DESCRIPCIÓN

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un dispositivo automático de posicionamiento para corte de tejido tridimensional en muestras vivas o fijadas, que tiene aplicación, principalmente, en histología y neurociencia, también en anatomía, bioquímica o farmacología.

Estado de la técnica anterior a la invención En las últimas dos décadas se ha incrementado el uso de vibrátomos (micrótomos de vibración) en los laboratorios de neurociencias con el fin de simplificar la complejidad tridimensional del sistema objeto de estudio e investigar la conectividad anatomo- funcional de grupos neuronales seleccionados. Estos equipos permiten obtener cortes relativamente gruesos (cientos de μηι de espesor) sin tener que procesar el tejido en medios de inclusión; por lo tanto, permiten realizar estudios electrofisiológicos in vitro en los que investigar las propiedades eléctricas y el acoplamiento funcional entre las poblaciones neuronales, así como los detalles finos de la conectividad estructural. El problema de los vibrátomos comerciales existentes es que permiten realizar cortes en un único plano definido por el usuario, no pudiendo variar el plano una vez iniciado el corte. Además, estos planos están sujetos a las direcciones axiales y longitudinales. Esto se traduce en la imposibilidad física de estudiar la mayor parte de las vías de procesamiento de información, por ejemplo, en el cerebro, por su anatomía curva. Es decir, un vibrátomo convencional en la mayoría de los casos secciona los tractos axonales entre las poblaciones neuronales que se pretendía estudiar. Por este motivo, los vibrátomos convencionales reducen su campo de utilidad a estudios fisiológicos entre poblaciones neuronales locales, en marcada contradicción con los requerimientos de una estructura tridimensional como el cerebro, constituido por circuitos neuronales altamente distribuidos por territorios físicamente distantes y que se comunican por conexiones de largo recorrido. La solicitud de patente WO2013095972 A2 (SAKURA FINETEK USA INC) divulga un aparato que tiene un dispositivo para seccionar muestras, el cual tiene un mecanismo accionable para el corte de secciones de una muestra y un soporte de muestra que es accionable para sujetar dicha muestra. Además tiene un sistema de accionamiento acoplado con el soporte de la muestra para accionar el propio soporte; y un elemento de vaivén acoplado al sistema de accionamiento para proveer de movimiento vertical al soporte de la muestra. El elemento de vaivén se mueve alternativamente en un ángulo de rotación de menos de 180°. Este es uno de los sistemas según el cual, y a diferencia del sistema propuesto en la presente invención, no se puede cambiar la orientación de la muestra una vez iniciado el proceso de corte, y tampoco se pueden realizar cortes siguiendo tractos. Otras diferencias con la presente invención y que hacen que ésta sea especialmente ventajosa son, entre otras, que según WO2013095972:

• la muestra tiene que estar fijada en resina, parafina o materiales similares por lo que no puede cortar tejidos vivos como en el caso de la presente invención,

• la muestra no puede estar sumergida en líquido tamponado,

• el dispositivo no permite mantener una muestra a temperatura inferior a la temperatura ambiente,

y no puede realizar cortes siguiendo tractos, al menos de tejido vivo.

El documento EP0386840 A (LAB ELECTRONIQUE PHILIPS) divulga un dispositivo micromanipulador para desplazar un soporte de muestra con varios grados de libertad con la ayuda de elementos de desplazamiento fijados a fuelles elásticos que participan en la transmisión del movimiento a través de una pared. El soporte de la muestra puede realizar al menos un movimiento de traslación y al menos un movimiento de rotación mediante varillas que transmiten el movimiento. El soporte puede también rotar no sólo en el plano en el que se encuentra, sino también en un plano inclinado respecto al primero. Sin embargo, a pesar de estos grados de libertad, este sistema solo permite la rotación de la muestra como se indica en la figura 3 del documento. Y además tampoco permite realizar cortes siguiendo tractos. Por lo tanto mantiene también diferencias con el sistema de la presente invención que hacen que ésta sea claramente ventajosa respecto al dispositivo descrito en EP0386840.

US5461953 A (MCCORMICK J B) divulga un método y un aparato para cortar secciones de tejido para generar tiras con cualquier secuencia de sección deseada. Es un micrótomo tridimensional que permite el movimiento relativo de la muestra de tejido y la cuchilla en tres dimensiones. También puede incluir una cuchilla con capacidad de avanzar en dirección longitudinal y proporcionar un borde de corte fresco a la zona de corte del micrótomo. Además de que el aparato divulgado en US5461953 no es un dispositivo de posicionamiento que se puede incluir en un vibrátomo como se describe en la presente invención, el microtomo divulgado en US5461953 genera movimiento relativo únicamente si la muestra esta endurecida, en caso contrario no puede cortarla.

Otras ventajas del dispositivo de la presente invención son: que según US5461953

• la muestra tiene que estar fijada en resina, parafina o materiales similares por lo que no puede cortar tejidos vivos.

• la muestra no puede estar sumergida en líquido tamponado.

• no permite mantener una muestra a temperatura inferior a la temperatura ambiente.

Mientras que en el caso de la presente invención la muestra puede estar viva, se puede sumergir en líquido tamponado y puede estar a temperatura inferior a la temperatura ambiente.

DE10258555 A1 (LEICA Mikrosysteme GMBH) divulga un método de preparación en un micrótomo o ultra-micrótomo en el que antes de la inserción de la muestra en el micrótomo se determina la distancia entre la superficie cortada de la muestra y el soporte de la muestra y se transmite al micrótomo. También se divulga un método para medir la trayectoria que permite detectar cambios en la distancia mencionada, y un sistema de posicionamiento automático de una muestra en un micrótomo.

Otros documentos relacionados con dispositivos para seccionar muestras son DE 202004007658 que divulga un micrótomo de vibración para preparar muestras blandas, y tiene elementos de alineación circulares o prismáticos para la plataforma de soporte del contenedor de vibración y el porta-cuchilla, dispuestos en paralelo y perpendiculares a la dirección de vibración. O el documento US 7954406 B2, que se refiere a un dispositivo para medir la desviación vertical de la cuchilla vibrante durante la operación de corte en un micrótomo de vibración.

Los vibrátomos convencionales presentan marcadas limitaciones que ralentizan el avance de la neurociencia. La estructura tridimensional del cerebro está constituida por circuitos neuronales altamente distribuidos por territorios físicamente distantes y que se comunican por conexiones de largo recorrido. Los estudios dirigidos a entender la función de los circuitos cerebrales conducirán a un mejor entendimiento del cerebro como sistema y con ello de sus patologías, y necesitan información electrofisiológica de dichas poblaciones neuronales distribuidas. Estos estudios no se pueden realizar hoy en día con los vibrátomos existentes por lo que todas las posibilidades experimentales se reducen a estudios in vivo, con un rendimiento menor por su complejidad, y en los que tanto los registros múltiples, como las manipulaciones causales (farmacológicas y/o genéticas) necesarias para una comprensión profunda del cerebro son limitados. No existe en la actualidad un sistema de posicionamiento tridimensional de muestras, y de modo preferente, para vibrátomo, que permita presentar la muestra al micrótomo de vibración (vibrátomo) para que éste la corte en un plano cualquiera de forma automática. No existe tampoco, por tanto, ningún sistema automático que permita variar el plano en el que la muestra es presentada al micrótomo para que éste realice un corte siguiendo una trayectoria cualquiera en el espacio.

A la vista de lo anterior, es necesario encontrar una solución al problema de la limitación de los planos de corte de los vibrátomos conocidos.

Con el sistema de posicionamiento de la presente invención se puede elegir cualquier plano de orientación para presentar una muestra a un vibrátomo con una orientación cualquiera previamente establecida atendiendo a un plano seleccionado en un entorno tridimensional virtual. También es posible variar la posición y orientación de la muestra a medida que el vibrátomo está seccionándola, de forma que es posible realizar un corte tomográfico de un plano cualquiera que siga una trayectoria tridimensional curva. Gracias a ello, los circuitos de largo recorrido podrán ser diseccionados y estudiados en experimentos electrofisiológicos in vitro.

Descripción detallada de la invención La presente invención se refiere a un dispositivo automático de posicionamiento para corte de tejido tridimensional en una muestra de tejido vivo o fijado, caracterizado porque al menos comprende:

• una plataforma (1) para depositar las muestras de tejido

• un subsistema electromecánico que al menos comprende

o un primer motor (2) y primeros medios mecánicos que imprimen un movimiento angular a la plataforma (1) o un segundo motor (3) y segundos medios mecánicos que imprimen un movimiento de inclinación de la plataforma (1).

El dispositivo automático de posicionamiento de la invención comprende además medios electrónicos de control del movimiento del subsistema electromecánico.

Según realizaciones preferentes los primeros medios mecánicos son dos engranajes dentados, concretamente un primer engranaje (4) y un segundo engranaje (5).

Según realizaciones preferentes adicionales los segundos medios mecánicos son un tercer engranaje de tipo tornillo sinfín y un cuarto engranaje dentado. El tercer engranaje de tipo tornillo sinfín está implementado en el extremo del eje de plataforma (6), en el lado cercano al segundo motor (3) y el cuarto engranaje dentado está fijado al eje del segundo motor (3). El engrane de los segundos medios mecánicos se produce en el interior de la base del segundo motor (7).

En una realización especialmente preferida del dispositivo, el subsistema electromecánico comprende un primer motor y primeros medios mecánicos que son dos engranajes dentados que transmiten el movimiento angular a la plataforma (1) en la que se depositan las muestras de tejido, un segundo motor (3) y segundos medios mecánicos que comprenden un tercer engranaje de tipo tornillo sinfín (1 1) y un cuarto engranaje dentado (12) que dota a la plataforma (1) anteriormente mencionada de la posibilidad de modificar la inclinación con la que la cuchilla del vibrátomo (8) penetra en el tejido, consiguiendo con estos dos grados de libertad la posibilidad de realizar cortes histológicos multidireccionales. El cuarto engranaje o rueda dentada (12) y el tornillo sinfín (1 1) son los elementos que proporcionan la unión de engranajes y que a su vez produce el movimiento angular del soporte de la muestra.

El dispositivo de la invención comprende dos recipientes (9, 10) con unas dimensiones aproximadamente iguales a la de los recipientes que se emplean habitualmente en los micrótomos de vibración, pero modificados para disponer del subsistema electromecánico descrito.

De acuerdo con la invención, de los dos recipientes mencionados uno de ellos, recipiente interior (9), es una cubeta contenida en el interior del segundo recipiente, recipiente exterior (10), que es por lo tanto de mayor tamaño que la cubeta. Esta cubeta se fabrica de un material que tenga unas buenas propiedades de transmisión térmica. La cubeta se puede fabricar de cualquier material metálico o aleación, que no se oxide con facilidad, tal como Ti, Cr, Va, Mo, Mn, Ni, Al, acero inoxidable. De modo preferente la cubeta es de acero inoxidable, aluminio, alumide (nylon relleno con polvo de aluminio) para conseguir la máxima transmisión térmica entre el hielo que hay que disponer (si la muestra no está fijada) en el recipiente exterior (10) de mayor tamaño, y la solución que mantiene el tejido. Además dicha cubeta es la misma tanto para cortar tejido vivo, como muestras fijadas.

El recipiente exterior (10) debe ser de tales dimensiones y características que permita contener hielo y mantener así una temperatura inferior a la temperatura ambiente. Según realizaciones particulares, el recipiente exterior (10), de mayor tamaño que la cubeta, y la plataforma (1) de la cubeta están compuestos por un material plástico para reducir el peso del dispositivo y que también resista el agua. Un material adecuado puede ser el metacrilato, PLA (ácido poliláctico) o ABS (acrilonitrilo- butadieno- estireno); preferentemente están compuestos por plástico de nylon blanco con un acabado mate.

El dispositivo automático de posicionamiento comprende además preferentemente dos finales de carrera que permiten posicionar la plataforma (1) en el punto de origen cada vez que se realiza un corte, de modo que se optimiza dicho corte y se pueda obtener la trayectoria deseada.

Los engranajes y eje se pueden fabricar de diversos materiales, que pueden ser metales que no se oxiden o cualquier tipo de polímero resistente a la humedad. Según realizaciones particulares están realizados en plástico, siendo recomendable también su fabricación en aluminio. También pueden ser engranajes disponibles en el mercado.

Los engranajes se pueden fabricar de distintos modos, ya sea por corte láser, mediante sinterizado láser selectivo o mediante cualquier sistema de fabricación que permita un alto detalle. Según realizaciones particulares los engranajes son fabricados por sinterizado mediante láser (SLS).

Según una realización particular adicional, los engranajes están cortados mediante un cortador láser en metacrilato. El dispositivo automático de posicionamiento según la invención también puede comprender medios para el control del subsistema electromecánico: - medios para crear prototipos electrónicos de código abierto,

- medios de control de dos motores paso a paso que accionan los engranajes del dispositivo. Estos medios de control del sistema electromecánico están compuestos según una realización particular por:

- Arduino Mega (plataforma de creación de prototipos electrónicos de código abierto)

- Ramps 1.4

- un conjunto de drivers para controlar motores A4988

- dos motores paso a paso (steppers) que accionan los engranajes anteriormente descritos, por ejemplo 2 motores paso a paso nema 14 de la marca Pololu.

El firmware de Arduino se limita a recibir órdenes recibidas por puerto USB enviadas desde MATLAB. La secuencia de control se produce de la siguiente forma:

En MATLAB se selecciona la trayectoria o posición deseada. MATLAB, a través del puerto USB del PC, le transmite a Arduino la secuencia de comandos a ejecutar.

- Arduino, a través de la shield RAMPS 1.4, le manda la cantidad de pulsos y dirección necesarios a los drivers A4988. Éstos últimos son los encargados de traducir estos pulsos a polarizaciones de las bobinas de los motores paso a paso.

Mediante la combinación de estos motores, el sistema de control empleado y los engranajes utilizados, se consiguen resoluciones angulares y de inclinación de milésimas de grado. La velocidad del sistema de control va configurada en función de la velocidad de avance a la que se configure el dispositivo.

Todo el dispositivo puede ser alimentado mediante un transformador universal de 12V y 2A, tal que dicha fuente de alimentación de 12 V proporciona el intervalo de tensión necesaria para el sistema Arduino y los steppers.

Además, la presente invención se refiere también a un aparato, preferentemente un vibrátomo (8) que comprende un dispositivo de posicionamiento tal como se ha definido. La presente invención se refiere también al uso del dispositivo automático de posicionamiento definido, o de un aparato que comprenda el dispositivo de posicionamiento, tal como un vibrátomo (8), en histología, neurociencia, anatomía o bioquímica. Las muestras para el corte con el dispositivo de la invención pueden ser muestras vivas o fijadas.

Según realizaciones particulares, el uso del dispositivo automático de posicionamiento o del vibrátomo (8) que comprenda este dispositivo, comprende:

- disponer un líquido tamponado en la cubeta

- disponer hielo en el recipiente exterior de mayor tamaño

- sumergir una muestra de tejido viva en el líquido tamponado contenido en la cubeta,

- posicionar dicha muestra para ser seccionada,

- iniciar el proceso de corte y realizar cambios de orientación mientras el corte se está efectuando según la necesidades del usuario.

Según realizaciones particulares el uso del dispositivo automático de posicionamiento, o del vibrátomo (8), tal como han sido definidos, comprende realizar cortes de la corteza cerebral paralelos a capas definidas de la misma, en cerebros extraídos de animales pequeños de laboratorio

Según realizaciones particulares adicionales las muestras de tejido vivo son muestras conectadas funcionalmente y localizadas en distintas regiones cerebrales.

El dispositivo automático de posicionamiento de la invención, o el aparato que incluya dicho dispositivo, preferentemente un vibrátomo (8), según la invención permite realizar cortes de la corteza cerebral paralelos a capas definidas de la misma.

La mayor ventaja del sistema es que permite cortes en tejido vivo con cambios de orientación mientras el corte se está efectuando.

Las ventajas de la presente invención son entre otras:

- Posicionamiento automático de una muestra viva o fijada en cualquier orientación del espacio para su corte en vibrátomo. Dicho posicionamiento se realiza gracias a un entorno virtual informatizado que facilita dicha operación al usuario, - ajuste dinámico y sincronizado de la orientación 3D de la muestra gracias al dispositivo de la presente invención, para posibilitar el corte tomográfico de un plano cualquiera, incluidos aquellos que sigan una trayectoria tridimensional curva.

- permite mediante la combinación de dos motores seguir trayectorias de corte multidimensionales predefinidas (a través de una imagen de resonancia magnética, por ejemplo),

- gracias a su capacidad para cortar muestras de tejido vivo siguiendo trayectorias curvas, esta invención permite la preparación de rodajas de tejido para estudios electrofisiológicos en poblaciones neuronales conectadas funcionalmente y localizadas en distintas regiones cerebrales. Dicha aplicación es inédita a día de hoy y se le ha llamado "electrofisiología de circuitos",

- gracias a su capacidad para cortar muestras en cualquier plano del espacio tiene aplicación en cualquier campo de la histología con muestras fijadas de todo tipo. En el ámbito de la neurociencia y para muestras fijadas esta capacidad permite: seccionar complejos tractos de fibras nerviosas para estudiar su densidad, localización de sus proyecciones, estructura 3D. Además, permitirá realizar cortes de tejido seleccionando un plano por su interés anatómico y no por limitaciones o restricciones impuestas por el sistema de corte, por ejemplo, cortes de la corteza cerebral paralelos a capas definidas de la misma serían fáciles de realizar, algo imposible en la actualidad,

- accesibilidad para que el usuario capture los cortes histológicos con facilidad,

- permite que la muestra esté sumergida en liquido tamponado para mantenerla viva,

- el dispositivo permite que la muestra esté a una temperatura baja gracias a que soporta que la muestra esté rodeada de hielo,

- funciona tanto con muestras fijadas como con tejido vivo,

- ofrece la posibilidad de anclaje a un vibrátomo comercial, como por ejemplo el de Leica Biosystems, Modelo VT 1200S.

Breve descripción de las figuras.

Figura 1. Detalle del dispositivo de posicionamiento 3D desarrollado.

Sistema de posicionamiento 3D compuesto por los siguientes elementos:

1 Base para la muestra que se pretende cortar.

2 Motor paso a paso para movimiento de rotación.

3 Motor paso a paso para movimiento de inclinación.

4 Rueda dentada motriz para rotación. 5. Rueda dentada secundaria para rotación.

6. Eje trasmisor de inclinación.

7. Caja de engranajes para inclinación.

9. Recipiente interior en el cual se deposita el líquido tamponado. 10. Recipiente exterior en el cual se contiene el hielo.

Figura 2. Representación en 3D del vibrátomo comercial VT 1200S de Leica Biosystems.

Figura 3. Muestra una vista superior del dispositivo de posicionamiento 3D.

La Figura 3a muestra una vista a través del corte por la línea H-H de la figura 3

Se ilustra en la figura la unión del sinfín (11) y la rueda dentada (12) para conformar el engranaje que proporciona inclinación a la muestra.

La Figura 3b muestra una vista a través del corte por la línea F-F de la figura 3.

Se representa cómo está unida la rueda dentada (12) al eje de transmisión (6). La Figura 3c muestra una vista a través del corte por la línea G-G de la figura 3.

En la parte derecha del sistema se encuentra la unión de engranajes que proporciona movimiento angular al soporte para la muestra. Esta unión está compuesta por un sinfín (11) y una rueda dentada (12). El movimiento es trasmitido gracias al motor paso a paso (3) el cual es solidario al sinfín (1 1). Esta transmisión se puede ver más claramente en la figura 3a.

Figura 4. Muestra una vista frontal del dispositivo, una vista desde el elemento 5 de la figura 1.