Beschreibung

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Autoimmunreaktion hervorrufende Peptide, Komplexe dieser Peptide mit Molekülen des Major Histocompatibility Komplex (MHC) , mit den Peptiden oder/und den Komplexen aus Peptiden und MHC-Molekülen reagie- rende T-Zellsubpopulationen sowie diagnostische und therapeu¬ tische Anwendungen dieser Verbindungen.

Die Aufklärung der molekularen Zusammenhänge bei der Entste¬ hung von Autoimmunerkrankungen, wie etwa der rheumatoiden Arthritis und des juvenilen Diabetes (IDDM) , ist innerhalb der letzten Jahre schnell fortgeschritten und läßt mittlerweile konkrete Anwendungen für die frühe Diagnose und eine kausale Therapie dieser Erkrankungen erkennen.

Heute gilt als gesichert, daß bei der Entstehung dieser Er¬ krankungen neben einer genetischen Disposition auch Umweltfak¬ toren eine Rolle spielen. Auf der Ebene der genetischen Risi¬ kofaktoren sind z.B. bei dem IDDM nur einige wenige Allele der MHC-Klasse II-Antigene eng mit dieser Erkrankung assoziiert. Somit besteht die Möglichkeit, über eine Analyse dieser Allele eine Risikogruppe für IDDM zu definieren (vgl. z.B. Thomson et al., Am. J. Hum. Genet. 43 (1988), 799-816 oder Todd et al. , Nature 329 (1987) , 599-604) .

Bei den an der Entstehung von IDDM beteiligten Umweltfaktoren handelt es sich wahrscheinlich um exogene, als Immunogen wirk¬ same Peptidsequenzen. In diesem Zusammenhang werden u.a. vi- rale Antigene, die partielle Homologien zu körpereigenen Strukturen aufweisen, diskutiert. Unter besonderen Umständen, insbesondere in der postnatalen Phase, können durch die Nah¬ rung aufgenommene Antigene, wie z.B. Rinderserumalbumin, eine Immunantwort induzieren, welche aufgrund von Homologien zu

körpereigenen Strukturen einen autoaggressiven Prozeß in Gang setzen können.

Typisch für den Krankheitsverlauf bei IDDM ist die progressive Zerstörung der Pankreas-ß-Zellen durch cytotoxische Lymphozy- ten. Dieser Prozeß setzt schon lange vor einer erkennbaren Störung des Glucosestoffwechseis ein. Bei einer erkennbaren Manifestation des Diabetes sind bereits über 90 % der ß-Zellen zerstört. Es wäre deshalb außerordentlich wichtig, diese auto- aggressiven T-Zellen frühzeitig bei Risikopersonen zu erfas¬ sen, um die betroffenen Individuen einer kausalen Therapie zuführen zu können.

Es gilt heute als gesichert, daß die Zerstörung von körper- eigenem Gewebe bei Autoimmunerkrankungen anfänglich sehr lang¬ sam verläuft. Im Anfangsstadium dieses Prozesses erkennen die autoaggressiven T-Zellen wahrscheinlich nur ein oder wenige Autoantigene. Arbeiten von Kaufman et al. (Nature 368 (1993), 69-72) und Tisch et al. (Nature 368 (1993), 72-78) an einem Tiermodell (NOD-Maus) des Typ I-Diabetes haben ergeben, daß beim spontan auftretenden Diabetes dieses Mausstammes die initiale, über T-Zellen vermittelte Auto-Immunreaktion gegen die Glutaminsäure-Decarboxylase gerichtet ist. Dabei werden in der NOD-Maus anfänglich nur 1 bis 2 Epitope am C-Terminus der Glutaminsäure-Decarboxylase (GAD) erkannt. Zu diesem Zeitpunkt lassen sich - wie oben ausgeführt - noch keine Veränderungen im Glucose-Metabolismus feststellen, während hingegen eine Perinsulitis bereits nachweisbar ist. Erst im weiteren Krank¬ heitsverlauf weitet sich das Spektrum der von den autoaggres- siven T-Zellen erkannten Peptide der GAD aus. Nach einer Mani¬ festation des Diabetes sind auch präaktivierte T-Zellen gegen andere Inselzell-Antigene nachweisbar, z.B. Peripherin, Heat Shock Protein HSP 65 und Carboxypeptidase H.

Es gibt Hinweise, daß auch beim Menschen die Immunantwort gegen GAD ursächlich mit dem Entstehen des Typ I-Diabetes verknüpft ist. So lassen sich beispielsweise in über 80 % der

Prädiabetiker Autoantikörper gegen GAD nachweisen, wobei die ätiologische Rolle dieser Autoantikörper allerdings gering eingeschätzt wird. Man nimmt vielmehr an, daß beim Typ I-Dia¬ betes eine progressive Zerstörung der Pankreas-ß-Zellen durch T-Lymphozyten vorliegt . Diese gegen GAD gerichteten T-Lympho¬ zyten konnten bereits von mehreren Forschergruppen nachgewie¬ sen werden (Harrison et al. , J. Clin. Invest. 89 (1992) , 1161; Honeyman et al . , J. Exp. Med. 177 (1993), 535) . Die von diesen Gruppen gefundenen Autoantikörper reagierten mit einem aus den Aminosäuren 208 bis 404 bestehenden Peptidfragment des GAD 67 kd Moleküls.

In EP-A-0 519 469 werden autoimmun reagierende Polypeptide aus dem humanen GAD 65 kd Molekül offenbart. Diese Polypeptide haben die Aminosequenz :

X-P-E-V-K- (T oder E) -K-Z,

wobei X eine fakultative, aus 1 bis 10 Aminosäuren ausgewählte Sequenz ist und Z eine fakultative, aus 1 bis 8 Aminosäuren ausgewählte Sequenz ist .

In der europäischen Patentanmeldung Nr. 95 100 764.0 werden autoreaktive Peptidsequenzen aus der humanen GAD 65 kd vor- geschlagen, umfassend:

(a) die Aminosäuresequenz

G-M-A-A-L-P-R-L-I-A-F-T-S-E-H-S-H-F-S-L-K-K-G-A-A,

(b) die Aminosäuresequenz

E-R-G-K- -I-P-S-D-L-E-R-R-I-L-E-A-K-Q-K,

(c) eine der in Abb. 1 oder 2 dargestellten AminosäureSequen¬ zen,

(d) Teilbereiche der in (a) , (b) oder/und (c) dargestellten Aminosäuresequenzen mit einer Länge von mindestens 6 Aminosäuren oder/und

(e) Aminosäuresequenzen, die eine im wesentlichen äquivalente Spezifität oder/und Affinität der Bindung an MHC-Moleküle wie die in (a) , (b) , (c) oder/und (d) dargestellten Ami¬ nosäuresequenzen zeigen.

Eine der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Aufgabe be¬ stand darin, neue autoreaktive Peptide bereitzustellen, die mit T-Zellen aus Typ I-Diabetikern, insbesondere mit T-Zellen aus frisch entdeckten Typ I-Diabetikern reagieren und somit frühe Auto-Epitope definieren.

Diese Aufgabe wird gelöst durch Peptide, Peptid-Derivate oder analog bindende Moleküle, die zum Nachweis, zur Isolierung, zur Vermehrung, zur Anergisierung oder/und zur Elimination autoreaktiver T-Zellen geeignet sind. Ein Gegenstand der Er- findung ist somit ein Peptid oder Peptid-Derivat, umfassend:

(a) die Aminosäuresequenz (I)

D-V-N-Y-A-F-L-H-A-T-D-L-L-P-A-C-D-G-E-R,

(b) die Aminosäuresequenz (II)

S-N-M-Y-A-M-M-I-A-R-F-K-M-F-P-E-V-K-E-K,

(c) die Aminosäuresequenz (III) N-W-E-L-A-D-Q-P-Q-N-L-E-E-I-L-M-H-C-Q-T,

(d) die Aminosäuresequenz (IV) T-L-K-Y-A-I-K-T-G-H-P-R-Y-F-N-Q-L-S-T-G,

(e) die Aminosäuresequenz (V) P-R-Y-F-N-Q-L-S-T-G-L-D-M-V-G-L-A-A-D-W,

(f) die Aminosäuresequenz (VI) T-Y-E-I-A-P-V-F-V-L-L-E-Y-V-T-L-K-K-M-R,

(g) die Aminosäuresequenz (VII) F-F-R-M-V-I-S-N-P-A-A-T-H-Q-D-I-D-F-L-I,

(h) Teilbereiche der in (a) , (b) , (c) , (d) , (e) , (f) oder/und (g) dargestellten Aminosäuresequenzen mit einer Länge von mindestens 6 Aminosäuren oder/und

(i) Aminosäuresequenzen, die eine im wesentlichen äquivalente Spezifität oder/und Affinität der Bindung an MHC-Moleküle wie die in (a) , (b) , (c) , (d) , (e) , (f) , (g) oder/und (h) dargestellten Aminosäuresequenzen zeigen.

Die Aminosäuresequenzen (I) bis (VII) entsprechen den Amino- säureresten 86-105 (I), 246-265 (II) , 146-165 (III) , 166-185

(IV) , 176-195 (V) , 206-225 (VI) und 556-575 der humanen GAD 65.

Überraschenderweise wurde festgestellt, daß Peptide, welche den Aminosäuresequenzen (I) bis (VII) der humanen GAD 65 ent¬ sprechen, eine spezifische Reaktion mit T-Zellsubpopulationen zeigten, die aus frisch entdeckten Typ I-Diabetikern isoliert wurden. Somit handelt es sich bei den erfindungsgemäßen Pepti¬ den um frühe Autoepitope, mit deren Verwendung eine sehr frühe Diagnose des Typ I-Diabetes ermöglicht wird. Weiterhin können die erfindungsgemäßen Peptide auch therapeutisch angewendet werden, indem die mit den Peptiden reaktive T-Zellpopulation ausgeschaltet wird.

Bevorzugte Beispiele für T-Zellsubpopulationen, mit denen die erfindungsgemäßen Peptide der Aminosäuresequenzen (I) oder/und (II) reagieren, sind die T-Zellinien R.B. und M.C. oder T- Zellen mit einer äquivalenten Bindungsspezifität .

Die Aminosäuresequenzen (I) bis (VII) sind Teilbereiche aus der 65 kD Isoform der humanen Glutaminsäure-Decarboxylase

(GAD) , deren vollständige Aminosäuresequenz von Bu et al.

(Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89 (1992) , 2115 ff.) beschrieben wurde. Die Aminosäuresequenzen (I) bis (VII) wurden durch Anlegen von T-Zellinien aus dem peripheren Blut von Typ I- Diabetikern und anschließende in vitro Stimulation mit rekom- binanter humaner GAD und Testen dieser T-Zellinien in einem Proliferationsassay mit synthetischen Peptidsequenzen gefun¬ den, die aus der humanen GAD-Sequenz abgeleitet wurden.

Die erfindungsgemäßen Peptide können durch bekannte Synthese¬ verfahren mittels chemischer Methoden erzeugt werden oder durch Klonierung und Expression einer für diese Peptide codie- renden DNA-Sequenz in einer geeigneten Wirtszelle, insbeson¬ dere E.coli, auf gentechnische Weise hergestellt werden.

Weiterhin umfaßt die vorliegende Erfindung auch Peptide mit Teilbereichen der spezifisch angegebenen Aminosäuresequenzen (I) , (II) , (III) , (IV), (V) , (VI) oder (VII) , die eine Länge von mindestens 6 Aminosäuren, vorzugsweise von mindestens 8 Aminosäuren, besonders bevorzugt von mindestens 10 Aminosäuren und am meisten bevorzugt von mindestens 15 Aminosäuren auf¬ weisen. Die minimale Länge eines erfindungsgemäßen Peptids wird durch seine Fähigkeit bestimmt, ein MHC-Molekül zu erken¬ nen, mit ihm spezifisch zu binden und mit dem entsprechenden T-Zellrezeptor zu reagieren.

Die maximale Länge der aus der GAD stammenden und MHC-binden- den Abschnitte in einem erfindungsgemäßen Peptid beträgt vor¬ zugsweise 100 Aminosäuren, besonders bevorzugt 50 Aminosäuren und am meisten bevorzugt 25 Aminosäuren.

Neben Peptiden mit den Aminosäuresequenzen (I) bis (VII) oder Teilbereichen davon betrifft die Erfindung auch noch Peptide mit Aminosäuresequenzen, die im wesentlichen äquivalente Spe- zifität oder/und Affinität der Bindung an MHC-Moleküle wie die

zuvor genannten Sequenzen zeigen und die vorzugsweise durch Substitution, Deletion oder Insertion einzelner Aminosäure¬ reste oder kurzer Abschnitte von Aminosäureresten aus den Aminosäuresequenzen (I) bis (VII) abgeleitet sind oder analog bindende verfremdete Substanzen.

Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung auch Peptid- varianten, die in ihrer Sequenz mit den oben genannten Amino¬ säuresequenzen nicht völlig übereinstimmen, sondern nur glei- ehe oder nahe verwandte "Ankerpositionen" aufweisen. Die Be¬ zeichnung "Ankerposition" bedeutet in diesem Zusammenhang einen für die Bindung an ein MHC-Molekül, insbesondere an ein MHC-Molekül der Klassen DR1, DR2, DR3 , DR4 oder DQ, wesentli¬ chen Aminosäurerest. Die Ankerposition für das DRB1 ^* 0401-Bin- dungsmotiv sind z.B. bei Hammer et al . , Cell 74 (1993) , 197- 203, angegeben. Derartige Ankerpositionen sind in erfindungs¬ gemäßen Peptiden konserviert oder gegebenenfalls durch Amino¬ säurereste mit chemisch sehr nahe verwandten Seitenketten ersetzt (z.B. Alanin durch Valin, Leucin durch Isoleucin und umgekehrt) . Die Bestimmung der Ankerpositionen in den erfin¬ dungsgemäßen Peptiden kann auf einfache Weise durch Tests von Varianten der oben angegebenen spezifischen Peptide auf ihre Bindungsfähigkeit an MHC-Moleküle erfolgen. Erfindungsgemäße Peptide sind dadurch gekennzeichnet, daß sie eine im wesentli- chen äquivalente Spezifität oder/und Affinität der Bindung an MHC-Moleküle wie die zuvor genannten Peptide zeigen. Vorzugs¬ weise besitzen die aus Peptiden mit den Aminosäuresequenzen (I) bis (VII) abgeleiteten Peptide eine Sequenzhomologie von mindestens 30 %, besonders bevorzugt von mindestens 50 % und am meisten bevorzugt mindestens 60 % mit den Ausgangspeptiden oder Teilsequenzen davon.

Beispiele für Varianten der spezifisch angegebenen Peptide sind die entsprechenden homologen Peptidabschnitte aus der humanen GAD 67, deren vollständige Aminosäuresequenz ebenfalls von Bu et al. , Supra, beschrieben wurde.

Der Begriff "im wesentlichen äquivalente Spezifität oder/und Affinität der Bindung an MHC-Moleküle" umfaßt auch eine gegen¬ über den Aminosäuresequenzen (I) bis (VII) verbesserte Bin- dungsspezifität oder/und -affinität, die insbesondere bei verkürzten Peptiden gefunden wird, die eine Länge von vorzugs¬ weise 8 bis 15 Aminosäuren besitzen.

Weiterhin umfaßt die vorliegende Erfindung auch Peptid-Deriva- te. Dieser Begriff umfaßt Peptide, in denen eine oder mehrere Aminosäuren durch eine chemische Reaktion derivatisiert worden sind. Beispiele von erfindungsgemäßen Peptid-Derivaten sind insbesondere solche Moleküle, in denen das Backbone oder/und reaktive Aminosäureseitengruppen, z.B. freie Aminogruppen, freie Carboxylgruppen oder/und freie Hydroxylgruppen, deriva- tisiert worden sind. Spezifische Beispiele für Derivate von Aminogruppen sind Sulfonsäure- oder Carbonsäureamide, Thio- urethanderivate und Ammoniumsalze, z.B. Hydrochloride. Bei¬ spiele für Carboxylgruppenderivate sind Salze, Ester und Ami- de. Beispiele für Hydroxylgruppenderivate sind O-Acyl- oder O- Alkylderivate. Weiterhin umfaßt der Begriff Peptid-Derivat gemäß vorliegender Erfindung auch solche Peptide, in denen eine oder mehrere Aminosäuren durch natürlich vorkommende oder nicht natürlich vorkommende Aminosäurehomologe der 20 "Stan¬ dard"-Aminosäuren ersetzt werden. Beispiele für solche Homo- löge sind 4-Hydroxyprolin, 5-Hydroxylysin, 3-Methylhistidin, Homoserin, Omithin, ß-Alanin und 4-Aminobuttersäure.

Insbesondere sind solche Peptide bevorzugt, welche eine im we¬ sentlichen äquivalente Spezifität oder/und Affinität der Bin- düng an MHC-Moleküle wie Peptide mit den Aminosäuresequenzen (I) bis (VII) aufweisen, die aber im Gegensatz zu diesen Pep¬ tiden keine Aktivierung von T-Zellen, sondern die Erzeugung eines anergen Zustands in T-Zellen hervorrufen.

Von der vorliegenden Erfindung werden auch Polypeptide erfaßt, in denen der MHC-bindende Peptidabschnitt Bestandteil einer größeren Polypeptideinheit ist, wobei die Verbindung von MHC-

bindendem Peptid und dem Rest der Polypeptideinheit vorzugs¬ weise eine Sollbruchstelle aufweist, z.B. eine Proteasespalt- stelle.

5 Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Peptid oder Peptid-Derivat, das eine signalerzeugende Substanz bzw. eine Markierungsgruppe, z.B. eine Fluoreszenzmarkierungs- gruppe (z.B. Rhodamin, Phycoerythrin) , Digoxin, Biotin, eine radioaktive Gruppe oder eine Toxingruppe (z.B. Ricin, Cholera- o toxin etc.) trägt. Durch Kopplung des erfindungsgemäßen Pep- tids mit Markierungsgruppen kann das Peptid als diagnostisches Mittel für in vivo oder in vitro (z.B. Imaging) Anwendungen oder als therapeutisches Mittel eingesetzt werden. Weiterhin kann das erfindungsgemäße Peptid auch beispielsweise in cycli- 5 sierter Form oder in oligomerer Form vorliegen, wobei die für die Bindung an das MHC-Molekül wichtigen Sequenzen durch Spa- cerregionen voneinander getrennt sind.

Die Erfindung betrifft auch peptidmimetische Substanzen, die 0 eine im wesentlichen äquivalente Spezifität oder/und Affinität der Bindung an MHC-Moleküle wie die zuvor genannten Peptide oder Peptid-Derivate zeigen. Peptidmimetische Substanzen oder Peptidmimetika sind Verbindungen, die Peptide in ihrer Wech¬ selwirkung mit den MHC-Molekülen ersetzen können und gegenüber 25 den nativen Peptiden eine erhöhte metabolische Stabilität, bessere Bioverfügbarkeit und größere Wirkungsdauer aufweisen können. Methoden zur Herstellung von Peptidmimetika sind be¬ schrieben bei Giannis und Kolter, Angew. Chem. 105 (1993) , 1303-1326, Lee et al. , Bull. Chem. Soc. Jpn. 66 (1993) , 2006- 30 2010 und Dorsch et al . , Kontakte (Darmstadt) (1993) (2) , 48- 56. Bezüglich der Herstellung erfindungsgemäßer peptidmimeti- scher Substanzen wird auf die Offenbarung dieser Literatur¬ stellen verwiesen.

35 Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Komplex, der mindestens ein erfindungsgemäßes Peptid, Peptid- Derivat oder Peptidmimetikum und mindestens ein MHC-Molekül

oder ein peptidbindendes Derivat eines MHC-Moleküls umfaßt. In diesem Komplex ist ein Peptid, Peptid-Derivat oder Peptidmime- tiku mit einer Bindungskonstante von vorzugsweise mindestens 10 ^"7 1/mol, besonders bevorzugt im Bereich von 10 ^"8 -10 ^"9 1/mol, an ein MHC-Molekül oder ein peptidbindendes Derivat eines MHC- Moleküls gebunden. Alternativ kann das Peptid, Peptid-Derivat oder Peptidmimetikum auch kovalent an das MHC-Molekül gekop¬ pelt sein, z.B. über einen Photolinker odei als kovalente genetische Peptid-MHC-Fusion. Ein derartiges Peptid-MHC-Fu- sionsprotein enthält vorzugsweise eine HLA-DR beta-Kette und ein damit genetisch fusioniertes autoreaktives Peptid. Beson¬ ders bevorzugt enthält der Komplex ein MHC-Klasse II-Molekül oder ein peptidbindendes Derivat davon.

Das MHC-Klasse II-Molekül ist vorzugsweise vom Typ DR, bei¬ spielsweise vom Typ DR1, DR2, DR4 oder DQ6. Besonders bevor¬ zugt ist das MHC-Klasse II-Molekül vom Typ DR1 (Subtyp DR Bl ^* 0101) , DR2 (Subtyp Bl ^* 1501, DR Bl ^* 1502, DR Bl ^* 1601 oder DR B5 ^* 0101) , DR4 (Subtyp DR Bl ^* 0401) oder DQ6 (Subtyp DQ Bl ^* 0602) . Die T-Zellinie R.B. proliferiert mit dem autoreaktiven Peptid der Aminosäuresequenz 86 - 105 von GAD 65 kd in Anwesenheit des DR Bl-Allels 0101. Die T-Zellinie M.C. proliferiert mit dem autoreaktiven Peptid der Aminosäuresequenz 246 - 265 von rGAD in Gegenwart des DR Bl-Allels 1501 oder/und des DQ Bl- Alleis 0602. Für das autoreaktive Peptid mit der Aminosäurese¬ quenz 556-575 von GAD wurde das DR Bl-Allel 0401 als Restrik¬ tionselement identifiziert.

Die Nukleotidsequenzen der für ein MHC-Klasse II-Molekül der obigen Subtypen kodierenden Gene sind veröffentlicht in Corell et al. (Mol. Immunol . 28 (1991), 533-543) . Auf den Inhalt dieser Publikation wird hiermit Bezug genommen.

Der Begriff "peptidbindendes Derivat eines MHC-Moleküls" um- faßt Fragmente von MHC-Molekülen, die durch proteolytische Spaltung nativer MHC-Moleküle oder durch rekombinante DNA- Techniken hergestellt sind und ihre peptidbindenden Eigen-

Schäften im wesentlichen beibehalten haben. Weiterhin sind unter diesem Begriff Fusionsproteine zu verstehen, die neben einem für die Peptidbindung verantwortlichen MHC-Anteil noch weitere Polypeptid-Komponenten enthalten.

Die erfindungsgemäßen Peptid-MHC-Komplexe werden vorzugsweise durch Assoziierung peptidfreier MHC-Moleküle oder MHC-Molekül- derivate mit den erfindungsgemäßen Peptiden, Peptid-Derivaten oder Peptidmimetika hergestellt. Die Herstellung von peptid- freien MHC-Molekülen kann beispielsweise durch Entfaltung von nativen MHC-Molekülen, um gebundene Peptide zu dissoziieren, und Rückfaltung der leeren MHC-Moleküle erfolgen (siehe Dorn- mair und McConnell, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87 (1990) , 4134-4138 und WO91/14701) .

Andererseits können peptidfreie MHC-Moleküle auch durch rekom- binante Herstellung von MHC-Molekülen oder Derivaten davon gewonnen werden. Beispiele hierfür sind die Expression von MHC-Klasse II-Molekülen in Fibroblasten (Germain und Malissen, Ann. Rev. Immunol. 4 (1990) , 281-315) sowie die Expression von löslichen MHC-Klasse II-Molekülderivaten ohne Membrananker in CHO-Zellen (Wettstein et al. , J. Exp. Med. 174 (1991) , 219- 228, Buelow et al . , Eur. J. Immunol. 23 (1990) , 69-76) und mittels des Baculovirus-Expressionssystems in Insektenzellen (Stern und Wiley, Cell 68 (1992), 465-477; Scheirle et al. , J. Immunol. 149 (1992) , 1994-1999) . Auch MHC-Klasse I-Moleküle wurden in CHO-Zellen (Fahnestock et al . , Science 258 (1992), 1658-1662) in Insektenzellen (Jackson et al . , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89 (1992) , 12117-12120; Matsamura et al. , J. Biol. Chem. 267 (1992) , 23589-23595) sowie in Fibroblasten (Mage et al . , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89 (1992), 10658- 10661) exprimiert.

Weiterhin ist auch die Expression von peptidfreien MHC-Molekü- len in E.coli bekannt (Parker et al. , Mol. Immunol. 29 (1992) ,

371-378; Zhang et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89 (1992) ,

8403-8407; Garboczi et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89

(1992) , 3429-3433; Altman et al . , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90 (1993) , 10330-10334) . Auf die in diesen Veröffentlichungen beschriebenen Techniken zur rekombinanten Expression von MHC- Molekülen oder MHC-Molekülderivaten wird für die vorliegende Erfindung Bezug genommen.

Vorzugsweise ist der MHC-Bestandteil des erfindungsgemäßen Komplexes ein rekombinantes MHC-Molekül oder ein peptidbinden¬ des Derivat davon und besonders bevorzugt ein lösliches MHC- Molekülderivat, bei dem der Membrananker teilweise oder voll¬ ständig deletiert ist.

Zur Identifizierung von MHC-Molekülen, welche das erfindungs¬ gemäße autoreaktive Peptid präsentieren, werden die Antigen präsentierenden Zellen eines Spenders mit dem erfindungsgemä¬ ßen Peptid in markierter Form inkubiert, wobei vorzugsweise zuerst gebundene Peptide durch Denaturierung nativer MHC-Mole¬ küle dissoziiert werden. Anschließend können die markierten MHC-Peptid-Komplexe mit Subtyp-spezifischen Antikörpern, die gegen Framework-spezifische Determinanten der MHC-Moleküle gerichtet sind, immunpräzipitiert und aufgrund des Vorhanden¬ seins der markierten Peptide identifiziert werden.

Alternativ können als Antigen präsentierende Zellen auch EBV (Epstein-Barr-Virus) transformierte B-Zellen des Spenders ver¬ wendet werden.

Die Herstellung der erfindungsgemäßen Komplexe aus einem re¬ kombinanten MHC-Molekülderivat kann beispielsweise so erfol- gen, daß DNA-Fragmente für die löslichen Teile der <_.- und ß- Ketten eines MHC-Moleküls, z.B. eines MHC-DR1-, DR2- oder DQ1- Moleküls durch PCR isoliert werden, wobei als Template cDNA aus einer EBV transformierten B-Zellinie des Spenders benutzt wird, welche das entsprechende MHC-Molekül exprimiert. Bei diesem Schritt wird vorzugsweise am C-Terminus der <_.- und der ß-Kette durch entsprechende Auswahl des PCR-Primers eine Rei¬ nigungshilfe, z.B. ein Oligohistidinseg" z (z.B. ein Hexa-

Histidin-Segment) , eingeführt. Die PCR-Produkte können an¬ schließend in E.eoli subkloniert und als Inclusion-Bodies exprimiert werden. Die Inclusion-Bodies können nach bekannten Verfahren (vgl. Literaturstellen zur Expression von MHC-Mole- külen in E.eoli, supra) solubilisiert und die MHC-Proteine mittels Metall-Chelat-Affinitätschromatographie gereinigt werden. Anschließend werden die α- und ß-Untereinheiten in Anwesenheit des Peptids renaturiert.

Der erfindungsgemäße Peptid-MHC-Komplex kann auch eine wie oben beschriebene Markierungsgruppe tragen, wobei die Markie¬ rungsgruppe sowohl am Peptidbestandteil als auch am MHC-Be- standteil des Komplexes durch bekannte Methoden gebunden sein kann.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein oligomerisierter Peptid-MHC-Komplex, der mindestens 2 MHC- Moleküle oder MHC-Molekülderivate enthält, die über kovalente oder nicht-kovalente Wechselwirkungen assoziiert sind. Ein derartiger oligomerisierter Peptid-MHC-Molekül-Komplex hat gegenüber bekannten (bezüglich des MHC-Moleküls) monomeren Komplexen den Vorteil einer höheren Affinität und somit einer verbesserten diagnostischen oder/und therapeutischen Wirksam¬ keit.

In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann ein derartiger oligomerisierter Komplex durch kovalente Querver¬ netzung von monomeren Peptid/MHC-Molekül-Komplexen über che¬ mische Kopplungsreagenzien, z.B. N-Succinimidyl-3 (2-pyridyl- thio)propionat, 3-Maleimidobenzoyl-N-hydroxy-succinimidester, Maleimidohexanoyl-N-hydroxy-succinimidester, Bis (maleimidome- thyDether, Disuccinimidylsuberat, Glutardialdehyd etc. nach bekannten Verfahren hergestellt werden. Gegebenenfalls können auch einzelne Aminosäuren der Peptidkomponente oder der MHC- Komponente so verändert sein, daß spezielle Kopplungsreagen¬ zien an dieser Stelle bevorzugt angreifen. So lassen sich durch Einführung von zusätzlichen Cystein- oder Lysin-Resten

auf rekombinantem Wege bei der Proteinkomponente bzw. durch chemische Synthese bei der Peptidkomponente Kopplungen über SH-Linker bzw. über Aminogruppen erzielen.

In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann der oligomerisierte Peptid-MHC-Komplex so hergestellt werden, daß die an das MHC-Molekül bindende Peptidkomponente als Oligomer eingesetzt wird, d.h. als ein Peptidmolekül, das mindestens 2 MHC-bindende Bereiche enthält, wobei die für die Bindung an das MHC-Molekül wichtigen Sequenzen durch Spacerre- gionen voneinander getrennt sind. Diese Spacerregionen beste¬ hen üblicherweise aus 10-15 Aminosäuren. Man verwendet kleine, hydrophile Aminosäuren, z.B. Glycin, Alanin, Serin, Prolin bzw. Kombinationen davon. Bei einer Renaturierung von peptid- freien MHC-Molekülen in Anwesenheit dieser Peptidoligomere entsteht der erfindungsgemäße oligomerisierte Komplex, der durch die oligomerisierte Peptidkomponente über nicht-kova¬ lente Wechselwirkungen vernetzte MHC-Moleküle enthält.

Weiterhin können oligomerisierte Peptid-MHC-Komplexe durch Modifikation rekombinant hergestellter MHC-Moleküle erzeugt werden. So kann bei Herstellung der Vektoren für die Expres¬ sion rekombinanter α- bzw. ß-Ketten von MHC-Klasse II-Molekü- len ein Gensegment, vorzugsweise jeweils am C-Terminus, ein- kloniert werden, das für ein Epitop codiert, das von einem Antikörper erkannt wird. Dieser Antikörper kann vom IgG-Typ, vorzugsweise aber vom IgM-Typ sein. Die renaturierten monome¬ ren Peptid/MHC-Komplexe werden dann mit einem, das eingeführte Epitop erkennenden Antikörper inkubiert, so daß nicht-kovalent vernetzte Immunkomplexe, bestehend aus mehreren Antikörpern und mehreren Peptid-MHC-Komplexen, erzeugt werden. Die Ein¬ führung von DNA-Segmenten, die für ein Epitop codieren, in die für die a- bzw. ß-Kette des MHC-Moleküls codierenden DNA-Frag¬ mente kann mittels bekannter molekularbiologischer Techniken erfolgen, z.B. durch Insertion in Restriktionsstellen oder durch zielgerichtete Mutagenese.

Der erfindungsgemäße oligomerisierte Peptid-MHC-Komplex ent¬ hält ein Peptid, das die Aminosäuresequenzen (I) , (II) , (III) , (IV) , (V) , (VI) , (VII) , Teilbereiche davon oder/und davon abgeleitete Aminosäuresequenzen umfaßt, oder ein Peptid-Deri- vat oder Peptidmimetikum davon. Der oligomerisierte Komplex kann vorzugsweise als diagnostisches oder therapeutisches Reagenz bei Typ I-Diabetes eingesetzt werden.

Die Erfindung betrifft somit auch eine pharmazeutische Zusam- mensetzung, die ein Peptid, Peptid-Derivat, Peptidmimetikum oder/und einen Peptid-MHC-Komplex als aktive Komponente gege¬ benenfalls in Kombination mit pharmazeutisch üblichen Zusatz¬ stoffen enthält. Die Zusammensetzung kann weiterhin eine ak- zessorische stimulierende Komponente enthalten, z.B. Cytokine wie IL-2 und IL-4 oder/und das Oberflächenantigen B7 (Wyss- Coray et al . , Eur. J. Immunol. 23 (1993) , 2175-2180; Freeman et al., Science 262 (1993), 909-911), das mit dem Oberflächen¬ molekül CD-28 auf einer T- elle binden kann. Die Anwesenheit der akzessorischen stimulierenden Komponente kann die thera- peutische Wirkung der Zusammensetzung verbessern oder/und modifizieren.

Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner die Ver¬ wendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die ein Pep- tid, Peptid-Derivat, Peptidmimetikum oder/und einen Peptid- MHC-Komplex enthält zur Herstellung eines Mittels für die Diagnose von Erkrankungen oder einer Prädisposition für Er¬ krankungen, die das Immunsystem beeinflussen, oder für die Diagnose von Tumorerkrankungen oder einer Prädisposition für Tumorerkrankungen, insbesondere für die Diagnose von Autoim¬ munerkrankungen oder einer Prädisposition für Autoimmunerkran¬ kungen, z.B. Diabetes Typ I oder Typ II, vorzugsweise Diabetes Typ I.

Analoge diagnostische Anwendungen sind jedoch auch bei anderen Autoimmunerkrankungen möglich. Beispiele derartiger Autoimmun¬ erkrankungen sind Multiple Sklerose, wo reaktive T-Zellen

gegen das Myelin Basic Protein oder das Proteolipid-Protein bestimmt werden können, rheumatoide Arthritis, wo reaktive T- Zellen gegen Kollagen Typ II, Cytokeratine und Hsp 65 bestimmt werden können, Basedow-Krankheit, wo reaktive T-Zellen gegen Thyroidperoxidase bestimmt werden können.

Allgemein ist die diagnostische Anwendung bei allen Erkrankun¬ gen möglich, die das Immunsystem beeinflussen, wie z.B. auch bei der Arteriosklerose. Hier wurde eine Assoziation der Krankheit mit einer Immunantwort gegen das Heat Shock Protein Hsp 65 nachgewiesen (Xu et al. , Lancet 341, 8840 (1993), 255- 259) .

Noch eine weitere Anwendung ist der diagnostische Nachweis von T-Zellen, die gegen Tumorantigene reagieren. Beispiele hierfür sind T-Zellen gegen ein Melanom-assoziiertes Antigen MAGE 1, die aus Melanompatienten isoliert wurden (van der Bruggen et al., Science 254 (1991), 1643-1647). Der Nachweis dieser T- Zellen kann mit erfindungsgemäßen oligomerisierten Komplexen schon in einem Stadium erfolgen, in dem der Tumor aufgrund einer noch zu geringen Zellmasse mit herkömmlichen Methoden noch nicht nachweisbar ist. Ferner könnte der Nachweis von spezifisch reagierenden T-Zellen auch zur Verlaufskontrolle bei einer Anti-Tumorvakzinierung eingesetzt werden.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein Verfahren zur Bestimmung einer spezifischen T-Zell-Sub- population, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine T-Zellen enthaltende Probe, die vorzugsweise aus einer Körper- flüssigkeit, z.B. Vollblut, stammt, mit einem erfindungsgemä¬ ßen Peptid, Peptid-Derivat, Peptidmimetikum oder/und einem erfindungsgemäßen Komplex in Kontakt bringt und die Reaktion von T-Zellen mit dem Peptid oder Komplex bestimmt. Eine spezi¬ fische Reaktion von T-Zellen mit dem Komplex oder dem Peptid kann z.B. durch eine erhöhte T-Zellenproliferation nachgewie¬ sen werden, die sich durch den Einbau von Radioaktivität mes¬ sen läßt. Andererseits kann die Reaktion von T-Zellen auch

direkt durch Verwendung eines markierten Peptids oder Komple¬ xes bestimmt werden. Bei dieser Ausführungsform werden das Peptid oder der Komplex vorzugsweise mit einer daran gekoppel¬ ten Fluoreszenzmarkierungsgruppe verwendet. Die Auswertung kann beispielsweise durch FACS-Analyse erfolgen, wobei die T- Zellen mit einem ersten Fluoreszenzmarker, der an einen T- Zell-spezifischen Antikörper gekoppelt ist, und dann mit dem Peptid- MHC-Komplex, der mit einem zweiten Fluoreszenzmarker gekoppelt ist, in Kontakt gebracht werden und das Vorhanden- sein von doppelmarkierten Zellen durch fluorographische Ana¬ lyse bestimmt wird. Auf diese Weise wird eine T-Zell-Subpopu- lation bestimmt, die durch ihre Reaktivität mit einem erfin¬ dungsgemäßen Peptid oder Peptid-Derivat oder/und mit einem erfindungsgemäßen Peptid-MHC-Komplex charakterisiert ist. Aufgrund der geringen Konzentration der spezifischen T-Zell- Population im Blut erfolgt als erster Schritt des Verfahrens vorzugsweise eine Selektion auf präaktivierte T-Zellen, z.B. eine selektive Anreicherung von IL-2-Rezeptor-positiven T- Zellen durch Inkubation mit IL-2 oder/und durch Inkubation mit IL-2-Rezeptor-Antikörper und anschließende Separation der Antikörper-bindenden Zellen beispielsweise mit immunmagneti¬ schen Methoden. Andererseits kann die Selektion auf präakti¬ vierte Zellen erst nach dem Kontakt der T-Zellen mit dem Pep¬ tid oder dem Komplex erfolgen.

In einer Abwandlung dieses Verfahrens kann auch das Verhältnis von präaktivierten autoreaktiven T-Zellen, d.h. T-Zellen mit dem IL-2-Rezeptor als Oberflächenmarker, zu nicht-aktivierten autoreaktiven T-Zellen, d.h. T-Zellen ohne den IL-2-Rezeptor, bestimmt werden.

Dieses Verfahren kann insbesondere zur Diagnose von Typ I- Diabetes, aber auch bei anderen das Immunsystem beeinflussen¬ den Erkrankungen bzw. zur Diagnose einer Prädisposition für derartige Erkrankungen angewendet werden.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die ein Peptid, Peptid-Derivat, Peptidmimetikum oder/und einen Pep¬ tid-MHC-Komplex enthält, zur Herstellung eines Mittels für die Therapie oder Prävention von Erkrankungen, die das Immunsystem beeinflussen. Zur therapeutischen Anwendung der erfindungs- gemäßen Peptide und der erfindungsgemäßen Peptid-MHC-Komplexe können beispielsweise mit Toxinen gekoppelte Peptide oder Peptid-MHC-Komplexe verwendet werden, andererseits können aber auch Peptide alleine oder als Bestandteile des Komplexes ein¬ gesetzt werden, die zwar eine Bindung an den T-Zellrezeptor ermöglichen, aber keine Aktivierung der T-Zelle hervorrufen, d.h. die also anergisierend wirken.

Die therapeutische Wirkung derartiger anergisierender Peptid- analoga beruht darauf, daß der T-Zellrezeptor (TCR) zur Akti¬ vierung der T-Zelle mit einem Peptid wechselwirken muß, das von einem MHC-Antigen der Klasse I oder Klasse II präsentiert wird. Dabei sind insbesondere Aminosäuren in Ankerpositionen des Peptids für die Bindung an das MHC-Molekül verantwortlich, während andere Aminosäuren im Peptid zur Wechselwirkung mit dem TCR beitragen und somit eine T-Zellstimulation hervorru¬ fen. Durch Aminosäuresubstitutionen in den Peptiden können nun Peptidanaloga hergestellt werden, die aufgrund des Vorhanden- seins der Ankerpositionen noch an das MHC-Molekül binden, andererseits aber nur eine partielle oder keine T-Zellaktivie- rung hervorrufen (vgl. z.B. Sloan-Lancaster et al. , Nature 363 (1993) , 156-159) . Z.B. können solche Peptidanaloga bewirken, daß die Expression bestimmter Oberflächenmoleküle hochregu- liert wird (z.B. IL2-Rezeptor, LFA-1) , daß jedoch keine Proli- feration oder Cytokin-Expression erfolgt. T-Zellen, die mit einem solchen P ptidanalogon in Wechselwirkung treten, gehen in einen sogenannten anergen Zustand über, d.h. sie können auch durch eine nachfolgende reguläre Stimulation mit einem immunogenen Peptid nicht mehr pro] iferieren. Dieser anerge Zustand hält mindestens 7 Tage an und läßt sich deshalb thera¬ peutisch bei der Behandlung einer Autoimmunerkrankung nutzen.

Ein weiterer therapeutischer Aspekt der vorliegenden Erfindung besteht darin, daß das Peptid bzw. der Komplex aus Peptid und MHC-Molekül als Antigen verwendet werden kann. Ein derartiges Antigen kann dabei als Immunogen, d.h. als ein die Immunant- wort stimulierendes Mittel oder als Tolerogen wirken, d.h. als ein Mittel, das eine Immuntoleranz hervorruft. Die Verwendung als Immunogen kann z.B. bei der Vakzinierung gegen Tumoranti¬ gene Verwendung finden. Statt den bisher zu diesem Zweck ver¬ wendeten ganzen Tumorzellen ist es möglich, daß von den T- Zellen erkannte tumorspezifische Peptide im Komplex mit dem entsprechenden MHC-Molekül, insbesondere in Form eines oligo- merisierten Komplexes, zu injizieren, um eine T-Zellantwort gegen den Tumor zu erzeugen. Zur Erhöhung der Immunstimulation kann dieser Komplex auch in Kombination mit zusätzlichen sti- mulierenden Substanzen verabreicht werden. Zu diesem Zweck sind beispielsweise Cytokine, wie etwa IL2 oder IL4 geeignet, die gegebenenfalls und vorzugsweise kovalent mit dem erfin¬ dungsgemäßen Peptid-MHC-Komplex verknüpft sind. Eine weitere Möglichkeit ist die Assoziierung des Komplexes mit akzessori- sehen Komponenten für die T-Zellaktivierung, insbesondere mit für Antigen präsentierenden Zellen essentiellen Oberflächenmo¬ lekülen, z.B. dem Oberflächenmolekül B7.

Eine bevorzugte therapeutische Formulierung ist der Einbau von mit Peptid beladenen MHC-Molekülen in künstliche Vesikel, z.B. Lipidvesikel, die gegebenenfalls noch weitere embrangebundene Moleküle tragen können, wie z.B. B7 oder/und immobilisierte Cytokine.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Isolierung von T-Zellsubpopulationen, die mit einem erfin¬ dungsgemäßen Peptid oder Peptid-MHC-Komplex reagieren. Bei einem solchen Verfahren bringt man eine T-Zellen enthaltende Probe, die z.B. aus einer Körperflüssigkeit stammt, die einem Patienten vorher entnommen wurde, mit einem erfindungsgemäßen Peptid oder einem erfindungsgemäßen Peptid-MHC-Komplex in Kontakt, identifiziert die mit dem Peptid oder Komplex reagie-

renden T-Zellen und trennt sie gegebenenfalls von anderen T- Zellen ab. Auch hier kann vor oder/und nach dem Kontakt der T- Zellen mit dem Peptid oder dem Komplex vorzugsweise eine Se¬ lektion auf präaktivierte T-Zellen, d.h. T-Zellen mit dem IL- 2-Rezeptor, erfolgen.

Bei einem solchen Verfahren kann man das Peptid oder den Pep¬ tid-MHC-Komplex in immobilisierter Form auf einem Träger ver¬ wenden, wodurch die Abtrennung der positiv reagierenden T- Zell-Population von anderen T-Zellen vereinfacht wird. Aus den auf diese Weise isolierten T-Zell-Subpopulationen können durch Restimulation T-Zellinien angelegt werden. Diese autoreaktive T-Zellinien können dann zur Immunisierung von Patienten ver¬ wendet werden.

Eine spezifische Immuntherapie des Typ I-Diabetes umfaßt zu¬ nächst die Isolierung von spezifischen T-Zellinien gegen ein Autoantigen, z.B. GAD 65 aus IDDM-Patienten. Dann erfolgt eine Bestimmung der Feinspezifität der T-Zellinien, d.h. die Iden- tifizierung der autoreaktiven Peptide. Für die spätere Inoku¬ lation der Patienten werden solche T-Zellinien ausgewählt, die ein prädominantes Peptid erkennen, d.h. ein Peptid, gegen das mehrere der isolierten T-Zellinien reagieren. Insbesondere handelt es sich dabei um T-Zelllinien, welche ein Peptid mit den Aminosäuresequenzen (I) , (II) , (III) , (IV) , (V) , (VI) oder (VII) erkennen.

Falls sich bei einem Patienten kein eindeutig prädominantes Peptid findet, müssen für die spätere Inokulation mehrere T- Zellinien gemischt werden. Die ausgewählten T- ^" ellklone werden vor der Inokulation nochmals mit Antigen-präsentierenden Zel¬ len und den entsprechenden Peptiden stimuliert, um eine gute Expression von Aktivierungsmolekülen und insbesondere der T- Zellrezeptoren zu gewährleisten. Dann werden die T-Zellinien inaktiviert, z.B. durch Hitzebehandlung oder/und radioaktive Bestrahlung, vorzugsw ise mit einer Dosis im Bereich von 4000 -10000 rad, besonders bevorzugt ca. 8000 rad, und subkutan in

einer Zellenzahl von vorzugsweise 10 ⁷ bis 5 x 10 ⁷ in den Pa¬ tienten, aus dem sie gewonnen wurden, injiziert. Üblicherweise werden mindestens drei Injektionen über einen Zeitraum von 6 bis 12 Monaten verteilt.

Anschließend kann man die T-Zellantwort des Patienten auf das Inokulat testen. Hierzu isoliert man die peripheren Blutlymp- hozyten (PBLs) des Patienten, z.B. über Ficoll-Dichte-Gradien- tenzentrifugation, und testet die Proliferation gegen das Inokulat in einem Standard-Proliferationstest . Nach erfolg¬ reich verlaufender Immunisierung sollte eine deutliche Proli¬ feration der Patienten-PBLs gegen das Inokulat nachweisbar sein. Eine weitere Kontrolle des Immunisierungserfolgs kam; durch Bestimmung der Frequenzen der GAD-reaktiven T-Zellen des Patienten im Verlauf cer Immunisierung erfolgen. Dies kann z.B. nach dem Standardverfahr _ der Limiting Dilution mit autologen Stimulatorzellen erfolgen, die nach Inkubation mit GAD mit z.B. 4000 rad bestrahlt worden sein. Bei erfolgreich verlaufender Immunisierung nimmt die Frequenz der autoreakti- ven T-Zellen deutlich ab.

Nach weiterer Eingrenzung der von den regulatorischen T-Zellen erkannten Oberflächenstrukturen auf den T-Zellen des Inokula- tes kann auch mit Teilstrukturen der regulatorischen T-Zellen immunisiert werden, z.B. mit Segmenten des T-Zellrezeptors .

Andererseits können bei einer Antitumorvakzinierung auch tei- lungsfähige T-Zellen reinjiziert werden, die zu einer aktiven Immunisierung des Patienten gegen Tumorzellen führen können.

Bei den diagnostischen und therapeutischen Verfahren zur Iden¬ tifizierung bzw. Aktivierung/Inhibierung von spezifischen T- Zellsubpopulationen kann anstelle der erfindungsgemäßen Pep¬ tide oder Peptid-MHC-Moleküle auch ein anti-idiotypischer Antikörper verwendet werden, der die Wirkung des MHC-Peptid- Komplexes nachahmt . Derartige Antikörper können ohne weiteres erhalten werden, indem eine gegen ein bestimmtes Peptid spezi-

fische T-Zellsubpopulation als Immunogen zur Erzeugung eines Antikörpers (z.B. in einer Maus) verwendet wird oder indem zuerst ein erster Antikörper gegen den MHC-Peptid-Komplex und dann ein anti-idiotypischer Antikörper gegen den ersten Anti- körper erzeugt wird.

Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit auch ein Antikörper (erster Antikörper) gegen ein erfindungsgemäßes Peptid oder Peptid-Derivat oder einen erfindungsgemäßen Kom¬ plex, erhältlich durch Immunisierung, mit dem Peptid, Peptid- Derivat oder Komplex und Gewinnung eines durch Immunisierung erzeugten Antikörpers, vorzugsweise eines durch das Verfahren von Köhler und Milstein oder Weiterentwicklungen davon herge¬ stellten monoklonalen Antikörpers.

Schließlich betrifft die Erfindung auch einen anti-idiotypi- schen Antikörper gegen den ersten Antikörper, erhältlich durch Immunisierung mit dem ersten Antikörper, der gegen das Peptid oder Peptid-Derivat oder den Komplex gerichtet ist, und Gewin- nung eines durch die Immunisierung erzeugten anti-idiotypi- schen Antikörpers.

Noch ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine T-Zelle, die mit einem erfindungsgemäßen autoreaktiven Peptid, Peptid-Derivat oder Peptidmimetikum oder einem Komplex aus Peptid und MHC-Molekül reagiert. Bevorzugte Beispiele sind T-Zellen, die von den T-Zellinien R.B., M.C., 24/31 oder 40/2, stammen oder eine äquivalente T-Zellrezeptor-Bindungsspezifi- tät aufweisen, d.h. ein von einem MHC-Molekül präsentiertes Peptid oder Peptid-Derivat der Aminosäuresequenzen (I) , (II) , (III) , (IV) , (V) , (VI) oder/und (VII) oder/und Teilbereichen dieser Aminosäuresequenzen erkennen. Die T-Zellinie <GAD> 40/2 wurde am 10.07.1996 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorga¬ nismen und Zellkulturen (DSMZ) , Mascheroder Weg lb, D 38124 Braunschweig, gemäß den Vorschriften des Budapester Vertrags hirterlegt. Eine Eingangsbescheinigung der Hinterlegun sstelle ist den Anmeldungsunterlagen als Anlage beigefügt.

Beispiele für bevorzugte T-Zellen weisen einen T-Zellrezeptor auf, der eine TCR-α-Kette mit einer der in Abb. 5 dargestell¬ ten CDR3-Regionen oder/und eine TCR-3-Kette mit einer der in Abb. 6 dargestellten CDR3-Regionen umfaßt. Ebenfalls Gegen- stand der Erfinαung sind T-Zellrezeptoren, die eine zu den in Abbildung 5 oder 6 dargestellten CDR3-Regionen mindestens 70 %, vorzugsweise mindestens 80 % und besonders bevorzugt mindestens 90 % homologe Aminosäuresequenzen aufweisen.

Noch ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Polypeptid mit T-Zellrezeptoraktivität, welches an ein erfindungsgemäßes Peptid, Peptid-Derivat, Peptidmimetikum oder einen ein solches enthaltenden MHC-Komplex bindet. Vorzugs¬ weise umfaßt ein erfindungsgemäßes Polypeptid eine TCR-α-Kette mit einer der in Abb. 5 dargestellten CDR3-Regionen oder einer dazu mindestens 70 % homologen Aminosäuresequenz oder/und eine TCR-?-Kette mit einer der in Abb. 6 dargestellten CDR3-Regio¬ nen oder einer dazu mindestens 70 % homologen Aminosäurese¬ quenz .

Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung auch die Ver¬ wendung von Peptiden aus GAD, insbesondere humaner GAD 65, davon abgeleiteten Peptid-Derivaten oder Peptidmimetika zur Herstellung eines Arzneimittels, das bei Verabreichung an Diabetes-Patienten zur Ausbildung einer Immuntoleranz führt.

Vorzugsweise werden hierfür Peptide der Aminosäuresequenzen

(I) , (II) , (III) , (IV) , (V) , (VI) , (VII) bzw. mit den in EP 95

100 764.0 vorgeschlagenen Aminosäuresequenzen, Teilbereiche dieser Peptide mit einer Länge von mindestens 6 Aminosäuren oder/und Aminosäuren mit einer im wesentlichen äquivalenten Spezifität oder/und Affinität der Bindung an MHC-Moleküle wie die obengenannten Peptidsequenzen verwendet . Vorzugsweise haben die Peptide eine Länge von mindestens 8 Aminosäuren, besonders bevorzugt eine Länge vcn 10 bis 25 Aminosäuren.

Grundlage dieser Erfindung sind Beobachtungen, die bei einer in vitro-Verwendung von Peptiden zur T-Zellstimulation gemacht

wurden. Wenn man nämlich bereits etablierte T-Zellinien mit einem als reaktiv identifizierten Peptid, z.B. einem Peptid mit einer Länge von 20 Aminosäuren, stimuliert, dann erfolgt eine Proliferation, die annähernd so hoch ist wie bei Verwen- düng des nativen Antigens, z.B. rekombinante humane GAD 65 kd. Wenn man die solchermaßen expandierten T-Zellen in einer zwei¬ ten Runde nach ca. 10 Tagen nochmals restimuliert, erhält man eine viel schwächere proliferative Antwort als wenn in der ersten Runde das native Antigen verwendet wurde. Dieser Befund ist unabhängig davon, ob man bei der zweiten Runde wieder das Peptid oder das native Antigen verwendet. Eine dritte Resti u- lation endet meistens in einem vollständigen Absterben der T- Zellen, auch wenn als Antigen native GAD 65 kd verwendet wird.

Für diese Anwendungsform werden die Peptide in relativ hohen Dosierungen, vorzugsweise von 1 bis 100 mg, besonders bevor¬ zugt von 3 bis 30 mg und am meisten bevorzugt von 5 bis 10 mg pro kg Körpergewicht verabreicht.

Weiterhin ist bevorzugt, daß nach der erstmaligen Verabrei¬ chung der Peptide, d.h. der Erstvakzinierung, mindestens noch eine zweite Vakzinierung und besonders bevorzugt noch minde¬ stens eine dritte Vakzinierung durchgeführt wird. Bei der zweiten und den gegebenenfalls folgenden Vakzinierungen werden vorzugsweise die bereits zur Erstvakzinierung verwendeten Peptide, komplette GAD oder/und ein die Sequenz der Peptide enthaltender Teil davon eingesetzt. Bei einer Mehrfachvakzi- nierung sind die Intervalle zwischen den einzelnen Vakzinie¬ rungen vorzugsweise jeweils von 5 bis 25 Tagen, besonders bevorzugt von 7 bis 14 Tagen.

Weiter soll die Erfindung durch die folgenden Beispiele in Verbindung mit den Abbildungen 1, 2, 3A, 3B, 3C 4A, 4B, 5 und 6 und den Sequenzprotokollen SEQ ID No. 1 bis 30 erläutert werden.

Abb. 1 zeigt autoreaktive Aminosäuresequenzen gemäß EP 95 100 764.0,

Abb. 2 zeigt weitere autoreaktive Aminosäuresequenzen gemäß EP 95 100 764.0,

Abb. 3A zeigt das Ergebnis eines Peptid-Screeningassays der T-Zellinien R.B. und M.C. mit rekombinanter humaner GAD bzw. Peptidpools,

Abb. 3B zeigt das Ergebnis eines Proliferationsassays mit der T-Zellinie R.B. mit Einzelpeptiden aus rGAD,

Abb. 3C zeigt das Ergebnis eines Proliferationsassays mit der T-Zellinie M.C. mit Einzelpeptiden aus rGAD,

Abb. 4A zeigt das Ergebnis eines Peptid-Screeningassays der T-Zellinie 24/31 mit rekombinanter humaner GAD bzw. Peptidpools,

Abb. 4B zeigt das Ergebnis eines Proliferationsassays mit der T-Zellinie 24/31 mit Einzelpeptiden aus GAD,

Abb. 5 zeigt das Ergebnis der Sequenzierung von TCR-α-Ket- ten aus Klonen der T-Zellinien 40/2 und 24/31,

Abb. 6 zeigt das Ergebnis der Sequenzierung von TCR- _/ ß-Ket- ten aus Klonen der T-Zellinien 40/2 und 24/31.

SEQ ID No. 1-7 zeigen die erfindungsgemäßen autoreaktiven

Aminosäuresequenzen (I) - (VII) ,

SEQ ID No. 8-11 zeigen die autoreaktiven Aminosäuresequenzen gemäß Abb. 1,

SEQ ID No. 12-28 zeigen die autoreaktiven Aminosäuresequenzen gemäß Abb. 2, und

SEQ ID No. 29-30 zeigen weitere autoreaktive Aminosäureseque::- zen gemäß EP 95 100 764.0.

BEISPIEL 1 5 Etablierung von GAD-spezifischen T-Zellinien

1. PrimärStimulation

Durch Ficoll-Dichtegradienten-Zentrifugation werden aus EDTA- Blut von Typ I-Diabetikern die peripheren Blut-Lymphozyten ιo (PBLs) gewonnen. Die Zellen werden 2 mal in RPMI-Medium gewa¬ schen und dann in einem Kulturmedium, bestehend aus RPMI 1640, 5 % Humanserum, 2 mM Glutamin und 100 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin, aufgenommen. Pro Napf einer 96 Napf Rundboden-Platte werden 100 μl Zellsuspension, entsprechend

15 100000 Zellen, eingesät. Danach erfolgt die Zugabe von rekom¬ binanter humaner GAD 65 kd (rGAD) , die im Baculovirus-System exprimiert wurde, in einer Endkonzentration von 3 bis 5 μg/ml. Die Zellen werden 3-4 Tage im Blutschrank bei 37°C/7 % C0 ₂ inkubiert. Nach diesem Zeitraum erfolgt Zugabe von 100 μl IL-2

20 (5 U/ml) . Nach weiteren 3-4 Tagen werden von allen Kulturan¬ sätzen 100 μl abgesaugt und wiederum 100 μl IL-2 (5 U/ml) zu¬ gegeben. Dies wird alle 3-4 Tage wiederholt.

2. Restimulation

25 Am Tag 14 nach dem Beginn der Primärstimulation erfolgt die erste Restimulation. Hierfür wird im Vergleich zur Primärsti¬ mulation die doppelte Anzahl von autologen PBLs mittels Ficoll isoliert und in Kulturmedium auf eine Zellkonzentration von 2 x 10 ⁶ /tnl eingestellt. Eine Hälfte dieser Stimulatorzellen

30 wird mit dem Antigen rGAD (Endkonzentration 3 bis 5 μg/ml) für 2Stunden/37°C/7 % C0 ₂ inkubiert (Antigen-Pulse) . Die andere Hälfte wird unter gleichen Bedingungen ohne Antigen, nur mit Kulturmedium inkubiert. Anschließend werden alle Stimulator¬ zellen mit 4000 rad bestrahlt. Die Stimulatorzellen werden

35 dann in 96 Napf Rundbode -Platten verteilt (je 100000 Zellen/ Napf) und zwar so, daß immer ein Napf mit Antigen enthaltenden

Stimulatorzellen benachbart zu einem Loch mit Stimulatorzellen ohne Antigen zu liegen kommt.

Anschließend erfolgt die Präparation der T-Zellen aus den 5 Primärstimulationsansätzen. Hierfür werden die Überstände aus den Primärstimulationsansätzen abgesaugt und die Zellen in den Platten zweimal mit je 100 μl Waschmedium (Dulbeccos Modified Eagle Medium = DMEM) gewaschen. Dazwischen werden die Zellen in den Platten bei 400 g zentrifugiert . Anschließend werden o die Zellen in je 100 μl Kulturmedium aufgenommen und je 50 μl auf zwei benachbarte Näpfe der Restimulations-Platte verteilt. Auf diese Weise werden die T-Zellen in einem Napf mit Antigen inkubiert und im benachbarten Napf ohne Antigen kann die Anti- gen-Spezifität der Restimulation kontrolliert werden. 5

Ab dem 2. oder 3. Tag nach dem Beginn der Restimulation kann die Proliferation mikroskopisch beurteilt werden. Dabei werden nur solche Mikrokultur-Pärchen als relevant angesehen, bei denen nur im Napf mit Antigen-Anwesenheit Proliferation er- 0 folgt. Ab Tag 4 wird wiederum zu jedem Kultur-Napf 100 μl IL-2 (5 U/ml) zugegeben. Bis zum Tag 14 wird alle 3-4 Tage ca. 50 % des Kulturmediums gegen IL-2 (5 U/ml) ausgetauscht.

Bei gutem Wachstum werden die Kulturen auf mehrere 96er Näpfe 25 aufgeteilt . Bei späteren Restimulationen kann auch in größere Näpfe aufgeteilt werden. Alle 2 Wochen erfolgt eine erneute Restimulation nach der oben beschriebenen Methode. Ab der 3. Restimulation wird die Spezifität der Mikrokulturen in ein Proliferationstest ermittelt.

T0

3. Proliferationstest mit rekombinanter humaner GAD 65 kd

Alle Tests werden mindestens in Doppel-Ansätzen durchgeführt.

a) Stimulator-Zellen: 35 Als Stimulatorzellen (APC) werden autologe PBLs oder in den HLA-Klasse II Antigenen identische PBLs eines norma¬ len Spenders verwendet . Die PBLs werden in einer Zahl von

100000 pro Loch einer 96 Napf-Platte verteilt und mit rGAD in einer Endkonzentration von 3 bis 5 μg/ml ver¬ setzt. In Kontrollansätzen wird statt Antigen ein glei¬ ches Volumen an Medium vorgegeben. Nach Inkubation von 2 h bei 37°C und 7 % C0 ₂ werden die Stimulatorzellen mit 4000 rad bestrahlt.

b) T-Zellen

Die verwendeten T-Zellen stammen immer aus der Abschluß- phase einer Restimulationsperiode. Sie werden 3 mal mit DMEM von Antigen und IL-2-freigewaschen und mit 6000 bis 10000 Zellen/96er Napf verteilt.

Nach 3-4 Tagen bei 37°C/7 % C0 ₂ erfolgt die Zugabe von 1 μCi ³ H-Thymidin und weitere Inkubation für 16-20 Stun¬ den. Danach erfolgt das Übertragen der Zellen auf einen Glasfaserfilter mittels eines Zeil-Ernte Gerätes und die Bestimmung der eingebauten Radioaktivität im ß-Zählgerät. Die Proliferationsaktivität der T-Zellinien wird mittels eines Stimulationsindex (SI) ausgedrückt. Diet. ist der Quotient aus den cpm in Anwesenheit von rGAD dividiert durch die cpm in den Kontrollansätzen ohne Antigen. Abb. 3A (Säule rGAD) zeigt ein typisches Ergebnis eines Proli- ferationstests mit rGAD und den Linien R.B. und M.C.

4. Proliferationstest mit Peptiden, die aus der H-GAD 65 kd Sequenz abgeleitet sind

T-Zellinien, die über mindestens 4 Restimulationsrunden expan¬ diert wurden und mit rGAD im Proliferationstest reagierten, wurden zusätzlich mit überlappenden Peptiden der rGAD gete¬ stet. Diese Experimente haben zum Ziel, die von den T-Zellen erkannten Epitope der rGAD zu definieren. Dazu werden zunächst sich überlappende 20 mer Peptide der rGAD synthetisiert (Über¬ lappungsbereich 10 Aminosäuren, insgesamt 59 verschiedene Peptide) .

Jeweils 4-5 dieser Peptide werden zu einem Pool vereinigt und in einer Endkonzentration von 5 μg/ml zu den Stimulatorzellen gegeben (Präparation der Stimulatorzellen wie unter Abschnitt 3a beschrieben) .

Danach erfolgt die Zugabe von 6000-20.000 T-Zellen pro Mikro- kultur-Napf. Das weitere Verfahren ist analog dem unter Ab¬ schnitt 3b beschriebenen.

Abbildung 3A zeigt die Ergebnisse dieses Peptid-Screeningas¬ says. Die T-Zellinie R.B. reagiert mit dem Peptidpool, der den rGAD-Sequenzabschnitt 46-115 enthält, während die T-Zellinie M.C. Peptide aus dem Sequenzabschnitt 216 - 285 erkennt. In Abbildung 3B bzw. 3C sind die Reaktivitäten der T-Zellinie R.B bzw. M.C. mit den Einzelpeptiden des jeweiligen Peptidpools dargestellt. Die Linie R.B. reagiert ausschließlich mit dem Peptid p86-105, während die Linie M.C. für das Peptid p246 - 265 spezifisch ist. Bei diesen Proliferationstests wurden die Peptide in einer Konzentration von 3 μg/ml eingesetzt .

Abb. 4A zeigt das Ergebnis eines weiteren Peptid-Screening- tests mit der T-Zellinie 24/31. Diese T-Zellinie reagiert spezifisch mit den Peptidpools 1, 4 und 11. In Abb. 4B sind die Reaktivitäten dieser T-Zellinie mit den Einzelpeptiden aus diesen Pools dargestellt. Daraus läßt sich ableiten, daß die T-Zellinie 24/31 mit den Peptiden pl66-185 und pl76-195 rea¬ giert.

BEISPIEL 2 Bestimmung des Subtyps von MHC-Molekülen, die den T-Zellinien R.B. und M.C. autoreaktive Peptide präsentieren

Die Versuchsdurchführung erfolgte analog dem Beispiel 1.4. Als Antigen-präsentierende Zellen wurden allerdings keine autolo- gen PBLs verwendet, sondern Epstein Barr Virus transformierte B-Zellen mit definierten MHC-Allelen (sogenannte homozygote Typisierungszellinien) . Diese wurden so ausgewählt, daß nur

eine teilweise Übereinstimmung mit den MHC-Klasse II Molekülen des Spenders der T-Zellinien gegeben war, z.B. Identität in den DR-Allelen, Nichtidentität bezüglich der DQ-Aliele. In Abweichung vom beschriebenen Beispiel 1.4 wurden die Peptide nach dem Antigenpulse ausgewaschen, um eine Autopräsenta ion durch die T-Zellen zu vermeiden.

Die Ergebnisse dieses Tests sind in Tabelle 1 dargestellt. Die T-Zellproliferation ist als Stimulationsindex (SI) ausge- drückt .

Das Ergebnis dieser Analyse ist bei der T-Zellinie R.B. ein¬ deutig. Nur wenn die Antigen-präsentierenden Zellen das Peptid p86-106 in Assoziation mit DRB1*0101 präsentieren, erfolgt eine Stimulation der T-Zellen. Andere DR-Allele können das Peptid nicht präsentieren, eine Beteiligung des DQ-Alleles DQB1*0501 konnte ausgeschlossen werden (siehe Ergebnis mit den antigenpräsentierenden Zellen MZ070782) . Somit ist DRB1*0101 das Restriktionselement für die T-Zellinie R.B. Für die T- Zellinie M.C. konnte das Restriktioπselement durch diese Art der Analyse nicht im Detail aufgeklärt werden, da das DR-Allel DRB1*1501 und das DQ-Allel DQB1*0602 in der kaukasischen Be¬ völkerung eng gekoppelt vorliegen. Die Analyse ergab eine Präsentation des Peptids entweder über die DR-Allele DRB1*1501 bzw. 1601 oder über das DQB1 ^* 0602 Allel .

Tabelle 1

APC DRB1* :DQB1* T-Zellinienproliferation kein Antigen rGAD Peptid

86-105 246-265 (CPM) (SI) (SI) (SI)

R.B. T-Zellinie

56 28

20

118

32 28

34

11 41 13 12

BEISPIEL 3

Identifizierung- des autoreaktiven Peptids p556-p575

Analog dem in Beispiel 1.4 beschriebenen Verfahren wurde ein Screening nach weiteren autoreaktiven Peptiden aus der humanen GAD 65 kd durchgeführt. Dabei wurde gefunden, daß die T- Zellinie 40/2 mit einem einzigen Peptidpool reagiert. Bei einer Untersuchung der Einzelpeptide dieses Peptidpools wurde festgestellt, daß die T-Zellinie 40/2 ausschließlich mit dem Peptid p556-575 reagiert.

Zur Bestimmung des Isotyps von MHC-Molekülen, die das autore¬ aktive Peptid p556-575 präsentieren, wurden autologe PBL mit monoklonalen Antikörpern, welche HLA-DR, HLA-DQ und HLA-Klasse I-Moleküle erkennen, vorinkubiert. Dann erfolgte die Zugabe von Peptid p556-575. Nach einer Zwischeninkubation von 3 h wurden die T-Zellen zugegeben und ein Proliferationstest durchgeführt. Dabei wurde gefunden, daß eine signifikante Inhibition der Profiferation nur in Anwesenheit desjenigen monoklonalen Antikörpers, der HLA-DR er.-ennt, erfolgt. Da der Patient, aus dem die T-Zellinie 40/2 entwickelt wurde, homozy- got das Allel DR Bl ^* 0401 exprimiert, ist dieses somit als Restriktionselement identifiziert.

BEISPIEL 4

Identifizierung von T-Zellrezeptoren (TCR)

Zur Identifizierung und Sequenzierung von GAD-spezifischen TCR wurde aus T-Zellen Gesamt-RNA isoliert. Hierzu wurden die Zellen in Suspension mit PBS gewaschen und das Zellpellet mit 0,2 ml RNAzol-B pro 1 x 10 ⁶ Zellen resuspendiert. Nach mehr¬ fachem mechanischen Resuspendieren der Lysate und gegebenen¬ falls Zugabe von Hefe tRNA als Trägermatrix erfolgte die RNA- Extraktion durch Zugabe von 0,2 ml Chloroform pro 2 ml Homoge- nisat, nachfolgendem Mischen für 15 sek. und 5-minütiger Lage¬ rung auf Eis.

Nach einem Zentrifugationsschritt von 12.000 g für 15 min. wurde die wässrige Phase abgenommen und in ein neues Reak¬ tionsgefäß überführt . Die erste Präzipitation der RNA erfolgte durch Zugabe eines identischen Volumens Isopropanol und an- schließender Lagerung für mindestens 15 min. bei 4 °C. Nach Zentrifugation für 15 min. bei 12.000 g und 4 °C wurde die RNA als Pellet am Grund des Gefäßes erhalten.

Nach Verwerfen des Überstandes wurde das RNA-Pellet durch kurzes Mischen in 75 % Ethanol von Salzen gereinigt. Nach Zentrifugation (7.500 g, 4 °C, 8 min.) wurde das Pellet in 100 μl mit Diethylpyrocarbonat (DEPC) behandeltem Wasser ge¬ löst und mit 250 μl Ethanol und 10 μl 2M NaCl für mindestens 1 h bei -20 °C erneut präzipitiert. Die Zentrifugations- und Waschschritte nach der zweite Präzipitation erfolgten wie bei der ersten Fällung beschrieben. Nach Lufttrocknung des Pellets wurde die RNA in H ₂ 0-DEPC resuspendiert.

Aus der RNA wurde durch reverse Transkription cDNA syntheti- siert. Hierzu wurden ca. 3 μg Gesamt-RNA mit 30 ng p-CαST (ein für die TCR-α-Kette spezifischer Primer mit der Sequenz 5'-CAC

TGA AGA TCC ATC ATC TG-3') und 30 ng p-C3ST (ein für die ß-

Kette spezifischer Primer mit der Sequenz 5'-TAG AGG ATG GTG

GCA GAC AG-3') in einem Reaktionsvolumen von 10 μl für 10 min. bei 55 °C inkubiert. Anschließend wurden 38 μl RAV-2-RT-Puffer

(100 mM Tris-HCl pH 8,3; 140 mM KC1; 10 mM MgCl ₂ ; 2 mM Di- thiothreitol, jeweils 0,1 mM dNTP) , 1 μl (0,75 U) rRNasin und

1 μl (18 U) reverse Transkriptase zupipettiert. Die reverse

Transkription erfolgte für 90 min. bei 42 °C, gefolgt von einem Denaturierungsschritt bei 68 °C für 5 mir;. Die Lagerung bis zum Verbrauch erfolgte bei -80 °C.

Anschließend wurde eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) druch- geführt. Mit Hilfe von 5' -familienspezifischen Primern für die variablen Domänen der <_.- und ß-Ketten wurde durch das Auftre¬ ten eines Arplifikats angezeigt, ob die entsprechende V-Fami- lie exprimiert wird oder nicht. Die 3'-Primer lagen in der

konstanten Domäne und waren bei allen c_- bzw. ^-Ansätzen gleich. Ein Kontrollamplifikat, welches in der konstanten Domäne liegt und nicht mit dem spezifischen Amplifikations- produkt überlappt, zeigt an, ob die PCR-Reaktion in diesem 5 Ansatz funktioniert hat und konnte zur semiquantitativen Be¬ stimmung der V-familienspezifischen Expression dienen.

Die Primer wurden auch biotinyliert eingesetzt, um eine nach¬ folgende Aufreinigung der PCR-Produkte durch Kopplung an eine ιo magnetische partikuläre Festphase (Streptavidin-beschichtete Beads) zu ermöglichen.

Die PCR wurde unter Verwendung einer thermostabilen DNA-Poly- merase mit folgendem Reaktionsschema durchgeführt :

15

94 °C 4 min. Prädenaturierung 94 °C 30 sek. DNA-Denaturierung 56 °C 30 sek. Annealinig 72 °C 1 min. Extension 20 72 °C 5 min. Auffüllen aller Einzelstränge in der Reaktions¬ lösung (nur am Ende)

Die Anzahl von Reaktionszyklen bei der PCR war in der Regel 35.

25

Die auf diese Weise erhaltenen PCR-Fragmente wurden sequen¬ ziert.

Die 4 unabhängig isolierten GAD-spezifischen T-Zellklone des 30 Patienten 24: 24/31#l/_L, 24/31#l/4, 24/31#9, 24/31#PF7 expri- mieren alle den gleichen TCR. Dieser setzt sich zusammen aus: Vα8 (AV8S1A1) und Vjß5 (BV5S1A1T) . Auch die verwendeten J-Gen- segmente und die CDR3-Regionen sind identisch.

35 Der T-Zellklon 40/2#20 des Patienten 40 exprimiert 2 α-Ketten, nämlich Vα2 (AV2S1A2) und Vα.21 (ADV21S1A1) und eine V3-Kette, V/32 (BV2S1A4T) .

In ..bb. 5 und 6 sind die Sequenzdaten der CDR3-Regionen aus den TCR-CY- bzw. TCR3-/3-Ketten gezeigt.

Die vollständigen Sequenzen der TCR können mit Hilfe bekannter Sequenzen aus der GENBank/EMBL-Datenbank ohne weiteres be¬ stimmt werden. Die jeweiligen Zugriffsnummern (Accession nura- bers) sind wie folgt:

Vα8 (AV8S1A1) X04954/M13734 Vα;2 (AV2S1A2) M17652 Vα21 (ADV21S1A1) M15565

V/S5 (BV5S1A1T) X04954 V/32 (BV2S1A4T) M11954

SEQUENZPROTOKOLL

(1) ALLGEMEINE ANGABEN:

(i) ANMELDER:

(A) NAME: Boehringer Mannheim GmbH

(B) STRASSE: Sandhofer Str. 112-132

(C) ORT: Mannheim

(E) LAND: DE

(F) POSTLEITZAHL: 68305

(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Autoreaktive Peptide aus der humanen Glutamin-Decarboxylase (GAD)

(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 30

(iv) COMPUTER-LESBARE FASSUNG:

(A) DATENTRÄGER: Floppy disk

(B) COMPUTER: IBM PC compatible

(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS

(D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, Version #1.30 (EPA)

(vi) DATEN DER URANMELDUNG:

(A) ANMELDENUMMER: DE 19525784.7

(B) ANMELDETAG: 14-JUL-1995

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 20 Aminosäuren

(B) ART: Aminosäure

(C) STRANGFORM:

(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:

Asp Val Asn Tyr Ala Phe Leu His Ala Thr Asp Leu Leu Pro Ala Cys 1 5 10 15

Asp Gly Glu Arg 20

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 20 Aminosäuren

(B) ART: Aminosäure

(C) STRANGFORM:

(D) TOPOLOGIE: linear

(Xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:

Ser Asn Met Tyr Ala Met Met Ile Ala Arg Phe Lys Met Phe Pro Glu 1 5 10 15

Val Lys Glu Lys 20

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 3:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 20 Aminosäuren

(B) ART: Aminosäure

(C) STRANGFORM:

(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:

Asn Trp Glu Leu Ala Asp Gin Pro Gin Asn Leu Glu Glu Ile Leu Met 1 5 10 15

His Cys Gin Thr 20

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 4:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 20 Aminosäuren

(B) ART: Aminosäure

(C) STRANGFORM:

(D) TOPOLOGIE: linear

(.:i) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:

Thr Leu Lys Tyr Ala Ile Lys Thr Gly His Pro Arg Tyr Phe Asn Gin 1 5 10 15

Leu Ser Thr Gly 20

(. ANGABEN ZU SEQ ID NO: 5:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 20 Aminosäuren

(B) ART: Aminosäure

(C) STRANGFORM:

(D) TOPOLOGIE: linear

(Xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5:

Pro Arg Tyr Phe Asn Gin Leu Ser Thr Gly Leu Asp Met Val Gly Leu 1 5 10 15

Ala Ala Asp Trp 20

(2) ANGABEN ZU SEQ ID _.0: 6:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 20 Aminosäuren

(B) ART: Aminosäure

(C) STRANGFORM:

(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 6:

Thr Tyr Glu Ile Ala Pro Val Phe Val Leu Leu Glu Tyr Val Thr Leu 1 5 10 15

Lys Lys Met Arg 20

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 7:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 20 Aminosäuren

(B) ART: Aminosäure

(C) STRANGFORM:

(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 7:

Phe Phe Arg Met Val Ile Ser Asn Pro Ala Ala Thr His Gin Asp Ile 1 5 10 15

Asp Phe Leu Ile 20

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 8:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren

(B) ART: Aminosäure

(C) STRANGFORM:

(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 8:

Ile Leu Ile Lys Cys Asp Glu Arg Gly Lys Met Ile Pro Ser 1 5 10

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 9:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren

(B) ART: Aminosäure

(C) STRANGFORM:

(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 9:

Leu Gly Ile Gly Thr Asp Ser Val Ile Leu Ile Lys Cys Asp 1 5 10

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 10:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren

(B) ART: Aminosäure

(C) STRANGFORM:

(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 10:

Leu Ala Phe Leu Gin Asp Val Met Asn Ile Leu Leu Gin Tyr 1 5 10

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 11:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren

(B) ART: Aminosäure

(C) STRANGFORM:

(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 11:

Tyr Asp Leu Ser Tyr Asp Thr Gly Asp Lys Ala Leu Gin Cys 1 5 10

(.. ANGABEN ZU SEQ ID NO: 12:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren

(B) ART: Aminosäure

(C) STRANGFORM:

(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 12:

V-r.1 Ser Tyr Gin Pro Leu Gly Asp Lys Val Asn PLe Phe Arg 1 5 10

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 13:

(i SEQUENZKENNZEICHEN:

_- 4 _Λ( 0 _\ _

(A) LÄNGE: ___ Aminosäuren

(B) ART: Aminosäure

(C) STRANGFORM:

(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 13:

Leu Ala Ala Asp Trp Leu Thr Ser Thr Ala Asn Thr Asn Met 1 5 10

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 14:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren

(B) ART: Aminosäure

(C) ΞTRANGFORM:

(D) TOPOLOGIE: linear

( i) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 14:

Leu Leu Tyr Gly Asp Ala Glu Lys Pro Ala Glu Ser Gly Gly 1 5 10

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 15:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren

(B) ART: Aminosäure

(C) STRANGFORM:

(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 15:

Val Asn Tyr Ala Phe Leu His Ala Thr Asp Leu Leu Pro Ala 1 5 10

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 16:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren

(B) ART: Aminosäure

( ) STRANGFORM:

(D) TOPOLOGIE: linear

( i) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 16:

Leu Leu Gin Tyr Val Val Lys Ser Phe Asp Arg Ser Thr Lys 1 5 10

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 17:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren

(B) ART: Aminosäure

(C) STRANGFORM:

(D) TOPOLOGIE: linear

( i) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 17:

Phe Thr Tyr Glu Ile AI"* ¹ Pro Val Phe Val Leu Leu Glu Tyr 1 5 10

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 18:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren

(B) ART: Aminosäure

(C) STRANGFORM:

(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 18:

Leu Glu Tyr Val Thr Leu Lys Lys Met Arg Glu Ile Ile Gly 1 5 10

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 19:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren

(B) ART: Aminosäure

(C) STRANGFORM:

(D) TOPOLOGIE; linear

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 19:

Asn Met Tyr Ala Met Met Ile Ala Arg Phe Lys Met Phe Pro 1 5 10

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 20:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

,A) LÄNGE: 14 Aminosäuren

(B) ART: Aminosäure

(C) STRANGFORM:

(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 20:

Lys Ile Trp Met His Val Asp Ala Ala Trp Gly Gly Gly Leu 1 5 10

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 21:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren

(B) ART: Aminosäure

(C) STRANGFORM:

(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 21:

Trp Gly Gly Gly Leu Leu Met Ser Arg Lys His Lys Trp Lys 1 5 10

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 22:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren

(B) ART: Aminosäure

(C) STRANGFORM:

(D) TOPOLOGIE: linear

(Xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 22

Glu Gly Tyr Glu Met Val Phe Asp Gly Lys Pro Gin His Thr 1 5 10

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 23:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren

(B) ART: Aminosäure

(C) STRANGFORM:

(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 23:

Arg Tyr Phe Asn Gin Leu Ser Thr Gly Leu Asp Met Val Gly 1 5 10

(2) ANG/.3EN ZU SEQ ID NO: 24:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren

(B) ART: Aminosäure

(C) STRANGFORM:

(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 24:

Trp Leu Thr Ser Thr Ala Asn Thr Asn Met Phe Thr Tyr Glu 1 5 10

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 25:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren

(B) ART: Aminosäure

(C) STRANGFORM:

(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 25:

Thr Ala Asn Thr Asn Met Phe Thr Tyr Glu Ile Ala Pro Val 1 5 10

ANGABEN ZU SEQ ID NO: 26:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren

(B) ART: Aminosäure

(C) STRANGFORM:

(D) TOPOLOGIE: linear

xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 26:

Leu Val Ser Ala Thr Ala Gly Thr Thr Val Tyr Gly Ala Phe 1 5 10

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 27:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren

(B) ART: Aminosäure

(C) STRANGFORM:

(D) TOPOLOGIE: linear

(Xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 27:

Tyr Ile Pro Pro Ser Leu Arg Thr Leu Glu Asp Asn Glu Glu 1 5 10

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 28:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 14 Aminosäuren

(B) ART: Aminosäure

(C) STRANGFOx^M:

(D) TOPOLOGIE: linear

( i) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 28:

Val Ile Ser Asn Pro Ala Ala Thr His Gin Asp Ile Asp Phe 1 5 10

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 29:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 25 Aminosäuren

(B) ART: Aminosäure

(C) STRANGFORM:

(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 29:

Gly Met Ala Ala Leu Pro Arg Leu Ile Ala Phe Thr Ser Glu His Ser 1 5 10 15

His Phe Ser Leu Lys Lys Gly Ala Ala 20 25

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 30:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:

(A) LÄNGE: 20 Aminosäuren

(B) ART: Aminosäure

(C) STRANGFORM:

(D) TOPOLOGIE: linear

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 30:

Glu Arg Gly Lys Met Ile Pro Ser Asp Leu Glu Arg Arg Ile Leu Glu 1 5 10 15

Ala Lys Gin Lys 20