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| REVENDICATIONS 1 - Procédé pour l'expression d'une protéine d' intérêt par une bactérie caractérisé en ce qu' il comprend la culture d'une bactérie exprimant de façon temporaire ou continue une protéine Hsp, en ce que ladite bactérie comprend en outre une séquence d'acide nucléique, codant une protéine d'intérêt, sous le contrôle d'un promoteur lac et en ce que ladite bactérie est cultivée dans un milieu ne contenant pas d' IPTG ou une molécule métabolisée de telle sorte à induire automatiquement l'induction de la transcription à partir du promoteur lac. 2 - Procédé selon la revendication précédente caractérisé en ce que ledit acide nucléique codant une protéine d'intérêt est compris dans un premier plasmide. 3 - Procédé selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que ladite protéine d' intérêt est une protéine recombinante. 4 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 2 caractérisé en ce que ladite protéine d' intérêt est une polymérase . 5 - Procédé selon la revendication précédente caractérisé en ce que ladite polymérase est une T7 polymérase . 6 - Procédé selon l'une des revendications 4 à 5 caractérisé en ce que ladite bactérie comprend en outre une deuxième séquence d'acide nucléique, codant une seconde protéine d'intérêt placé sous le contrôle d'un promoteur spécifique de ladite polymérase. 7 - Procédé selon la revendication précédente caractérisé en ce que ladite deuxième séquence d' acides nucléiques est comprise dans ledit premier plasmide ou dans un second plasmide. 8 - Procédé selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que ladite protéine Hsp est codée par une séquence d' acides nucléiques sous le contrôle d'un promoteur lac. 9 - Procédé selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que ladite bactérie est une E. coli. 10 - Procédé selon la revendication 9 caractérisé en ce que ladite bactérie appartient à la souche BL21 (DE3) ou BL21 (DE3) star. 11 - Procédé selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que la protéine Hsp est choisie dans le groupe comprenant l'Hsp40, l'Hsp70, l'Hsp90 et l'HspllO. 12 - Procédé selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que la protéine Hsp est la protéine Hsp70 humaine. 13 - Procédé selon la revendication précédente caractérisé en ce que ladite bactérie est cultivée dans un milieu liquide. |
Domaine technique
La présente invention concerne notamment une bactérie permettant l'expression à haut niveau d'une protéine d'intérêt. La présente invention concerne également un procédé de production d'une protéine d'intérêt mettant en œuvre une bactérie selon l'invention. Par ailleurs, la présente invention concerne également un ensemble de parties permettant d'obtenir une bactérie selon 1' invention .
Technique antérieure
La production de protéines recombinantes, comme les enzymes, les hormones et les anticorps, est nécessaire dans de nombreux domaines comme la recherche en biologie, la médecine humaine ou vétérinaire et l'industrie alimentaire. Cette production est souvent faite en cellules procaryotes et plus particulièrement en Escherichia coli (E. coli) .
Le promoteur lac est le promoteur inductible le plus utilisé pour l'expression de protéine chez E. coli. Il peut être notamment utilisé pour induire l'expression de la T7 polymérase. Dans ce système, le gène codant la T7 polymérase est inséré dans le chromosome bactérien sous le contrôle de l'opéron lac. L'ajout d' isopropyle--D galactoside (IPTG) dans le milieu de culture permet d' induire efficacement la transcription de la T7 polymérase qui va ensuite pouvoir induire la transcription d'un gène, codant une protéine hétérologue, placé sous le contrôle d'un promoteur spécifique de la T7 polymérase.
Toutefois, l'IPTG présente des limitations pour la production industrielle de protéines recombinantes. Ces limitations sont notamment liées au coût et à la toxicité de l'IPTG. Par ailleurs, l'IPTG doit être introduit à un moment bien précis de la croissance bactérienne ce qui implique la nécessité de suivre précisément la densité cellulaire dans le milieu de culture.
Afin de contourner les problèmes liés à l'IPTG, différentes stratégies ont été mises en œuvre. Parmi celle- ci, on peut notamment citer l'utilisation de lactose ou du galactose comme inducteur de transcription. Mais ces derniers ne permettent pas d' atteindre des taux de production équivalents à l'IPTG et nécessitent toujours une surveillance précise de la croissance bactérienne.
Des systèmes auto-inductibles mettant en œuvre des milieux de culture spécifiques, comprenant des molécules métabolisées de telles sortes à induire automatiquement l'induction de la transcription à partir du promoteur lac, ont également été proposés.
Ces derniers systèmes, bien qu'efficaces, peuvent mettre en œuvre des molécules et des milieux qui ne sont pas encore approuvés par les autorités réglementaires. Il existe donc un besoin pour de nouvelles bactéries capables d'exprimer de façon auto-inductible une protéine hétérologue sous le contrôle d'un promoteur lac dans un milieu de culture ne comprenant pas de molécules toxiques. Résumé de l'invention
Ainsi la présente invention concerne notamment un procédé pour l'expression d'une protéine d'intérêt par une bactérie remarquable en ce qu'il comprend la culture d'une bactérie exprimant de façon temporaire ou continue une protéine Hsp, en ce que ladite bactérie comprend en outre une séquence d'acide nucléique, codant une protéine d'intérêt, sous le contrôle d'un promoteur lac et en ce que ladite bactérie est cultivée dans un milieu ne contenant pas d'IPTG.
La présente invention concerne également un procédé pour l'expression d'une protéine d'intérêt par une bactérie remarquable en ce qu'il comprend la culture d'une bactérie exprimant de façon temporaire ou continue une protéine Hsp, en ce que ladite bactérie comprend en outre une séquence d'acide nucléique, codant une protéine d'intérêt, sous le contrôle d'un promoteur lac et en ce que ladite bactérie est cultivée dans un milieu ne contenant pas une molécule métabolisée de telle sorte à induire automatiquement l'induction de la transcription à partir du promoteur lac.
Dans le cadre de la présente invention, le terme « un milieu ne contenant pas une molécule métabolisée de telle sorte à induire automatiquement l'induction de la transcription à partir du promoteur lac » entend signifier que ledit milieu ne contient pas ladite molécule au moment de l'introduction desdites bactéries et que ladite molécule n'est pas introduite, depuis l'extérieur, dans ledit milieu au cours du procédé selon l'invention.
Il a été observé, de façon surprenante, que l'expression d'une protéine Hsp par la bactérie induisait, même en l'absence d'IPTG, la transcription des séquences d'acides nucléiques sous le contrôle d'un promoteur lac. Bien que des milieux ou des conditions de culture particulières sans IPTG puissent conduire à l'induction de la transcription de ces séquences (voir par exemple Studier et al. protein expression and purification, académie press, vol. 41, 1, 2005, 207-234 ou le produit Overnight ExpressTM Autoinduction Systems de Novagen) , la combinaison spécifique d'un promoteur lac et d'une protéine Hsp permet d'obtenir cette induction tout en utilisant les milieux et les conditions de culture classiques. Dans le cadre de la présente invention, le terme « promoteur lac » se réfère à un promoteur de l'opéron lac, dont l'activité de transcription est réprimée par une protéine répresseur comme la protéine Lacl codée par le gène lacl mais levée par un inducteur, tel que le lactose ou des analogues de celui-ci (par exemple, 1 ' isopropyle-β-Ο galactoside (IPTG)) . L'inducteur se lie à la protéine répresseur et empêche la répression de la transcription génique .
Dans le cadre de la présente invention, le terme
« sous le contrôle » entend signifier que la transcription de la séquence d'acide nucléique, codant ladite protéine d'intérêt, est dépendante de l'association d'une polymérase sur ledit promoteur. Avantageusement, ledit promoteur lac est placé en amont de ladite séquence d'acide nucléique, codant ladite protéine d'intérêt.
Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, ladite protéine d'intérêt n'est pas la β-galactosidase, la lactose perméase et/ou la thiogalactoside transacétylase .
Selon un mode de réalisation préféré de l'invention ladite protéine d'intérêt est une protéine hétérologue.
Dans le cadre de la présente invention, le terme « protéine hétérologue » entend signifier que ladite protéine n'est pas une protéine naturellement exprimée par ladite bactérie.
Selon un mode de réalisation préféré, ledit acide nucléique codant une protéine d' intérêt est compris dans un premier plasmide. Dans le cadre de ce mode de réalisation, ledit plasmide comprend le promoteur lac.
Selon un mode de réalisation préféré, ladite protéine d' intérêt est une protéine recombinante et de façon encore plus préféré une protéine de mammifère et de façon tout à fait préféré une protéine humaine. Selon un mode de réalisation encore plus préféré ladite protéine recombinante n'est pas une polymérase.
Selon un autre mode de réalisation préféré, ladite protéine d'intérêt est une polymérase. Selon un mode de réalisation encore plus préféré, ladite polymérase est une T7 polymérase.
Dans le cadre de ces deux derniers modes de réalisations, la bactérie selon l'invention comprend en outre une deuxième séquence d'acide nucléique, codant une seconde protéine d'intérêt placé sous le contrôle d'un promoteur spécifique de ladite polymérase. Ainsi, dans ce mode de réalisation c'est l'induction de l'expression de la polymérase qui va permettre l'expression de la protéine d'intérêt. Selon un mode de réalisation préféré ladite deuxième séquence d'acides nucléiques est comprise dans ledit premier plasmide ou dans un second plasmide. Selon un mode de réalisation encore plus préféré, ladite séquence codant pour la polymérase sous le contrôle d'un promoteur Lac est comprise dans le génome de ladite bactérie.
Selon un mode de réalisation préféré, ladite protéine
Hsp est codée par une séquence d' acides nucléiques sous le contrôle d'un promoteur lac.
Selon un mode de réalisation préféré, ladite bactérie est une E. coli.
Selon un mode de réalisation préféré, ladite bactérie appartient à la souche BL21 (DE3) star ou à la souche BL21 (DE3) .
Dans le cadre de la présente invention, le terme « protéine Hsp » fait référence aux « heat shock protein » c.à.d. aux protéines appartenant au groupe de protéines dont l'expression est naturellement induite par un choc thermique. Ces protéines sont bien connues de l'homme du métier. Elles sont notamment impliquées dans le pliage et le dépliage des autres protéines. Leur expression est augmentée lorsque les cellules sont exposées à des températures élevées ou à d'autres stress. Les Hsp sont trouvées dans presque tous les organismes vivants, de la bactérie à l'homme. Les protéines de choc thermique sont nommées en fonction de leur poids moléculaire. Par exemple, la Hsp60, Hsp70 et Hsp90 se réfèrent à des familles de protéines de choc thermique de l'ordre de 60, 70 et 90 kilodaltons par la taille, respectivement.
Dans le cadre de la présente invention, le terme
« protéine Hsp » fait référence aux protéines Hsp produites naturellement par les cellules eucaryotes ou procaryotes. Le terme « protéine Hsp » fait également référence aux protéines présentant une séquence ayant une homologie supérieure à 90%, préfèrent iellement supérieure à 95% et tout à fait préfèrent iellement supérieure à 99% aux protéines Hsp naturellement produites. Dans le cadre de la présente invention, est considérée comme une séquence protéique, homologue d'une autre séquence protéique, une protéine qui présente, sur un nombre d'acides aminés au moins égal à 80 pourcent du nombre d'acides aminés de la séquence protéique de référence, de préférence sur la longueur totale de la séquence de référence, un pourcentage d' homologie correspondant aux valeurs indiquées précédemment. Le pourcentage d' homologie est calculé en comptant le nombre de positions pour lesquelles les séquences protéiques présentent des acides aminés identiques et en divisant ce nombre de positions identiques par la longueur de la séquence du polypeptide le plus long et en multipliant le résultat obtenu par 100 pour obtenir le pourcentage d' homologie entre ces deux séquences.
Selon un mode de réalisation préféré, la protéine Hsp est choisie dans le groupe comprenant les Hsp27 (P04792), Hsp40 (P25685), Hsp60 (P10809), Hsp70 (P08107), Hsp90 (P08238 and P07900) et HspllO (Q92598) (Uniprot référence number) .Selon un mode de réalisation préféré, la protéine Hsp est la protéine Hsp70 humaine (Uniprot référence number : PO 8107) .
Selon un mode de réalisation préféré, ladite bactérie est cultivée dans un milieu liquide.
De façon surprenante, la demanderesse a observé que la concentration en glucose et/ou en lactose du milieu de culture utilisé permet de moduler le moment où la protéine d'intérêt est exprimée par la bactérie selon l'invention.
Ainsi, selon un mode de réalisation préféré de l'invention, le milieu de culture comprend du glucose. Selon un mode de réalisation encore plus préféré ledit milieu de culture comprend entre 0.01% et 0.5% de glucose et selon un mode de réalisation tout à fait préféré entre 0.3% et 0.7% de glucose.
Ainsi, selon un autre mode de réalisation préféré de l'invention, le milieu de culture comprend du lactose. Selon un mode de réalisation encore plus préféré ledit milieu de culture comprend entre 0.01% et 0.5% de lactose et selon un mode de réalisation tout à fait préféré entre 0.3% et 0.7% de lactose. Description des modes de réalisation
Expression de protéines hétérologues par une bactérie exprimant l'Hsp70 humaine Matériels et méthodes
Dans toutes les expériences suivantes une souche de bactérie E. coli BL21 (DE3 ) star a été utilisée. Toutefois, l'invention n'est pas limitée à ce type particulier de bactéries . La séquence codant l'Hsp70 humaine a été clonée dans le plasmide d'expression bactérien pET21d et placée sous le contrôle du promoteur T71ac. Ce plasmide contient par ailleurs un gène de résistance à 1 ' ampicilline .
Le plasmide pET21d-Hsp70 a été utilisé pour transformer E. coli BL21 (DE3 ) Star et obtenir une bactérie capable d'exprimer l'Hsp70.
Un second plasmide pET comprenant un gène de résistance à la kanamycine et la même origine de réplication que le plasmide pET21d a été utilisé pour cloner un gène codant pour une protéine hétérologue. Ce second plasmide a été utilisé pour transformer la souche bactérienne codant Hsp70.
La production de cinq protéines hétérologues différentes a été testée, ces protéines sont :
La méthionine sulfoxyde réductase B (MsrB) de Xanthomonas compestris.
La thioredoxine 1 (Trxl) d'E. coli.
La purine nucléoside phosphorylase (PNP) d'E. coli.
Le domaine N-Terminal du récepteur T1R3 d'Homo sapiens .
La miraculine de Richardella dulcifica (MCL) .
Ces cinq protéines sont d'origines différentes (bactérie, plante ou homme) et de taille variant de 14kDa à 45kDa. Elles présentent par ailleurs différentes fonctions (enzyme, récepteur ou ligand) et localisation cellulaire (cytoplasme, plasma ou membrane) .
Les bactéries transformées ont été cultivées en milieu LB, dans des volumes différents (5ml, 20 ml, IL) à différentes températures (25°C, 30°c et 37°C).
Les milieux de culture obtenus ont été analysés par électrophorèse PAGE-SDS. Résultats
Toutes les protéines testées sont exprimées à haut niveau à 37°C en l'absence d'inducteur. Ainsi on peut observer sur les électrophorèses PAGE-SDS que la protéine hétérologue est la protéine la plus fortement exprimée par la bactérie.
Une accumulation des protéines hétérologues est observée pendant au moins 20 heures.
La production des protéines hétérologues n'est pas dépendante du volume de milieu de culture utilisé.
Ces résultats sont retrouvés à toutes les températures compatibles avec la croissance bactérienne.
Le procédé selon l'invention a été mis en œuvre, avec le même succès, avec des protéines hétérologues de mammifères (notamment humaines) , de bactéries et de plantes. Parmi celles-ci, on peut notamment citer les GST humaines (GSTA1 et GSTP1), de drosophile (GSTD2 et GSTD7), une lipocaline humaine (LCN1), et l'HspllO humaine.
Le procédé selon l'invention fonctionne également quelque soit la localisation de la protéine : membranaire, extracellulaire ou cytoplasmique .
Le procédé selon l'invention n'est pas dépendant de la structure du plasmide utilisé et a pu être mis en œuvre avec succès avec les plasmides pD431-SR, pD451-SR, pD434-
SR, pD434-WR, pD454-WR, pJ431:2047, pJ414:2047 (DNA2.0
Menlo Park, USA) .
Effets du glucose et du lactose sur l'expression des protéines d' intérêts
Matériels et méthodes
Les bactéries transformées pour exprimer les protéines recombinantes citées précédemment ont été cultivées en milieu LB supplémenté avec 0.05% de glucose ou 0.2% de lactose.
La croissance bactérienne a été suivie en mesurant la densité optique à 600nm et la quantité de protéine recombinante produite a été mesurée par chromatographie PAGE-SDS du surnageant de culture.
Résultats
En l'absence de glucose ou de lactose, l'expression des protéines d'intérêt apparaît à une densité optique de 1.
L'ajout de 0.05% de glucose dans le milieu retarde l'expression de la protéine d'intérêt à une densité optique à 600nm de 1.5.
L'ajout de 0.02% de lactose permet d'accélérer la production de la protéine d' intérêt à une densité optique de 0.7.
Next Patent: FAST CURING COMPOSITIONS