BANGERT JOACHIM (DE)
GUMBRECHT WALTER (DE)
HILTAWSKY KARSTEN (DE)
PAULICKA PETER (DE)
STANZEL MANFRED (DE)
FRIEDRICH KATJA (DE)
BANGERT JOACHIM (DE)
GUMBRECHT WALTER (DE)
HILTAWSKY KARSTEN (DE)
PAULICKA PETER (DE)
STANZEL MANFRED (DE)
WO2003022999A2 | 2003-03-20 |
EP0713087A1 | 1996-05-22 | |||
US4124449A | 1978-11-07 | |||
US3731806A | 1973-05-08 | |||
US20110076684A1 | 2011-03-31 |
Patentansprüche 1. Verfahren zum Nachweis von Zellen in einer flüssigen Probe, aufweisend folgende Schritte: a) Filtrieren der flüssigen Probe durch eine poröse Membran, die geeignet ist, nachzuweisende Zellen zurückzuhalten, derart, dass nachzuweisende Zellen auf zumindest einem Teil der Oberfläche der Membran zu liegen kommen und dass zumindest ein Teil der Probenflüssigkeit die Membran passiert, b) Aufbringen einer ersten Prozessflüssigkeit, welche ein erstes Mittel zum Markieren der nachzuweisenden Zellen mit einem ersten Marker enthält, c) Inkubieren der Prozessflüssigkeit auf der Membran für einen vorbestimmten Zeitraum, wobei die nachzuweisenden Zellen markiert werden, d) Detektieren der markierten nachzuweisenden Zellen auf der Oberfläche der Membran. 2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei vor Schritt b) oder nach Schritt c) mindestens eine weitere Prozessflüssigkeit aufgebracht wird. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die mindestens eine weitere Prozessflüssigkeit Mittel enthält, die aus Mitteln zum Waschen, Mitteln zum Fixieren von biologischen Strukturen, Mitteln zum Verhindern von unspezifischen Markierungsereignissen oder Mitteln zum Markieren der nachzuweisenden Zellen mit einem weiteren Marker gewählt sind, wobei sich der weitere Marker von dem ersten Marker unterscheidet . 4. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die zweite Prozessflüssigkeit Mittel enthält, die zum Waschen oder Fixieren der Zellen oder zum Verhindern von unspezifischen Markierungsereignissen geeignet sind. 5. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobe während Schritt c) ein Überdruck auf der Seite der Membran anliegt, welche der Seite abgewandt ist, auf der die nachzuweisenden Zellen in Schritt a) zu liegen gekommen sin wobei der Überdruck so gewählt ist, dass ein Durchfluß von Prozessflüssigkeit durch die Membran hindurch verhindert wird . 6. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei während Schritt d) ein Unterdruck auf der Seite der Membran anliegt, welche der Seite abgewandt ist, auf der die nachzuweisenden Zellen in Schritt a) zu liegen gekommen sind, wobei der Unterdruck so gewählt ist, dass die Prozessflüssigkeit durch die Membran hindurch abgesaugt wird. 7. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die nachzuweisenden Zellen Tumorzellen sind. 8. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche wobei in Schritt c) die Prozessflüssigkeit und die Inkubationsbedingungen gewählt sind, um ein Überleben der nachzuweisenden Zellen über den vorbestimmten Zeitraum zu ermöglichen . 9. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei von den nachzuweisenden Zellen abgegebene Stoffe nachgewiesen werden . 10. Anordnung zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 9, aufweisend: a) eine poröse Membran, die geeignet ist, nachzuweisende Zellen zurückzuhalten, b) Mittel zum Aufbringen einer Flüssigkeit auf die Membran, c) Mittel zum Durchdrücken der Flüssigkeit durch die Membran, d) Mittel zum Einstellen einer Druckdifferenz vor und hinter der Membran, e) Mittel zum Steuern des zeitlichen Ablaufs, die das Aufbringen der Flüssigkeit auf die Membran, das Verweilen der Flüssigkeit auf der Membran für eine vorbestimmte Zeitdauer und das Durchdrücken der Flüssigkeit durch die Membran steuern kann, wobei die Mittel zum Einstellen der Druckdifferenz ermöglichen, einen Überdruck von < 50mbar auf der Rückseite der Membran zu Erzeugen, um das Verweilen der Flüssigkeit auf der Membran für eine vorbestimmte Zeitdauer zu ermöglichen. 11. Anordnung nach Anspruch 10, wobei die Membran auf einem Objektträger angeordnet ist. 12. Anordnung nach Anspruch 10 oder 11, ferner aufweisend einen Abfallbehälter zum Sammeln von durch die Membran durchgedrückten Flüssigkeiten. |
Automatisierter CTC Nachweis
Die Erfindung ist auf dem Gebiet der in vitro Diagnostik und betrifft ein Verfahren und eine Anordnung zum Nachweis lebender, zirkulierender oder disseminierter Zellen aus
Körperflüssigkeiten (z.B. Blut, Urin) bzw. mit Flüssigkeit versetzter Gewebeproben (z.B. Knochenmark) . Das
erfindungsgemäße Verfahren dient insbesondere zur
automatisierten Gewinnung und zur Analyse von zirkulierenden Tumorzellen und findet somit bevorzugt Anwendung in der
Tumordiagnostik .
Die Erfindung ermöglicht den automatisierten Nachweis von Zellen oder Zellbestandteilen aus peripherem Blut oder
Knochenmark durch einen funktionellen Test, nachdem das Blut oder Knochenmark durch ein spezielles Filtrationsverfahren gefiltert wurde. Bei den Zellen handelt es sich insbesondere um zirkulierende Tumorzellen (engl, circulating tumor cells, CTC oder (plur.) CTCs), mesenchymale Stammzellen aus
peripherem Blut oder Bakterien aus Blut oder anderen
Körperflüssigkeiten sowie disseminierte Tumorzellen aus
Knochenmark (engl, disseminated tumor cells, DTC) .
Das Vorkommen von CTCs in peripherem Blut ist ein Hinweis auf eine mögliche Streuung von Zellen eines soliden Tumors zu einem sehr frühen Stadium, in dem mit üblichen bildgebenden Untersuchungsverfahren noch keine Metastasierung nachgewiesen werden kann. Daher stellen sowohl der Nachweis als auch die Charakterisierung von CTCs in peripherem Blut
vielversprechende Möglichkeiten dar, systemische
Tumorzellausbreitung sehr frühzeitig zu erkennen und CTCs als prognostischen Marker zu nutzen. Dadurch könnten Prognosen und kontinuierliche Beobachtung von systemischen Therapien ausgesprochen bzw. durchgeführt werden. Weiterhin könnte die Charakterisierung und Bewertung von CTCs als diagnostisches Instrument genutzt werden, um eine geeignete Behandlung für solide Tumoren auszuwählen.
Für die Früherkennung, Diagnose und Therapiekontrolle von Krebs hat der Nachweis von zirkulierenden Tumorzellen (CTC) im Blut eine immer größer werdende Bedeutung. Dabei ist auf Grund der geringen Zahl an CTCs, die im Bereich von nur 3-5 in einem Milliliter Blut liegen kann und auf Grund des großen Hintergrundes an Leukocyten (6-10xl0 6 pro Milliliter) ein Verfahren zu wählen, das CTCs möglichst selektiv anzureichern oder aber vor einem großen Überschuss anderer Blutzellen darzustellen vermag. Zum Einsatz kommen dabei z.B.
physikalische Methoden wie das Filtrieren, das mittels entsprechender Porengrößen eine Größenselektion der Zellen erlaubt, oder andere Verfahren, die z.B. über eine selektive Antikörper-Bindung die Anreicherung von CTCs in einer
Blutprobe erlauben.
Kein Verfahren, das auf einer Größenselektion beruht, ist bislang vollautomatisiert. Zwischen dem Anreicherungsschritt und den eigentlichen selektiven immunochemischen
Nachweisreaktionen der CTCs sind stets manuelle
Arbeitsschritte notwendig.
Neben Flow-Cytometrischen Verfahren (z.B. das FACS Verfahren, fluorescence activated cell sorting) und Filtrationsverfahren ist das bislang einzig verfügbare kommerzielle für die
Routine in-vitro-Diagnostik zugelassene System das der Firma Veridex (CellSearch) . Das verwendete Verfahren erlaubt in einem Ausgangsvolumen von einigen ml Blut den Nachweis von CTCs, wenn deren nachzuweisende Zahl gleich oder über 3 pro Milliliter liegt. Das verwendete Verfahren zur Anreicherung nutzt die spezifische Bindung von an Magnetbeads gekoppelten Antikörpern an die CTCs. Der spezifische Nachweis der
angereicherten CTCs erfolgt optisch mit Hilfe von Fluoreszenz markierten Antikörpern. Es sind auch physikalische Verfahren bekannt, die über eine Grössenselektion die CTCs anreichern bzw. die Leukozyten im Blut abreichern und schonend „fixieren". Dabei kommen Filter mit definierten Porengrößen zum Einsatz, die die Permeation von Leukozyten und anderen Blutbestandteilen erlauben, jedoch ein Durchschlüpfen von CTCs verhindern sollen. Für die anschließende Prozessierung, die aus einer Reihe von Wasch- und selektiven Färbeschritt besteht, ist der manuelle
Transfer des Filters auf eine Färbestation die übliche
Vorgehensweise .
Demgegenüber ermöglicht die vorliegende Erfindung ein
zuverlässiges, kostengünstiges automatisierbares Verfahren zum Nachweis von (lebenden) Zellen in einer Probe,
insbesondere von Tumorzellen in einer Blutprobe.
Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung betrifft das Verfahren nach Anspruch 1 und die Anordnung nach Anspruch 10.
Bei einem Filtrationsvorgang im Sinne der Erfindung wird eine Suspension durch ein Filter, z.B. eine Filtermembran,
filtriert. Dabei wird Permeat durch den Filter gedrückt und Retentat auf der Filteroberfläche (oder auch in den Poren und Hohlräumen des Filters) zurückgehalten. Bei dem
Filtriervorgang gibt es daher eine vorherrschende
Strömungsrichtung des Permeats durch den Filter, so dass man von einem Bereich stromaufwärts von dem Filter sprechen kann, in welchem das Retentat (welches als wesentlichen Bestandteil die Zellen enthält) zurückgehalten wird, und einem Bereich stromabwärts, in welchen das Permeat durchgedrückt wird und z.b. dort gesammelt werden kann. Unabhängig von dieser vorherrschenden Strömungsrichtung kann in Ausnahmefällen die Strömungsrichtung auch umgekehrt werden, z.B. bei einer
Rückspülung des Filters.
Um das Permeat durch den Filter zu drücken, kann eine
Druckdifferenz erzeugt werden, wobei dann stromaufwärts von dem Filter ein höherer Druck vorliegt als Stromabwärts. Dies kann erreicht werden durch Anlegen eines Überdrucks
stromaufwärts von dem Filter, Anlegen eines Unterdurcks stromabwärts oder einer Kombination aus beiden. Um den
Permeatfluss durch den Filter zu stoppen (auf Null zu
reduzieren) , kann eine Druckdifferenz von Null eingestellt werden. Dies ist unabhängig von der Orientierung des Filters im Raum. Für den Sonderfall, dass die Strömungsrichtung am Filter vertikal verläuft oder eine vertikale Komponente (also in Richtung oder entgegen der Erdanziehungskraft) verläuft, ist ferner zu berücksichtigen, dass die Wassersäule auf dem Filter zur Druckkdifferenz beiträgt.
Für manche Anwendungen des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es bevorzugt, dass die Strömungsrichtung der Filtration am Filter im Wesentlichen in Richtung der Erdanziehungskraft verläuft. Dadurch kommt zurückgehaltenes Retentat auf der Oberfläche des Filters zu liegen, was z.b. eine einfache Weiterverarbeitung des Retenats (der Zellen) ermöglicht.
Für bestimmte Anwendungen kann es bevorzugt sein, nicht in Richtung der Erdanziehungskraft, sondern entgegen der
Erdanziehungskraft zu Filtrieren, z.B. wenn das Retentat aufschwimmt, oder um Zellen nach dem Filtrieren von der Unterseite des Filters in einem Auffanggefäß zu sammeln.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Zellen in einer flüssigen Probe, aufweisend folgende Schritte:
a) Filtrieren der flüssigen Probe durch eine poröse
Membran, die geeignet ist, nachzuweisende Zellen
zurückzuhalten, derart, dass nachzuweisende Zellen auf zumindest einem Teil der Oberfläche der Membran
zurückgehalten werden und dass zumindest ein Teil der
Probenflüssigkeit die als Permeat Membran passiert,
b) Aufbringen einer ersten Prozessflüssigkeit, welche ein erstes Mittel zum Markieren der nachzuweisenden Zellen enthält,
c) Inkubieren der ersten Prozessflüssigkeit auf der Membran für einen vorbestimmten Zeitraum, wobei die nachzuweisenden
Zellen markiert werden,
d) Detektieren der markierten nachzuweisenden Zellen auf der Oberfläche der Membran. Die flüssige Probe kann z.B. ein Blutprobe, Urinprobe oder Plasmaprobe sein.
Gemäß einer Aus führungs form der Erfindung wird Schritt b) realisiert, indem die Prozessfüssigkeit der flüssigen Probe direkt zugesetzt wird.
Gemäß einer Aus führungs form der Erfindung wird die erste Prozessflüssigkeit vor dem Detektieren der markierten nachzuweisenden Zellen entfernt, z.B. durch Durchdrücken durch die Membran.
Geeignete Mittel zum Markieren umfassen Marker die
unspezifisch oder spezifisch Zellen anfärben können.
Unspezifische Marker können z.B. Farbstoffe sein, die
Proteine, Nukleinsäuren oder andere Zellbestandteile
anfärben. Spezifische Marker können z.B. Antikörper,
Sondenoligonucleotide, Peptide oder andere Moleküle sein, die spezifisch an Proteine, Nukleinsäuresequenzen oder andere
Zellspezifische Strukturen binden. Der Marker kann mit einer nachweisbaren Markierung direkt markiert sein, z.B.
chromogene Farbstoffe, Fluoreszenzfarbstoffe,
Isotopenmarkierung o.a.. Alternativ kann der Marker auch über ein sekundäres Nachweisreagenz (z.B. Sekundärantiköper oder Enzym-Substrat-System) nachgewiesen werden.
Dabei kann optional mindestens eine weitere
Prozessflüssigkeit aufgebracht werden, z.B. vor Schritt b) oder nach Schritt d) .
Vorzugsweise enthält die mindestens eine weitere
Prozessflüssigkeit Mittel, die gewählt sind aus:
- Mitteln zum Waschen,
- Mitteln zum Fixieren von biologischen Strukturen,
- Mitteln zum Verhindern von unspezifischen
Markierungsereignissen oder
- Mitteln zum Markieren der nachzuweisenden Zellen mit einem weiteren Marker gewählt sind, wobei sich der weitere Marker von dem ersten Mittel zum Markieren unterscheidet .
Als Mittel zum Waschen sind entsprechende Waschpuffer
bekannt. Sie können ferner Mittel zur Permeabiliserung von Zellmembranen enthalten, z.B. Tenside, Saponin und ähnliche. Als Mittel zum Fixieren von biologischen Strukturen sind entsprechende Fixierlösungen bekannt, die Fixiermittel enthalten, z.B. Formalin, Glutaraldehyd und ähnliche. Als Mittel zum Verhindern von unspezifischen
Markierungsereignissen sind entsprechende Blockierpuffer bekannt. Wenn z.B. ein Antikörper als Marker verwendet wird, ist es bekannt, unspezifische Bindungen des Antikörpers durch einen Blockierpuffer abzusättigen, welcher unspezifische Immunglobuline der gleichen Spezies enthält, aus welcher der Marker-Antikörper stammt.
Bevorzugt enthält die weitere Prozessflüssigkeit Mittel, die zum Waschen oder Fixieren der Zellen oder zum Verhindern von unspezifischen Markierungsereignissen geeignet sind.
Gemäß einem bevorzugten Aspekt der Erfindung werden bei dem Verfahren nach dem Filtrieren die Zellen auf der Membran mit einem Farbstoff durch Inkubation mit einer entsprechenden Prozessflüssigkeit angefärbt. Dazu können Farbstoffe gewählt werden, die Zellen oder Zellbestandteile anfärben und aus Cytologie und Histologie bekannt sind. Dies können Lebend ¬ oder Totfarbstoffe sein, Farbstoffe, die spezifisch Zellkerne oder andere Organellen anfärben oder die spezifisch bestimmte Zellkomponenten, z.B. Nukleinsäuren oder Proteine anfärben. Bekannte Zellfarbstoffe sind, z.B. Trypanblau, DAPI und ähnliche .
Die nachzuweisenden Zellen können auf der Membran ungefärbt oder gefärbt auch mikroskopisch analysiert werden.
Gemäß einer bevorzugten Aus führungs form der Erfindung wird während Schritt c) ein Überdruck auf der Seite der Membran angelegt, welche der Seite abgewandt ist, auf der die
nachzuweisenden Zellen in Schritt a) zurück gehalten worden sind, wobei der Überdruck so gewählt ist, dass ein Durchfluß von Prozessflüssigkeit durch die Membran hindurch verhindert wird, wobei der Überdruck < 50mbar, < 20mbar, < lOmbar oder < 5mbar beträgt. Bevorzugt beträgt der Überdruck 3-10 mbar. Durch einen geringen Überdruck wird verhindert, dass die Prozessflüssigkeit durch die Membran sickert. Bevorzugt ist der Überdruck so gewählt, dass bei einer
Strömungsrichtung nach unten (in Richtung der
Erdanziehungskraft) gleichgroß oder größer als der Druck der Wassersäule über dem Filter ist. Dabei gilt: 1 cm Wassersäule entspricht ca. 1 mbar. Die Wassersäule entspricht der
Füllstandshöhe der Suspension über dem Filter bei einer im wesentlichen horizontalen Anordnung der Filters, wobei von oben nach unten gefiltert wird.
Gemäß einer bevorzugten Aus führungs form der Erfindung wird während Schritt d) ein Unterdruck auf der Seite der Membran angelegt, welche der Seite abgewandt ist, auf der die
nachzuweisenden Zellen in Schritt a) zu liegen gekommen sind, wobei der Unterdruck so gewählt ist, dass die
Prozessflüssigkeit durch die Membran hindurch abgesaugt wird.
Gemäß einer bevorzugten Aus führungs form der Erfindung ist die nachzuweisende Zelle eine Tumorzelle. Das erfindungsgemäße Verfahren ist besonders gut für den Nachweis von CTCs
geeignet .
Gemäß einer bevorzugten Aus führungs form der Erfindung sind in Schritt c) die Prozessflüssigkeit und die
Inkubationsbedingungen so gewählt, dass ein Überleben der nachzuweisenden Zellen über den vorbestimmten Zeitraum zu ermöglicht wird. Dadurch ist es möglich an den Zellen weitere funktionelle Tests durchzuführen. Als Prozessflüssigkeit können hier Puffer mit physiologischen Salzkonzentrationen gewählt werden. Die Inkubation kann bei entsprechenden
Temparatur- und Feuchtigkeitsbedingungen erfolgen.
Ferner können von den nachzuweisenden Zellen abgegebene
Stoffe nachgewiesen werden. Ferner betrifft die Erfindung eine Anordnung zur Durchführung der Schritte a) bis d) des erfindungsgemäßen Verfahrens, aufweisend :
a) eine poröse Membran, die geeignet ist, nachzuweisende Zellen zurückzuhalten
b) Mittel zum Aufbringen einer Flüssigkeit auf die Membran, c) Mittel zum Durchdrücken der Flüssigkeit durch die Membran, d) Mittel zum Einstellen einer Druckdifferenz vor und hinter der Membran,
e) Mittel zum Steuern des zeitlichen Ablaufs, die das
Aufbringen der Flüssigkeit auf die Membran, das Verweilen der Flüssigkeit auf der Membran für eine vorbestimmte Zeitdauer und das Durchdrücken der Flüssigkeit durch die Membran steuern können, . wobei die Mittel zum Einstellen der Druckdifferenz
ermöglichen, einen Überdruck auf der Rückseite der Membran zu Erzeugen, um das Verweilen der Flüssigkeit auf der Membran für eine vorbestimmte Zeitdauer zu ermöglichen.
Die Mittel zum Aufbringen einer Flüssigkeit auf die Membran können z.B. als Zuleitung oder als Pippetiereinrichtung ausgeführt sein.
Die Mittel zum Durchdrücken der Flüssigkeit durch die Membran können Mittel umfassen, mit denen eine Druckdifferenz erzeugt wird, wobei dann stromaufwärts von dem Filter ein höherer Druck vorliegt als Stromabwärts.
Die Mittel zum Steuern des zeitlichen Ablaufs können als eine programmierbare Steuerung der Anordnung vorgesehen sein, bei der sich die vorbestimmte Zeitdauer einstellen lässt.
Gemäß einer bevorzugten Aus führungs form der Erfindung wird ein Überdruck auf der Seite der Membran angelegt, welche der Seite abgewandt ist, auf der die nachzuweisenden Zellen in zurück gehalten worden sind, wobei der Überdruck so gewählt ist, dass ein Durchfluß von Prozessflüssigkeit durch die Membran hindurch verhindert wird, wobei der Überdruck <
50mbar, < 20mbar, < lOmbar oder < 5mbar beträgt. Bevorzugt beträgt der Überdruck 3-10 mbar. Durch einen geringen
Überdruck wird verhindert, dass die Prozessflüssigkeit durch die Membran sickert.
Bevorzugt ist der Überdruck so gewählt, dass bei einer
Strömungsrichtung nach unten (in Richtung der
Erdanziehungskraft) gleichgroß oder größer als der Druck der Wassersäule über dem Filter ist. Dabei gilt: 1 cm Wassersäule entspricht ca. 1 mbar. Die Wassersäule entspricht der
Füllstandshöhe der Suspension über dem Filter bei einer im wesentlichen horizontalen Anordnung der Filters, wobei von oben nach unten gefiltert wird.
Die Membran kann in eine entsprechende Haltevorrichtung eingespannt sein, so dass entsprechende Unter- oder
Überdrücke angelegt werden können.
Bevorzugt ist die Membran auf einem Objektträger angeordnet, so dass nach Durchführen der Schritte a) bis d) des
erfindungsgemäßen Verfahrens der Objektträger mit der Membran zum Nachweis der Zellen begutachtet werden kann, z.B. durch Untersuchung mit einem Mikroskop.
Ein Mikoroskopie-Obj ektträger ist eine transparente ein
Platte von ca. 26 x 76 mm (ISO 8255-2) und einer Dicke von ca . 0,1 bis 1.5 mm.
Der Objektträger weist bevorzugt Öffnungen auf, so dass die Flüssigkeiten problemlos abgesaugt werden können. Dies können mehrere kleine Öffnungen sein, z.B. Poren oder Bohrungen. Alternativ können es auch ein oder mehrere größere
Ausschnitte sein, die von der Membran bedeckt werden können.
Die Membran weist z.B. eine Porengröße von 0,1 bis 200 μπι auf. Dadurch können Zellen zurückgehalten werden, während Zellfragmente, Thrombozyten und kleinere Festbestandteile der Probe durch das Filter (die Membran) hindurch gehen.
Gemäß einem bevorzugten Aspekt der Erfindung weist die
Membran eine Porengröße von 2 bis 50 μπι, stärker bevorzugt 5 bis 20 μπι, noch stärker bevorzugt 5 bis 10 μπι, auf.
Porengrößen der Größenbereiche 2 bis 50 μπι, 5 bis 20 μπι oder insbesondere 5 bis 10 μπι bieten den Vorteil, dass die Zellen davon zurückgehalten werden, jedoch teilweise in den Poren haften bleiben und so besonders gut auf der Membran haften und für weitere Analysen zur Verfügung stehen.
Gemäß einem Aspekt der Erfindung wird mit dem ersten Marker ein Antigen aus der folgenden Liste 1 oder Liste 2
nachgewiesen.
Gemäß einem bevorzugten Aspekt der Erfindung wird bei
Verwendung einer Blutprobe vor dem Filtrieren eine
Erythrozytenlyse (z.B. durch hypotone Lyse) durchgeführt, um störende Erythrozyten zu entfernen.
Ferner können die Zellen auch nach dem Filtrieren wieder in Zellkulturmedium aufgenommen werden und für weitere
Untersuchungen kultiviert werden. So können z.B.
nachgewiesene Tumorzellen kultiviert und weiter untersucht werden, um das Ansprechen auf bestimmte Arzneimittel (z.B. Zytostatika) zu überprüfen.
Liste 1: bevorzugte zellspezifische Antigene:
- Alpha-l-Fetoprotein (AFP) bei Leberzellkarzinom und
gonadalen und extragonadalen Keimzelltumoren
Bence-Jones-Protein beim Multiplen Myelom
Beta-HCG (beta-Untereinheit des humanen
Choriongonadotropin) bei Keimzelltumoren des Ovars und nicht-seminomatösem Tumoren des Hodens
CA 15-3 beim Brustkrebs (Mammakarzinom) r
Eierstockkrebs (Ovarialkarzinom) CA 19-9 und CA 50 beim Bauchspeicheldrüsenkrebs
( Pankreaskarzinom)
CA-125 beim Eierstockkrebs (Ovarialkarzinom)
Calcitonin (humanes Calcitonin, hCT) , beim medullären Schilddrüsenkarzinom
Carcino-Embryonales Antigen (CEA) bei Darmkrebs,
Pankreaskarzinom sowie Adenokarzinom der Lunge
- Cytokeratin-21-Fragment (CYFRA 21-1) und Serpin B4 (SCC) bei allen Varianten des Lungenkrebses
(Bronchialkarzinoms)
- HER-2 /neu
HPV-Antikörper bzw. HPV-Antigene
Homovanillinsäure beim Neuroblastom
5-Hydroxyindolessigsäure beim Karzinoid
- Katecholamine, Vanillinmandelsäure beim Phäochromozytom
Laktat-Dehydrogenase (LDH) bei Keimzelltumoren
Laktat-Dehydrogenase Isoenzym 1 (LDH-1) bei
Keimzelltumoren; eine routinemäßige Bestimmung wird in den gängigen Leitlinien jedoch noch nicht empfohlen - MAGE Antigene
Metanephrine beim Phäochromozytom
MUCl beim nicht kleinzelligen Bronchialkarzinom (NSCLC) oder beim Mammakarzinom
NSE beim kleinzelligen Bronchialkarzinom (SCLC) ,
Neuroblastom sowie seminomatösen Keimzelltumoren
Plazentare alkalische Phosphatase (PLAP) bei
seminomatösen Keimzelltumoren
PSA beim Prostatakrebs (Prostatakarzinom)
Thyreoglobulin (Tg) in jeder Konzentration beim
papillären oder follikulären Schilddrüsenkarzinom
Thymidinkinase
Cytokeratine, z.B. Cytokeratin 8, 18, 19
Liste 2: Zusätzliche zellspezifische Antigene
- ß2-Mikroglobulin (ß2-M),
- CA 54-9,
- CA 72-4,
- CA 195, Cancer Associated Serum Antigen (CASA) ,
- C-Peptid,
Cytokeratin,
Gastrin,
- Glucagon,
Glucose-6-phosphat-Isomerase (GPI),
Insulin,
Neopterin,
nukleares Matrixprotein 22 (NMP 22),
- Ostase,
P53-Autoantikörper,
Paraproteine,
- Prolaktin (PRL) ,
- Protein S-100,
- Serpin B4 (SCC) ,
Schwangerschaftsspezifisches ßl-Glykoprotein (SP-1), Tumor-assoziiertes Glykoprotein 12 (TAG 12),
- Thymidinkinase (TK) ,
Tissue Polypeptide antigen (TPA) ,
- Tissue Polypeptide specific antigen (TPS),
- Tumor M2-PK,
Vasoaktives intestinales Polypeptid (VIP) ,
- Transketolase-like-l-Protein (TKTL1) Die in Liste 1 und 2 genannten Antigene sind beispielhafte
Targets für spezifische Marker (z.B. Antikörper) . Über welche gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren Zellen, insbesondere Tumorzellen nachgewiesen werden können. Das Erfindungsgemäße Verfahren wird im Folgenden beispielhaft beschrieben. In der angehängten Figur 1 sind die Schritte a) bis d) des erfindungsgemäßen Verfahrens schematisch
dargestellt . Schritt A zeigt das Filtrieren der flüssigen Probe durch eine poröse Membran derart, dass nachzuweisende Zellen auf der Oberfläche der Membran zurückgehalten werden bzw. zu liegen kommen, Schritt B zeigt das Aufbringen einer ersten
Prozessflüssigkeit, welche ein erstes Mittel zum Markieren der nachzuweisenden Zellen enthält,
Schritt C zeigt das Inkubieren der Prozessflüssigkeit auf der Membran für einen vorbestimmten Zeitraum, wobei die
nachzuweisenden Zellen markiert werden (durch Schraffierung der markierten Zellen dargestellt) , und
Schritt D zeigt das Entfernen der Prozessflüssigkeit, z.B. durch Absaugen.
Die von dem umgebenden Medium (Probenflüssigkeit) zu
trennenden Feststoffe (Zelle, Partikel, Gewebe) werden vom Medium dadurch getrennt, dass Sie auf der Oberfläche einer Filtermembran verbleiben, die impermeabel für die zu
trennenden Feststoffe ist, jedoch permeabel für das
Umgebungsmedium und auch für den zu trennenden Feststoff verunreinigende Feststoffe ist. Die dazu sind Mittel
vorgesehen, die es erlauben, die Flussrate des Gases oder der Flüssigkeit durch die für sie permeable Oberfläche gezielt zu bestimmen und zu verändern. Vorzugsweise handelt sich in der medizinischen Diagnostik bei den Feststoffen um zelluläre Komponenten und bei dem umgebenden Medium um
Vollblut/Serum/Plasma, das auch Partikel enthalten kann, für die jedoch die Oberfläche auf Grund ihrer Eigenschaften permeabel ist (z.B. Leukozyten) .
Durch eine automatisierte Vorgehensweise werden neben der Probe alle für die Isolierung/Anreicherung und den Nachweis notwendigen Reagenzien gezielt auf die Oberfläche der Membran aufgebracht, beispielsweise durch einen Pipettier-Roboter . Die Probe sowie die Reagenzien können kontrolliert auf der Oberfläche zu Inkubationszwecken verbleiben und/oder durch die für sie permeable Oberfläche entfernt werden. Dies wird durch die Verwendung verschiedener Sensoren und Aktuatoren erreicht, die eine je nach den Erfordernissen geregelten
Durchtritt der Stoffe durch die Permeationsschicht (permeable Oberfläche) der Membran erlauben. Dabei kann die Regelung beispielsweise nach der Flussrate oder aber auch, bei besonders empfindlichen zellulären Komponenten, mittels am System angelegten Druckdifferenz (zum Umgebungsdruck) erfolgen .
Sämtliche Schritte, vom Aufbringen des Mediums auf die semipermeable Oberfläche bis zur selektiven Markierung werde vorzugsweise in einem Liquid Handling Roboter automatisch durchgeführt und überwacht. Dabei kann eine gleichzeitige, parallele Bearbeitung einer Mehrzahl von zu untersuchenden Proben erreicht werden.
Durch die Abarbeitung des sequenziellen
Isolierung/Anreicherungs-Protokolls und der selektiven
Nachweisreaktionen in einer Geräte-Einheit, ohne die bislang üblichen manuellen Zwischenschritte und den Probentransfer wird eine weniger fehleranfällige Analyse und eine schnellere Durchlaufzeit erreicht. Da bei dem hier vorgeschlagenen
Verfahren auch die Inkubation aller für den Nachweis
notwendiger Prozessflüssigkeiten bzw. Reagenzien mittels gezieltem Aufbringen auf die semipermeable Oberfläche und den gesteuerten Fluss durch diese Oberfläche geregelt wird, lassen sich die eingesetzten Reagenzienvolumina deutlich verringern, was bei den oft hochpreisigen immunochemischen Reagenzien einen erheblichen Kostenvorteil bedeutet. Sowohl beim manuellen immunochemischen Färben als auch bei den bekannten „Autostainern" ist das Inkubationsvolumen deutlich größer, da nicht nur die zu behandelnde Oberfläche benetzt werden muss, sondern eine sehr viel größere Fläche überspült wird bzw. das gesamte Inkubationsgefäß mit einem
ausreichenden Volumen befüllt werden muss.
Für die Durchführung der Anreicherung-/Wasch- und
Färbeschritte ist es notwendig:
(a) das Flüssigkeitsvolumen bzw. den Füllstand über der semipermeablen Oberfläche
(b) die Geschwindigkeit der Permeation der Flüssigkeit durch die semipermeable Oberfläche (c) die für die Permeation not' ■ endige Druckdifferenz zwischen der Umgebung und der Apparatur zu kennen und zur Steuerung der Permeationsgeschwindigkeit und zur Bestimmung des aktuell analysierten Probe-ivolumens zu nutzen .
Die dafür notwendige Sensorik und Aktorik kann sowohl
Bestandteil der Permeations-Apparatur als auch des Pipettier- Roboters sein oder aber verteilt vorliegen, was eine
Kommunikation zwischen den Komponenten erforderlich macht.
Für die individuelle Ansteuerung von jeder/ edem einzelnen Probe/Kanal wird mindestens 1 Drucksensor und 1 Ventil benötigt, mit dem sich die am System anliegende
Druckdifferenz zur Umgebung (also der Überdruck bzw.
Unterdruck) regeln lässt. Die jeweilige Druckdifferenz wird beispielsweise durch die Verbindung mit einem Vorratsgefäß hergestellt, in dem entweder ein Unter- oder ein Überdruck gegenüber der Umgebung herrscht.
Eine Überwachung des Durchflusses an Flüssigkeit kann
vorteilhafterweise durch einen Liquid Handling Roboter erfolgen, der dazu folgende Schritte übernimmt:
(a) Kanalspezifische Füllstandsmessung (z.B. kapazitiv) zur Bestimmung des Flüssigkeitsvolumens über der semipermeablen Membran zur Überlaufkontrolle und Steuerung des Zeitpunkts des Nachpipettierens ,
(b) Umwandlung der erfassten Meßdaten in Daten, die von einer externen Software gelesen und einer weiteren Verarbeitung zugeführt werden können,
(c) in Abhängigkeit vom jeweiligen Füllstand das
Zupipettieren eines weiteren Flüssigkeitsaliquots .
Die Geschwindigkeit, mit der die Permeation des Mediums durch die semipermeable Oberfläche erfolgt, wird vorteilhafterweise entweder über die Flussrate oder die zur Permeation
notwendige Druckdifferenz gesteuert. Dazu wird bei
empfindlichen zu isolierenden Komponenten eine möglichst geringe Druckdifferenz z.B. von bis zu 7 mbar angelegt, diese kann aber auch auf bis zu 50 mbar ansteigen. Die fortlaufende Messung der Druckdifferenz dient aber auch zur Feststellung, ob sich noch Probenmaterial über der semipermeablen Membran befindet, und kann somit als Signal für die beendete
Permeation dienen, oder aber als Analyse-Abschaltsignal genutzt werden, falls es während des Assay-Ablaufs zu einer Verstopfung der semipermeablen Oberfläche kommt.
Durch portioniertes Zugeben der Probe, z.B. durch einen
Liquid-handling-Roboter, und gelegentliches Aufmischen der Probe, kann eine Sedimentation der Zellen und damit
einhergehend ein Zellverlust weitestgehend vermieden werden.
Beispielhaft beschrieben werden die automatisierten Schritte für die Anreicherung und den immunochemischen Nachweis bzw. die moleklarbiologische Charakterisierung von CTCs in einer Blutprobe .
(i) Manuelle Arbeitsschritte:
· Einsetzen der zu untersuchenden Blutproben in das Gerät
• Einsetzen der benötigten vorbereiteten Reagenzien
• Einsetzen des sonstigen Verbrauchsmaterials (z.B.
Pipettenspitzen)
• Nach Analyse: Entfernen des Abfalls
(ii) Ablauf der automatisierten CTC Anreicherung und
immunochemischer CTC Nachweis:
• Mischen der Blutproben
• Entnahme der Blutprobe und Zugabe zu einem Verdünnungs- /Aufschluss-/Fixierungs-Puffer
• Inkubation von Blutprobe und Puffer
• wahlweise Konditionierung der Membran durch eine Reihe von Wasch- und Inkubationsschritten
• Pipettieren der behandelten Blutprobe in die Anordnung, so, dass die Membran bedeckt wird. • Durch Füllstands- und Druckdifferenz gesteuerte
Anreicherung der CTCs auf der Membran (z.B. durch
Füllstandssensorik in der Pipettenspitze, Druckmessung und Steuerung der Druckdifferenz mittels Ventil zum Unter- /Überdruckvorratsgefäss )
• Abschaltung des Permeationsvorgangs bei dauerhaftem Zusetzen der Membran
• Mildes Fixieren und Waschen der Zellen auf der
semipermeablen Membran
• Immunochemisches Färben durch Inkubation der Zellen auf der Membran mit den notwendigen Prozessflüssigkeiten
/Reagenzien
• Durch Füllstands- und Druckdifferenz gesteuerter
Assayablauf (Füllstandssensorik in der Pipettenspitze, Druckmessung und Steuerung der Druckdifferenz mittels Ventil zum Unter-/Überdruckvorratsgefäss )
• Abschaltung des Permeationsvorgangs bei dauerhaftem Zusetzen Membran
Wahlweise nachgeschaltet: (c) "moleklarbiologische
Charakterisierung" durch FISH ( Fluroescence in-situ
hybridization)
• Molekularbiologisches Färben durch temperierte
Inkubation auf der Membran mit den notwendigen Reagenzien
• Verhinderung von Verdunstung bei längerer Inkubation durch Auflegen eines Deckglases, welches nach der Inkubation wieder entfernt wird
(iv) Abschließende Schritte
• Pipettieren eines geeigneten Mountingmediums , welches auch verfestigend sein kann, auf die semipermeable Membran
• Auflegen eines Deckglases Schritt (iv) kann wahlweise wieder manuell erfolgen.
Beim sog. Immunostaining werden Körperzellen oder
Zellverbände (Gewebeschnitte) z.B. mit Antikörperlösungen, Label-Reagenzien, Waschpuffer und vielerlei
Prozessflüssigkeiten (zumeist sequentiell) inkubiert.
Typischerweise werden die gefärbten Objekte auf einem
Mikroskop-Ob ektträger (Slide) mit einem Mikroskop
analysiert .
Die für das Anfärben (Staining) erforderlichen fluidischen Prozessschritte sind sehr vielfältig und komplex. Die
verwendeten Reagenzien sind teilweise sehr kostspielig.
Ein automatisiertes Prozessieren auf einem Objektträger lässt eine kostensparende Prozessierung mit wenig Volumen kaum zu. Die Reagenzien werden meist über den Objektträger
hinweggespült, was neben einem hohen Verbrauch an Reagenzien u.U. auch mit einem teilweisen Verlust von Objekten
einhergehen kann.
Erfindungsgemäß werden die Reagenzien nicht über eine
Oberfläche hinweggespült, sondern durch eine Membran
hindurchgespült, was Reagenzien einspart, den Verlust von Objekten vermeidet und eine generell bessere Prozesskontrolle erlaubt.