本发明涉及植物蛋白及其编码基因与应用，特 别是涉及一个来源于棉花的 AVP1蛋白， 以 及其在培育抗旱性、 耐盐性提高的转基因植物中的应用。

背景技术

干旱使得超过 40%的地球陆地面积种植农作物受到限制， 对全球农业生产和粮食供应也 构成了严重的威胁， 干旱是对农作物产量的主要环境限制条件之一 。

世界上盐碱土的面积很大， 约有 4亿公顷， 占灌溉农田的 1 /3。 在气候干燥的半干旱、 干旱 地区由于降雨量少、 蒸发剧烈， 盐分不断积累； 海滨地区由于海水倒灌造成土壤含盐量增加。 我国盐碱土主要分布于西北、华北、 东北和滨海地区， 随着大棚面积的逐年增长和栽培年代的 推移， 土壤盐渍化日趋严重。 对绝大多数农作物来说， 土壤中过量的 Na+会对植物体的正常的 生长代谢产生毒害作用。因此如何在盐渍环境 下提高作物产量就成为我国农业生产中十分重 要 的问题。

采用传统的方法选育耐盐、 抗旱的植物品种固然简便可行， 但进展缓慢， 局限性大。 随着 分子生物学技术的发展， 一大批与植物耐盐、抗旱有关的基因相继得到 克隆， 植物转基因技术 有了重大突破， 这为有效利用旱地及盐碱地提高作物产量， 治理盐渍化及荒漠化土地提供了新 的思路和方法。

植物的抗逆性是一个十分复杂的数量性状， 其耐盐机制涉及从植株到器官、 组织、 生理 生化直至分子的各个水平。 植物在受到胁迫时会产生相应的应答反应， 来降低或消除给植株 带来的危害。植物的这种应答反应是一个涉及 多基因、多信号途径、多基因产物的复杂过程 。 这些基因及其表达产物可以分为 3类： （1)参与信号级联放大系统和转录控制的基因� ��产物； (2) 直接对保护生物膜和蛋白质起作用的基因及其 表达产物； （3)与水和离子的摄入和转运 相关的基因及蛋白质。各国的科学家也为此做 了大量的工作， 并取得突破性的进展（Park S. 2005. Up- regulation of a tf- pyrophosphatase (tf-PPase) as a strategy to engineer drought-resistant crop plants. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 102 : 18830-18835 ; ABE H. 2003. A rabid op sis AtMYC2 (bM) and AtMYB2 (MYB) function as transcrip tional activato rs in abscisic acid signaling. Plant Cell, 15 : 63-78； Zhang ZL. 2011. Arabidopsis Floral Initiator SKB1 Confers High Salt Tolerance by Regulating Transcription and Pre-mRNA Splicing through Altering Hi stone H4R3 and Small Nuclear Ribonucleoprotein LSM4 Methylation. Plant Cell, 23 : 396 - 411)。 通过生物技术手段， 对胁迫具有耐受能力的农作物、 旱生植物和盐生植物的研究都取得了显著的成 果， 对胁迫相 关基因和信号转导系统也有了更进一步的了解 。

但就目前的研究状况而言， 由于其机制十分复杂， 许多植物对逆境下的生物化学和生理 学上的响应机制仍有待深入研究。 在抗逆应答基因的功能及表达调控方面的研究 占多数， 但 抗逆相关的信号传递途径之间的联系以及整个 信号传递网络系统的机理还有待进一步研究。 虽然许多研究机构通过现代生物技术， 获得了各类具有一定耐盐、 抗旱等抗逆能力的转基因 植物， 但还未达到产业化的标准。 因此在提高植物抗逆性方面， 还有许多工作需要做。 发明内容

发明人从棉花中克隆 AVP1基因， 转化到烟草中， 获得耐盐性、 抗旱性提高的转基因烟 草， 在提高植物抗逆性研究领域具有明显的应用前 景。

本发明人利用 SSH和 RACE相结合的方法克隆出了棉花的一个 AVP1类蛋白的编码基因 (本文命名为 GhAVPl-3基因） 的 DNA序列。 并发现将其导入转基因植株后， 可明显改善转 基因植株的耐盐性和抗旱性， 而且这些性状可稳定遗传。

本发明的第一方面提供棉花的一个 AVP1类蛋白， 其序列为 SEQ ID No: 1。

本发明的第二方面提供编码本发明第一方面所 述的蛋白的核苷酸序列。 优选地， 编码所 述蛋白的核苷酸序列具有 SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列。

本发明的第三方面提供一种重组表达载体，其 含有本发明第二方面所述的核苷酸序列， 并且所述核苷酸序列与所述表达载体的表达控 制序列可操作地连接。 在另一个实施方案中， 所述表达载体为 rd29A-GhAVPl-3-2300， 如图 2中所示。

本发明的第四方面提供一种重组细胞， 含有本发明第二方面所述的核苷酸序列或者本 发明第三方面所述的重组表达载体。 在一个实施方案中， 所述重组细胞为重组农杆菌细胞。

本发明的第五方面提供一种改善植物耐盐性和 /或抗旱性的方法， 包括： 将本发明第二 方面所述的核苷酸序列或者本发明第三方面所 述的重组表达载体导入植物或植物组织并使 所述基因表达。 在一个实施方案中， 所述植物是烟草。

本发明的第六方面提供一种制备转基因植物的 方法， 包括： 在有效产生植物的条件下 培养含有本发明第二方面所述的核苷酸序列或 者本发明第三方面所述的重组表达载体的植 物或植物组织。 在一个实施方案中， 所述植物是烟草。

本发明的第七方面提供本发明第一方面所述的 蛋白、 本发明第二方面所述的核苷酸序 列、 本发明第三方面所述的重组表达载体或本发明 第四方面所述的重组细胞用于改善植物 耐盐性和 /或抗旱性以及用于植物育种的用途。 在一个实施方案中， 所述植物是烟草。 附图说明

图 1. 植物表达载体 rd29A- GhAVPl-3-2300构建流程 （图 la-c)。

图 2. 植物表达载体 rd29A- GhAVPl-3-2300的质粒图谱。 图 3. 转基因烟草和对照植物的抗旱性生长情况； 左： 转基因植株（ 01-6); 右： 对照 烟草 6。

图 4. 转基因烟草和对照植物的耐盐性生长情况； 左： 转基因植株 （ 05-12); 右： 对 照烟草 13。 具体实施方式

AVP1基因是液泡膜 焦磷酸酶基因。

实施例 1、 干旱胁迫下棉花 SSH文库构建：

具体方法为：

利用 Clontech公司的 PCR-select™ cDNA Subtraction Kit所示的方法通过抑制消减杂交 方法构建消减文库。在实验过程中以干旱处理 的棉花幼苗的叶子的 mRNA作为样本（tester), 以未处理的棉花幼苗的叶子的 mRNA作为对照 （driver)。 具体步骤简述如下：

( 1 )供试材料：

冀棉 14 (国家棉花中期库， 获取单位中国棉花研究所， 统一编号： ZM-30270)播种到 灭过菌的蛭石上，在 25°C、光周期 16h/8h条件下培养，每周浇 1/2MS培养基（9.39 mM KN0 ₃ ， 0.625 mM KH2P0 ₄ , 10.3 mM MliNOs, 0.75 mM MgS0 ₄ ， 1.5 mM CaCl ₂ , 50 μ Μ ΚΙ, 100 μ M H ₃ B0 ₃ ， 100 μ M MnS0 ₄ ， 30 μ M ZnS0 ₄ ， 1 μ MNa ₂ Mo0 ₄ ， 0.1 μ M CoCl ₂ ， 100 μ M Na ₂ EDTA， 100 M FeSO ₄ ) 一次。 当苗株高达 25-30cm时用于实验。

(2)材料处理：

将供试幼苗分为 2组， 每组 4盆， 每盆 1株。 第一组为对照组， 在 25°C、 光照培养， 正 常浇灌。第二组为干旱处理组， 25°C、光照培养， 停止烧灌， 处理 10天， 处理完毕后及时剪 取两组幼苗顶端 1/3的叶片， 用液氮迅速冷冻后， 于 -70°C冰箱中保存。

(3 ) 总 RNA提取：

分别取对照组和干旱处理组的棉花叶子 0.5g， 用植物 RNA提取试剂盒 （invitrogen) 依 照说明书提取棉花的总 RNA。 用 HITACffl公司的紫外分光光度计 U-2001测定总 RNA在 260nm和 280nm的吸光度值， OD260/OD280比值为 1.8-2.0，表明总 RNA纯度较高，用 1.0% 的琼脂糖凝胶电泳检测总 RNA的完整性， 28S条带的亮度约为 18S条带的 2倍， 表明 RNA 的完整性良好。 使用 Qiagen公司的 Oligotex mRNA纯化试剂盒 (purification of polyA+ RNA from total RNA)分离 mRNA。

(4)抑制消减杂交：

为了增加获得 EST (imig _ene )的有效性， 避免基因无酶切位点及所获得序列在非翻译区 ， 进行了如下抑制消减杂交。 从前一步骤得到的 mRNA根据 Clontech公司的 PCR-selectTM cDNA Subtraction Kit的说明获得 cDNA。 用 Rsal (购自 New England Biolabs )和 Haein (购 自 New England Biolabs)分别对双链 cDNA进行消化， 做两组抑制消减杂交。 第一组： 对照 组、 干旱组获得的双链 cDNA用 Rsal酶切， 然后进行抑制消减杂交； 第二组： 对照组、 干旱 组获得的双链 cDNA用 Haelll酶切， 然后进行抑制消减杂交。 抑制消减杂交的其他步骤及方 法严格按 Clontech公司的 PCR-selectTM cDNA Subtraction Kit产品说明书中所示的方法进 行， 最后合并两组正向消减杂交 cDNA片段的第二次 PCR产物。

(5) cDNA消减文库的构建与初步筛选、 克隆、 鉴定

合并的正向消减杂交 cDNA片段的第二次 PCR产物（ QIAquick PCR Purification Kit纯化， 购自 Qiagen)与 pGEM-T Easy (购自 Promega试剂盒)载体连接， 依照 pGEM-T Easy试剂盒的 产品说明书， 具体步骤如下： 用 200ul PCR管依次加入下列成分： 纯化 cDNA片段的第二次 PCR产物 3ul， T4连接酶缓冲液 5 ul， pGEM-T Easy载体 l ul， T4 DNA连接酶 lul， 于 4°C 连接过夜。取 ΙΟμΙ^连接反应产物，加入到 ΙΟΟμί感受态大肠杆菌 JM109(购自 TAKARA)中， 冰浴 30min、热休克 60s、冰浴 2min，另加 250 μΙ Β液体培养基 ( 1% Tryptone购自 OXOID, 0.5% Yeast Extract购自 OXOID, 1% NaCl购自国药） 置 37°C摇床中， 225 r/min摇菌 30min， 取 200 ^菌液种植于含 50 ug/mL氨苄青霉素、 40 ug/mL X-gak 24 ug/mL IPTG ( X-gal/IPTG 购自 TAKARA) 的 LB固体培养基 (LB液体培养基中加入 1.5%的琼脂）培养板上， 37°C培 育 18 h。 计数培养板中直径 >1 mm的清晰白色及蓝色菌落数， 随机挑取 360个白色菌落 (编 号： Gh-D001至 Gh-D360)。 将 360个白色克隆挑于含有 50 ug/mL氨苄青霉素的 LB 液体培 养基的 96孔细胞培养板 (CORNING)中， 37°C培养过夜后加甘油至终浓度 20%， 于- 80°C保 存备用。 以巢式 PCR弓 I物 Primer 1 (Clontech公司的 PCR-select™ cDNA Subtraction Kit试剂 盒自带） 和 Primer 2R ( Clontech公司的 PCR-select™ cDNA Subtraction Kit试剂盒自带） 进 行菌液 PCR扩增，得到 292个阳性克隆，对所有阳性克隆在送英潍捷基 （上海）贸易有限公 司测序。

(6) 差异克隆的 cDNA测序分析：

将 DNA测序结果去除载体和不明确序列及多余的 cDNA后，共得到 180个 EST(unig _ene )。 经 BlastN发现其中 102条 unigene在 GenBank 中有同源序列（同源性 50%以上）， 33条 EST 功能未知或者为假定蛋白， 另有 45条未获得同源匹配， 推测可能是处于 3 '、 5' 末端非翻译 区的较短序列。

实施例 2、 GhAVPl-3基因的克隆

在上述有同源序列的 unigene中， 克隆子 Gh-D177序列： SEQ ID No: 3：

1 ACTACGGTGA TGACTGGGAA GGCCTTTTTG AGGCTATTAC TGGTTATGGT CTTGGGGGAT

61 CCTCTATGGC ACTGTTTGGA AGAGTTGGTG GTGGTATATA TACAAAGGCT GCTGATGTCG

121 GTGCTGATCT TGTAGGAAAG GTTGAAAGGA ACATTCCAGA GGATGACCCA AGAAACCCAG

181 CTGTCATTGC CGACAATGTT GGCGATAATG TTGGGGATAT TGCTGGTATG GGTTCTGATC

241 TATTTGGCTC ATATGCTGAA TCCTCCTGTG CTGCTCTTGT TGTTGCTTCT ATATCCTCTT

301 TTGGAATAAA CCACGAGTTC ACTGCCATGT TGTATCCTCT GCTCATTAGT TCTGTTGGTA

361 TTCTTGTCTG TTTGATCACA ACCCTATTTG CTACGGATTT CTTCGAAATT AAGGCTGTCA

421 AAGAAATCGA ACCAGCTTTG AAGAAGCAGC TTATTATATC TACTGTTCTT ATGACTGTGG

481 GGATTGCAAT TGTTACTTGG GTTGGTGTGC CATCGTCCTT CACCATTTAC AATTTTGGGG

541 ATCAGAAAGT TGTTAAGAAC TGGCAACTAT TTTTGTGCGT TGGTGTTGGT CTCTGGGCTG

601 GACTTATTAT TGGTTTTGTT ACTGAGT

序列分析（核酸序列在 NCBI Blast)表明该序列的编码的氨基酸序列属于 AVP1类蛋白， 本文将克隆子 Gh-D177对应的编码基因命名为 GhAVPl-3基因。

根据已经获得的 GhAVPl-3基因片段， 设计两条特异性引物， 作为 3 ' RACE的 5 '端特 异性引物：

GhAVPl-3 GSP1 : SEQ ID No: 4：

ACTGTTTGGA AGAGTTGGTG G

GhAVPl-3 GSP2: SEQ ID No: 5：

TGTAGGAAAG GTTGAAAGGA AC

实验步骤按试剂盒说明书操作（3' RACE System for Rapid Amplification ofcDNAEnds试 剂盒购自 invitrogen公司）。

用 SEQ ID NO: 4与 3'端弓 |物 AUAP (试剂盒自带）， 以 mRNA逆转录的 cDNA为模板 进行第一轮 PCR扩增。具体步骤如下: Ex Taq购自 TAKARA, 50 μΐ PCR反应体系： 5 μΐ ΙΟχΕχ Buffer, 3 μΐ 2.5mM的 dNTP， 2.0 μΐ mRNA反转录的 cDNA， 1.0 μΐ Ex Taq、 10 μΜ的弓 |物 SEQ ID NO: 4和 AUAP各 2.0μ1， 以及 35 μΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min; 94 °C 变性 30 s， 58°C退火 30 s, 72 °C 延伸 2min， 33个循环； 72°C 延伸 10 min。

所得的 PCR产物用双熘水稀释 100倍后取 2.0 μΐ作为模板， 用 SEQ ID NO: 5与 3'端弓 | 物 AUAP进行第二轮 PCR扩增，具体步骤如下： 50 μ1 ΡΟ 反应体系： 5 μΐ ΙΟχΕχ Buffer, 3 μΐ 2.5mM的 dNTP， 2.0 μΐ第一轮稀释的 PCR产物， 1.0 l Ex Taq、 10 μΜ的引物 SEQ ID NO: 5 和 AUAP各 2.0μ1， 以及 35 μΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min; 94 °C 变性 30 s， 58°C退火 30 s， 72 °C 延伸 2min， 33个循环； 72°C 延伸 10 min。第二次 PCR产物（QIAquick PCR Purification Kit纯化， 购自 Qiagen) 3ul连接于 pGEM-T Easy Vector, 转化到大肠杆菌 JM109(具体方法同上)，随机挑取 10个白色菌落于含有 50 ug/mL氨苄青霉素的 LB 液体培养 基中培养, 37°C培养过夜后加甘油至终浓度 20%, -80°C保存备用。 SEQ ID NO: 5与 3'端弓 |物 AUAP进行菌液 PCR扩增 （50 μ1 ΡΟ 反应体系： 5 μΐ ΙΟχΕχ Buffer, 3 μΐ 2.5mM的 dNTP， 2.0 μΐ菌液， 1.0 μΐ Ex Taq、 10 μΜ的弓 |物 SEQ ID NO: 5和 AUAP各 2.0μ1， 以及 35 μΐ的双 蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min; 94 °C 变性 30 s， 58°C退火 30 s, 72 °C 延伸 2min， 33个循环； 72°C 延伸 lO min) , 得到 4个阳性克隆， 送英潍捷基（上海）贸易有限公司测序, 获得该基因的 cDNA的 3'端。

根据已经获得的 GhAVPl-3基因片段， 设计三条特异性引物， 作为 5 ' RACE的 3 '端特 异性引物：

GhAVPl-3 GSP4: SEQ ID No： 6：

GCACACCAAC CCAAGTAACA

GhAVPl-3 GSP5: SEQ ID No： 7：

GCTGCTTCTT CAAAGCTGGT TC

GhAVPl-3 GSP6: SEQ ID No： 8：

CTTAATTTCG AAGAAATCCG TAG

实验步骤按试剂盒说明书操作 （ 5 ' RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends 试剂盒， 购自 invitrogen公司）。 SEQ ID No: 6作为 mRNA反转录成 cDNA的引物。

ffl SEQ ID NO: 7与 5'通用引物 AAP (试剂盒自带）， 以 mRNA逆转录的 cDNA (反转 录弓 I物 SEQ ID NO: 6)为模板进行第一轮 PCR扩增，具体步骤如下： Ex Taq购自 TAKARA, 50 μΐ PCR反应体系： 5 μΐ ΙΟχΕχ Buffer, 3 μΐ 2.5mM的 dNTP， 2.0 μΐ总 RNA反转录的 cDNA, 1.0 μ1 Εχ Τα 10 μΜ的引物 SEQ ID NO: 7和 AAP各 2.0μ1， 以及 35 μΐ的双蒸水。 PCR反应 条件： 94°C预变性 5 min; 94 °C 变性 30 s， 55°C退火 30 s, 72 °C 延伸 2min， 33个循环； 72 °C 延伸 10 min。

所得的 PCR产物用双蒸水稀释 100倍后取 2.0 μΐ作为模板， 用 SEQ ID NO: 8与 3'端弓 | 物 AUAP进行第二轮 PCR扩增，具体步骤如下： 50 μ1 ΡΟ 反应体系： 5 μΐ ΙΟχΕχ Buffer, 3 μΐ 2.5mM的 dNTP， 2.0 μΐ第一轮稀释的 PCR产物， 1.0 μΐ Ex Taq、 10 μΜ的弓 |物 SEQ ID NO: 8 和 AUAP各 2.0μ1， 以及 35 μΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min; 94V 变性 30 s， 58°C退火 30 s, 72V 延伸 2min， 33个循环； 72°C 延伸 10 min。第二次 PCR产物（QIAquick PCR Purification Kit纯化， 购自 Qiagen) 3ul连接于 pGEM-T Easy Vector, 转化到 JM109(具 体方法同上),随机挑取 10个白色菌落于含有 50 ug/mL氨苄青霉素的 LB 液体培养基中培养, 37°C培养过夜后加甘油至终浓度 20%, -80°C保存备用。 SEQ ID NO: 8与 3'端弓 |物 AUAP进 行菌液 PCR扩增 （50 μΐ PCR反应体系： 5 μΐ ΙΟχΕχ Buffer, 3 μΐ 2.5mM的 dNTP， 2.0 μΐ菌 液， 1.0 μΐ Ex Taq、 10 μΜ的弓 |物 SEQ ID NO: 8和 AUAP各 2.0μ1， 以及 35 μΐ的双蒸水。 PCR 反应条件： 94°C预变性 5 min; 94 °C 变性 30 s， 58°C退火 30 s, 72°C 延伸 2min， 33个循环； 72°C 延伸 10 min) , 得到 3个阳性克隆,送英潍捷基 （上海） 贸易有限公司测序,获得该基因 的 cDNA的 5'端。

所得的 5 ' RACE产物克隆测序后， 与 3 ' RACE产物测序结果拼接。 获得 GhAVPl-3 全长 cDNA序列。 根据 GhAVPl-3全长 cDNA序列设计一对弓 |物如下：

GhAVPl-3F: SEQ ID No: 9：

ATGGGAGCGGTTTTGTTGTCGGAGTTTG

GhAVPl-3R _: SEQ ID No: 10：

CTAAAAGATC TTGAAAAGCAAGCCACCG

通过 SEQ ID No: 9和 SEQ ID No: 10来克隆 GhAVPl-3基因全长。

采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶， 以棉花的 cDNA为模板进行 PCR反应。 50μ1 ΡΟ 反应体系： ΙΟμΙ 5 xPS Buffer, 3μ1 2.5mM的 dNTP， 2.0μ1 cDNA, Ι .ΟμΙ PrimeSTAR, 10μΜ的弓 I物 SEQ ID No: 9和 SEQ ID No: 10各 2.0μ1， 30μ1的双蒸水。 PCR反应条件： 94 °C 预变性 5min; 94°C 变性 30s，58°C退火 30s，72°C 延伸 2min， 33个循环后； 72°C 延伸 10min。

PCR扩增产物加 A。 将上述 PCR产物加 2.5倍的无水乙醇， -20°C放置 10分钟， 离心， 去上清，晾干，用 21μ1双蒸水溶解。加入 2.5ul ΙΟχΕχ Buffer, 0.5ul 5 mM的 dATP， 2.5ul ΙΟχΕχ Taq。反应条件： 70°C反应 30分钟。将得到约 2300bp的 DNA片段回收（Omega回收试剂盒）， 连接至 pGEM T-easy载体 （购自 Promega试剂盒）， 转化 JM109C方法同上)， 随机挑取 10个 白色菌落于含有 50 ug/mL氨苄青霉素的 LB液体培养基中培养， 37 °C培养过夜后加甘油至终 浓度 20%， -80°C保存备用。 SEQ ID NO : 9与 SEQ ID NO : 10进行菌液 PCR扩增 （采用 TaKaRa 的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶， 菌液进行 PCR反应。 50μ1 PCR反应体系： ΙΟμΙ 5><PS Buffer, 3μ1 2.5mM的 dNTP， 2.0μ1菌液， Ι.ΟμΙ PrimeSTAR, 10μΜ的弓 |物 SEQ ID No: 9和 SEQ ID No: 10各 2.0μ1， 30μ1的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5min; 94 °C 变性 30s， 58°C退火 30s, 72V 延伸 2min， 33个循环后； 72°C 延伸 10min。）得到 4个阳性克隆，送英潍捷基（上海） 贸易有限公司测序，序列为 SEQ ID NO : 2。 其蛋白表达序列为 SEQ ID NO: 1。 GhAVPl-3的氨基酸序列： SEQ ID No: 1

1 MGAVLLSEFA TEIWPVCAV 21 IGIAFSLVQW LLVSRVKLNP

41 ERHASGNSNK NGYSDYLIEE

61 EEGLNDPSW TKCAEIQSAI

81 SEGATSFLFT EYQYVGIFMV

101 AFAILIFLFL GSVEGFSSKS

121 QPCTYDKEKT CKPALATAIF

141 STISFLLGAI TSVLSGFLGM

161 KIATY眉 ART TLEARKGVGK

181 AFIVAFRSGA VMGFLLAANG

201 LLVLFVAINL FKLYYGDDWE

221 GLFEAITGYG LGGSS ALFG

241 RVGGGIYTKA ADVGADLVGK

261 VERNIPEDDP RNPAVIADNV

281 GDNVGDIAGM GSDLFGSYAE

301 SSCAALWAS ISSFGINHEF

321 TAMLYPLLIS SVGILVCLIT

341 TLFATDFFEI KAVKEIEPAL

361 KKQLI ISTVL MTVGIAIVTW

381 VGVPSSFTIY NFGDQKWKN

401 WQLFLCVGVG LWAGLIIGFV

421 TEYYTSNAYS PVQDVADSCR

441 TGAATNVIFG LALGYKSVI I

461 PIFAIAISIF VSFSFAAMYG

481 IAVAALGMLS TIATGLAIDA

501 YGPISDNAGG IAEMAGMSHH

521 IRERTDALDA AGNTTAAIGK

541 GFAIGSAALV SLALFGAFVS

561 LAAISTVDVL TPKVFIGLIV

581 GAMLPYWFSA MTMKSVGSAA

601 LK VEEVRRQ FNTIPGLMEG

621 RAKPDYATCV KISTDASIKE

641 MIPPGALVML TPLIVGTFFG

661 VETLAGVLAG ALVSGVQIAI

681 SASNTGGAWD NAKKYIEAGA

701 SEHARTLGPK GSDPHKAAVI

721 GDTVGDPLKD TSGPSLNILI

741 KLMAVESLVF APFFATHGGL

761 LFKIF

GhAVPl-3编码基因的核苷酸序列： SEQ ID No: 2

1 ATGGGAGCGG TTTTGTTGTC GGAGTTTGCG ACGGAGATCG TGGTGCCAGT GTGCGCCGTG

61 ATTGGAATTG CTTTCTCGTT GGTGCAGTGG CTGTTGGTGT CGCGCGTGAA GCTTAACCCG

121 GAGCGGCATG CATCGGGGAA TAGCAACAAG AACGGTTACA GTGATTACTT GATTGAGGAA

181 GAGGAAGGAC TTAATGACCC CAGTGTCGTC ACCAAGTGCG CTGAAATTCA AAGCGCTATC

241 TCCGAAGGTG CAACATCCTT TCTTTTCACT GAATATCAGT ATGTCGGCAT CTTCATGGTT

301 GCTTTTGCTA TCTTGATATT CCTTTTCCTG GGTTCTGTTG AGGGCTTCAG CTCAAAGAGC

361 CAGCCTTGCA CCTATGATAA GGAGAAGACG TGCAAACCAG CTCTTGCCAC TGCTATCTTC 421 AGTACCATAT CCTTCTTGCT TGGTGCTATC ACCTCTGTTC TTTCTGGGTT CCTTGGGATG

481 AAAATTGCTA CATATGCCAA TGCAAGAACA ACCTTAGAAG CAAGAAAGGG TGTTGGAAAG

541 GCTTTTATTG TTGCATTTAG ATCTGGCGCG GTAATGGGTT TTCTCCTCGC TGCCAATGGC

601 TTGTTGGTGC TTTTCGTTGC CATCAATCTA TTCAAGCTGT ACTACGGTGA TGACTGGGAA

661 GGCCTTTTTG AGGCTATTAC TGGTTATGGT CTTGGGGGAT CCTCTATGGC ACTGTTTGGA

721 AGAGTTGGTG GTGGTATATA TACAAAGGCT GCTGATGTCG GTGCTGATCT TGTAGGAAAG

781 GTTGAAAGGA ACATTCCAGA GGATGACCCA AGAAACCCAG CTGTCATTGC CGACAATGTT

841 GGCGATAATG TTGGGGATAT TGCTGGTATG GGTTCTGATC TATTTGGCTC ATATGCTGAA

901 TCCTCCTGTG CTGCTCTTGT TGTTGCTTCT ATATCCTCTT TTGGAATAAA CCACGAGTTC

961 ACTGCCATGT TGTATCCTCT GCTCATTAGT TCTGTTGGTA TTCTTGTCTG TTTGATCACA

1021 ACCCTATTTG CTACGGATTT CTTCGAAATT AAGGCTGTCA AAGAAATCGA ACCAGCTTTG

1081 AAGAAGCAGC TTATTATATC TACTGTTCTT ATGACTGTGG GGATTGCAAT TGTTACTTGG

1141 GTTGGTGTGC CATCGTCCTT CACCATTTAC AATTTTGGGG ATCAGAAAGT TGTTAAGAAC

1201 TGGCAACTAT TTTTGTGCGT TGGTGTTGGT CTCTGGGCTG GACTTATTAT TGGTTTTGTT

1261 ACTGAGTACT ACACCAGTAA TGCTTACAGT CCCGTGCAGG ATGTTGCCGA TTCCTGCAGG

1321 ACAGGAGCAG CTACCAATGT TATATTTGGC CTTGCTTTAG GTTACAAATC TGTGATCATC

1381 CCAATTTTTG CCATTGCGAT CAGCATTTTT GTTAGTTTTA GCTTTGCTGC CATGTATGGG

1441 ATTGCAGTTG CTGCCCTTGG AATGTTAAGC ACCATTGCAA CTGGGTTGGC CATTGATGCT

1501 TATGGTCCCA TCAGTGACAA TGCTGGAGGC ATTGCTGAGA TGGCTGGCAT GAGCCATCAC

1561 ATTCGTGAGA GAACTGATGC ACTAGATGCT GCTGGAAACA CTACAGCTGC CATTGGAAAG

1621 GGATTTGCCA TTGGGTCAGC AGCATTGGTG TCATTGGCTC TATTTGGTGC CTTTGTGAGC

1681 CTTGCAGCTA TCTCTACTGT TGATGTCTTG ACCCCGAAGG TTTTCATTGG TTTAATAGTT

1741 GGTGCCATGC TTCCCTACTG GTTCTCTGCT ATGACCATGA AAAGCGTGGG GAGTGCAGCT

1801 TTAAAGATGG TTGAGGAGGT TCGCAGGCAG TTCAACACCA TCCCTGGTCT CATGGAGGGT

1861 CGTGCCAAGC CTGATTATGC TACCTGTGTC AAAATCTCAA CTGATGCCTC TATCAAGGAG

1921 ATGATTCCTC CTGGTGCCCT TGTTATGCTT ACTCCCCTAA TCGTTGGAAC TTTCTTTGGT

1981 GTTGAGACTC TTGCCGGTGT CCTTGCTGGT GCCCTTGTCT CTGGTGTTCA GATTGCAATA

2041 TCTGCTTCCA ACACTGGTGG TGCATGGGAT AATGCCAAGA AGTACATTGA GGCTGGTGCC

2101 TCAGAGCACG CGAGGACCCT GGGTCCAAAA GGATCGGATC CTCACAAGGC AGCTGTCATT

2161 GGTGACACGG TTGGTGATCC ACTCAAGGAT ACCTCTGGCC CTTCACTCAA CATCCTGATC

2221 AAGCTTATGG CAGTCGAGTC ACTCGTATTT GCTCCCTTCT TTGCCACTCA CGGTGGCTTG

2281 CTTTTCAAGA TCTTTTAG 实施例 3 GhAVPl-3基因植物表达载体构建

植物表达载体 rd29A- GhAVPl-3-2300构建流程如图 1所示。

选择植物双元表达载体 PCAMBIA2300 (购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）� �为 植物表达载体，用 Pnos启动子替换 NPTII基因含双增强子的 35S启动子， 以降低 ΝΡΤΠ蛋白 在植物中的表达。 选择诱导型启动子 rd29A及 Tnos作为 GhAVPl-3基因的启动子和终止子。 具体步骤简述如下：

SEQ ID NO: 11和 SEQ ID NO: 12以植物表达载体 PBI 121 (购自北京华夏远洋科技有限 公司） 为模板扩增 Pnos, 采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶。 50 μ 1 PCR反应体系： 10 μ 1 5 X PS Buffer, 3 μ 1 2· 5mM的 dNTP， 1. 0 μ 1 PBI 121 , 1. 0 μ 1 PrimeSTAR、 10 μ Μ 的引物 SEQ ID NO : 11和 SEQ ID NO: 12各 2. 0 μ 1， 以及 31 μ 1的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min; 94 °C 变性 30 s， 56°C退火 30 s， 72 °C 延伸 30 s， 33个循环； 72 °C 延 伸 10 min。 PCR产物通过 EcoRI、 Bgll l (购自 New England Biolabs )酶切连接到 pCAMBIA2300 获得 pCAMBIA2300-l， 连接反应条件见 pr omega T4连接酶盒所示步骤。

SEQ ID NO: 11 ：

GCAC GAATTC ATACAAATGGACGAACGGAT SEQ ID NO: 12：

ATCC AGATCT AGATCCGGTGCAGATTATTTG SEQ ID No: 13和 SEQ ID No : 14以 PBI121为模板扩增 Tnos，采用 TaKaRa的 PrimeSTAR

HS DNA聚合酶。 50 μΐ PCR反应体系： 10 μΐ 5xPS Buffer, 3 μΐ 2.5mM的 dNTP， 1.0 μΐ PBI121， 1.0 ^ PrimeSTAR 10 μΜ的引物 SEQ ID NO: 13和 SEQ ID NO: 14各 2.0μ1， 以及 31 μ1的双 蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min; 94V 变性 30 s， 58°C退火 30 s, 72V 延伸 30 s， 33个循环； 72°C 延伸 10 min。 PCR产物通过 Sacl、 EcoRI (购自 New England Biolabs )酶切 连接到 pCAMBIA2300-l获得 pCAMBIA2300-2, 连接反应条件是 promega T4连接酶试剂盒所 示步骤。

SEQ ID No: 13：

AAGGAGCTCGAATTTCCCCGATCGTTCAAA SEQ ID No: 14：

TCAGAATTC CCAGTGAATT CCCGATCTAG TA

SEQ ID NO: 15和 SEQ ID NO: 16以拟南芥 (哥伦比亚型，购自 www.arabidopsis.org)DNA为模 板 (参考 Zeng I, et L. 2002, Preparation of total DNA from"recalcit rant plant taxa", Acta Bot. Sin., 44(6): 694-697 中的方法提取拟南芥 DNA)扩增拟南芥 rd29 A启动子。采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶。 50 μΐ PCR反应体系： 10 μΐ 5><PS Buffer, 3 μΐ 2.5mM的 dNTP， 1.0 μΐ拟南芥 DNA, 1.0 ^ PrimeSTAR 10 μΜ的引物 SEQ ID NO: 15和 SEQ ID NO: 16各 2.0μ1， 以及 31 μΐ的双 蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变性 5 min; 94 °C 变性 30 s， 58°C退火 30 s, 72V 延伸 30 s， 33 个循环； 72°C 延伸 10 min。 PCR产物通过 HindIII、 Sail (购自 New England Biolabs ) 酶切连接 到 pCAMBIA2300-2获得 pCAMBIA2300-3， 连接反应条件是 promega T4连接酶试剂盒所示步 骤。

SEQ ID No: 15：

ACTAAGCTT CCTTCTTGACATCATTCAATTTTA SEQ ID No: 16：

TGAgt cga cTCCAAAGATT TTTTTCTTTC CAATAG

SEQ ID No: 17和 SEQ ID No: 18扩增 AVP1-3基因， （模板是实施例 2所获得含有 AVP 1-3 基因的 pGEM T-easy重组载体）， 采用 TaKaRa的 PrimeSTAR HS DNA聚合酶。 50 μ 1 PCR反 应体系： 10 μ 1 5XPS Buffer, 3 μ 1 2. 5mM的 dNTP， 1. 0 μ 1 AVPl-3-pGEM, 1. 0 μ 1 PrimeSTAR、 10 μ Μ的引物 SEQ ID NO: 17和 SEQ ID NO: 18各 2. 0 μ 1， 以及 31 μ 1的双蒸水。 PCR反 应条件： 94°C预变性 5 min; 94 °C 变性 30 s， 58°C退火 30 s， 72 °C 延伸 2min， 33个循环； 72 °C 延伸 10 min。 PCR产物通过 Sall、 Sac I (购自 New England Biolabs ) 酶切连接到 PCAMBIA2300-3, 获得植物表达载体 rd29A-GhAVPl-3_2300， 连接反应条件是 pr omega T4连 接酶试剂盒所示步骤。

SEQ ID No: 17：

TGAGTCGACATGGGAGCGGTTTTGTTGTCGGAGTTTG SEQ ID No: 18：

AAGGAGCTC CTAAAAGATC TTGAAAAGCAAGCCACCG

实施例 4 rd29A-GhAVPl-3-2300表达载体转化农杆菌

农杆菌 LBA4404 (购自 Biovector Science Lab, Inc) 感受态细胞制备： 提前 l_2d将农 杆菌 LBA4404在含 50 μ g/ml利福平和 50 μ g/ml链霉素的 LB固体培养基平板（LB液体培养 基中加入 1.5%的琼脂）上划单斑接种， 28°C培养 1至 2d。挑取单菌落接种于 5ml含 50 μ g/ml 利福平和 50 μ g/ml链霉素的 LB液体培养基中， 28°C下摇动培养过夜 (约 12_16h)至 0D600值 为 0. 4， 形成种子菌液。 取 5ml活化后的菌液 （ 1： 20的比例）接种于 100ml同样浓度抗生素 的 LB液体培养基中， 28°C摇动培养 2-2. 5h至 0D600=0. 8。 冰浴菌液 10min， 每隔 3min摇匀 一次， 令细菌均匀进入休眠状态。 于 4°C下 4000g离心 10min， 弃上清液； 加入一定量预冷 10%甘油重悬浮菌体， 4°C下 4000g离心 10min， 收集沉淀； 用 10%甘油重复洗 3-4次； 加入适 量冰浴预冷的 10%甘油重新悬浮细菌沉淀， 以 40 μ ΐ/管将其分装， 于 -70°C保存备用。

转化农杆菌： 在冰上融化上述农杆菌 LBA4404感受态细胞， 往 40 μ 1的感受态细胞中加 入 1 μ 1的实施例 3制备的表达载体构建 rd29A-GhAVPl-3-2300， 混匀后冰浴约 10 min。 将 上述混合物用枪转移到预冷的电击杯中， 轻敲使混合物到达底部， 注意不要有气泡。 将电击 杯（购自 bio-rad， 型号 Micropulser)放到电击室的滑道上， 推动滑道将电击杯放至电击室 基座电极处。 使用 0. lcm的电击杯， MicroPulser (购自 bio-rad) 的程序设置为 "Agr"， 电击一次 。立即取出电击杯， 加入 28°C预热的 LB液体培养基中。 快速而轻柔的用枪将细胞 打匀。将上述悬浮液转入 1. 5ml的离心管， 28°C， 225rpm培养 lh。取 100-200 μ 1的菌液涂 布与相应的抗性筛选培养基 (LB固体培养基， 含 50 _μ§ /ιη1利福平、 50 _μ§ /ιη1链霉素、 50 _μ§ /ιη1 卡那霉素）平板上， 28°C培养。 实施例 5 利用农杆菌介导的转化法获得转基因烟草

用 75%酒精浸泡烟草（国家烟草中期库，获取单位 中国农科院烟草所，库编号 I5A00660) 种子 30s， 再用 0.1%升汞浸泡 8min， 进行表面消毒。将消过毒的烟草种子置于 MS固体培养 ¾ (18.78 mMKN0 ₃ , 1.25 mMKH ₂ P0 ₄ , 20.6 mMMliNOs, 1.5mMMgS0 ₄ , 3.0mMCaCl ₂ , 50μΜΚΙ, 100μΜΗ ₃ ΒΟ ₃ ， 100 MMnSO ₄ , 30 MZnSO ₄ , 1 MNa ₂ Mo0 ₄ , 0.1 MCoCl ₂ , 100 MNa ₂ EDTA, 100 MFeSO ₄ , 7.4 g/L琼脂， 蔗糖 30g/L) 上无菌发芽， 制备无菌苗。 取无菌苗叶片剪成 5mm X 5mm大小的叶盘， 用实施例 4中处于对数生长期的含表达载体的 农杆菌浸染叶盘 lOmin, 吸干菌液， 在黑暗条件下共培养 2天 （MS固体培养基)； 并以未被 农杆菌浸染的叶盘作为对照叶片。 将农杆菌浸染的叶片转到分化培养基 （MS 固体培养基 +lmg/L BA+O.lmg/L NAA+50mg/L卡那霉素 +500mg/L头孢霉素）上， 光照条件下培养 45天 左右， 待芽长大后切下转移到生根培养基（MS固体培� ��基 +50mg/L卡那霉素 +500mg/L头孢 霉素） 中培养 30天左右， 待根系发达后将小苗转入仅加有 500mg/L头孢霉素的 MS固体培 养基上。 同时， 将对照叶片转到分化培养基 （MS 固体培养基 +lmg/L BA+O.lmg/L NAA+50mg/L卡那霉素 +500mg/L头孢霉素）上， 光照条件下培养 45天左右， 待芽长大后切 下转移到生根培养基 (MS固体培养基 +50mg/L卡那霉素 +500mg/L头孢霉素） 中培养 30天 左右， 待根系发达后将小苗转入仅加有 500mg/L头孢霉素的 MS固体培养基上。

取农杆菌浸染的烟草小苗叶片，提取基因组 DNA (同实施例 3中拟南芥 DNA提取方法) 后， 用引物 SEQIDNo: 17和 SEQIDNo: 18进行 PCR鉴定（Ex Taq购自 TAKARA, 50 μΐ PCR反应体系： 5 μΐ ΙΟχΕχ Buffer, 3 μΐ 2.5mM的 dNTP， 2.0 μΐ DNA, 1.0 μΐ Ex Taq、 10 μΜ 的引物 SEQIDNO: 17和 SEQIDNo: 18各 2.0μ1， 以及 35 μΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94 °C预变性 5min; 94 °C 变性 30 s， 58°C退火 30 s, 72 °C 延伸 2min， 33个循环； 72°C 延伸 lOmin), 选取 20株成功转化的转基因烟草编号成 T _Q M1-T _Q M20。

灭过菌的蛭石用 1/2MS培养基浸透，将上述培养 T _Q M1-T _Q M20转基因烟草小苗和对照小 苗移栽到所述蛭石上， 25°C、 10小时光培养 /14小时暗培养循环， 每 5天烧一次 1/2MS。 大 约 60天后获得种子。 实施例 6 过表达 GhAVPl-3转基因烟草 T1代的抗旱模拟实验及功能鉴定

灭过菌的蛭石用 1/2MS培养基浸透。将 T。代转基因烟草 T。01、 Τ。02、 Τ。03、 Τ。04和 Τ ₀ Ο5 的种子以及对照烟草种子分别播种在蛭石上， 25°C、 10小时光培养 /14小时暗培养循环， 每 5 天浇一次 1/2MS, 培养 25天之后， 摘取最下端一片叶子， 提取基因组 DNA (同实施例 3中拟南 芥 DNA提取方法）， 利用引物 SEQ ID NO: 17和 SEQ ID NO: 18做 PCR鉴定 (Ex Taq购自 TAKARA, 50 μ1 ΡΟ反应体系： 5 μΐ 10xEx Buffer， 3 μΐ 2.5mM的 dNTP， 2.0 μΐ DNA, Ι.Ο μΙ Εχ Taq、 10 μΜ的引物 SEQ ID NO: 17和 SEQ ID No: 18各 2.0μ1， 以及 35 μΐ的双蒸水。 PCR反应条 件： 94°C预变性 5 min; 94 °C 变性 30 s， 58°C退火 30 s, 72 °C 延伸 2min， 33个循环； 72 °C 延 伸 10 min), 剔除阴性植株 （对照烟草也同样摘取一片叶子）。 挑取大小一致的转基因烟草 ( ΤιΟΙ、 Τι02 1^03、 1^04 1^05各 10株，编号分别是 ^(^^至！ ¹ ^ -^)、 ^(^-至！ ¹ ^?-^)、 ^(^-至！ ¹ ^?-^)、 ^(^^至丁^ ^)禾口 1 ¹ ₁ 05-1至1 ¹ ₁ 05-10)、 对照烟草 （10株， 编号是对照 1 至对照 10) 做耐旱实验。 转基因烟草、 对照烟草干旱 14天 (不浇水)， 25°C、 10小时光培养 /14 小时暗培养循环。 然后取出植株对植株进行称重。 上述 1代转基因植株的抗旱性鉴定表明， 对照植株都萎蔫严重，而转基因植株都能够正 常生长，显示出明显的抗旱性（参见图 3及表 1 )。 在图 3中， 选取转基因植株1 01-6和对照烟草 6示例性显示， 其他烟草的结果与它们类似。 实施例 7 过表达 GhAVPl-3转基因烟草 T1代的抗盐模拟实验及功能鉴定

灭过菌的蛭石用 1/2MS培养基浸透。 将 T。代转基因烟草 T。01、 Τ。02、 Τ。03、 Τ。04和 Τ ₀ Ο5 的种子以及对照烟草种子分别播种在蛭石上， 25°C、 10小时光培养 /14小时暗培养循环， 每 5天 浇一次 1/2MS, 培养 25天之后， 摘取最下端一片叶子， 提取基因组 DNA (同实施例 3中拟南芥 DNA提取方法），利用引物 SEQ ID NO: 17和 SEQ ID NO: 18做 PCR鉴定 (Ex Taq购自 TAKARA, 50 μΐ PCR反应体系： 5 μΐ ΙΟχΕχ Buffer, 3 μΐ 2.5mM的 dNTP， 2.0 μΐ DNA, 1.0 μ1 Εχ Τα 10 μΜ 的引物 SEQ ID NO: 17和 SEQ ID No: 18各 2.0μ1， 以及 35 μΐ的双蒸水。 PCR反应条件： 94°C预变 性 5 min; 94 °C 变性 30 s， 58°C退火 30 s, 72 °C 延伸 2min， 33个循环； 72°C 延伸 10 min)， 剔 除阴性植株 （对照烟草也同样摘取一片叶子）。 挑取大小一致的转基因烟草 （ 01、 1 02、 Ti03 Tii^^PTiOS各 10株， 编号分别是 ^(^-^至！ ¹ ^^。、 ^(^- 至！ ¹ ^? 。、 1^03-11至 ΤιΟ3-20 1 ¹ ₁ 04-11至1 ¹ ₁ 04-20和1 ¹ ₁ 05-11至1 ¹ ₁ 05-20)、对照烟草（10株，编号是对照 11至对照 20) 做耐盐实验， 浇灌 lOO mMNaCl, 25°C、 10小时光培养 /14小时暗培养循环， 14天后观察结果： 代转基因植株的耐盐性鉴定表明， 对照植株都不能正常生长， 生长明显受到抑制， 而转基因 植株生长都明显高于对照植株， 显现出明显的耐盐性（参见图 4及表 1 )。 在图 4中， 选取转基因 植株 05-12和对照烟草 13示例性显示， 其他烟草的结果与它们类似。 转化事件 代植株重量 （g) (平均值士标准差） 耐盐处理 耐旱处理

TiOl 0.82±0· 06 0.69±0. 06

Τι02 0.70±0· 10 0.55 ±0· 08

Τι03 0.77±0· 07 0.58±0· 09

Τι04 0.65 + 0. 06 0.53 ±0· 05

Τι05 0.65 + 0. 06 0.57±0· 07 对照烟草植株 0.30±0· 04 0.31 ±0· 04