml). Dicho estado refractario a la infección con VGJ$-kn se corresponde con un título muy bajo de hemaglutinación en las cepas JCG01 y JCG02 (1 : 2), respecto a su parental (1 : 32) y una anulación total de la hemaglutinación sensible a manosa. Igualmente, se corresponde con la nula capacidad de una preparación de células completas de estos mutantes para inhibir la unión del anticuerpo monoclonal anti-MSHA (2F12F1) a MshA fijada a la fase sólida en un ELISA de competencia. Sin embargo ambas cepas producen la subunidad estructural mayoritaria MshA, de acuerdo con experimentos de inmunoblot, indicando que la proteína no se está ensamblando correctamente en el exterior celular aunque se está produciendo. Estos mutantes permitieron probar el concepto de esta invención y pasar a la obtención de los mutantes de supresión.

Obtención de mutantes de supresión del gen insha a partir de otros canclidatos vac, unales cle cóle a Para obtener los mutantes de supresión en el gen estructura) de la mshA, los fragmentos flanqueantes al mismo en la cepa V. cholera N16961, de-1200 pares de bases por cada lateral del gen estructura) de la mshA fueron amplificados mediante reacciones en cadena de la polimerasa, utilizando los oligonucleótidos siguientes : CNC-8125, ATG ATC GTG AAG TCG ACT ATG (21 mer); CNC-8126 CAG CAA CCG AGA ATT ACA ATC ACC ACG (27 mer); CNC-8127, ATT CTC GGT TGC TGG AAC TGC TTG TG (26 mer) ; y CNC-8128, GCT CTA GAG TAT TCA CGG TAT TCG (24 mer). Los fragmentos amplificados fueron clonados independientemente y ensamblados in vitro para generar el clon pAmshA.

Dicho clon contiene estos fragmentos en ei mismo orden y orientación en que se encuentran en el cromosoma bacteriano, solo que la región codificadora de gen mshA ha sido suprimida de interior de la secuencia. El fragmento portador de la supresión fue subclonado desde el plasmidio anterior como un

fragmento Sal l/Xba I en el vector suicida pCVD442 para obtener el plasmidio pSAmshA.

El plasmidio pSAmshA fue utilizado para suprimir el gen mshA del cromosoma de cepas vacunales de V. cho/erae mediante una metodología tradicional de reemplazamiento alélico. Para ello, pSAmshA fue introducido en la cepa movilizadora SM10, pir y movilizado hacia V. cholera mediante un procedimiento de conjugación bacteriana. Los clones resultantes fueron seleccionados por su resistencia al antibiótico ampicillina en placas de medio LB supiementadas con ampicillina (100 Lglml). La mayoría de estos clones surgen por integración del plasmidio al cromosoma de los vibrios receptores mediante un evento de recombinación homológa entre uno de los fragmentos flanqueantes al gen mshA del cromosoma y el del plasmidio pSAmshA, dando origen a un cointegrado entre ambos. Este evento fue verificado mediante un experimento de Southern blot, en el cual el ADN total de 10 clones fue digerido con la enzima de restricción Sma I e hibridado con una sonda obtenida a partir del plasmidio pSAmshA (inserto Sal l/Xba 1). Los clones de nuestro interés son aquellas que originan una banda de 21 000 pares de nucleótidos. Un control similar de la cepa madre origina en este mismo experimento una banda de 13 000 pares de nucleótidos. Los clones apropiados fueron conservados inmediatamente en LB glicerol a-70°C.

Luego 3 de ellos fueron cultivados en ausencia de presión selectiva de antibióticos para permitir que un evento de recombinación homóloga eliminara la duplicación genética existente. Esto puede ocurrir mediante supresión de la estructura genética original (gen mshA intacto) y reemplazamiento por la estructura genética en el plasmidio (gen mshA suprimido). Los clones en los cuales el gen mutado reemplazó al gen intacto fueron analizados por Southern blot e identificados porque generan una banda de 12 000 pares de nucleótidos. Finalmente, los clones en los que el gen mshA fue suprimido fueron seleccionados y conservados apropiadamente como candidatos vacunales (congelados a-80°C en LB suplementado con glicerol 20%). Este procedimiento fue realizado con cada uno de los clones en que se construyó un mutante de supresión en mshA.

Caracterización serolóqica. Luego de la introducción de cada mutación en las cepas vacunales descritas en este documento, cada derivado fue

chequeado para la expresión correcta del lipopolisacárido correspondiente al serotipo de partida. Para ello las células fueron recogidas de una placa fresca, resuspendidas en salina (NaCI, 0.9%) e inmediatamente examinadas con un suero de aglutinación apropiado, específico para el serotipaje de vibrios Ogawa, naba u 0139.

La respuesta inmune mayoritaria generada por una vacuna anticólera, es contra el LPS, por tanto la expresión del antígeno correspondiente a cada una de las cepas presentadas en esta invención fue confirmada por la aglutinación con los antisueros específicos.

Ensayo de colonización del ratón lactante. El ensayo de colonización en ratón lactante (Herrington y cols., J. Exper. Med. 168 : 1487-1492,1988) fue utilizado para conocer la habilidad colonizadora de cada cepa. Un inóculo de 105-1 o6 vibrios en un volumen de 50 LI fue suministrado por vía orogástrica a grupos de al menos 5 ratones lactates. Luego de 18-24 horas a 30 C los ratones fueron sacrificados, el intestino fue extraído y homogenizado, y diluciones apropiadas fueron plaqueadas en medios bacteriológicos apropiados para el crecimiento de los mutantes.

Tabla 2. Capacidad colonizadora de las cepas vacunales de la presente solicitud de invención. Cepa Inóculo BLR01t0x102. \CTXcp./iap BLR02 2. 0 x 10''4. 2 x 10'VGJckX, W? BLR03 1. 2 x 10 0 x 103 , mshA EMGÓ1'3. 'ACTX./ EMG02 2. 5 x 10 0 x 106 X, hap : : ce/A, EMG03 4. 0 x 105 5. 0 x k, : : JCGO..... . p5..... .. , JCG02 1. x lo, 6. 0 x 10'CTX,. JCG03 . ap : ce/A, EVD01 3. 0 x 10'3, 0 x 105 X, : celA, KMD01 1. 0 7. 0 , : celA, mshA KMD02 2. 0 x 10 0 x 106 , : celA, mshA ESP06 1. 7 JCG03 ESP01 5. 0 VGJkXh, ESP02 6. 0 , ESP04 8. 0 VC0934_.,..,." . ...... .. . g-.-... -. ..----.. . -.-............ EVD02 2. 8 x 3. 1 x 106 X4, : : celA, ESP03 1. 5 x 0 x 10 , KMD03 2. 3x hap : ESP05 2. 1 , TLP01 2. 3x106 TLP02 3. 4 9. 4x TLP03 2. 7x 8. 8 : : celA, metF, AmshA

Todas las cepas muestran una capacidad colonizadora apropiada para ser empleadas como candidatos vacunales vivos. Téngase en cuenta que la colonización es necesaria para generar una respuesta inmunológica fuerte porque la multiplicación local de la bacteria potencia la duración de la interacción de la bacteria con el sistema inmune mucosai. En este caso, aunque no existe un modelo perfecto para cólera, el ratón lactante provee una aproximación apropiada de lo que puede ser la colonización posterior de cada cepa en los humanos posteriormente.

Ensayo de motilidad. Las células de una colonia bien aislada se cargan en la punta de una asa de platino desde una placa maestra hacia una placa para detección de la motilidad (LB, agar 0.4%), introduciendo la punta del asa 2-3 mm en el agar. El diámetro de dispersión de cada colonia en el agar suave a 30°C se mide a las 24 horas de incubación. El criterio de motilidad se toma como sigue. Una cepa bacteriana que alcance un diámetro de 3 mm o menos desde el punto de inoculación es considerada no mótii. Una cepa bacteriana que se dispersa en un diámetro mayor de 3 mm es considerada mótil. Todas las cepas contenidas en esta invención resultaron ser mótiles.

Ejemplo 6. Métodos de selección y construcción de cepas vacunales útiles para ser modificadas posteriormente mediante la introducción de las modificaciones objeto de la presente invención.

Cinco cepas patogénicas de nuestra colección fueron seleccionadas como cepas de partida debido a que no poseen secuencias de hibridación con VGJ (P. Estas cepas son V. cholera C7258 (01, El Tor, Ogawa, Perú, 1991), C6706 (01, El Tor, Inaba, Perú, 1991), CRC266 (0139, La India, 1999), CA385 (Clásico, Ogawa) y CA401 (Clásico, Inaba).

Los procedimientos mencionados o las mutaciones introducidas en V. cholera que se describen en el presente ejemplo no son objeto de invención sino descripción detallada de las características y los métodos de obtención de cepas que son útiles para construir directamente a partir de ellas los

mutantes que se caractericen por estar totalmente protegidos contra la infección por VGJ (P, objeto de la presente solicitud de invención, utilizando los métodos descritos en los ejemplos 4 y 5.

A continuación se describen los plasmidios suicidas utilizados en la introducción de diferentes mutaciones en V. cholera por reemplazamiento alélico, para originar cepas elegibles para ser modificadas con los procedimientos de la presente solicitud de invención. Téngase en cuenta que las cepas reivindicadas en la presente solicitud de invención tienen, además de una mutación que impide la expresión superficial de la fimbria MSHA, (a) una mutación supresora en los genes de la toxina del cólera y el fago CTX# y (b) el gen hap insercionalmente inactivado con el gen celA. Pueden además opcionalmente presentar mutaciones en los genes (c) IysA, (d) metF, (e) VC0934 (codificante de una transferasa de glucosilo) y (f) thyA.

(a) Para construir cepas atoxigénicas por supresión de los genes de la toxina del cólera y ei fago CTX# se utilizó ei plasmidio suicida pJAF (Benitez y cols, 1996, Archives of Medical Research, Vol 27, No 3, pp. 275-283). Ei plasmidio pJAF se obtuvo partiendo del plasmidio pBB6 (Baudry y cols, 1991, Infection and Immunity 60:428), el cual contiene un inserto de V. cholera 569B, de 5.1 kb que codifica los genes ace, zot, ctxA y ctxB. Debido a la ausencia de un RS1 hacia la zona 3'del operón ctxAB en esta cepa, el sitio EcuRi cuesta abajo dei operón está en el ADN cromosoma) flanqueante de función no definida. El plasmidio pBB6 fue modificado mediante una supresión del fragmento Scal interno al inserto para crear el plasmidio pBSCT5, el cual ahora contiene una región mutada por supresión del gen zot y ctxA. El sitio Pstl de pBSCT5 fue convertido en EcoRI mediante la inserción de un linker EcoRI para obtener pBSCT64. Luego, el fragmento EcoRI resultante fue subclonado hacia el sitio EcoRI de pGP704 para obtener pAJF.

(b) Para construir cepas afectadas en la expresión de HA/P se utilizó el plasmidio suicida pGPH6. Este plasmidio fue construido en diferentes pasos.

Primero, el plasmidio pCH2 (Hase y Finkelstein, 1991, J. Bacteriology 173 : 3311-3317) que contiene el gen hap en un fragmento Hindlll, de 3.2 kb, procedente de la cepa V. cholera 3083. Este plasmidio fue linealizado por el sitio Sidi, el cual se encuentra interno al gen hap y un fragmento Hindlll de plasmidio pCT104 (Cornet y cols, 1983, Biotechnology 1 : 589-594) de 3.2 kb,

el cual contiene el gen celA, fue subclonado en este sitio para obtener pAH3.

El inserto Hindlll de pAH3, el cual contiene el gen hap insercionalmente inactivado con el gen celA, fue subclonado en forma de fragmento Hindlll hacia un derivado de pUC19 que tiene el sitio de clonación múltiple flanqueado por sitios BgIII para obtener pIJHCI. El fragmento Bgl II de este último fue subclonado hacia pGP704 para obtener pGPH6, ei cual porta un fragmento de # 6. 4 kb con la estructura genética hap : : celA, donde el gen hap no es funcional.

(c) y (d) Para construir mutantes de supresión en los genes lysA o metF, se utilizaron los plasmidios pCV/ysAt1 o pCVMACIai. Para obtener estos, los genes IysA y metF fueron amplificados por la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), a partir del genoma de la cepa V. cholera C7258. Un par de oligonucleótidos específicos para cada gen fue diseñado y obtenido del Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología, Ciudad de La Habana, Cuba. Las secuencias de los oligonucleótidos utilizados para amplificar al gen IysA fueron : (P 6488) 5'-GTA AAT CAC GCT ACT AAG-3'y (P 6487) 5'-AGA AAA ATG GAA ATGC-3'y para metF : (P 5872) 5'-AGA GCA TGC GGC ATG GC-3'y (P 5873) 5'-ATA CTG CAG CTC GTC GAA ATG GCG-3'. Las secuencias amplificadas fueron clonadas en los plasmidios pGEM#T (Promega) y PIJ2925 (Janssen y cols, 1993, Gene 124.133-134), obteniéndose los plasmidios recombinantes pGlysA3 y pMF29, conteniendo los genes activos IysA y metF, respectivamente. La identidad de cada gen fue chequeada por secuenciación nucleotídica.

Los genes metF y IysA clonados fueron mutados in vitro por deleción del fragmento interno Clal de 246 pares de bases y Pstl/Accl de 106 pb, respectivamente. En este último caso se diseñó una estrategia para mantener el marco abierto de lectura de gen y evitar posibles efectos polares durante y después de la construcción de un mutante IysA de V. cholera. Cada gen inactivado fue clonado como un fragmento Bgl II en el vector suicida pCVD442 para su posterior introducción en las cepas vacunales de V. cholera de interés. El derivado con el gen IysA fue denominado pCVlysAt1 y el derivado con el gen metF, pCVMdClal.

(e) Para construir mutantes de supresión en el gen VC0934 fue construido y utilizado el plasmidio suicida pCVDA34. Para ello, el gen VC0934 fue amplificado mediante PCR usando como molde el ADN de la cepa N16961 y los siguientes oligonucleótidos: 5'-GCA TGC GTC TAG TGA TGA AGG-3'y 5'-TCT AGA CTG TCT TAA TAC GC-3'. El producto de PCR fue clonado en el plasmidio pGEM5Zf T-vector obteniéndose de esta forma el plasmidio pGEM34, dentro del cual se realizó una deleción interna en el gen VC0934 de 270 pb NarllBglll. Después de un tratamiento con klenow y posterior religamiento se obtuvo el plasmidio pG34. El gen inactivado se subclonó en el vector suicida pCVD442 digerido con las enzimas de restricción Sall/Sphl resultando el plasmidio pCV#34 que fue utilizado luego en el reemplazamiento alélico del gen salvaje.

(f) Para construir mutantes de supresión en el gen thyA fue utilizado el plasmidio suicida pEST. Para construir este piasmidio el gen thyA de la cepa V. cholera C7258 fue clonado en pBR322 como un fragmento EcoRI-HindIII proveniente del ADN cromosomal, para obtener pVT1 (Valle y cols, 2000, Infection and Immunity 68, No 11, pp6411-6418). Un fragmento de 300 pares de bases interno al gen thyA, comprendido entre los sitios Bglll y Mlul, fue delecionado de este plasmidio para obtener pVMT1, donde la deleción entre los sitios de restricción Bgill y MILII eliminó el fragmento de ADN que codifica para los amlnoácldos desde el/al 105 de la protein lirjliclilatú sintasa El gen thyA mutante fue escindido como un fragmento EcoRI-Hindlll, el cual fue romado en sus extremos y luego clonado en el sitio Smal de pUC19 en la misma dirección de la ß-galactosidasa para obtener pVT9. El gen mutado fue subclonado como un fragmento Sacl desde pVT9 hacia pCVD442 para obtener pEST, el cual fue utilizado para realizar el reemplazamiento alélico en las cepas de interés.

Los vectores anteriores constituyen un sistema de módulos que pueden ser empleados para introducir secuencialmente mutaciones en candidatos vacunales de V. cholerae.

El reemplazamiento alélico, utilizando dichos vectores, se efectúa utilizando dichos vectores de acuerdo con los siguientes cinco pasos :

En un primer paso, el vector suicida de que se trate, conteniendo el gen apropiado inactivado por cualquiera de las supresiones anteriores, es transferido por conjugación de E coli SM10Xpir hacia la cepa V. cholera que se desea modificar, para producir un cointegrado resistente a ampicillina. Los clones resultantes de la conjugación son seleccionados en placas de LB suplementadas con ampicillina (100 tg/ml).

Este primer paso se efectúa de la siguiente manera : La cepa donante, SM10Spir, transformada con el vector suicida de interés, es crecida en una placa de LB (NaCI, 10 g/I ; Triptona bacteriológica, 10 g/l, y extracto de levadura, 5 g/l), suplementada con ampicillina (100 yLg/ml), y la cepa receptora, la cepa de V. cholera que se desea modificar, es crecida en una placa de LB sólido. La condición de crecimiento es 37 C durante toda una noche. Una colonia de la cepa donante y una de la cepa receptora son estriadas en una nueva piaca de LB, estriando primero la cepa receptora (V. cholera) en una dirección e inmediatamente después la cepa donante (SM10Xpir, transformada con el vector suicida de interés) en la dirección perpendicular, de manera que las nuevas estrías crucen por encima de las anteriores. Ei estriado perpendicular superpuesto garantiza que ambas cepas crezcan en pleno contacto. A continuación, las placas son incubadas a 37 C durante 12 horas, al cabo de las cuales, el cultivo es recogido en 5 mi de NaCl (0.9 %) y 200 µl de diluciones 102, 103, 104 y 105 son sembrados en placas de LB suplementadas con ampicillina y polimixina, para seleccionar los clones de V. cholera que recibieron el plasmidio suicida y contraseleccionar la cepa donante E. coli SM10Spir. Diez clones resistentes de cada proceso son conservados por congelación a-80°C en LB con glicerol al 20 % para ser analizados en el segundo paso.

En un segundo paso, mediante una hibridación de Southern con una sonda específica para el gen a manipular, se estudia la estructura del cointegrado en los clones conservados en el paso anterior. Aquellos clones, en los que el plasmidio suicida se insertó por recombinación homóloga en el gen de interés son identificados porque presentan en la estructura cromosómica particular-una copia del alelo natural y una copia mutada, separadas únicamente por secuencias de vector plasmídico. Esta estructura

particular genera un patrón de Southern específico que permite su identificación. Los clones apropiadas son conservadas por congelación a- 80°C en LB glicerol.

Este segundo paso se efectúa de la siguiente forma : Primeramente el ADN total de cada clona conservada en el segundo paso, es purificado mediante un procedimiento tradicional de purificación (Ausubel y cols, Short protocols in Molecular Biology, third edition, 1992, unit 2.4, page 2-11, basic protocol). También se purifica el ADN total de la cepa madre que originó los diez clones. Luego, el ADN total de las diez clones y de la cepa madre es digerido con las enzimas de restricción apropiadas, señaladas más adelante en este documento. 1 tg del ADN digerido de cada clona y de la cepa madre es aplicado en once carries paralelos de un gel de agarosa y los fragmentos de diferentes tallas son separados mediante electroforesis. Ei ADN contenido en el gel, después de la corrida, es transferido a una membrana de nylon para Southern blot mediante un procedimiento de transferencia alcalina por capilaridad descendente (Ausubel y cols, Short protocols in Molecular Biology, third edition, 1992, unit 2.9 A, page 2-30, alternate protocol 1).

Una vez en la membrana, el ADN es fijado mediante incubación a 80 C durante 15 minutos. Los sitios libres de la membrana son luego bloqueados mediante un paso de prehibridación e inmediatamente ei ADN en la membrana es hibridado con una sonda específica para cada mutación de supresión a estudiar.

A continuación se describe en detalle, la enzima de restricción, la sonda (siempre marcada con digoxigenina por el método de síntesis asistida por oligonucleótidos hexaméricos de secuencia aleatorizada) y la talla del fragmento de hibridación que identifica la estructura deseada en el cointegrado de cada clona, según cada uno de los genes en los que se desea obtener el mutante de supresión : a) Para los mutantes de supresión de los genes del fago CTXcP, el ADN total de los clones es digerido con la enzima de restricción Hind lil, y una vez en la membrana es hibridado con una sonda obtenida a partir del fragmento Pst I-EcoR I del plasmidio pBB6. Los ciones de interés son las que tienen la estructura genética que origina dos bandas en el Southern blot, una de 10 000 pares de nucleótidos y otra de 7 000 pares

de nucleótidos. Como control la cepa madre origina una sola banda de 17 000 pares de nucleótidos en el mismo experimento de Southern blot. b) Para los mutantes de supresión del gen hap, el ADN total de los clones es digerido con la enzima de restricción Xho 1, y una vez en la membrana es hibridado una sonda obtenida a partir del inserto Hind III de 3 200 pares de nucleótidos presente en el piasmidio pCH2 que contiene el gen hap. Los clones de interés son las que tienen la estructura genética que origina una sola banda en el Southern blot, de 16 000 pares de nucleótidos. Como control la cepa madre genera una sola banda de 6 000 pares de nucleótidos en el mismo experimento de Southern blot. c) Para los mutantes de supresión de gen IysA, el ADN total de los clones es digerido con là enzima de restricción Xho 1, y una vez en la membrana es hibridado con una sonda obtenida a partir del fragmento Sph l/Sma I de plamidio pCVlysA#1, conteniendo el gen IysA mutado. Los clones de interés son las que tienen la estructura genética que origina una sola banda en el Southern blot, de 12 500 pares de nucleótidos. Como control la cepa madre genera uns sola banda de 5 200 pares de nucleótidos en el mismo experimento de Southern blot. d) Para los mutantes de supresión en el gen metF, el ADN total de los clones es digerido con la enzima de restricción Nco 1, y una vez en la membrana es hibridado con una sonda obtenida a partir de ! fragmento Bgl II de pCVAa/al, conteniendo el gen i-r7etF mutado. Los clones de interés son las que tienen la estructura genética que origina una sola banda en el Southern blot, de 12 000 pares de nucleótidos. Como control la cepa madre genera una sola banda de 5 000 pares de nucleótidos en el mismo experimento de Southern blot. e) Para los mutantes de supresión en el gen VC0934, el ADN total de los clones es digerido con la enzima de restricción Ava 1, y una vez en la membrana es hibridado con una sonda obtenida a partir del fragmento Sal IlSph I de pCVDA34, conteniendo el gen VC0934 mutado. Los clones de interés son las que tienen la estructura genética que origina dos bandas en el Southern blot, una de 1 600 ó 1 900 y otra de 8 200 ó 7 900 pares de nucleótidos. Como control la cepa madre genera una sola

banda de 3 500 pares de nucleótidos en el mismo experimento de Southern. f) Para los mutantes de supresión en el gen thyA, el ADN total de los clones es digerido con la enzima de restricción Bstx 1, y una vez en la membrana es hibridado con una sonda obtenida a partir del fragmento Sac I de pEST1, conteniendo el gen thyA mutado. Los clones de interés son las que tienen la estructura genética que origina una sola banda en el Southern blot, de 9 600 pares de nucleótidos. Como control la cepa madre genera una sola banda de 2 400 pares de nucleótidos en el mismo experimento de Southern blot.

En ei tercer paso del procedimiento, 3 clones de interés, conteniendo un cointegrado de una de las estructuras citadas, son cultivadas en ausencia de la presión selectiva del antibiótico para permitir la escisión del vector suicida mediante recombinación homológa y la amplificación de los clones resultantes. En dichas clones la escisión del vector suicida permite la pérdida de una de las dos copias del gen, la mutada o la natural, de la dotación genética de la bacteria.

En un cuarto paso de procedimiento, diluciones de los cultivos anteriores son sembrados en placas para obtener colonias aisladas, las cigales son entonces replicaclas por independiente hacia placas suplementadas con ampicillina para evaluar cuales clones se convirtieron en sensibles a la ampicillina. Dichas clones, sensibles a ampcillina, son conservados por congelación, como se describió anteriormente.

En un quinto paso, mediante un estudio de Southern blot con las sondas específicas para cada uno de los genes de interés (descritas en a, b, c, d, e, y f) se verifica cuales clones retuvieron en el cromosoma la copia mutada del alelo de interés. Estos clones de interés son expandidos para crear un banco de trabajo y realizar su posterior caracterización, así como la introducción de las modificaciones objeto de protección en la presente solicitud de invención.

A continuación se describe en detalle, la enzima de restricción, la sonda y la talla del fragmento de hibridación que identifica la estructura

deseada el mutante de supresión de cada clon, según cada uno de los genes en los que se desea obtener el mutante de supresión : a) Para los mutantes de supresión de los genes del fago CTX (P, el ADN total de los clones es digerido con la enzima de restricción Hind III, y una vez en la membrana es hibridado con una sonda obtenida a partir del fragmento Pst I-EcoR I del plasmidio pBB6. Los clones de interés son las que tienen la estructura genética que no origina bandas en el Southern blot. b) Para los mutantes de supresión del gen hap, el ADN total de los clones es digerido con la enzima de restricción Xho 1, y una vez en la membrana es hibridado una sonda obtenida a partir del inserto Hind III de 3 200 pares de nucleótidos presente en el plasmidio pCH2 que contiene el gen hap. Los clones de interés son las que tienen la estructura genética que origina una sola banda en el Southern blot, de 9 000 pares de nucleótidos. c) Para los mutantes de supresión del gen IysA, el ADN total de los clones es digerido con la enzima de restricción Xho 1, y una vez en la membrana es hibridado con una sonda obtenida a partir del fragmento Sp a 1 de plamidio pCVlysA#1, conteniendo el gen IysA mutado. Los clones de interés son las que tienen la estructura genética que origina una sola banda en el Southern blot, de 5 000 pares de nucleótidos. d) Para los mutantes de supresión en el gen metF, el ADN total de los clones es digerido con la enzima de restricción Nco 1, y una vez en la membrana es hibridado con una sonda obtenida a partir del fragmento Bg/11 de pCVM4Clal, conteniendo el gen irretF mutado. Los clones de interés son las que tienen la estructura genética que origina una sola banda en el Southern blot, de 4 700 pares de nucleótidos. e) Para los mutantes de supresión en el gen VC0934, el ADN total de los clones es digerido con la enzima de restricción Ava 1, y una vez en la

membrana es hibridado con una sonda obtenida a partir del fragmento Sal IlSph I de pCVDA34, conteniendo el gen VC0934 mutado. Los clones de interés son las que tienen la estructura genética que origina una banda en el Southern blot, de 3 200 pares de nucleótidos. f) Para los mutantes de supresión en el gen thyA, el ADN total de los clones es digerido con la enzima de restricción Bstx 1, y una vez en la membrana es hibridado con una sonda obtenida a partir del fragmento Sac I de pEST1, conteniendo el gen thyA mutado. Los clones de interés son las que tienen la estructura genética que origina una sola banda en el Southern biot, de 2 100 pares de nucleótidos.

Ejemplo 6. Métodos para conservar cepas vacunales mediante liofilización.

En el ejemplo que sigue el cultivo del microorganismo fue realizado en caldo LB a 37°C en zaranda orbital termostatada, con una agitación situada entre 150 y 250 rpm hasta alcanzar la fase logarítmica. Posteriormente, la biomasa fue separada empleando la centrifugación entre 5000 y 8000 rpm a 4°C durante 10-20 minutos y fue mezclada con las formulaciones que mostraron buenas características para la protección de microorganismo, de modo que la concentración celular estuviese entre 108 y 109 células mL-', a razón de 2mL por frasco dei tipo 10R. El ciclo de liofilización comprendió la congelación profunda del material, la realización de secado primario manteniendo cada producto entre-30 °C y-39 °C por espacio de 8 a 12 horas y para el secado secundario la temperatura dei producto se mantuvo entre 18 °C y 25 °C por no más de 12 horas. Se definió la pérdida de viabilidad como la diferencia logarítmica de la UFC/mL antes y después de la liofilización o antes y después del almacenamiento del material liofilizado cuando la disolución del producto se efectuó en una solución de bicarbonato de sodio al 1.33%.

Formulación L+E+S Empleando una formulación del tipo L (5.0%), E (2.0%), S (2.0%), se sometieron a un mismo proceso de liofilización, las cepas BLR01, JCG03 y ESP05. La congelación se efectuó a-60°C. Durante el secado primario, la temperatura del producto se mantuvo a-32°C por 10 horas y en el secado

secundario la temperatura del mismo fue de 22°C por espacio de 12 horas.

La disolución en una solución de bicarbonato de sodio al 1.33% fue instantánea. La pérdida de la viabilidad calculada inmediatamente después de la disolución, con respecto a la concentración de células vivas antes de la liofilización resultó ser de 0.30, 0.43, y 0.60 órdenes logarítmicos respectivamente.

Comparación de las variantes L+P+S y L+E+S con la de leche+peptona +sorbitol.

La cepa JCG03 fue liofilizada empleando tanto una formulación del tipo L (6.0%), P (2.0%), S (2.0%), como L (5.5%), E (1.8%), S (1.6%). A tono comparativo, dicha cepa fue también liofilizada en una formulación compuesta por leche descremada al 6.0%, peptona al 2.0% y sorbitol al 2.0%. La congelación se efectuó a-60°C. Durante el secado primario, la temperatura del producto se mantuvo a-33°C por 12 horas y en el secado secundario la temperatura del mismo fue de 20°C por espacio de 14 horas.

La disolución en una solución de bicarbonato de sodio al 1.33% fue instantánea cuando fue liofilizada en las formulaciones del tipo L+P+S o L+E+S y algo más lenta cuando fue liofilizada en la formulación de comparación. La pérdida de la viabilidad calculada inmediatamente después de la disolución, con respecto a la concentración de células vivas antes cle la liofilización resultó ser de 0.48, 0.52 y 0.55 órdenes logarítmicos respectivamente, significativamente semejantes.

Efectos de la humedad y el oxígeno La cepa JCG03 liofilizada en las tres formulaciones mencionadas en el acápite anterior, fue sometida a la acción simultánea de la humedad y del oxígeno inmediatamente después de ser liofilizada. Esto se logró, al ser confinadas las muestras, durante 3 días, al ambiente reinante en desecadoras de cristal estériles, a 25°C, bajo una humedad relativa del 11% (creada por una solución saturada de cloruro de litio). La pérdida de viabilidad resultó ser de 1.61, 1.10 y 3.43 órdenes logarítmicos respectivamente, por lo que las formulaciones objeto de esta invención garantizan mucha mayor protección ante la humedad y el oxígeno que la empleada en la comparación.

ttecto de la temperatura de almacenamiento.

Las cepas TLP01, JCG01 y ESP05 fueron liofilizadas empleando una formulación de tipo L (5.5%), E (2.0%), S (2.0%). La congelación se efectuó a - 58°C. Durante el secado primario, la temperatura del producto se mantuvo a - 30°C por 12 horas y en el secado secundario la temperatura del mismo fue de 20°C por espacio de 14 horas. La disolución en una solución de bicarbonato de sodio al 1.33% fue instantánea. La pérdida de la viabilidad calculada inmediatamente después de la disolución, con respecto a la concentración de células vivas antes de la liofilización resultó ser de 0.43, 0.55 y 0.44 orden logarítmico respectivamente. Se almacenaron 1 año a 8°C y a-20°C. La tabla 2 recoge los resultados obtenidos en cuanto a viabilidad.

Tabla 3. Pérdida de Viabilidad. (1 año de almacenamiento) Cepa 8°C-20°C TLP01 1.07 0. 64 <BR> <BR> JCG01 <BR> 1. 02 ESP05 0.91 0.55 Ejemplo 8. Cepas de la presente invención y sus características.

Las cepas de la presente invención han sido depositada en la Begium Coordinated Collection of f licroorganisms (BCCMi). Laboratorium voor Microbiologie-Bacterienverzameling (LMG) : Vibrio cholera JCG01 (LMG P-22149) Vibrio cholera JCG02 (LMG P-22150) Vibrio cholera JCG03 (LMG P-22151) Vibrio cholera KMD01 (LMG P-22153) Vibrio cholera KMD02 (LMG P-22154) Vibrio cholera KMD03 (LMG P-22155) Vibrio cholera JCG04 (LMG P-22152) Vibrio cholera ESP01 (LMG P-22156) Vibrio cholera ESP02 (LMG P-22157) Vibrio cholera ESP03 (LMG P-22158) Vibrio cholera RAF01 (LMG P-22159) Vibrio cholerae TLP01 (LMG P-22160) Vibrio cholera TLP02 (LMG P-22161) y Vibrio cholera TLP03 (LMG P-22162) Las mismas se describen a continuación, en la Tabla 4.

Tabla 4. Cepas vacunales de la presente invención.

Parental Cepa Biotipo/Serotipo Genotipo relevante.

Patógeno BLR01 CA385 Clásico/Ogawa ACT, hap BLR02 CA385 Clásico/Ogawa ACT, : : celA, BLR03 CA385 Clásico/Ogawa EMG01 CA401 Clásico/Inaba ACTE4), hap : : celA, AmshA EMG02 CA401 Clásico/Inaba ACTX, ap , EMG03 CA401 Clásico/Inaba , JCG01 C7258 El Tor/Ogawa ACT, hap JCG02 C7258 El Tor/Ogawa aCTX<, : celA, MSHA- JCG03 C7258 El Tor/Ogawa ACTXct), ap : celA, AmshA EVD01 C7258 El Tor/Ogawa ACTX KMD01 C7258 El Tor/Ogawa ACT, : : celA, metF, AmshA KMD02 C7258 El Tor/Ogawa ACT) hap : celA, ESP06 C7258 El Tor/Ogawa ACT) hap JCG03 C7258 El Tor/Ogawa/-\CTXcP, : celA, At-nshA ESP01 C7258 El Tor/Ogawa ACT), hap : : celA, metF, AmshA ESP02 C7258 El Tor/Ogawa ACT), hap ESP04 C7258 El Tor/Ogawa _CTX¢, RAF01 C6706 El Tor/Inaba , : celA, Ams/7A EVD02 C6706 El Tor/Inaba ACTX ESP03 C6706 El Tor/l : : celA, metF, AmshA KMD03 C6706 El Tor/Inaba ACTX<, ESP05 C6706 El Tor/lnaba. TLP01 CRC266 013J. TLP02 CRC266 0139 ACT), hap : : celA, TLP03 _RC266

A continuación sigue una descripción de las figuras : Figura 1. Apariencia del fago VGJQ al microscopio electrónico. En esta figura se observa una imagen aumentada 32 000 veces de fago VGJ purificado a partir del sobrenadante de la cepa 569B infectada.

Figura 2. Diagrama del genoma fago híbrido HybP$-kn que tiene muy alta potencialidad para trasmitir los genes de la toxina de cólera.

Figura 3. Esquema de la manipulación genética utilizada para suprimir el gen mshA de cepas vacunales de V. cholera y del vector suicida pAMSHA utilizado en el procedimiento.

Figura 4. Sobrevivencia de ratones lactantes inoculados con una cepa atenuada y su derivado infectado con HybP (P-Kn. Conversión a la virulencia por este fago.

Ventais La presente invención nos provee con una metodología para proteger los candidatos vacunales vivos de la readquisición de los genes de la toxina de cólera y otras toxinas del bacteriófago CTX<), y por tanto de la conversión a la virulencia.

Igualmente nos provee de la información necesaria para asegurar que las cepas vacunales no dispersen el fago CTX$ en caso de readquisición de mismo, por transducción especializada mediada por VGJ (P.

La presente invención nos provee la aplicación de los mutantes MSHA como candidatos vacunales de V. cholera, los cuales muestran mejores índices de seguridad ambiental dada su resistencia a la infección con CTXO asistida por VGJCP.

También nos provee con una nueva característica a tener en cuenta durante el diseño y construcción de candidatos vacunales vivos para la inmunización oral contra el cólera para lograr vacunas vivas provistas de una mejor seguridad ambiental, es decir que no sean capaces de dispersar los genes de CTX# y de la toxina del cólera en caso de readquisición Las características anteriores son aplicables a candidatos vacunales de cólera ya existentes que hayan demostrado índices disminuidos de reactogenicidad hasta niveles aceptables como vacunas vivas orales contra el cólera para reducir su potencial impacto ambiental.

Se proveen además formulaciones que permiten la conservación por liofilización de estas cepas vacunales de Vibrio cholera, con mutaciones genéticas específicas que incrementan su seguridad ambiental, que garantizan una mejor tolerabilidad del agente vacuna) liofilizado, a la presencia temporal de oxígeno y humedad en el envase.

Estas formulaciones garantizan también una resuspensión instantánea del agente liofilizado en una solución de bicarbonato de sodio, facilitando el manejo y protección del agente vacunal vivo durante este proceso, así como

un mejoramiento en las características organolépticas, fundamentalmente en lo relacionado con el aspecto de la pastilla liofilizada y la transparencia luego de la resuspensión del agente vacunal vivo.

Una de las formulaciones que se provee para la conservación por liofilización de cepas vacunales de Vibrio cholera está desprovista de los usuales componentes bovinos presentes en formulaciones para la liofilización de vacunas cuyo destino final es el consumo humano.

Lista de secuencia <110> Centro Nacional de Investigaciones Científicas < 120> Cepas atenuadas de Vibrio cholera mejoradas en su seguridad ambiental presentadas en forma liofilizada para la vacunación por vía oral.

< 130> VGJphi <141> 2004-02-20 <150> CU 2003-0039 <151> 2003-02-20 <150> CU 2003-0084 <151> 2003-04-17 <160> 1 <170> Versión de Patente 3.1 <BR> <BR> <210> 1 <BR> <211 > 7542 < 212> DNA < 213> Fago filamentoso de Vibrio cholera <220> <221 > ORF359 CDS < 222> (1). . (1077) < 223> Similar a proteína de la replicación, pll, de otros fagos filamen tosos < 220> <221> ORF112 CDS < 222> (1085). . (1420) < 223> Proteína hipotética < 220> < 221> ORF81 CDS < 222> (1433). . (1675) < 223> Proteína hipotética < 220> <221> ORF44 CDS < 222> (1690). . (1821) < 223> Similar a proteína mayoritaria dela Cápsida, pVIII, de otros fago s filamentosos < 220> <221 > ORF29 CDS < 222> (1839). . (1925) < 223> Proteína hipotética < 220> <221 > ORF493 CDS < 222> (1954). . (3432) < 223> Similar a proteína minoritaria de la cápsida, pill, de otros fago s filamentosos < 220> <221 > ORF80 CDS < 222> (3510). . (3749) < 223> Proteína hipotética < 220> <221 > ORF384 CDS < 222> (3755). . (4906) < 223> Similar a proteína de ensamblaje, pl, deotros fagos filamentosos < 220> <221> ORF104 CDS <222> (5232)..(5543) < 223> Similar a proteína de ensamblaje, pl, de otros fagos filamentosos < 220> < 221> ORF67 CDS < 222> (7328). . (7528) < 223> Proteína hipotética < 220> <221> ORF136 CDS < 222> (6105). . (6112) < 223> Cadena complementaria Posible regulador transcripcional < 220> <221> ORF154 CDS < 222> (6439). . (6900) < 223> Cadena complementaria Posible regulador transcripcional <220> <221> <222> (6439).. (6900) <223> Cadena complementaria Proteína hipotética <400> 1 atgatacggt tcgccctgtc aaagttgacc acttggcttt tactttcgcc tatgcggact 60 tgcgccactt ggacaaaagc aacgaccaag actttatcaa tctacagatg cccgtttatc 120 acgagccaaa gacccgaacc aaggaacaag gcgcggtgtg ctctaccttg gaacaaatcg 180 agcatcatat ggaagcgcac cgaaacaaag tgtccaagat gctctttcat cgctttgatt 240 tgttcatgtc caaaatcatg gctttcgtta tcgcctatgc gtggtcgtgg ccttcatggt 300 tacaacgatt ctatggtcat tctcgatatg accggacaag ttgagtgtgg ccttgtcgga 360 attggcggaa acaacgatac cgtttttgtc caaatcaacg gcacggggtg caccaaactt 420 ttcgaccgta tcgactctaa gaagcttcat tggtggctcg ctcaggttct tggcattact 480 cgcttagttc gtctcgactt ggccgtggac gattacaccg gaaacttcga cgccaagtat 540 gcagagaaat gtttttatga gggagcattt cgcactgctc cacgggggca aggtccctca 600 atggttcctc ataaacgcat tacagaaaac ggcgctttga tggaagaagc aacgattgtc 660 ggctctcgtt cctcggcgat ttactggcgt atctacaaca aaaagcttga gcaaaaaatt 720 actgaccctg acctgatttg gtatcgaaac gaggttgagc tgaaaaagtg cgacatcgag 780 cttttagcca atcctgccgc ctcttttgcg ggtatctgcc ctttcgcggc ctctatcgag 840 tgtacgcctc cggttaagtt ctctcgcaac aaaaaggctc aaggtcttga atttatggct 900 cgcatcgcat gggttcgccg tcaatgtggc gtggcgttag cggaagttat cgccatgacg 960 caaggcgatt taggcgaagc attcgggatg cttatccctc acaaacatag acgccctgac 1020 tttgaattgc tcggcgttcc tgattcatac acacaactga aaaacacact atggagttaa 1080 ggtaatggct aacatcactg gcatcgtcat caaaacattt cctaaatcgg gtaccacgat 1140 tgcagagctg aacgttcttc gccctgttga aaccgtcaac gttgagaagt ttgctcaata 1200 cggtttgggg ctaaacacgg atattccttt caataagcag ccgctgcgta tcgaacctac 1260 ttacgccaag cgtttgattg aaacacgcgc ttttgttcct aaccgtgaat atgacattcg 1320 ctttggtagt aaccctgacg acccattgga agtcgttgct gttgagctca tccccaagga 1380 tgacgacctt aaaaaatact ttactgaaac acttaaaaag taaggaagtt ttatgcctgt 1440 gtgcgctctc ccaaatagtc agggattcct agcggttact gacaagccac tgaatgaatg 1500 tgacggcggt tatgttgctt tcactattca ggattacgac tacttgatga gctacacacg 1560 cataacccca accgatgccg gaacggcctt tagcttcggt tttatggctg tattcgctct 1620 cggttattta tatacctatg ccgtttatat cggtaaaaaa ctcatcaacc tcttataagg 1680 agatacatca tggctgatat ctttggcgca attgattttg caggtgtcgc tgctcttgtt 1740 actgctgctg gtgttgccat cattggcatt actatggctt tcaaaggcat ctcacttggc 1800 aaacgcgctg ttaacaaagc ctaatcggta actgaactat gcttattgcc ctgcatgata 1860 ttcagttaat tattttcgcg ttgctgggtg gcatgtcggg ttttatagct gctctcaact 1920 tccgataaca aaggggctaa cgcccctttt tttatggtta tgtttatgcg caaatttttt 1980 attatctctc ttgtcattag cttatatttc accgttcttc ctgcüttgc tgcttatcag 2040 ttaccttttg accaaacaaa gactttctca actgttcagg ccgccgctga gtattatgtc 2100 aatttacttg gtggtacttc atgcaaggct gacggtaaca ggtttaaaat ttacagagtt 2160 aaatctattg gcgacccctc ttttgttatt caacaagaaa cctatttaga caacaaatgt 2220 caggtctttt catcaaaggg tgatatcagc gttactctta ttgttgttga cgaccctacc 2280 acctgcgagg cttcaaaagg tcaaacagga aaagtcggtt ggaattctta cttctggggc 2340 tcggcaactc catcccgtta tatctgctct tctgcttatg gtggttgtgt tgccctcact 2400 ggtgaccatt tatgtattaa tattgaccct gaagcattga aaaatgaccc gtctctttat 2460 gattgcgatg ctctctatat cgttcaggat actccttgtt ccccttctgg tgattatcca 2520 ttttgtaccg atgagaattg ctcttctttt cttcctgagc cgaatcctaa ccctaaccct 2580 gaaccagagc cggagccaga accccaacca gacccagaac acaatccctc tgacccgaca 2640 gcgccactcc ctggctctgg cggtgaagtc attaacccta ctgttcctcc taaaccaccg 2700 accgaggaaa cgcctaagcc tgacgtagaa acaccagacc ctacacctga ttcaaattct 2760 gacgttgttc aatctgttac cggaatgaat gaggatatga acgagttatt aactcgactc 2820 aattctgaca acaacaagca gcttgatgat gttaacaatc agctcttgca gctcaataca 2880 caatcacaac gtatcgttgc tcagattgcc aaacaggaaa aacaagatgc tgccatctac 2940 gaaaatacaa aggcacttat ccagaacctt aacaaagacg tgaccacggc cgttaacaaa 3000 accaccaatg ccgttaatgc tttgggctct aaagttgatg gcttatccga tgccgtcgat 3060 ggtcttggtg aagatgtatc agcaataaaa gatgtaatta ctaatgttga tacttctggg 3120 gctggtattt ctggcacttg tatagagtct gacacttgta cggggtttta tgaatctggt 3180 tatcctgatg gtatttcagg catattttca cagcattttg aaatcgtctc tgaaagtgtt 3240 actgataccg tcaaagactt tatgaaaatt gatttatctc acgctcaaag gccatcattt 3300 tctattccag ttctccactt tggaaatttc agctttgacg attatataaa ccttgattgg 3360 atatttggct ttgttcgtgt ttgcatgatg gtttcaactg ctttcctatg tcgtaaaata 3420 atattcggag gttaatatgg attgggtaat tgatttattt aaccaagctt atcgagtttc 3480 tttaccgctt attaatcacg cttattgata tgctaaagga tgttttcttg tggcttattg 3540 atggcgttct ttctgccgta aaccttttat tagagaaagc attatcactc atagaaccaa 3600 tggatgtttc ctcttacttg actggaatcc cttccggtgc tgcttgggtt attagcgcca 3660 ttggtatccc tcagtgtctt ggtatgatta tgtcagcaat cattgttcgt atcttattgc 3720 aactcgttcc attcactcgt ttaggttctt aattatgatt tatgcaattg ttggccgtcc 3780 tcgctctggt aagtcatacg agtctgttgt ttatcatatt attcccgccg ttaaatctgg 3840 ccgtaaagtc attacaaata ttcctttaaa tatggatatg tttgtaaagg ttttcggtga 3900 ttcggttaga gatttaatcc gcatcgtcga tgctaaattt aatgaatacg gttcaatgaa 3960 tagaccattt tcaaaggttg atgattatct tgatgactgg cgagatgata aaaaccgcgc 4020 tcctctttat gttattgatg aggctcatat ggttattcca actcgcctcg gtgatcaaag 4080 atacttgagt tctattcaat gcacggttca ttacggcatc gatattatta ttctcactca 4140 aaatttaaga aagattcatg ctgatattag agcaatgatt gagatgactt attactgtgc 4200 taaaaatacc gcattcggca gtaaaaagac ttatacaaaa aaggttcgca tcggtgatac 4260 cagagaagac ttacacatag agcaacgcac ttacaaagaa cactatttcg gtttttatca 4320 atctcatact caaagcgcag gctctgtagt cgaagctcag gcattcgaca ttactcccat 4380 ttggaagcgc tggcctttct ggggctctct tgtctgcttc attatcgtta ttcttatact 4440 tgcttattat tttcagtcac gtaagtcaaa acacgctgaa gatgttcccc cagttcctga 4500 gcacagccaa cagactcctt catctgactc atccatttct caccctccta aacctcttca 4560 aaccataaag gctgctcctc tctctgagcc gctaagggat tttcagcttt acgtatctgg 4620 ccacgctaag cagatagcct ataaaaagat gtcattttct cgagagattg ataccaggct 4680 aaccttctat cacgtttaca ttagcgctta tcaggatgac aaattctctt tctctctcaa 4740 taacatagac ttagaaaaga tgggttatca atttgaggct ttaacggagt gcgtttatcg 4800 tattacttgg ygctctaatt ctcy gcaaaaggcc gaaactgtat tcgaccacgt tcctaaactt gatatttgaa aagcgtttca 4920 gacttcaaac atcttgatta ttgaaacact tttcaaggaa tttgatttgt gtaacagatt 4980 tcatgacctt gattgctgta acatatatca agttacttga aatctgttac aggaatcaat 5040 tatgtcttat tgcaaatctt ctttcccaga ggctgatttt gctgtttatc aggagttcca 5100 aagaaagctt ggcccctaaa tataaatcta gaccagaggc cccctattag ccttgctcgc 5160 caatatatgg agaaataccc tgagtttcag cacattggcg gcattggtac acctctcgat 5220 gttattgacg aatgcttaga gcagattgct gcccttcaaa agcccaaaca cggaggaaac 5280 gcaagggcgc tgcccgtaag cctgcaccaa gtcaacttaa gcgcgttcct gttcctctca 5340 tcccaatcat tgaccgtatc atctcccaat ataaatcttg tgacttaaca tctttttcgc 5400 ttcttgcctt atatgattat ctagttactc aaagtttcag cctgtgcgag ggttctgttt 5460 ttaaaggtct ttttcttgat gatgttactt ttgaaccgtt agatgaccct gaacataatc 5520 ccccttcgat acaaaaaggt ttctgactac tttcttcaag ctggcctact tgatgacttt 5580 tacaattggg ctatctccaa cggccgcctt gctctttagc tttttaattt tctttattaa 5640 ctatccgcgc cttagtgcgc gacttttgag cttagctcga tgcccgcagg gactaggcca 5700 taacgttagc ctcaacacac tttgaacgta tgctactgca tatccgaaac actctaaggt 5760 tcgcggcggt tcgcttgatt ctaaagcgcg ccagtcagtc aagtgatcat caatactctt 5820 gcgccagaaa aaacaccctt cgccctgcca agccataaaa gatgtttcag caagcgcagt 5880 aggtagcagc attttctcgc cgtactatca acaacagggc gcggcgagtg tcgagcaagc 5940 catatttcat tcgttaagcg ttgcgctctg gaggggccca ctgggaggac acgggaggaa 6000 gcgccaaccc ccgagctgta tcacgggggt agattccacc atactccttg gtctcaccgt 6060 ataaatccct aaaaaaaatt agggctactg cctccctgct tttacttaat ccctttgatt 6120 ctagccatag ctctagcgta cttgagaagt ttagaacgtg tcattgcatc gtctggtgct 6180 tgtatttgca agatagcgat agcggctaat aactgctgtg gtgctaccct gtcacctgtt 6240 gggaatatca gtctcccccc ttccatccta aatccccacc actcatcacc gtaatacagc 6300 tcttttctgc tgtgccatct catcagcctc ttgcaaatcg gtggtatctt ctcccctgcg 6360 tcccattgct tgacctcgct cacagtttta aaacaaagtt tcgccgcttc ttcaacgctt 6420 aacccgcatt caaattcacg aaaaacaaaa ttctttgtca tttcgcttcg attcattgat 6480 aaaactccca aaagcggaag ttttataagc atttgaattt atagcaactt ttaccataag 6540 ccgacataat gcgaagtaag aaacagcctc gttaaactgg ctgattgaca ccgctagacc 6600 accgcaaagc attgatattg ttcttaatcc tagcccgttt tgcttttttg ctatgctttc 6660 ccaaatcgct ttgatgcgtg ggttttcgtt gcggtctgcg tgacatccta acagtgcgat 6720 ttcagggtca attcctgctg attcagctaa aaaaattgct tcttcatcag atatatacct 6780 aactccagtt ctcattttgc ttattttctg tggcgacaag ttcaagtcgt gtgcaatttg 6840 cttgtcttgt acgtagtttt ttgccttttt gtaggcgtct aacagttcat ttgcatacat 6900 atttatccct ccttttcttt tctatcatag cttgccaatc cccaatttgc gctatttaca 6960 atccccaaaa atgggactag aatcctcata aatcggaatt tgaccacctt gggcgctaga 7020 ccttaactct tccccttggt ggtctcccca accagttaag gcggttatca tggcaaattc 7080 agcaaagaaa caaaccctat cacaatctgt taacccattt gtgaccatcc agttaacttc 7140 tggcgctctt cctcgctttc ttgcttacgg cggctttaat tcggatggtt ctcagcgctc 7200 taagtaactt ctgtttctac tgatgcccca caaaatgccg cttcctactg caaacgcctt 7260 ttacccaagg ataagcgtaa ttggcctcta gctcagattt cctatcaggt taaataaggt 7320 cgctatcatg ggtgatttca tctactacga caacgaaccc aacatcggga tcaacgtgta 7380 tttcgtttgg gggcatcgtt tctttaaaaa ctggcctgag ttagagcaat accttgccat 7440 tcactatggc gctgacccat atcaactggt tgaaatcact aacgaaaact acaacgaatt 7500 gcttttaaag ggggtctttc atgccatgta agcaccctca cc 7542